ES2574827T3 - Líneas de embriocitoblastos de pato para la producción de vacunas antivíricas - Google Patents

Líneas de embriocitoblastos de pato para la producción de vacunas antivíricas Download PDF

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ES2574827T3 ES12187538.9T ES12187538T ES2574827T3 ES 2574827 T3 ES2574827 T3 ES 2574827T3 ES 12187538 T ES12187538 T ES 12187538T ES 2574827 T3 ES2574827 T3 ES 2574827T3
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Abstract

Una línea celular continua y diploide de pato derivada de embriocitoblastos que es útil para ser infectada con y replicar un virus en la que dicha línea celular de pato no produce partículas retrovirales endógenas competentes para la replicación.

Description

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DESCRIPCION
Lfneas de embriocitoblastos de pato para la produccion de vacunas antivfricas Descripcion de la invencion
La presente invencion se relaciona con el desarrollo y elaboracion de vacunas antivfricas. En particular, la invencion se relaciona con el campo de la produccion industrial de vectores vfricos y vacunas, mas especfficamente con el uso de lfneas celulares de pato derivadas de embriocitoblastos que estan libres de retrovirus endogenos aviares, para la produccion de vectores vfricos y virus. La invencion es particularmente util para la produccion industrial y vacunas antivfricas para evitar la infeccion vfrica de humanos y animales.
Antecedentes
Las vacunas reducen eficazmente y evitan la muerte y enfermedad causada por muchas infecciones vfricas tales como, por ejemplo, gripe, sarampion, paperas, viruela y fiebre amarilla.
Muchas vacunas antivfricas se producen actualmente en huevos de pollo embrionados o en fibroblastos de embrion- de pollo primario aislados de embriones de pollo. No obstante, la produccion de vacunas ocasionalmente se ha visto complicada por contaminacion inadvertida con agentes adventicios que se pudieron haber originado de sustratos de celulas aviares utilizadas para propagar las cepas de vacuna. En realidad, la actividad de transcriptasa inversa (RT), una indicacion de la presente de retrovirus, se detecto en vacunas atenuadas elaboradas con microbios vivos derivados de celulas de pollo que incluyen las producidas por fabricantes Europeos y de Estados Unidos para fiebre amarilla, sarampion y paperas (Hussain et al., 2003, J. Virol 77: 1105-1111, Johnson et Heneine, 2001, J. Virol., 75:3605-3612). Las investigaciones respecto al origen de la actividad de RT en dichas vacunas encontraron pruebas de partfculas que contienen ARN de virus de leucosis aviar endogeno (ALV -E) y virus aviar endogeno (EAV) (Johnson et Heneine, 2001, 1. Virol 75:3605-3612; Tsang et al., 1999, J. Viro1 73:5843-5851; Weissmahr et al., 1997, J. Virol 71:3005-3012).
Tanto ALV -E como EAV son miembros de las familias de retrovirus endogenos presentes en la lfnea germinal de pollo. ALV-E se expresa de los loci ev los cuales son elementos provfricos hederables. En base en sus secuencias de envoltura, ALV-E se diferencian de ALV subgrupos A a D y J, los cuales son infecciones adquiridas de manera exogena. Aunque los ALV exogenos provocan varias enfermedades neoclasicas tales como miocarditis y osteoporosis en pollos infectados, no se sabe que ALV-E sea patogeno para pollos. La carencia de un potencial oncogenico en infecciones con AL V-E puede ser atribuida a la ausencia de un oncogen vfrico y un mejorador de actividad en la secuencia repetida terminal grande endogena (LTR). Se han identificado mas de 20 diferentes loci ev en pollos White Leghom (ev-1 a ev-22). Las designaciones de los loci ev se asignan en el orden descubierto y son clasificados fenotfpicamente con respecto a los productos de gen que expresan y su capacidad para generar partfculas infecciosas. Los fenotipos ALV-E conferidos por los loci ev varfan de partfculas estructurales y enzimaticamente completas infecciosas hasta expresion de protefna vfrica detectable defectuosa o nula, estructural o enzimaticamente (RT-). La mayor parte de los loci ev son estructuralmente incompletos y por lo tanto no codifican para todas las secuencias necesarias para la produccion de partfculas de virus infecciosas. La cepa en pollo, denominada ev-0, se ha obtenido por crianza para ser resistente a ALV -E. Los pollos de la lfnea-0 carecen de los loci ev (es decir, son ev-0), pero estan presentes secuencias provfricas de EAV en el genoma de pollos de la lfnea 0 (Dunwiddie and Faras, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82:5097-5101).
Se conoce poco acerca de la familia EAV, la cual es distinta, pero esta relacionada con la familia ALV. Los elementos EAV estan presentes en por lo menos 50 copias por genoma de pollo. No obstante, ninguna de las secuencias EAV conocidas resultan en genomas retro vfricos de longitud completa e intactos y aun no se han identificado aislados de EAV infecciosos. No obstante, se ha demostrado que EAV tiene una expresion elevada en celulas embrionicas derivadas de aves del genero Gallus. Weissmahr et al. (Weissmahr et al., 1997, J. Virol 71:3005-3012) han demostrado que las partfculas de la familia de retrovirus endogeno EAV son muy responsables, con mayor probabilidad, de una gran porcion de la actividad de R T asociado a partfculas que se encuentra en los sobrenadantes de fibroblastos de embriones de pollo cultivados.
El riesgo de transmision inadvertida es particularmente elevado para la vacuna antivfrica atenuada con organismos vivos dado que no se pueden someter a un procedimiento de inactivacion y la mayor parte de los mismos se inyectan al humano, por lo tanto evadiendo los mecanismos de proteccion inmunitarios inespecfficos. De esta manera, para asegurar la de celulas para la produccion de vacunas ahora deben probarse para determinar la presencia de retrovirus capaces de replicarse que puedan pasar a los hospedadores animales o humanos durante la inmunizacion (WHO, series de reportes tecnicos, 1994).
Por otra parte, los huevos de pollo embrionados y los sistemas de produccion de fibroblastos de embrion de pollo primario se asocian con varias limitaciones graves, que incluyen:
- un procedimiento de elaboracion largo, molesto y que consume recursos que requiere el suministrar y el control de calidad de grandes cantidades de huevos o fibroblastos de embrion de pollo (CEF) para cada campana de produccion individual;
- la necesidad en muchos casos del uso de embriones de pollo libres de patogenos especfficos (SPF) costosos;
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- los riesgos de un suministro insuficiente de huevos en casos de infecciones epidemicas emparvadas de polios donadores;
- los costos de inflacion relacionados con el uso de sueros bovinos que se obtienen de pafses libres de encefalopatfas espongiforme bovina (BSE);
- la incapacidad de utilizar huevos para la propagacion de virus que son altamente virulentos y mortales para los pollos.
Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejoramiento de las tecnologfas de produccion de vacunas antivfricas actuales basadas en huevos o fibroblastos embrioncitos de pollo. El desarrollo de plataformas de cultivos de celulas como una alternativa para los sistemas de produccion en huevos y CEF para la elaboracion de vacunas antivfricas probablemente es la solucion mas rapida y promisoria para superar los cuellos de botella y limitaciones de tiempo en la produccion de vacunas hoy en dfa. Ademas, el uso de lfneas celulares para la elaboracion de vacunas antivfricas en vez de las plataformas de huevo o CEF, tiene las siguientes ventajas adicionales en relacion con la seguridad de la vacuna; no hay aditivos antibioticos presentes en la formulacion de vacuna; no se necesitan conservadores toxicos (tal como tiomerasa l); se tienen concentraciones reducidas de endotoxina; no hay problemas respecto a la alergia al huevo; no hay riesgo de un agente adventicio/BSE por cultivo celular en protefna y medio libre de suero; una pureza mayor de la preparacion de vacuna antivfrica.
Los ejemplos de lfneas celulares para la produccion de vacunas antivfricas son MDCK (celulas derivadas de rinon del perro Madin-Darby), PerC6 (celulas derivadas de celulas retinales embrionicas humanas modificadas geneticamente al insertar los genes E 1 del adenovirus humano tipo 5) desarrollado por CRUCELL (Pafses Bajos», celulas VERO (celulas derivadas de celulas epiteliales de rinon de mono verde Africano (Cercopithecus aethiops) aislado en Chiba University en Chiba, Japon), BHK21 (celulas inmortalizadas de celulas de rinon de crfa de hamster). Ninguna de las lfneas celulares disponibles satisfacen todos los requerimientos medicos, regulatorios e industriales. Por ejemplo, la mayor parte de estas lfneas celulares son tumorigenicas y existen preocupaciones reguladoras importantes respecto al uso de celulas tumorigenicas para la produccion de vacunas humanas; por lo tanto, actualmente las autoridades reguladoras estan renuentes a aprobar sustratos de celulas tumorigenicas para elaboracion de vacunas masivas. Ademas, algunas de estas lfneas celulares dependen de anclaje, lo que constituye un problema grave para el incremento en el tamano de produccion industrial de la produccion de vacuna.
Asf, existe la necesidad de desarrollar lfneas celulares independientes de anclaje, libres de replicacion competente de retro virus que sean no tumorigenicas e industrialmente confiables, las cuales sean susceptibles a infeccion con una amplia gama de virus. Este es el proposito de la presente invencion.
Asf, el inventor ha aprovechado su conocimiento en biologfa aviar y embriocitoblastos (ES) aviares para llevar a cabo el desarrollo de lfneas celulares de pato estables novedosas que permiten la replicacion eficaz de una gran cantidad de vacunas humanas y veterinarias y candidatos de vacunas. Al adoptar un procedimiento registrado (veanse los documentos WO 03/076601 y WO 05/007840), el inventor ha sido capaz de generar una serie de lfneas celulares de pato bien caracterizadas y documentadas (es decir, las celulas dEBx®) que se derivan de celulas ES de pato, sin etapas de inmortalizacion genetica, qufmica o vfrica y que no producen retrovirus competentes de replicacion en cultivo.
Descripcion
La presente solicitud proporciona un procedimiento para obtener lfneas celulares aviares diploides continuas, denominadas EBx derivadas de embriocitoblastos (ES) aviares, en donde las lfneas celulares aviares no producen partfculas de retrovirus endogenas capaces de replicarse.
Las lfneas celulares de la invencion son "continuas" debido a que tienen caracterfsticas para ser cultivadas in vitro con respecto a un periodo de tiempo extendido. Ventajosamente, las celulas de la invencion son capaces de proliferar durante por lo menos 50 generaciones, por lo menos 75 generaciones, por lo menos 100 generaciones, por lo menos 125 generaciones, por lo menos 150 generaciones, por lo menos 175 generaciones, por lo menos 200 generaciones o por lo menos 250 generaciones. Las 250 generaciones no constituyen un lfmite de tiempo debido a que las celulas obtenidas aun estan vivas y aun pueden ser sometidas a paso para pase adicional. Sin desear unirse a teorfa alguna, se postula que las celulas de la invencion se pueden cultivar "continuamente" en la medida en que en las celulas se exprese telomerasa. En realidad, se supone que el alto nivel de expresion de telomerasa de celulas aviares de la invencion es responsable de la estabilidad genetica (es decir, las celulas aviares de la invencion son diploides) y el crecimiento celular continuo.
Mediante el termino "pase" se quiere indicar la transferencia o transplante de celulas, con o sin dilucion, de un recipiente de cultivo a otro. Debe entenderse que en cualquier momento las celulas se transfieren de un recipiente a otro, y cierta porcion de las celulas se puede perder y por tanto puede presentarse dilucion de celulas, deliberado o no. Este termino es sinonimo en termino "sub cultivo". El numero de pases es el numero de veces que las celulas estan en el cultivo, que crecen en suspension o en adherencia y que han sido subcultivadas o se han pasado a un recipiente nuevo. El termino no es sinonimo de duplicacion de poblacion o generacion de la misma, el cual es el tiempo necesario para que una poblacion celular se duplique una vez; es decir, aproximadamente al momento en que cada una de las celulas de una poblacion se ha duplicado. Por ejemplo, las celulas ES aviares de la etapa a) de la invencion tienen un tiempo de duplicacion de poblacion (PDT) de aproximadamente >40 horas. Las celulas EBx
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aviares de la invencion tienen un PDT de aproximadamente <30 horas; habitualmente para celulas EBx®, existe un pase cada tres generaciones.
Mediante el termino "diploide" se quiere indicar que las celulas de la invencion tienen dos copias (2n) de cada cromosoma, habitualmente uno de la madre y uno del padre.
El hecho de que las lfneas celulares EBx® aviar de la invencion sean continuas y diploides (es decir, geneticamente estables) constituye una caracterfstica notable y unica debido a que estos terminos habitualmente son antagonistas. Asf, las celulas cancerosas y/o celulas inmortalizadas obtenidas por modificacion qufmica, ffsica (radiacion UV, rayos X o irradiacion g, ... ) o modificacion genetica (transformacion de virus, sobreexpresion de oncogenes, ... ) son celulas continuas debido a que son capaces de replicarse indefinidamente en el cultivo pero no son geneticamente estables debido a que muestran cariotipos poliploides. Por otra parte, las celulas primarias tales como fibroblastos embrioncitos de pollo, MRC5, WI38, las cuales son celulas no transformadas, no son continuas debido a que tienen una duracion de vida finita despues de algunas generaciones, pero son celulas geneticamente estables (es decir, diploides).
En la presente invencion, los terminos "lfneas celulares" y "celulas" se utilizan de manera indistinta.
Los terminos "aviar", "aves" o "de las aves", como se utiliza en la presente, se pretende que tengan el mismo significado y se utilizaran de manera indistinta. El termino "aves" se refiere a cualquier especie, subespecie o raza de organismos de la clase taxonomica "ava". En una realizacion preferida, las "aves" se refiere a cualquier animal del orden taxonomico:
- "Anserifomes" (es decir, pato, ganso, cisne y similares), el orden anseriformes contiene aproximadamente 150 especies de aves en tres familias, los Anhimidae (las chillonas), Anseranatidae (la urraca-ganso) y los Anatidae, los cuales incluyen mas de 140 especies de aves acuaticas, entre ellas patos, gansos y cisnes. Todas las especies en el orden estan altamente adaptadas para existencia acuatica en la superficie del agua. Todas tienen patas palmipedas para nadar eficientemente (aunque algunas posteriormente se han vuelto principalmente terrestres);
- "Galliformes" (es decir, pollos, codornices, pavos, faisanes y similares). Los galliformes es un orden de aves que contienen a los pollos, pavos, codornices y faisanes. Se encuentran en todo el mundo aproximadamente 256 especies.
- "Columbiformes" (por ejemplo pichon y similares). Las aves del orden columbiformes incluyen a palomas y pichones ampliamente diseminados.
En la presente invencion, mediante el termino "partfcula retrovfrica endogena" o "partfcula de retrovirus endogena" terminos que pueden utilizarse de manera indistinta, se quieren indicar una partfcula retrovfrica o un retrovirus codificado y/o que se expresa de las secuencias provfricas de ALV-E o EAV presentes en algunos genomas de celulas aviares. En las aves, se sabe que las secuencias provfricas de ALV-E estan presentes en el genoma del pollo domestico (excepto el pollo lfnea-0), las aves de jungla roja y el faisan de cuello de anillo. En las aves, se sabe que las secuencias provfricas de EAV estan presentes en todo el genero Gallus que incluyen pollo domestico, pollo lfnea-0, ave acuatica de jungla roja, ave acuatica de jungla verde, ave acuatica de jungla gris, ave acuatica de jungla de Ceilan y similares) (vease Resnick et al, 1990, J. Viral., 64:4640-4653).
De acuerdo con una realizacion preferida, el ave de la invencion se selecciona de entre las aves que no comprenden secuencias provfricas ALV-E y EAV en su genoma y es un pato. Una persona experta en la tecnica es capaz de determinar si estan presentes las secuencias ALV-E Y EAV en el genoma de un ave (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al, 1996). Preferiblemente, el ave se selecciona del grupo que consiste de Anseriformes (es decir, pato, ganso, cisne), pavos, codornices, codorniz Japonesa, aves de guinea, aves Pea. Por lo tanto las celulas derivadas de dichas aves no producen partfculas ALV-E y/o EAV endogenas capaces de replicarse. Dicho ave se selecciona de entre el grupo que contiene patos, gansos, cisnes, pavos, codornices y codornices Japonesas, aves de Guinea, y aves Pea. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el ave es un pato, de manera mas preferible patos pequines y Muscovy. De acuerdo la invencion, el ave es un pato pequines. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un procedimiento para la obtencion de lfneas celulares de pato diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pato no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse.
Existen otras aves que no comprenden las secuencias provfricas ALV-E completas en su genoma pero finalmente secuencias provfricas EAV. Una persona experta en la tecnica es capaz de determinar si estan presentes las secuencias ALV-E y EAV parciales o completas en el genoma de un ave (Johnson and Heneine, 2001). Se han seleccionado varias cepas de pollos por crianza de manera que no contengan las secuencias provfricas ALV-E completas (es decir, la cepa ev-0) y por lo tanto no producen retropartfculas ALV-E infecciosas, tales como:
- Pollo domestico lfnea 0 del concentrado de aves de corral East Lansing USDA (cepa ELL-0). Los pollos de la lfnea-0 de East Lancing no contienen ningun loci vfrico endogeno (ev) relacionado con ALV (Dunwiddie and Faras, 1985).
- Lfneas DE y PE 11 del Institut National de la Recherche Agronomique (Domaine de Magneraud, Surgeres, Francia).
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Por lo tanto, las celulas derivadas de aves ev-0 no producen partfculas ALV-E endogenas capaces de replicarse. Por lo tanto, la solicitud tambien describe el ave es un pollo domestico ev-0 (Gallus Gallus subespecies domesticus), que preferiblemente se selecciona de entre ELL-0, DE y PE11.
Habitualmente, los pollos ev-0 aun contienen la secuencia pro vfrica de EAV pero hasta ahora no se han identificado aislados EAV infecciosos. Por lo tanto, la presente solicitud describe un procedimiento para obtener lfneas celulares de pollo diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES) de cepas de pollos ev-0, en donde las lfneas celulares de pollo ev-0 no producen partfculas de retrovirus endogenos capaces de replicarse.
Tambien hay aves que comprenden secuencias provfricas ALV-E y EAV completas y/o incompletas en su genoma pero que no son capaces de producir retropartfculas de ALV-E y EAV capaces de replicarse. Una persona experta en la tecnica es capaz de determinar si se producen retropartfculas infecciosas y/o no infecciosas de ALV-E y/o EAV a partir de celulas de ave (Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). Preferiblemente, el ave se selecciona del grupo que comprende pollos libres de patogenos especfficos (SPF), preferiblemente de la cepa Valo (Lohman) o lfnea 22 (SPAFAS).
Mediante el termino "capaces de replicarse" se quiere indicar que las partfculas retrovfricas endogenas son infecciosas, es decir, que dichas partfculas retrovfricas son capaces de infectar y replicarse en celulas de pato de la invencion.
El procedimiento de establecimiento de lfneas de celulas aviares diploides continuas, denominado EBx® comprende dos etapas:
a) aislamiento, cultivo y expansion de embriocitoblastos a partir de aves que no contienen secuencias provfricas endogenas completas, o un fragmento de las mismas, susceptibles de producir partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse, de manera mas especffica secuencias provfricas EAV y/o ALV-E o un fragmento de las mismas, en un medio de cultivo completo que contiene todos los factores que permiten su crecimiento y en presencia de una capa alimentadora y complementado con suero animal; opcionalmente en un medio de cultivo completo que puede comprender aditivos tales como aminoacidos adicionales (es decir, glutamina, aminoacidos no esenciales, ... ) piruvato de sodio, p-mercaptoetanol, vitaminas, hidrolizado de protefnas de origen no animal (es decir yeastolato, hidrolizados de plantas (soja, trigo, ...);
b) pase al modificar el medio de cultivo de manera que se obtenga una extraccion total de dichos factores, la capa alimentadora y del suero, y opcionalmente los aditivos y ademas que se obtengan lfneas celulares aviares adherentes o en suspension, denominadas EBx® que no produzcan partfculas de retrovirus endogenos capaces de replicarse, celulas capaces de proliferar durante un perfodo de tiempo prolongado, en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento exogenos, capa alimentadora y suero animal.
En la invencion, el ave es un pato.
La modificacion del medio de cultivo de la etapa b) del procedimiento del establecimiento de las lfneas celulares EBx®, de manera que se obtenga eliminacion progresiva o total de los factores de crecimiento, suero y de la capa alimentadora se puede llevar a cabo simultaneamente, de manera sucesiva o por separado. La secuencia de eliminacion de suplementos del medio de cultivo se puede seleccionar de entre:
- capa alimentadora/suero/factores de crecimiento;
- capa alimentadora/factores de crecimiento/suero;
- suero/factores de crecimiento/capa alimentadora;
- suero/capa alimentadora/factores de crecimiento;
- factores de crecimiento/suero/capa alimentadora;
- factores de crecimiento/capa alimentadora/suero.
En una realizacion preferida, la secuencia de la eliminacion es factores de crecimiento/ capa alimentadora/suero. En una realizacion preferida, la eliminacion de aditivos, tales como piruvato sodico, aminoacidos no esenciales (NNEA), vitaminas, yeastolato se realiza despues de la eliminacion de la capa alimentadora y antes de la eliminacion de suero. Preferentemente, la retirada del yeastolato se realiza despues de la retirada del piruvato sodico, NNEA y vitaminas.
De acuerdo con una realizacion preferida, los embriocitoblastos aviares de acuerdo con la etapa a) de la invencion se recolectan de embriones aviares en ovoposicion, es decir, cuando se pone el huevo. De acuerdo con Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228), la oviposicion corresponde a las siguientes etapas de desarrollo de acuerdo con la clasificacion de Eyal-Giladi (clasificacion de EYAL-GILADI, EYAL-GILADI y KOCHAN, 1976, "From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look al the first stages of the development in the chick" "General Morphology' Dev. Biol. 49:321- 337).
- Pato Muscovy (tambien denominado pato Barbari); etapa VII
- Ave de Guinea: etapa VII-VIII
- Pavo: etapa VII-VIII
- Pato pequines: etapa VIII
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- Pollo: etapa X
- Codorniz Japonesa: etapa XI
- Ganso: etapa XI
Preferiblemente, los embriocitoblastos (ES) de pato de la etapa a) se obtienen al disociar embriones de pato pequines aproximadamente en la etapa VIII (oviposicion) de la clasificacion de Eyal-Giladi. Si el huevo puesto recolectado en la oviposicion no se ha desarrollado lo suficiente para recolectar embriocitoblastos, el huevo opuesto puede incubarse adicionalmente entre varias horas (durante la noche) a uno o dos dfas para que madure el embrion. De acuerdo con una segunda realizacion, los embriocitoblastos (ES) de pato de la etapa a) es de un pato Muscovy. En el momento de la oviposicion, el pato Muscovy no esta suficientemente maduro debido a que se encuentra aproximadamente en la etapa VII, y por lo tanto el huevo debe incubarse durante la noche para que madure el huevo hasta la etapa VIII a X de la clasificacion de Eyal-Giladi.
El metodo divulgado en el presente documento tambien puede usarse con embriocitoblastos (ES) de pollo, preferiblemente de la cepa de pollo ev-0, que en la etapa a) se obtienen al disociar embriones aproximadamente en la etapa X (oviposicion) de la clasificacion de Eyal-Giladi.
De manera alternativa, los embriocitoblastos aviares de acuerdo con la etapa a) del proceso divulgado se recolectan de embriones antes de la oviposicion. Las limitaciones principales que se encuentran antes de la oviposicion es el hecho de que el huevo deba ser extirpado quirurgicamente de las hembras y que la cantidad de celulas ES por embrion es menos importante. Ademas, en etapas muy tempranas del desarrollo del embrion aviar, las celulas ES no se han individualizado bien haciendo diffcil el cultivo in vitro de celulas ES. Una persona experta en la tecnica sera capaz de definir el intervalo de tiempo antes de la puesta de huevo que permite recolectar celulas ES aviares.
De manera alternativa, los embriocitoblastos aviares de acuerdo con la etapa a) de la invencion se pueden recolectar de embriones aviares despues de oviposicion hasta la eclosion. No obstante, los embriocitoblastos aviares progresivamente entran en diferenciacion para generar tejidos diferenciados; por tanto, se prefiere recolectar los ES aviares no demasiado tarde despues de que han sido opuestos. Una persona experta en la tecnica sera capaz de definir el intervalo de tiempo despues de que se ha puesto al huevo que permite recolectar embriocitobastos aviares.
De acuerdo con otra realizacion, las celulas de la etapa a) son una poblacion de embriocitobastos enriquecida con celulas germinales primordiales (PGC). De manera mas preferible, las celulas ES aviares de la etapa a) son PGC purificadas. En especies aviares, las celulas germinales primordiales surgen de la region central del blastodermo (Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 10 1 (2):209-19; Karagenic et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al. 1997 Poultry Sci. 76(8): 1084-92). Despues se desplazan a un sitio extraembrionico anterior, la parte creciente germinal hasta que se recolectan por la vasculatura entre 2.5 y 5 dfas de desarrollo embrionico para llegar al borde germinal. Colonizan el borde germinal en donde finalmente se diferencian en ovocitos o espermatocitos (Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the promordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127). Los metodos de aislamiento de PGC de embriones aviares donadores se ha reportado en la literatura y se puede llevar a cabo facilmente por una persona experta en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento JP924997 publicado el 7 de septiembre de 1993, publicacion numeros 05-227947; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2):143-149; Naito et al, 1994. Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528; Chang et al. 1992. Cell Biol. lnt. Reporter 16(9):853-857). De acuerdo con una realizacion, las PGC se recolectan de sangre embrionica recolectada de la aorta dorsal de un embrion de pollo en la etapa 12-14 de la clasificacion de Hamburger & Hamilton (Hamburger & Hamilton. 1951. A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92). En otra realizacion preferida, las PGC se recolectan de la parte creciente germinal por diseccion mecanica de embrion de pollo o de las gonadas. No obstante, corno se ha descrito en lo anterior, otros metodos de aislamiento de PGC se conocen y se pueden utilizar de manera alternativa.
Estos embriocitoblastos aviares estan caracterizados por un tiempo de duplicacion lento y que comprende entre 48 y 72 horas en cultivo a 39°C.
Sin desear unirse a teorfa alguna, las condiciones de cultivo de celulas definido de celulas ES aviares seguido por la eliminacion de suplementos progresiva en factores de crecimiento, capa alimentadora, aditivos y suero, permite adaptar y seleccionar celulas que mantienen la mayor parte de la caracterfstica deseable de celulas ES (estabilidad de cariotipo, proliferacion indefinida, expresion de marcadores ES), pero ademas muestran caracterfsticas amigables industrialmente como crecimiento en suspension hasta densidades celulares elevadas en medio libre de suero. La telomerasa constituye uno de los marcadores ES mas importantes. Debido a la expresion sostenida y mantenida de telomerasa durante los pases de celulas, la celula EBx® es continua (es decir, inmortal) pero ademas es geneticamente estable (es decir, diploide).
De manera mas especffica, la presente solicitud describe un procedimiento para obtener lfneas celulares aviares diploides continuas derivadas de celulas ES, en donde las lfneas celulares aviares no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse, el procedimiento comprende las siguientes etapas de:
a) aislar embriones de ave, preferiblemente de pato o de pollo ev-0 en una etapa de desarrollo que comprende desde aproximadamente la etapa VI de la clasificacion de Eyal-Giladi (clasificacion de EYAL-GILADI:
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EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, "From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick". "General Morphology" Dev. BioI. 49:321-337) y antes de la eclosion, de manera preferible aproximadamente en la oviposicion, en donde el genoma de dicho ave no contiene secuencias provfricas endogenas susceptibles de producir partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
b) suspender embriocitoblastos (ES) aviares obtenidos por disociacion de embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con:
- Factor 1 de crecimiento insulfnico (IGF -1) y factor neurotrofico ciliar (CNTF);
- suero animal; y
- opcionalmente, factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que consiste de interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor de citoblastos (SCF), y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF);
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES durante por lo menos 1 pase;
d) opcionalmente retirar todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IL-6, IL-6R. SCF, FGF del medio de cultivo sobre un intervalo de varios pases de 1 a aproximadamente 15 pases, de manera preferible de 3 a aproximadamente 15 pases y ademas cultivar las celulas ES aviares durante por lo menos un pase. Preferiblemente, el retiro de la totalidad de los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo se realiza simultaneamente sobre un pase. Habitualmente, el retiro de IL-6, IL-6R, SCF, FGF se realiza aproximadamente en el pase 10 a 15;
e) retirada de IGF-1 y CNTF del medio de cultivo y cultivo adicional de las celulas ES aviares durante por lo menos un pase. Preferiblemente el retiro de los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IGF-1 y CNTF del medio de cultivo, se realiza simultaneamente, en un pase. Habitualmente, el retiro de IGF-1 y CNTF se realiza aproximadamente en el pase numero 15 a numero 25. De manera alternativa, el retiro de IGF-1 y CNTF se realiza por disminucion progresiva en varios pases (por lo menos 2 pases y aproximadamente hasta 15 pases);
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de aditivos en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de aditivos despues de por lo menos un pase; y
h) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total del suero animal despues de varios pases; e
i) obtener lfneas celulares aviares adherentes denominadas EBx® derivadas de celulas ES capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora, opcionalmente sin suero animal y aditivos y en donde las lfneas celulares aviares diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
j) de manera opcional, adaptar adicionalmente dichas lfneas celulares EBx® aviares adherentes a condiciones de cultivo de suspension. La etapa de adaptacion de cultivo celular a suspension se puede llevar a EBx®. Por ejemplo, las celulas EBx® de pato derivadas de embriocitoblastos Muscovy, las celulas se adaptan al crecimiento en suspension antes del retiro de la capa alimentadora. Para celulas EB® de pato (EB24, EB26, EB66) derivadas de pato pequines, las celulas se adaptan al crecimiento en suspension antes de retirar el suero animal;
k) Opcionalmente sub clonar de manera adicional las celulas EBx® aviares, por ejemplo por dilucion limitada. Esto hace posible obtener celulas de pato de acuerdo con la invencion.
En una realizacion preferida, la presente solicitud describe un procedimiento para obtener lfneas celulares aviares diploides continuas, denominadas EBx®, derivadas de embriocitoblastos (ES) aviares, en donde las lfneas celulares aviares no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar embriones de ave en una etapa de desarrollo alrededor de la oviposicion, en donde el genoma de las aves no contiene secuencias provfricas endogenas susceptibles de producir partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
b) suspender los embriocitoblastos (ES) aviares obtenidos por disociacion de embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con por lo menos:
- Factor 1 de crecimiento insulfnico (IGF-l) y factor neurotrofico ciliar (CNTF); y
- suero de mamffero tal como suero bovino fetal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES durante por lo menos un pase;
e) retirar IGF-1 y CNTF del medio de cultivo y cultivo adicional de las celulas durante por lo menos un pase;
f) disminuir progresivamente la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) disminuir progresivamente la concentracion de suero de mamffero en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de suero de mamffero despues de varios pases; y
h) obtener lfneas celulares EBx® aviares adherentes derivadas de celulas ES capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora y suero de mamffero y en donde las lfneas celulares aviares diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
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i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lineas celulares EBx® aviares adherentes a condiciones de cultivo de suspension, preferiblemente al promover el crecimiento como suspension, de manera mas preferible al transferir lineas celulares EBx® aviares adherentes obtenidas en la etapa h) en otro soporte que tenga una caracteristica de union menor que el soporte inicial (es decir tal como soporte de union ultra bajo).
La etapa j) de adaptar lineas celulares EBx® aviares adherentes a condiciones de cultivo de suspension, cuando se lleva a cabo, se puede efectuar en otra realizacion preferida antes de la etapa g) de disminuir progresivamente la concentracion de suero de mamffero en el medio de cultivo.
Este proceso hace posible obtener celulas de pato de acuerdo con la invencion.
En otra realizacion preferida, el medio de cultivo basado en la etapa b) del procedimiento para obtener lineas celulares aviares diploides continuas se suplementa adicionalmente con un factor de crecimiento que se selecciona del grupo que consiste de interleucina 6 (lL-6), receptor de interleucina 6 (lL-6R), factor de citoblastos (SCF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y el procedimiento comprende ademas una etapa d) de:
d) opcionalmente retirar todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IL-6, lL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo y cultivar adicionalmente celulas ES durante por lo menos un pase.
En una realizacion mas preferida, cuando se lleva a cabo la etapa d), la etapa e) de retiro de IGF-1 y CNTF del medio de cultivo se lleva a cabo despues de la etapa d) de retirada de todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo.
"Medio de cultivo basal" significa un medio de cultivo con una formulacion de medio clasica que permite, por si misma, por lo menos la supervivencia de celulas, e incluso mejor, el crecimiento de celulas. Los ejemplos de medios basales son BME (medio de Eagle basal), MEM (medio de Eagle mfnimo), medio 199, DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), GMEM (medio de Eagle modificado por Glasgow), DMEM-HamF12, Ham-F12 y Ham-F10, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio MacCoy 5A, RPMI 1640, GTM3. El medio basal comprende sales inorganicas (por ejemplo: CaCh, KCI, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4, ... ), aminoacidos, vitaminas (tiamina, riboflavina, acido folico, D-Ca pantotenato, ... ) y otros componentes tales como glucosa, beta-mercaptoetanol, y piruvato de sodio. Preferiblemente, el medio basal es un medio sintetico. La tabla 1 proporciona la composicion de DMEM/HAM F12:
Tabla 1: Formulacion de DMEM-HAM F12 (mg/l)
Sales Inorganicas
Cloruro de calcio anhidro Nitrato ferrico (III) *9H2O Sulfato ferrico (II) *7^0 Cloruro de potasio Sulfato cuprico (II) *5 H2O Cloruro de magnesio *6 H2O Sulfato de magnesio anhidro Cloruro de sodio Fosfato diacido de sodio *H2O Fosfato diacido disodico anhidro Sulfato de zinc* 7 H2O Carbonato acido de sodio Aminoacidos L-alanina L-argfnina *HCI L-asparagina *H2O Acido L-aspartico L-cistina* HCl *H2O L-cistefna *2HCl Acido L-glutamico L-glutamina en E15-813 Glicina
L-histidina * HCl *H2O
L-isoleucina
L-leucina
L-lisina * HCl
L-metionina
L-fenilalanina
L-prolina
L-serina
L-treonina
L-triptofano
116.60
0.05
0.417
311.80
0.0013
61.20
48.84
6996.00
62.50
71.02
0.432
4.45
147.5 7.50 6.65 31.29 17.56 7.35 365.00 18.75 31.48
54.47
59.05 91.25
17.24
35.48
17.25
26.25
53.45 9.02
1200.00
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L-tirosina
L-valina
Vitaminas
D(+)-biotina
D-pantotenato de calcio Cloruro de colina Acido folico Myo-inositol Nicotinamida Piridoxal •HCl Piridoxina • HCl Riboflavina Tiamina • HCl Timidina Vitamina B12 Otros Componentes D-glucosa anhidra Hipoxantina Acido DL-68-lipoico Acido linoleico Rojo de fenol Putrescina • 2HCI Piruvato de sodio
2.24
8.98
2.65
12.60
2.02
2.00
0.031
0.219
2.17
0.365
0.68
2.10
0.105
0.042
8.10
0.081
55.00
38.70
52.85
0.0035
3151.00
Ademas, el medio basal de la invencion se puede complementar con aditivos que se seleccionan del siguiente grupo:
- 0.1 a 5 mM de L-glutamina, preferiblemente entre 2 y 3 mM de L-glutamina:
- 0.05 a 2 mM de piruvato de sodio, preferiblemente entre 0.1 mM a 1 mM de piruvato de sodio;
- 0.1 a 2.5% de aminoacidos no esenciales, preferiblemente de aproximadamente 1 % de aminoacidos no esenciales;
- 0.1 a 2.5% de vitaminas, preferiblemente aproximadamente 1 % de vitaminas
- 0.05 a 5 mM de p-mercaptoetanol, de manera preferible aproximadamente 0.16 mM de p-mercaptoetanol;
- hidrolizado protefnico de origen no animal.
Para el establecimiento de celulas EBx® de pato de la invencion, el medio basal preferiblemente se complementa con hidrolizado protefnico de origen no animal. Los hidrolizados protefnicos de origen no animal se seleccionan del grupo que consiste de triptona de bacterias, triptona de levadura, hidrolizados vegetales tales como hidrolizados de soja o una mezcla de los mismos. En una realizacion preferida, los hidrolizados de protefna de origen no animal son hidrolizados de levadura. El termino "hidrolizado" incluye un digerido enzimatico de peptona soja o extracto de levadura. El hidrolizado se puede obtener de una pluralidad de preparaciones de peptona soja o extracto de levadura, respectivamente, las cuales pueden ser digeridas enzimaticamente de manera adicional (por ejemplo por papafna) y/o formadas por autolisis, termolisis y/o plasmolisis. Los hidrolizados tambien se pueden obtener comercialmente tal como Yeastolato, Hy-Soy, Hy-Yeast 412 y Hi-Yeast 444, de fuentes tales como SAFC BioSciences (anteriormente JRH) (Lenaxa, KA), Quest International (Norwich, N.Y.), OrganoTechnie S.A. (Francia) o Deutsche Hefewerke GmbH (Alemania). Las fuentes de extractos de levadura tambien se describen en el documento WO 98/15614. Las fuentes de extractos de levadura e hidrolizados de soja tambien se describen en el documento WO 00/03000. Los hidrolizados utilizados en los medios de la invencion preferiblemente se purifican de una fraccion cruda, debido a que las impurezas las cuales pueden interferir con un cultivo eficaz se eliminan preferiblemente durante esta purificacion, con lo que se mejora la consistencia del hidrolizado. La purificacion puede ser por ultrafiltracion en cromatograffa Shepadex (por ejemplo, con Sephadex G25 o Sephadex G10 o materiales equivalentes), cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion de tamano o cromatograffa en "fase inversa". Preferiblemente, la purificacion se realiza por ultrafiltracion utilizando un filtro de lfmite de 10 kDa. Estos procedimientos se conocen en el ambito. Utilizando estos metodos, se pueden seleccionar fracciones que contengan hidrolizado de soja o de levadura de peso molecular definido. Preferiblemente, el promedio de pesos moleculares de los hidrolizados de soja y levadura preferiblemente se encuentra entre aproximadamente 220 y 375 Da. Preferiblemente, el hidrolizado de levadura esta presente en el medio de cultivo celular. El hidrolizado de levadura 50X (aproximadamente 200 g/l) obtenido, por ejemplo de SAFC-BIOSCIENCES (Ref 58902C) esta presente en el medio de cultivo celular en una concentracion final que comprende entre aproximadamente 0.1X a 2X, de manera preferible aproximadamente 0.5X a aproximadamente 1X en el medio de cultivo. El hidrolizado de soja tambien se puede agregar al medio de cultivo celular. El hidrolizado de soja 50X obtenido, por ejemplo de SAFC-BIOSCIENCES (Ref 58903C) se agrega en una concentracion final que comprende entre aproximadamente 0.1X a 2X, de manera preferible aproximadamente 1X en el medio de cultivo. De manera alternativa, se puede agregar una mezcla de hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura al medio de cultivo celular como se describe en el documento US2004/0077086.
Un medio basal preferido es DMEM-HamF 12 que se complementa con L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoacidos no esenciales, 1% de vitaminas, p-mercaptoetanol 0.16 mM y opcionalmente con hidrolizado de levadura 1X.
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Mediante el termino "medio de cultivo completo" se quiere indicar un medio de cultivo basal complementado o no, preferiblemente un medio sintetico basal complementado con por lo menos un factor de crecimiento y suero animal. Un ejemplo de medios de cultivo completo se describe en los documentos WO 03/076601, WO 05/007840, EP 787180, US 6,114,168, US 5,340,740, US 6,656,479, US 5,830,510 y en Pain et al (1996, Development 122:2339-2348). De manera alternativa, el medio de cultivo completo puede ser un medio acondicionado, preferiblemente un medio acondicionado BRL. A modo de ejemplo, el medio acondicionado BRL se prepara de acuerdo con tecnicas reconocidas en el ambito tales como las descritas por Smith y Hooper (1987, Dev. Biol. 121:1-9). Las celulas BRL estan disponibles de ATCC, numero de acceso CRL-1442. El medio acondicionado puede ser complementado con factores de crecimiento exogenos y suero animal, como se describe a continuacion.
El termino "factores de crecimiento", como se utiliza en la presente significa factor de crecimiento necesario para la supervivencia y el crecimiento de celulas ES aviares no diferenciadas en cultivo en un medio de cultivo basal. Es posible distinguir esquematicamente dos familias de factores de crecimiento: Las citocinas y los factores troficos. Las citocinas son principalmente citocinas cuya accion es a traves de un receptor el cual se asocia con la protefna gp130. De esta manera el factor inhibidor de leucemia (LIF), la interleucina 11, la interleucina 6, el receptor de interleucina 6, el factor neurotrofico ciliar (CNTF), la oncostatina y cardiotrofina tienen un modo de accion similar con el reclutamiento a nivel de receptor de una cadena especffica y la combinacion de esta ultima con la protefna gp130 en forma monomerica o algunas veces heterodimerica. Los factores troficos son principalmente el factor de citoblastos (SCF), el factor 1 de crecimiento insulfnico (IGF-1) Y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), preferiblemente FGF basico (bFGF) o FGF humano (hFGF).
El medio de cultivo completo comprende medio de cultivo basal, preferiblemente medio sintetico basal y por lo menos una citocina cuya accion es a traves de un receptor al cual esta asociado con la protefna gp130 y/o por lo menos un factor trofico. Preferiblemente, el medio de cultivo completo comprende medio basal y por lo menos un factor de crecimiento que se selecciona del grupo que consiste de factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina, cardiotrofina, factor 1 de crecimiento insulfnico (lGF-1), factor neurotrofico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor de citoblastos (SCF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), interleucina 11 (IL-11). De acuerdo con una primera realizacion preferida, el medio de cultivo completo es medio basal complementado con suero animal y con por lo menos IGF-1 y CNTF. De acuerdo con una segunda realizacion preferida, el medio de cultivo completo es medio basal complementado con suero animal y por lo menos IGF-1, CNTF, IL-6 e IL-6R. De acuerdo con una tercera realizacion preferida, el medio de cultivo completo es medio basal complementado con suero animal y por lo menos IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF. De acuerdo con otra realizacion, el medio de cultivo completo es un medio de cultivo acondicionado que comprende factores de crecimiento (es decir, expresados por celulas BRL o STO, por ejemplo) y opcionalmente complementado con por lo menos uno de los factores de crecimiento exogenos que se seleccionan del grupo que consiste de LIF, IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11. La concentracion de los factores de crecimiento IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11 en el medio basal o en el medio de cultivo acondicionado esta comprendido entre aproximadamente 0.01 y 10 ng/ml, de manera preferible 0.1 a 5 ng/ml y de manera mas preferible de aproximadamente 1 ng/ml.
El medio de cultivo tambien comprende ademas de antibioticos tales como por ejemplo gentamicina, penicilina y estreptomicina para evitar contaminacion bacteriana. Los antibioticos se pueden agregar al medio de cultivo en los pases tempranos de cultivo de celulas ES. Por ejemplo, se pueden agregar al medio de cultivo gentamicina en una concentracion final de 10 ng/ml, penicilina en una concentracion final de 100 U/mI y estreptomicina en una concentracion final de 100 pg/ml. En una realizacion preferida no se agregan antibioticos al medio de cultivo durante las etapas finales del procedimiento de establecimiento de lfneas celulares de pato diploides continuas de la invencion.
Durante el procedimiento de establecimiento de celulas de pato de la invencion, las celulas se cultivan sobre una capa de celulas alimentadoras. De manera mas preferible, las celulas alimentadoras con celulas animales o lfneas celulares cultivadas con el proposito de cultivar celulas ES aviares. De manera alternativa, las celulas alimentadoras se pueden sustituir con matriz extracelular mas factores de crecimiento unidos. La matriz alimentadora posteriormente se denominara como celulas alimentadoras o matriz extracelular. Una matriz alimentadora, como se utiliza en la presente se construye de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica. Como se indica en lo anterior, se prefiere que la matriz alimentadora este preacondicionada. Mediante el termino "preacondicionada" se quiere indicar que la matriz alimentadora se cultiva en presencia de medio por un perfodo de tiempo antes de la deposicion de las celulas que se originan del disco de blastodermo de huevos aviares fertilizados en contacto con la matriz alimentadora, por ejemplo un tiempo suficiente para iniciar y establecer la produccion, por ejemplo de factores de crecimiento u otros factores por la matriz alimentadora; habitualmente, la matriz alimentadora se preacondiciona al cultivar la matriz alimentadora por si misma durante uno o dos dfas antes de la deposicion de las celulas que se originan del disco del blastodermo de los huevos aviares fertilizados en contacto con la matriz alimentadora. Preferiblemente, las celulas alimentadoras comprenden celulas de fibroblasto de raton. Se prefieren fibroblastos STO, pero tambien son adecuados fibroblastos primarios. Ademas, aunque el presente proceso se ha descrito con respecto al uso de matrices alimentadoras de celulas de raton, se contempla que las matrices alimentadoras que comprenden celulas de otras especies murinas (por ejemplo rata); otras especies de mamffero (por ejemplo especies de ungulados, bovinos o porcinos); o especies aviares (por ejemplo Gallinacea, pollo, pavo, pato, ganso, codorniz, faisan) tambien pueden ser utilizadas. En otra realizacion, las celulas alimentadoras de la invencion se pueden transfectar con uno o varios vectores de expresion que permiten, por ejemplo, la expresion constitutiva de factores
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de crecimiento tales como SCF aviar en celulas STO. De esta manera, este "alimentador" produce el factor en una forma la cual es soluble y/o se unen la membrana plasmatica de las celulas. De esta manera, el procedimiento de cultivo de la presente solicitud opcionalmente puede comprender establecer una monocapa de celulas alimentadoras. Las celulas alimentadoras se inactivan mitoticamente utilizando tecnicas estandar o convencionales. Por ejemplo, las celulas alimentadoras se pueden exponer a rayos X o radiacion gamma (por ejemplo 4000 Rads de radiacion gamma) o se pueden tratar con mitomicina C (por ejemplo 10 pg/mI durante 2-3 horas). Los procedimientos para inactivar mitoticamente celulas tambien se describen detalladamente en la informacion enviada tfpicamente con celulas desde la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas. Va 20110-2209 (por ejemplo las celulas alimentadoras STO estan disponibles bajo ATCC, numero de acceso 1503). Opcionalmente, las mono capas se pueden cultivar hasta aproximadamente 80% de confluencia, preferiblemente a aproximadamente 90% de confluencia y de manera mas preferible aproximadamente 100% de confluencia. Aunque la configuracion de las celulas alimentadoras como una mono capa es la configuracion preferida para el cultivo, se contempla que cualquier configuracion adecuada este dentro del alcance de la presente invencion. Asf, por ejemplo, las capas, monocapas, conjuntos, agregados u otras asociaciones o dentro del alcance del presente proceso y se contemplan particularmente para que se encuentren dentro del significado del termino "matriz".
El medio de cultivo se suplementa con suero animal. El suero animal que se utiliza preferiblemente es suero animal fetal. Se prefiere suero bovino fetal. Ademas, aunque el presente proceso se ha descrito con respecto al uso de suero bovino fetal, se contempla que tambien se puede utilizar suero animal que comprende suero de otras especies animales (por ejemplo pollos, caballos, porcinos, ungulados, etc.). La concentracion final de suero animal en el medio de cultivo comprende entre aproximadamente 1 y 25%, de manera preferible entre 5% y 20%, de manera mas preferible entre 8% y 12%. En la realizacion preferida, la concentracion final de suero animal en el medio de cultivo es de aproximadamente 10%. De acuerdo con una realizacion preferida, el medio de cultivo comprende aproximadamente 10% de suero bovino fetal.
El ave de la presente invencion se selecciona del orden de los Anseriformes y es un pato, de manera mas preferible un pato pequines y de manera mucho mas preferible un pato pequines cepa M14 o GL30. De acuerdo con una segunda realizacion preferida, el ave de la presente invencion es un pato Muscovy. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un primer procedimiento para obtener lfneas celulares de pato diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pato no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar los embriones de pato en oviposicion (es decir, cuando se ponen los huevos) o ligeramente antes o despues de la oviposicion. Opcionalmente, el huevo se puede incubar, habitualmente durante la noche para que madure (es decir, pato Muscovy);
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pato obtenidos al disociar embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con factor 1 de crecimiento insulfnico (lGF-1), factor neurotrofico ciliar (CNTF), interleucina 6 (lL-6), receptor de interleucina 6 (lL-6R), factor de citoblastos (SCF) y factor de crecimientos de fibroblastos (FGF) en suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pato durante por lo menos 1 pase;
d) extraer todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo sobre un intervalo de 1 a aproximadamente 15 pases, de manera preferible simultaneamente sobre un pase, y cultivar adicionalmente las celulas ES de pato durante por lo menos un pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo, desde un pase a otro, de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total del suero animal despues de varios pases; y
h) obtener lfneas celulares de pato adherentes derivadas de celulas ES, denominadas EBx® de pato capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, una capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lfneas celulares de pato diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lfneas celulares de pato adherentes a condiciones de cultivo de suspension.
Los aditivos para el medio basal se retiran durante el procedimiento y preferiblemente entre las etapas f) y g) o
entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de factor 1 de crecimiento insulfnico (IGF-1), factor neurotrofico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de interleucina 6 (IL-6R), factor de celulas madre (SCF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) preferiblemente es de aproximadamente 1 ng/ml.
La presente solicitud tambien proporciona un segundo procedimiento para obtener lfneas celulares de pato diploides continuas a partir de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pato no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
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a) aislar los embriones de pato en oviposicion (es decir, cuando se pone el huevo) o ligeramente antes o despues
de la oviposicion. Opcionalmente, el huevo se puede incubar, habitualmente durante la noche para que madure (es decir, pato Muscovy);
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pato obtenidos al disociar embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF en suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pato durante por lo menos 1 pase;
d) retirar todos los factores de crecimiento seleccionados entre el grupo que comprende IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo durante un intervalo de 1 a aproximadamente 15 pases, preferentemente simultaneamente en un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pato durante al menos un pase;
e) retirar los factores de crecimiento IGF-1 y CNTF del medio de cultivo durante un intervalo de 1 a aproximadamente 15 pases, de manera preferible simultaneamente sobre un pase, y cultivar adicionalmente las celulas ES de pato durante por lo menos 1 pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se
obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro del suero animal despues de varios pases; y
h) obtener lfneas celulares de pato adherentes derivadas de celulas ES, denominadas EBx® de pato capaces de
proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lfneas celulares aviares diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lfneas celulares de pato EBx® adherentes a condiciones de
cultivo de suspension. Los aditivos para el medio basal se retiran durante el procedimiento y preferiblemente entre las etapas f) y g) o entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de IGF -1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF es preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml.
La presente solicitud tambien proporciona un tercer procedimiento para obtener lfneas celulares de pato diploides continuas a partir de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pato no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar los embriones de pato en oviposicion (es decir, cuando se pone el huevo) o ligeramente antes o despues
de la oviposicion. Opcionalmente, el huevo se puede incubar, habitualmente durante la noche para que madure (es decir, pato Muscovy);
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pato obtenidos al disociar embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con el factor 1 de crecimiento insulfnico (IGF-1) y el factor neurotrofico ciliar (CNTF) y suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pato durante por lo menos 1 pase;
d) retirar los factores de crecimiento IGF-1 y CNTF del medio de cultivo durante un intervalo de 1 a aproximadamente 15 pases, preferentemente simultaneamente en un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pato durante al menos un pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se
obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pases y cultivar adicionalmente las celulas; eliminacion de aditivos?
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro del suero animal despues de varios pases; y
h) obtener lfneas celulares de pato adherentes derivadas de celulas ES, denominadas EBx® de pato capaces de
proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lfneas celulares aviares diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lfneas celulares de pato EBx® adherentes a condiciones de
cultivo de suspension.
Los aditivos para el medio basal se retiran durante el procedimiento y preferiblemente entre las etapas f) y g) o entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de IGF -1 y CNTF es preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml.
Una vez que se han obtenido lfneas celulares de pato adherentes o en suspension, el procedimiento tambien comprende la etapa adicional de adaptar las celulas de pato EBx® al crecimiento en medio de cultivo celular sin hidrolizado de protefnas de origen no animal tal como hidrolizados de levadura.
Preferiblemente, las lfneas celulares de pato EBx® de la invencion no muestran actividad de transcriptasa inversa por
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analisis Q-PERT. Ademas no se producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse por celulas de pato EBx®, como se demuestra por los experimentos de co-cultivo de celulas de pato EBx® de la invencion con celulas capaces de replicarse ALV tales como celulas QT6 de codorniz o celulas DF1 de pollo. Ademas el analisis por microscopia electronica de transmision (TEM) tambien demuestra la ausencia de partfculas de retrovirus endogenas capaces de replicarse en celulas de pato EBx®. Preferiblemente, la lfnea de celulas de pato EBx® de la invencion se selecciona de entre las lfneas de pato EB24, de pato EB26 y de pato EB66, como se describen posteriormente.
La solicitud tambien describe que el ave se selecciona del orden de Galliformes, y de manera mas preferible es un pollo, preferiblemente un pollo domestico ev-0 (Gallus gallus subespecie domesticus). Por lo tanto la presente invencion describe un procedimiento para obtener lfneas celulares de pollo domestico ev-0 diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pollo domestico ev-0 no producen partfculas de retrovirus ALV-E endogeno capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar embriones de pollo domesticos ev-0 en oviposicion (es decir, en el momento de puesta del huevo) o ligeramente antes o despues de la oviposicion;
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pollo domesticos ev-0 obtenidos por disociacion de embriones de la etapa a) en medio de cultivo basal complementado con IGF -1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF y suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pollo domesticas ev-0 durante por lo menos 1 pase;
d) retirar todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo sobre una gama de 1 a aproximadamente 15 pases, preferiblemente de manera simultanea sobre un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pollo durante por lo menos un pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de suero animal despues de varios pases y;
h) obtener lfneas celulares de pollo domestico ev-0 adherentes derivadas de celulas ES, denominadas EBx ev-0, capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lfneas celulares aviares diploides continuas no producen partfculas de retrovirus endogeno ALV-E capaces de replicarse;
i) opcionalmente, adaptar de manera adicional las lfneas celulares aviares EBx ev-0 adherentes a condiciones de cultivo en suspension.
Los aditivos al medio basal se retiran durante el procedimiento y de manera preferible entre las etapas f) y g) o entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF es preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml.
La presente solicitud tambien describe un segundo procedimiento para obtener lfneas celulares de pollo domestico ev-0 diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES), en donde las lfneas celulares de pollo domestico ev-0 no producen partfculas de retrovirus ALV-E endogeno capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar embriones de pollo domesticos ev-0 en oviposicion (es decir, en el momento de poner el huevo) o ligeramente antes o despues de la oviposicion;
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pollo domesticos ev-0 obtenidos por disociacion de embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con IGF-l, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF y suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pollo domesticas ev-0 durante por lo menos 1 pase;
d) retirar todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IL-6, IL-6R, SCF, FGF del medio de cultivo sobre una gama de 1 a aproximadamente 15 pases, preferiblemente de manera simultanea sobre un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pollo durante por lo menos un pase;
e) retirar los factores de crecimiento IGF-1 y CNTF del medio de cultivo durante un intervalo de 1 a aproximadamente 15 pases, preferiblemente de manera simultanea sobre un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pollo domestico ev-0 durante por lo menos un pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total del suero animal despues de varios pases; y
h) obtener lfneas celulares de pollo domestico ev-0 adherentes derivadas de celulas ES, capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lfneas celulares de pollo domestico ev-0 diploides continuas, llamadas EBx® de pollo no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
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i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lineas celulares de pollo domestico ev-0 adherentes a condiciones de cultivo en suspension.
Los aditivos para el medio basal se retiran durante el procedimiento y preferiblemente entre las etapas f) y g) o entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF preferiblemente es de aproximadamente 1 ng/ml.
La presente solicitud tambien describe un tercer procedimiento para obtener lineas celulares de pollo domestico ev-0 diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES), en donde las lineas celulares de pollo domestico ev-0 no producen partfculas de retrovirus ALV-E endogeno capaces de replicarse, y el procedimiento comprende las etapas de:
a) aislar embriones de pollo domesticos ev-0 en oviposicion (es decir, en el momento de poner el huevo) o ligeramente antes o despues de la oviposicion;
b) suspender los embriocitoblastos (ES) de pollo domesticos ev-0 obtenidos por disociacion de embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal complementado con IGF-1, y CNTF y suero animal;
c) sembrar la suspension de celulas ES obtenidas en la etapa b) sobre una capa de celulas alimentadoras y cultivar adicionalmente las celulas ES de pollo domesticas ev-0 durante por lo menos 1 pase;
d) retirar todos los factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que comprende IGF-1 y CNTF del medio de cultivo sobre una gama de 1 a aproximadamente 15 pases, preferiblemente de manera simultanea sobre un pase y adicionalmente cultivar las celulas ES de pollo domesticas ev-0 durante por lo menos un pase;
f) progresivamente disminuir la concentracion de celulas alimentadoras en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total de la capa alimentadora despues de varios pases, preferiblemente despues de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 pases y cultivar adicionalmente las celulas;
g) de manera opcional, disminuir progresivamente la concentracion de suero animal en el medio de cultivo de manera que se obtenga un retiro total del suero animal despues de varios pases; y
h) obtener lineas celulares de pollo domestico ev-0 adherentes derivadas de celulas ES, llamadas EBx® ev-0 de pollo capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, capa alimentadora opcionalmente sin suero animal y en donde las lineas celulares de pollo domestico ev-0 diploides continuas no producen partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse;
i) de manera opcional, adaptar adicionalmente las lineas celulares de pollo domestico ev-0 adherentes a condiciones de cultivo en suspension.
Los aditivos para el medio basal se retiran durante el procedimiento y preferiblemente entre las etapas f) y g) o entre las etapas g) y h).
La concentracion de suero animal en la etapa b) preferiblemente es de 5 a 10%. La concentracion de IGF-1 y CNTF es preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml.
La solicitud tambien describe que el ave es un pollo domestico (Gallus Gallus subespecie domesticus) que se obtiene de una parvada libre de patogeno especffico (SPF). De manera mas preferible, la cepa de pollo es White-Leghorn. Los huevos de pollo SPF se han sometido a analisis sistematico para determinar la ausencia de patogenos bacterianos y virus de pollo conocidos que incluyen el virus de reticuloendoteliosis (REV) y el virus de leucosis exogena aviar (ALV-A, aLV-B, ALV-C, ALV-D, ALV-J). El huevo SPF de la invencion pueden ser huevos VALO de LOHMANN (Cuxhaven, Alemania) o huevos L22 de CHARLES RIVER (Spafas). Por lo tanto, la presente solicitud tambien describe procedimientos para obtener lineas celulares de pollo diploides continuas derivadas de embriocitoblastos (ES) obtenidas de huevos de pollo SPF como las descritas en huevos de pollo ev-0. Preferiblemente, la lfnea de celulas EBx® de pollo obtenida de huevos SPF es EBv13.
Las lineas celulares EBx® de pollo pueden mostrar actividad de transcriptasa inversa por analisis Q-PERT pero sin producir partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicacion. La ausencia de partfculas retrovfricas endogenas capaces de replicarse se puede demostrar por experimentos co-cultivo de celulas EBx® ev-0 de pollo de la invencion con celulas capaces de replicacion de ALV tales como celulas QT6 de codorniz o celulas DF1 de pollo. Ademas, la ausencia de partfculas retrovfricas endogenas en celulas EBx® ev-0 de pollo tambien se puede demostrar por TEM.
La temperatura corporal del ave habitualmente es de aproximadamente 39°C. Por lo tanto, los procedimientos tambien pueden comprender la etapa adicional de disminuir la temperatura de cultivo celular a 37°C con el fin de adaptar las lineas celulares aviares de la invencion para que crezcan a 37°C. Preferiblemente, la adaptacion de temperatura se realiza despues de supresion del alimentador y antes de la supresion del suero. De manera alternativa, la adaptacion de temperatura se realiza despues de la etapa de supresion de suero o despues de la etapa de adaptar las lineas celulares a cultivo de suspension.
Las lineas EBx establecidas tienen la caracterfstica de crecer ya sea como celulas adherentes o como celulas en suspension en un medio de cultivo libre de factores de crecimiento exogenos y suero animal, y sin celulas alimentadoras. Se pueden utilizar diferentes tecnicas solas o combinadas para adaptar las celulas a cultivo en suspension, entre estos:
- se siembran celulas adherentes a una alta densidad celular, ligeramente por encima de la confluencia celular
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para obligar a las celulas a que se encuentren en suspension;
- se siembran celulas adherentes en un medio de cultivo celular con una baja concentracion de suero animal;
- se siembran celulas adherentes sobre recipientes de cultivo celular elaborados de plastico que no permitan la adhesion celular o que produzcan una adhesion celular debil, tales como recipientes bacterianos y placas y placas de union ultrabaja desarrollados por companfas como Corning (recipientes y placas de cultivo de tejido Ref. 3262, 3473, 3471, 3474; matraces referencia 3814 ... ) o Sarstedt (matraz, referencia 831810502 ... );
- se siembran celulas adherentes sobre el recipiente y se cultivan bajo agitacion (aproximadamente 50 rpm).
Las celulas EBx®, preferiblemente EBx® de pato y EBx® ev-0 de pollo se pueden cultivar in vitro durante un perfodo de tiempo considerable. Ventajosamente, las celulas EBx® adherentes o independientes de anclaje (es decir, en "suspension") obtenidas por el procedimiento de la invencion son capaces de proliferar durante por lo menos 50 generaciones, por lo menos 75 generaciones, por lo menos 100 generaciones, por lo menos 125 generaciones, por lo menos 150 generaciones, por lo menos 175 generaciones, por lo menos 200 generaciones, por lo menos 250 generaciones. Se entiende que la expresion "lfnea" significa cualquier poblacion de celulas capaces de proliferar indefinidamente en cultivo in vitro y al mismo tiempo retienen en mayor o menor grado las mismas caracterfsticas morfologicas y fenotfpicas. Se pueden obtener clones, por ejemplo, por dilucion limitada de celulas EBx® de la invencion. Estos clones son celulas las cuales son geneticamente identicas a la celula de la cual se derivan, por division.
La presente invencion tambien se relaciona con lfneas celulares aviares diploides continuas, denominadas EBx®, que se pueden obtener por el procedimiento de la invencion, dichas celulas EBx® con pequenas, redondas (es decir, con un diametro aproximado de 10 um) e individualizadas con un tiempo de duplicacion de aproximadamente 30 horas o menos a 37°C o 39°C. Las celulas EBx® aviares, preferiblemente EBx® de pato o EBx® ev-0 de pollo, expresan un fenotipo de embriocitoblasto con las siguientes caracterfsticas:
- una relacion alta nucleo-citoplasma,
- actividad de telomerasa endogena,
- opcionalmente, puede no expresar uno o mas marcadores ES adicionales tales como fosfatasa alcalina, marcadores SSEA-1, EMA-1 y ENS1.
- un tiempo de duplicacion mas corto que el tiempo de duplicacion de celulas ES aviares de la etapa a) del procedimiento de la invencion (48 ha 72 ha 39°C) de aproximadamente 30 horas o menos (preferiblemente 24 horas) a 37°C.
Dichas celulas no producen partfculas de retrovirus endogenas capaces de replicarse.
Las lfneas celulares EBx® de pato de la invencion son capaces de proliferar indefinidamente en un medio basal, en particular en un medio tal como el medio SAFC Excell, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 o McCoy, libre de factores de crecimiento endogenos, suero y/o una capa de alimentacion inactivada, opcionalmente complementada con varios aditivos usados comunmente para personas expertas en la tecnica. Los ejemplos de aditivos son aminoacidos no esenciales, vitaminas, piruvato de sodio y antibioticos. Las celulas EBx® de pato de la invencion tienen una caracterfstica notable para crecer en un medio de cultivo basal que no se complementa con glutamina.
La presente solicitud tambien describe un medio de cultivo celular para mantener embriocitoblastos aviares pluripotentes o multipotentes, preferiblemente embriocitoblastos (ES) de pato pluripotentes o multipotentes en cultivo en un estado no diferenciado. De acuerdo con una realizacion preferida, la presente solicitud describe un medio de cultivo para embriocitoblastos de pato que comprende un medio de cultivo basal, complementado con suero animal y suplementado con por lo menos IGF-1 y CNTF. De acuerdo con una segunda realizacion preferida, la presente solicitud describe un medio de cultivo celular para embriocitoblastos de pato que comprende un medio de cultivo basal complementado con suero animal y complementado con por lo menos IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R. De acuerdo con una tercera realizacion preferida, la presente solicitud describe un medio de cultivo celular para embriocitoblastos de pato que comprende un medio de cultivo basal complementado con suero animal y complementado con por lo menos IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF. Dichos medios son suficientes para el mantenimiento de celulas ES de pato en cultivo durante por lo menos 7 dfas, preferiblemente durante por lo menos 20 dfas, de manera preferible por lo menos 100 dfas en un estado no diferenciado. Dicho medio de cultivo de la invencion puede comprender ademas, de manera opcional, por lo menos un compuesto que se selecciona del grupo que comprende interleucina-11, cardiotrofina, oncostatina y factor inhibidor de leucemia (LIF). Preferiblemente, dicho medio de cultivo comprende ademas hidrolizado de protefna de origen no animal, como se ha descrito previamente, de manera mas preferible es hidrolizado de levadura a una concentracion 1X. El medio de cultivo de celulas ES aviares (preferiblemente de pato) de la invencion puede comprender ademas una capa de celulas alimentadoras.
La presente invencion por lo tanto proporciona un cultivo de celulas ES de pato sostenido que consiste esencialmente de celulas ES de pato no diferenciadas que expresan el fenotipo de citoblastos con las siguientes caracterfsticas:
- una relacion alta nucleo-citoplasma,
- actividad de telomerasa endogena,
- opcionalmente, las celulas ES de pato pueden expresar uno o mas marcadores ES adicionales tales como los marcadores de fosfatasa alcalina, SSEA-l, EMA-1 y ENS 1,
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- un tiempo de duplicacion de aproximadamente alrededor de 40 horas a 37°C o 39°C.
Dichas celulas de pato no diferenciadas son capaces de mantener el fenotipo de citoblastos cuando crecen sorbe celulas alimentadoras en un medio de cultivo celular para embriocitoblastos de pato, como se ha descrito previamente. Dichas celulas de pato no diferenciadas son utiles para producir patos quimericos o transgenicos.
Por lo tanto, la solicitud invencion tambien describe un metodo para obtener un pato quimerico, el metodo comprende las etapas de:
a) introducir un cultivo de celulas ES de pato sostenido como se describe en lo anterior en la cavidad sub germinal de un embrion de pato receptor; y
b) incubar el embrion obtenido en la etapa a) para que eclosione como un pato pequeno;
c) seleccionar el pato pequeno quimerico que comprende celulas meteorologas que han colonizado al pato pequeno.
La presente solicitud tambien describe un metodo para obtener un pato quimerico geneticamente modificado, que comprende las etapas de:
a) introducir celulas ES de pato modificadas geneticamente como se describe en lo anterior en la cavidad sub germinal de un embrion de pato receptor; y
b) incubar el embrion obtenido en la etapa a) para que eclosione como un pato pequeno;
c) seleccionar el pato pequeno quimerico que comprende celulas heterologas modificadas geneticamente que han colonizado al pato pequeno.
La presente solicitud tambien describe un metodo para obtener una descendencia del pato pequeno quimerico en donde el metodo comprende las siguientes etapas:
a) permitir que el pato pequeno quimerico seleccionado obtenido en la etapa c) madure como un ave adulta;
b) criar al ave adulta que tiene celulas heterologas en el mismo para de esta manera producir descendencia del ave;
c) seleccionar las aves de interes en la descendencia.
El procedimiento puede comprender la etapa adicional de expresar un polipeptido heterologo codificado por un vector de expresion comprendido en las celulas ES de pato modificadas geneticamente. Preferiblemente, el polipeptido heterologo se suministra en el fluido biologico del pato, tal como suero, esperma, orina o la clara de un huevo aviar en desarrollo producida por una hembra del pato modificado geneticamente.
Las celulas EBx® de la invencion tienen todas las caracterfsticas mencionadas antes y son utiles para la produccion de sustancias biologicas tales como vacunas antivfricas y peptidos y protefnas recombinantes.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para replicar un virus en lfneas celulares EBx® aviares diploides continuas de la invencion. De manera mas preferible, la invencion proporciona un procedimiento para replicar un virus en lfneas celulares EBx® aviares diploides continuas de la invencion, preferiblemente lfneas celulares EBx® de pato o pollo, que comprende las etapas de:
- infectar un cultivo de celulas EBx® aviar con un virus de interes; las celulas EBx® aviares preferiblemente se cultivan en un medio libre de suero animal;
- cultivo de celulas EBx® aviares infectadas con el fin de replicar el virus;
- cosechar el virus en sobrenadante de cultivo celular y/o dentro de las celulas.
De acuerdo con una realizacion preferida, el procedimiento comprende las etapas de:
a) proliferar EBx® aviar en un recipiente de cultivo, en suspension, en un medio libre de suero No. 1;
b) infectar las celulas con el virus seleccionado cuando la densidad celular sea de por lo menos 1.5 millones de celulas/mI;
c) opcionalmente, poco antes de la infeccion, simultaneamente la infeccion o poco despues de la infeccion, agregar al cultivo celular el medio libre de suero No. 2; y
d) cultivar adicionalmente las celulas infectadas con el fin de permitir la replicacion del virus; y
e) opcionalmente, cosechar el virus.
Dicho procedimiento de la invencion puede comprender la etapa adicional de agregar enzima proteo lftica del medio de cultivo en condiciones que permiten la propagacion del virus. La enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste de tripsina, quimiotripsina, termolisina, pepsina, pancreatina, papafna, pronasa, subtilisina A, elastasa, furina y carboxipeptidasa. De acuerdo con una realizacion preferida, la enzima es tripsina. Preferiblemente, la enzima proteolftica es una protefna recombinante producida por un hospedador procariotico o en plantas (es decir, tripzean). La enzima proteolftica se puede agregar antes, durante y/o despues de la infeccion por el' virus. Preferiblemente, la adicion de la enzima proteolftica se realiza despues de la infeccion por el virus. La adicion de la enzima proteolftica en el medio de cultivo se puede llevar a cabo una vez al dfa, mas de una vez al dfa o menos de una vez al dfa, hasta la cosecha del virus.
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El termino "virus", como se utiliza en la presente, incluye no solo los virus que se encuentran de manera natural sino tambien virus atenuados, virus reagrupados, cepas de vacuna asf como virus recombinantes y vectores vmcos derivados de los mismos. Los virus de la invencion preferiblemente se seleccionan del grupo que comprende los poxvirus, ortomixovirus, paramixovirus, virus de herpes, hepadnavirus, adenovirus, parvovirus, reovirus, circovirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, birnavirus y los retrovirus.
En una realizacion preferida, los virus, los vectores vmcos relacionados, las partfculas vmcas y las vacunas vmcas pertenecen, a la familia de poxviridae, y de manera mas preferible a cordopoxviridae. En una realizacion, los virus o los vectores vmcos relacionados, las partmulas vmcas y las vacunas antivmcas son un poxvirus, preferiblemente un avipoxvirus que se selecciona de entre el virus de viruela aviar (es decir TROVAC), el virus canaripox (es decir, ALVAC), el virus juncopox, el virus minahpox, el virus pigeonpox, el virus psittacinepox, cualipoxvirus, sparrowpoxvirus, el poxvirus starling, y el virus turkeypox. De acuerdo con otra realizacion preferida, el virus es un virus de variolovacuna que se selecciona de la cepa de virus de variolovacuna Lister-Elstree, virus de variolovacuna modificado tal como el virus de variolovacuna modificado Ankara (MVA), el cual se puede obtener de ATCC (ATCC, No. VR-1508), NYV AC (Tartaglia et a1., 1992, Virology, 188:217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine, 12:675-681), CVI78 (Kempe et al., 1968, Pediatrics 42:980-985) y otros virus de variolovacuna recombinantes o no recombinantes.
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vmcos relacionados, las partfculas vmcas y las vacunas pertenecen a la familia ortho-myxoviridae, en particular el virus de la influenza. El virus de la influenza se selecciona del grupo que consiste de virus de la influenza humana, virus de influenza aviar, virus de influenza equina, virus de influenza porcina y virus de influenza felina. El virus de la influenza preferiblemente se selecciona en las cepas A, B y C. Entre las cepas A uno puede mencionar virus con diferentes subtipos de hemaglutinina y neuraminidasa tales como, sin limitacion H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2 H7N7 et H9N2. Entre las cepas H1N1 se pueden mencionar A/Porto Rico/8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/JohannesburgI282/96, A/Texas/36/91, A/Singapore, A/Solomon Islands/03/2006. Entre las cepas H3N2, uno puede mencionar A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94, A/Wisconsin/10/04. Entre las cepas B uno puede mencionar, sin limitacion B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Viena/1/99, B/Ann Arborll/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98, B/JiangsuI/10/03, B/Malaysia. El virus de influenza de la invencion se selecciona de entre virus de tipo silvestre, aislado vmco primario que se obtiene de virus recombinante individual infectado, virus atenuado, virus sensible a la temperatura, virus adaptado a baja temperatura, virus reagrupado, virus manipulado por genetica inversa. Cuando el virus de la invencion es virus de influenza, el procedimiento del medio de cultivo en condiciones que permiten la propagacion del virus. De acuerdo con una realizacion preferida, la enzima es tripsina. La concentracion final de tripsina en el medio de cultivo celular comprende entre aproximadamente 0.01 pg/ml hasta 10 pg/ml. De manera mas preferible, la concentracion final de tripsina en el medio de cultivo celular esta comprendido entre 0.01 y 10 usp/ml (usp: unidad de farmacopea de E. U .A.), preferiblemente de aproximadamente entre 0.05 y 2 usp/ml, y de manera mas preferible de aproximadamente entre 0.3 y 1 usp/ml, y de manera mucho mas preferible de aproximadamente 0.75 usp/ml.
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vmcos relacionados, las partmulas vmcas y las vacunas pertenecen a la familia paramyxoviridae. Preferiblemente, el virus es un paramixovirus que se encuentra de manera natural o un paramixovirus recombinante que se selecciona del grupo que comprende el virus de sarampion, el virus de paperas, el virus de rubeola, el virus Sendai, el virus sincicial respiratorio (RSV), los virus de parainfluenza humana tipos I y III, el virus Rinderpest, el virus de malestar canino, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus de para-influenza de patos. De acuerdo con una realizacion preferida, el virus es un virus de sarampion o un virus de sarampion recombinante. De acuerdo con otra realizacion preferida, el virus es el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) o un NDV recombinante. Un ejemplo de la cepa NDV es la cepa LaSota. Cuando el virus de la invencion es NDV, el procedimiento de la invencion comprende preferiblemente la etapa adicional de agregar
enzima proteolttica al medio de cultivo en condiciones que permiten la propagacion del virus. De acuerdo con una realizacion preferida, la enzima es tripsina. La concentracion final de tripsina en el medio de cultivo celular comprende entre aproximadamente 0.01 pg/ml y 10 pg/ml. De manera mas preferible, la concentracion final de tripsina en el medio de cultivo celular esta comprendido entre 0.01 y 10 usp/ml (usp: unidades de la farmacopea de E.U.A.), de manera preferible de aproximadamente entre 0.3 y 1 usp/ml, de manera mas preferible aproximadamente entre 0.4 y 0.75 usp/ml. De manera interesante, las lmeas celulares EBx® de la invencion que pueden crecer en adherencia son utiles para realizar titulacion de virus y preferiblemente titulacion de NDV o un analisis en placa. En realidad, a diferencia de los CEF y los fibroblastos DF1 de pollo para los cuales no es posible observar ningun efecto citopatico, el crecimiento de virus en celulas EBx® genera la formacion de celulas gigantes caractensticas. Se pueden determinar partfculas vmcas NDV por analisis de hemaglutinacion. Por lo tanto, la invencion tambien describe el uso de celulas EBx® de la invencion para la titulacion de virus, tales como el virus NDV.
En otra realizacion preferida, los virus, vectores vmcos relacionados, partfculas vmcas y vacunas pertenecen a la familia togaviridae. Preferiblemente, el virus es un alfavirus que se encuentra de manera natural o un alfavirus recombinante que se selecciona del grupo que consiste del virus Sinbis, el virus Sernliki forest, el virus O'nyong'nyong, el virus Chikungunya, el virus Mayaro, el virus Ross river, el virus de encefalitis equina oriental, el virus de encefalitis equina occidental y el virus de encefalitis equina venezolana.
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vmcos relacionados, las partfculas vmcas y las vacunas
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pertenecen a la familia herpesviridae. Preferiblemente, el virus es el virus de la enfermedad de Marek que se presenta de manera natural o un virus de enfermedad de Marek recombinante. El virus de la enfermedad Marek (MDV) preferiblemente se selecciona de entre las cepas de vacuna de licencia de MDV tales como: FC 126 (HTV), SB-1, 301B/1, CVI988 Clone C. CV1988/C/R6, CVI988/Rispens, R2/23 (Md11/75).
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vfricos, las partfculas vfricas y las vacunas pertenecen a la familia hepadnaviridae. Preferiblemente, el virus es un hepadnavirus que se presenta de manera natural, el cual se presenta de manera natural o un hepadnavirus recombinante, que preferiblemente se selecciona de entre hepadnavirus aviar y humano. El hepadnavirus aviar preferiblemente se selecciona de entre el grupo que consiste de virus hepatitis B de pato (DHBV), virus de hepatitis B de garza (HHBV) y del ganso de la nieve (SGHBV).
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vfricos relacionados, las partfculas vfricas y las vacunas pertenecen a la familia birnaviridae, en particular el virus de la enfermedad Bursal infecciosa.
En otra realizacion preferida, el virus, los vectores vfricos relacionados, las partfculas vfricas y las vacunas pertenecen a la familia de flaviviridae, en particular el virus del dengue, virus de encefalitis japonesa y virus del nilo occidental.
En otra realizacion preferida, el virus, los vectores vfricos relacionados, las partfculas vfricas y las vacunas pertenecen a la familia de coronaviridae, en particular el virus de bronquitis infecciosa.
En otra realizacion preferida, los virus, vectores vfricos relacionados, partfculas vfricas y vacunas pertenecen a la familia circoviridae, en particular virus de anemia de pollo.
En otra realizacion preferida, los virus, vectores vfricos relacionados, las partfculas vfricas y vacunas pertenecen a la familia retroviridae. Preferiblemente, el virus es un retrovirus como se encuentra de manera natural que se selecciona de entre el virus de retfculo-endoteliosis, virus de anemia infecciosa de pato, virus de necrosis del bazo de pato o un retrovirus recombinante de los mismos.
En otra realizacion preferida, los virus, vectores vfricos relacionados, partfculas vfricas y vacunas pertenecen a la familia de parvoviridae. Preferiblemente, el virus es un parvovirus como se encuentra de manera natural tal como el parvovirus de pato o un parvovirus recombinante del mismo.
En otra realizacion preferida, los virus, los vectores vfricos relacionados, las partfculas vfricas y las vacunas pertenecen a la familia de adenoviridae. Preferiblemente el virus es un adenovirus como se encuentra de manera natural que preferiblemente se selecciona de entre adenovirus de aves, adenovirus de ganso, adenovirus de pato y adenovirus de pichon o un adenovirus recombinante de los mismos. Los ejemplos de adenovirus de ave son adenovirus de ave 1 (CELO), adenovirus de ave 5 (340), adenovirus de ave 4 (KR95), adenovirus de ave 10 (CFA20), adenovirus de ave 2 (P7-A), adenovirus de ave 3 (75), adenovirus de ave 9 (A2-A), adenovirus de ave 11 (380), adenovirus de ave 6 (CR119), adenovirus de ave 7 (YR36), adenovirus de ave 8a (TR59), adenovirus de ave 8b (764) Y virus de sfndrome de cafda de huevos. Los ejemplos de adenovirus de ganso son adenovirus de ganso 1, adenovirus de ganso 2, adenovirus de ganso 3. Los ejemplos de adenovirus de pato son adenovirus de pato 2. Los ejemplos de adenovirus de pichon son adenovirus de pichon 1.
Los virus recombinantes incluyen pero no se limitan a vectores vfricos que comprenden un gen heterologo. En algunas realizaciones se proporciona una funcion cooperadora (helper) para replicacion de los virus por la celula hospedadora EBx®, un virus cooperador o un plasmido cooperador. Los vectores representativos incluyen pero no se limitan a aquellos que infectaran a celulas aviares o de mamffero.
La presente invencion tambien describe el uso de celulas EBx® de la invencion para replicar bacterias intracelulares tales como Chlamydia, Rickettsia o Coxiella.
Las celulas EBx® de la invencion tambien se pueden utilizar para producir protefnas y peptidos recombinantes. La invencion tambien describe un metodo de produccion de protefnas y peptidos recombinantes que incluyen las etapas de: (i) modificar geneticamente las celulas EBx® de la invencion por transfeccion transitoria o estable de un vector de expresion; (ii) opcionalmente, seleccionar celulas EBx® que expresen dichas protefnas o peptidos recombinantes; (iii) purificacion de los peptidos o protefnas. Los peptidos y protefnas producidos en celulas EBx® tambien se incluyen en la presente invencion.
El recipiente de cultivo se selecciona de manera mas preferible de entre un biorreactor de tanque de agitacion continua, un biorreactor Wave™ , biorreactor Bello™ , un matraz giratorio, un matraz y una fabrica de celulas. Tfpicamente, las celulas se hacen crecer a gran escala a partir de un frasco de banco de celulas maestro o de trabajo a traves de diversos tamanos de matraces T, botellas giratorias o un biorreactor Wave™ y, de manera preferible, finalmente a biorreactores. La suspension de celulas resultante despues tfpicamente se alimenta a un biorreactor de produccion de siembra (tfpicamente con un volumen de 20-30 l) para cultivo adicional y en algunas realizaciones con un biorreactor de produccion mas grande (tfpicamente un volumen de 150-180 l y mayor). La relacion del volumen del segundo biorreactor (mas grande) respecto al biorreactor de siembra depende del grado con el cual se propaga la lfnea de celulas en el primer biorreactor, pero tfpicamente es de 3:1 a 10:1, por ejemplo en
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el intervalo de (6-8): l. De acuerdo con una realizacion preferida, el recipiente de cultivo es un biorreactor de tanque de agitacion continua que permite el control de temperatura, aireacion, pH y otras condiciones controladas y el cual esta equipado con entradas apropiadas para introducir las celulas, el oxfgeno esteril, diversos medios para cultivo y salidas para extraer celulas y medio asf como medios para agitar el medio de cultivo en el biorreactor.
De acuerdo con la presente invencion, el termino "medio libre de suero" (SFM) significa un medio de cultivo celular listo para usarse, es decir, que no requiere la adicion de suero animal para permitir la supervivencia de celulas y el crecimiento celular. Este medio no necesariamente esta definido qufmicamente y puede contener hidrolizados de diversos orfgenes por ejemplo de plantas o levaduras. Preferiblemente el SFM es calificado como "origen no animal" es decir, no contiene componentes de origen animal o humano (estado FAO: “libre de origen animal"). En el SFM las protefnas de suero nativas son sustituidas por protefnas recombinantes. De manera alternativa, el medio SFM de acuerdo con la invencion no contiene protefna (medio PF: "medio libre de protefnas") y/o esta definido qufmicamente (medio CDM: "medio definido qufmicamente"). El medio SFM presenta varias ventajas: (i) primero que nada existe un cumplimiento regulador de dicho medio (en realidad no hay riesgo de contaminacion por agentes adventisos tales como BSE, o virus); (ii) la optimizacion de los procedimientos de purificacion; (iii) una mejor capacidad de reproduccion del procedimiento debido a un medio mejor definido. Los ejemplos de medios SFM disponibles comercialmente son: VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catalogo 2003), Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catalogo 2003), Episerf (lnVitrogen Ref 10732-022, catalogo 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, catalogo 2003). LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CRO 5-CDM (Cambrex ref 12-766Q, catalogo 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-utility (Hyclone Ref SR30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02), RyQ PF Yero (Hyclone Ref SR30352.02), medio Excell 293 (SAFC Biosciences ref 14570-1000M), Excell 325 Pf ChO medio libre de protefna (SAFC Bioscience ref 14335-1000M), medio Excell VPRO (SAfC Biosciences ref 14560-1000M), medio libre de suero Excell 302 (SAFC Biosciences ref 14312-1000M), Excell 65319, Excell 65421, Excell 65625, Excell 65626, Excell 65627, Excell 65628, Excell 65629 (JRH Biosciences), Excell MDCK SFM (SAFC-Biosciences Ref. 14581 C), Excell MDCK Prod (Ref. M3678), medio 3 de genoterapia (libre de componente animal) (SIGMA-Aldrich, ref. G-9916 o Excell GTM-3) (a continuacion denominado medio G9916), HYQ CDM4 HEK-293 (Hyc1one Ref. SH30859), HYQ SFM4 HEK-293 (HYCLONE Ref. SH30521), AEM (InVitrogen). De acuerdo con una primera realizacion preferida, el medio libre de suero No. 1 Y el medio libre de suero No. 2 son el mismo medio. De acuerdo con una segunda realizacion preferida, el medio libre de suero No. 1 y el medio libre de suero No. 2 tienen una composicion diferente.
El procedimiento de la invencion abarca la eliminacion de la totalidad o un parte del medio 1 libre de suero, seguido por su sustitucion por medio libre de suero No. 2. No obstante, es mas conveniente quitar una fraccion sustancial (por ejemplo de hasta aproximadamente 50%) del medio libre de suero 1 y despues reabastecerlo con el medio libre de suero No. 2 mientras aun se esta retirando el medio 1, por ejemplo a traves de un filtro giratorio. De acuerdo con una realizacion preferida, el medio libre de suero No. 2 se agrega directamente al medio libre de suero No. 1 sin retirar una parte del medio libre de suero No.1. Se agregan entre 0.25 y 10 volumenes de medio libre de suero No. 2 a 1 volumen de medio libre de suero No. 1. En una realizacion preferida, se agregan entre aproximadamente 0.5 y 8 volumenes de medio libre de suero No. 2 a 1 volumen de medio libre de suero No. 1. En una realizacion mas preferida se agregan entre aproximadamente 3 a 6 volumenes de medio libre de suero No. 2 a 1 volumen de medio libre de suero No. 1.
El medio libre de suero No. 1 y/o el medio libre de suero No. 2 puede suplementar con por lo menos un ingrediente que se selecciona del grupo que consiste de aminoacidos, lfpidos, acidos grasos, colesterol, vitaminas, carbohidratos, hidrolizados de protefna de origen no animal y una mezcla de los mismos.
De manera alternativa, el procedimiento de replicacion de un Virus de la invencion es un procedimiento de alimentacion por lotes que comprende la etapa adicional de alimentar las celulas con por lo menos un ingrediente que se selecciona del grupo que consiste de aminoacidos, lfpidos, vitaminas, carbohidratos, hidrolizados de protefna de origen no animal, tensioactivos y una mezcla de los mismos. De acuerdo con una primera realizacion preferida, la alimentacion se produce durante las etapas a) a d) del procedimiento de la invencion de replicacion de un virus, de manera alternativa solo durante las etapas b) a d), o de manera alternativa solo durante las etapas d). La alimentacion se puede llevar a cabo ya sea en una base diaria o sobre una base continua. Cuando la alimentacion es discontinua, la alimentacion se puede llevar a cabo una vez al dfa, mas de una vez al dfa o menos de una vez al dfa.
El medio SFM de la invencion comprende numerosos ingredientes, que incluyen aminoacidos, vitaminas, sales organicas e inorganicas, fuentes de carbohidratos, cada ingrediente esta presente en una cantidad la cual soporta el cultivo de una celula in vitro. No obstante, con el fin de mejorar el crecimiento de las celulas o la productividad vfrica, se agregan ingredientes adicionales a los medios SFM.
La seleccion de los aminoacidos que se agregan al cultivo celular se puede determinar por un analisis de consumo de aminoacidos con las celulas en el cultivo; dicho consumo varfa de acuerdo con la especie de celula. De acuerdo con una realizacion preferida, los aminoacidos agregados el medio se pueden seleccionar del grupo que consiste de asparagine y glutamina o una mezcla de los mismos. En una realizacion mas preferida, se agrega glutamina para cultivo de celulas EBx de pollo y la alimentacion de glutamina se realiza durante la etapa a) a d) para mantener la concentracion de glutamina en el medio entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 5 mM, de manera preferible entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 3 mM y de manera mas preferible en aproximadamente 2 mM. En una realizacion preferida, la alimentacion de glutamina se produce en una base continua. De manera
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interesante, la celula EBx® de pato no consume mucha glutamina debido a que las celulas de pato tiene la capacidad de sintetizar glutamina. Por lo tanto, se puede agregar o no glutamina a un cultivo de celulas EBx de pato.
De acuerdo con una realizacion preferida, los carbohidratos agregados al medio se seleccionan del grupo que consiste de D-glucosa, D-sacarosa y D-galactosa o una mezcla de los mismos. De acuerdo con una realizacion mas preferida, el carbohidrato agregado es D-glucosa. La alimentacion de D-glucosa se realiza durante la etapa a) a d), de manera mas preferible entre b) a d) para mantener la concentracion de D-glucosa en el medio entre aproximadamente 0.5 g/l y 25 g/l de D-glucosa, de manera preferible entre aproximadamente 1 g/l y 10 g/l de D-glucosa, de manera preferible de aproximadamente 2 a 3 g/l de D-glucosa. En una realizacion preferida, la alimentacion de D-glucosa se produce en una base continua.
De acuerdo con una realizacion preferida, los lfpidos se seleccionan del grupo que consiste de colesterol, esteroides y acidos grasos tales como acido palmftico, acido palmitoleico, acido estearico, acido mismos. De manera mas preferible, los acidos grasos son de SIGMA-ALDRICH (Ref. F7050) y aproximadamente 0.35 pl/ml de solucion de acidos grasos se agrega al medio de cultivo.
El medio puede contener sustancias auxiliares tales como sustancias amortiguadoras como bicarbonato de sodio, estabilizantes de oxidacion, estabilizantes para contrarrestar la tension mecanica o inhibidores de proteasa. Si se requiere se puede agregar un tensioactivo no ionico tal como polipropilenglicol (PLURONIC F-61, pLuRONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 o PLURONIC F-108) al medio como un agente desespumante. Estos agentes generalmente se utilizan para proteger a las celulas de los efectos negativos de la aireacion puesto que, sin la adicion de un tensioactivo, las burbujas de aire ascendentes y que golpean pueden generar dano en aquellas celulas que se localizan sobre la superficie de estas burbujas de aire ("purgado"). La cantidad de tensioactivo no ionico preferiblemente esta entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 10 g/l, de manera tfpica entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5 g/l. De acuerdo con otra realizacion de la invencion, la concentracion de tensioactivo en el medio de cultivo celular se puede modificar para adaptar (es decir, aumentar o disminuir) el tamano de los grumos de celulas.
De acuerdo con una realizacion del procedimiento de replicacion de un virus de la invencion, la adicion de medio libre de suero No. 2 al cultivo celular se realiza despues de la etapa b) de infeccion, preferiblemente entre aproximadamente 0.5 a 4 horas despues de la etapa b) y de manera mas preferible aproximadamente 1 hora despues de la etapa b). De acuerdo con otra realizacion de la invencion, la adicion de medio libre de suero No. 2 al cultivo celular se realiza antes de la etapa b) de infeccion, preferiblemente entre aproximadamente 0.5 a 4 horas despues de la etapa b) y de manera mas preferible aproximadamente 1 hora antes de la etapa b). De acuerdo con otra realizacion de la invencion, la adicion de medio libre de suero No. 2 al cultivo celular se realiza simultaneamente a la etapa de infeccion b. La infeccion vfrica de la etapa b) se lleva a cabo a una m.o.i. (multiplicidad de infeccion) de aproximadamente 10 a 10-8, preferiblemente 10-1 a 10-6, de manera mas preferible aproximadamente 10-2 a 10-5 y de manera mas preferible aproximadamente 10-4. Una persona experta en la tecnica determinara la m.o.i.. optima de acuerdo con el tipo de virus. En la etapa c), las celulas infectadas preferiblemente se cultivan durante por lo menos 24 h, por lo menos 48 h, por lo menos 72 h, por lo menos 96 h, por lo menos 120 h, por lo menos 144 h. Cuando el virus es un poxvirus, las celulas infectadas se cultivan por lo menos 144 h.
En el procedimiento de la invencion, el cultivo celular de la etapa a) se lleva a cabo por cultivo en lotes, cultivo de lote repetido, cultivo de lote de alimentacion o cultivo por perfusion. De manera mas preferible, el cultivo celular de la etapa a) se realiza por cultivo de lote de alimentacion. La infeccion de la etapa b) se realiza cuando la densidad celular es de por lo menos aproximadamente 4 millones, de manera preferible 6 millones de celulas/mI, de manera mas preferible 8 millones de celulas/mI en un procedimiento por lotes o de lotes de alimentacion. Cuando se utiliza el procedimiento de perfusion, la infeccion en la etapa b) se realiza cuando la densidad celular es de por lo menos 8 millones de celulas/mI, de manera preferible de aproximadamente 9 a 10 millones de celulas/ml incluso mayor.
El pH del medio de cultivo libre de suero en las etapas a), b), c) y d) preferiblemente se monitorean por el biorreactor. El pH estara en el intervalo de 6.5 a 7.8, de manera preferible aproximadamente de 6.8 a 7.5 y de manera mas preferible de aproximadamente 7.2.
En el procedimiento de la invencion, la etapa d) dura 1 a 10 dfas antes de la cosecha. De acuerdo con una realizacion preferida, la etapa d) dura por 2 a 5 dfas antes de la cosecha. El tiempo de cosecha (etapa e) se define de acuerdo con la densidad celular en el recipiente de cultivo. El inventor ha encontrado ahora que el tiempo optimo para cosecha de virus es 2 dfas despues de que la densidad de las celulas viables ha alcanzado su nivel optimo y han comenzado a disminuir debido a infeccion vfrica.
El cultivo de celula se realiza a una temperatura que comprende entre 32°C a 39°C, dependiendo del tipo de virus. Para produccion de virus de influenza y poxvirus, la infeccion de cultivo celular preferiblemente se realiza 33°C.
Las celulas EBx® tienen la capacidad de crecer en cultivo de suspension con celulas agrupadas en agregados sueltos de algunas celulas, hasta mas de cientos de celulas. Sin desearse unirse a teorfa alguna, se considera que el tamano de los grumos puede variar de acuerdo con la composicion del medio de cultivo celular. Por ejemplo, la presencia de un tensioactivo tal como polipropilenglicol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 o PLURONIC F-108), la agitacion, la concentracion de iones divalentes tales como Mg2+ y Ca2+
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puede tener un efecto sobre el tamano de los grumos. El inventor ha encontrado que el rendimiento vfrico se puede incrementar al permitir que las celulas EBx® de la invencion se agreguen entre si para formar grumos durante por 10 menos la etapa a) del procedimiento. Durante el aumento de escalas de un lote maestro y un frasco de un banco de celulas de trabajo a traves de los diversos tamanos de matraces T o botellas giratorias a biorreactores, las celulas de suspension generalmente se someten a pase a un recipiente mas grande, ya sea por dilucion en medio fresco o por centrifugacion seguido por una resuspension del sedimento celular en un medio fresco. El inventor ha encontrado que durante los pases de celulas, se recomienda mantener grumos de celulas grandes en el cultivo. Para hacer esto, es mejor no romper los grumos de celulas con el fin de mejorar la replicacion del virus en celulas EBx®. Por ejemplo, durante las fases iniciales de cultivo de la etapa a) en matraces T o botellas giratorias, se recomienda diluir el cultivo celular para el paso de las celulas a recipientes mas grandes y no se recomienda centrifugar ni romper los grumos de celulas por pipeteo o agitacion. No obstante, grumos demasiado grandes pueden ser suboptimos para una elevada produccion vfrica. En consecuencia, una persona experta en la tecnica definira si una ruptura parcial de los grumos, por pipeteo o agitacion durante los pases de celulas iniciales de la etapa a) puede mejorar el rendimiento vfrico. De acuerdo con una realizacion preferida, los poxvirus, y preferiblemente MVA, ALVAC y virus de viruela aviar se obtienen por un procedimiento de la invencion que incluye la etapa a) de proliferar EBx® agrupado en agregados sueltos de doscientas celulas, por lo menos quinientas celulas o por lo menos mil celulas.
Los inventores han encontrado que el tamano de los grumos de celulas EBx®, preferiblemente los grumos de celulas EBx® de pato pueden depender de la concentracion de iones Mg2+ y/o Ca2+ en un medio de cultivo de celulas independiente de anclaje. Puesto que los grumos demasiado grandes pueden ser suboptimos para una elevada produccion vfrica, se puede vigilar el tamano de los grumos al ajustar la concentracion de Mg2+ y Ca2+ en el medio de cultivo celular.
Para celulas EBx® de pato, el medio de cultivo celular preferiblemente contiene una concentracion de Mg2+ que comprende entre 0.5 mM y 2.5 mM, de manera preferible aproximadamente 1.6 mM y la concentracion de Ca2+ comprende entre 0.01 mM y 0.5 mM, de manera preferible aproximadamente 0.1 mM.
La invencion tambien describe el virus que se puede obtener por un procedimiento de la invencion. La presente invencion tambien describe una vacuna que contiene el virus de la invencion. El procedimiento de elaboracion de una vacuna antivfrica comprende el procedimiento de replicar un virus de acuerdo con la invencion en donde la etapa e) de la cosecha de virus comprende por lo menos una etapa que se selecciona de entre filtrado, concentracion, congelamiento y estabilizacion por adicion del agente estabilizante. La cosecha de virus se realiza de acuerdo con tecnologfas bien conocidas por una persona experta en la tecnica. De acuerdo con una realizacion preferida, la etapa de cosecha del centrifugacion del cultivo celular, despues filtrar, concentrar, congelar y estabilizar la preparacion de virus por adicion de agente estabilizante. Por ejemplo, para virus de influenza vease Furminger en Nicholson, Webster y Hay (Eds) libro de texto de influenza, capftulo 24, pp 324-332.
El procedimiento de elaboracion de una vacuna vfrica de acuerdo con la invencion tambien puede comprender la etapa adicional de inactivacion de virus cosechado. La inactivacion preferiblemente se realiza por tratamiento con formaldehfdo, p-propiolactona, eter y eter y detergente (tal como Tween 80TM), bromuro de cetil-trimetilamonio (CTAB) y Triton N102, desoxicolato de sodio y fosfato de tri(N-butilo).
De acuerdo con otra realizacion, la invencion tambien describe un procedimiento de preparacion de protefnas antigenicas vfricas a partir del virus que se pueden obtener por un procedimiento de la invencion, el procedimiento comprende las etapas adicionales de:
a) opcionalmente, incubar el sobrenadante de cultivo celular que comprende el virus completo con una enzima de restriccion de acido desoxirribonucleico, preferiblemente desoxirribonucleasas (DNAsas) (veanse las clasificaciones EC3.1.21 y EC3.1.22) y nucleasas (veanse las clasificaciones EC3.1.30 y EC3.1.31). Preferiblemente, la enzima de digestion de ADN es benzonasa (nucleasa benzon) o desoxirribonucleasa (DNasa) 1;
b) adicion de un detergente cationico. Los ejemplos de detergente cationico son: sin limitacion: sal de cetil-trimetilamonio tal como CTAB, sal de miristil-trimetilamonio, lipofectina, DOTMA y Tween™;
c) aislamiento de protefnas antigenicas. Esta ultima etapa se puede llevar a cabo por centrifugacion o ultrafi ltracion.
El virus de la vacuna puede estar presente ya sea como partfculas de virus intactas o como partfculas de virus desintegradas. De acuerdo con una realizacion, la vacuna es una vacuna elaborada con organismos muertos o una vacuna inactivada. De acuerdo con otra realizacion, la vacuna es una vacuna hecha con organismos vivos atenuados, en donde las vacunas comprenden principalmente sobrenadante de cultivo de celulas EBx que se pueden obtener por el procedimiento de la invencion, preferiblemente sin suero, opcionalmente filtrado y/o concentrado y que comprenden al virus. De acuerdo con una tercera realizacion, la vacuna comprende protefnas antigenicas vfricas que se pueden obtener de un virus preparado de acuerdo con el procedimiento de la invencion.
La solicitud tambien describe el suministro de una vacuna que comprende una lfnea de celulas infectadas EBx®, preferiblemente EBx® de pato o de pollo ev-0, y en donde la lfnea de celulas infectadas EBx® , preferiblemente EBx® de pato o de pollo ev-0 se cosechan en la etapa d).
La vacuna de la invencion puede comprender el virus de la invencion en combinacion con sustancias
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farmaceuticamente aceptables las cuales incrementan la respuesta inmunitaria. Los ejemplos no limitantes de ejemplos de sustancias los cuales incrementan la respuesta inmunitaria comprenden adyuvante incompleto de Freund, saponina, sales de hidroxido de aluminio, lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, peptidos, bacilos de Calmette-Ouerin (BCG) y Corynebacterium parvum. Los ejemplos de adyuvantes sinteticos es QS-21. Ademas, las protefnas inmunoestimulantes (interleucinas IL1, IL2, lL3, IL4, IL12, IL13, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos, ...) se pueden utilizar para incrementar la respuesta inmunitaria a la vacuna.
La vacuna de la invencion preferiblemente es una formulacion lfquida, una preparacion congelada, una preparacion deshidratada y congelada, adaptada opcionalmente para via de administracion intranasal.
La vacuna de la invencion se utiliza para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de un humano o un animal infectado por un virus incluido en la lista previamente. Preferiblemente, la vacuna vfrica de la invencion de preferencia se utiliza para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de un humano infectado por un virus que se selecciona de entre viruela, influenza, sarampion, paperas, virus de rubeola, o RSV. De manera alternativa, la vacuna de la invencion preferiblemente se utiliza para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de un animal infectado por un virus que se selecciona de entre influenza, virus de enfermedad de Newcastl e, virus de sfndrome de cafda de huevo, enfermedad bursal infecciosa, virus de bronquitis infecciosa, virus de malestar canino, virus de anemia de pollo. La vacuna vfrica recombinante de la invencion tambien se puede utilizar para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de enfermedades cronicas tales como cancer y enfermedades infecciosas tales como SIDA.
Las lfneas celulares EBx® de la invencion son utiles para generar y producir virus reagrupados. El virus con un genoma segmentado, tal como el virus de influenza puede ser reagrupado. Cuando se infectan simultaneamente celulas EBx® de la invencion con por lo menos dos cepas diferentes de virus de influenza, esta presente en la misma celula hospedadora una mezcla de genoma segmentado de dos cepas diferentes. Durante el ensamblado del virus, todas las combinaciones de segmentos genomicos teoricamente se pueden generar. Los virus reagrupados especfficos de esta manera se pueden aislar por seleccion o eliminacion con un anticuerpo, por ejemplo, virus con un rasgo deseado (vease Kilnourne E.D. y Plotkin SA y Mortimer E.A. Eds, Bacines 1994). Las lfneas celulares EBx® de la invencion tambien son utiles para generar y producir virus de influenza por genetica inversa (vease Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese, J. Virol. 65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989)).
La presente invencion tambien describe el uso de lfneas celulares EBx® de la invencion como un sustrato celular para realizar titulacion de virus. Las celulas EBx® son eficaces para sustituir al sistema de celulas actual, tal como huevos embrionados, los CEF, celulas DF1 y otras, utilizadas para determinar el tftulo de una solucion vfrica. Preferiblemente, la titulacion vfrica se realiza por el metodo TCID50 (Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97).
La presente invencion tambien describe el uso de lfneas celulares EBx® de la invencion como un sustrato celular para realizar pruebas sanitarias.
La invencion tambien describe una composicion de diagnostico que contiene los virus de la invencion o constituyentes de los mismos.
Los ejemplos siguientes explican la invencion con mayor detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir a una persona experta en la tecnica comprender con mayor claridad y llevar a la practica la presente invencion. No obstante, la presente invencion no esta limitada en alcance por las realizaciones ejemplificadas, las cuales se consideran como ilustraciones de aspectos unicos de la invencion unicamente y los metodos los cuales son funcionalmente equivalentes estan dentro del alcance de la invencion. En realidad, diversas modificaciones de la invencion, ademas de las que se describen aquf, seran evidentes para aquellos expertos en la tecnica a partir de la descripcion siguiente y los dibujos que la acompanan. Se pretende que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Para el resto de la descripcion, se hara referencia a la leyenda de las figuras siguientes.
Figuras
FIGURA 1: Celulas EBx de pollo independientes de anclaje.
Figura 1A: Celulas Valo EBv13 de pollo independientes de anclaje en medio libre de suero. Se cultivan celulas EBv13 a 37°C en suspension en medio libre de suero Excell 65319 (SAFC). Las celulas EBv13 tienen un tamano homogeneo y crecen en grumos sueltos en el cultivo. El tiempo de duplicacion de poblacion es de aproximadamente 16-18 horas y la densidad celular alcanzada en los recipientes de matraces agitados es de aproximadamente 4-5 millones de celulas/mI.
Figura 1B: Celulas de EB lfnea 0 de poBo independientes de anclaje en medio libre de suero. Las celulas EB lfnea 0 se cultivan a 39°C en suspension de medio libre de suero Excell 66444 (SAFC). Las celulas EB lfnea 0 tienen un tamano homogeneo y crecen en grumos sueltos.
FIGURA 2: Celulas Valo EBv13 de pollo expresan alto nivel de telomerasa
Las celulas EBv13 en el pase p193 expresan un alto nivel de telomerasa del mismo orden de magnitud que las celulas de pollo EB 14-074 (vease el documento WO 03/076601) en el pase p 164 (Master cell Bank: McB) o en
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el pase p184 (Workin Cell bank: WCB). Los embriocitoblastos murinos (los mES) se utilizan como un control positivo y fibroblastos de raton (FED) se utilizan como un control negativo.
FIGURAS 3A y 3B: Susceptibilidad de Vaio EBv13 de pollo a poxvirus
Se siembran EBv13 (pase 188) a 0.4 x 106 celulas/mI en 100 ml en matraces F175 ya sea en 40 ml de medio Excell SFM 65319 o medio SFM G9916 (SAFC) complementado con glutamina 4 mM. El crecimiento celular y la infeccion con MVA-GFP (MOI 10-2 TCID50/celula) se realiza a 37°C. Una hora despues de la infeccion se agregan 60 ml de medio fresco.
Figura 3A: cinetica de densidad celular en medio Excell SFM 65319 medio SFM G9916 (SAFC).
Figura 3B: Productividad de MVA expresada en TCID50/ml en medio Excell SFM 65319 o medio SFM G9916 (SAFC).
FlGURA 4: Analisis de microscopia electronica de transmision de celulas EBx de pato
El analisis por microscopia electronica de transmision de celulas dEBx se realiza por el Dr. A Rivoire (Lyon, Francia). Las celulas EBx de pato muestran morfologfa tfpica de embriocitoblastos (es decir, una relacion de nucleo-citoplasma) que recuerda al fenotipo de embriocitoblastos murinos y celulas VIVALIS EB14 descritas en el documento WO2006/108846. Las celulas EBx de pato son celulas redondas pequenas con un nucleo grande y nucleolo, con pseudopodos cortos que se extienden desde la membrana plasmatica. Son altamente activas metabolicamente con un citoplasma con ribo somas y mitocondrias.
FIGURAS 5A y 5B: Expresion die tenomerasa en lfneas de celulas EBx de pato
La expresion de telomerasa durante diferentes etapas del establecimiento de celulas EBx de pato se investiga mediante la utilizacion del equipo de deteccion de telomerasa Roche (Telomerase OCR ELISA).
Figura 5A: Se encuentra telomerasa la cual se expresa en altas concentraciones en diferentes lfneas celulares EBx de pato adherentes muy similar a las celulas EBv13 de pollo. Las celulas epiteliales de pato utilizadas como un control negativo no expresan telomerasa.
Figura 5B: Durante el procedimiento de establecimiento de suspension de celulas EBx de pato, se mantiene un alto nivel de expresion de telomerasa. El alto nivel de telomerasa se investigo en celulas EBx de pato durante supresion de alimentador (con o sin celulas alimentadoras) durante el procedimiento de adaptacion de las celulas EB26 de pato a suspension y despues de suspension de suero de dEB24 y dEB26.
Las celulas EBx de pato tales como EB24 y EB26 expresan un alto nivel de telomerasa de manera muy similar a las celulas EB14 de pollo. Las celulas EB66 de pato tambien expresan un alto nivel de telomerasa (datos no mostrados).
FIGURAS 6A y 6B: Las celulas EBx® de pato no muestran actividad de transcriptasa inversa endogena
Figura 6A: Se investigo la expresion de transcriptasa inversa endogena por analisis directo F-PERT (Lovatt et al., 1999, J. Virol. Methods, 82: 185-200) en celulas CIean (FRANCE). Las lfneas celulares EBx® de pato, EB26 y EB5-1 no muestran actividad de transcriptasa inversa (RT) endogena. El alto nivel de actividad RT se detecto en cultivo de celulas EB14 y EBv13 de pollo (a diferentes pases) asf como, y en menor grado, en fibroblasto embrionico de pollo (CEF) derivado de una cepa de pollo libre de patogeno especffico (SPF). Las celulas CEM, las cuales son RTasa negativas, se utilizan como un control negativo para establecer el lfmite de deteccion del analisis.
Figura 6B: Se investigo la presencia de partfculas retrovirales endogenas, ya sea replicantes (es decir, capaces de replicarse), o no replicantes en el sobrenadante de cultivo celular de celulas EBx de pato y de pollo por medio de un analisis de ELISA que detecta el antfgeno P27 de capside principal de leucocis aviar. Las lfneas celulares EBx de pato, EB26 y EB5-1 asf como EBv13 de pollo no secretan el antfgeno p27 de ALV. En oposicion, las celulas EB14 de pollo expresan el antfgeno P27 de ALV.
FIGURAS 7 A Y 7B: Las celulas EBx de pato no secretan el virus de leucocis aviar replicante (ALV)
El analisis de cocultivo de celulas EBx de pato con la lfnea de celulas QT6 de codorniz, que se sabe son sensibles a ALV endogeno y exogeno se realizan en Bioreliance (Reino Unido) para detectar la presencia de virus de pato replicante endogeno.
Figura 7 A: Describe el principio del cocultivo QT6.
Figura 7B: La presencia del virus replicante se detecta por un analisis de ELISA que detecta el antfgeno P27 de capside principal de leucocis aviar.
El analisis demuestra que ninguna de las celulas EBx® de pato probadas (dEB26 y dEB51) secretan ALV replicante. El virus RAV-1, el cual se sabe que se replica en QT6, se utilizo como control positivo.
FIGURA 8: Expresion en superficie celular de receptores SAa2-3 y SAa2-6 en lfneas celulares EBx de pato y EB14 de pollo
Se incubaron celulas con lectinas marcadas con digoxigenina: La lecitina de aglutinina de Sambuca nigra se une especfficamente a Sia2-6Gal, mientras que la lectina de aglutinina de Maackia amurensis se une especfficamente a Sia2-3Gal. Las lectinas que se unen a celulas se manifiestan con un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con FITC, de acuerdo con tecnicas bien conocidas por las personas expertas en la tecnica. Las celulas marcadas con FITC se numeran con un clasificador de celulas fluorescente (FACS). Las moleculas SAa2-3 y SAa2-6 se han descrito como receptores de los virus de influenza aviar y humana, respectivamente. Casi todas las celulas EBx de pato expresan con un alto nivel los receptores de superficie SAa2-3 y SAa2-6.
FIGURAS 9A y 9B: Propagacion del virus MVA-GFP en celulas EBx de pato infectadas Figura 9A; Se permite que las celulas EBx® de pato formen grumos pequenos en matraces de tanque de agitacion T175 durante la proliferacion celular en un medio de crecimiento celular SFM. Los grumos despues se infectan con 10-2 TCID50/celula de virus MVA-GFP y la mezcla se diluye en medio de produccion SFM. Durante un perfodo de propagacion de virus de 6 dfas a 37°C, se toman diariamente imagenes de celulas infectadas expuestas a radiacion UV. El pico de la infeccion por MVA se alcanza en el dfa 4 post-infeccion (pi). En el dfa 6 pi, las celulas infectadas comienzan a morir.
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Figura 9B: titulacion del virus MVA-GFP propagada en celulas EBx® de pato en un biorreactor de alimentacion por lotes de 3L (panel izquierdo) se permite que la biomasa derivada de EBx de pato se acumule durante la fase de proliferacion' celular en un medio de crecimiento Excell (SAFC). En el dfa 4, la densidad celular alcanza 4 millones de celulas/ml. Las celulas despues se infectan a 10-1. TCID50/celula de virus MVA-GFP y la mezcla se diluye en 1.5 l de medio Excell. Durante un perfodo de propagacion de virus de 6 dfas a 37°C las muestras se recolectan diariamente y se realiza la titulacion con TCID50 (panel derecho) al final del ensayo de cinetica. Se alcanza un rendimiento de 8.5 unidades logarftmicas de TCID50/ml a 4 p.i., lo que corresponde a un rendimiento de 205 TCID50/celula.
FIGURA 10: Influencia de la concentracion de calcio y magnesio en el medio SFM sobre el tamano de los grumos de celulas EBx®
Figura 10A: Las celulas EBv13 de pollo se cultivan primero en medio SFM a partir de SAFC Biosciences que comprende una alta concentracion de calcio (Ca2+) (aproximadamente 0.79 mM) y iones magnesio (Mg2+); en este medio, las celulas producen agregados grandes en cultivo.
Tres dfas despues de haber cambiado el medio de cultivo celular con el mismo medio SFM que comprende una concentracion menor de Ca2+ (0.03 mM final) y Mg2+ (1.6 mM final) las celulas forman agregados mas pequenos.
Figura 10B: Las celulas de pato EB24, EB26 y EB66 se cultivan primero en el medio SFM a partir de SAFC Biosciences que comprende una alta concentracion de iones calcio (Ca2+) (aproximadamente 0.79 mM) y magnesio (Mg2+); en este medio, las celulas producen agregados grandes en cultivo.
Tres dfas despues de haber cambiado el medio de cultivo celular con el mismo medio SFM que comprende una concentracion menor de Ca2+ (0.03 mM final) y Mg2+ (1.6 mM final), las celulas forman agregados mas pequenos.
FIGURAS 11A y 11B: Produccion de cepas A de virus de influenza en celulas EBx de pato en biorreactores de 31
Se permite que la biomasa de EBx® de pato se acumule a 37°C durante la fase de proliferacion celular en un medio de crecimiento celular. Las lfneas despues se infectan a 10-4 TCID50/celula de virus de influenza A/HY1N1/Beijing/262/95 O A/H3N2/New York/55/2004, la mezcla se diluye en 1.5 l de medio de produccion Excell complementado con 0.75 USP/ml de tripsina y se disminuye la temperatura a 33°C. Durante un perfodo de propagacion de virus de 14 dfas se recolectan muestras diariamente y se almacenan a -80°C.
Figura 11 A: Cinetica de crecimiento de celulas EBx de pato infectadas con la cepa de virus de influenza A/H1N1/Beijing/262/95. Panel izquierdo: Densidad celular (rombos, x 106 celulas.ml-1) y tftulo vfrico en unidades logarftmicas de TCID50/ml.
Panel derecho: numero total de celulas (cuadros), viabilidad (cfrculos negros, %) y concentracion de
hemaglutinina, en pg/ml (cfrculos rojos, %)
El rendimiento vfrico alcanza 20 pg de hemaglutinina por mI de sobrenadante de cultivo.
Figura 11 B: Cinetica de crecimiento de celulas EBx de pato infectadas con cepa de virus de influenza A/H3N2/New York/55/2004
Panel izquierdo: Densidad celular (rombos, x 106 celulas.ml-1)
Panel derecho: Numero total de celulas (cuadros), viabilidad (cfrculos negros, %) y concentracion de
hemaglutinina, en jg/mi (cfrculos rojos, %).
El rendimiento vfrico alcanza 30 ug de hemaglutinina por mI de sobrenadante de cultivo.
FIGURA 12: Produccion de cepa B de virus de influenza en celulas EBx® de pato
Se permite que la biomasa de EBx® de pato se acumule a 37°C durante la fase de proliferacion celular en un medio de crecimiento celular. Las celulas despues se infectan con 10"3 TCID50/celula de virus de influenza B/Jiangsu/1012003, la mezcla se diluye en 1.5 l de medio de produccion Excell complementado con 0.75 USP/ml de tripsina y se hace descender la temperatura a 33°C. Durante un perfodo de propagacion de virus de 14 dfas se recolectan las muestras diariamente y se almacenan a -80°C.
Panel izquierdo: Densidad celular (rombos, x 106 celulas.ml-1)
Panel derecho: Numero total de celulas (cuadros), viabilidad (cfrculos negros, %) y concentracion de
hemaglutinina, en jg/mi (cfrculos rojos, %)
El rendimiento vfrico alcanzo 25 ug de hemaglutinina por mI de sobrenadante de cultivo.
FIGURA 13: Analisis de productividad de NDV y expresion de protefna vfrica en suspension de celulas EBV66 de pato (MOl 10-3, 0.75 USP/mI de tripsina)
Las celulas EBx de pato y pollo son sensibles y replican NDV, cepa La Sota. Los tftulos (en TCID50/ml) de NDV producidas por celulas eB66 de pato aumentan del dfa 0 al dfa 2 pi para alcanzar un promedio de 106 83 TCID50/ml (figura 13, panel izquierdo).
El analisis de transferencia Western (figura 13, panel derecho) muestra las protefnas vfricas NDV (HN, Fo/F, NP y M) de expresion. La composicion de protefnas vfricas de virus NDV producidas en celulas EB66 de pato son similares a las que se obtienen con virus NDV producidas en celulas EB14 de pollo. Ademas, la cinetica de liberacion para virus producidos en celulas EBx de pollo y pato son similares.
FIGURA 14: Analisis de replicacion de virus de sarampion recombinante en suspension de celulas EB66 de pato (MOl 10-1 o 10-2) en matraces de cultivo de tejido en medio libre de suero. Las celulas EB66 de pato son por lo menos tan sensib.1es como las celulas VERO a 5 infeccion por virus de sarampion. Los tftulos (en TCID50/ml) del virus de paperas recombinante que expresa protefna fluorescente verde (GFP) producida en celulas EB66 de pato alcanza 107 TCID50/ml al dfa 6 postinfeccion.
FIGURAS 15A y 15B: Expresion de SSEA-1, EMA-1 y telomerasa en celulas EB66 de pato
Se investigo la expresion de telomerasa en diferentes pases de EB66 de pato cultivada en botellas giratorias mediante la utilizacion del equipo de deteccion de telomerasa de Roche (Telomerase OCR ELISA). Se investigo
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por analisis FACS SSEA-1 y EMA-1 en diferentes pases de EB66 de pato cultivado en botellas giratorias.
Figura 15A: Se encontro que la telomerasa se expresa en una alta proporcion en una suspension de una lfnea de celulas EB66 de pato en diferentes pases (138,144,147,150,154).
Figura 15B: Se encontro que los marcadores de superficie celular SSEA-1 y EMA-1 se expresan con un alto nivel en una suspension de lfneas celulares EB66 de pato en diferentes pases (138, 144, 147, 150, 154).
FIGURA 16: Analisis de cariotipo de celulas EB66 de pato
El cario tipo de celulas EB66 de pato se realizo por Pr. Franck, ENVL, Lyon. Las celulas EB66 son celulas diploides.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Lfnea de celulas EBv13 de pollo a partir de pollo SPF, cepa VALO
1.1 -Materia prima
Huevos
La cepa libre de patogenos especfficos (SPF) se denomina Valo. La cepa valo es una cepa Leghorn blanca producida y suministrada por Lohmann de Alemania. Los huevos de pollo SPF suministrados con un certificado de analisis, se analizan para determinar: CAV, adenovirus aviar (grupo 1, serotipos 1-12 y grupo 3), EDS, virus de encefalomielitis aviar, virus de leucocis aviar/RSV (que incluye serotipo ALV-J), virus de nefritis aviar, reovirus aviar, virus de viruela aviar, virus de bronquitis infecciosa, virus de bursitis infecciosa (IBDV), virus de laringotraqueitis infecciosa, influenza virus tipo A, virus de enfermedad de Marek, micoplasmosis (Mg + Ms), micobacterium avium, virus de enfermedad de Newcastle, virus de retfculo endoteliosis, Salmonella pullorum, otras infecciones por salmonella, virus de rinotraqueitis aviar (ART), Hemophilus paragallinarum. Los huevos de pollo Valo se envfan unicamente a una desinfeccion con el descontaminante para evitar cualquier riesgo de contaminacion relacionado con la manipulacion de los huevos durante el transporte.
Celulas alimentadoras
En la primera etapa del procedimiento del establecimiento de EBv13, se utilizan celulas de origen murino (celulas STO), como la capa alimentadora para mantener la pluripotencia de citoblastos de pollo. Estas celulas alimentadoras estan inactivadas mitoticamente por irradiacion y (45 a 55 Grays) antes de su siembra en plastico. Esta dosis de irradiacion es una dosis submortal que induce una supresion definitiva del ciclo celular pero que aun permite la produccion de factores de crecimiento y matriz extracelular, necesarios- para la promocion del crecimiento celular de celulas no diferenciadas.
La lfnea de celulas STO se deriva de A. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Tortonto, Canada de una lfnea continua de fibroblastos embrioncitos de raton SIM (ratones endogamicos Sandos) y se suministra por la American Type Culture Collection (ATCC) (STO, numero de producto: CRL-1503, numero de lote 1198713). Se preparan dos veces a la semana capas alimentadoras frescas, en general el lunes y jueves. Las celulas exponenciales se disocian y se cuentan. Una parte de las celulas se siembra para mantenimiento de cultivos viables y otra parte se irradia. Para irradiacion, se prepara una suspension celular a 10 x 106 celulas/ml en tubos. Las celulas se exponen a una dosis de 45 a 55 greys y se siembran en plastico.-Despues de la siembra, los recipientes o las placas se recubren con celulas alimentadoras inactivadas y se utilizan durante un maximo de 5 dfas.
Medio
DMEM - HamF12 (Cambrex, Cat No. BE04-687) medio Optipro (Invitrogenl n.° de catalogo 12309)
EX-CELLmr 65195,60947 y 65319 (SAFC, medio adaptado)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, n.° de catalogo BE17-605E)
Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat No. BE17-602E))
Aminoacidos no esenciales (Ambrex, n.° de catalogo BE13-114E)
Piruvato de sodio (Cambrex, n.° de catalogo BE13-115)
Vitaminas (Cambrex, n.° de catalogo 13-607C)
Beta-mercaptoetanol (Sigma, n.° de catalogo M7522)
Amortiguador y fijadores
PBS 1X (Cambrex, n.° de catalogo BE17-516F)
Paraformaldehfdo 4% (Sigma, n.° de catalogo P6148)
KCI 5.6% (Sigma, n.° de catalogo P9333)
Metanol/acido acetico (3/1): Metanol (Merck, n.° de catalogo K34497209; Acido acetico Sigma n.° de catalogo A6283)
Colcemida, Karyomax (Gibco, n.° de catalogo 15212-046)
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Agente crioprotector
Sulfoxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, n.° de catalogo D2650)
Factores
Se utilizan dos factores recombinantes diferentes:
O Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 450-13)
O Factor I similar a insulina humano recombinante (IGF 1) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 100-11)
Los dos factores se producen en bacterias E. coli.
Suero bovino fetal
Suero bovino fetal no irradiado (FBS) (JRH, n° de catalogo 12103)
El suero no irradiado utilizado en el programa se recolecta y produce en los Estados Unidos. Los animales utilizados para recoleccion son inspeccionados por USDA y aceptables para matanza. Se ha agregado en el medio durante cultivo de citoblasmos aviares. Este lote no se envfa a irradiacion para evitar la destruccion de protefnas crfticas o componentes identificados como esenciales para el mantenimiento de los citoblastos en cultivo.
Medio irradiado (JRH, n.° de catalogo 12107)
El lote irradiado utilizado en este programa tambien se recolecta en los Estados Unidos. Este lote irradiado se agrega como suplemento en el medio DMEM utilizado para el cultivo de celulas STO o FED (celulas alimentadoras). Estas no requieren como citoblastos una calidad especffica de suero para crecimiento y mantenimiento de cultivo. Para minimizar la alta concentracion en suero en el medio hemos adaptado las celulas STO para que crezcan en presencia de 4% de FBS unicamente.
Agentes disociantes
• Pronase (Roe/te, n.° de catalogo 165 921)
Pronase es una proteasa recombinante fabricada por Rache Diagnostics, Alemania, utilizada para la disociacion de citoblastos aviares adherentes.
• Tripsina EDTA (Cambrex, n.° de catalogo BE17-161E)
La tripsina se utiliza para la disociacion de celulas STO o FED y en pases tardfos para la disociacion de celulas aviares adaptadas a medio libre de suero. Esta enzima de origen porcino es fabricada asepticamente de acuerdo con las condiciones de referencia cGMP por un metodo de filtracion esteril validado y probable de acuerdo con E.P. actual. La materia prima, irradiada antes de la formulacion se analiza para determinar parvo virus porcino en cumplimiento estricto con 9/CFR 113.53.
• Solucion de disociacion celular no enzimatica (Sigma, n.° de catalogo C5914)
Este agente de disociacion es una formulacion lista para usarse que se utiliza para separar suavemente celulas de la superficie de crecimiento del recipiente de cultivo. La formula no contiene protefnas y permite la disociacion en las celulas sin el uso de enzimas. Las protefnas celulares se conservan lo que posibilita estudios inmunoqufmicos que dependen del reconocimiento de protefnas de la superficie celular. Esta enzima se utilizo para separar celulas antes de analisis por FACS de marcadores biologicos como EMA-1 (antfgeno 1 de membrana epitelial) y SSEA-1 (antfgeno 1 embrionico especffico de etapa).
1.2 PROCEDIMIENTO PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LINEA CEL ULAR EBV13
Los huevos se abren, se separa la yema de la albumina durante la abertura. Los embriones se separan de la yema ya sea directamente con la ayuda de una pipeta Pasteur o con la ayuda de un papel filtro absorbente pequeno (papel Whatmann 3M), se cortan de antemano en forma de un anillo perforado con la ayuda de un punzon. El diametro de la perforacion es de aproximadamente 5 mm. Estos anillos pequenos se esterilizan utilizando calor seco durante aproximadamente 30 minutos en un horno. Este anillo de papel pequeno se deposita sobre la superficie de la yema y se centra sobre el embrion el cual de esta manera es rodeado por el anillo de papel. Este ultimo despues se recorta con la ayuda de pares pequenos de tijeras y la totalidad separada se coloca en una caja de Petri, se rellena con PBS o con solucion salina fisiologica. El embrion separado de esta manera por el anillo se limpia del exceso de yema en el medio y el disco embrionico de esta manera libre del exceso de vitelina se recolecta con una pipeta Pasteur.
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Los embriones Valo de pollo se colocan en un tubo que contiene medio fisiologico (PBS 1X, Tris Glucosa, medio y similares). Los embriones Valo despues se disocian mecanicamente y se inoculan en una capa de celulas STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C. Las celulas alimentadoras se siembran en matraz a aproximadamente 2.7 x 104 celulas/cm2. El medio de cultivo completo esta constituido de medio comercial basal DMEM-HamF12 complementado con suero bovino fetal 10%, con lGF-1 y CNTF a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1% de aminoacidos no esenciales, con 1% de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 1 mM, con {3mercapto-etanol a una concentracion final de 0.2 mM, glutamina en una concentracion final de 2.9 mM, con una mezcla inicial de antibioticos que contienen penicilina a una concentracion final de 100 U/ml y estreptomicina a una concentracion final de 100 pg/ml. Rapidamente despues de los primeros pases de las celulas, las mezclas de antibioticos ya no se agregan al medio. La expresion "rapidamente" se entiende que significa despues de los primeros 3 a 5 pases en general.
Cuando las celulas ES aviares de embriones Valo de pollo se someten a pase de un recipiente de cultivo a otro, la siembra de los recipientes de cultivo se realiza con aproximadamente entre 7 x 104/cm2 a 8 x104 cm2 de celulas ES aviares en el medio de cultivo completo. Preferiblemente, la siembra se realiza con aproximadamente 7.3 x 104/cm2 (4 x 106 celulas/55 cm2 o 4 x 106 celulas/recipiente de 100 mm). Las celulas aviares, preferiblemente celulas embrionicas aviares de la etapa A) se cultivan durante varios pases en el medio completo. En el pase 15, el medio completo se suprimen de factores de crecimiento IGF-1 y CNTF. La supresion- se realiza directamente en una etapa, de un pase a otro. Los embriocitoblastos, preferiblemente los citoblastos aviares se cultivan durante varios pases en el medio completo sin los factores de crecimiento IGF-1 y CNTF.
Despues, la supresion de celulas alimentadoras se realiza despues de la supresion de factores de crecimiento IGF-1 y CNTF por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras durante varios pases. Practicamente, la misma concentracion de celulas alimentadoras se utiliza durante 2 a 4 pases, despues se utiliza una concentracion menor de celulas alimentadoras durante 2 a 4 pases adicionales y asf sucesivamente. El matraz originalmente se siembra con aproximadamente 2.7 x 104 celulas alimentadoras/ cm2, despues aproximadamente 2.2 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 1.8 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 1.4 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 1.1 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 0.9 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 0.5 x 104 celulas alimentadoras/cm2. Despues, el matraz se siembra con 6.5 x 104 celulas aviares/cm2 a 7.5 x 104 celulas aviares/cm2 y sin celulas alimentadoras. La supresion de celulas alimentadoras comienza a aproximadamente en el pase 21 y termina aproximadamente en el pase 65. Durante la supresion de celulas alimentadoras, las celulas ES Valo de pollo se siembran en matraces de cultivo a una concentracion menor que en la etapa a), aproximadamente de alrededor de 4 x 104 celulas/cm2 a 5 x 104 celulas/cm2. En la hipotesis de que las celulas ES Valo no estan en buena forma despues de una disminucion de la concentracion de celulas alimentadoras en el matraz, entonces las celulas aviares se cultivan para pases adicionales con la misma concentracion de celulas alimentadoras antes de proseguir la supresion de celulas alimentadoras.
La supresion de suero se realiza despues de supresion del factor de crecimiento y de las celulas alimentadoras. Al inicio de la supresion de suero, el medio de cultivo esta constituido de medio comercial basal DMEM-HamF12 complementado con suero bovino fetal 10% y con aminoacidos no esenciales 1%, con 1 % de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 1 mM, con p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.2 mM, glutamina en una concentracion final de 2.9 mM. Las celulas Valo de pollo se adapta al crecimiento en un medio de cultivo libre de suero en un procedimiento de dos etapas: en primer lugar, las celulas Valo de pollo se adaptan rapidamente a un medio de cultivo constituido de medio libre de suero comercial (SFM), preferiblemente, ExCell 60947 (SAFC Biosciences) complementado con suero bovino fetal 10% y con aminoacidos no esenciales 1%, con 1% de mezcla de vitaminas de origen comercial, con purivato de sodio a una concentracion final de 1 mM, con p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.2 mM, glutamina en una concentracion final de 2.9 mM. Una vez que se realiza esta adaptacion rapida a un medio nuevo (DMEM-HamF12 a Excell 60947) se realiza, se inicia una segunda etapa que consiste de una adaptacion lenta a una concentracion cada vez menor de suero animal en el medio SFM. La supresion de suero se realiza por una disminucion progresiva comenzando desde 10% de suero, despues 7.5%, posteriormente 5%, despues 2.5%, despues 1.25%, posteriormente 0.75% de concentracion de suero en medio de cultivo celular SFM hasta finalmente alcanzar 0% de suero en medio de cultivo celular SFM. La supresion de suero comi enza en el pase 103 y finaliza en el pase 135.
Al final del procedimiento de eliminacion de suministro de suero cuando la concentracion remanente de suero en el medio SFM es de 0.75% o 0%, la adaptacion de celulas EBv13 dependientes de anclaje para el cultivo de suspension se inicia. Entre los varios intentos realizados para aislar aislados EBv13 independientes de anclaje, 62.5% de los intentos tuvieron exito y permitieron obtener diferentes aislados de suspension de celulas EBvI3. Se selecciono un aislado de celulas EBv13 de acuerdo con el tiempo de duplicacion de poblacion (aproximadamente 18 h), la concentracion celular optima en el cultivo de matraz (aproximadamente 4 millones de celulas/mI), la viabilidad celular, la homogeneidad de cultivo celular (presencia y tamano de grupos de celulas) y la facilidad de manipular las celulas (figura 1).
Al final de la supresion de suero, las celulas Valo de pollo dependientes de anclaje, denominadas EBv13 son capaces de crecer en ausencia de factores de crecimiento y la ausencia de celulas alimentadoras, en medio libre de suero. Las celulas EBv13 despues se adaptan al crecimiento a 37°C al disminuir progresivamente la temperatura de
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EJEMPLO 2: Linea de celulas EB de pollo, linea 0 de cepa de polios SPF ELL-0
2.1 -MATERIAS PRIMAS
Huevos:
Se proporcionan pollos de cepa libre de patogeno especffico (SPF) denominada ELL-0 (linea Lancing oriental 0) por el Avian Disease and Oncology Laboratory (VSDA-ARS-MWA, EUA). Estos huevos de pollo SPF se producen de una parvada analizada intensamente en busqueda de diversos patogenos para aves de corral. Las enfermedades probadas incluyen: Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum, mycoplasma gallisepticum mycoplasma synoviae, virus de Leucosis aviar A-D y J, virus de enfermedad de Marek, virus de reticuloendoteliosis, adenovirus aviar, bronquitis infecciosa, enfermedad bursal infecciosa, influenza aviar, enfermedad de Newcastle, encefalomielitis aviar y reovirus aviar. Los huevos de pollo de linea 0 se envfan unicamente a desinfeccion con el descontaminante para evitar cualquier riesgo de contaminacion relacionado con la manipulacion de los huevos durante el transporte.
Celulas alimentadoras
En la primera etapa del procedimiento de establecimiento de EB linea 0, se utilizan celulas de origen murino (celulas STO) como una capa alimentadora para mantener la pluripotencia de citoblastos de pollo. Estas celulas alimentadoras se inactivan mitoticamente por irradiacion y (45 a 55 Grays) antes de su siembra en plastico. Esta dosis de irradiacion es una dosis submortal que induce una supresion definitiva del ciclo celular pero que aun permite la produccion de factores de crecimiento y matriz extracelular, necesarios para la promocion del crecimiento celular de celulas no diferenciadas.
La linea de celulas STO se deriva de A. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada de una linea continua de fibroblastos embrioncitos de raton SIM (ratones endogamicos Sandos) y se suministra por la American Type Culture Collection (ATCC) (STO, numero de producto: CRL-1503, numero de lote 1198713). Se preparan capas de alimentador fresco dos veces a la semana. Las celulas exponenciales se disocian y se cuentan. Una parte de las celulas se siembra para mantenimiento de cultivos viables y otra parte se irradia. Para irradiacion, preparamos una suspension celular a 10 x 106 celulas/ml en tubos. Las celulas se exponen a una dosis de 45 a 55 grey y se siembran en plastico. Despues de la siembra, los recipientes en placas de cubiertos con celulas alimentadoras inactivadas se utilizan durante un maximo de 5 dfas.
Medios
DMEM -HamF12 (Cambrex, Cat No. BE04-687)
medio GTM-3 (Sigma, n.° de catalogo G9916)
medio EX-CELLmR 66522, 65788 y 66444 (SAFC, medio adaptado)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, n.° de catalogo BE17-605E) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat No. BE17-602E» Aminoacidos no esenciales (Ambrex, n.° de catalogo BE13-114E) Piruvato de sodio (Cambrex, n.° de catalogo BE13-115)
Vitaminas (Cambrex, n.° de catalogo 13-607C) Beta-mercaptoetanol (Sigma, n.° de catalogo M7522)
Yeastolate (SAFC, n.° de catalogo 58902C)
Amortiguadores y fijadores
PBS 1X (Cambrex, n.° de catalogo BE17-516F)
Agente crioprotector
Sulfoxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, n.° de catalogo D2650)) Factores
Se utilizan seis factores recombinantes diferentes:
imagen1
Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 450-13)
Factor 1 similar a insulina humano recombinante (IGF-l) (Peprotech lnc, n.° de catalogo 100-11) Interleucinas-6-humanas recombinantes (lL-6) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 200-06)
Receptor de interleucina 6 soluble humanas recombinante (sIL6r) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 200-06
5
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R)
O Factor de citoblastos humanos recombinantes (SCF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 300-07)
O Factor de crecimiento de fibroblastos basicos humanos recombinantes (bFGF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 100-18B)
Todos los factores, excepto IL6r, se producen en bacterias E. coli IL6r soluble se expresa en celulas HEK293 transfectadas.
Suero bovino fetal
Suero bovino fetal no irradiado (FBS) (SAFC, n° de catalogo 12003)
El suero no irradiado utilizado en el programa se recolecta y produce en Australia. Los animales utilizados para recoleccion se inspeccionaron por USDA y son aceptables para matanza. Se agrega en el medio durante el cultivo de citoblastos aviares. Este lote no se envfa a irradiacion para evitar la destruccion de protefnas crfticas o componentes identificados como esenciales para el mantenimiento de citoblastos en cultivo.
Suero irradiado (JRH, n.° de catalogo 12007)
El lote irradiado utilizado en este programa se recolecta en Australia. Este lote irradiado se agrega como suplemento en el medio DMEM utilizado para el cultivo de celulas STO o FED (celulas alimentadoras). Aquellas celulas que no requieren como citoblastos una cantidad especffica de suero para crecimiento y mantenimiento en cultivo. Para minimizar la alta concentracion de suero en el medio se adaptaron las celulas STO para que crecieran en presencia de 4% de FBS unicamente.
Agentes disociantes
•Trypzean (Sigma, n.° de catalogo T3449)
2.2 - PROCEDIMIENTO DE ESTABLECIMIENTO DE LA LINEA DE CELULAS LINEA 0
Los embriones de 13 huevos de pollos de lfnea 0 se recolectaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.2. Despues, los embriones de lfnea 0 se colocaron en un tubo que contiene PBS 1X. Los embriones despues se disociaron mecanicamente y se inocularon sobre una capa de celulas STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C. Las celulas alimentaron se sembraron en recipientes a aproximadamente 2.7 x 104 celulas/cm2. El medio de cultivo completo esta constituido de medio comercial basal DMEM-HamF12 complementado con suero bovino fetal 10% con IGF 1, CNTF, bFGF, IL-6, IL-6r y SCF a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1% de aminoacidos no esenciales, con 1 % de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 1 mM, con , p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.2 mM, glutamina a una concentracion final de 2.9 mM con yeastolate 1X y con una mezcla inicial de antibioticos que contienen penicilina a una concentracion final de 100 U/mI y estreptomicina a una concentracion final de 100 pg/ml. Despues de 7 pases, la mezcla de antibioticos ya no se agrega al medio.
Cuando las celulas ES aviares de embriones de pollo lfnea 0 se transfieren de un recipiente de cultivo a otro, la siembra de los recipientes de cultivo se realiza con aproximadamente entre 7 x 104/cm2 a 8 x 104/cm2 de celulas ES aviares en medio de cultivo completo. Preferiblemente, la siembra se realiza a aproximadamente 7.3 x 104/cm2 (4 x 106 celulas/55 cm2 o 4 x 106 celulas/recipiente de 100 mm). Las celulas aviares, preferiblemente celulas embrionicas aviares de la etapa a) se cultivan durante varios pases en medio completo complementado con 10 o 15% de FBS. En el pase 7, el medio completo se suprime de factores de crecimiento bFGF, IL-6, IL-6r y SCF. Dicha supresion se realiza directamente en una etapa, de un pase a otro. Los embriocitoblastos, preferiblemente las celulas embrionicas aviares se cultivan durante varios pases en medio completo sin estos 4 factores de crecimiento. En el pase 12, los dos ultimos factores, IGF-1 y CNTF, se retiran del medio y las celulas se amplifican sin factor.
Para promover el crecimiento celular se utilizan sucesivamente 3 medios base: DMEM-HamF12 del pase 1 al pase 18, Excell GTM-3 del pase 18 al pase 26 y una mezcla de Excell 66788 y Excell 66522 despues del pase 26.
Despues del pase 30, la supresion de celulas alimentadoras se realiza por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras durante varios pases siguiendo un procedimiento etapa por etapa descrito previamente. Durante esta fase de supresion de alimentador, algunas capaces de crecer en suspension se afslan utilizando Excell 66444 como medio de crecimiento y se inicia la supresion de suero (figura 1B).
EJEMPLO 3: Celulas EBx de pato, lfnea EB66
3.1 -MATERIA PRIMA
Huevos de pato
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Los huevos de pato pequines cepas GL30 se obtienen de GRIMAUD FRERES SELECCION (La Corbiere, Roussay Francia). Los patos de origen se vacunaron contra Escherichia coli (vacuna autogena Coli 01 y 02), Pasteurella multocida (Landavax), hepatitis vinca de pato (Hepatovax), Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax), metapneumovirus avian (Nemovac), Salmonella typhimurium y Enteridis (vacuna autogena), Riemerella antipestifer (Autovaccine Riemerella), metapneumovirus aviar (N obilis RTV inactivo) y Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax). Despues de la recepcion, los huevos de pato pequines fertilizado se envian a desinfeccion en un bano de hipocloruro por una descontaminacion con Fermacidal (Thermo) para evitar cualquier riesgo de contaminacion relacionado con polvo unido al cascaron.
Celulas alimentadoras
En la primera etapa del procedimiento, las celulas de origen murino (celulas STO) se utilizan como capa alimentadora para mantener la pluripotencia de citoblasto de pato. Las celulas alimentadoras se inactivan mitoticamente por irradiacion y (45 a 55 grays) antes de sembrar en plastico. Esta dosis de irradiacion es una dosis sub mortal que induce supresion definitiva del ciclo celular pero que aun permite la produccion de factores de crecimiento y matriz extracelular, necesarios para la promocion y el crecimiento celular de celulas no diferenciadas. La linea de celulas STO derivada por A. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada de una linea continua de fibroblastos embrioncitos de raton SIM (ratones endogamicos Sandos) y se suministra por la American Type Culture Collection (ATCC) (STO, numero de producto: CRL-1503, numero de lote 1198713). Las capas alimentadoras frescas se preparan dos veces a la semana, las celulas en fase exponencial se disocian y se cuentan. Una parte de las celulas se siembra para mantenimiento de cultivos viables y otra parte se irradia. Para irradiacion, se prepara una suspension celular a 10 x 106 celulas/mI en tubos. Las celulas se exponen a una dosis de 45 a 55 greys y se siembran en plastico. Despues de la siembra, los recipientes o las placas se recubren con celulas alimentadoras inactivadas y se utilizan durante un maximo de 5 dias.
Medio
EX-CELLmr 65788, 65319, 63066 Y 66444 (SAFC, medio adaptado) medio GTM-3 (Sigma, n.° de catalogo G9916)
DMEM-HamF12 (Cambrex, Cat No. BE04-687)
DMEM (Cambrex, n.° de catalogo BE 12-614F)
Aditivos
Glutamina (Cambrex, n.° de catalogo BE17-605E) Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat No. BE17-602) Aminoacidos no esenciales (Ambrex, n.° de catalogo BE13-114E) Piruvato de sodio (Cambrex, n.° de catalogo BE13-115)
Vitaminas (Cambrex, n.° de catalogo 13-607C) Beta-mercaptoetanol (Sigma, n.° de catalogo M7522)
Yeastolate (SAFC, n.° de catalogo 58902C)
Amortiguador y fijadores
PBS 1X (Cambrex, n.° de catalogo BE17-516F)
Agente crioprotector
Sulfoxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, n.° de catalogo D2650) Factores
Se utilizan dos factores recombinantes diferentes:
□
Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 450-13)
□
Factor I similar a insulina humano recombinante (IGF 1) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 100-11) Estos 2 factores se producen en bacterias E. coli.
Suero bovino fetal
Suero bovino fetal no irradiado (FBS) (SAFC, n.° de catalogo12003)
El suero no irradiado utilizado en el programa se recolecta y produce en Australia. Los animales utilizados para- recoleccion se inspeccionaron por USDA y son aceptables para matanza. Se agrega en el medio durante el cultivo de citoblastos aviares. Este lote no se envia a irradiacion para evitar la destruccion de proteinas criticas o componentes identificados como esenciales para el mantenimiento de citoblastos en cultivo.
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Suero irradiado (JRH, n.° de catalogo 12107)
El lote irradiado utilizado en este programa se recolecta en Australia. Este lote irradiado se agrega como suplemento en el medio DMEM utilizado para el cultivo de celulas STO (celulas alimentadoras). Aquellas celulas que no requieren como citoblastos una calidad especffica de suero para crecimiento y mantenimiento en cultivo. Para minimizar la alta concentracion de suero en el medio se adaptaron las celulas STO para que crecieran en presencia de 4% de FBS unicamente.
Agentes disociantes:
• Pronase (Roche, n.° de catalogo 165 921)
Pronase es una pro teas a recombinante fabricada por Roche Diagnostics, Alemania, utilizada para la disociacion de citoblastos aviares adherentes.
• Tripsina EDTA (Cambrex, catalogo No. BE17-161 E)
Se utiliza tripsina para la disociacion de celulas STO y en pases tardfos para la disociacion de celulas aviares adaptadas a medio libre de suero. Esta enzima de origen porcino es fabricada asepticamente de acuerdo con condiciones de referencia cGMP por un metodo de filtracion esteril validado y se prueban de acuerdo con E.P. actual. La materia prima, irradiada antes de la formulacion, se prueba para parvovirus porcino en cumplimiento estricto con 9/CFR 113.53.
• Trypzean (Sigma, n.° de catalogo T3449)
La solucion de Trypzean se formula con tripsina bovina recombinante, expresada en mafz y fabricada por Sigma Aldrich utilizando un sistema de expresion de protefna vegetal transgenica registrado ProdiGene. Este producto se optimiza para disociacion celular tanto en cultivos de celula adherentes libre de suero como complementado con suero.
• Solucion de disociacion celular no enzimatica (Sigma, n.° de catalogo C5914)
Este agente de disociacion es una formulacion lista para utilizarse que se usa para separar suavemente celulas de la superficie de crecimiento en el recipiente de cultivo. La formula no contiene protefnas y permite la disociacion de las celulas sin el uso de enzimas. Las protefnas celulares se preservan posibilitando estudios inmunoqufmicos que dependen del reconocimiento de las protefnas de superficie celular. Esta enzima se utiliza para separar celulas antes de analisis FACS de marcadores biologicos como EMA-1 (antfgeno 1 de membrana epitelial) y SSEA-1 (antfgeno 1 embrionico especffico de etapa).
3.2 -PROCEDIMIENTO PARA EL ESTABLECIMIENTO DE CELULAS EBx DE PATO LINEA EB66
Aproximadamente 360 huevos de pato fertilizados se abren, se separa la yema de la albumina durante la abertura. Se extraen los embriones de la yema con la ayuda de papel filtro absorbente pequeno (papel Whatmann 3M), se recortan de antemano en forma de un anillo perforado con ayuda de un punzon. El diametro de perforacion es de aproximadamente 5 mm. Estos anillos pequenos se esterilizan utilizando calor seco aproximadamente 30 minutos en el horno. En la practica, durante la etapa de recoleccion de embriones, se deposita un anillo de papel pequeno sobre la superficie de la yema y se centra sobre el embrion el cual de esta manera esta rodeado por un anillo de papel. Este ultimo despues se recorta con la ayuda de un par pequeno de tijeras y la totalidad se extrae y se coloca en una caja de Petri, llenada con PBS. De esta manera el embrion es transportado por el anillo en donde se limpia el exceso de yema en el medio y el disco embrionico, de esta manera libre de exceso de vitelina se recolecta con una pipeta Pasteur.
Los embriones de pato se colocan en tubos de 50 ml que contienen PBS 1X. Los embriones de pato se disocian mecanicamente de esta manera, se lavan con PBS y se siembran en una capa inactivada de celulas STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C, CO2 7.5%. Las celulas alimentadoras se siembran en placas de 6 pozos o en recipientes de aproximadamente 2.7 x 104 cm2. El medio de cultivo completo esta constituido de DMEM-HamF12 de medio libre de suero complementado con suero bovino fetal 10%, con IGF 1, CNTF, a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1 % de aminoacidos no esenciales, con 1% de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina en una concentracion final de 2.1 mM, penicilina en una concentracion final de 100 U/ml, estreptomicina a una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolate 1X. Rapidamente en el pase 4, la mezcla de antibioticos ya no se agrega al medio.
Las celulas ES de pato se cultivan en medio DMEM-HamF12 hasta el pase 4. Despues del pase 4, el medio de base se modifica y se sustituye el medio completo DMEM-HamF12 por el medio SFM GTM-3 complementado con suero bovino fetal 10%, con lGF-1, CNTF a una concentracion final de 1 ng/ml con 1 % de aminoacidos no esenciales, con 1 % de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con
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p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM de glutamina a una concentracion final de 2.1 mM y yeastolate 1X. Las celulas ES de pato se cultivan adicionalmente durante 14 pases en este medio nuevo de cultivo y despues se lleva a cabo la eliminacion de suministro de factores de crecimiento en el pase 18. Se retiran simultaneamente IGF-1 y CNTF del medio, de esta manera, desde el pase 19 al pase 24, el medio de cultivo es medio GTM-3 complementado con FBS 10%, con aminoacidos no esenciales 1%, 1% de mezcla de vitaminas de origen comercial con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM con p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina a una concentracion final de 2.1 mM y yeastolate 1X.
Cuando las celulas ES de pato de embriones de pato pequines se hacen pasar de un recipiente de 'cultivo a otro, la siembra del recipiente de cultivo se realiza con aproximadamente entre 7 x 104/cm 2 a 2 x 104/cm2 de celulas ES de pato en medio de cultivo completo.
Despues, posterior al pase 24, la supresion de celulas alimentadoras se realiza por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras durante varios pases. Los recipientes originalmente se siembran con aproximadamente 2.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 1.8 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 25 y 31, posteriormente aproximadamente 1.4 x 104 celulas/cm2 entre los pases 32 y 35, despues aproximadamente 1 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre los pases 36 y 41, despues aproximadamente 0.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 42 y 44 y finalmente desde el pase 45 los recipientes se siembran unicamente con celulas aviares y sin celulas alimentadoras. Al final de la supresion de alimentador, los recipientes se siembran con 9 x 104 celulas aviares/cm2 a 12.7 x 104 celulas aviares/cm2. La supresion de celulas alimentadoras se inicia en el pase 25 y finaliza en el pase 45. Durante la supresion de celulas alimentadoras, las celulas ES de pato se siembran en recipientes de cultivo a una concentracion mayor que en la etapa a), aproximadamente de alrededor de 9 x 104 celulas/cm2 a 12.7 x 104 celulas/cm2.
Despues de varios pases sin celulas alimentadoras, se estudia los parametros de crecimiento (tiempo de duplicacion de poblacion (PDT) y densidad) para confirmar la estabilidad y robustez celulares y para iniciar la eliminacion del suministro de aminoacidos, vitaminas, p-mercaptoetanol, piruvato de sodio y yeastolate. Las celulas se consideran suficientemente robustas para ser enviadas a dicha eliminacion de suministro si PDT es menor de aproximadamente 40 horas y la densidad celular es superior de aproximadamente 26 x 104 ce1ulas/cm2.
En el caso del actual desarrollo de celulas EBx® de pato, denominadas EB66, la eliminacion de suministro de vitaminas, piruvato de sodio, aminoacidos no esenciales y p-mercaptoetanol se inicia en el pase 52. Todos estos aditivos se retiran simultaneamente del medio. De esta manera, entre el pase 52 y el pase 59, el medio de cultivo es SFM GTM-3 complementado con glutamina, yeastolate y FBS. Despues de un perfodo de adaptacion breve a las nuevas condiciones de cultivo, se inicia la disminucion de temperatura. Esta disminucion se realiza progresivamente entre el pase 60 y el pase 67. Despues del pase 67, las celulas son capaces de crecer a 37°C. Despues del pase 67, el medio de base GTM-3 se sustituye por un medio de base SFM nuevo denominado Excell 65788. Asf, despues del pase 67, el medio de cultivo es Excell 65788 complementado con FBS 10%, glutamina 2.5 mM y yeastolate 1X. En el pase 80, se transfieren 4 x 106 celulas en un recipiente Ultra Low Attachment (ULA) que se mantiene bajo agitacion constante para iniciar el crecimiento de celulas independiente de anclaje. Para promover el crecimiento como suspension, el medio de base se modifica y se disminuye el porcentaje de suero de 10% a 5% para la siembra en el recipiente ULA. De esta manera, del pase 80 al pase 85 el medio de cultivo es SFM GTM-3 complementado con FBS 5%, glutamina 2.5 mM y yeastolate 1X. La disminucion lenta de FBS se inicia en la suspension celular EB66 despues del pase 85. La supresion de suero se realiza por una disminucion progresiva comenzando desde suero 2.5% despues 1.5% de concentracion de suero en medio de cultivo de celulas SFM para finalmente llegar a 0% de suero en medio de cultivo celular SFM. La supresion de suero comienza en el pase 86 y finaliza el pase 94. Al final de la supresion de suero, las celulas dEB66 independientes de anclaje son capaces de crecer a 37°C en ausencia de factores de crecimiento, en ausencia de celulas alimentadoras en medio libre de suero.
Despues de obtener las celulas EB66 de pato que son capaces de crecer a 37°C en SFM GTM-3 complementado con glutamina 2.5 mM, se realiza cierta adaptacion adicional del medio SFM por dilucion o adaptacion progresiva en formulaciones SFM nuevas como Excel 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF, por ejemplo.
La subclonacion de la suspension de celulas EB66 de pato tambien se puede llevar a cabo en presencia o ausencia de yeastolate.
EJEMPLO 4: Celulas EBx de pato. lfnea EB26
4.1 -MATERIAS PRIMAS
Huevos de" pato, celulas alimentadoras, aditivos, amortiguadores y fijadores, agentes crioconservadores, suero bovino fetal y agentes disociantes (Igual que en el Ejemplo 3).
Se utilizan huevos de pato de pato pequines cepa GL30.
Medio
EX-CELLMR 65319, 63066 Y 66444 (SAFC, medio adaptado)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Medio GTM-3 (Sigma, n.° de catalogo G9916) DMEM (Cambrex, n.° de catalogo BE 12-614F)
Factores
Se utilizan seis factores recombinantes diferentes:
d Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 450-13) d Factor I similar a insulina humano recombinante (IGF-1) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 100-11) d Interleucinas 6 humanas recombinantes (IL-6) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 200-06)
□ Receptor de interleucina 6 soluble humanas recombinante (sIL-6r) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 200-06
R)
d Factor de citoblastos humanos recombinantes (SCF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 300-07)
□ Factor de crecimiento de fibroblastos basicos humanos recombinantes (bFGF) (Peprotech Inc, n.° de catalogo 100-18B)
Todos los factores, excepto IL-6r, se producen en bacterias E. coli. IL-6r soluble se expresa en celulas HEK293 transfectadas.
4.2 -PROCEDIMIENTO DE ESTABLECIMIENTO DE LA CELULA EBx DE PATO, LINEA EB26
Se recolectaron embriones de pato como se ha descrito previamente con EB66. Los embriones de pato se colocaron en tubos de 50 mI que contienen PBS 1X. Los embriones de pato despues se disociaron mecanicamente, se lavaron en PBS y se sembraron sobre una capa inactivada de celulas STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C, CO2 7.5%. Las celulas alimentadoras se sembraron en placas de 6 pozos o en recipientes a aproximadamente
2.7 x 104 celulas/cm2. El medio de cultivo completo esta constituido de medio libre de suero GTM-3 complementado con suero bovino fetal 5%, con IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1% de aminoacidos no esenciales, con 1% de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con (3mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina a una concentracion final de 2.1 mM, penicilina a una concentracion final de 100 U/mI, estreptomicina a una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolate 1X. Rapidamente despues de los primeros pases de la celula, las mezclas de antibioticos ya no se agregaron al medio. La expresion "rapidamente" se entiende que significa despues de los primeros 3 a 9 pases en general. Las celulas ES de pato se cultivaron en medio completo hasta el pase 9. Despues del pase 9 el medio completo se suprime parcialmente en factores. De esta manera, entre el pase 10 y 13, se elimino del medio SCF, IL-6, IL-6r y bFGF y solo se mantuvo IGF-1 recombinante y CNTF a una concentracion de 1 ng/ml. Una disminucion simultanea de la concentracion de IGF-1 y CNTF es realizada en segundo lugar entre el pase 13 y 16 para obtener finalmente celulas capaces de crecer sin factores recombinantes en el pase 17. La supresion del factor se realiza por una adaptacion progresiva a concentraciones cada vez mas bajas de factores. Cuando las celulas ES de pato de embriones de pato pequines se hacen pasar de un recipiente de cultivo a otro, la siembra del recipiente de cultivo se realiza con aproximadamente entre 7 x 104/cm2 a 12 x 104/cm2 de celulas ES de pato en el medio de cultivo completo. Preferiblemente, la siembra se realiza con aproximadamente 7.3 x 104/cm2 (4 x 106 celulas/55 cm2 o 4 x 106 celulas/recipiente de 100 mm). Despues de supresion de los factores recombinantes se realiza una disminucion de yeastolate en el pase 23 alcanzando la concentracion final a 0.5X. Despues, posterior al pase 31, la supresion de celulas alimentadoras se realiza por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras sobre varios pases. Los recipientes originalmente se siembran con aproximadamente 2.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues aproximadamente 1.8 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 32 y 38 y despues aproximadamente 1.4 x 104 celulas/cm2 entre el pase 39 y 44, despues aproximadamente 1 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 45 y 47 y despues de aproximadamente 0.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 48 al 50 y finalmente desde el pase 51 los recipientes se siembran unicamente con celulas aviares y sin celulas alimentadoras. Al final de la supresion de alimentador, los recipientes se siembran con 9 x 104 celulas aviares/cm2 a
12.7 x 104 celulas aviares/cm2. La supresion de las celulas alimentadoras comienza en el pase 32 y finaliza en el pase 51. Durante la supresion de celulas alimentadoras, las celulas ES de pato se siembran en recipientes de cultivo a una concentracion mayor que en la etapa a), de aproximadamente 9 x 104 celulas/cm2 a 12.7 x 104 celulas/cm2. Despues de varios pases sin celulas alimentadoras, se estudian los parametros de crecimiento (tiempo de duplicacion en poblacion (PDT) y densidad) para confirmar la estabilidad y robustez celulares e iniciar el crecimiento celular como suspension. Se considera a las celulas como suficientemente robustas para ser enviadas a cultivo en suspension si PDT es menor de aproximadamente 40 horas y la densidad celular es mayor de aproximadamente 26 x 104 celulas/cm2. Ademas, la morfologia de las celulas debe ser: redonda, refringente, muy pequena y las celulas no deben unirse al recipiente de plastico demasiado.
En el caso del desarrollo de celulas EB26, el cultivo en suspension se inicia en el pase 53. Se transfieren 7 x 106 celulas en un recipiente de union Ultra Low y se mantienen bajo agitacion constante a aproximadamente 50 a 70 rpm. Para los siguientes pases, las celulas se siembran en matraces T175 (Sarsted, ref 831812502) a una concentracion que comprende entre 0.4 y 0.5 x 106 celulas/ml. Despues de un perfodo breve de adaptacion a las condiciones de cultivo nuevas, las celulas PDT disminuyen de aproximadamente 160 H a 40 horas. Considerando esta buena evolucion, en el pase 59, se realiza un nuevo grupo de eliminacion de suministros. De esta manera, se retiraron vitaminas, piruvato de sodio, p-mercaptoetanol y aminoacidos no esenciales. De esta manera, despues del
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pase 59, el medio de cultivo se suplementa con FBS 5%, yeastolate 0.5 X y glutamina 2.5 mM solamente. La supresion de suero se realiza sobre suspensiones de celulas ya carentes de factor de crecimiento, celulas alimentadoras, vitaminas, aminoacidos no esenciales, piruvato de sodio y p-mercaptoetanol. La supresion de suero se realiza por una disminucion progresiva comenzando desde suero 5%, despues 2.5%, despues 1.5% de concentracion de suero en medio de cultivo celular SFM para finalmente llegar a 0% de suero en medio de cultivo celular SFM. La supresion de suero comenzo en el pase 61 y finalizo en el pase 79. Al final de la supresion de suero, las celulas EB26 de pato independientes de anclaje son capaces de crecer a 39°C en ausencias de factores de crecimiento, en ausencia de celulas alimentadoras, en medio libre de suero. Las celulas EB26 despues se adaptan al crecimiento en ausencia de yeastolate 0.5X a 37°C al disminuir la temperatura de cultivo celular en el pase 80.
Despues de obtener celulas EB26 que son capaces de crecer a 37°C en SFM GTM-3 complementado con glutamina 2.5 mM, se realizaron algunas adaptaciones adicionales por dilucion o adaptacion progresiva de formulaciones SFM nuevas como Excell 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF. La subclonacion de la suspension de celulas EB26 de pato tambien se puede llevar a cabo en presencia o ausencia de yeastolato.
EJEMPLO 5. Celulas EBx de pato. linea EB24
5.1 -MATERIA PRIMA
Huevos de pato, celulas alimentadoras, aditivos, amortiguadores y fijadores, agentes crioconservadores, suero bovino fetal y agentes disociantes (identico al ejemplo 3).
Se utilizaron huevos de pato pequines cepas GL30.
Medio
Medio EX-CELL™ 65319, 63066 Y 66444 (SAFC, medio adaptado) Medio GTM-3 (Sigma, Cat n° G9916)
DMEM F12 (Cambrex, Cat n° BE04-687)
DMEM (Cambrex, Cat n° BE 12-614F)
Factores
Se utilizaron seis factores recombinantes diferentes:
^Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat n° 450-13)
^Factor I similar a insulina humana recombinante (IGF-1) (Peprotech Inc, Cat n° 100-11) r"]|nterleucina 6 humana recombinante (IL-6) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06)
^Receptor de interleucina 6 soluble humano recombinante (slL-6r) (Peprotech Inc, Cat n° 200-06 R)
^Factor de citoblastos humano recombinantes (SCF) (Peprotech Ine, Cat n° 300-07)
^Factor de crecimiento de fibroblastos basico humano recombinante (bFGF) (Peprotech Inc, Cat n° 100-18B)
Todos estos factores, excepto IL-6r se producen en bacterias E. coli. IL-6r se expresa en celulas HEK293 transfectadas.
5.2 -PROCEDIMIENTO DE ESTABLECIMIENTO DE LA LINEA DE CELULAS EBx®DE PATO EB24
Se recolectan embriones de pato como se ha descrito previamente con EB66. Los embriones de pato se colocan en tubos de 50 ml que contienen PBS 1X. Los embriones de pato despues se disocian mecanicamente y se siembran sobre una capa inactivada de celulas STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C, CO2 7.5%. Las celulas alimentadoras se siembran en placas de 6 pozos o en recipientes a aproximadamente 2.7 x 104 celulas/cm2. El medio de cultivo completo esta constituido de medio libre de suero DMEM-HamF12 complementado con suero bovino fetal 10% con IGF-1, CNTF, II-6, II-6R, SCF y FGF a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1 % de aminoacidos no esenciales con 1 % de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con p-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina a una concentracion final de 2.1 mM, penicilina a una concentracion final de 100 U/mI, estreptomicina a una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolato 1X. Rapidamente despues de los primeros pases de las celulas, la mezcla de antibioticos ya no se agrego mas al medio. La expresion rapidamente se entiende que significa despues del primero de 3 a 9 pases en general.
Las celulas ES de pato se cultivan en medio completo DMEM-HamF12 hasta el pase 7. Despues del pase 7 el medio de base se modifica y el medio completo DMEM-HamF12 se sustituye por medio completo GTM-3 complementado con suero bovino fetal 10%, con IGF1, CNTF, II-6, II-6R, SCF y FGF a una concentracion final de 1 ng/ml con 1 % de aminoacidos no esenciales, con 1 % de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con ~-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina a una concentracion final de 2.1 mM, penicilina a una concentracion final de 100 U/mI, estreptomicina en una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolato 1X. Por lo tanto, en el pase 11, la concentracion de suero disminuye en 5% y se retiran SCF, IL-6, IL-6R y bFGF del medio. De esta manera, desde el pase 11, el medio esta constituido de FBS 5%
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con IGF-1 y CNTF en una concentracion final de 1 ng/ml con 1% de aminoacidos no esenciales, con 1 % de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con p-mercaptoetanol en una concentracion final de 0.5 mM, glutamina en una concentracion final de 2.1 mM, penicilina en una concentracion final de 100 U/ml, estreptomicina en una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolato 1X. Se realiza una suspension simultanea de IGF-1y CNTF en el pase 22. No estan presentes factores recombinantes en el medio de cultivo GTM-3 despues del pase 22. Las celulas de pato se mantienen en dicho medio entre el pase 23 y el pase 28. Cuando las celulas ES de pato de los embriones de pato pequines se hacen pasar de un recipiente de cultivo a otro, la siembra del recipiente de cultivo se realiza con aproximadamente entre 7 x 104/cm2 a 12 x 104/cm2 de celulas Es de pato en el medio de cultivo completo. Preferiblemente, la siembra se realiza con aproximadamente 7.3 x 104/cm2 (4 x 106 celulas/55 cm2 o 4 x 106 celulas/recipiente de 100 mm). Despues, posterior al pase 28, se realiza la eliminacion de celulas alimentadoras por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras durante varios pases. Los recipientes originalmente se siembran con aproximadamente 2.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2, despues con aproximadamente 1.8 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 29 y 33, despues aproximadamente 1.4 x 104 celulas/cm2 entre el pase 34 y 37, despues aproximadamente 1 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 38 y 42, despues con aproximadamente 0.7 x 104 celulas alimentadoras/cm2 entre el pase 43 y 46, Y finalmente desde el pase 47 los recipientes se siembran unicamente con celulas aviares y sin celulas alimentadoras. Al final de la supresion de alimentador los recipientes se siembran con 9 x 104 celulas aviares/cm2 a
12.7 x 104 celulas aviares/cm2. La eliminacion de celulas alimentadoras comienza en el pase 29 y finaliza en el pase 47. Durante la eliminacion de las celulas alimentadoras, las celulas Es de pato sembradas en recipientes de cultivo a una concentracion mayor que en la etapa a), aproximadamente de alrededor de 9 x 104 celulas/cm2 a 12.7 x 104 celulas/cm2. Despues de varios pases sin celulas alimentadoras, se estudiaron los parametros de crecimiento (tiempo de duplicacion de poblacion (PDT) y densidad) para confirmar la estabilidad y robustez de las celulas y para iniciar el crecimiento celular como una suspension. Las celulas se consideran como suficientemente robustas para ser enviadas a un cultivo de suspension si el PDT es menor de aproximadamente 40 horas y la densidad celular es mayor de aproximadamente 26 x 104 celulas/cm2. Ademas, la morfologfa de las celulas debe ser: redonda, refringente, muy pequena y las celulas no deben estar unidas al recipiente de plastico demasiado. En el caso del desarrollo de celulas EB24, el cultivo en suspension se inicia en el pase 48. Se transfieren 8 x 106 celulas en un recipiente de union Ultra Low y se mantienen bajo agitacion constante a aproximadamente 50 a 70 rpm. Para los siguientes pases, las celulas se siembran en matraces T 175 (Sarsted, ref 831812502) a una concentracion que comprende entre 0.4 y 0.5 x 106 celulas/ml. Despues de un perfodo breve de adaptacion a las condiciones de cultivo nuevas, las celulas PDT disminuyen de aproximadamente 248 H a 128 horas y la siguiente etapa de supresion se lleva a cabo despues. De esta manera, en el pase 52, se han eliminado las vitaminas, aminoacidos no esenciales, piruvato de sodio y p-mercaptoetanol. Respecto a la buena evolucion de PDT al alcanzar las 44 horas, en el pase 56, desde el pase 57, se inicia la eliminacion de suministro de suero. De esta manera, desde el pase 57, el medio de cultivo gTM-3 se suplementa con FBS 5%, yeastolato 1X y glutamina 2.5 mM, unicamente. La eliminacion de suministro de suero se realiza en suspensiones de celulas que ya se les ha eliminado el suministro de factores de crecimiento, celulas alimentadoras, vitaminas, aminoacidos no esenciales, piruvato de sodio y ~ mercaptoetanol. La eliminacion del suministro de suero se realiza por una disminucion progresiva comenzando con suero 5%, despues 2.5%, posteriormente 2%, despues 1.5% de concentracion de suero en medio de cultivo de celulas SFM para finalmente alcanzar 0% de suero en medio de cultivo de celulas SFM. La eliminacion de suministro de suero comienza en el pase 57 y termina en el pase 77. Durante esta eliminacion de suministro de suero, tambien se realiza la adaptacion para crecimiento a 37°C. De esta manera, en el pase 65, las celulas que crecen en medio de cultivo complementado con FBS 2.5% se transfieren a 37°C evitando un desplazamiento de temperatura progresivo. Al final de la eliminacion de suministro de suero, las celulas EB24 de pato independientes de anclaje son capaces de crecer a 37°C en ausencia de factores de crecimiento, en ausencia de celulas alimentadoras, en medio libre de suero.
Despues de obtener celulas EB24 de pato capaces de crecer a 37°C en SFM GTM-3 complementado con glutamina 2.5 mM, se realiza cierta adaptacion adicional por dilucion de la adaptacion progresiva en formulaciones nuevas de SFM como Excell 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF. La subclonacion de la suspension de EB24 de pato se realiza y se selecciona un subclon de EB24-12 de pato debido a su buen desempeno para replicar eficazmente virus.
EJEMPLO 6: Lfnea de celulas EBx de pato Muscovy SPF
6. -MATERIA PRIMA
Huevos de pato:
Se obtienen huevos SPF de pato de las cepas Muscovy de Le Couvoir de Cerveloup (Francia). Estos huevos de pato SPF se producen a partir de una parvada analizada intensamente en busqueda de diversos patogenos para aves de corral. Las enfermedades probadas incluyen: Salmonella gallinarum-pullorum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma galliepticum, virus de enfermedad de Marek, influenza aviar, paramixovirus tipo 2, paramixovirus tipo 3, enfermedad de Newcastle, adenovirus tipo 3 (EDS), enfermedad de Gumboro, reovirus aviar, virus de reticuloendoteliosis, encefalomielitis aviar, rinotraqueitis infecciosa y clamidiosis. Los huevos de pato Muscovy se envfan unicamente a desinfeccion con el descontaminante para evitar cualquier riesgo de contaminacion relacionado con la manipulacion de huevos durante el transporte.
Celulas alimentadoras (veanse ejemplo anteriores)
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Medios
Medio EX-CELL™ MR 66444 (SAFC, medio adaptado)
Medio GTM-3 (Sigma, Cat no G9916)
DMEM-Ham F 12 (Cambrex, Cat no BE04-687)
Aditivos
glutamina (Cambrex, Cat no BE17-605E)
Penicilina/estreptomicina (Cambrex, Cat no BE17-602E) aminoacidos no esenciales (Cambrex, Cat no BEI3-114E) piruvato de sodio (Cambrex, Cat no BE13-115) vitaminas (Cambrex, Cat no 13-607C) p-mercaptoetanol (Sigma, Cat no M7522)
Yeastolato (SAFC, Cat no 58902C)
Amortiguadores y fijadores
PBS IX (Cambrex, Cat no BE17-65I6F)
Agente crioprotector
sulfoxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, Cat no D2650)
Factores
Se utilizaron dos factores recombinantes diferentes:
□ Factor neurotrofico ciliar humano recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, Cat no 450-13)
□ Factor I similar a insulina humana recombinante I(IGF1) (Peprotech Inc, Cat no 100-11)
Estos dos factores se producen en bacterias E. coli.
Suero Bovino Fetal
Suero bovino fetal (FBS) no irradiado (JRH, Cat No. 12003)
El suero no irradiado utilizado en el programa se recolecta y produce en Australia. Los animales utilizados para la recoleccion son inspeccionados por USDA y aceptables para matanza. Se ha agregado en el medio durante el cultivo de citoblastos aviares. Este lote no se envfa a irradiacion para evitar la destruccion de protefnas crfticas o componentes identificados como esenciales para el mantenimiento de los citoblastos en cultivo.
Suero irradiado (JRH, Cat no 12007)
El lote irradiado utilizado en este programa se recolecta en Australia. Este lote irradiado se agrega como suplemento en el medio DMEM utilizado para el cultivo de celulas STO (celulas alimentadoras). Estas celulas no requieren como citoblastos una calidad especffica de suero para crecimiento y mantenimiento en cultivo. Para minimizar la alta concentracion de suero en el medio hemos adaptado celulas STO para que crezcan en presencia de 4% de FBS unicamente.
Agentes de disociacion
• Pronasa (Ro che, Cat no 165 921)
•Trypzean (Sigma, cat no T3449)
6.2 -PROCEDIMIENTO DE ESTABLECIMIENTO DE LINEAS DE CELULAS EBx DE PATO MUSCOVY
Los embriones de 20 huevos SPF fertilizados de patos Muscovy se recolectan de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Los embriones de pato se colocan en tubos de 50 mI que contienen PBS 1X. Los embriones de pato despues se disocian mecanicamente, se lavan con PBS y se siembran en un pozo de una placa de 12 pozos recubierta con una capa inactivada de celulas STO alimentadoras. Las celulas embrionicas de pato se siembran en medio de cultivo completo y se transfieren a 39°C, CO2 7.5% 5%. Las celulas alimentadoras se siembran a aproximadamente 2.7 x 104 celulas/cm2. El medio de cultivo completo utilizado esta constituido de DMEM-Ham F12 complementado con suero bovino fetal 10% con IGF1, CNTF, a una concentracion final de 1 ng/ml y con 1% de aminoacidos no esenciales con 1 % de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con ~-mercaptoetanol a una concentracion final de 0.5 mM, glutamina en una concentracion final de 2.1 mM, penicilina en una concentracion final de 100 U/mI, estreptomicina en una concentracion final de 100 pg/ml y yeastolato 1X. En el pase 2, el medio de base DMEM-HamF12 se sustituye por
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medio de base GTM-3. La mezcla de antibioticos ya no se agrega al medio despues del pase 4.
Las celulas ES de pato se cultivan en medio GTM-3 completo hasta el pase 8. Despues del pase 8, la concentracion de IGF-1 y CNTF se reduce a 0.5 ng/ml. Las celulas ES de pato se cultivan adicionalmente durante el pase 2 en este medio nuevo de cultivo y despues se realiza eliminacion de suministro de factor de crecimiento en el pase 10. Se retiran del medio simultaneamente IGF1 y CNTF.
Asf, desde el pase 10 hasta el pase 37, el medio de cultivo es medio GTM-3 complementado con FBS 10%, con 1 % de aminoacidos no esenciales, con 1 % de mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentracion final de 0.1 mM, con p-mercaptoetanol en una concentracion final de 0.5 mM, glutamina en una concentracion final de 2.1 mM, y yeastolato 1X.
Cuando las celulas ES de pato aisladas de embriones de pato Muscovy se hacen pasar de un recipiente de cultivo a otro, la siembra se realiza con aproximadamente 12 x 104/cm2 de celulas ES de pato en el medio de cultivo. Ocasionalmente se utiliza cierto medio acondicionado para siembra de celulas para mejorar la recuperacion de celulas despues de la disociacion.
Posteriormente, despues del pase 37, se realizan la supresion de celulas alimentadoras por una disminucion progresiva de la concentracion de celulas alimentadoras durante varios pases siguiendo el procedimiento etapa por etapa descrito previamente.
Durante esta fase de eliminacion de suministro de alimentador, alguna celulas son capaces de crecer en suspension, se afslan y adaptan para crecer sin aditivos y suero (figura 4C). Las celulas EBx de pato Muscovy independientes de anclaje que expresan marcadores de celulas ES tales como telomerasa, SSEA-1 y EMA-1 (datos no mostrados).
EJEMPLO 7: Caracterizacion de lfneas de celulas lEBx
7.1 - CARACTERIZACION DE CEILUILAS VAlLO EBv13 DE POLLO
7.1.1 -Actividad de Telomerasa
La deteccion de telomerasa se obtiene mediante la utilizacion del sistema Telo TAGGG telomerasa PCR ELISA desarrollado por Roche Applied Science (Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP) -Cat. No. 11 854 666 910) de acuerdo con los procedimientos del proveedor.' El sistema Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA permite la amplificacion de productos de alargamiento mediados por telomerasa combinados con deteccion no radiactiva siguiendo un procedimiento ELISA. El analisis es valido si el valor de absorbancia del control negativo es menor que o igual a 0.25 A450nm -A690 nm y si el valor de absorbancia del control positivo es mayor que o igual a 1.5 A450 nm -A690 nm cuando se utiliza 1 x 103 equivalentes de celulas en el analisis. Las muestras se consideran como positivas a telomerasa si la diferencia en la absorbancia es superior a 0.2 A450 nm -A690 nm unidades. Se utilizan dos controles: el control negativo son fibroblastos murinos (celulas FED) y los controles positivos son celulas FGB8 (embriocitoblastos establecidos por Vivalis de embriones de raton 129 SV) y celulas EB14-O74 de pollo previamente establecidas en el documento WO 03/076601.
Los resultados que se obtienen se resumen en la figura numero 2. Las celulas EBv13 expresan un alto nivel de telomerasa. En el pase p193 y 195, la actividad de telomerasa es equivalente a una de celulas EB14-O74 de pollo.
7.1.2 -Marcadores biologicos de celulas ES
Los embrioncitos estan caracterizados por la expresion de marcadores biologicos expresados sobre la membrana celular. Se evaluo la expresion de EMA-1 (antfgeno 1 de membrana epitelial) y SSEA-1 (antfgeno 1 embrionico especffico de etapa) en celulas EBv13 por analisis FACS. Despues de 10 minutos con fijacion con PFA 4% (para- formaldehfdo), las muestras celulares y los controles se enjuagaron y preincubaron con anticuerpos monoclonales especfficos para EMA-1 o SSEA-1. Se utilizo un segundo anticuerpo conjugado a FITC para deteccion de celulas que expresan los 2 marcadores biologico seleccionados. Las muestras se analizan por citometrfa de flujo utilizando un FACS (clasificador de celulas activado por flujo) de Coulter.
El analisis FACS se realiza en celulas de fibroblastos de raton (celulas FED) como un control negativo, celulas ES FGB8 murinas como un control positivo, celulas EB14-O74 de pollo como un control positivo de celulas EBx y celulas Ebv13. Como se esperaba, las celulas FED no expresan marcadores biologicos mientras que las celulas FGB8 y EB14-O74 presentan una tincion importante, respectivamente, de 60.13% y 78.7 para EMA-1 y de 94.45% y 95% para SSEA-1 (datos no mostrados). La poblacion de celulas valo EBv13 de pollo no presentan ninguna tincion para EMA1 (2%) y una muy ligera para SsEA-1 (22%).
7.1.3 -Cariotipo
Se realizo analisis de cariotipo para verificar la diploidia de celulas y el origen aviar de celulas EBv 13. Las celulas en la fase exponencial de crecimiento se cosechan y tratan 2 horas por colcemide (0.02 pg/ml). Despues de lavado y centrifugacion se produce un choque hipotonico en celulas con kCi (0.56%) durante 20 minutos. Posteriormente se
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fijan celulas EBv13 en metanollacido acetico (3/1) y se almacenan durante la noche a -20°C. Al dfa siguiente, se realiza metafasis por puntos en vidrio, se tinen por una solucion de Wright/Giemsa y se observan bajo el microscopio. Se observan varias series de metafasis que confirman el origen de pollo de las celulas Ebv13. No se observan pruebas de poliploidia.
7.1.4 -Influencia de la composicion de medio de cultivo celular sobre el tamano de los grumos de celulas EBv13
Los inventores han encontrado que la concentracion de calcio y magnesio en el medio libre de suero utilizado para el cultivo de celulas EBx y la infeccion tienen un impacto en el tamano de los grumos.
La figura 10 muestra la disminucion en el tamano de los grumos cuando se hacen pasar a las celulas EBv13 de un medio con una concentracion alta a una baja de Ca2+ y Mg2+.
7.2 -CARACTERIZACION DE LA LINEA DE CEL ULAS EBx DE PATO
7.2.1 -Morfologfa de las celulas EBx de pato
El analisis por microscopia electronica de transmision de celulas dEBx® se realiza por el Doctor A Rivoire (Lyon, Francia). Las celulas EBx® de pato muestran una morfologfa de embriocitoblastos tfpica (es decir, una relacion alta nucleo-citoplasma) que recuerda el fenotipo de embriocitoblastos murinos y celulas EB14 VIVALIS descritas en el documento WO2006/108846. Las celulas EBx® de pato son celulas redondas pequenas (diametro -10 pm) con un nucleo grande y nucleolo, con seudopodos cortos que se extienden desde la membrana plasmatica (figura 4). Son altamente activos metabolicamente con un citoplasma rico en ribo somas y mitocondrias. Contienen numerosas vacuolas intracelulares, un sistema de Golgi muy desarrollado y un retfculo endoplasmfco granuloso.
7.2.2 -Expresion de telomerasa de celulas EBx® de pato
Se investigo la expresion de telomerasa durante diferentes etapas de establecimiento en celulas EBX® de pato mediante la utilizacion del equipo de deteccion de telomerasa de Roche (Telomerase OCR ELISA). Se encontro que la telomerasa se encuentra altamente expresada en celulas EBx® de pato adherentes asf como durante la eliminacion del suministro de alimentador, durante el procedimiento de adaptacion de las celulas EBx® de pato a suspension y durante la eliminacion del suministro de alimentador. La figura 5 muestra que EB24 y EB26 de pato presentan un alto nivel de telomerasa, de manera similar a las celulas EB14 de pollo. EB66 de pato tambien expresa un alto nivel de telomerasa en todos los pases celulares. Esta elevada actividad de telomerasa es estable en celulas EB66 despues de adaptacion en diferentes SFM (figura 15).
7.2.3 -Las celulas EBx® de pato no muestran actividad de transcriptasa inversa endogena
Se investigo la expresion de transcriptasa inversa endogena mediante el analisis F-PERT directo (Lovatt et al., 1999, J. Viral. Methods, 82: 185-200) en celulas Clean (FRANCE). Las lfneas celulares EBx® de pato, EB24 (datos no mostrados), EB66 (datos no mostrados), EB26 y EB51 no muestran actividad de transcriptasa inversa (RT) endogena (figura 6A). La actividad RT se detecto en cultivo de celulas EB 14 de pollo asf como, en menor grado, el fibroblasto embrionico de pollo derivado de una cepa de pollo libre de patogenos especfficos (SPF).
La presencia de partfculas retrovfricas endogenas, ya sea replicantes o no replicantes en el sobrenadante de cultivo celular de celulas EBx® de pato y pollo se investigo por un analisis de ELISA que detecta el antfgeno P27 de capside principal de leucosis aviar (figura 6B). Todas las lfnea de celulas EBx® de pato (EB26, EB51, EB24, EB66...), asf como EBv13 de pollo no se secretan el antfgeno p27 de ALV. Por el contrario, las celulas EB14 de pollo expresan el antfgeno P27 de ALV.
7.2.4 -Las celulas EBx de pato no secretan virus de leucosis aviar replican te (ALV)
El analisis de co-cultivo de celulas Ebx de pato con la lfnea de celulas QT6 de codorniz, que se sabe es sensible a ALV endogeno y exogeno, se realizo para detectar la presencia de virus de pato replicante endogeno. La figura 7A describe el principio del co-cultivo de QT6. La presencia del virus replicante se detecta por un analisis de ELISA que detecta el antfgeno P27 de capside principal de leucosis aviar. El analisis demuestra que ninguna de las celulas EBx de pato probadas secreta ALV replicante (es decir, capaz de replicacion) (figura 7B).
7.2.5 - Las celulas EBx de pato expresan receptores de virus de influenza aviar y humano
Se llevo a cabo la deteccion de receptores para virus de influenza aviar (Siaa2-3Gal) y humano (Siaa2-6Gal) en celulas EBx de pato por analisis de clasificacion de celulas fluorescente mediante la utilizacion de lectinas marcadas con digoxigenina (Boehringer):
□ lectina de aglutinina de Sambuca nigra (SNA) que se une especfficamente a Siaa2-6Gal;
□ lectina de aglutinina de Maackia amurensis (mAa) que se une especfficamente a Siaa2-3Gal.
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Las celulas EB14 de pollo y EBx de pato se lavan en HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, pH 7.5 y se resuspenden en el mismo amortiguador a una concentracion final de 5.106 Las celulas se incuban durante 30 min en hielo, y despues durante 15 a 30 minutos adicionales en presencia de SNA o MAA. Las celulas tratadas con lectina se lavan en HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, pH 7.5 antes de su incubacion en hielo durante 15 a 30 minutos con anticuerpo anti-digoxigenina marcado con FITC. Despues las celulas se lavan con NaCl 0.9% y se analizan por FACS.
Las celulas EB 14 de pollo y EBx de pato expresan receptores en la superficie celular que comprenden oligosacaridos con residuos Siaa2-6Gal y Siaa2-3Gal (figura 8).
7.2.6 -Cariotipo
El analisis de cariotipo se realiza para verificar la diploidia celular y el origen aviar de las celulas EB24 de pato y EB66. Las celulas en la fase exponencial de crecimiento se cosechan y se tratan de 3 a 6 horas con colcemid (0.6 mg/mll Despues de lavado y centrifugacion se realiza choque hipotonico sobre celulas con KCI (0.56%) durante 20 minutos. Posteriormente las celulas EB24 y EB66 de pato se fijan en metanol/acido acetico (3/1) y se almacenan durante la noche a -20°C. Al dfa siguiente la metafasis se pone por puntos sobre vidrio, se tine con una solucion de Wright/Giemsa y se observan bajo microscopio.
Se observan varias series de metafasis que confirman el origen de pato de las celulas EBx. No se observan pruebas de poliploidia. La figura 16 muestra el cariotipo diploide de celulas EBx66 de pato (figura 16).
EJEMPLO 6: Replicacion de poxvirus en la lfnea de celulas EBv13 de pollo
La susceptibilidad de celulas EBv13 a infeccion con poxvirus se investiga utilizando una variolovacuna modificada recombinante .de Ankara (MVA) que codifica para un gen GFP (protefna fluorescente verde).
Se utilizo el siguiente procedimiento: tres dfas antes de la infeccion se sembraron 0.4 x 106 celulas EBv13 (pase 188)/ml en matraces T175 bajo 40 ml de SFM Excell 65319 (SAFC) complementado con glutamina 4 mM. La infeccion se realiza a una multiplicidad de infeccion de 10"2 TCID50/celula (el concentrado de MVA-GFP esta a 10e9.7 TCID/ml). Una hora despues de la infeccion, se agregan al matraz 60 mI de medio fresco. El cultivo y la infeccion se realizan a 37°c, CO2 7.5% y se agita a 60 rpm. Cada dfa despues de la infeccion se recolecta un alfcuota de la suspension celular y se congela. Al final del analisis de cinetica se realiza una evaluacion de la productividad siguiendo TCID50. Brevemente, la titulacion del virus MVA-GFP infeccioso se realiza en celulas DF-1. Las celulas se siembran en placas de 96 pozos de fondo plano a una densidad de 15 x 103 celulas/pozo en medio DMEM (Biowhittaker) complementado con suero bovino fetal 5% (FCS) (SAFC) y L-glutamina 2 mM (Biowhittaker). A las veinticuatro horas despues, las celulas se infectan con muestras diluidas seriadas decimales en DMEM y se incuban durante una semana a 37°C, CO2 5% en una atmosfera humidificada. Se mide la infectividad del virus mediante observacion microscopica del efecto citopatico global (CPE) y celulas infectadas expuestas a radiacion UV. Despues se calculan los tftulos TCID50 de acuerdo con el metodo de Reed y Muench (1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97). Durante todo el experimento se monitorean la proliferacion y viabilidad celulares. Las celulas Valo EBv13 de pollo parecen ser altamente sensibles a la infeccion por MVA-GFP (figuras 3A-3B).
EJEMPLO 8: Replicacion de poxvirus en lfneas de celulas EBx de pato
La susceptibilidad de celulas EBx de pato a infeccion con poxvirus se investigo utilizando variolovacuna modificada recombinante Ankara que codifica para un GFP. La titulacion de virus se realizo como se ha descrito previamente para celulas EBv13 de pollo.
8.1 -Metodo de cultivo celular
Las celulas EBx de pato se almacenan en frascos criogenicos en nitrogeno lfquido a -196°C (20 x 106 celulas/frasco). El frasco criofrasco se recalienta directamente en un bano maria calentado previamente a +37°C. La suspension de celulas se coloca en un tubo esteril de 50 mI con 30 mI de medio de cultivo calentado previamente. Despues de centrifugacion (5 min a 300 ± 20 g, a temperatura ambiente), se agregan 15 mI de medio de cultivo fresco en el sedimento y se homogeniza suavemente. La muestra se numera utilizando azul de tripan. La numeracion debe ser > 20 x 106 celulas y la disponibilidad debe ser de > 70% para garantizar un buen cultivo.
La suspension celular se siembra en placas, en un matraz T75 cm2 y se incuba a +37°C bajo una atmosfera de CO2 7.5% en un agitador orbital a 50 rpm. Despues se agrega diariamente medio fresco. Las celulas despues se someten a pase para incrementar la biomasa de celulas para sembrar en un biorreactor 3 L. Se necesitan 320.106 celulas para inocular un biorreactor de 3 L. Se toma una muestra despues de mezclado ligero para realizar una numeracion utilizando azul de tripan para determinar la densidad celular. Se prepara una mezcla de celulas de 150 mI con el fin de obtener una concentracion de celulas de 0.4 x 106 celulas.ml-1 en los 800 mI de volumen de cultivo final en el biorreactor. Antes de la siembra de celulas, se ajusta el pH en el recipiente a 7.2 (debido a que el pH disminuira por inyeccion de CO2 en la superficie). Se ajusta la pO2 a 50% de saturacion de O2 (el controlador de flujo de masa se ajusta a 100%, que corresponde a un caudal de purgado maximo de 50 ml.min-1). Al inicio del procedimiento, se mantiene el pH por inyeccion de CO2 en la superficie, posteriormente, se controla por adicion de NaHCO3 7.5%. La
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inyeccion de aire en la superficie se inicia con aire a un caudal de 0.3 ml.min'1. La numeracion de celulas se realiza en una base rutinaria.
Despues de 3 dfas de cultivo, la densidad celular debe ser mayor de 4-5 x 106 celulas.ml-1. Si se alcanza la densidad celular esperada, la infeccion por virus se realiza a una MOl de 10-4. Se ajusta la temperatura del recipiente a 33°C. La cepa del virus se calienta en hielo. La mezcla de infeccion se prepara en 10 ml de medio de produccion. Despues de inoculacion de la mezcla de infeccion en el biorreactor se realiza la adsorpcion vfrica durante 1 hora. Se prepara el medio de produccion final: en 1.5 L de medio de produccion se agrega tripsina con el fin de obtener una concentracion final en el recipiente de 0.3 U.ml-1 (2.3 L en el total). Despues se agrega el medio de produccion final calentado previamente. Cada dfa una muestra de aproximadamente 15 ml se recolecta del biorreactor para realizar numeracion de celulas, analisis de morfologfa celular y observar CPE. Los metabolitos tales como glutamato, glutamina, lactato y glucosa se analizan durante el cultivo con el programa BioProfile Basic. La concentracion de los metabolitos se ajusta si es necesario. Por ejemplo, la concentracion de glutamina se ajusta a 2 mM, si es necesario. La concentracion de glucosa se ajusta a 2 g.L-1, si es necesario.
La titulacion del virus se lleva a cabo al final del experimento utilizando todas las muestras recolectadas.
8.2 -Resultados
8.2.1 -Cinetica de crecimiento celular de celulas EBx® de pato en un biorreactor de alimentacion por lotes de 3L
Las celulas EBx® de pato se cultivan rutinariamente en un biorreactor de tanque agitado. La biomasa derivada de EBx® de pato se permite que se acumule a 37°C en un medio de crecimiento celular hasta que se alcanza una densidad celular de 5-6.106 celulas/ml. Despues la mezcla se diluye durante aproximadamente 3 a 10 veces y se sigue la cinetica de crecimiento durante un perfodo de 10 dfas. En dichas condiciones, la densidad celular de 12 a 20 millones de celulas/ml se alcanza rutinariamente de manera habitual entre el dfa 5 y 8. De esta manera, las celulas EBx® de pato muestran una gama de relacion de di vision que avanza a por lo menos hasta 10 a 15 veces.
8.2.2 -Influencia de la composicion del medio de cultivo celular sobre el tamano de los grumos durante la infeccion de virus MVA-GFP de celulas EBx de pato
Los inventores han encontrado que la concentracion de calcio y magnesio en el medio libre de suero utilizado para el cultivo de celulas EBx y la infeccion pueden tener un impacto sobre el tamano de los grumos. La presencia de grumos pequenos de celulas EBx de pato mejora la infeccion y propagacion de virus, que deja tftulos de virus MVA altos (figura 9A).
8.2.3 -Produccion de virus MVA en biorreactor 3L
Se permite que la biomasa derivada de EBx® de pato se acumula durante la fase de proliferacion celular en medio de crecimiento Excell 66444. Las celulas despues se infectan con 10-2 TCID50/celula de virus MVA-GFP y la mezcla se diluye en medio de produccion Excell 66444. Despues de la adicion del medio Excell fresco, la densidad celular desciende en el dfa 2, y en dfa 4 la densidad celular de las celulas infectadas aumenta y alcanza 12 millones de celulas/ml. En dichas condiciones, la productividad de MVA-GFP es elevada. puesto que en el dfa 4 post-infeccion el tftulo MVA-GFP es de aproximadamente 108 TClD50/ml (figura 9B). Se obtiene un rendimiento de MVA-GFP de 205 TClD50/celula en celulas EBx® de pato.
EJEMPLO 9: Produccion .de virus de influenza en lfneas EBx de pato
9.1 -Materiales y Metodos
9.1.1 -Analisis de infectividad de virus de influenza (TCID50)
La titulacion del virus de influenza infeccioso se realiza en celulas MDCK. Brevemente, las celulas se siembran en placas de 96 pozos de fondo plano a una densidad de 3 x 103 celulas/pozo en medio UltraMDCK complementado con L-glutamina 2.5 mM. A las veinticuatro horas despues las celulas se infectan con muestras diluidas seriadas decimales en UltraMDCK que contiene 6 pg.mL'1 de tripsina-EDTA y se 'incuban durante una semana a 33°C, CO2 5% en una atmosfera humidificada. La replicacion del virus despues se prueba en un analisis HA utilizando eritrocitos de pollo y se calculan los tftulos TClD50 so de acuerdo con el metodo de Reed y Muench (1938)*.-*Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27,493-97.
9.1.2 -Analisis de inmunodifusion radial unica (SRID)
La concentracion de hemaglutfnina en las muestras derivadas de celulas EB14 infectadas con virus de influenza se determina como se describe por Wood y colaboradores*. Brevemente se recubren placas de vidrio con un gel de agarosa que contiene suero anti-influenza (concentracion recomendada proporcionada por NlBSC). Despues de que el gel ha fraguado, 10 pl de diluciones apropiadas de la referencia y las muestras se cargan en pozos perforados de 3 mm 0. Despues de una incubacion durante 18-24 h en una camara humeda a temperatura ambiente las placas se
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humedecen en NaCI 0.9% y se lavan con agua destilada. El gel despues se prensa y seca. Las placas se tinen con solucion azul brillante de Coomassie durante 15 min y se destinen dos veces en una mezcla de metanol y acido acetico hasta que se vuelven visibles las zonas tenidas definidas claramente. Despues de secado de las placas, se mide el diametro de las zonas tenidas que rodean a los pozos de antfgeno en dos direcciones en angulos rectos. Se construyen las curvas dosis-respuesta de diluciones de antfgeno contra la superficie y los resultados se calculan de acuerdo con los metodos de analisis de pendiente-relacion estandar. *Wood JM. Et al. "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines" (J. Biol. Stand., 1977,5(3): 237-47).
9.1.3 -Analisis de transferencia Western de protefna de hemaglutinina de influenza
Se realiza SDS-PAGE como se describe por Laemmli UK (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259: 680-685) en gel de poliacrflamida 10%. Las protefnas desnaturalizadas (SDS 1%, p-mercaptoetanol 70 mM) se transfieren a una membrana de difluoruro de polivinilideno (hybond P, Amersham) mediante un procedimiento de transferencia semi-seca (Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose (J Biochem Biophys Methods 10: 203-209). Las manchas se bloquean durante 1 h a temperatura ambiente con una mezcla constituida de 5% de grasa de polvo de leche seca en TBST complementado con FCS 1 % (SAFC). Despues las manchas se incuban durante la noche en solucion de bloqueo complementado con suero anti-Ha de borrego policlonal especffico (1:500 (NIBSC). Las manchas se lavan 6 veces con TBST y se incuban durante 1 h a temperatura ambiente con una anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de borrego conjugado con harp (1:5000 (Rockland) en solucion de bloqueo. Despues de 6 lavados con TBST, el complejo de protefna conjugada final se muestra utilizando quimioluminiscencia (equipo ECL, Amersham) y pelfculas (Hyperfilm, Amersham).
9.2 - Infeccion por virus de influenza die celulas EBx®de pato en biorreactor 3L
9.2.1 - Materiales y equipo
Material de recalentamiento de celulas
o Matraces T75 cm 2 (Sarstedt, Cat# 831813502) o medio de cultivo (medio libre de suero) o L-glutamina 200 mM (Biowhittaker, Cat# BE17-605E) o agitador orbital IKA KS260 (Fisher Bioblock, Cat# F35044)
Material de amplificacion celular
o matraces T175 cm2 (Sarstedt, Cat# 831812502)
o medio de cultivo (medio libre de suero): Excell 65319 (JRH, Cat# 65319-1000M1687) adicionado con glutamina 2.5 mM o L-glutamina 200 mM (Biowhittaker, Cat# BE 17-605E) o D (+) glucosa (45%) (Sigma, Cat# G8769)
Material de produccion
o Medio de produccion (medio libre de suero): Excell 65629 (JRH, Cat# 65629) complementado con glutamina 2.5 mM o L-glutamfna 200 mM (Biowhittaker, Cat# BE17-605E) o D (+) glucosa (45%) (Sigma, Cat# G8769) o trypzean 1 x (Sigma, Cat# T3449)
o solucion de bicarbonato de sodio 7.5% (Sigma, Cat# 205-633-8) o cepa de virus de influenza (congelada a -80°C)
9.2.2 -Metodo de cultivo celular
(identico a la replicacion de MV A - ejemplo 7.1)
La titulacion de virus, los analisis de hemaglutinina (HAU) y las cuantificaciones de antfgeno HA (transferencia Western, SRID) se llevan al cabo al final del experimento utilizando todas las muestras recolectadas.
9.3 -Resultados
Los inventores demostraron que las celulas EBx de pato son un sustrato celular confiable y eficiente para la replicacion de diversas cepas A Y B de virus de influenza. La produccion de virus de influenza se puede realizar en diversos recipientes tales como matraces y centrifugadores (datos no mostrados) y biorreactores. Se obtuvieron por los inventores procedimientos de elaboracion por alimentacion por lotes reproducibles y eficientes de virus de influenza en biorreactores de tanque de agitacion de 3L y 30L. El rendimiento vfrico superior a 15 mg/l y de hasta 50 mg/l de hematoglutinina habitualmente se obtienen en matraces y en biorreactores con las cepas A y B del virus de influenza (figuras 11 y 12).
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EJEMPLO 10: Replicacion de virus de enfermedad de Newcastle en lfneas celulares EBx de pato
Se investigo la susceptibilidad de celulas EBx de pato para infeccion con virus de enfermedad de Mewcastle utilizando la cepa NDV La Sota.
10.1 -Metodos
Se hace crecer celulas EBx® de pato en medio Excell (SFAC) en matraces T175 a 37°C bajo una atmosfera de CO2 7.5% en un agitador orbital a 60 rpm. En el dfa 0, las celulas se siembran a 0.4 x 106 celulas/ml en 40 ml de medio fresco. El cultivo celular se incuba a 37°C, CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). La cinetica de crecimiento celular es seguida hasta que la densidad celular a alcanzado una concentracion entre 4 x 106 a 6 x 106 celulas/ml (habitualmente en el dfa 3 posterior a la siembra). En ese punto, las celulas se inoculan con NDV cepa La Sota en dos MOl diferentes (10-3 y 10-4 TCID50/celulas) y se incuba durante una hora adicional a 37°C, CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). Despues el cultivo celular se diluye con la adicion de 60 ml de medio de produccion vfrica fresco y la incubacion continua a 37°C y CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). El crecimiento celular y la cinetica de produccion de virus se realizan durante 7 dfas. Como una fuente de proteasa se agregan cada dfa tripsina recombinante (SAFC) en el medio de cultivo; se prueban dos concentraciones de tripsina (0.4 y 0.75 USP/ml). Se extraen alfcuotas diariamente para numeracion celular, titulacion de virus y analisis de transferencia Western.
Las muestras se separan utilizando 10% de SDS-PAGE y se siembran por puntos sobre una membrana PDVF (Amersham) por la tecnica semi-seca. La inmunodeteccion se realiza utilizando antisuero poli clona! de pollo contra NDV (1:2000, CHARLES RlVER laboratories), seguido por anticuerpo de conejo antipollo conjugado con fosfatasa alcalina (1:5000, SlGMA). El anticuerpo secundario unido se detecta utilizando el equipo de sistema de deteccion ECL-Chemiluminescence (ROCHE).
10.2 - Resultados
Las celulas EBx de pato y pollo son sensibles y se replican en NDV cepa La Sota. Los tftulos (en TClD50/ml) de NDV producidas en celulas EBx® de pato aumentan del dfa 0 a al dfa 2, pi, hasta alcanzar un promedio de 10683 TClD50/ml (figura 13, panel izquierdo).
El analisis de transferencia Western (figura 13, panel derecho) muestra la expresion de protefnas vfricas NDV (HN, Fo/F, NP & M). La composicion de protefnas vfricas de virus NDV producido en celulas EBx® de pato son similares a las que se obtienen con virus nDv producido en EBx® de pollo. Ademas, la cinetica de liberacion para virus producidos en celulas EBx de pollo y pato son similares.
EJEMPLO 11: Replicacion de virus de sarampion en celulas EB66 de pato
Se investigo la susceptibilidad de celulas EB66 de pato a la infeccion con sarampion utilizando virus de sarampion recombinante que expresa protefna fluorescente verde.
11.1 -Metodos
Se hacen crecer celulas EB66 en medio Excell en matraces T175 a 37°C bajo una atmosfera de CO2 7.5% en un agitador orbital a 60 rpm. En el dfa 0, las celulas se siembran a 0.4 x 106 celulas/ml en 40 ml de medio fresco. El cultivo celular se incuba a 37°C, CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). La cinetica de crecimiento celular es seguida hasta que la densidad celular a alcanzado una concentracion entre 4 x 106 a 6 x 106 celulas/ml (habitualmente en el dfa 3 posterior a la siembra). En ese punto, las celulas se inoculan con virus de sarampion recombinante en dos MOl diferentes (10 -1 y 10-2 TClDso/celulas) y se incuban durante una hora adicional a 37°C, CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). Despues el cultivo celular se diluye con la adicion de 60 mi de medio de produccion vfrica fresca y la incubacion continua a 37°C y CO2 7.5% bajo agitacion (60 rpm). El crecimiento celular y la cinetica de produccion de virus se realizan durante 7 dfas. Las alfcuotas diarias se separan para numeracion de celulas y titulacion de virus.
11.2 -Resultados
Las celulas EB66 son sensibles y replican el virus de sarampion. En condiciones no optimizadas, los tftulos (en TClD50/ml) se sarampion producido en celulas EB66 alcanza un promedio de 107 TC1D50/ml (figura 14).

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una linea celular continua y diploide de pato derivada de embriocitoblastos que es util para ser infectada con y replicar un virus en la que dicha linea celular de pato no produce particulas retrovirales endogenas competentes para
    5 la replicacion.
  2. 2. Una linea celular continua y diploide de pato de acuerdo con la reivindicacion 1 en la que dicho virus se selecciona del grupo que comprende poxvirus, ortomixovirus, paramixovirus, herpesvirus, hepadnavirus, adenovirus, parvovirus, reovirus, circovirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, birnavirus y retrovirus.
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  3. 3. Una linea celular continua y diploide de pato de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 en la que dicho virus es el virus del sarampion.
  4. 4. Uso de una linea celular continua y diploide de pato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 15 para la produccion de un virus que se selecciona del grupo que comprende poxvirus, ortomixovirus, paramixovirus,
    herpesvirus, hepadnavirus, adenovirus, parvovirus, reovirus, circovirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, birnavirus y retrovirus.
  5. 5. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4 en la que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en virus del 20 sarampion, virus respiratorio sincitial (VRS), virus de las paperas, virus de la rubeola, virus Sendai, virus
    parainfluenza humana de tipos I y III, virus de la enfermedad de Newcastle, virus Rinderpest, virus del moquillo y virus parainfluenza del pato.
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