JPH05227947A - 鳥類原始生殖細胞の分離方法 - Google Patents
鳥類原始生殖細胞の分離方法Info
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- JPH05227947A JPH05227947A JP4004997A JP499792A JPH05227947A JP H05227947 A JPH05227947 A JP H05227947A JP 4004997 A JP4004997 A JP 4004997A JP 499792 A JP499792 A JP 499792A JP H05227947 A JPH05227947 A JP H05227947A
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Abstract
(57)【要約】
〔構成〕鳥類原始生殖細胞の分離方法であって、（Ａ）
鳥類胚の血液を、動物血清を含む動物細胞培養用培地を
用いて希釈する工程；動物血清を含む動物細胞培養用培
地中に、浸透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの
範囲内に保ったまま比重を変えうる物質を１０〜２０％
（w/v)で含む溶液を上記工程（Ａ）の希釈血液に容量比
で５〜２０倍の割合で混合して混合物を得る工程；
（Ｃ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を４〜８％（w/v)で含む溶液を
工程（Ｂ）で得た混合物上に重層する工程；（Ｄ）重層
された２層の液を遠心分離して上清を得る工程；及び
（Ｅ）鳥類原始生殖細胞を含む上清を分離する工程を含
む方法。 〔効果〕簡便かつ高効率に鳥類胚の血液からＰＧＣを分
離精製することができるので有用であり、ＰＧＣの保
存、培養、移植、遺伝子操作、ならびに鳥類における系
統保存、鳥類におけるトランスジェニック動物の作成技
術の開発等に貢献できるので有用である。
鳥類胚の血液を、動物血清を含む動物細胞培養用培地を
用いて希釈する工程；動物血清を含む動物細胞培養用培
地中に、浸透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの
範囲内に保ったまま比重を変えうる物質を１０〜２０％
（w/v)で含む溶液を上記工程（Ａ）の希釈血液に容量比
で５〜２０倍の割合で混合して混合物を得る工程；
（Ｃ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を４〜８％（w/v)で含む溶液を
工程（Ｂ）で得た混合物上に重層する工程；（Ｄ）重層
された２層の液を遠心分離して上清を得る工程；及び
（Ｅ）鳥類原始生殖細胞を含む上清を分離する工程を含
む方法。 〔効果〕簡便かつ高効率に鳥類胚の血液からＰＧＣを分
離精製することができるので有用であり、ＰＧＣの保
存、培養、移植、遺伝子操作、ならびに鳥類における系
統保存、鳥類におけるトランスジェニック動物の作成技
術の開発等に貢献できるので有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は鳥類の原始生殖細胞の分
離方法に関する。
離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】有用動物遺伝資源の保存を図ることは畜
産学上の大きな課題となっている。哺乳動物に属する家
畜においては、その手段として、受精卵の凍結保存なら
びに移植技術が実用化されている。しかし、ニワトリな
どの鳥類については、資源保存方法の開発が遅れてい
る。このため、遺伝学的に重要な系統や産業的に価値の
高い原種などは、多大な費用をかけて群単位で維持され
ているというのが現状である。例えば、ニワトリの場
合、精子の凍結保存は可能であるのに対し、多量の細胞
質を含む卵子および受精卵の長期保存は技術的に極めて
困難であった。また、鳥類では卵子および受精卵の取扱
いが哺乳類の該当細胞に比べて困難なため、鳥類のトラ
ンスジェニック動物の作成技術も哺乳類に比べて開発が
遅れていた。これらの点から、これらの細胞に代わるも
のとして、原始生殖細胞（PrimordialGerm Cells 、以
下ＰＧＣと略す）が注目されているが、鳥類のＰＧＣ
は、分離が困難であった。
産学上の大きな課題となっている。哺乳動物に属する家
畜においては、その手段として、受精卵の凍結保存なら
びに移植技術が実用化されている。しかし、ニワトリな
どの鳥類については、資源保存方法の開発が遅れてい
る。このため、遺伝学的に重要な系統や産業的に価値の
高い原種などは、多大な費用をかけて群単位で維持され
ているというのが現状である。例えば、ニワトリの場
合、精子の凍結保存は可能であるのに対し、多量の細胞
質を含む卵子および受精卵の長期保存は技術的に極めて
困難であった。また、鳥類では卵子および受精卵の取扱
いが哺乳類の該当細胞に比べて困難なため、鳥類のトラ
ンスジェニック動物の作成技術も哺乳類に比べて開発が
遅れていた。これらの点から、これらの細胞に代わるも
のとして、原始生殖細胞（PrimordialGerm Cells 、以
下ＰＧＣと略す）が注目されているが、鳥類のＰＧＣ
は、分離が困難であった。
【０００３】ニワトリＰＧＣの分離方法に関しては、
（１）分別沈降法（Shuman, R. M., M. S. Thesis, Uni
versity of Minnesota, St. Paul, MN, USA,１９８
１）、（２）Percoll (Sigma Chemical, Co., St. Loui
s, MO, USA) による遠心分離法、（３）Elutriator (Be
ckman Instruments, Fullerton, CA, USA)による分離
法、（４）セルソーター（例えば、 FACStar Plus, Bec
ton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain Vi
ew, CA, USA)による方法（（２）（３）（４）とも Wen
tworth, B. C., et al., Poultry Science, ６８：９９
９−１０１０，１９８９）が知られている。しかし、
（１）や（２）の方法ではＰＧＣ以外の細胞からの分離
能が悪く、（３）の方法では回収されたＰＧＣの生存率
が１０％程度と低いので実用的ではなかった。また、
（４）の方法によれば分離は効果的に行えるものの、分
離装置が高価であり簡単に実施できないという問題があ
った。
（１）分別沈降法（Shuman, R. M., M. S. Thesis, Uni
versity of Minnesota, St. Paul, MN, USA,１９８
１）、（２）Percoll (Sigma Chemical, Co., St. Loui
s, MO, USA) による遠心分離法、（３）Elutriator (Be
ckman Instruments, Fullerton, CA, USA)による分離
法、（４）セルソーター（例えば、 FACStar Plus, Bec
ton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain Vi
ew, CA, USA)による方法（（２）（３）（４）とも Wen
tworth, B. C., et al., Poultry Science, ６８：９９
９−１０１０，１９８９）が知られている。しかし、
（１）や（２）の方法ではＰＧＣ以外の細胞からの分離
能が悪く、（３）の方法では回収されたＰＧＣの生存率
が１０％程度と低いので実用的ではなかった。また、
（４）の方法によれば分離は効果的に行えるものの、分
離装置が高価であり簡単に実施できないという問題があ
った。
【０００４】一方、Yasudaら（Yasuda, Y., et al., J.
Reproduction & Fertility, in press,１９９２）は、
Ficoll (Pharmacia Inc., Sweden)と Hanks平衡塩類溶
液を組み合わせた重層遠心分離法を開発している。この
方法により、ニワトリ胚血液からＰＧＣが精製される
が、該ＰＧＣには血液細胞の混入が多く、精製率は3.９
％であった。さらにＰＧＣを分離精製する場合には、顕
微鏡下で一つずつＰＧＣ細胞を拾い上げるという様な煩
雑な操作が必要であった。
Reproduction & Fertility, in press,１９９２）は、
Ficoll (Pharmacia Inc., Sweden)と Hanks平衡塩類溶
液を組み合わせた重層遠心分離法を開発している。この
方法により、ニワトリ胚血液からＰＧＣが精製される
が、該ＰＧＣには血液細胞の混入が多く、精製率は3.９
％であった。さらにＰＧＣを分離精製する場合には、顕
微鏡下で一つずつＰＧＣ細胞を拾い上げるという様な煩
雑な操作が必要であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、改良
されたＰＧＣの分離法を提供することを目的とするもの
である。さらに具体的には、本発明は、簡便な遠心分離
法によりニワトリ胚血液から、生細胞のうちほぼ１００
％がＰＧＣである実質的に純粋なＰＧＣ細胞集団を分離
する方法を提供することを目的とするものである。
されたＰＧＣの分離法を提供することを目的とするもの
である。さらに具体的には、本発明は、簡便な遠心分離
法によりニワトリ胚血液から、生細胞のうちほぼ１００
％がＰＧＣである実質的に純粋なＰＧＣ細胞集団を分離
する方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく鋭意努力した結果、例えばFicoll等の浸
透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保
ったまま比重を変えうる物質と動物細胞培養用培地とを
組み合わせることにより、ニワトリ胚血液から、生存し
ている細胞のほとんどがＰＧＣである実質的に純粋なＰ
ＧＣの細胞集団を分離することができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
題を解決すべく鋭意努力した結果、例えばFicoll等の浸
透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保
ったまま比重を変えうる物質と動物細胞培養用培地とを
組み合わせることにより、ニワトリ胚血液から、生存し
ている細胞のほとんどがＰＧＣである実質的に純粋なＰ
ＧＣの細胞集団を分離することができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
【０００７】本発明の鳥類原始生殖細胞の分離方法は、
以下の工程： （Ａ）鳥類胚の血液を、動物血清を含む動物細胞培養用
培地を用いて希釈する工程； （Ｂ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を１０〜２０％（w/v)で含む溶
液を、上記工程（Ａ）の希釈血液に容量比で５〜２０倍
の割合で混合して混合物を得る工程； （Ｃ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を４〜８％（w/v)で含む溶液
を、工程（Ｂ）で得た混合物上に重層する工程； （Ｄ）重層された２層の液を遠心分離して上清を得る工
程；及び （Ｅ）ＰＧＣを含む上清を分離する工程 を含むものである。
以下の工程： （Ａ）鳥類胚の血液を、動物血清を含む動物細胞培養用
培地を用いて希釈する工程； （Ｂ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を１０〜２０％（w/v)で含む溶
液を、上記工程（Ａ）の希釈血液に容量比で５〜２０倍
の割合で混合して混合物を得る工程； （Ｃ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を４〜８％（w/v)で含む溶液
を、工程（Ｂ）で得た混合物上に重層する工程； （Ｄ）重層された２層の液を遠心分離して上清を得る工
程；及び （Ｅ）ＰＧＣを含む上清を分離する工程 を含むものである。
【０００８】工程（Ａ）においては、鳥類、例えばニワ
トリの胚の血液（約0.５〜５μｌ）を、動物血清を含む
動物細胞培養用培地で希釈する。希釈率は特に限定され
ないが、通常２００倍程度が好ましい。鳥類の胚はいか
なる時期のものでもよいが、孵置２日目のものが好まし
く、孵置５１時間のものが特に好ましい。動物血清はい
かなる動物由来のものでもよく、動物培養用培地も動物
細胞の培養に通常使用されるものならばいかなる種類の
ものでもよい。例えば、ウシ胎児血清を１０％（v/v)程
度に加えた Medium １９９（Morgan, J. F. et al., Pr
oc. Soc. Exp.Biol. Med., ７３：１−８、１９５０）
で Hanks平衡塩類溶液を含むものが好適に使用される。
トリの胚の血液（約0.５〜５μｌ）を、動物血清を含む
動物細胞培養用培地で希釈する。希釈率は特に限定され
ないが、通常２００倍程度が好ましい。鳥類の胚はいか
なる時期のものでもよいが、孵置２日目のものが好まし
く、孵置５１時間のものが特に好ましい。動物血清はい
かなる動物由来のものでもよく、動物培養用培地も動物
細胞の培養に通常使用されるものならばいかなる種類の
ものでもよい。例えば、ウシ胎児血清を１０％（v/v)程
度に加えた Medium １９９（Morgan, J. F. et al., Pr
oc. Soc. Exp.Biol. Med., ７３：１−８、１９５０）
で Hanks平衡塩類溶液を含むものが好適に使用される。
【０００９】工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）に使用される浸
透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保
ったまま比重を変えうる物質は、それぞれ異なる割合で
溶液に添加した場合に、比重の異なる溶液を形成し、該
溶液を重層した場合に界面が形成されるものならば、い
かなるものを使用してもよい。例えばフィコール(Ficol
l)、アルブミン、血清タンパク、デキストラン等をあげ
ることができる。例えばフィコールを用いる場合、いか
なるグレードのものを用いてもよいが、例えば市販品で
ある無毒性加工の Type ４００ＤＬ Ficoll (Sigma Che
mical Co.)が好ましい。
透圧を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保
ったまま比重を変えうる物質は、それぞれ異なる割合で
溶液に添加した場合に、比重の異なる溶液を形成し、該
溶液を重層した場合に界面が形成されるものならば、い
かなるものを使用してもよい。例えばフィコール(Ficol
l)、アルブミン、血清タンパク、デキストラン等をあげ
ることができる。例えばフィコールを用いる場合、いか
なるグレードのものを用いてもよいが、例えば市販品で
ある無毒性加工の Type ４００ＤＬ Ficoll (Sigma Che
mical Co.)が好ましい。
【００１０】工程（Ｂ）においては、動物血清を含む動
物細胞培養用培地中に上記の浸透圧を２００mOsm／kgか
ら３８０mOsm／kgの範囲内に保ったまま比重を変えうる
物質を最終濃度が１０〜２０％（w/v)となるように含む
溶液を使用するが、フィコールを用いる場合には、最終
濃度が１６％（w/v)であることが好ましい。動物血清を
含む動物細胞培養用培地としては、上記工程（Ａ）で使
用したものを用いることが好ましいが、異なる種類の動
物血清、動物細胞培養用培地を用いてもよい。工程
（Ａ）で得た希釈血液に容量比で５〜２０倍量の上記溶
液を添加して混合物を得るが、このときの希釈倍率は約
９とすることが好ましい。
物細胞培養用培地中に上記の浸透圧を２００mOsm／kgか
ら３８０mOsm／kgの範囲内に保ったまま比重を変えうる
物質を最終濃度が１０〜２０％（w/v)となるように含む
溶液を使用するが、フィコールを用いる場合には、最終
濃度が１６％（w/v)であることが好ましい。動物血清を
含む動物細胞培養用培地としては、上記工程（Ａ）で使
用したものを用いることが好ましいが、異なる種類の動
物血清、動物細胞培養用培地を用いてもよい。工程
（Ａ）で得た希釈血液に容量比で５〜２０倍量の上記溶
液を添加して混合物を得るが、このときの希釈倍率は約
９とすることが好ましい。
【００１１】工程（Ｃ）においては、動物血清を含む動
物細胞培養用培地中に上記の浸透圧を２００mOsm／kgか
ら３８０mOsm／kgの範囲内に保ったまま比重を変えうる
物質を最終濃度が４〜８％（w/v)となるように含む溶液
を使用するが、フィコールを使用する場合には、最終濃
度は6.３％（w/v)であることが好ましい。動物血清を含
む動物細胞培養用培地としては、上記工程（Ａ）または
工程（Ｂ）で使用したものを用いることが好ましいが、
異なる種類の動物血清、動物細胞培養用培地を用いても
よい。この溶液を、工程（Ｂ）で得た混合物上に、境界
面がくずれないようにゆっくりと重層する。重層する溶
液の液量は任意の量でよいが、下層となる工程（Ｂ）の
混合物の液量に対し容量比で１／５が好ましい。
物細胞培養用培地中に上記の浸透圧を２００mOsm／kgか
ら３８０mOsm／kgの範囲内に保ったまま比重を変えうる
物質を最終濃度が４〜８％（w/v)となるように含む溶液
を使用するが、フィコールを使用する場合には、最終濃
度は6.３％（w/v)であることが好ましい。動物血清を含
む動物細胞培養用培地としては、上記工程（Ａ）または
工程（Ｂ）で使用したものを用いることが好ましいが、
異なる種類の動物血清、動物細胞培養用培地を用いても
よい。この溶液を、工程（Ｂ）で得た混合物上に、境界
面がくずれないようにゆっくりと重層する。重層する溶
液の液量は任意の量でよいが、下層となる工程（Ｂ）の
混合物の液量に対し容量比で１／５が好ましい。
【００１２】工程（Ｄ）では、重層された２層の液を遠
心分離機で遠心する。遠心により付加する重力は、例え
ば１００Ｇ以上２０００Ｇ以下であればよいが、約８０
０Ｇ程度が好ましい。遠心する時間は、例えば１分以上
６時間以下であればよいが、約３０分程度が好ましい。
工程（Ｅ）において、遠心分離した結果生じる上清液を
採取することにより、目的とするＰＧＣが分離される。
上清液をすべて採取してもよいが、液面から下方にむけ
て容量比で５／１２までの上清液を採取することが好ま
しい。この方法により、生きている細胞のうちほぼ１０
０％がＰＧＣである細胞集団が回収される。
心分離機で遠心する。遠心により付加する重力は、例え
ば１００Ｇ以上２０００Ｇ以下であればよいが、約８０
０Ｇ程度が好ましい。遠心する時間は、例えば１分以上
６時間以下であればよいが、約３０分程度が好ましい。
工程（Ｅ）において、遠心分離した結果生じる上清液を
採取することにより、目的とするＰＧＣが分離される。
上清液をすべて採取してもよいが、液面から下方にむけ
て容量比で５／１２までの上清液を採取することが好ま
しい。この方法により、生きている細胞のうちほぼ１０
０％がＰＧＣである細胞集団が回収される。
【００１３】
【発明の効果】本発明の方法によれば、簡便かつ高効率
に鳥類胚の血液からＰＧＣを分離精製することができる
ので有用である。また、本発明の方法は、ＰＧＣの保
存、培養、移植、遺伝子操作、ならびに鳥類における系
統保存、鳥類におけるトランスジェニック動物の作成技
術の開発等に貢献できるので有用である。
に鳥類胚の血液からＰＧＣを分離精製することができる
ので有用である。また、本発明の方法は、ＰＧＣの保
存、培養、移植、遺伝子操作、ならびに鳥類における系
統保存、鳥類におけるトランスジェニック動物の作成技
術の開発等に貢献できるので有用である。
【００１４】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。 （実施例１）実験にあたり、以下の材料を用意した。 (1) ニワトリの受精卵：ホワイトロック種（アーバーエ
ーカー）の受精卵１５個を種鶏場から購入して、実験に
供すまで１５℃で保存し使用した。 (2) 受精卵の培養器：ふ卵器（ISUZU, model ２−２１
８３）の温度を３８℃に設定して使用した。 (3) 採血用マイクロピペット：５０μｌのガラス製マイ
クロピペット（Disposable micropipettes, Drummond S
cientific Company. USA.)を微小電極製作器（Type PN-
3, No.８６０６，NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT LA
B.) を用いて内径３０−８０μm になるように伸ばし、
斜めに切断して使用した。これにつなぐアスピレーター
チューブは Drummond Scientific Co. USA製のものを使
用した。 (4) 顕微鏡：血液採取用には実体顕微鏡（ニコン製）
を、細胞観察には倒立顕微鏡（Type BH-2,オリンパス
製）を使用した。 (5) 培地と血清：動物細胞培養用培地として MEDIUM １
９９（Hanks 平衡塩類溶液を含むもの、GIBCO LABORATO
RIES製、以下ＴＣ１９９（Hanks)と称する）を、血清と
してウシ胎児血清 (fetal bovine serum、以下ＦＢＳと
称する）を用いた。また MEDIUM １９９に、Hanks 平衡
塩類溶液に代わって Earleの平衡塩類溶液を含む培地を
製造した（以下、ＴＣ１９９（Earle)と称する）。 (6) フィコール溶液：１０％（v/v)ＦＢＳを含むＴＣ１
９９（Hanks)に、無毒性加工の Type ４００ＤＬ Ficol
l (Sigma Chemical Co．製）を、最終濃度がそれぞれ6.
３％（v/v)および１６％になるように加えて溶解した
後、0.２μm メンブレンフィルターで濾過した（以下そ
れぞれＦ１液、Ｆ２液と略す） 以上の材料を用いてニワトリ胚血液からＰＧＣを分離し
た。 (1) ニワトリ胚血液の調製：３８℃のふ卵器で５１−５
３時間孵置した受精卵の表面を７０％アルコール綿で拭
いた後、割卵し、卵黄と卵白を直径１００mmのプラスチ
ックディッシュに入れた。実体顕微鏡下で、採血用マイ
クロピペットを用いて胚の心臓または背動脈から、１卵
あたり血液１〜１０μｌを採取した。採取した血液は、
予め用意した1.５mlチューブ（Eppendolf 製）の中に入
っているＴＣ１９９（Hanks)１mlに混入した。火炎で先
端を丸くした１０００μｌ用チップを用いて、血液とＴ
Ｃ１９９（Hanks)をよく混合した後、２００Ｇで３分間
遠心分離を行い上清９００μｌを取り除いた。 (2) フィコール濃度勾配遠心分離：上記の血液サンプル
１００μｌにＦ２液９００μｌを加え、火炎で先端を丸
くした１０００μｌ用チップで十分に混合した後、Ｆ１
液２００μｌを境界面がくずれないようにゆっくりと重
層した。８００Ｇで３０分間遠心後、ＰＧＣが含まれて
いる上清を液面から５００μｌまで吸い取り、別のチュ
ーブに入れた。 (3) フィコールの除去と培地交換および観察：(2) で回
収したＰＧＣが含まれている上清５００μｌに、ＴＣ１
９９（Earle)を８００μｌ加えて攪拌した後、４００Ｇ
で３分間遠心し、上清１２００μｌを除いた。残りの１
００μｌにＴＣ１９９(Earle) １２００μｌを加えて攪
拌した後、２００Ｇで３分間遠心し、上清１２００μｌ
を除いた。再度ＴＣ１９９（Earle)１２００μｌを加え
て攪拌した後、２００Ｇにて３分間遠心し、最後に１２
０μｌを残してＰＧＣ分画とした。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。 （実施例１）実験にあたり、以下の材料を用意した。 (1) ニワトリの受精卵：ホワイトロック種（アーバーエ
ーカー）の受精卵１５個を種鶏場から購入して、実験に
供すまで１５℃で保存し使用した。 (2) 受精卵の培養器：ふ卵器（ISUZU, model ２−２１
８３）の温度を３８℃に設定して使用した。 (3) 採血用マイクロピペット：５０μｌのガラス製マイ
クロピペット（Disposable micropipettes, Drummond S
cientific Company. USA.)を微小電極製作器（Type PN-
3, No.８６０６，NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT LA
B.) を用いて内径３０−８０μm になるように伸ばし、
斜めに切断して使用した。これにつなぐアスピレーター
チューブは Drummond Scientific Co. USA製のものを使
用した。 (4) 顕微鏡：血液採取用には実体顕微鏡（ニコン製）
を、細胞観察には倒立顕微鏡（Type BH-2,オリンパス
製）を使用した。 (5) 培地と血清：動物細胞培養用培地として MEDIUM １
９９（Hanks 平衡塩類溶液を含むもの、GIBCO LABORATO
RIES製、以下ＴＣ１９９（Hanks)と称する）を、血清と
してウシ胎児血清 (fetal bovine serum、以下ＦＢＳと
称する）を用いた。また MEDIUM １９９に、Hanks 平衡
塩類溶液に代わって Earleの平衡塩類溶液を含む培地を
製造した（以下、ＴＣ１９９（Earle)と称する）。 (6) フィコール溶液：１０％（v/v)ＦＢＳを含むＴＣ１
９９（Hanks)に、無毒性加工の Type ４００ＤＬ Ficol
l (Sigma Chemical Co．製）を、最終濃度がそれぞれ6.
３％（v/v)および１６％になるように加えて溶解した
後、0.２μm メンブレンフィルターで濾過した（以下そ
れぞれＦ１液、Ｆ２液と略す） 以上の材料を用いてニワトリ胚血液からＰＧＣを分離し
た。 (1) ニワトリ胚血液の調製：３８℃のふ卵器で５１−５
３時間孵置した受精卵の表面を７０％アルコール綿で拭
いた後、割卵し、卵黄と卵白を直径１００mmのプラスチ
ックディッシュに入れた。実体顕微鏡下で、採血用マイ
クロピペットを用いて胚の心臓または背動脈から、１卵
あたり血液１〜１０μｌを採取した。採取した血液は、
予め用意した1.５mlチューブ（Eppendolf 製）の中に入
っているＴＣ１９９（Hanks)１mlに混入した。火炎で先
端を丸くした１０００μｌ用チップを用いて、血液とＴ
Ｃ１９９（Hanks)をよく混合した後、２００Ｇで３分間
遠心分離を行い上清９００μｌを取り除いた。 (2) フィコール濃度勾配遠心分離：上記の血液サンプル
１００μｌにＦ２液９００μｌを加え、火炎で先端を丸
くした１０００μｌ用チップで十分に混合した後、Ｆ１
液２００μｌを境界面がくずれないようにゆっくりと重
層した。８００Ｇで３０分間遠心後、ＰＧＣが含まれて
いる上清を液面から５００μｌまで吸い取り、別のチュ
ーブに入れた。 (3) フィコールの除去と培地交換および観察：(2) で回
収したＰＧＣが含まれている上清５００μｌに、ＴＣ１
９９（Earle)を８００μｌ加えて攪拌した後、４００Ｇ
で３分間遠心し、上清１２００μｌを除いた。残りの１
００μｌにＴＣ１９９(Earle) １２００μｌを加えて攪
拌した後、２００Ｇで３分間遠心し、上清１２００μｌ
を除いた。再度ＴＣ１９９（Earle)１２００μｌを加え
て攪拌した後、２００Ｇにて３分間遠心し、最後に１２
０μｌを残してＰＧＣ分画とした。
【００１５】ＰＧＣ分画１０μｌをスライドガラスに載
せて、倒立顕微鏡下で観察した。また、ＰＧＣ分画一滴
をスライドガラスに載せ、９9.９％のメタノールで固定
してＰＡＳ染色を行った。その結果、ＰＧＣ分画に分離
回収されたのは、大型の球形細胞で、直接１０−２０μ
m であることが認められた。核は直径８−１２μm と大
きく細胞のかなりの部分を占めており、ＰＧＣ分画をＰ
ＡＳ染色した結果、ほとんどすべての細胞がＰＡＳ陽性
（赤色）に染色された。ごく一部にＰＡＳ陰性で細胞形
態をとるものがあったが、その細胞には核が存在しない
ので、生存細胞ではないと判定された。尚、分離直後
に、ＰＧＣが破壊されＰＡＳ陽性に染色される細胞断片
がＰＧＣ分画にまれに観察された。
せて、倒立顕微鏡下で観察した。また、ＰＧＣ分画一滴
をスライドガラスに載せ、９9.９％のメタノールで固定
してＰＡＳ染色を行った。その結果、ＰＧＣ分画に分離
回収されたのは、大型の球形細胞で、直接１０−２０μ
m であることが認められた。核は直径８−１２μm と大
きく細胞のかなりの部分を占めており、ＰＧＣ分画をＰ
ＡＳ染色した結果、ほとんどすべての細胞がＰＡＳ陽性
（赤色）に染色された。ごく一部にＰＡＳ陰性で細胞形
態をとるものがあったが、その細胞には核が存在しない
ので、生存細胞ではないと判定された。尚、分離直後
に、ＰＧＣが破壊されＰＡＳ陽性に染色される細胞断片
がＰＧＣ分画にまれに観察された。
【００１６】本実施例においては、生存ＰＧＣの判定は
Yasudaら（Yasuda, Y., et al., J.Reproduction & Fer
tility, in press,１９９２）の判定方法に従い、分離
直後のメタノール固定前ＰＧＣ分画において、細胞膜に
全く損傷がなく、かつ細胞質が位相差顕微鏡下で特徴的
な強い屈折率を示す細胞を生存ＰＧＣと判定した。その
結果、ＰＧＣ分画に含まれている直径１０−２０μm の
大型の生存細胞はすべてＰＧＣであった。 （実施例２）実施例１と同じ方法で、分離操作を１６回
繰り返した。１回の分離について５個から３０個の受精
卵を使用し、分離されたＰＧＣをタタイ式血球計算盤で
計数して、受精卵１個あたりのＰＧＣの回収率を求め
た。実施例１と実施例２を合わせた結果を表１に示す。
総計２３２個の受精卵を使用し、９８２９個のＰＧＣが
分離できた。一個の受精卵あたりのＰＧＣ回収数は４2.
４個であった。
Yasudaら（Yasuda, Y., et al., J.Reproduction & Fer
tility, in press,１９９２）の判定方法に従い、分離
直後のメタノール固定前ＰＧＣ分画において、細胞膜に
全く損傷がなく、かつ細胞質が位相差顕微鏡下で特徴的
な強い屈折率を示す細胞を生存ＰＧＣと判定した。その
結果、ＰＧＣ分画に含まれている直径１０−２０μm の
大型の生存細胞はすべてＰＧＣであった。 （実施例２）実施例１と同じ方法で、分離操作を１６回
繰り返した。１回の分離について５個から３０個の受精
卵を使用し、分離されたＰＧＣをタタイ式血球計算盤で
計数して、受精卵１個あたりのＰＧＣの回収率を求め
た。実施例１と実施例２を合わせた結果を表１に示す。
総計２３２個の受精卵を使用し、９８２９個のＰＧＣが
分離できた。一個の受精卵あたりのＰＧＣ回収数は４2.
４個であった。
【００１７】
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 分離No. 使用受精卵数 分離回収PGC 数 １卵あたりのPGC 数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ １５ ５５６ ３７．１ ２ １５ １４６ ９．７ ３ １５ ４７６ ３１．７ ４ １５ ５５２ ３６．８ ５ １５ ２４２５ １６１．７ ６ １５ ７４７ ４９．８ ７ １５ １７３ １１．５ ８ １５ １５０１ １００．０ ９ １３ １５８ １２．２ 10 １０ ２３ ２．３ 11 １４ ７３ ５．２ 12 ５ ３３９ ６７．８ 13 ５ ４２ ８．４ 14 ５ １７３ ３４．６ 15 １０ ７８０ ７８ 16 ２０ １３１８ ６５．９ 17 ３０ ３４７ １１．６ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 計 ２３２ ９８２９ 平均 ４２．４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
Claims (1)
- 【請求項１】 鳥類原始生殖細胞の分離方法であって、
以下の工程： （Ａ）鳥類胚の血液を、動物血清を含む動物細胞培養用
培地を用いて希釈する工程； （Ｂ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を１０〜２０％（w/v)で含む溶
液を、上記工程（Ａ）の希釈血液に容量比で５〜２０倍
の割合で混合して混合物を得る工程； （Ｃ）動物血清を含む動物細胞培養用培地中に、浸透圧
を２００mOsm／kgから３８０mOsm／kgの範囲内に保った
まま比重を変えうる物質を４〜８％（w/v)で含む溶液
を、工程（Ｂ）で得た混合物上に重層する工程； （Ｄ）重層された２層の液を遠心分離して上清を得る工
程；及び （Ｅ）鳥類原始生殖細胞を含む上清を分離する工程 を含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4004997A JPH05227947A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | 鳥類原始生殖細胞の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4004997A JPH05227947A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | 鳥類原始生殖細胞の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227947A true JPH05227947A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=11599238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4004997A Pending JPH05227947A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | 鳥類原始生殖細胞の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05227947A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4818469A (en) * | 1985-10-28 | 1989-04-04 | Deutsche Gesellschaft Fur Wiederaufarbeitung Von Kernbrennstoffen Mbh | Seal for turning valve bodies, in particular for valves in nuclear-engineering plants |
| EP0779359A4 (en) * | 1994-08-24 | 1999-10-27 | Meiji Milk Prod Co Ltd | METHOD FOR THE CULTURE OF BIRD CELLS AND CELL LINES OBTAINED THEREFORE |
| EP2500417A1 (en) | 2006-08-09 | 2012-09-19 | Vivalis | Method of production of transgenic avian using embryonic stem cells |
| EP2572728A1 (en) | 2007-04-24 | 2013-03-27 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
| US9382513B2 (en) | 2002-03-08 | 2016-07-05 | Valneva | Method of making an avian cell line |
-
1992
- 1992-01-14 JP JP4004997A patent/JPH05227947A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4818469A (en) * | 1985-10-28 | 1989-04-04 | Deutsche Gesellschaft Fur Wiederaufarbeitung Von Kernbrennstoffen Mbh | Seal for turning valve bodies, in particular for valves in nuclear-engineering plants |
| EP0779359A4 (en) * | 1994-08-24 | 1999-10-27 | Meiji Milk Prod Co Ltd | METHOD FOR THE CULTURE OF BIRD CELLS AND CELL LINES OBTAINED THEREFORE |
| US9382513B2 (en) | 2002-03-08 | 2016-07-05 | Valneva | Method of making an avian cell line |
| EP2500417A1 (en) | 2006-08-09 | 2012-09-19 | Vivalis | Method of production of transgenic avian using embryonic stem cells |
| US8962311B2 (en) | 2006-08-09 | 2015-02-24 | Valneva | Method of obtaining chicken embryonic stem cells |
| EP2572728A1 (en) | 2007-04-24 | 2013-03-27 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
| US9260694B2 (en) | 2007-04-24 | 2016-02-16 | Valneva | Generation of duck cell lines |
| US9822345B2 (en) | 2007-04-24 | 2017-11-21 | Valneva | Method of making a virus using duck embryonic derived stem cell lines |
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