CN113699119A - 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法。取MDCK细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，得到接种培养基质；将新城疫病毒接种至上述培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加无血清培养基的病毒生产液继续进行悬浮培养，得到新城疫病毒。本发明方法生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，生产出的新城疫疫苗安全性好、免疫效力高，对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法。
背景技术
目前，己上市的新城疫疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外使用鸡胚培养工艺生产新城疫病毒己有许多年的历史。虽然“鸡胚法”这种技术不断进化来应对各个挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生长速度等方面。但在实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗，若所有鸡胚来自普通鸡蛋，不仅可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。如需大批量繁殖新城疫病毒制备疫苗时，直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，势必无法保证鸡胚来源、品种以及母源抗体水平的一致，继而对鸡胚的孵化率及其所繁殖病毒的效价造成很大影响，由于这些自然因素，造成的结果就是不同批次间的疫苗均一性很不稳定。同时鸡胚培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白，在疫苗制备过程中存在一定的安全隐患，另外胚体废弃物往往高压灭菌并不彻底，也会存在散毒的危险，所以，利用鸡胚培养难以保证每批产品质量的一致性，稳定性及安全性，因此急需选择新的新城疫病毒疫苗生产介质。并且，新城疫病毒生产中一般用转瓶贴壁生长的方式培养，生产效率低成本高，在疫苗需求激增时会出现生产能力不足的问题。因此，选择一株能够大幅提高新城疫病毒的生长滴度并能大产量生产的细胞株显得尤为重要。目前已有报道用传代细胞系包括vero细胞系、marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系、MDBK细胞系以及鸡胚传代细胞DF-1细胞系来培养新城疫病毒制备疫苗，但是由于上述细胞表面新城疫病毒受体丰度低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，并且大多使用血清培养，其价格非常昂贵，给进一步深入研究疫苗的制备造成极大困难。
专利CN 102978166 A公开了一种使用连续传代的细胞系制备新城疫病毒与疫苗的方法及其制品。将MDBK细胞系、VeroE6细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系的任意一种或几种细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层，然后将新城疫病毒接种于细胞单层进行病毒吸附，换用细胞维持液培养后加入D-氨基葡萄糖孵育，洗去孵育剂后重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖新城疫病毒。该专利虽然公开了采用无血清的细胞维持液进行病毒繁殖，但细胞生长所用的细胞培养液仍采用血清含量为1％-7％v/v的培养液，且为细胞贴壁培养，消化传代，并未实现新城疫病毒的无血清全悬浮培养与繁殖。
专利CN 110283791 A公开了一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法。首先利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因VII型病毒，使其收获抗原效价大于9；再利用悬浮MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒，使其收获抗原效价大于10；最后利用悬浮培养的新城疫基因VII型和H9N2亚型禽流感抗原制备新流二联疫苗。该专利虽然公开了采用无血清培养基培养新城疫基因VII型病毒，但采用的是BHK细胞系无血清培养基，且并未对新城疫病毒的生长与增殖的不同条件予以分开考虑。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述方法培养得到的病毒在制备新城疫疫苗中的应用。
本发明方法生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，生产出的新城疫疫苗安全性好、免疫效力高，对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，包括如下步骤：
(1)取MDCK细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，得到接种培养基质；
(2)将新城疫病毒接种至步骤(1)的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒生产液继续进行悬浮培养，得到新城疫病毒；
步骤(2)中所述病毒生产液采用无血清培养基。
进一步地，所述新城疫病毒在接种前先进行如下适应与驯化：
将新城疫病毒接种至步骤(1)的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒生产液继续进行悬浮培养，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒滴度最高时收获病毒作为下一代驯化的种毒；按此方法连续传代培养3～4代，收获得到新城疫病毒在MDCK细胞中的适应毒。
进一步地，步骤(1)中所述无血清培养基为CD MDCK 244无血清培养基(甘肃健顺生物科技有限公司商业化产品，编号为22039-244.1)。该培养基属于无血清、化学界定培养基。
进一步地，步骤(1)中所述悬浮培养的温度为35℃～37℃，更优选为37℃；培养转速为120rpm～150rpm，更优选为150rpm。
进一步地，步骤(2)中所述新城疫病毒为II类VII型流行NDV株DHN3(为专利CN201910894754.9中公开的重组毒株，简称rDHN3-mF株)。
进一步地，步骤(2)中所述新城疫病毒接种量为10-2-10-5MOI，更优选为10-3MOI。
进一步地，步骤(2)中所述病毒吸附的时间为0.5h～1h，更优选为1h；病毒吸附的培养温度为33℃～37℃，更优选为37℃；培养转速为120rpm～150rpm，更优选为120rpm。
进一步地，步骤(2)中所述补加病毒生产液的体积为原有生长培养基体积的1～4倍，更优选补加1倍体积的病毒生产液。
进一步地，步骤(2)中所述补加病毒生产液继续进行悬浮培养的温度为33℃～37℃，更优选为33℃，培养转速为120rpm～150rpm，更优地120rpm。
进一步地，步骤(2)中所述病毒生产液采用的无血清培养基为CD MDCK 244无血清培养基(产品编号22039-244.1)或BHK LSM 228无血清培养基(产品编号为10301-228)。均为甘肃健顺生物科技有限公司商业化产品。更优选为CD MDCK 244无血清培养基。
进一步地，步骤(2)中所述病毒生产液需补加TPCK胰酶和葡萄糖。
进一步地，步骤(2)中所述病毒生产液中还加入植物蛋白胨、大豆水解乳蛋白和酵母提取物作为补料。
通过上述方法培养得到的病毒在制备新城疫疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用全悬浮传代细胞系MDCK细胞进行新城疫病毒培养，不仅避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时存在的大量杂蛋白的缺点，降低鸡只免疫副反应的发生。同时还避免了生产基质和培养过程引入外源病毒的风险，制备的病毒抗原纯净、质量稳定均一且安全。
2、采用本发明培养的新城疫病毒各批间质量差异小，疫苗质量高，又克服了疫苗大量生产受制于鸡胚供应的缺点，节省了生产成本。另外还具有生产工艺简便易操作、培养环境可控、可大规模生产等特点，因而有很好的经济效益和应用前景。
3、本发明采用先进的悬浮培养技术，具有如下优势：(1)大大增加了细胞培养密度；(2)病毒滴度及疫苗效价显著提高，同时降低了疫苗产生的副反应；(3)采用了全封闭、管道化系统的细胞与病毒培养方式，培养条件可实现自动监测，确保培养环境及病毒的稳定性；(4)该技术可以应用在在生物反应器中，以全悬浮传代细胞系作为新城疫病毒的靶细胞，采用无血清化学界定的个性化培养基进行新城疫病毒的全悬浮培养，既解决了传统新城疫病毒培养受制于鸡胚供应的缺陷，又避免了感染外源病毒的风险。(5)无血清全悬浮培养可以突破传统贴壁细胞生长表面积的限制，无需昂贵的微载体和添加血清，可以节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。(6)因生产过程中无需微载体和消化液，从而可以大大减少产品杂质的引入，简化产品后期的分离纯化过程，有效的降低生产成本。
4、本发明接毒培养采用的MDCK细胞倍增时间短(约16h-20h)，生长密度高(>3,000万个细胞/mL)，与其他细胞源及鸡胚源生产相比，大大缩短了疫苗的生产时间，对于提高病毒疫苗的生产效率，具有非常大的优势，同时因为单位细胞密度高，因此病毒增殖滴度也高，生产出的病毒疫苗无需经过浓缩等下游繁琐的程序，大大节约了成本。并且能在大流行新城疫爆发的情况下迅速投入生产，提供疫苗产品，为养禽业保驾护航，减少损失，最大限度的保护养殖户的经济利益。
5、本发明采用MDCK全悬浮二阶式培养，其优势在于：生产工艺简单；不浪费培养基；不换液；生长培养基和生产培养基可以为相同的培养基，也可以为不同的培养基。生产培养基和生长培养基按照比例混合，既可以达到细胞生长的作用，又可以达到新城疫病毒复制增殖的作用，极大的提高了培养基的利用率，节省了成本。
6、本发明生长培养基和生产培养基均为无血清、化学界定的个性化培养基，价格实惠，无需购买国外昂贵的进口培养基，具有突出的价格优势，大大节约了成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、材料：
1.病毒：II类VII型流行NDV株DHN3(即为专利CN201910894754.9中公开的毒株，由本公司华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司保存，简称rDHN3-mF株)。
2.细胞：全悬浮传代细胞系MDCK细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.无血清、化学界定培养基：CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)、BHKLSM228培养基(产品编号为10301-228)，均由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
二、方法：
1.细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞株，37℃水浴融化后加入到约30mL的CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)培养基中，经离心机1000RPM离心10min，倒掉上清液，使用125mL三角摇瓶将细胞重悬在10mL的CD MDCK 244培养基中置于37℃，5％CO2培养箱中培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率。
2.细胞传代：对第一代的细胞密度进行计数，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，按1.0×106～1.5×106cells/mL接种至三角瓶中进行细胞传代，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，转速为150rpm，继续培养2～3天后，按照此方法继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验。
3.细胞扩增：根据实际实验条件，扩增种子细胞，采用第3代的种子细胞扩增第4代的实验用种子细胞200mL，传代方法及培养条件同步骤2，当细胞密度达到8.08×106/mL，活率为98.85％时，用于接毒。
4.接毒：新城疫(rDHN3-mF)株种毒为鸡胚源毒，种毒来源为华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司，已在专利CN201910894754.9中公开，毒价为108.2EID50/0.1mL。取鸡胚培养的新城疫种毒一支，采用二阶培养法按10-2MOI接种于步骤1中的MDCK细胞中，接毒后置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养1h，此为病毒吸附阶段，转速为120rpm。吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，生产液培养基为BHK LSM 228(建顺生物，产品编号为10301-228)，生产液需补加4mg/L TPCK胰酶，3g/L Gluc葡萄糖，放回到33℃、5％CO2培养箱中培养继续培养，摇床转速为120rpm。每隔12h取样，进行EID50的检测。在病毒滴度最高的时段收获病毒作为下一代驯化的种毒。
5.病毒的传代驯化
将步骤4中收获的种毒反复冻融离心3次，按相同的方法接毒进行传代驯化，如此连续传代培养3-4代。
6.病毒的检测：对收获的病毒进行EID50检测。
三、结果
经过连续4代次的传代驯化，发现新城疫病毒能够很好的在MDCK细胞中增殖，EID50检测结果(表1)如下：
表1：新城疫病毒在MDCK细胞中的传代驯化结果
Figure BDA0002827782240000061
Figure BDA0002827782240000071
从表中可以看出，随着在MDCK细胞中的连续传代驯化，新城疫病毒能够逐渐适应MDCK细胞，病毒滴度经过传代驯化呈上升趋势。经检测，每0.1mL培养液病毒含量为107.0EID50以上，甚至达108.03EID50，符合《中华人民共和国兽药典》规程。因此选择全悬浮传代细胞系MDCK细胞作为新城疫病毒培养的靶细胞是非常具有可行性的。
实施例2
一、材料：
1.病毒：II类VII型流行NDV株DHN3(即为专利CN201910894754.9中公开的毒株，由本公司华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司保存，简称rDHN3-mF株)。
2.细胞：全悬浮传代细胞系MDCK细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.无血清、化学界定培养基：CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)、BHKLSM228(产品编号为10301-228)，均由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
二、方法：
1.细胞的传代及培养：将MDCK细胞按1.0×106～1.5×106cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
2.病毒的接种：采用二阶培养法，将新城疫病毒接种MDCK细胞，接毒量以体积比为主，接毒液与细胞培养基体积比为：1/100、1/1000、1/10000。接毒后置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养1h，此为病毒吸附阶段，转速为120rpm。吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，生产液培养基为BHK LSM 228(建顺生物，产品编号为10301-228)，生产液需补加4mg/LTPCK胰酶，3g/L Gluc葡萄糖，放回到33℃、5％CO2培养箱中培养继续培养，摇床转速为120rpm。每隔12h取样，进行EID50的检测。
3.病毒的检测：对收获的病毒进行EID50检测。
对实施例2进行EID50检测，结果如表2所示：
表2：不同接毒量对新城疫病毒在MDCK细胞中增殖的影响
接毒量(体积比) EID<sub>50</sub>/0.1mL
1/100 10<sup>7.47</sup>
1/1000 10<sup>8.03</sup>
1/10000 10<sup>7.93</sup>
从表中可以看出，新城疫病毒在MDCK细胞中的培养受到接毒量的影响，接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量(体积比)为1/1000(10-3MOI)时，可达到最高滴度，为每0.1mL培养液病毒含量约达到108.08EID50，因此新城疫病毒在MDCK细胞中的最佳接毒量(体积比)为1/1000。
实施例3
一、材料：
1.病毒：由实施案例2中收获的病毒滴度最高的新城疫病毒。
2.细胞：全悬浮传代细胞系MDCK细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.无血清、化学界定培养基：CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)、BHKLSM228(产品编号为10301-228)，均由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
4.补料：植物蛋白胨(Phytone Peptone)、大豆水解乳蛋白(SE50)、酵母提取物(Yeast Extrct)，均为公开销售商品，一般市场上可购买。
二、方法：
1.细胞的传代及培养：将MDCK细胞按1.0×106～1.5×106cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
2.病毒的接种：采用二阶培养法，将新城疫病毒接种MDCK细胞，接毒量以体积比为1/1000，接毒后置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养1h，此为病毒吸附阶段，转速为120rpm。吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，生产液培养基为BHK LSM 228(建顺生物，产品编号为10301-228)，生产液均需补加4mg/L TPCK胰酶，3g/L Gluc葡萄糖，此时条件一为不添加任何补料，条件二的生产液额外补加2g/L Phytone Peptone，2g/L SE50，2g/L YeastExtrct。除了补料添加与否外，其他条件均保持一致，补加生产液后放回到33℃、5％CO2培养箱中培养继续培养，摇床转速为120rpm。每隔12h取样，进行EID50的检测。
对本实施例进行EID50检测，结果如表3所示：
表3：添加补料对新城疫病毒在MDCK细胞中增殖的影响
添加补料情况 EID<sub>50</sub>/0.1mL
不添加补料 10<sup>7.87</sup>
添加补料 10<sup>8.01</sup>
从表中可以看出，新城疫病毒在MDCK细胞中的培养受到补料的影响，添加补料可提高新城疫病毒滴度，为每0.1mL培养液病毒含量约达到108EID50，因此新城疫病毒在MDCK细胞中增殖，补加生产液时可补加上述补料。
实施例4
一、材料：
1.病毒：由实施案例2中收获的病毒滴度最高的新城疫病毒。
2.细胞：全悬浮传代细胞系MDCK细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.无血清、化学界定培养基：CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)、BHKLSM228(产品编号为10301-228)，均由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
4.补料：植物蛋白胨(Phytone Peptone)、大豆水解乳蛋白(SE50)、酵母提取物(Yeast Extrct)，均为公开销售商品，一般市场上可购买。
二、方法：
1.细胞的传代及培养：将EB66细胞按1.0×106～1.5×106cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
2.病毒的接种：采用二阶培养法，将新城疫病毒接种MDCK细胞，接毒量以体积比为1/1000，接毒后置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养1h，此为病毒吸附阶段，转速为120rpm。吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，条件一的生产液培养基为BHK LSM 228(建顺生物，产品编号为10301-228)，条件二的生产培养基为CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)，生产液均需补加4mg/L TPCK胰酶，3g/L Gluc葡萄糖，由实施案例3知，两个条件均需要补加2g/L Phytone Peptone，2g/L SE50，2g/L Yeast Extrct。除了生产培养基不同，其他条件均保持一致，补加生产液后放回到33℃、5％CO2培养箱中培养继续培养，摇床转速为120rpm。每隔12h取样，进行EID50的检测。
对本实施例进行EID50检测，结果如表4所示：
表4：不同种类生产培养基对新城疫病毒在MDCK细胞中增殖的影响
生产液培养基种类 EID<sub>50</sub>/0.1mL
BHK LSM 228 10<sup>7.93</sup>
CD MDCK 244 10<sup>8.08</sup>
从表中可以看出，新城疫病毒在MDCK细胞中的培养受到生产培养基种类的影响，新城疫在MDCK细胞上增殖时，生长液培养基与生产培养基均为CD MDCK 244更适合病毒的增殖，每0.1mL培养液病毒含量可达到108。08EID50。因此新城疫病毒在MDCK细胞中增殖，生长培养基与生产培养基均选择CD MDCK 244。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取MDCK细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至8.0×106～16×106cells/mL，活率在90％以上时，得到接种培养基质；
(2)将新城疫病毒接种至步骤(1)的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒生产液继续进行悬浮培养，得到新城疫病毒；
步骤(2)中所述病毒生产液采用无血清培养基。
2.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：所述新城疫病毒在接种前先进行如下适应与驯化：
将新城疫病毒接种至步骤(1)的培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加病毒生产液继续进行悬浮培养，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒滴度最高时收获病毒作为下一代驯化的种毒；按此方法连续传代培养3～4代，收获得到新城疫病毒在MDCK细胞中的适应毒。
3.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述无血清培养基为CD MDCK 244无血清培养基；所述悬浮培养的温度为35℃～37℃，培养转速为120rpm～150rpm。
4.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述新城疫病毒为II类VII型流行NDV株DHN3；所述新城疫病毒接种量为10-2-10- 5MOI。
5.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述病毒吸附的时间为0.5h～1h；病毒吸附的培养温度为33℃～37℃，培养转速为120rpm～150rpm。
6.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述补加病毒生产液的体积为原有生长培养基体积的1～4倍；所述补加病毒生产液继续进行悬浮培养的温度为33℃～37℃，培养转速为120rpm～150rpm。
7.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述病毒生产液采用的无血清培养基为CD MDCK 244无血清培养基或BHK LSM 228无血清培养基。
8.根据权利要求3所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述病毒生产液采用的无血清培养基为CD MDCK 244无血清培养基。
9.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述病毒生产液需补加TPCK胰酶和葡萄糖，并进一步还加入植物蛋白胨、大豆水解乳蛋白和酵母提取物作为补料。
10.权利要求1～9任一项所述的方法培养得到的病毒在制备新城疫疫苗中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090081251A1 (en) * 2005-04-11 2009-03-26 Vivalis Production of Viral Vaccines in Suspension on Avian Embryonic Derived Stem Cell Lines
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
CN108220227A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN110129281A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 成都天邦生物制品有限公司 一种使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090081251A1 (en) * 2005-04-11 2009-03-26 Vivalis Production of Viral Vaccines in Suspension on Avian Embryonic Derived Stem Cell Lines
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
CN108220227A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN110129281A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 成都天邦生物制品有限公司 一种使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG D等: "Serum-Free Suspension Culture of MDCK Cells for Production of Influenza H1N1 Vaccines", 《PLOS ONE》 *
徐宏军等: "BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究", 《中国兽药杂志》 *

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