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一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。包括以下步骤：将鸭坦布苏病毒毒株在悬浮BHK‑21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；悬浮BHK‑21细胞复苏后使用无血清培养液在生物反应器内放大培养；将放大培养后的悬浮BHK‑21细胞接种基础种毒株，继续培养；接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；接种病毒48小时后每隔6小时取样计算细胞活率，细胞活率低于50％时收获病毒培养液；将病毒培养液反复冻融、离心后保存。本发明采用悬浮BHK‑21细胞培养，病毒适应性好，病毒含量高；操作成本低，产品质量稳定；易操作，具备工业化大生产可行性。

Description

一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种可以引起鸭产蛋下降的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属。鸭群感染该病毒后临床症状为脚麻痹、采食量下降、产蛋骤减和神经症状，雏鸭最早发病日龄为7日龄，产蛋期高发，商品鸭和产蛋鸭愈后发育不良且产蛋率恢复差，给养鸭业造成巨大经济损失。目前现有技术中主要利用鸭胚、鸭胚成纤维细胞、Vero细胞进行体外培养，但并不能完全满足鸭坦布苏病毒大规模低成本培养的需求。此外，现有技术中培养鸭坦布苏病毒获得的病毒液滴度低，给鸭坦布苏病毒疫苗的制备造成了极大的困难。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：
步骤1、毒株适应：将鸭坦布苏病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；
步骤2、细胞培养：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在生物反应器内放大培养；
步骤3、病毒接种：待步骤2中悬浮BHK-21细胞密度达到7.0×106～1.0×107cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度6.0×105～5.0×106cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，继续培养；
步骤4、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；
步骤5、收获病毒：接种病毒48小时后每隔6小时取样计算细胞活率，细胞活率低于50％时一次性收获全部病毒培养液；
步骤6、病毒保存：将步骤5收获的病毒液进行反复冻融、离心后保存。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤2中培养条件为温度35～37℃，pH 6.6～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～70r/min，保持细胞密度1.0×106～1.0×107cells/mL。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤3中病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.01～0.5。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤3中接种病毒后培养条件为35～37℃，pH 6.6～7.1，DO 20％～60％，搅拌速度30～60r/min。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤4中营养包为无血清培养液浓缩液，浓缩倍数为2～10倍。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤4中葡萄糖监测的方法为使用罗氏卓越精采NC型血糖仪检测。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤5中病毒收获时间为接毒后48～96小时。
进一步地，在上述鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤6中细胞活力的检测方法为使用台盼蓝染色法计数。
进一步地，在上述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤6的具体步骤为在-40～-20℃反复冻融1～3次，冻融后以2000g～5000g离心5分钟收集上清液，于-20℃保存。
一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液在制备鸭坦布苏病毒灭活疫苗中的应用。
一种采用上述鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液配制的鸭坦布苏病毒灭活疫苗。
本发明的有益效果为：
本发明提供的一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，不使用鸭胚培养病毒工艺，不需要专门饲养种鸭和挑选鸭胚，不需要无害化处理鸭胚组织物，对环境影响小；本发明采用悬浮BHK-21细胞培养，病毒适应性好，病毒含量高；本发明不用细胞贴壁介质，采用无血清全悬浮培养工艺，接种病毒前不需更换维持液，不需血清，培养基成分清晰可控，采用节省操作成本，产品质量稳定；本发明使用生物反应器培养鸭坦布苏病毒，降低了病毒扩散的风险，具有更好的安全性，工艺简单，易操作，染菌风险小，具备工业化大生产可行性；本发明提供的鸭坦布苏病毒无血清悬浮培养方法制备的病毒液病毒含量高，可以很好的应用于鸭坦布苏病毒疫苗的制备中。
附图说明
图1是接种病毒前的悬浮BHK-21细胞状态图
图2是收获病毒液前的悬浮BHK-21细胞状态图
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所采用的原料如下：
鸭坦布苏病毒：本实验室分离鉴定保存。
悬浮BHK-21细胞系：本实验室驯化保存。
无血清培养液：倍谙基生物科技有限公司Tac-S101S无血清培养基或苏州沃美生物技术有限公司BS-SFM无血清培养基。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：
步骤1、毒株适应：将鸭坦布苏病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代5代，使用贴壁BHK-21细胞测TCID50，毒价为107.67TCID50/mL，保存病毒液作为基础种毒株；
步骤2、细胞培养：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在生物反应器内放大培养；培养条件为温度37℃，pH 7.0，DO 60％，搅拌速度70r/min，细胞密度达到1.0×107cells/mL后补充无血清培养液，稀释细胞密度至2.0×106cells/mL继续培养。
步骤3、病毒接种：细胞培养体积达到5L后，当悬浮BHK-21细胞密度达到1.0×107cells/mL时使用无血清培养基稀释细胞至细胞密度6.0×105cells/mL，按MOI为0.01接入基础种毒株。接毒后培养条件为36℃，pH 7.0，DO 60％，搅拌速度60r/min；
步骤4、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为5mmol/L时，补充营养包；
步骤5、收获病毒：接种病毒48小时后每隔6小时取样计算细胞活率，接种96小时后细胞活率低于50％，一次性收获全部病毒培养液；
步骤6、病毒保存：将步骤5收获的病毒液-20℃反复冻融2次，冻融后2000g离心5分钟收集上清，-20℃保存。
将上述方法制备的病毒液使用贴壁BHK-21细胞按照《中华人民共和国兽药典》2015年版第三部附录27的方法检测，测定病毒毒价为108.33TCID50/mL。
本实施例接种病毒前的悬浮BHK-21细胞形态如图1所示，收获病毒前悬浮BHK-21细胞形态如图2所示。图中标尺为100μm。
实施例2
一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：
步骤1、毒株适应：将鸭坦布苏病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代6代，使用贴壁BHK-21细胞测TCID50，毒价为108.33TCID50/mL，保存病毒液作为基础种毒株；
步骤2、细胞培养：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在生物反应器内放大培养；培养条件为温度37℃，pH 7.1，DO 50％，搅拌速度60r/min，细胞密度达到9.0×106cells/mL后补充无血清培养液，稀释细胞密度至1.0×106cells/mL继续培养。
步骤3、病毒接种：细胞培养体积达到5L后，当悬浮BHK-21细胞密度达到9.0×106cells/mL时使用无血清培养基稀释细胞至细胞密度2.0×106cells/mL，按MOI为0.05接入基础种毒株。接毒后培养条件为36.5℃，pH 7.1，DO 60％，搅拌速度60r/min；
步骤4、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为5mmol/L时，补充营养包；
步骤5、收获病毒：接种病毒48小时后每隔6小时取样计算细胞活率，接种84小时后细胞活率低于50％，一次性收获全部病毒培养液；
步骤6、病毒保存：将步骤5收获的病毒液-20℃反复冻融2次，冻融后3000g离心5分钟收集上清，-20℃保存。
将上述方法制备的病毒液使用贴壁BHK-21细胞按照《中华人民共和国兽药典》2015年版第三部附录27的方法检测，测定病毒毒价为108.5TCID50/mL。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、毒株适应：将鸭坦布苏病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；
步骤2、细胞培养：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在生物反应器内放大培养；
步骤3、病毒接种：待步骤2中悬浮BHK-21细胞密度达到7.0×106～1.0×107cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度6.0×105～5.0×106cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，继续培养；
步骤4、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；
步骤5、收获病毒：接种病毒48小时后每隔6小时取样计算细胞活率，细胞活率低于50％时一次性收获全部病毒培养液；
步骤6、病毒保存：将步骤5收获的病毒液进行反复冻融、离心后保存。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤2中培养条件为温度35～37℃，pH 6.6～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～70r/min，保持细胞密度1.0×106～1.0×107cells/mL。
3.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤3中病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.01～0.5。
4.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤3中接种病毒后培养条件为35～37℃，pH 6.6～7.1，DO 20％～60％，搅拌速度30～60r/min。
5.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤4中营养包为无血清培养液浓缩液，浓缩倍数为2～10倍。
6.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤4中葡萄糖监测的方法为使用罗氏卓越精采NC型血糖仪检测。
7.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤5中病毒收获时间为接毒后48～96小时。
8.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤6的具体步骤为在-40～-20℃反复冻融1～3次，冻融后以2000g～5000g离心5分钟收集上清液，于-20℃保存。
9.根据权利要求1～8任意一项所述鸭坦布苏病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液在制备鸭坦布苏病毒灭活疫苗中的应用。
10.一种鸭坦布苏病毒灭活疫苗，其特征在于，采用权利要求1～8任意一项所述培养方法制备的鸭坦布苏病毒液配制而成。
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