WO2005045026A1

WO2005045026A1 - 可逆的に増殖可能なインスリン発現ヒト膵島細胞株およびその用途

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Publication number: WO2005045026A1
Application number: PCT/JP2003/014243
Authority: WO
Inventors: Noriaki Tanaka; Naoya Kobayashi; Michiki Narushima; Yoshihito Tanaka
Original assignee: Kuraray Medical Inc.
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-05-19
Also published as: CN100467596C; CN1878864A; JPWO2005045026A1; CA2545180C; US20070086988A1; US7629168B2; CA2545180A1; JP4425856B2; AU2003277633A1

Abstract

　本発明は、それぞれ一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子を含有する可逆性不死化ヒト膵島細胞株であって、インスリン産生能を有し、かつ該ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子を除去したのちにインスリンの発現が増強されることを特徴とする可逆性不死化ヒト膵島細胞株、特にはＮＡＫＴ−１３（寄託機関　独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、あて名　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日　平成１５年９月４日、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−０８４６１）またはそれらの継代株、該可逆性不死化ヒト膵島細胞株またはその継代株からｈＴＥＲＴ遺伝子およびＳＶ４０Ｔ遺伝子を除去することにより得られるヒト膵島細胞、ならびにそれらの細胞の用途に関する。本発明の可逆性不死化ヒト膵臓細胞株を用いることにより、需要に見合った数のインスリン産生細胞を容易に確保することができる。

Description

明糸田可逆的に増殖可能なインスリン発現ヒト滕島細胞株およびその用途技術分野

本発明は、可逆的に増殖可能なィンスリン発現ヒト塍島細胞株に関する。さらに、本発明は、糖尿病用治療剤およびインスリンの製造方法に関する。背景技術

糖尿病は、インスリン活性の低下の原因に基づき、 1型糖尿病（若年型糖尿病）と 2型糖尿病とに大きく二つに分類される。

1型糖尿病は自己免疫の異常によって、ィンスリンを産生する塍細胞が特異的に破壊されることで発症する（Atkinson MA, Mac l aren NK. , N. Engl. J . Med . 331 : 1428-1436 , 1994参照) 。その根本的治療には、塍 j8 細胞の再生置換療法のひとつである移植が考えられる。この方法として勝臓移植と滕島移植がある。これら二つの移植の目的は、非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン療法による日常の煩わしさから患者を開放し生活の質（Q O L ) を向上させる事だけが目的ではない。移植療法はインスリン依存性糖尿病を治癒という最終目標に向かわせる手段として、インスリン療法よりは遙かに潜在能力を持った治療法である。しかしながら、勝臓移植では手術侵襲が大きいこと、また付随して移植される外分泌腺による合併症が重度となりうるなどの問題がある。これに対して、移植操作に伴う合併症の原因となっている外分泌腺を除去し塍 ;9細胞のみを単離して移植することを目的とした滕島移植は、現在、最も生理的に近い方法で糖尿病発症以前の状態に戻ることが期待できる治療法といえる。また、インスリンの分泌がぁる程度保たれている 2型糖尿病においても病期が進むと糖毒性や β 細胞の疲弊によってィンスリンの不足を来すが、 2型糖尿病は現在のところ、移植脖島の不足という厳然たる事実から、塍島移植の適応とはなっていない。将来、豊富な移植 Ji萃島の供給が可能となった場合には、インスリン抵抗性を契機としたィンスリン依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。

2 0 0 0年カナダ ·エドモントンのアルバータ大学から臨床勝島移植 7 症例について、後に「エドモントン 'プロトコール」と呼ばれる免疫抑制剤の斬新な使用法によって塍島移植を受けた全ての 1型糖尿病症例でィンスリンから離脱できたという報告がなされた（Shapi ro AM, Lakey JR, Ry an EA, et al .， N. Engl. J. Med. 343 : 230-238 , 2000参照) 。滕島移植はィンスリン依存型糖尿病患者にとって現在もっとも理想に近い治療法であると考えられている。

塍島は、滕臓の内分泌腺組織であり、その容積は勝臓全容積の 2 %以下である。塍島は内分泌細胞の集団であり、ひ細胞、 3細胞、 P P細胞、 <5 細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつィンスリンは滕島の β細胞から分泌される。 β細胞は塍島を構成する全細胞の 8 0〜8 5 %を占め、単にインスリンを分泌するのみではなく、血中の糖分を感知できる。この塍島を塍臓から単離し、インスリン依存型糖尿病の患者に移植して一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが Ji萃島移植である。

しかしながら、現行の塍島移植には、免疫抑制剤の使用による安全性の問題、さらには、移植塍島の不足という大きな問題がある。移植塍島の不足という問題は、現在の塍島単離技術がいかに向上したとしても、塍臓移植 ·塍島単離に要する脳死体からの摘出滕はそれを必要とする患者数に対して圧倒的に少なく、今後解消される見込みはない。したがって、滕島あるいは塍 )S細胞に匹敵する機能をもつ細胞を作成することは高い社会的貢献と大きな医療経済的影響を有するものである。また、近年急速に進歩し注目を集めている幹細胞研究でも塍内分泌細胞への分化誘導の可能性が示されており（Lumelsky N， Blondel 0， Laeng P, et al. , Sc ience 292 : 1389-1394, 2001 ; Assady S, Maor G, Ami t M, et al . , Di abete s 50 : 1691 -1697, 2001参照) 、人為的塍) 3細胞産生に対する関心をさらに助長する要因となっている。

現在、ヒト成熟塍島 iS細胞にかわる細胞の供給源として、ヒト E S細胞、組織幹細胞などが活発に研究されている。分化誘導で一部の細胞（マウス E S細胞や肝幹細胞）でィンスリン発現が認められたとの報告があるが、どの段階で、どの遺伝子を導入すれば効果的にィンスリンが分泌されるか未だに不明である。また、こうした幹細胞の使用は多分化能と活発な増殖能をもつこと自体に由来する制御の困難さを本質的に内包しており、実用化には今後かなりの時間を要するものと考えられる。

また、ブタ組織'細胞を利用した研究が進む一方、人畜共通感染症、生体組織適合性や倫理的問題も浮上してきた。とくにウィルスの潜在的危険性が大きな問題となってきた。たとえば、ブ夕の臓器、細胞が保有するブ夕由来のウィルスがレシピエントに感染して病気を起こす危険性（とりわけ、内因フタ特異 0勺レトロウイ Jレス ^porc ine endogenous ret rovirus ; PERV) は、染色体に組み込まれているために排除は不可能である）、それが家族や医療ス夕ッフに感染を広げ、さらに社会に新しいウィルス感染を広げる危険性などである。

よって現在、ヒト成熟塍島細胞にかわる細胞の供給源として、取り扱いの容易なィンスリン分泌ヒト塍島細胞株の樹立が望まれている。しかしながら、これまで、多くの研究者がヒト塍島細胞を不死化しようと精力的に取り組んでいるが、ィンスリンを産生するヒト塍島細胞株は一切報告されていない。これは、 1) インスリンを産生する細胞が塍島の内部に存在するため遺伝子導入が困難である、 2) 不死化株を樹立するためにウイルス由来の癌遺伝子（シミアンウィルス 40腫瘍抗原など）を使用したものであるために細胞寿命の延命は起こるが完全な不死化には至らないためと考えられる。事実、ヒト細胞が増殖崩壊を越えて無制限に増殖し続けることができる頻度は低い（Shay JW, Wright WE, Exp. Cell Res. 184: 10 9-118， 1989; Ray FA, Kraemer PM, Carcinogenesis 14: 1511-1516, 199 3参照）。さらには、 S V40 Tを使用した細胞の i n v i t r oでの自然な不死化の確率はおよそ 3. 3 X 10— ⁷であると報告されており、これには内因的なテロメラーゼ活性の自然発現が必要といわれている（Bo ndar AG, Science 279: 349-352, 1998; Z u J, et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 96: 3723-3728, 1999; Halvorsen TL, et al., Mol. Cell Biol. 19: 1864-1870, 1999参照）。

本発明は、従来の問題点を解消し、インスリンを産生することができ、かつ需要に見合つた細胞数を容易に確保することができるヒト塍島細胞株を提供することを課題とする。発明の開示

前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、我々は、健常分離ヒト塍島細胞に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素'（以下、「hTERT遺伝子」と略称する）を発現する組み換えレトロウイルスベクター S SR# 19 7 (Watanabe T, et al., Transplantation 15;75 (11) :1873-1880, 2003参照）、およびシミアンウィルス 40腫瘍抗原遺伝子（以下、「SV40T 遺伝子」と略称する）を発現する組み換えレトロウイルスベクター S SR #69 ( esterman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93 ： 8971-8976, 1996参照）を導入したところ、可逆的に増殖可能な不死化細胞であって、インスリン産生能を有し、かつ hTERT遺伝子および S V40 T遺伝子を除去したのちにィンスリンの発現が増強されるという特徵を有する細胞株を樹立できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、それぞれ一対の LoxP配列に挟まれた hTER T遺伝子および S V40 T遺伝子を含有する可逆性不死ィ匕ヒト塍島細胞株であって、インスリン産生能を有し、かつ該 hTERT遺伝子および SV 40 T遺伝子を除去したのちにインスリンの発現が増強されることを特徴とする可逆性不死化ヒト塍島細胞株またはその継代株に関する。

前記可逆性不死化ヒト塍島細胞株が N A KT— 13 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) であることが好ましい。

本発明はまた、前記可逆性不死化ヒト滕島細胞株またはその継代株から hTER T遺伝子および S V40 T遺伝子を除去することにより得られるヒト塍島細胞に関する。

本発明はさらに、前記可逆性不死化ヒト滕島細胞株またはその継代株から h T E R T遺伝子および S V 40 T遺伝子を除去することにより得られるヒト滕島細胞を含有する糖尿病用治療剤に関する。

本発明はまた、前記可逆性不死化ヒト塍島細胞株もしくはその継代株、または前記可逆性不死化ヒト塍島細胞株もしくはその継代株から h T E R T遺伝子および S V 40 T遺伝子を除去することにより得られるヒト塍島細胞を用いることを特徴とするィンスリンの製造方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の可逆性不死化ヒト滕島細胞株の製造方法および該可逆性不死化細胞から h T E R T遺伝子および S V 40 T遺伝子を除去することにより得られる本発明のヒト脖島細胞の製造方法を示す概略図である。ここで、 ATGは開始コドン、はパッケージングシグナル、 L oxPは LoxP配列、 hTERTは、 hTERT遺伝子、 EGFPは増強緑色蛍光タンパク質遺伝子、 MoMLV LTRはモロニ一マウス白血病ウィルス長末端反復配列、 ECMV I RESは脳心筋炎ウィルス内リボゾームエントリ一部位、 H y g r o Rはハイグロマイシン耐性遺伝子、 HSV- TKは単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子、 SV40Tは SV

40 T遺伝子、 N e o Rはネオマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。

図 2は、 NAKT— 13細胞（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1 番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9 月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) を示す位相差顕微鏡写真である。部分 1は核を示し、部分 2は神経内分泌細胞様の突起を示す。図 3は、インスリン免疫染色法により染色された NAKT— 13細胞（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 30

5— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP -08461) を示す写真である。濃淡を問わず赤色にあらわれている部分 1はすべて細胞の核を示し、濃淡を問わず緑色にあらわれている部分 3 はすべてインスリンを示す。

図 4は、ィンスリンおよび細胞の核をより明確に示すために描いた図 3 のスケッチ図である。 1は図 3の 1に対応しており、細胞の核を示す。また、 3は図 3の 3に対応しており、インスリンを示す。

図 5は、インスリン免疫染色法により染色された、 AxCANCr eにて処理した NAKT— 13細胞を示す写真である。濃淡を問わず赤色にあらわれている部分 1はすべて細胞の核を示し、濃淡を問わず緑色にあらゎれている部分 3はすべてィンスリンを示す。

図 6は、ィンスリンおよび細胞の核をより明確に示すために描いた図 5 のスケッチ図である。 1は図 5の 1に対応しており、細胞の核を示す。また、 3は図 5の 3に対応しており、インスリンを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明において、「可逆性不死化」または「可逆的に増殖可能な」とは、不死化遺伝子を細胞に形質導入して、当該細胞を無限に増殖可能な状態にしたものであって、目的の細胞数まで増殖させた後、当該不死化遺伝子を取り除くことで、細胞増殖を停止し、元の安全性の高い状態に復帰させることのできる状態を意味する。

本発明の可逆性不死化ヒト塍島細胞株は、それぞれ一対の L o X P配列に挟まれた hTERT遺伝子および SV40T遺伝子を含有するヒト塍島細胞株である。さらに詳しくは、健常分離ヒト塍島細胞に、一対の l ox P配列に挟まれた h T E R T遺伝子を含有するレトロウイルスベクター S S R # 197、および一対の 1 o X P配列に挟まれた S V 40 T遺伝子を含有するレトロウイルスベクター S SR# 69を導入することにより得られ、インスリン産生能を有し、かつ該 hTERT遺伝子および S V40T 遺伝子を除去したのちにインスリンの発現が増強される細胞である。このなかでも、 NAKT— 13細胞株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) が好ましい。また、本発明の可逆性不死化塍島細胞は、図 2 (NAKT— 13細胞（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856 6) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 0846 1) ) に示すように、小型で、突起（部分 2) を伸ばしており、神経内分泌細胞の特徴を有する。

本発明に使用する健常分離ヒト塍島細胞は、公知の方法に従ってヒト塍臓から分離することができる (Staudacher C, Ricordi C, Stella M, Soc ci C, Cammelli L, Ferrari G, Dicarlo V. Minerva Chir. 31: 1665-166 8， 1985 または Ricordi C， Finke EH, Lacy PE., Diabetes 35: 649-653 , 1986参照）。

「ィンスリンの発現が増強」とは不死化遺伝子を除去することにより、除去前の細胞と比較してィンスリンの発現量が増加することを意味し、たとえば、 2〜100倍増加されることが好ましい。

インスリンの発現は、公知の方法、たとえば、インスリン抗体を用いたインスリン免疫染色法によって評価することができ、その発現量は、インスリン染色された試料の蛍光強度を測定することにより比較することができる。この蛍光強度の比較には、画像処理解析ソフト NIH image (Vol.62) (米国 N IH (National Institute of Health) により無償で配布）などを用いることができる。

レトロウイルスベクタ一 S SR# 197は、 hTERT遺伝子以外に、増強緑色蛍光タンパク質（EGFP) 遺伝子がコードされており、レトロウィルスベクター S SR# 69は、 SV40T遺伝子以外に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hy g r oR) と単純へルぺスウィルスヘルぺスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV— TK) との融合遺伝子、およびネォマイシン耐性遺伝子（ N e o R) がコードされている。これらはそれぞれ公知の方法、たとえば、前述した Wat anabe T, et al.， Transplantat io n 15;75 (11)： 1873-1880, 2003および West erman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996に記載された方法にしたがつて製造することができる。

前記 L o X P配列は、 C r e組換え酵素によって認識される公知の部位特異的組換え配列であり、この配列間で DNA鎖の切断、鎖の交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列である。同一の DN A分子上に同方向の一対の L o X P配列が存在する場合は、その間に挟まれた DN A配列が切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。

前記 hTERT遺伝子は、正常細胞の TERT遺伝子由来である。 hT ERT遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜など、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹 ·前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクロ一ン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子である。

前記 SV40T遺伝子は、公知の DN A型腫瘍ウィルスの腫瘍抗原（T 抗原）遺伝子である。

レトロウイルスベクター S SR# 197およびレトロウイルスベクター SSR#69の導入は、培養細胞へのこれらレトロウイルスベクターの直接播種による方法により行なわれる。

レトロウィルスベクタ一を培養細胞に直接播種することによって培養細胞にレトロウイルスベクターを導入する方法としては、本発明の目的を達成するものであればどのような方法でも用いることができる。たとえば、レトロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清を、別途培養中の塍島細胞に播種することにより導入を達成することもできる。各細胞の培養条件および播種濃度など種々の条件は、当該技術分野で周知の方法で決定することができる。

また、培養細胞への播種回数は、細胞への影響、たとえば染色体の安定性を考えると、 1回のみが好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらのことから、本発明では、 4時間感染を 1日に 2回、計 3日間実施することが最も好ましい。

本明細書において、 C r e組換え酵素は、 LoxP配列を特異的に認識する公知の組換え酵素であり、 L o X P配列に挟まれたヌクレオチド配列を切り出すことができる限り限定されるものではない。本発明においては、可逆性不死化ヒト滕島細胞株の染色体上に存在する L o X P配列に挟まれた hTERT遺伝子および S V40 T遺伝子を切り出すために、 C r e組換え酵素を使用する。 L oxP配列に挟まれた hTERT遺伝子および S V40 T遺伝子を可逆性不死化ヒト滕島細胞の染色体上から切り出すことにより得られた細胞は、癌化の危険性がなく安全であり、細胞移植に適する。

C r e組換え酵素を使用して、 11丁£1^丁遺伝子ぉょび3¥40 T遺伝子をィンビト口で大量培養した可逆性不死化ヒト塍島細胞株から除去する方法としては、（1) 遺伝子導入効率の良好なアデノウイルスベクターにより C r e組換え酵素を形質導入する方法、（2) リン酸カルシウム法にて、 C r e組換え酵素 DNAを細胞培養液中に添加する方法、（3) 培養上清中に、 human immunodeficiency virus (HI V) 由来の TATタンパク質と C r e組み換え酵素との融合タンパク質を添加する方法、（4) C r e組換え酵素タンパク質をカチォニック化して、細胞培養液中に添加す ' る方法、さらに（5) 薬剤誘導性 C r e組み換え酵素発現ベクターを導入することにより、薬剤を添加することで該遺伝子の除去を自由に起こさせるシステムを付加する方法などがあげられる。アデノウイルスベクタ一を用いない方法では、ウィルスベクタ一による更なる重複感染が不要であり、より好ましい。

本発明の可逆性不死化ヒト塍島細胞株から h T E R T遺伝子および S V 4 0 T遺伝子を除去することにより得られるヒト滕島細胞（以下、「復帰ヒト鹧島細胞」と略称する）は、たとえば、図 5 (復帰 NAKT—1 3細胞）に示すように、インスリンの発現が増強され、自然と細胞同士が凝集し、正常勝島構造に類似した形態をとるようになる。

本発明の糖尿病用治療剤は、前記復帰ヒト塍島細胞を含有する細胞製剤として使用することができる。本発明の糖尿病用治療剤は、前記復帰ヒト塍島細胞以外に、そのほかの活性成分として、糖尿病の治療に用いられる成分を含有することができる。そのような活性成分としては、トロダリ夕ゾンなどがあげられる。また、インスリンの分泌を促進させる目的で、二コチンアミドを添加することが好ましい。本明細書において細胞製剤とは、前記ヒト塍島細胞を培地、等張液、または緩衝液に懸濁した懸濁液、もしくは遠心などにより濃縮したペレツトなどの細胞塊などがあげられる。培地、等張液、または緩衝液は、前記ヒト塍島細胞に適合するよう適宜選択される。さらに、前記細胞製剤は、 DM S Oなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。また、前記細胞製剤は、ヒト体内に接種されることを考慮して、細胞増殖性をなくしておくとより安全である。細胞製剤として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシン C処理など、細胞製剤としての機能を残しつつ、病原細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる。

復帰ヒト塍島細胞を移植する場合、細胞は、経門脈的に肝臓に移植することが好ましい。その方法としては、たとえば、右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法、またはエコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法があげられる。なかでも、エコーにて細胞移植を行なう方法の方が、侵襲が少ないため好ましい。

また、該治療剤の投与量（移植量）は、たとえば 1億〜 1 0 0億細胞個 /個体が好ましく、 1 0億〜 1 0 0億細胞個ノ個体がさらに好ましく、 1 0億〜 2 0億細胞個 Z個体が最も好ましい。

本発明の可逆性不死化ヒト塍島細胞株および復帰ヒト塍島細胞は、たとえば、糖尿病を標的とした移植医療またはバイオ人工勝臓のソースとして利用できる。移植医療またはバイオ人工塍臓としては、たとえば、インスリン分泌細胞を高分子素材で作成したデバイス中に封入された、拡散チヤンバー型、マイクロカプセル型、中空糸型のモジュール (デバイス) と分離 ·培養細胞を組み合わせたバイプリッド型の人工勝臓などが挙げられる。バイオ人工 Ji萃臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の可逆性不死化滕島細胞および復帰ヒト滕島細胞はどちらも、いずれの形態のバイオ人工塍臓にも使用可能である。

また、本発明の可逆性不死化塍島細胞および復帰ヒト塍島細胞はどちらも、インスリンの製造に使用することができる。復帰ヒト滕島細胞は、ィンスリンの発現が増強されているため、可逆性不死化塍島細胞を大量培養したのち、 h T E R T遺伝子および S V 4 0 T遺伝子を除去し復帰ヒト塍島細胞としてィンスリンを効果的に製造することが好ましい。

インスリンの製造は、細胞培養物から細胞を除去し、得られた培養液をァフィ二ティーカラムなど、通常タンパク質の精製に使用される方法によつて精製することにより行なうことができる。

以下、具体的な実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1 ：可逆性不死ィ匕ヒト塍島細胞株 N AKT— 1 3 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6 ) 、寄託日平成 1 5年 9月 4日、受託番号 F E RM B P— 0 8 4 6 1 ) の樹立

カナダのアルバータ大学から提供された健常分離ヒト塍島細胞（カナダ、アルバータ大学、ヒト鹧島移植プログラム、ジョナサンレイキー（Jona than RT. Lakey) 博士より、万人が入手可能である）から、球形のきれいな形態を呈しているものを実体顕微鏡（STEMI、 Ca r l Z e i s s社、ドイツ）下に hand picku 法にて 10個選別し、これを T 25培養フラスコに播いた。培養液は、ウイリアムズミディアム E (WILLIAM ' S MEDIUM E) (シグマ社、セントルイス、米国）に 10%ゥシ胎仔血清 (FCS、シグマ社) 、 I t)—⁷ mo 1/1 インスリン (シグマ社) 、 1 0— ⁶ mo 1 / 1 デキサメタゾン (シグマ社) 、 25 / g/m 1 上皮成長因子 (EGF、シグマ社) 、 10mM ニコチンアミド (シグマ社) 、抗生物質のペニシリン G/ストレプトマイシン (シグマ社) の組成のものを基本培養液として用いた。播種から 3日目までは、基本培養液を 4ml とし、培養液の交換はしなかった。 4日目より、培養液の交換の際に、基本培養液を 2ml、レトロウイルスベクター S SR# 69産生細胞の培養上清とレトロウイルスベクター SSR# 197産生細胞の培養上清をそれぞれ 0. 45ミクロンのフィルターにかけたものをそれぞれ lm 1ずつ加え、計 4mlとして 4時間インキュベーションすることにより、遺伝子導入を 1日 2回行なった。この操作を、 4、 6、 8日目（計 6回）に、同様に繰り返した。

なお、レトロウイルスベクター S SR# 197産生細胞の培養上清およびレトロウイルスベクター S SR# 69産生細胞の培養上清の調製は以下のように行なった。

米国マサチューセッツ州ケンプリッジのハーバードーマサチューセッツ工科大学のフィリッぺレポルフ博士より提供されたレトロウイルスべクター S SR# 197産生細胞である C r i p細胞（S SR# 197) (Wa tanabe T， et al., Transplantation 15; 75 (11) :1873-1880, 2003.) (力価 4 X 10⁶ c f u/m 1 ) およびレトロウイルスベクター S S R# 69 産生細胞である C r i p細胞（SSR#69) (Westerman KA, Leboulch P., Pro Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996) (力価 4X 10⁶c f u/ml) を用い、各 C r i p細胞を、 T75フラスコに 10 万細胞個/ cm²で播種し、 1 Om 1の DMEM+ 10 %NCS (新生仔ゥシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約 90%となった時点で、培養液を DMEM+ 10%NCS培養液10m 1に交換した。培養液交換後 2 4時間培養し、それぞれレトロウイルスベクター S S R# 197およびレトロウィルスベクター S SR# 69を含有する培養上清を得た。

前記ヒト滕島細胞の播種から 10日目（最終感染から 2日目）より、基本培養液を、低グルコース DMEM (ギブコ社、オークランド、ニュージヤージ一州) に 10%FCS、 1 OmM ニコチンアミド、 320 Z 1 ハイグロマイシン、ペニシリン G/ ストレプ卜マイシンの組成のものに変更し、 100 gZm 1のハイグロマイシン（シグマ社）による選別を行なった。ハイグロマイシン耐性株が出現したところで、クロー二ングリングを用いて細胞をクロ一ン化した。各クローン細胞が増殖してきたところで、フローサイ卜メータ一 Mo F l o (ダコ ·サイトメ一ション（株）製、京都、日本）にて GFP陽性細胞を回収することで、可逆性不死化ヒ卜塍島細胞株 NAKT— 13 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 1 5年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) を樹立した。この NAKT— 13を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) 。得られた細胞株 NAKT— 13 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 一 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) は、図 2に示すように、小型で、突起（部分 2) を伸ばしており、神経内分泌細胞の特徴を有する。

実施例 2 ：可逆性不死化ヒト滕島細胞株からの S V 40 T遺伝子および h TERT遺伝子の除去

実施例 1で得られた可逆性不死化ヒト塍島細胞株を 10万細胞個 Zm 1 で、培地として低グルコース DMEM (ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に 10%FCS、 1 OmM ニコチンアミド、ペニシリン

GZ ストレプトマイシンの組成のもので培養した。培養開始から 24 時間で、培地中に C r e組み換え酵素の発現アデノウイルスベクター Ax CANC r eを 1モイ (MO I ： multiplicity of infection) 添加し、その後 48時間持続感染を行なった。得られた細胞を P B Sで 2回洗浄し、培地の交換を行なった。得られた復帰 NAKT— 13細胞は、図 5に示すように、自然と細胞同士が凝集し、正常勝島構造に類似した形態をとるようになるという特徴を有する。

実施例 3 ：インスリン発現と形態

実施例 1および 2で得られた細胞（各 5万細胞個）を、 6ゥエルプレートの中に力パースライドを敷いたところに播種し、培地として低ダルコ一ス DMEM (ギブコ社、才一クランド、ニュージャージー州) に 10 % F CS、 1 OmM ニコチンアミド、ペニシリン G/ ストレブトマイシンの組成のものを用いて、細胞が 60%密集となるまで 24時間培養した。ついで、培地を高グルコース DMEM (ギブコ社、オークランド、ニュージャージー州）に 10%FCS、 1 OmM ニコチンアミド、ペニシリン G/ ストレプトマイシンの組成のものに交換し、 6時間培養した。培養終了後、ゥサギ抗ヒトインスリン抗体（ダコ ·サイトメーシヨン（株）製、京都、日本）を用いる免疫染色法にて、細胞におけるインスリンの発現を検討した。染色結果を図 3および 5に示す。また、図 4および 6 はそれぞれ、図 3および 5のスケッチ図である。図 3および 5はそれぞれ、実施例 1で得られた N AKT— 13細胞（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 F ERM BP— 0846 1) 、および実施例 2で得られた復帰 NAKT— 13細胞を示す。図 3および図 5において、濃淡を問わず赤色にあらわれている部分 1はすべて細胞の核を示し、濃淡を問わず緑色にあらわれている部分 3はすべてィンスリンを示す。

図 3より、実施例 1で得られた NAKT—13細胞（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) では、インスリンの発現が確認された。また、図 3および 5より、実施例 2 で得られた復帰 NAKT— 1 3細胞では、画像処理解析ソフト NIH image (Vol.62) (米国 N I Hにより無償で配布）を使用して、蛍光度の強度を比較することで、復帰前の不死化塍島細胞よりインスリンの発現が約 30倍と顕著に増加していることが確認された。産業上の利用可能性

本発明の可逆性不死化ヒト塍島細胞株により、インスリン産生能を有する細胞を、需要に見合った数だけ容易に確保することができる。また、 h TER T遺伝子および S V 40 T遺伝子を当該細胞株から除去して得られる復帰ヒト塍島細胞は、増強されたインスリンの発現を示し、かつ安全であり、糖尿病治療において非常に有用である。

さらに、本発明の細胞を基に、インスリンの製造、または拡散チャンバ一型、マイクロカプセル型、中空糸型のモジュール（デバイス）と分離' 培養細胞を組み合わせたハイプリッド型などのバイオ人工勝臓の開発が可能である。

Claims

言青求の範囲

1. それぞれ一対の Lo xP配列に挟まれた hTERT遺伝子および SV 40 T遺伝子を含有する可逆性不死化ヒト塍島細胞株であって、ィンスリン産生能を有し、かつ該 hTERT遺伝子および SV40T遺伝子を除去したのちにィンスリンの発現が増強されることを特徴とする可逆性不死化ヒ卜腾島細胞株またはその継代株。

2. 可逆性不死化ヒト塍島細胞株が NAKT— 13 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 15年 9月 4日、受託番号 FERM BP— 08461) である特許請求の範囲第 1項記載の可逆性不死化ヒト塍島細胞株またはその継代株。

3. 請求の範囲第 1項記載の可逆性不死化ヒト塍島細胞株またはその継代株から h T E RT遺伝子および S V 40 T遺伝子を除去することにより得られるヒト塍島細胞。

4. 請求の範囲第 1項記載の可逆性不死化ヒト塍島細胞株またはその継代株から hTERT遺伝子および SV 40 T遺伝子を除去することにより得られるヒト塍島細胞を含有する糖尿病用治療剤。

5. 請求の範囲第 1項記載の可逆性不死化ヒト滕島細胞株もしくはその継代株、または請求の範囲第 3項記載のヒト塍等細胞を用いることを特徵とするィンスリンの製造方法。