JP2007236311A - 不死化ヒトメサンギウム細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 SV40T抗原遺伝子と構成的に発現するヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子とを導入することにより安定的に増殖を維持するヒト由来の不死化メサンギウム細胞株を樹立することができる。この不死化ヒトメサンギウム細胞をSV40抗原発現の非許容条件下で培養することにより、分化型ヒトメサンギウム細胞を得ることができる。本発明の不死化ヒトメサンギウム細胞及び分化型ヒトメサンギウム細胞は、ヒトメサンギウム細胞の機能を調節する物質のスクリーニングに有用である。
【選択図】図1
Description
胞では染色体末端に存在するテロメアが細胞分裂ごとに短縮し、一定の分裂回数の後、増殖が停止する。テロメラーゼ逆転写酵素は、このテロメア長を維持する酵素であり、この遺伝子を導入することにより細胞分裂回数を延長して細胞を不死化できることが見いだされている(Counter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14723-14728: 1998)。SV40tsT抗原遺伝子に加えて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードする遺伝子(hTERT)を構成的に発現するように導入することにより、より長期にわたり増殖を維持することのできる不死化メサンギウム細胞を樹立することができる。本発明に基づき樹立した細胞の増殖速度は、形質導入の宿主に用いた元の細胞とほぼ同等で、45〜55時間の二倍増殖時間を有しており、継代によりその増殖速度が減少することがない。また、本発明の不死化メサンギウム細胞は、後に示すメサンギウム細胞マーカー若しくは分化型メサンギウム細胞マーカーである細胞マーカーの発現能を保持していることを特徴とする。係る細胞の一例としては寄託番号がFERM BP-10478で示される不死化メサンギウム細胞を挙げることができるが、本発明は該寄託細胞に限定されるものではなく、上記記載の特徴を有する細胞であればいかなるものでもよい。
すなわち、本発明のスクリーニング方法により見いだされたメサンギウム細胞の機能調節物質は、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、アルポート症候群、糸球体腎炎、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎等の腎疾患の治療剤として使用することができる。
初代ヒトメサンギウム細胞(MC)はCambrex社(Walkersville, MD)より入手した。該細胞は18歳の男性より調製されたもので、37℃にて95%空気と5%の二酸化炭素ガスの環境下、MsGM増殖培地(Cambrex)中で培養した。
293FT細胞はInvitrogen社(Carlsbad, CA)より入手し、10%のウシ胎児血清(HyClone社, Logan, UT以下、FBS)、1%の非必須アミノ酸溶液及び1%のペニシリンとストレプトマイシン溶液(100 U/ml and 100 μg/mL)を加えたダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium、以下DMEM)にて培養した。細胞培養の全製品は特に記載がなければGibco-Invitrogen社(Grand Island, NY)より入手した。
不死化のために0.5-1.0 x 105個の初代ヒトメサンギウム細胞を6穴プレートにて終夜培養し、第2継代の段階で3 x 104 TUのLtV-tsTAgとなるよう調節した6 μg/mlのポリブレン(Sigma社, St Louis, MO) を含む1 mLウイルス上清に感染させた。培養液に32℃にて2 μg/mLのブラストシジンを添加することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。次に限界希釈クローン化を行い、単クローン細胞株を得た。最終的に167クローンを拾い、拡大培養した28クローンを9継代目にて保存した。全てのtsTAg感染細胞は19継代目以内に細胞危機(細胞死)を引き起こした。これらのクローンの内、#4, #130 及び #142を6穴プレート中、11から13継代時にLtV-hTERT(1 x 104 TU)を用いて更に感染させ、限界希釈クローニングを再び行った。その後、69クローンを拾い、拡大培養した30クローンを保存した。これらの細胞株は、5%のFBS、2 mMのグルタミン、1%のペニシリン、ストレプトマイシン及び2 μg/mLブラストシジンを添加したMCDB-131培地中、32℃、95%空気と5%二酸化炭素中で維持した。
実施例3で得られたクローンから、(a) tsTAg発現の32℃から37℃への温度シフトにおける制御、(b) 32℃及び37℃におけるマーカータンパク質の発現、及び(c) TGF-βに応答して培養液中でのPAI-1又はCOL4の発現を指標として不死化ヒトメサンギウム細胞を選択した。以下に、その実験方法と結果を示す。
不死化したメサンギウム細胞は32℃にて培養し、次に37℃にて6日間培養して、分化誘導した。刺激試験では、該細胞を0.5% FBSを含有する培地で血清飢餓下、24時間後に32℃又は37℃にて各実施例で示す量のTGF-β(R&D Systems社, Minneapolis, MN)を加え、培養した。メサンギウム細胞を1 mMのフェニルメタンスルフォニル・フルオライド(Cell Signaling社, Beverly, MA、以下PMSF)を含む1倍濃度の溶解バッファー(Cell Signaling社, Beverly, MA)にて氷上溶解し、全タンパク質を抽出した。培養皿より溶解物を剥離し、超音波破砕機を用いて(アウトプット1、TOMY社, Tokyo)5秒間超音波処理した。超音波処理物を4℃にて15000rpmで10分間遠心処理を施して、上清中のタンパク質含量をブラッドフォードタンパク質アッセイ(Bio-Rad社, Hercules, CA, USA)を用いて測定した。2-メルカプトエタノールを含有するLDSサンプルバッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)(以下、LDS-2ME)中でタンパク質還元処理後、標品は使用するまで-80°Cにて保存した。細胞培養培地も同バッファーを加え-80°Cにて保存した。
上述のウエスタンブロッティングの結果を、更に別の試験法である免疫染色により確認した。メサンギウム細胞株、HuVEC細胞及びHepG2細胞を96穴又は24穴細胞培養プレートで培養して、免疫蛍光染色により調べた。不死化メサンギウム細胞株は32℃にて培養し、37℃で6日間培養することにより分化誘導した。HepG2細胞とHuVECはAmerican Type Culture Collection (ATCC)から得て、それぞれ、10%のFBSと1%のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM培地、及び, 10%のFBS、50 μg/mLのヘパリン(Sigma社, St Louis, MO)と30 μg/mLの内皮細胞成長添加物(endothelial cells growth supplement)(BD Bioscience社, Bedford MA、以下ECGS)を添加したRPMI 1640培地にて培養した。HepG2細胞とHuVECは37°C にて、95%空気5%二酸化炭素中で培養した。培養後、細胞を-20°Cにて10分間、メタノールアセトン(4:1)で固定した。リン酸緩衝生理食塩水(以下、PBS)にて洗浄後、細胞を4℃にて10%FBSを含有するPBSでブロッキングした。固定させた細胞をウサギ抗COL4抗体(1:500希釈、abcam社, Cambridge, MA)、マウス抗FN抗体(1:500希釈, Sigma社, St. Louis, MO)、マウス抗α平滑筋アクチン(以下、αSMA)抗体(1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark)、ウサギ抗フォンビルブラント因子抗体(1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark)、マウス抗サイトケラチン18抗体(1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA)あるいはマウス抗サイトケラチン19抗体(1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA)のいずれかを含有する、10%FBSを含むPBSにてインキュベートした。PBSで洗浄後、細胞をAlexa 488ラベルした抗ウサギ二次抗体(1:500希釈, Molecular Probes社, Eugene, OR)又はCy3ラベルした抗マウス二次抗体(1:500希釈, Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA)とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡BZ-8000(Keyence社, Osaka)を使用して各マーカーの発現を調べた。
SV40tsT及びhTERTの二重形質導入株(#130hT-9)を用いて、分化型形質の発現条件を検討した。具体的には、TGF-βの濃度の変化および血清飢餓の有無がCOL4発現に及ぼす影響を、実施例4で示した免疫蛍光顕微鏡下での観察により調べた。図7に示された結果より、血清飢餓の有無のいずれの場合にも、TGF-β刺激による濃度依存的なCOL4の発現亢進が観察された。尚、発現亢進の程度は血清飢餓条件の方が強いことが示された。
実施例5と同様の試験をTGF-βの濃度を1.0 ng/mLに固定した上で、更に血清飢餓の有無とALK5阻害剤であるSB-505124の有無によるCOL4発現に対する影響を観察した。SB-505124 (Byfield et al., Mol. Pharmacol. 65: 744-752, 2004)は化学合成法により合成した。細胞株は#130hT-9株を使用した。血清飢餓の有無、TGF-βによる刺激の有無に関らず、ALK-5阻害剤であるSB-505124によりCOL4発現が強く抑制された(図8)。抑制の程度は血清欠乏条件下のほうが強いことが示唆された。
実施例5及び実施例6で示された細胞機能アッセイを定量的に実施するために、ELISA法を検討した。具体的には、細胞培養液中のPAI-1及びCOL4の量をELISA法により解析した。
PAI-1アッセイについては、0.5%のFBS含有培地にて血清飢餓後、不死化メサンギウム細胞を32℃にてALK-5阻害剤の存在又は非存在下、1.0 ng/mLの用量のTGF-βとインキュベートした。実施例4で取得した#130hTクローンの内の4株を試験に供した。細胞培養液試料は48時間経過時点で回収し使用するまでは-80°Cにて保存した。PAI-1 ELISAについては、96穴のイムノプレートに抗PAI-1モノクローナル抗体(1 μg/mL, American diagnostica, Stamford, CT)を100 mM NaHCO3中で固相化した。ブロッキングバッファー(0.2% I-block (Tropix社, Bedford, MA)を含有する 0.05%のトゥイーン20を含むPBS(以下、PBS-T)中)にてブロッキング後、試料(1:5希釈)又は標準PAI-1(Chemicon社, Temecula, CA)を種々の濃度でウエル当たり50μLにて加えて、室温にて1時間から2時間の間インキュベートした。ウエルをPBS-Tにて3回洗浄し、続けてブロッキングバッファー中のヤギ抗PAI-1モノクローナル抗体(0.5 μg/mL, R&D Systems社, Minneapolis, MN)とともに1時間インキュベートした。PBS-T洗浄後、ウエルをブロッキングバッファー中のアルカリフォスファターゼ(以下、AP)をコンジュゲートした抗ヤギ抗体(1:6000希釈, Zymed社, South San Francisco, CA)とともに1時間インキュベートした。ウエルをPBS-Tにて4回洗浄し、ウエル当たり100 μLのSIGMA FAST p-ニトロフェニルリン酸溶液(Sigma社, St.Louis, MO)を各ウエルに加えた。AP活性を405nmの吸収増加により分光光度法により測定した。試料中のPAI-1量を同じアッセイにおける既知濃度の標準PAI-1により作成された対照曲線から、GraphPad Prismソフトウエア(GraphPad社, San Diego, CA)を使用して計算した。図10Aは標準PAI-1により作成された標準曲線を示し、図10Bは試料中のPAI-1の定量値を示す。図10Bから、4種類のSV40tsT及びhTERTの二重形質導入株における、TGF-βに応答したPAI-1の発現亢進をELISA法により定量的に検出しうることが示された。
COL4アッセイについては、不死化ヒトメサンギウム細胞を、通常の培地の条件で、コラーゲンタイプIを被覆した培養プレート(Nippon Beckton Dickinson社、Tokyo)上で32℃又は37℃にて、ALK-5阻害剤の存在又は非存在下で、6日間インキュベートした。実施例4で選抜した#130hT-9の32継代目の細胞と55継代目の細胞を試験に供した。COL4 ELISAの手順はPAI-1と基本的に同じ手順であったが、ただし、以下の実験材料を使用した:ウサギ抗COL4ポリクローナル抗体(2 μg/mL, Rockland社, Gilbertsville, PA)、マウス抗COL4モノクローナル抗体(1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA)、APコンジュゲートした抗マウスIg抗体(1:1000希釈, Zymed社, South San Francisco, CA)及びヒトCOL4標準(Collagen Research Center社, Tokyo)。
不死化ヒトメサンギウム細胞を24時間0.5%のFBSを含む培地で血清飢餓させて、続けて1 μMのALK-5阻害剤の存在又は非存在下、TGF-β(1 ng/mL)又はBMP2(300 ng/mL, R&D Systems社, Minneapolis, MN)を用いて32℃にて30分間刺激した。コンプリートミニ(Complete mini)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics社, Penzberg, Germany)、フォスファターゼ阻害剤カクテル1及び2(Sigma社, St. Louis, MO)及び1 mMのPMSFを含む細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解した。各30 μgの標品を実施例4のウエスタンブロット法で示した方法でイムノブロットした。即ち、NuPAGE 4-12%ゲル上で電気泳動しPVDF膜に転写した後に、ウサギ抗Smad1(Upstate社, Lake Placid, NY)、ウサギ抗リン酸化Smad1(Ser463/465)(1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA)、ウサギ抗Smad2/3(1:1000希釈, Upstate社, Lake Placid, NY)、ウサギ抗リン酸化Smad2(Ser465/467)(1:1000希釈, Chemicon社, Temecula, CA)、マウス抗Stat3(Cell Signaling社, Beverly, MA)又はウサギ抗リン酸化Stat3(Tyr705)抗体((1:1000希釈, Cell Signaling社, Beverly, MA)を用いて、タンパク質をイムノブロットした後、HRPをコンジュゲートした二次抗体により検出した。膜をLumiImager中でECL plusを用いて可視化した。
Claims (15)
- 構成的もしくは制御可能なように発現するSV40T抗原遺伝子及び構成的に発現するhTERT遺伝子を含有する不死化ヒトメサンギウム細胞。
- SV40T抗原遺伝子の発現が制御可能である、請求項1記載の不死化ヒトメサンギウム細胞。
- SV40T抗原遺伝子の発現が温度シフトにより制御可能である、請求項2記載の不死化ヒトメサンギウム細胞。
- SV40T抗原遺伝子が温度感受性変異型遺伝子SV40T tsA58である、請求項3記載の不死化ヒトメサンギウム細胞。
- 寄託番号FERM BP-10478として寄託されている、請求項4記載の不死化ヒトメサンギウム細胞。
- ヒト初代メサンギウム細胞にSV40T抗原遺伝子とhTERT遺伝子とを導入することを含む、不死化ヒトメサンギウム細胞の製造方法。
- 請求項2−5のいずれかに記載の不死化ヒトメサンギウム細胞をSV40抗原発現の非許容条件下で培養することにより得られる分化型ヒトメサンギウム細胞。
- 分化型ヒトメサンギウム細胞がαSMA又はCOL4を発現する、請求項7記載の分化型ヒトメサンギウム細胞。
- 請求項2−5のいずれかに記載の不死化ヒトメサンギウム細胞をSV40抗原発現の非許容条件下で培養することを含む、分化型ヒトメサンギウム細胞の製造方法。
- 被検物質がヒトメサンギウム細胞の機能を調節する能力を検定する方法であって、被検物質の存在下で請求項1−5のいずれかに記載の不死化ヒトメサンギウム細胞株又は請求項7又は8に記載の分化型ヒトメサンギウム細胞を培養し、そして該細胞におけるマーカータンパク質の活性及び/又は発現及び/又は分泌の程度を測定する工程を含む方法。
- 不死化ヒトメサンギウム細胞株又は分化型ヒトメサンギウム細胞をヒトメサンギウム細胞の刺激物質の存在下及び/又は非存在下で培養することを含む、請求項10記載の方法。
- ヒトメサンギウム細胞の刺激物質が、TGF-β、BMPファミリータンパク質、AGEs、LDL及び酸化型LDLからなる群より選択される物質である、請求項11記載の方法。
- マーカータンパク質がCOL4、FN、PAI-1、αSMA、Id1及びCbfa1からなる群より選択される物質である、請求項10−12のいずれかに記載の方法。
- 請求項10−12のいずれかに記載の方法により得られる、ヒトメサンギウム細胞の機能調節物質。
- 請求項14記載の機能調節物質を有効成分として含有する、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、アルポート症候群、糸球体腎炎、ループス腎炎、巣状糸球体硬化症、慢性糸球体腎炎、急性進行性腎炎、ネフローゼ症候群、膜性腎症、半月体形成性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎の治療剤。
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