JP3953399B2 - 不死化骨髄間葉系幹細胞 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨髄間葉系幹細胞に細胞増殖因子遺伝子を導入することによって得られる不死化骨髄間葉系幹細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
様々な研究者により、骨髄間葉系幹細胞が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、心筋細胞へと分化するということが報告されている。したがって、骨髄間葉系幹細胞を、その多分化能を維持したままインビトロで大量に増殖させることができれば、得られた骨髄間葉系幹細胞は再生医療において非常に有用な手段となることが期待されている。
【０００３】
従来、骨髄間葉系幹細胞以外の例として、ＢＳＭＣ、ＭＤＨＦまたはＲＫＣに癌遺伝子を導入してそれらの細胞を不死化することにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出できることが知られている（たとえば、非特許文献１参照）。この方法を用いればそれらの不死化細胞を大量に得ることは可能であったが、そのような不死化細胞株は、生体内に注入することにより、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性があるという問題があった。したがって、このような問題を解決し得る安全性の高い骨髄間葉系幹細胞を、大量に得ることは困難であった。
【０００４】
【非特許文献１】
ケイ エイ ウェスタマン（K. A. Westerman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.93巻、8971頁、1996年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、無限に増殖可能であり、かつ癌化の可能性を回避するための手段を有する不死化骨髄間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子を骨髄間葉系幹細胞に導入することにより、癌化の危険性を回避するための手段を有し、かつ、大量増殖が可能な骨髄間葉系幹細胞を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、骨髄間葉系幹細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られる不死化骨髄間葉系幹細胞を提供する。
【０００８】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、骨髄間葉系幹細胞はヒトの骨髄間葉系幹細胞であることが好ましい。
【０００９】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、細胞増殖因子遺伝子はｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子であることが好ましい。
【００１０】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、一対の部位特異的組換え配列はＬｏｘＰ配列であることが好ましい。
【００１１】
さらに、該細胞増殖因子遺伝子はレトロウイルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本明細書に記載される「骨髄間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞または骨髄間質細胞への分化が可能な前駆細胞である。骨髄間葉系幹細胞を同定する手段の一例としては、たとえば表面抗原試験があり、該試験において、骨髄間葉系幹細胞はＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ２９およびＣＤ４４が陽性、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５が陰性である。
【００１３】
骨髄間葉系幹細胞は、たとえば豚、猿、類人猿、ヒトの骨髄間葉系幹細胞などであり、好ましくはヒトの骨髄間葉系幹細胞であり、最も好ましくはヒトの成人骨髄間葉系幹細胞である。ヒトの胎児骨髄間葉系幹細胞に関しても応用可能である。
【００１４】
本発明に使用される細胞増殖因子遺伝子は正常細胞由来の遺伝子であり、哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入されることにより該骨髄間葉系幹細胞を不死化できるものである。該細胞増殖因子遺伝子の産物は、増殖因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキナーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと結合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナーゼ活性を有するもの、核内に存在しＤＮＡに結合能を有するものであり、正常細胞の細胞増殖、情報伝達に基本的に関与するものである。該細胞増殖因子遺伝子としては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子などを使用することができる。この中でも、ｈＴＥＲＴ遺伝子が好ましい。なぜなら、ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子であるためである。
【００１５】
本発明において、細胞増殖因子遺伝子を骨髄間葉系幹細胞に導入するためにレトロウイルスベクターが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞に対する外来遺伝子導入手段として利用される。レトロウイルスベクターによって導入された遺伝子は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるために、その遺伝子は確実に嬢細胞に受け継がれ、長期の安定した遺伝子発現が可能である。
【００１６】
レトロウイルスベクターの導入方法としては、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、直接穿刺による投与、インビトロでは培養細胞への直接播種による方法などがあり、好ましくは直接穿刺による投与、培養細胞への直接播種による方法である。
【００１７】
レトロウイルスベクターを培養細胞に直接播種して導入する方法としては、本発明の目的を達成するものであればどのような方法でもよい。たとえば、レトロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清を、別途培養中の骨髄間葉系幹細胞に播種することにより導入を達成することもできる。各細胞の培養条件および播種濃度など種々の条件は、当該技術分野における周知の方法にしたがって設定することができる。
【００１８】
また、培養細胞への播種回数は、細胞への影響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらのことから、本発明では、培養細胞に４時間感染を１日に２回、計３日間実施する方法が最も好ましい。
【００１９】
さらに本発明で用いられる細胞増殖因子遺伝子は、骨髄間葉系幹細胞に導入されたプロウイルス内で後に切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配列に挟まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であり、この特異的な配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列である。部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列やＦＲＴ配列などがあり、中でもＬｏｘＰ配列が好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独により相同組換えを行うための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４塩基からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に一対のＬｏｘＰ配列が同方向で存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列は切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。
【００２０】
さらに本発明において、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入する際には、常に同時にＧＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位特異的組換え配列間にコードされることが好ましい。「部位特異的組換え配列間」とは、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた位置関係を示す。該ＧＦＰ遺伝子は、レトロウイルスベクターが感染し、プロウイルスがゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞をＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorter）にて選択的に同定するために用いられる。よって、プロウイルスがゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞を選択的に同定できれば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子を用いてもよい。
【００２１】
該薬剤耐性遺伝子の例としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、とくにこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書に記載される「不死化骨髄間葉系幹細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常骨髄間葉系幹細胞に近い形態を呈し、骨髄間葉系幹細胞の多分化能を維持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴を有する細胞を意味する。
【００２３】
該不死化骨髄間葉系幹細胞の培養は、増殖速度を速める条件で実施するのが好ましい。しかしながら、使用する培養容器としては、取り扱いが容易であるという点からコラーゲンなどによる培養容器表面の特別なコーティングを有していない容器が好ましい。該不死化骨髄間葉系幹細胞の倍化時間は２４〜７２時間であり、好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４〜３６時間である。該不死化骨髄間葉系幹細胞の培地としては、たとえば間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社製）などの間葉系幹細胞培養培地が好ましく、ＣＳ−Ｃ培地などの無血清培地を使用するのがさらに好ましい。
【００２４】
本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞は、一対の部位特異的組換え配列を有する可逆的な不死化細胞である。すなわち、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞から、導入された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え酵素により除去することができる。したがって、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞を用いれば、生体内に移植する前に細胞増殖因子遺伝子を切り出すことができる。あるいは、不死化骨髄間葉系幹細胞の分化を誘導した後に、細胞から細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともできる。細胞増殖因子遺伝子を切り出すことによって得られた骨髄間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞から分化した細胞は、癌化の危険性がなく安全であるため、再生医療において非常に有効である。
【００２５】
前記部位特異的組換え酵素は、部位特異的組換え配列を特異的に認識し、切断、結合という相同組換えを単独で行う酵素である。部位特異的組換え酵素としては、たとえばＣｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素などがあり、Ｃｒｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換え酵素はＬｏｘＰ配列を特異的に認識する組換え酵素である。該部位特異的組換え酵素はアデノウイルスによってコードされるのが好ましい。
【００２６】
以下、実施例、製造例および試験例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
製造例１
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７の製造
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７（図１参照）は、従来の方法（ケイ エイ ウェスタマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、８９７１頁、１９９６年）にしたがい、具体的には以下の方法にて製造した。
１． ＬＸＳＮレトロウイルスベクターをＥｃｏＲ１とＲｓｒ２で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏｔ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ１、Ｓａｌ１、Ｓｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に挿入した。ｈＴＥＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位に挿入した。
２． ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰおよびＢ型肝炎転写後調節因子（ティー エス エン（T. S. Yen）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９５年）を含有するカセットベクターを、以下のようにして製造した。
ｐＵＣ１９をＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ３で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲＶ、Ｎｏｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。ついで、ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（Novagen）製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結され、一方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌａ１部位である断片を製造し、この断片をバックボーンベクターのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入した。
３． 前記１で製造したベクターのＳａｌ１およびＣｌａ１部位に、前記２で製造したカセットベクター由来のＸｈｏ１およびＣｌａ１断片を挿入し、ＳＳＲ＃１９７ベクターを完成させた。
【００２８】
実施例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株の樹立
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生細胞であるＣｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５のフラスコに播種密度１×１０4細胞／ｃｍ2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約９０％となった時点で、ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ培養液１５ｍｌで培養液の交換を行なった。
【００２９】
培養液交換２４時間後に、レトロウイルスベクターを含有するＣｒｉｐ細胞上清１５ｍｌを０．４５μｍのフィルターで濾過し、得られた液に１２μｇ／ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sigma）社製）を加えた。これを、別途培養中の継代数１の成人ヒト骨髄間葉系幹細胞（製品番号ＰＴ−２５０１、三光純薬株式会社製）１×１０6細胞個の培養液と交換し、４時間感染させた。同様な感染処置を１日に２回、計３日間施行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な無血清のＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて骨髄間葉系幹細胞を培養した。
【００３０】
最終感染後２日後に細胞をトリプシンにて処理し、回収した。ＦＡＣＳ Calibur（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson）製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を回収した。９６穴プレートおよび間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社製）を用いた限界希釈法（１穴１／２個の細胞となるように播種）にて不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株を樹立した。該不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞は蛍光顕微鏡で確認された（図２および図３参照）。該細胞株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７）。
【００３１】
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７は、親細胞に類似した形態を呈し、かつ、増殖が停止する危機（クライシス）もなく不死化し、無血清のＣＳ−Ｃ培地において単層に増殖し、約４８時間でその数が倍加した。
【００３２】
試験例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖能の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の増殖能を測定するために、周知の方法にて、ＭＴＴアッセイを行った。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００３３】
９６穴プレートに、２０００細胞個／穴となるようにＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７またはコントロール細胞を播種した。培養液としては、ＣＳ−Ｃ培地を用いた。播種から１日、３日、５日および７日後、２０μｇ／ｍｌの５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイドを各穴の培養液に１０μｌ添加し、４時間培養した。ついで、１５０μｌのイソプロパノールを各穴の培地に添加し、１０分間反応させた。そののち、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＥＩＡリーダー（バイオラッド社（Bio-Rad）製、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、５７０μｍと６３０μｍの吸光度の比率から細胞増殖曲線（図４）を作成した。
【００３４】
本試験の結果、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７は、ＰＤＬ（集団倍化レベル（population doubling level））１５０を超えても増殖することを確認した。一方、コントロール細胞は、ＰＤＬ２５前後で増殖が停止する複製不能細胞老化（replicative senescence）に陥った。
【００３５】
試験例２
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７のｈＴＥＲＴ遺伝子の発現
実施例１で得られたＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。コントロール細胞としては、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。これらの細胞における遺伝子発現の陽性コントロールとして、β−アクチン遺伝子の発現を調べた。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バイオテックス社製、アメリカ合衆国テキサス州フレンズウッド）を用い、そのプロトコルにしたがってＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７からＲＮＡを抽出し、２μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
【００３７】
得られた２μｇの逆転写産物を、プライマー濃度各２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄキット（アプライドバイオシステムズ社製、アメリカ合衆国カルフォルニア州）を用い、そのプロトコルにしたがってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、最初に９５℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイクルとしてこれを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間インキュベーションすることで実施した。ｈＴＥＲＴ遺伝子またはβ−アクチン遺伝子に対するプライマーには下記のものを使用した。
ｈＴＥＲＴ遺伝子
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧ
β−アクチン遺伝子
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５において、レーン１はコントロール細胞、レーン２はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７においてはｈＴＥＲＴ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の発現が認められた。一方、コントロール細胞においては、β−アクチン遺伝子の発現のみが認められた。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が適切に発現していることを示す。
【００３９】
試験例３
テロメラーゼ活性の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におけるｈＴＥＲＴのテロメラーゼ活性を調べるために、ＴＲＡＰアッセイを行った。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００４０】
ＴＲＡＰアッセイは、ＴＲＡＰ−ｅａｓｅテロメラーゼ検出キット（オンコー社（Oncor）製、ＭＤ、ＵＳＡ）を用い、そのプロトコルにしたがって実施した。その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７では陽性、コントロール細胞では陰性であった。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が発現した後、ｈＴＥＲＴタンパク質が適切な活性を有していることを示す。
【００４１】
試験例４
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プレップキット骨芽細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ−３００２、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４２】
つぎに、従来の方法（「新染色法のすべて」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたがってコッサ染色を実施した。その結果、細胞内のカルシウムの沈着が存在した領域が黒褐色で点状に染色されたことから、骨芽細胞への分化を確認した（図６）。図６中、ａは、黒褐色で点状に染色された、カルシウムの沈着が存在した領域を示す。
【００４３】
試験例５
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プレップキット脂肪細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ−３００４、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４４】
つぎに、従来の方法（「新染色法のすべて」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたがってオイル赤染色を実施した。その結果、細胞内の脂肪滴が赤に染色されたことから、脂肪細胞への分化を確認した（図７）。図７中、ｂは赤く染色された脂肪滴を示す。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、多分化能を維持したまま不死化した骨髄間葉系幹細胞株を得ることができる。本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞株は、癌遺伝子ではなく正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子により不死化しているため、癌化の危険性を回避することができる。そのうえ、該細胞株から導入した細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともできるため、安全性が非常に高い。すなわち、細胞増殖遺伝子を切り出して得られる細胞は、再生医療において極めて有用である。
【００４６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ＬｏｘＰ配列
配列番号２：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号３：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号４：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号５：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
【００４７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７を示す図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケージングシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴはｈＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長い末端反復配列、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位をそれぞれ示す。
【図２】図２はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の位相差顕微鏡像である。
【図３】図３は図２に示したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の蛍光顕微鏡像である。
【図４】図４はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコントロール細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図５】図５はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコントロール細胞を用いて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】図６はコッサ染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の一部を示す図である。
【図７】図７はオイル赤染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の一部を示す図である。
【符号の説明】
ａ カルシウムの沈着が存在した領域
ｂ 脂肪滴
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨髄間葉系幹細胞に細胞増殖因子遺伝子を導入することによって得られる不死化骨髄間葉系幹細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
様々な研究者により、骨髄間葉系幹細胞が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、心筋細胞へと分化するということが報告されている。したがって、骨髄間葉系幹細胞を、その多分化能を維持したままインビトロで大量に増殖させることができれば、得られた骨髄間葉系幹細胞は再生医療において非常に有用な手段となることが期待されている。
【０００３】
従来、骨髄間葉系幹細胞以外の例として、ＢＳＭＣ、ＭＤＨＦまたはＲＫＣに癌遺伝子を導入してそれらの細胞を不死化することにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出できることが知られている（たとえば、非特許文献１参照）。この方法を用いればそれらの不死化細胞を大量に得ることは可能であったが、そのような不死化細胞株は、生体内に注入することにより、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性があるという問題があった。したがって、このような問題を解決し得る安全性の高い骨髄間葉系幹細胞を、大量に得ることは困難であった。
【０００４】
【非特許文献１】
ケイ エイ ウェスタマン（K. A. Westerman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.93巻、8971頁、1996年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、無限に増殖可能であり、かつ癌化の可能性を回避するための手段を有する不死化骨髄間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子を骨髄間葉系幹細胞に導入することにより、癌化の危険性を回避するための手段を有し、かつ、大量増殖が可能な骨髄間葉系幹細胞を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、骨髄間葉系幹細胞に一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入することにより得られる不死化骨髄間葉系幹細胞を提供する。
【０００８】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、骨髄間葉系幹細胞はヒトの骨髄間葉系幹細胞であることが好ましい。
【０００９】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、細胞増殖因子遺伝子はｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子であることが好ましい。
【００１０】
前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、一対の部位特異的組換え配列はＬｏｘＰ配列であることが好ましい。
【００１１】
さらに、該細胞増殖因子遺伝子はレトロウイルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本明細書に記載される「骨髄間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞または骨髄間質細胞への分化が可能な前駆細胞である。骨髄間葉系幹細胞を同定する手段の一例としては、たとえば表面抗原試験があり、該試験において、骨髄間葉系幹細胞はＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ２９およびＣＤ４４が陽性、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５が陰性である。
【００１３】
骨髄間葉系幹細胞は、たとえば豚、猿、類人猿、ヒトの骨髄間葉系幹細胞などであり、好ましくはヒトの骨髄間葉系幹細胞であり、最も好ましくはヒトの成人骨髄間葉系幹細胞である。ヒトの胎児骨髄間葉系幹細胞に関しても応用可能である。
【００１４】
本発明に使用される細胞増殖因子遺伝子は正常細胞由来の遺伝子であり、哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入されることにより該骨髄間葉系幹細胞を不死化できるものである。該細胞増殖因子遺伝子の産物は、増殖因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキナーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと結合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナーゼ活性を有するもの、核内に存在しＤＮＡに結合能を有するものであり、正常細胞の細胞増殖、情報伝達に基本的に関与するものである。該細胞増殖因子遺伝子としては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子などを使用することができる。この中でも、ｈＴＥＲＴ遺伝子が好ましい。なぜなら、ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子であるためである。
【００１５】
本発明において、細胞増殖因子遺伝子を骨髄間葉系幹細胞に導入するためにレトロウイルスベクターが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞に対する外来遺伝子導入手段として利用される。レトロウイルスベクターによって導入された遺伝子は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるために、その遺伝子は確実に嬢細胞に受け継がれ、長期の安定した遺伝子発現が可能である。
【００１６】
レトロウイルスベクターの導入方法としては、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、直接穿刺による投与、インビトロでは培養細胞への直接播種による方法などがあり、好ましくは直接穿刺による投与、培養細胞への直接播種による方法である。
【００１７】
レトロウイルスベクターを培養細胞に直接播種して導入する方法としては、本発明の目的を達成するものであればどのような方法でもよい。たとえば、レトロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清を、別途培養中の骨髄間葉系幹細胞に播種することにより導入を達成することもできる。各細胞の培養条件および播種濃度など種々の条件は、当該技術分野における周知の方法にしたがって設定することができる。
【００１８】
また、培養細胞への播種回数は、細胞への影響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらのことから、本発明では、培養細胞に４時間感染を１日に２回、計３日間実施する方法が最も好ましい。
【００１９】
さらに本発明で用いられる細胞増殖因子遺伝子は、骨髄間葉系幹細胞に導入されたプロウイルス内で後に切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配列に挟まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であり、この特異的な配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列である。部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列やＦＲＴ配列などがあり、中でもＬｏｘＰ配列が好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独により相同組換えを行うための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４塩基からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に一対のＬｏｘＰ配列が同方向で存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列は切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。
【００２０】
さらに本発明において、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入する際には、常に同時にＧＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位特異的組換え配列間にコードされることが好ましい。「部位特異的組換え配列間」とは、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた位置関係を示す。該ＧＦＰ遺伝子は、レトロウイルスベクターが感染し、プロウイルスがゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞をＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorter）にて選択的に同定するために用いられる。よって、プロウイルスがゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞を選択的に同定できれば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子を用いてもよい。
【００２１】
該薬剤耐性遺伝子の例としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、とくにこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書に記載される「不死化骨髄間葉系幹細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常骨髄間葉系幹細胞に近い形態を呈し、骨髄間葉系幹細胞の多分化能を維持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴を有する細胞を意味する。
【００２３】
該不死化骨髄間葉系幹細胞の培養は、増殖速度を速める条件で実施するのが好ましい。しかしながら、使用する培養容器としては、取り扱いが容易であるという点からコラーゲンなどによる培養容器表面の特別なコーティングを有していない容器が好ましい。該不死化骨髄間葉系幹細胞の倍化時間は２４〜７２時間であり、好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４〜３６時間である。該不死化骨髄間葉系幹細胞の培地としては、たとえば間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社製）などの間葉系幹細胞培養培地が好ましく、ＣＳ−Ｃ培地などの無血清培地を使用するのがさらに好ましい。
【００２４】
本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞は、一対の部位特異的組換え配列を有する可逆的な不死化細胞である。すなわち、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞から、導入された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え酵素により除去することができる。したがって、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞を用いれば、生体内に移植する前に細胞増殖因子遺伝子を切り出すことができる。あるいは、不死化骨髄間葉系幹細胞の分化を誘導した後に、細胞から細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともできる。細胞増殖因子遺伝子を切り出すことによって得られた骨髄間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞から分化した細胞は、癌化の危険性がなく安全であるため、再生医療において非常に有効である。
【００２５】
前記部位特異的組換え酵素は、部位特異的組換え配列を特異的に認識し、切断、結合という相同組換えを単独で行う酵素である。部位特異的組換え酵素としては、たとえばＣｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素などがあり、Ｃｒｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換え酵素はＬｏｘＰ配列を特異的に認識する組換え酵素である。該部位特異的組換え酵素はアデノウイルスによってコードされるのが好ましい。
【００２６】
以下、実施例、製造例および試験例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
製造例１
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７の製造
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７（図１参照）は、従来の方法（ケイ エイ ウェスタマンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、８９７１頁、１９９６年）にしたがい、具体的には以下の方法にて製造した。
１． ＬＸＳＮレトロウイルスベクターをＥｃｏＲ１とＲｓｒ２で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏｔ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ１、Ｓａｌ１、Ｓｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に挿入した。ｈＴＥＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位に挿入した。
２． ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰおよびＢ型肝炎転写後調節因子（ティー エス エン（T. S. Yen）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９５年）を含有するカセットベクターを、以下のようにして製造した。
ｐＵＣ１９をＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ３で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲＶ、Ｎｏｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。ついで、ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（Novagen）製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結され、一方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌａ１部位である断片を製造し、この断片をバックボーンベクターのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入した。
３． 前記１で製造したベクターのＳａｌ１およびＣｌａ１部位に、前記２で製造したカセットベクター由来のＸｈｏ１およびＣｌａ１断片を挿入し、ＳＳＲ＃１９７ベクターを完成させた。
【００２８】
実施例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株の樹立
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生細胞であるＣｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５のフラスコに播種密度１×１０4細胞／ｃｍ2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約９０％となった時点で、ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ培養液１５ｍｌで培養液の交換を行なった。
【００２９】
培養液交換２４時間後に、レトロウイルスベクターを含有するＣｒｉｐ細胞上清１５ｍｌを０．４５μｍのフィルターで濾過し、得られた液に１２μｇ／ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sigma）社製）を加えた。これを、別途培養中の継代数１の成人ヒト骨髄間葉系幹細胞（製品番号ＰＴ−２５０１、三光純薬株式会社製）１×１０6細胞個の培養液と交換し、４時間感染させた。同様な感染処置を１日に２回、計３日間施行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な無血清のＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて骨髄間葉系幹細胞を培養した。
【００３０】
最終感染後２日後に細胞をトリプシンにて処理し、回収した。ＦＡＣＳ Calibur（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson）製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を回収した。９６穴プレートおよび間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社製）を用いた限界希釈法（１穴１／２個の細胞となるように播種）にて不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株を樹立した。該不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞は蛍光顕微鏡で確認された（図２および図３参照）。該細胞株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７）。
【００３１】
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７は、親細胞に類似した形態を呈し、かつ、増殖が停止する危機（クライシス）もなく不死化し、無血清のＣＳ−Ｃ培地において単層に増殖し、約４８時間でその数が倍加した。
【００３２】
試験例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖能の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の増殖能を測定するために、周知の方法にて、ＭＴＴアッセイを行った。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００３３】
９６穴プレートに、２０００細胞個／穴となるようにＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７またはコントロール細胞を播種した。培養液としては、ＣＳ−Ｃ培地を用いた。播種から１日、３日、５日および７日後、２０μｇ／ｍｌの５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイドを各穴の培養液に１０μｌ添加し、４時間培養した。ついで、１５０μｌのイソプロパノールを各穴の培地に添加し、１０分間反応させた。そののち、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＥＩＡリーダー（バイオラッド社（Bio-Rad）製、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、５７０μｍと６３０μｍの吸光度の比率から細胞増殖曲線（図４）を作成した。
【００３４】
本試験の結果、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７は、ＰＤＬ（集団倍化レベル（population doubling level））１５０を超えても増殖することを確認した。一方、コントロール細胞は、ＰＤＬ２５前後で増殖が停止する複製不能細胞老化（replicative senescence）に陥った。
【００３５】
試験例２
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７のｈＴＥＲＴ遺伝子の発現
実施例１で得られたＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。コントロール細胞としては、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。これらの細胞における遺伝子発現の陽性コントロールとして、β−アクチン遺伝子の発現を調べた。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バイオテックス社製、アメリカ合衆国テキサス州フレンズウッド）を用い、そのプロトコルにしたがってＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７からＲＮＡを抽出し、２μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
【００３７】
得られた２μｇの逆転写産物を、プライマー濃度各２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄキット（アプライドバイオシステムズ社製、アメリカ合衆国カルフォルニア州）を用い、そのプロトコルにしたがってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、最初に９５℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイクルとしてこれを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間インキュベーションすることで実施した。ｈＴＥＲＴ遺伝子またはβ−アクチン遺伝子に対するプライマーには下記のものを使用した。
ｈＴＥＲＴ遺伝子
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧ
β−アクチン遺伝子
５′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ
３′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５において、レーン１はコントロール細胞、レーン２はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７においてはｈＴＥＲＴ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の発現が認められた。一方、コントロール細胞においては、β−アクチン遺伝子の発現のみが認められた。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が適切に発現していることを示す。
【００３９】
試験例３
テロメラーゼ活性の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におけるｈＴＥＲＴのテロメラーゼ活性を調べるために、ＴＲＡＰアッセイを行った。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００４０】
ＴＲＡＰアッセイは、ＴＲＡＰ−ｅａｓｅテロメラーゼ検出キット（オンコー社（Oncor）製、ＭＤ、ＵＳＡ）を用い、そのプロトコルにしたがって実施した。その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７では陽性、コントロール細胞では陰性であった。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が発現した後、ｈＴＥＲＴタンパク質が適切な活性を有していることを示す。
【００４１】
試験例４
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プレップキット骨芽細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ−３００２、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４２】
つぎに、従来の方法（「新染色法のすべて」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたがってコッサ染色を実施した。その結果、細胞内のカルシウムの沈着が存在した領域が黒褐色で点状に染色されたことから、骨芽細胞への分化を確認した（図６）。図６中、ａは、黒褐色で点状に染色された、カルシウムの沈着が存在した領域を示す。
【００４３】
試験例５
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プレップキット脂肪細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ−３００４、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４４】
つぎに、従来の方法（「新染色法のすべて」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたがってオイル赤染色を実施した。その結果、細胞内の脂肪滴が赤に染色されたことから、脂肪細胞への分化を確認した（図７）。図７中、ｂは赤く染色された脂肪滴を示す。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、多分化能を維持したまま不死化した骨髄間葉系幹細胞株を得ることができる。本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞株は、癌遺伝子ではなく正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子により不死化しているため、癌化の危険性を回避することができる。そのうえ、該細胞株から導入した細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともできるため、安全性が非常に高い。すなわち、細胞増殖遺伝子を切り出して得られる細胞は、再生医療において極めて有用である。
【００４６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ＬｏｘＰ配列
配列番号２：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号３：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
配列番号４：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー
配列番号５：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
【００４７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７を示す図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケージングシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴはｈＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長い末端反復配列、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位をそれぞれ示す。
【図２】図２はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の位相差顕微鏡像である。
【図３】図３は図２に示したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の蛍光顕微鏡像である。
【図４】図４はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコントロール細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図５】図５はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコントロール細胞を用いて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】図６はコッサ染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の一部を示す図である。
【図７】図７はオイル赤染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の一部を示す図である。
【符号の説明】
ａ カルシウムの沈着が存在した領域
ｂ 脂肪滴
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- 不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７。
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