JP2003174870A - 不死化骨髄間葉系幹細胞 - Google Patents
不死化骨髄間葉系幹細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 無限に増殖可能であり、かつ癌化の可能性を
回避するための手段を有する不死化骨髄間葉系幹細胞を
提供するを提供すること。 【解決手段】 骨髄間葉系幹細胞に一対の部位特異的組
換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入すること
により得られる不死化骨髄間葉系幹細胞。
回避するための手段を有する不死化骨髄間葉系幹細胞を
提供するを提供すること。 【解決手段】 骨髄間葉系幹細胞に一対の部位特異的組
換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入すること
により得られる不死化骨髄間葉系幹細胞。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄間葉系幹細胞
に細胞増殖因子遺伝子を導入することによって得られる
不死化骨髄間葉系幹細胞に関する。
に細胞増殖因子遺伝子を導入することによって得られる
不死化骨髄間葉系幹細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】様々な研究者により、骨髄間葉系幹細胞
が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、心筋
細胞へと分化するということが報告されている。したが
って、骨髄間葉系幹細胞を、その多分化能を維持したま
まインビトロで大量に増殖させることができれば、得ら
れた骨髄間葉系幹細胞は再生医療において非常に有用な
手段となることが期待されている。
が骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、心筋
細胞へと分化するということが報告されている。したが
って、骨髄間葉系幹細胞を、その多分化能を維持したま
まインビトロで大量に増殖させることができれば、得ら
れた骨髄間葉系幹細胞は再生医療において非常に有用な
手段となることが期待されている。
【０００３】従来、骨髄間葉系幹細胞以外の例として、
ＢＳＭＣ、ＭＤＨＦまたはＲＫＣに癌遺伝子を導入して
それらの細胞を不死化することにより、適度な分化機能
を保持した細胞株を産出できることが知られている（た
とえば、非特許文献１参照）。この方法を用いればそれ
らの不死化細胞を大量に得ることは可能であったが、そ
のような不死化細胞株は、生体内に注入することによ
り、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性があると
いう問題があった。したがって、このような問題を解決
し得る安全性の高い骨髄間葉系幹細胞を、大量に得るこ
とは困難であった。
ＢＳＭＣ、ＭＤＨＦまたはＲＫＣに癌遺伝子を導入して
それらの細胞を不死化することにより、適度な分化機能
を保持した細胞株を産出できることが知られている（た
とえば、非特許文献１参照）。この方法を用いればそれ
らの不死化細胞を大量に得ることは可能であったが、そ
のような不死化細胞株は、生体内に注入することによ
り、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性があると
いう問題があった。したがって、このような問題を解決
し得る安全性の高い骨髄間葉系幹細胞を、大量に得るこ
とは困難であった。
【０００４】
【非特許文献１】ケイ エイ ウェスタマン（K. A. We
sterman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.93巻、8971
頁、1996年
sterman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.93巻、8971
頁、1996年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、無限に増殖
可能であり、かつ癌化の可能性を回避するための手段を
有する不死化骨髄間葉系幹細胞を提供することを目的と
する。
可能であり、かつ癌化の可能性を回避するための手段を
有する不死化骨髄間葉系幹細胞を提供することを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記実情
に鑑み鋭意検討を重ねた結果、一対の部位特異的組換え
配列に挟まれた正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子を骨
髄間葉系幹細胞に導入することにより、癌化の危険性を
回避するための手段を有し、かつ、大量増殖が可能な骨
髄間葉系幹細胞を得ることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。
に鑑み鋭意検討を重ねた結果、一対の部位特異的組換え
配列に挟まれた正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子を骨
髄間葉系幹細胞に導入することにより、癌化の危険性を
回避するための手段を有し、かつ、大量増殖が可能な骨
髄間葉系幹細胞を得ることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、骨髄間葉系幹細胞に
一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺
伝子を導入することにより得られる不死化骨髄間葉系幹
細胞を提供する。
一対の部位特異的組換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺
伝子を導入することにより得られる不死化骨髄間葉系幹
細胞を提供する。
【０００８】前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、骨
髄間葉系幹細胞はヒトの骨髄間葉系幹細胞であることが
好ましい。
髄間葉系幹細胞はヒトの骨髄間葉系幹細胞であることが
好ましい。
【０００９】前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、細
胞増殖因子遺伝子はｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転
写酵素）遺伝子であることが好ましい。
胞増殖因子遺伝子はｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転
写酵素）遺伝子であることが好ましい。
【００１０】前記不死化骨髄間葉系幹細胞において、一
対の部位特異的組換え配列はＬｏｘＰ配列であることが
好ましい。
対の部位特異的組換え配列はＬｏｘＰ配列であることが
好ましい。
【００１１】さらに、該細胞増殖因子遺伝子はレトロウ
イルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
イルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】本明細書に記載される「骨髄間葉
系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨
細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞または骨髄間質細胞へ
の分化が可能な前駆細胞である。骨髄間葉系幹細胞を同
定する手段の一例としては、たとえば表面抗原試験があ
り、該試験において、骨髄間葉系幹細胞はＳＨ２、ＳＨ
３、ＣＤ２９およびＣＤ４４が陽性、ＣＤ１４、ＣＤ３
４およびＣＤ４５が陰性である。
系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨
細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞または骨髄間質細胞へ
の分化が可能な前駆細胞である。骨髄間葉系幹細胞を同
定する手段の一例としては、たとえば表面抗原試験があ
り、該試験において、骨髄間葉系幹細胞はＳＨ２、ＳＨ
３、ＣＤ２９およびＣＤ４４が陽性、ＣＤ１４、ＣＤ３
４およびＣＤ４５が陰性である。
【００１３】骨髄間葉系幹細胞は、たとえば豚、猿、類
人猿、ヒトの骨髄間葉系幹細胞などであり、好ましくは
ヒトの骨髄間葉系幹細胞であり、最も好ましくはヒトの
成人骨髄間葉系幹細胞である。ヒトの胎児骨髄間葉系幹
細胞に関しても応用可能である。
人猿、ヒトの骨髄間葉系幹細胞などであり、好ましくは
ヒトの骨髄間葉系幹細胞であり、最も好ましくはヒトの
成人骨髄間葉系幹細胞である。ヒトの胎児骨髄間葉系幹
細胞に関しても応用可能である。
【００１４】本発明に使用される細胞増殖因子遺伝子は
正常細胞由来の遺伝子であり、哺乳類の骨髄間葉系幹細
胞に導入されることにより該骨髄間葉系幹細胞を不死化
できるものである。該細胞増殖因子遺伝子の産物は、増
殖因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキ
ナーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと
結合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナ
ーゼ活性を有するもの、核内に存在しＤＮＡに結合能を
有するものであり、正常細胞の細胞増殖、情報伝達に基
本的に関与するものである。該細胞増殖因子遺伝子とし
ては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子な
どを使用することができる。この中でも、ｈＴＥＲＴ遺
伝子が好ましい。なぜなら、ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血
液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり再
生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の
抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球で
は自然と発現増強している遺伝子であるためである。
正常細胞由来の遺伝子であり、哺乳類の骨髄間葉系幹細
胞に導入されることにより該骨髄間葉系幹細胞を不死化
できるものである。該細胞増殖因子遺伝子の産物は、増
殖因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキ
ナーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと
結合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナ
ーゼ活性を有するもの、核内に存在しＤＮＡに結合能を
有するものであり、正常細胞の細胞増殖、情報伝達に基
本的に関与するものである。該細胞増殖因子遺伝子とし
ては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子な
どを使用することができる。この中でも、ｈＴＥＲＴ遺
伝子が好ましい。なぜなら、ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血
液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり再
生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の
抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球で
は自然と発現増強している遺伝子であるためである。
【００１５】本発明において、細胞増殖因子遺伝子を骨
髄間葉系幹細胞に導入するためにレトロウイルスベクタ
ーが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞
に対する外来遺伝子導入手段として利用される。レトロ
ウイルスベクターによって導入された遺伝子は宿主細胞
の染色体ＤＮＡに組み込まれるために、その遺伝子は確
実に嬢細胞に受け継がれ、長期の安定した遺伝子発現が
可能である。
髄間葉系幹細胞に導入するためにレトロウイルスベクタ
ーが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞
に対する外来遺伝子導入手段として利用される。レトロ
ウイルスベクターによって導入された遺伝子は宿主細胞
の染色体ＤＮＡに組み込まれるために、その遺伝子は確
実に嬢細胞に受け継がれ、長期の安定した遺伝子発現が
可能である。
【００１６】レトロウイルスベクターの導入方法として
は、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、直接穿刺に
よる投与、インビトロでは培養細胞への直接播種による
方法などがあり、好ましくは直接穿刺による投与、培養
細胞への直接播種による方法である。
は、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、直接穿刺に
よる投与、インビトロでは培養細胞への直接播種による
方法などがあり、好ましくは直接穿刺による投与、培養
細胞への直接播種による方法である。
【００１７】レトロウイルスベクターを培養細胞に直接
播種して導入する方法としては、本発明の目的を達成す
るものであればどのような方法でもよい。たとえば、レ
トロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清
を、別途培養中の骨髄間葉系幹細胞に播種することによ
り導入を達成することもできる。各細胞の培養条件およ
び播種濃度など種々の条件は、当該技術分野における周
知の方法にしたがって設定することができる。
播種して導入する方法としては、本発明の目的を達成す
るものであればどのような方法でもよい。たとえば、レ
トロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清
を、別途培養中の骨髄間葉系幹細胞に播種することによ
り導入を達成することもできる。各細胞の培養条件およ
び播種濃度など種々の条件は、当該技術分野における周
知の方法にしたがって設定することができる。
【００１８】また、培養細胞への播種回数は、細胞への
影響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが
好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮
すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これら
のことから、本発明では、培養細胞に４時間感染を１日
に２回、計３日間実施する方法が最も好ましい。
影響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが
好ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮
すると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これら
のことから、本発明では、培養細胞に４時間感染を１日
に２回、計３日間実施する方法が最も好ましい。
【００１９】さらに本発明で用いられる細胞増殖因子遺
伝子は、骨髄間葉系幹細胞に導入されたプロウイルス内
で後に切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配
列に挟まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部
位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配
列であり、この特異的な配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の
交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列
である。部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列
やＦＲＴ配列などがあり、中でもＬｏｘＰ配列が好まし
い。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独により相同
組換えを行うための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣ
ＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４塩基
からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に一対のＬｏ
ｘＰ配列が同方向で存在する場合は、その間に挟まれた
ＤＮＡ配列は切り出されて環状分子となる（切り出し反
応）。
伝子は、骨髄間葉系幹細胞に導入されたプロウイルス内
で後に切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配
列に挟まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部
位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配
列であり、この特異的な配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の
交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列
である。部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ配列
やＦＲＴ配列などがあり、中でもＬｏｘＰ配列が好まし
い。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独により相同
組換えを行うための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣ
ＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４塩基
からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に一対のＬｏ
ｘＰ配列が同方向で存在する場合は、その間に挟まれた
ＤＮＡ配列は切り出されて環状分子となる（切り出し反
応）。
【００２０】さらに本発明において、細胞増殖因子遺伝
子を哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入する際には、常に
同時にＧＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位
特異的組換え配列間にコードされることが好ましい。
「部位特異的組換え配列間」とは、一対の部位特異的組
換え配列に挟まれた位置関係を示す。該ＧＦＰ遺伝子
は、レトロウイルスベクターが感染し、プロウイルスが
ゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞をＦＡＣＳ（fl
uorescence activated cell sorter）にて選択的に同定
するために用いられる。よって、プロウイルスがゲノム
に組み込まれた骨髄間葉系幹細胞を選択的に同定できれ
ば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子を用いても
よい。
子を哺乳類の骨髄間葉系幹細胞に導入する際には、常に
同時にＧＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位
特異的組換え配列間にコードされることが好ましい。
「部位特異的組換え配列間」とは、一対の部位特異的組
換え配列に挟まれた位置関係を示す。該ＧＦＰ遺伝子
は、レトロウイルスベクターが感染し、プロウイルスが
ゲノムに組み込まれた骨髄間葉系幹細胞をＦＡＣＳ（fl
uorescence activated cell sorter）にて選択的に同定
するために用いられる。よって、プロウイルスがゲノム
に組み込まれた骨髄間葉系幹細胞を選択的に同定できれ
ば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子を用いても
よい。
【００２１】該薬剤耐性遺伝子の例としては、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、と
くにこれらに限定されるものではない。
マイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、と
くにこれらに限定されるものではない。
【００２２】本明細書に記載される「不死化骨髄間葉系
幹細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常骨髄間葉系幹細胞
に近い形態を呈し、骨髄間葉系幹細胞の多分化能を維持
し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴
を有する細胞を意味する。
幹細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常骨髄間葉系幹細胞
に近い形態を呈し、骨髄間葉系幹細胞の多分化能を維持
し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴
を有する細胞を意味する。
【００２３】該不死化骨髄間葉系幹細胞の培養は、増殖
速度を速める条件で実施するのが好ましい。しかしなが
ら、使用する培養容器としては、取り扱いが容易である
という点からコラーゲンなどによる培養容器表面の特別
なコーティングを有していない容器が好ましい。該不死
化骨髄間葉系幹細胞の倍化時間は２４〜７２時間であ
り、好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４
〜３６時間である。該不死化骨髄間葉系幹細胞の培地と
しては、たとえば間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ
−３００１、三光純薬株式会社製）などの間葉系幹細胞
培養培地が好ましく、ＣＳ−Ｃ培地などの無血清培地を
使用するのがさらに好ましい。
速度を速める条件で実施するのが好ましい。しかしなが
ら、使用する培養容器としては、取り扱いが容易である
という点からコラーゲンなどによる培養容器表面の特別
なコーティングを有していない容器が好ましい。該不死
化骨髄間葉系幹細胞の倍化時間は２４〜７２時間であ
り、好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４
〜３６時間である。該不死化骨髄間葉系幹細胞の培地と
しては、たとえば間葉系幹細胞増殖培地（製品番号ＰＴ
−３００１、三光純薬株式会社製）などの間葉系幹細胞
培養培地が好ましく、ＣＳ−Ｃ培地などの無血清培地を
使用するのがさらに好ましい。
【００２４】本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞は、一対
の部位特異的組換え配列を有する可逆的な不死化細胞で
ある。すなわち、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞か
ら、導入された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え
酵素により除去することができる。したがって、本発明
の不死化骨髄間葉系幹細胞を用いれば、生体内に移植す
る前に細胞増殖因子遺伝子を切り出すことができる。あ
るいは、不死化骨髄間葉系幹細胞の分化を誘導した後
に、細胞から細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともでき
る。細胞増殖因子遺伝子を切り出すことによって得られ
た骨髄間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞から分化し
た細胞は、癌化の危険性がなく安全であるため、再生医
療において非常に有効である。
の部位特異的組換え配列を有する可逆的な不死化細胞で
ある。すなわち、本発明の不死化骨髄間葉系幹細胞か
ら、導入された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え
酵素により除去することができる。したがって、本発明
の不死化骨髄間葉系幹細胞を用いれば、生体内に移植す
る前に細胞増殖因子遺伝子を切り出すことができる。あ
るいは、不死化骨髄間葉系幹細胞の分化を誘導した後
に、細胞から細胞増殖因子遺伝子を切り出すこともでき
る。細胞増殖因子遺伝子を切り出すことによって得られ
た骨髄間葉系幹細胞または骨髄間葉系幹細胞から分化し
た細胞は、癌化の危険性がなく安全であるため、再生医
療において非常に有効である。
【００２５】前記部位特異的組換え酵素は、部位特異的
組換え配列を特異的に認識し、切断、結合という相同組
換えを単独で行う酵素である。部位特異的組換え酵素と
しては、たとえばＣｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素
などがあり、Ｃｒｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換
え酵素はＬｏｘＰ配列を特異的に認識する組換え酵素で
ある。該部位特異的組換え酵素はアデノウイルスによっ
てコードされるのが好ましい。
組換え配列を特異的に認識し、切断、結合という相同組
換えを単独で行う酵素である。部位特異的組換え酵素と
しては、たとえばＣｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素
などがあり、Ｃｒｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換
え酵素はＬｏｘＰ配列を特異的に認識する組換え酵素で
ある。該部位特異的組換え酵素はアデノウイルスによっ
てコードされるのが好ましい。
【００２６】以下、実施例、製造例および試験例に基づ
き本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
き本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】製造例１
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７の製造
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７（図１参照）
は、従来の方法（ケイエイ ウェスタマンら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、
８９７１頁、１９９６年）にしたがい、具体的には以下
の方法にて製造した。 １． ＬＸＳＮレトロウイルスベクターをＥｃｏＲ１と
Ｒｓｒ２で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏ
Ｒ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏｔ１、ＢａｍＨ
１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ１、Ｓａｌ１、Ｓ
ｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を含有するポリリン
カーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベ
クターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に挿入した。ｈＴＥ
ＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位に挿入した。 ２． ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰおよびＢ型肝
炎転写後調節因子（ティー エス エン（T. S. Ye
n）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９５年）を
含有するカセットベクターを、以下のようにして製造し
た。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ３で消化し、バ
ックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたの
ち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲＶ、Ｎｏ
ｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、
Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリンカーを
挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクター
のＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。ついで、
ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（Novagen）
製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社
（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結され、一
方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌａ１部
位である断片を製造し、この断片をバックボーンベクタ
ーのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入した。３．
前記１で製造したベクターのＳａｌ１およびＣｌａ１
部位に、前記２で製造したカセットベクター由来のＸｈ
ｏ１およびＣｌａ１断片を挿入し、ＳＳＲ＃１９７ベク
ターを完成させた。
は、従来の方法（ケイエイ ウェスタマンら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、
８９７１頁、１９９６年）にしたがい、具体的には以下
の方法にて製造した。 １． ＬＸＳＮレトロウイルスベクターをＥｃｏＲ１と
Ｒｓｒ２で消化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏ
Ｒ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏｔ１、ＢａｍＨ
１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ１、Ｓａｌ１、Ｓ
ｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を含有するポリリン
カーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベ
クターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に挿入した。ｈＴＥ
ＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位に挿入した。 ２． ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰおよびＢ型肝
炎転写後調節因子（ティー エス エン（T. S. Ye
n）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９５年）を
含有するカセットベクターを、以下のようにして製造し
た。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ３で消化し、バ
ックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異させたの
ち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲＶ、Ｎｏ
ｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、
Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリンカーを
挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該ベクター
のＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。ついで、
ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（Novagen）
製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロンテク社
（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結され、一
方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌａ１部
位である断片を製造し、この断片をバックボーンベクタ
ーのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入した。３．
前記１で製造したベクターのＳａｌ１およびＣｌａ１
部位に、前記２で製造したカセットベクター由来のＸｈ
ｏ１およびＣｌａ１断片を挿入し、ＳＳＲ＃１９７ベク
ターを完成させた。
【００２８】実施例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株の樹立
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生細胞である
Ｃｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクター
ＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5
ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５のフラスコに播種密度１×
１０4細胞／ｃｍ 2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０
％ＮＣＳ（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密
度が約９０％となった時点で、ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ
培養液１５ｍｌで培養液の交換を行なった。
Ｃｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクター
ＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5
ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５のフラスコに播種密度１×
１０4細胞／ｃｍ 2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０
％ＮＣＳ（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密
度が約９０％となった時点で、ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ
培養液１５ｍｌで培養液の交換を行なった。
【００２９】培養液交換２４時間後に、レトロウイルス
ベクターを含有するＣｒｉｐ細胞上清１５ｍｌを０．４
５μｍのフィルターで濾過し、得られた液に１２μｇ／
ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sigma）社製）
を加えた。これを、別途培養中の継代数１の成人ヒト骨
髄間葉系幹細胞（製品番号ＰＴ−２５０１、三光純薬株
式会社製）１×１０6細胞個の培養液と交換し、４時間
感染させた。同様な感染処置を１日に２回、計３日間施
行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な無血清の
ＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて骨髄間葉系幹細胞を培養し
た。
ベクターを含有するＣｒｉｐ細胞上清１５ｍｌを０．４
５μｍのフィルターで濾過し、得られた液に１２μｇ／
ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sigma）社製）
を加えた。これを、別途培養中の継代数１の成人ヒト骨
髄間葉系幹細胞（製品番号ＰＴ−２５０１、三光純薬株
式会社製）１×１０6細胞個の培養液と交換し、４時間
感染させた。同様な感染処置を１日に２回、計３日間施
行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な無血清の
ＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて骨髄間葉系幹細胞を培養し
た。
【００３０】最終感染後２日後に細胞をトリプシンにて
処理し、回収した。ＦＡＣＳ Calibur（ベクトンディッ
キンソン社（Becton Dickinson）製）を用いてＧＦＰ陽
性細胞を回収した。９６穴プレートおよび間葉系幹細胞
増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社
製）を用いた限界希釈法（１穴１／２個の細胞となるよ
うに播種）にて不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株を樹立し
た。該不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞は蛍光顕微鏡で確認
された（図２および図３参照）。該細胞株を独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つ
くば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７）。
処理し、回収した。ＦＡＣＳ Calibur（ベクトンディッ
キンソン社（Becton Dickinson）製）を用いてＧＦＰ陽
性細胞を回収した。９６穴プレートおよび間葉系幹細胞
増殖培地（製品番号ＰＴ−３００１、三光純薬株式会社
製）を用いた限界希釈法（１穴１／２個の細胞となるよ
うに播種）にて不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞株を樹立し
た。該不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞は蛍光顕微鏡で確認
された（図２および図３参照）。該細胞株を独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つ
くば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７）。
【００３１】ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７は、親細胞に類
似した形態を呈し、かつ、増殖が停止する危機（クライ
シス）もなく不死化し、無血清のＣＳ−Ｃ培地において
単層に増殖し、約４８時間でその数が倍加した。
似した形態を呈し、かつ、増殖が停止する危機（クライ
シス）もなく不死化し、無血清のＣＳ−Ｃ培地において
単層に増殖し、約４８時間でその数が倍加した。
【００３２】試験例１
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖能の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の増殖能を測定するために、
周知の方法にて、ＭＴＴアッセイを行った。本試験例に
おいては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子
非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
周知の方法にて、ＭＴＴアッセイを行った。本試験例に
おいては、コントロール細胞として、ｈＴＥＲＴ遺伝子
非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００３３】９６穴プレートに、２０００細胞個／穴と
なるようにＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７またはコントロー
ル細胞を播種した。培養液としては、ＣＳ−Ｃ培地を用
いた。播種から１日、３日、５日および７日後、２０μ
ｇ／ｍｌの５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロ
マイドを各穴の培養液に１０μｌ添加し、４時間培養し
た。ついで、１５０μｌのイソプロパノールを各穴の培
地に添加し、１０分間反応させた。そののち、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ ＥＩＡリーダー（バイオラッド社（Bio-Rad）
製、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、５７０μｍと６３
０μｍの吸光度の比率から細胞増殖曲線（図４）を作成
した。
なるようにＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７またはコントロー
ル細胞を播種した。培養液としては、ＣＳ−Ｃ培地を用
いた。播種から１日、３日、５日および７日後、２０μ
ｇ／ｍｌの５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロ
マイドを各穴の培養液に１０μｌ添加し、４時間培養し
た。ついで、１５０μｌのイソプロパノールを各穴の培
地に添加し、１０分間反応させた。そののち、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ ＥＩＡリーダー（バイオラッド社（Bio-Rad）
製、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、５７０μｍと６３
０μｍの吸光度の比率から細胞増殖曲線（図４）を作成
した。
【００３４】本試験の結果、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７
は、ＰＤＬ（集団倍化レベル（population doubling le
vel））１５０を超えても増殖することを確認した。一
方、コントロール細胞は、ＰＤＬ２５前後で増殖が停止
する複製不能細胞老化（replicative senescence）に陥
った。
は、ＰＤＬ（集団倍化レベル（population doubling le
vel））１５０を超えても増殖することを確認した。一
方、コントロール細胞は、ＰＤＬ２５前後で増殖が停止
する複製不能細胞老化（replicative senescence）に陥
った。
【００３５】試験例２
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７のｈＴＥＲＴ遺伝子の発現
実施例１で得られたＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７における
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調
べた。コントロール細胞としては、ｈＴＥＲＴ遺伝子非
導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。これらの細胞における
遺伝子発現の陽性コントロールとして、β−アクチン遺
伝子の発現を調べた。
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調
べた。コントロール細胞としては、ｈＴＥＲＴ遺伝子非
導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。これらの細胞における
遺伝子発現の陽性コントロールとして、β−アクチン遺
伝子の発現を調べた。
【００３６】ＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＲＮＡｚｏｌ
（シンナ／バイオテックス社製、アメリカ合衆国テキサ
ス州フレンズウッド）を用い、そのプロトコルにしたが
ってＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７からＲＮＡを抽出し、２
μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２
０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
（シンナ／バイオテックス社製、アメリカ合衆国テキサ
ス州フレンズウッド）を用い、そのプロトコルにしたが
ってＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７からＲＮＡを抽出し、２
μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２℃で２
０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
【００３７】得られた２μｇの逆転写産物を、プライマ
ー濃度各２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇ
ｏｌｄキット（アプライドバイオシステムズ社製、アメ
リカ合衆国カルフォルニア州）を用い、そのプロトコル
にしたがってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、最初に９５
℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で３
０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイク
ルとしてこれを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７
分間インキュベーションすることで実施した。ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子またはβ−アクチン遺伝子に対するプライマー
には下記のものを使用した。 ｈＴＥＲＴ遺伝子 ５′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴ
ＴＣＣＡ ３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡ
ＧＡＧＧ β−アクチン遺伝子 ５′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣ
ＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ ３′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧ
ＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ
ー濃度各２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇ
ｏｌｄキット（アプライドバイオシステムズ社製、アメ
リカ合衆国カルフォルニア州）を用い、そのプロトコル
にしたがってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、最初に９５
℃で１０分間インキュベーションしたのち、９５℃で３
０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイク
ルとしてこれを３５サイクル行ない、最後に７２℃で７
分間インキュベーションすることで実施した。ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子またはβ−アクチン遺伝子に対するプライマー
には下記のものを使用した。 ｈＴＥＲＴ遺伝子 ５′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴ
ＴＣＣＡ ３′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡ
ＧＡＧＧ β−アクチン遺伝子 ５′ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣ
ＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ ３′ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧ
ＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ
【００３８】ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５に
おいて、レーン１はコントロール細胞、レーン２はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−８１９７を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示
す。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７においてはｈＴＥＲＴ遺
伝子およびβ−アクチン遺伝子の発現が認められた。一
方、コントロール細胞においては、β−アクチン遺伝子
の発現のみが認められた。これらの結果は、ＦＥＲＭ
ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子
が適切に発現していることを示す。
おいて、レーン１はコントロール細胞、レーン２はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−８１９７を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示
す。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７においてはｈＴＥＲＴ遺
伝子およびβ−アクチン遺伝子の発現が認められた。一
方、コントロール細胞においては、β−アクチン遺伝子
の発現のみが認められた。これらの結果は、ＦＥＲＭ
ＢＰ−８１９７において、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子
が適切に発現していることを示す。
【００３９】試験例３
テロメラーゼ活性の測定
ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におけるｈＴＥＲＴのテロメ
ラーゼ活性を調べるために、ＴＲＡＰアッセイを行っ
た。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈ
ＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
ラーゼ活性を調べるために、ＴＲＡＰアッセイを行っ
た。本試験例においては、コントロール細胞として、ｈ
ＴＥＲＴ遺伝子非導入骨髄間葉系幹細胞を用いた。
【００４０】ＴＲＡＰアッセイは、ＴＲＡＰ−ｅａｓｅ
テロメラーゼ検出キット（オンコー社（Oncor）製、Ｍ
Ｄ、ＵＳＡ）を用い、そのプロトコルにしたがって実施
した。その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＥＲＭ ＢＰ
−８１９７では陽性、コントロール細胞では陰性であっ
た。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におい
て、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が発現した後、ｈＴＥ
ＲＴタンパク質が適切な活性を有していることを示す。
テロメラーゼ検出キット（オンコー社（Oncor）製、Ｍ
Ｄ、ＵＳＡ）を用い、そのプロトコルにしたがって実施
した。その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＥＲＭ ＢＰ
−８１９７では陽性、コントロール細胞では陰性であっ
た。これらの結果は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７におい
て、導入されたｈＴＥＲＴ遺伝子が発現した後、ｈＴＥ
ＲＴタンパク質が適切な活性を有していることを示す。
【００４１】試験例４
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プ
レップキット骨芽細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ
−３００２、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培
養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
レップキット骨芽細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ
−３００２、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培
養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４２】つぎに、従来の方法（「新染色法のすべ
て」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたが
ってコッサ染色を実施した。その結果、細胞内のカルシ
ウムの沈着が存在した領域が黒褐色で点状に染色された
ことから、骨芽細胞への分化を確認した（図６）。図６
中、ａは、黒褐色で点状に染色された、カルシウムの沈
着が存在した領域を示す。
て」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたが
ってコッサ染色を実施した。その結果、細胞内のカルシ
ウムの沈着が存在した領域が黒褐色で点状に染色された
ことから、骨芽細胞への分化を確認した（図６）。図６
中、ａは、黒褐色で点状に染色された、カルシウムの沈
着が存在した領域を示す。
【００４３】試験例５
不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１にて樹立したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７を、プ
レップキット脂肪細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ
−３００４、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培
養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
レップキット脂肪細胞分化用培地（製品番号ＣＬ ＰＴ
−３００４、三光純薬株式会社製）を用い、２１日間培
養した。培地は５日ごとに新しい培地と交換した。
【００４４】つぎに、従来の方法（「新染色法のすべ
て」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたが
ってオイル赤染色を実施した。その結果、細胞内の脂肪
滴が赤に染色されたことから、脂肪細胞への分化を確認
した（図７）。図７中、ｂは赤く染色された脂肪滴を示
す。
て」、医歯薬出版株式会社、１９９９年発行）にしたが
ってオイル赤染色を実施した。その結果、細胞内の脂肪
滴が赤に染色されたことから、脂肪細胞への分化を確認
した（図７）。図７中、ｂは赤く染色された脂肪滴を示
す。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、多分化能を維持したまま
不死化した骨髄間葉系幹細胞株を得ることができる。本
発明の不死化骨髄間葉系幹細胞株は、癌遺伝子ではなく
正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子により不死化してい
るため、癌化の危険性を回避することができる。そのう
え、該細胞株から導入した細胞増殖因子遺伝子を切り出
すこともできるため、安全性が非常に高い。すなわち、
細胞増殖遺伝子を切り出して得られる細胞は、再生医療
において極めて有用である。
不死化した骨髄間葉系幹細胞株を得ることができる。本
発明の不死化骨髄間葉系幹細胞株は、癌遺伝子ではなく
正常細胞由来の細胞増殖因子遺伝子により不死化してい
るため、癌化の危険性を回避することができる。そのう
え、該細胞株から導入した細胞増殖因子遺伝子を切り出
すこともできるため、安全性が非常に高い。すなわち、
細胞増殖遺伝子を切り出して得られる細胞は、再生医療
において極めて有用である。
【００４６】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：ＬｏｘＰ配列
配列番号２：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメ
ラーゼ連鎖反応用５′プライマー 配列番号３：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメ
ラーゼ連鎖反応用３′プライマー 配列番号４：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するための
ポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー 配列番号５：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するための
ポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
ラーゼ連鎖反応用５′プライマー 配列番号３：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメ
ラーゼ連鎖反応用３′プライマー 配列番号４：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するための
ポリメラーゼ連鎖反応用５′プライマー 配列番号５：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するための
ポリメラーゼ連鎖反応用３′プライマー
【００４７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KOBAYASHI, Naoya
LEBOULCH, Philippe
TANAKA, Noriaki
FUJIWARA, Toshiyoshi
<120> IMMORTALIZED BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELL
<130> JP-13648
<150> US 09/975,304
<151> 2001-10-12
<160> 5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> P1 pharge
<220>
<223> LoxP sequence
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for polymerase chain reaction to detect hTERT gene
<400> 2
ctgaccaggg tcctattcca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for polymerase chain reaction to detect hTERT gene
<400> 3
tggttatccc aagcaagagg 20
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for polymerase chain reaction to detect human beta-actin
gene
<400> 4
tgacggggtc acccacactg tgcccatcta 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for polymerase chain reaction to detect human beta-actin
gene
<400> 5
ctagaagcat ttgcggtgga cgatggaggg 30
【図１】レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７を示す
図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケー
ジングシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴ
はｈＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、Ｍ
ｏＭＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長い
末端反復配列、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾー
ムエントリー部位をそれぞれ示す。
図である。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケー
ジングシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴ
はｈＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、Ｍ
ｏＭＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長い
末端反復配列、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾー
ムエントリー部位をそれぞれ示す。
【図２】図２はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７の位相差顕微
鏡像である。
鏡像である。
【図３】図３は図２に示したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７
の蛍光顕微鏡像である。
の蛍光顕微鏡像である。
【図４】図４はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコント
ロール細胞の増殖曲線を示すグラフである。
ロール細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図５】図５はＦＥＲＭ ＢＰ−８１９７およびコント
ロール細胞を用いて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す
図である。
ロール細胞を用いて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す
図である。
【図６】図６はコッサ染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１９
７の一部を示す図である。
７の一部を示す図である。
【図７】図７はオイル赤染色したＦＥＲＭ ＢＰ−８１
９７の一部を示す図である。
９７の一部を示す図である。
ａ カルシウムの沈着が存在した領域
ｂ 脂肪滴
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(71)出願人 599173527
藤原 俊義
岡山県岡山市東山３−５−30
(72)発明者 小林 直哉
岡山市海吉2033−15
(72)発明者 フィリップ レブルシュ
アメリカ合衆国、02129 マサチューセッ
ツ州、チャールズタウン、エイス ストリ
ート 197、ナンバー 729（番地なし)
(72)発明者 田中 紀章
岡山県浅口郡鴨方町六条院中2325−１
(72)発明者 藤原 俊義
岡山市東山３−５−30
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA21 CA04 DA03 EA02
FA18 GA11 HA01
4B065 AA93X AA99Y AB01 AC14
AC20 BA02 CA24 CA46
Claims (5)
- 【請求項１】 骨髄間葉系幹細胞に一対の部位特異的組
換え配列に挟まれた細胞増殖因子遺伝子を導入すること
により得られる不死化骨髄間葉系幹細胞。 - 【請求項２】 骨髄間葉系幹細胞がヒトの骨髄間葉系幹
細胞である請求項１記載の不死化骨髄間葉系幹細胞。 - 【請求項３】 細胞増殖因子遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子
である請求項１記載の不死化骨髄間葉系幹細胞。 - 【請求項４】 一対の部位特異的組換え配列がＬｏｘＰ
配列である請求項１記載の不死化骨髄間葉系幹細胞。 - 【請求項５】 細胞増殖因子遺伝子がレトロウイルスベ
クターを用いて導入される請求項１記載の不死化骨髄間
葉系幹細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/975,304 | 2001-10-12 | ||
| US09/975,304 US6645763B2 (en) | 2001-10-12 | 2001-10-12 | Immortalized bone marrow mesenchymal stem cell |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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