JP4860612B2

JP4860612B2 - 脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法

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Publication number: JP4860612B2
Application number: JP2007521277A
Authority: JP
Inventors: 隆宏円居; 竜嗣榎; 裕章佐川; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2006-06-12
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2026-06-12
Also published as: EP1892294A1; KR20080016888A; US20090162936A1; US8835177B2; EP1892294A4; WO2006134871A1; JPWO2006134871A1

Description

本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学などの分野において有用な、脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞に高効率で遺伝子を導入する技術に関する。

遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する遺伝病やがんなどの難病について、正しい遺伝子情報の付加によってその細胞の機能を修正したり、細胞が本来持っていなかった新しい「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療または予防を行う行為である。

遺伝子治療において治療用遺伝子として使用される遺伝子は、通常は前記遺伝子が発現される必要のある組織、臓器に導入される。例えば、嚢胞性線維症患者の呼吸器上皮細胞にＣＦＴＲ遺伝子を導入する治療がこれに当たる。一方、遺伝子発現がその組織、臓器を問わない場合もある。例えば血漿中の血液凝固因子である第ＶＩＩ因子は肝臓で産生されることが知られているが、前期因子をコードする遺伝子を骨格筋細胞に導入し、当該細胞で第ＶＩＩ因子を産生させ、血漿中に供給しようとする試みも行われている（非特許文献１）。

後者のように、目的の遺伝子を発現させる細胞に特段の制約がない場合には、細胞の取扱の容易さ等を考慮して被遺伝子導入細胞（標的細胞）を選択することができる。例えば、脂肪細胞や前駆脂肪細胞は採取、培養、個体への移植が容易であり、遺伝子導入用標的細胞として注目されている（特許文献１）。

一方、レトロウイルスベクターを標的細胞に高効率に感染させる方法として、レトロウイルスに結合する機能性物質の存在下に標的細胞にレトロウイルスを感染させる方法が開発されている（特許文献２、３、４；非特許文献２）。これらの方法では、標的細胞に結合する物質もしくは標的細胞結合部位を有する物質が使用されるが、脂肪細胞や前駆脂肪細胞についてレトロウイルスの感染性を高めることができるような機能性物質は知られていない。

国際公開第０３／１０６６６３号パンフレット国際公開第９５／２６２００号パンフレット国際公開第９７／１８３１８号パンフレット国際公開第００／０１８３６号パンフレットブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０１巻、第２９６３〜２９７２頁（２００３）ネイチャー・メディシン（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、第８７６〜８８２頁（１９９６）

本発明の目的は、脂肪細胞、前駆脂肪細胞に効率よく外来遺伝子を導入する方法を開発し、疾患の治療や予防に有効な形質転換細胞の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域を有する機能性物質を使用して脂肪細胞や前駆脂肪細胞とレトロウイルスベクターを共配置した場合に、レトロウイルスが効率よく脂肪細胞、前駆脂肪細胞に感染することを見出し、本発明を完成させた。

本発明を概説すれば、本発明は脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法であって、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質またはレトロウイルス結合部位を有する物質と標的細胞結合部位を有する他の物質との混合物の存在下に外来遺伝子を有するレトロウイルスベクターを脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞に感染させる工程を包含し、かつ前記の標的細胞結合部位がＶＬＡ−５に結合しうる領域および／またはＶＬＡ−４に結合しうる領域を含むことを特徴とする。

本発明に使用されるレトロウイルス結合部位としては、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメイン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲンのインシュリン結合部位、ポリリジン、ＤＥＡＥデキストランから選択される物質に由来するレトロウイルス結合部位が例示される。

本発明には、フィブロネクチン由来のＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域である標的細胞結合部位を使用することができる。前記の標的細胞結合部位を有し、かつレトロウイルス結合部位を有する物質としては配列番号１記載のアミノ酸配列と、配列番号２記載のアミノ酸配列および／または配列番号３記載のアミノ酸配列とを有するポリペプチドが例示される。

本発明に使用されるレトロウイルスベクターは、複製能欠損レトロウイルスベクターであってもよい。

本発明によれば、有用な外来遺伝子を人為的に組み入れた脂肪細胞、前駆脂肪細胞を効率よく製造することが可能となる。当該細胞は種々の疾患の治療に利用することができ、医療上、極めて有用である。

本発明はレトロウイルスベクターと脂肪細胞または前駆脂肪細胞とを共配置させることにより、レトロウイルスベクターによる前記の細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法を提供する。

本発明には、レトロウイルス結合部位と脂肪細胞、前駆脂肪細胞結合部位とを同一分子中に有する物質、またはレトロウイルス結合部位を有する物質と脂肪細胞結合部位を有する他の物質との混合物を使用することができる。

前記の、レトロウイルス結合部位としては、レトロウイルスベクターに結合する活性を有しているものであれば特に限定はないが、例えばフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメイン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲンのインシュリン結合部位、ポリリジン、ＤＥＡＥデキストラン等を使用することができる。特に好適には、配列番号１（Ｈ−２７１）に示すアミノ酸配列からなる、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメイン由来のレトロウイルス結合部位を有するポリペプチドを使用することができる。

また、脂肪細胞、前駆脂肪細胞との結合部位としては、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域を含む物質を使用することができる。前記領域の由来にも特に限定はなく、公知のＶＬＡ−５またはＶＬＡ−４のリガンドや、ＶＬＡ−５またはＶＬＡ−４を認識する抗体を使用することができる。好適にはフィブロネクチン由来のＶＬＡ−５またはＶＬＡ−４結合部位を使用することができ、それぞれ配列番号２（Ｃ−２７４）記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３（ＣＳ−１）記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。

本発明には、前記のレトロウイルス結合部位と脂肪細胞または前駆脂肪細胞結合部位の両方を有する機能性物質を使用してもよく、レトロウイルス結合部位を含む機能性物質と脂肪細胞または前駆脂肪細胞結合部位を有する他の機能性物質の混合物を使用してもよい。特に好適な態様としては、フィブロネクチン由来の組み換えポリペプチド、例えば配列番号１、２、３に示すアミノ酸配列のすべてを有しているＣＨ−２９６（配列番号４）、配列番号１、３に示すアミノ酸配列を有しているＨ−２９６（配列番号５）や配列番号１、２に示すアミノ酸配列を有しているＣＨ−２７１（配列番号６）が使用される。また、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列のポリペプチドであるＨ−２７１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドであるＣ−２７４との混合物を使用してもよい。前期のＣＨ−２９６、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−２７４は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）の記載に基づいて作製することができる。さらに、ＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の商品名で市販されている（タカラバイオ社製）。

前記の機能性物質の使用方法にも特に限定はないが、例えば、細胞へのレトロウイルスベクター感染操作に使用される容器表面を当該機能性物質で被覆して使用することができる。前記の被覆操作には公知の方法を使用すればよい。

本発明に使用されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。遺伝子導入を目的とする場合には、通常、人為的に改変された組換えレトロウイルス、すなわちレトロウイルスベクターが本発明に使用される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止する観点からは複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、ＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター等］あるいはこれらを改変したベクターが例示される。

前記のレトロウイルスベクターに保持させる外来遺伝子には特に限定はなく、目的の細胞で発現させることが望まれる任意の遺伝子を挿入することができ、ポリペプチド（酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等をコードする遺伝子が例示される。遺伝子治療を目的として本発明が実施される場合には、疾患の治療または予防に有用な物質をコードする遺伝子が標的細胞に導入される。脂肪細胞または前駆脂肪細胞を標的細胞とする本発明においては、導入する遺伝子としては、細胞により産生された後、細胞外に移行（例えば血管内を循環）して作用を示すポリペプチド、例えば分泌酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン等をコードするものが好適である。

本発明では、前記の外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下で、レトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された遺伝子はその下流にターミネーター配列を含有することができる。さらに、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼのようなレポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子、レセプタータンパクをコードする遺伝子等）を有していてもよい。

前記のレトロウイルスベクターは公知の方法で調製し、本発明に使用すればよい。調製方法には特に限定はなく、使用されるレトロウイルスベクターに適したレトロウイルス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して本発明に使用することができる。前記のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レトロウイルスベクタープラスミドのトランスフェクションにより一過性にレトロウイルス粒子を生産するもののいずれでも構わない。

上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］等を使用してもよい。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ／１７細胞、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。

本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープやエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウイルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスベクターも本発明に使用できる。

本発明において、標的細胞には成熟脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）のみならず、脂肪細胞に分化しうる前駆脂肪細胞に該当する細胞を使用することができる。前駆脂肪細胞には、直接脂肪細胞に分化しうる細胞の他、脂肪細胞を含む多種の細胞への分化能を維持している間葉系幹細胞や間質系細胞が包含される。前記の各細胞は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の脂肪組織等より採取した初代培養の細胞であってもよく、株化された培養細胞株であってもよい。脂肪組織の採取源としては皮下脂肪や内臓脂肪が例示されるが、これらに限定されるものではない。脂肪組織は採取されることにより個体に与える機能障害のおそれが小さいことから、標的細胞の採取源として好適である。また、間葉系幹細胞や間質系細胞は骨髄やその他の組織より採取することができる。

上記の機能性物質の存在下、脂肪細胞や前駆脂肪細胞にレトロウイルスベクターを感染させることにより、遺伝子が導入された脂肪細胞、前駆脂肪細胞を効率よく得ることができる。また、前駆脂肪細胞に前記方法で遺伝子導入を行った場合、得られた遺伝子導入細胞を公知方法により脂肪細胞に分化させ、遺伝子導入された脂肪細胞を取得することもできる。さらに、遺伝子導入された前駆脂肪細胞を生体内に移植して脂肪細胞への分化を図ってもよい。

特に本発明を限定するものではないが、例えば前記の機能性物質でその表面を被覆された容器中でレトロウイルスベクターの細胞への感染を行い、本発明を実施することができる。前記の容器は細胞の維持、培養に使用可能なものであれば特に限定はなく、シャーレ、細胞培養用プレート、フラスコ、細胞培養用バッグ等が使用できる。容器表面への機能性物質の固定化は、使用する機能性物質に適した公知の手法によって実施すればよく、例えばレトロネクチンは滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理食塩水等に溶解した状態で固定化に使用することができる。

レトロウイルスベクターの感染の方法は、特に本発明を限定するものではないが、例えば下記の２つの方法が例示される。
（１）機能性物質で被覆された容器中に脂肪細胞または前駆脂肪細胞とレトロウイルスベクター（例えばレトロウイルス産生細胞の上清）を添加し、インキュベートする。
（２）機能性物質で被覆された容器中にレトロウイルスベクターを添加してインキュベートし、この容器を洗浄してレトロウイルス産生細胞由来の不純物等を除いた後、脂肪細胞または前駆脂肪細胞を添加してインキュベートする。

後者はレトロウイルス産生細胞に存在する可能性のある感染阻害物質を除去できることが特徴であるが、必ずしもこの方法で実施する必要はない。感染方法は使用するベクターや細胞に応じて上記の方法、あるいはそれ以外の方法のうちから適切なものを選択すればよい。

レトロウイルスベクターとともに培養中の細胞は、必要に応じて培地の交換や新たなベクターの添加を行いながら培養する。培養終了後、容器中の細胞を回収し、必要に応じて洗浄し、種々の目的に使用することができる。また、遺伝子導入された細胞が前駆脂肪細胞である場合には、細胞をそのまま維持するのみならず、成熟細胞への分化を誘導してもよい。例えば、間葉系幹細胞は適切な成長因子、分化誘導物質を添加して培養することにより、成熟脂肪細胞に分化させることができる。

標的細胞の培養、ならびにレトロウイルスベクターの感染には、適切な細胞培養用の培地を選択し、使用することができる。例えば市販の培地や、これを改変したものを使用すればよい。さらに、前記の培地は成長因子、細胞増殖因子等の成分を含んでいてもよい。

本発明では、任意に、レトロウイルスベクターの感染に供された細胞から遺伝子導入された細胞のみを選択してもよい。この操作は導入された外来遺伝子、例えば、前期のマーカー遺伝子の発現を指標とし、その遺伝子の特徴に応じた公知の方法により実施することができる。

こうして得られた、遺伝子導入された細胞は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物に移植して導入された遺伝子を発現させ、所望の作用、例えば疾患に対する治療効果や予防効果を発揮させることができる。通常、遺伝子導入された脂肪細胞や前駆脂肪細胞は、皮下組織や脂肪組織などに移植されるが、特に限定されるものではない。移植は、細胞懸濁液を目的の部位に注射する方法や、外科的に切開した目的部位に細胞を移植する方法により実施することができる。

上記の態様では、標的細胞となる脂肪細胞または前駆脂肪細胞のドナーは、好適にはレシピエント自身である。しかし、組織適合性抗原の一致度が高い場合には、非自己由来の遺伝子導入細胞を移植することも可能である。

以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。

調製例１ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターの調製
ｐＤＯＮ−ＡＩプラスミド（タカラバイオ社製、３６５０）のマルチクローニングサイトにプラスミドｐＱＢＩ２５（ＱｕａｎｔｕｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ（以下ＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子を挿入し、プラスミドｐＤＯＮ−ＧＦＰを作製した。ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターの調製はＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔＡｍｐｈｏ（タカラバイオ社製、６１６１）により、２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１１２６８）と前記のｐＤＯＮ−ＧＦＰを用いて、キット付属のプロトコルに従って行った。なお、ＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（培養上清）はトランスフェクション後４８時間で回収したもの（実施例１で使用）および７２時間で回収したもの（実施例２で使用）の２種を調製して以下の実験に使用した。回収したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターは−８０℃で保存し、使用前に３７℃水浴中で急速溶解して使用した。なお、実施例１の試験にはＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ（以下ＰＧＭ培地、Ｃａｍｂｒｅｘ社製Ｂ８０００より調製）により１０倍、４０倍、１６０倍希釈した上清を、また実施例２の試験には１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｃａｍｂｒｅｘ社製）含有ダルベッコ改良イーグル培地（シグマ社製、Ｄ６０４６）（以下ＤＭＥＭ培地）により４倍、１６倍、６４倍に希釈した上清をそれぞれ使用した。

実施例１ヒト前駆脂肪細胞へのレトロネクチンを用いた遺伝子導入
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
ノントリートメント２４穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、３５１１４７）の各ウエルに２０μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製、Ｔ１００Ａ）溶液を５００μＬずつ添加し、４℃で一晩固定化を行った。その後、各ウエルより溶液を除去し、２％牛血清アルブミンを含有するＰＢＳを５００μＬずつ添加してさらに室温で３０分以上放置した。こうして作製されたレトロネクチン固定化培養プレートはＰＢＳで１回洗浄した後に各実験に供した。

（２）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
調製例１により調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液を（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに５００μＬずつ添加して、ＣＯ_２インキュベーター中、３２℃で６時間インキュベートした。その後、各ウエルより上清を除去してＰＢＳで１回洗浄後、４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁したヒト前駆脂肪細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、ＰＴ５０２０）を５００μＬずつ各ウエルに播種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（３）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地で懸濁したヒト前駆脂肪細胞を５００μＬずつチューブにとり、１，５００×ｇ、５分間室温で遠心して上清を除去した。チューブに、調製例１で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液を５００μＬずつ添加し、沈殿（細胞）を懸濁した。この懸濁液を（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（４）ポリブレンＳＮ法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリブレンＳＮ法により遺伝子導入を行った。４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁したヒト前駆脂肪細胞を５００μＬずつ２４穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３０４７）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一晩培養した。その後、培養上清を除去し、調製例１で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液に終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン（ヘキサジメトリン・ブロミド；アルドリッチ社製、１０７６８−９）水溶液を添加したものを５００μＬずつ各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一晩培養した。培養上清を除去して新しいＰＧＭ培地を各ウエルに５００μＬずつ添加しさらに３日間培養した後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（５）遺伝子導入効率の測定
（２）、（３）、（４）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、ＧＦＰ発現細胞の比率をフローサイトメトリー（ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００、ベックマン・コールター社製）により測定し、遺伝子導入効率を評価した。すなわち、培養後の各細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ溶液（ギブコＢＲＬ社製、２５２００−０５６）により培養プレートよりはがした後、ＰＧＭ培地に懸濁し、フローサイトメトリー解析に供した。その結果を表１に示す。表１はそれぞれ１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表１に示すように、レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法、レトロネクチンＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったポリブレンＳＮ法より高い遺伝子導入効率を示し、脂肪細胞への遺伝子導入におけるレトロネクチンの有用性が示された。

実施例２マウス前駆脂肪細胞へのレトロネクチンを用いた遺伝子導入
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
調製例１により調製した各希釈ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに５００μＬずつ添加しＣＯ_２インキュベーター中、３２℃で６時間インキュベートした。その後、各ウエルより上清を除去しＰＢＳで１回洗浄後、各ウエルに４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＤＭＥＭ培地で懸濁したマウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２．１）を５００μＬずつ播種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で１日間培養した。培養上清を除去し新しいＤＭＥＭ培地を各ウエルに５００μＬずつ添加し、さらにＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３日間培養後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（３）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁した３Ｔ３−Ｌ１細胞を５００μＬずつチューブにとり、１，５００×ｇ、５分間室温で遠心して上清を除去した。チューブに、調製例１で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液を５００μＬずつ添加し、沈殿（細胞）を懸濁した。この懸濁液を（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で１日間培養した。培養上清を除去して新しいＤＭＥＭ培地を各ウエルに５００μＬずつ添加し、さらにＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３日間培養後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（４）ポリブレンＳＮ法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリブレンＳＮ法により遺伝子導入を行った。細胞として３Ｔ３−Ｌ１細胞、培地としてＤＭＥＭ培地を使用した他は、実施例１−（４）と同様の方法で行った。

（５）遺伝子導入効率の測定
（２）、（３）、（４）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、ＧＦＰ発現細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定し、遺伝子導入効率を評価した。すなわち、培養後の各細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ溶液により培養プレートよりはがした後、ＤＭＥＭ培地に懸濁し、フローサイトメトリー解析に供した。その結果を表２に示す。表２はそれぞれ４倍希釈、１６倍希釈、６４倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現比率）（％）を示したものである。

表２に示すように、レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法、レトロネクチンＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったポリブレンＳＮ法より高い遺伝子導入効率を示し、レトロネクチンの有用性が示された。

調製例２産生細胞が異なるＧＦＰ発現レトロウイルスベクターの調製
調製例１と同様の方法でＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを調製した。産生細胞として、２９３Ｔ／１７細胞に加えて、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製、６１６３）も使用した。それぞれのＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（培養上清）は、トランスフェクション後４８時間で回収したものと７２時間で回収したものの２種類を調製し、回収後はそれぞれ−８０℃で凍結保存した。

実施例３遺伝子導入細胞の分化誘導
（１）細胞の前培養
皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、ＰＴ５０２０）は、購入後解凍して、ＰＧＭ培地と２２５ｃｍ^２フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、４３１０８２）を用いて、約４８時間の培養を行い、細胞数を増加させてから、９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、再び液体窒素中にて保存した。

遺伝子導入時には、これら保存ヒト前駆脂肪細胞を３７℃水浴中にて急速溶解し、ＰＧＭ培地で洗浄後、１７５ｃｍ^２フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３０２８）に約４０００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２の条件で播種し、約４８時間の培養を行った。培養した細胞はトリプシン・ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、一部は後述の（６）のポリブレン法の実験に使用し、残りは再び１７５ｃｍ^２フラスコに播種して、更に約２４時間の培養を行った後、後述の（４）（５）のレトロネクチン法の実験に供した。

（２）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例１−（１）と同様の方法で行った。ただしプレートにはノントリートメント４８穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、３５１１７８）を使用し、ウェルに添加するレトロネクチン溶液の液量は２００μＬとした。

（３）ウイルスベクター溶液の調製
調製例２で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（産生細胞２９３Ｔ／１７細胞、トランスフェクション後４８時間後に回収）を３７℃水浴中で急速溶解し、ＰＧＭ培地により１０倍希釈、４０倍希釈して実験に供した。

（４）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
（３）で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液を、（２）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに２００μＬずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３２℃で５時間インキュベートした。その後、各ウエルより上清を除去してリン酸緩衝水溶液で１回洗浄後、（１）で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁し、２００μＬずつ各ウエルに播種、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（５）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
（１）で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁し、２００μＬずつチューブにとり、約１８００×ｇ、５分間、室温で遠心して上清を除去した。チューブに（３）で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液を２００μＬずつ添加し、沈殿（細胞）を懸濁した。この懸濁液を（２）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（６）ポリブレンＳＮ法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリブレンＳＮ法により遺伝子導入を行った。（１）で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁し、２００μＬずつ４８穴細胞培養用プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３０７８）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一晩培養した。その後、培養上清を除去し、（３）で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター希釈液に終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン水溶液を添加したものを２００μＬずつ各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養上清を除去して、新たにＰＧＭ培地を各ウエルに２００μＬずつ添加し、さらに３日間培養した後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（７）遺伝子導入効率の測定
（４）、（５）、（６）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、ＧＦＰ発現細胞の比率を測定した。その結果を表３に示す。表３はそれぞれ１０倍希釈、４０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表３に示すように、レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法、レトロネクチンＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったポリブレンＳＮ法より高い遺伝子導入効率を示し、脂肪細胞への遺伝子導入におけるレトロネクチンの有用性が示された。

（８）遺伝子導入細胞の分化誘導と分化した脂肪細胞の遺伝子導入効率の測定
遺伝子導入を行ったヒト前駆脂肪細胞が、脂肪細胞への分化能を保持しているかを評価するため、導入細胞の分化誘導を行った。（４）、（５）、（６）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、培養上清を除去した後、ＡｄｉｐｏｃｙｔｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（以下ＡＤＭ培地と略称する、ＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｃａｍｂｒｅｘ社製、ＰＴ８０００より調製）を各ウエルに２５０μＬずつ添加し、さらに各ウエルに等量の２５０μＬのＰＧＭ培地を添加して混和、７日間の培養を行うことで分化誘導を行った。分化誘導後の脂肪細胞は、（７）と同様にフローサイトメトリー解析に供した。その結果を表４に示す。表４はそれぞれ１０倍希釈、４０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行った後、分化誘導によって脂肪細胞へと分化した細胞のＧＦＰ発現細胞比率（％）を示したものである。

表４に示すように、いずれの方法で遺伝子導入された細胞においても、ＧＦＰ発現細胞の比率は表３の遺伝子導入効率の値と比較してほぼ変化は見られない。すなわち、前駆脂肪細胞に導入された遺伝子は脂肪細胞へ分化した後も安定に保持されていることが確認された。

（９）トリグリセライド蓄積量測定による脂肪細胞への分化能の評価
分化誘導後の遺伝子導入細胞のトリグリセライド蓄積量を測定することで、その分化能を評価した。（４）、（５）、（６）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞、および対照としてウイルスを含まない培地で遺伝子導入操作を実施した細胞について、（８）と同様の方法で分化誘導を行った後、培養上清を除去、リン酸緩衝水溶液で２回洗浄し、イソプロパノールとヘキサンを２：３の割合で混合した溶液を各ウエルに２５０μＬずつ添加した。室温で３０分間放置した後に上清を回収し、再び同様にイソプロパノールとヘキサンの混合液を添加、放置、回収の操作を繰り返した。回収した混合液から濃縮乾固によって溶媒を除き、得たトリグリセライドをジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製、０４７−２５４７５）に再度溶解した。こうして得られた試料は、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業社製、４３２−４０２０１）と反応させた後、吸光プレートリーダー（ＭｉｃｒｏＲｅａｄｅｒ４、Ｈｙｐｅｒｉｏｎ社製）で５７０ｎｍの吸光度を測定し、試料中のトリグリセライド含有量を算出した。

トリグリセライド回収後の細胞から、１規定水酸化ナトリウム（ナカライテスク社製、３１５１１−０５より調製）溶液を各ウエルに２５０μＬずつ添加し、３０分間、室温に放置することでタンパク質を回収した。回収したタンパク質は、ＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製、２３２３５）を用いて濃度を算出した。各試料のトリグリセライド蓄積量は、タンパク質量で割ることで補正し、単位タンパク質量あたりのトリグリセライド量を求めた。これらの結果を表５に示す。表５は、ウイルスを含まないＰＧＭ培地（ｍｏｃｋ）、１０倍希釈、４０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター溶液を用いて各方法で遺伝子導入を行った細胞について、分化誘導後の各ウエルのトリグリセライド蓄積量（ＴＧと表記、単位はμｇ）、タンパク質量（ｐｒｏｔｅｉｎと表記、単位はμｇ）、および単位タンパク質量あたりのトリグリセライド量（ＴＧ／ｐｒｏｔｅｉｎと表記、単位はμｇ）を示したものである。

表５に示すように、全ての方法において分化誘導後の遺伝子導入細胞のトリグリセライドの蓄積が示された。この際、ｍｏｃｋ細胞とレトロネクチンを用いて遺伝子導入された細胞とを比較しても大きな差は見られなかった。また、遺伝子導入していないヒト前駆脂肪細胞に同様の分化誘導を行って得られた細胞でも同程度のＴＧ／ｐｒｏｔｅｉｎ値が得られた。このように、遺伝子導入により前駆脂肪細胞の分化能の低下は起こらないことが示された。

実施例４異なる産生細胞から調製したウイルスベクターを用いた遺伝子導入
（１）細胞の前培養
実施例３−（１）と同様の方法で行った。

（２）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例３−（２）と同様の方法で行った。

（３）ウイルスベクター溶液の調製
調製例２で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを３７℃水浴中で急速溶解し、ＰＧＭ培地により１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈して実験に供した。ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターとして、トランスフェクションした２９３Ｔ／１７細胞、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞をそれぞれ７２時間培養した後に回収した培養上清を実験に供した。

（４）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
実施例３−（４）と同様の方法で行った。

（５）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（５）と同様の方法で行った。

（６）遺伝子導入効率の測定
実施例３−（７）と同様の方法で行った。その結果を表６に示す。表６は、それぞれ１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈した各種ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表６に示すように、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞を用いて調製したウイルスベクターによっても、レトロネクチン法による遺伝子導入が可能であることが示された。

実施例５ヒト血清含有ＰＧＭ培地を用いた遺伝子導入
（１）細胞の前培養
実施例３−（１）と同様の方法で行った。ただし前培養は７５ｃｍ^２フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３１１０）を使用し、約９０００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２の条件で播種して培養を行った。

（３）ウイルスベクター溶液の調製
調製例２で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（産生細胞２９３Ｔ／１７細胞、トランスフェクション後７２時間後に回収）を３７℃水浴中で急速溶解し、１０％ＦＢＳの代わりに１０％ｈｕｍａｎＡＢ血清（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＰＧＭ培地（以下１０ＨＰＧＭ培地と記載する）により１０倍、４０倍、１６０倍希釈し、実験に供した。

（４）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
実施例３−（４）と同様の方法で行った。ただし、培地には１０ＨＰＧＭ培地を使用した。

（５）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（５）と同様の方法で行った。ただし、培地には１０ＨＰＧＭ培地を使用した。

（６）ポリブレンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（６）と同様の方法で行った。ただし、培地には１０ＨＰＧＭ培地を使用した。

（７）遺伝子導入効率の測定
実施例３−（７）と同様の方法で行った。その結果を表７に示す。表７はそれぞれ１０ＨＰＧＭ培地を用いて１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表７に示すように、ヒト血清含有培地を用いた遺伝子導入も可能であることが示された。ヒト血清含有培地を用いた遺伝子導入においても、レトロネクチン法の方がポリブレン法よりも導入効率が高く、レトロネクチンの有用性が示された。

実施例６前培養条件が異なるヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入
（１）細胞の前培養
実施例３−（１）と同様の方法で行った。ただし前培養の際、細胞を１２．５ｃｍ^２フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３１０７）に約１３０００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２、２５ｃｍ^２フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製、３５３１０８）に約６６００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２、７５ｃｍ^２フラスコに約２２００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２の３種の条件で播種した。更に、３種それぞれの条件について、約７２時間培養を行った細胞と、約４８時間の培養後に一度細胞をはがして回収し、その一部を同じ面積のフラスコに再度ほぼ同じ細胞密度で播種して約２４時間培養した細胞、の２種を調製し、遺伝子導入に使用した。

（３）ウイルスベクター溶液の調製
調製例２で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（産生細胞Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞、トランスフェクション後７２時間後に回収）を３７℃水浴中で急速溶解し、ＰＧＭ培地により１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈して実験に供した。

（４）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（５）と同様の方法で行った。

（５）遺伝子導入効率の測定
実施例３−（７）と同様の方法で行った。その結果を表８に示す。表８は前培養の条件が異なる細胞について、１０倍希釈、４０倍希釈、１６０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、レトロネクチンＳＮ法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表８に示すように、前培養の条件によって導入効率に変化が生じることが示された。細胞の培養や継代の条件を至適化することで、レトロネクチン法における導入効率を更に上昇させることが可能であると示された。

実施例７内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入
（１）細胞の前培養
内蔵脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、ＰＴ５００５）は、購入後解凍して、ＰＧＭ培地と２２５ｃｍ^２フラスコを用いて、約４８時間の培養を行い、細胞数を増加させてから、９０％ＦＢＳ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、再び液体窒素中にて保存した。

遺伝子導入時には、これら保存前駆脂肪細胞を３７℃水浴中にて急速溶解し、ＰＧＭ培地で洗浄後、７５ｃｍ^２フラスコに約３７００ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｃｍ^２の条件で播種し、約４８時間の培養を行った。培養した細胞はトリプシン・ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、一部は後述の（６）のポリブレン法の実験に使用し、残りは再び７５ｃｍ^２フラスコに播種して、更に約２４時間の培養を行った後、後述の（４）（５）のレトロネクチン法の実験に供した。

（３）ウイルスベクター溶液の調製
調製例２で調製したＧＦＰ発現レトロウイルスベクター（産生細胞２９３Ｔ／１７細胞、トランスフェクション後４８時間に回収）を３７℃水浴中で急速溶解し、ＰＧＭ培地により１０倍、４０倍に希釈して実験に供した。

（４）レトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
実施例３−（４）と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（１）の内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を使用した。

（５）レトロネクチンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（５）と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（１）の内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を使用した。

（６）ポリブレンＳＮ法による遺伝子導入
実施例３−（６）と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（１）の内臓脂肪のヒト前駆脂肪細胞を使用した。

（７）遺伝子導入効率の測定
実施例３−（７）と同様の方法で行った。その結果を表９に示す。表はそれぞれ１０倍希釈、４０倍希釈したＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＧＦＰ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表９に示すように、内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を対象とした時も、皮下脂肪由来の細胞の時と同様の遺伝子導入が可能であることが示された。加えてレトロネクチンｂｉｎｄｉｎｇ法、レトロネクチンＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったポリブレンＳＮ法より高い遺伝子導入効率を示し、レトロネクチンの有用性が示された。

調製例３ＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクターの調製
ｐＤＯＮ−ＡＩプラスミドのマルチクローニングサイトに、プラスミドｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、６３２４４８）に挿入されている蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎをコードする遺伝子を挿入し、プラスミドｐＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎを作製した。ＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクターの調製は、前記のｐＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎを用いて、調製例１と同様の方法で行った。回収したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクターは−８０℃で保存し、使用前に３７℃水浴中で急速溶解し、ＰＧＭ培地によって１０倍希釈、１００倍希釈して実験に供した。

実施例８ＣＨ−２７１による遺伝子導入
（１）細胞の前培養
実施例３−（１）と同様の方法で皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を前培養し、以下の実験に使用した。

（２）ＣＨ−２７１の培養プレートへの固定化
実施例３−（２）と同様の方法で行った。ただしレトロネクチンではなく、ＣＨ−２７１を固定化した。その際、固定化に使用する溶液中のＣＨ−２７１の濃度は７７μｇ／ｍｌとした。

（３）ＣＨ−２７１ｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
調製例３で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液と、（２）で調製したＣＨ−２７１固定化培養プレートを用いて、実施例３−（４）と同様の方法で行った。

（４）ＣＨ−２７１ＳＮ法による遺伝子導入
調製例３で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液と、（２）で調製したＣＨ−２７１固定化培養プレートを用いて、実施例３−（５）と同様の方法で行った。

（５）プロタミンＳＮ法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンやＣＨ−２７１等のポリペプチドを用いない、プロタミンＳＮ法により遺伝子導入を行った。（１）で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＧＭ培地に懸濁し、２００μＬずつ４８穴細胞培養用プレートに播種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一晩培養した。その後、培養上清を除去し、調製例３で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液に、終濃度４μｇ／ｍＬとなるようにノボ硫酸プロタミン（持田製薬社製）を添加してから、２００μＬずつ各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養上清を除去して、新たにＰＧＭ培地を各ウエルに２００μＬずつ添加し、さらに３日間培養した後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て２連で行った。

（６）遺伝子導入効率の測定
（３）、（４）、（５）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の比率を測定した。その結果を表１０に示す。表１０はそれぞれＰＧＭ培地で１０倍希釈、１００倍希釈したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液を用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表１０に示すように、フィブロネクチン由来のレトロウイルス結合部位とＶＬＡ−５に結合しうる領域で構成されているＣＨ−２７１を用いた場合でも、レトロネクチンと同様に、ヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。また、ＣＨ−２７１ｂｉｎｄｉｎｇ法、ＣＨ−２７１ＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったプロタミン法よりも高い遺伝子導入効率が得られており、ＣＨ−２７１を用いた標的細胞とレトロウイルスベクターを共配置する導入法の有効性が示された。

実施例９Ｈ−２９６による遺伝子導入
（１）細胞の前培養
実施例３−（１）と同様の方法で皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を前培養した。ただし培地にはＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ−２（以下ＰＧＭ−２培地、Ｃａｍｂｒｅｘ社製；ＰＴ−８００２より調製）を用いた。

（２）Ｈ−２９６の培養プレートへの固定化
実施例３−（２）と同様の方法で行った。ただしレトロネクチンではなく、Ｈ−２９６を固定化した。その際、固定化に使用する溶液中のＨ−２９６の濃度は１００μｇ／ｍｌとした。

（３）Ｈ−２９６ｂｉｎｄｉｎｇ法による遺伝子導入
調製例３で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液と、（２）で調製したＨ−２９６固定化培養プレートを用いて、実施例３−（４）と同様の方法で行った。ただし培地にはＰＧＭ−２培地を使用した。

（４）Ｈ−２９６ＳＮ法による遺伝子導入
調製例３で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液と、（２）で調製したＨ−２９６固定化培養プレートを用いて、実施例３−（５）と同様の方法で行った。ただし培地にはＰＧＭ−２培地を使用した。

（５）プロタミンＳＮ法による遺伝子導入
実施例８−（５）と同様の方法で行った。ただし培地にはＰＧＭ−２培地を使用した。

（６）遺伝子導入効率の測定
（３）、（４）、（５）の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例１−（５）と同様の方法で、ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の比率を測定した。その結果を表１１に示す。表１１はそれぞれＰＧＭ−２培地で１０倍希釈、１００倍希釈したＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクター溶液を用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率（ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞比率）（％）を示したものである。

表１１に示すように、フィブロネクチン由来のレトロウイルス結合部位とＶＬＡ−４に結合しうる領域で構成されているＨ−２９６を用いた場合でも、レトロネクチンと同様に、ヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。また、Ｈ−２９６ｂｉｎｄｉｎｇ法、Ｈ−２９６ＳＮ法のいずれにおいても、対照として行ったプロタミン法よりも高い遺伝子導入効率が得られており、Ｈ−２９６を用いた、標的細胞とレトロウイルスベクターを共配置する導入法の有効性が示された。

本発明によれば、脂肪細胞、前駆脂肪細胞に対して有用な遺伝子を高効率で導入することが可能となる。前記の、遺伝子導入された細胞は、疾病の治療や予防に有用な遺伝子産物を生物個体内で発現することが可能であることから、本発明により当該細胞の移植による遺伝子治療方法が提供される。

SEQ ID NO:4; Polypeptide having cell-binding domain and heparin-binding domains of
fibronectin.
SEQ ID NO:6; Polypeptide having cell-binding domain and heparin-binding domains of
fibronectin.

Claims

脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法であって、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの存在下に外来遺伝子を有するレトロウイルスベクターを脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする遺伝子導入方法。
レトロウイルスベクターが、複製能欠損レトロウイルスベクターである請求項１記載の方法。