KR20080016888A - 지방세포 또는 전구 지방세포로의 유전자 도입 방법 - Google Patents
지방세포 또는 전구 지방세포로의 유전자 도입 방법 Download PDFInfo
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Abstract
레트로바이러스 결합 부위와 표적세포 결합 부위를 동일 분자 중에 존재하는 물질 또는 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 물질과 표적세포 결합 부위를 갖는 다른 물질과의 혼합물의 존재 하에 외래 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터를 지방 세포 또는 지방 전구 세포에 감염시키는 공정을 포함하고, 여기에서 상기의 표적세포 결합 부위가 VLA-5에 결합할 수 있는 영역 및/또는 VLA-4에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방 세포 또는 지방 전구 세포로의 유전자 도입 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 의학, 세포 공학, 유전자 공학 등의 분야에 있어서 유용한 지방세포 또는 전구 지방세포에 고효율로 유전자를 도입하는 기술에 관한 것이다.
유전자 치료는 세포가 갖는 「유전 정보의 오류」에 기인하는 유전병이나 암 등의 난치병에 있어서, 올바른 유전자 정보의 부가로 그 세포의 기능을 수정하거나 세포가 본래 가지고 있지 않은 새로운 「보호 유전자」를 부가하거나 해당 병의 치료 또는 예방을 수행하는 행위이다.
유전자 치료에 있어서 치료용 유전자로서 사용되는 유전자는 통상 상기 유전자가 발현될 필요가 있는 조직, 장기에 도입된다. 예를 들면, 낭포성 섬유증환자의 호흡기 상피 세포에 CFTR 유전자를 도입하는 치료가 이에 해당된다. 한편, 유전자 발현이 그 조직, 장기와 관련되지 않는 경우도 있다. 예를 들면 혈장 중의 혈액 응고 인자인 제 VII 인자는 간장에서 생산되는 것으로 공지되어 있지만, 상기 인자를 코딩하는 유전자를 골격근 세포에 도입하여, 해당 세포에서 제 VII 인자를 생산시켜, 혈장 중에 공급하려고 하는 시도도 행해지고 있다(비특허 문헌 1).
후자와 같이, 목적의 유전자를 발현시키는 세포에 특별한 제약이 없는 경우에는 세포의 취급의 용이함 등을 고려하여 피유전자 도입 세포(표적 세포)를 선택할 수 있다. 예를 들면, 지방세포나 전구 지방세포는 채취, 배양, 개체로의 이식이 용이하여, 유전자 도입용 표적 세포로서 주목받고 있다(특허 문헌 1).
한편, 레트로 바이러스 벡터를 표적 세포로 고효율로 감염시키는 방법으로서 레트로 바이러스에 결합하는 기능성 물질의 존재 하에 표적 세포에 레트로 바이러스를 감염시키는 방법이 개발되고 있다(특허 문헌 2, 3, 4; 비특허 문헌 2). 이러한 방법에서는, 표적 세포에 결합하는 물질 또는 표적 세포 결합 부위를 갖는 물질이 사용되지만, 지방세포나 전구 지방세포에 있어서, 레트로 바이러스의 감염성을 높일 수 있을 것 같은 기능성 물질은 알려져 있지 않다.
특허 문헌 1: WO 03/106663
특허 문헌 2: WO 95/26200
특허 문헌 3: WO 97/18318
특허 문헌 4: WO 00/01836
비특허 문헌 1: Blood, 제101권, 제2963~2972 페이지(2003)
비특허 문헌 2: Nature Medicine, 제2권, 제876~882 페이지(1996)
발명의 개시
발명이 해결하려고 하는 과제
본 발명의 목적은 지방세포, 전구 지방세포에 효율적으로 외래 유전자를 도입하는 방법을 개발하여, 질환의 치료나 예방에 유효한 형질 전환 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 VLA-5 및/또는 VLA-4에 결합하는 영역을 갖는 기능성 물질을 사용하여 지방세포나 전구 지방세포와 레트로 바이러스 벡터를 공배치할 경우, 레트로 바이러스가 효율적으로 지방세포, 전구 지방세포로 감염하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 설명하자면, 본 발명은 지방세포 또는 전구 지방세포로의 유전자 도입 방법이며, 레트로 바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자 내에 갖는 물질 또는 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 물질과 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 물질과의 혼합물의 존재 하에 외래 유전자를 갖는 레트로 바이러스 벡터를 지방세포 또는 전구 지방세포로 감염시키는 공정을 포함하고, 여기에서, 상기 표적 세포 결합 부위가 VLA-5에 결합할 수 있는 영역 및/또는 VLA-4에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용되는 레트로 바이러스 결합 부위로서는, 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 부위, 폴리리신, DEAE덱스트란으로부터 선택되는 물질로부터 유래하는 레트로 바이러스 결합 부위가 예시된다.
본 발명에는 피브로넥틴 유래의 VLA-5 및/또는 VLA-4의 결합 영역인 표적 세포 결합 부위를 사용할 수 있다. 상기 표적 세포 결합 부위를 가지고, 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 물질로서는 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열 뿐만아니라 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 3 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 예시된다.
본 발명에 사용되는 레트로 바이러스 벡터는 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터라도 무방하다.
발명의 효과
본 발명에 의하면, 유용한 외래 유전자를 인위적으로 도입한 지방세포, 전구 지방세포를 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다. 해당 세포는 여러 가지의 질환 치료에 이용할 수 있으므로, 의료상으로 특히 유용하다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명은 레트로 바이러스 벡터와 지방세포 또는 전구 지방세포를 공배치시키는 것으로, 레트로 바이러스 벡터에 의한 상기 세포로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에는 레트로 바이러스 결합 부위와 지방세포, 전구 지방세포 결합 부위를 동일 분자 중에 갖는 물질, 또는 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 물질과 지방세포 결합 부위를 갖는 다른 물질과의 혼합물을 사용할 수 있다.
상기의 레트로 바이러스 결합 부위로서는, 레트로 바이러스 벡터에 결합하는 활성을 갖고 있는 것이라면 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들면 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 부위, 폴리리신, DEAE 덱스트란 등을 사용할 수 있다. 특히 매우 적합하게는, 서열 번호 1(H-271)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래되는 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인 유래의 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
또한, 지방세포, 전구 지방세포와의 결합 부위로서는, VLA-5 및/또는 VLA-4에 결합하는 영역을 포함한 물질을 사용할 수 있다. 상기 영역의 유래에도 특별한 한정은 없고, 공지의 VLA-5 또는 VLA-4의 리간드나, VLA-5 또는 VLA-4를 인식하는 항체를 사용할 수 있다. 매우 적합하게는 피브로넥틴 유래의 VLA-5 또는 VLA-4 결합 부위를 사용할 수 있고, 각각 서열 번호 2(C-274) 기재의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 3(CS-1) 기재의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 예시된다.
본 발명에는, 상기 레트로 바이러스 결합 부위와 지방세포 또는 전구 지방세포 결합 부위의 양쪽 모두를 갖는 기능성 물질을 사용해도 무방하고, 레트로 바이러스 결합 부위를 포함하는 기능성 물질과 지방세포 또는 전구 지방세포 결합 부위를 갖는 다른 기능성 물질의 혼합물을 사용해도 무방하다. 특히 매우 적합한 구체예로서는, 피브로넥틴 유래의 재조합 폴리펩티드, 예를 들면 서열 번호 1, 2, 3에 나타낸 아미노산 서열의 모두를 갖고 있는 CH-296(서열 번호 4), 서열 번호 1, 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 있는 H-296(서열 번호 5)나 서열 번호 1, 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 있는 CH-271(서열 번호 6)이 사용된다. 또한, 예를 들면 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩티드인 H-271과 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩티드인 C-274와의 혼합물을 사용해도 무방하다. 상기CH-296, H-296, CH-271, H-271, C-274는 J. Biochem., 제110권, 제284~291페이지 (1991)의 기재에 근거해 제작할 수 있다. 게다가 CH-296은 레트로넥틴(등록상표)의 상품명으로 시판되고 있다(다카라 바이오 사 제품).
상기 기능성 물질의 사용 방법에도 특별한 한정은 없지만, 예를 들면, 세포로의 레트로 바이러스 벡터 감염 조작에 사용되는 용기 표면을 해당 기능성 물질로 피복하여 사용할 수 있다. 상기 피복 조작에는 공지의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 레트로 바이러스 벡터에는 특별한 한정은 없다. 유전자 도입을 목적으로 하는 경우, 통상, 인위적으로 변경된 재조합 레트로 바이러스, 즉 레트로 바이러스 벡터가 본 발명에 사용된다. 특히, 무제한 감염, 유전자 도입을 방지하는 관점으로부터는 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터가 매우 적합하다. 해당 벡터는 감염된 세포 중에서 자기 복제를 할 수 없도록 복제능을 결손시킴으로써, 비병원성이다. 이러한 벡터는 척추동물 세포, 특히, 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에 침입하여, 그 염색체 DNA 중으로, 벡터에 삽입된 외래 유전자를 안정적으로 도입할 수 있다. 공지의 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터로서는, MFG 벡터나 α-SGC 벡터(국제 공개 제92/07943호 팜플렛), pBabe[Nucleic Acids Res earch, 제18권, 제3587~3596페이지(1990)], pLXIN(크로텍크 사 제품), pDON-AI(다카라 바이오 사 제품) 등의 레트로 바이러스 벡터, 렌치 바이러스 벡터[인간 면역 부전 바 이러스(HIV) 유래 벡터, 원숭이 면역 부전 바이러스(SIV) 유래 벡터 등] 또는 이들을 변형시킨 벡터가 예시된다.
상기 레트로 바이러스 벡터에 보유시키는 외래 유전자에는 특별한 한정은 없고, 목적의 세포로 발현시키는 것이 바람직한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, 폴리펩티드(효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 디코이, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 유전자가 예시된다. 유전자 치료를 목적으로 본 발명이 실시되는 경우, 질환의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 코딩하는 유전자가 표적 세포로 도입된다. 지방세포 또는 전구 지방세포를 표적 세포로 하는 본 발명에 있어서, 도입하는 유전자로서는, 세포에 의해 생산된 후, 세포 외로 이행(예를 들면 혈관 내를 순환)하여 작용을 나타내는 폴리펩티드, 예를 들면 분비 효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 등을 코딩하는 것이 매우 적합하다.
본 발명에서, 상기 외래 유전자는 적당한 프로모터, 예를 들면, 레트로 바이러스 벡터 중에 존재하는 LTR의 프로모터나 외래 프로모터의 제어 하에서, 레트로 바이러스 벡터 내에 삽입해 사용하는 것이 가능하다. 또한, 외래 유전자의 전사를 달성하기 위해서는 프로모터 및 전사 개시 부위와 함께 다른 조절 요소, 예를 들면, 인핸서 서열이 벡터 내에 존재하고 있어도 무방하다. 게다가 바람직하게 도입된 유전자는 그 하류에 종결 서열을 함유할 수 있다. 게다가 유전자가 도입된 세포의 선별을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자(예를 들면 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, β-갈락토시다아제나 루시퍼라아제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자, 수용체 단백질을 코딩하는 유전자 등)를 갖고 있어도 무방하다.
상기 레트로 바이러스 벡터는 공지의 방법으로 제조하여, 본 발명에 사용할 수 있다. 제조 방법에 특별한 한정은 없고, 사용되는 레트로 바이러스 벡터에 적절한 레트로 바이러스 생산 세포를 배양하고, 그 배양 상청액을 채취해 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 레트로 바이러스 생산 세포는 안정적으로 레트로 바이러스 입자를 상청액 중에 생산하는 것, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 트랜스팩션에 의해 한시적으로 레트로 바이러스 입자를 생산하는 것이어도 상관없다.
상기의 레트로 바이러스 생산 세포의 제작에는 공지의 패키징 세포주, 예를 들면 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86이나 GP+envAm-12 (미국 특허 제 5,278,056호), Psi-Crip[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제85권, 제6460~6464페이지(1988)]등을 사용해도 무방하다. 또한, 트랜스팩션 효율이 높은 293 세포나 293T/17 세포, G3T-hi 세포를 이용하여 레트로 바이러스 생산 세포를 제작할 수도 있다.
본 발명에는, 해당 레트로 바이러스 벡터가 유래되는 게놈과는 다른 바이러스 유래의 피막을 갖는 슈도타입(pseudtyped) 패키징에 의해 제작된 레트로 바이러스도 사용할 수 있다. 예를 들면 모로니마우스 백혈병 바이러스(MoMLV), 테나가잘 백혈병 바이러스(GaLV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 고양이 내재성 바이러스(feline endogenous virus) 유래의 피막이나 피막으로서 기능할 수 있는 단백질을 갖는 슈도타입 레트로 바이러스를 사용할 수 있다. 게다가 당쇄합성에 관여하 는 효소 유전자 등을 도입한 레트로 바이러스 생산 세포를 이용하여 제작된 당쇄수식을 받은 단백질을 그 표면에 갖는 레트로 바이러스 벡터도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 표적 세포로는 성숙 지방세포(백색 지방세포, 갈색 지방세포 등) 뿐만 아니라, 지방세포로 분화할 수 있는 전구 지방세포에 해당하는 세포를 사용할 수 있다. 전구 지방세포로는 직접 지방세포로 분화할 수 있는 세포 외, 지방세포를 포함한 다종의 세포로의 분화능을 유지하고 있는 중간엽간세포(mesenchymal stem cell)나 간질계 세포(stromal cell)가 포함된다. 상기 각 세포는 인간 또는 비인간포유동물의 지방조직 등으로부터 채취한 초기 배양 세포일 수도 있고, 주화된 배양 세포주일 수도 있다. 지방조직의 채취원으로서는 피하지방이나 내장 지방이 예시되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 지방조직은 채취되는 것에 의해 개체에게 주는 기능 장해의 우려가 작은 것이 표적 세포의 채취원으로서 매우 적합하다. 또한, 중간엽간세포나 간질계 세포는 골수나 그 외의 조직에서 채취할 수 있다.
상기의 기능성 물질의 존재 하에, 지방세포나 전구 지방세포로 레트로 바이러스 벡터를 감염시킴으로써 유전자가 도입된 지방세포, 전구 지방세포를 효율적으로 수득할 수 있다. 또한, 전구 지방세포에 상기 방법으로, 유전자 도입을 실시할 경우, 수득한 유전자 도입 세포를 공지의 방법으로 지방세포로 분화시켜, 유전자가 도입된 지방세포를 수득할 수도 있다. 게다가 유전자가 도입된 전구 지방세포를 생체 내에 이식하여 지방세포로의 분화를 유도할 수 있다.
특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 상기 기능성 물질로 표면이 피복된 용기 중에서 레트로 바이러스 벡터를 세포로의 감염을 실시함으로써, 본 발명을 수행할 수 있다. 상기 용기는 세포의 유지, 배양에 사용 가능한 것이면 특별한 한정은 없고, 샬레, 세포 배양용 플레이트, 플라스크, 세포 배양용 가방 등을 사용할 수 있다. 용기 표면에 기능성 물질의 고정화는 사용하는 기능성 물질에 적절한 공지의 방법에 따라 실시할 수 있고, 예를 들면 레트로넥틴은 멸균 증류수, 완충액 또는 생리 식염수 등에 용해한 상태로 고정화에 사용할 수 있다.
레트로 바이러스 벡터의 감염의 방법은 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 하기와 같은 2개의 방법이 예시된다.
(1) 기능성 물질로 피복된 용기 중에 지방세포 또는 전구 지방세포와 레트로 바이러스 벡터(예를 들면 레트로 바이러스 생산 세포 상청액)를 첨가하고, 배양한다.
(2) 기능성 물질로 피복된 용기 중에 레트로 바이러스 벡터를 첨가해 배양 하고, 이 용기를 세정해 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 불순물 등을 제외한 후, 지방세포 또는 전구 지방세포를 첨가해 배양한다.
후자는 레트로 바이러스 생산 세포에 존재하는 가능성이 있는 감염 저해 물질을 제거할 수 있는 것이 특징이지만, 반드시 이 방법으로 실시할 필요는 없다. 감염 방법은 사용하는 벡터나 세포에 따라 상기의 방법, 또는 그 이외의 방법에서 적절한 것을 선택할 수 있다.
레트로 바이러스 벡터와 함께 배양 중인 세포는 필요에 따라 배지의 교환이 나 새로운 벡터의 첨가를 실시하면서 배양한다. 배양 완료후, 용기 중의 세포를 회수하고, 필요에 따라서 세정하여, 여러 가지의 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 유전자가 도입된 세포가 전구 지방세포인 경우에는, 세포를 그대로 유지할 뿐만 아니라, 성숙한 세포로의 분화를 유도해도 무방하다. 예를 들면, 중간엽간세포는 적절한 성장 인자, 분화 유도 물질을 첨가하여 배양함으로써, 성숙한 지방세포로 분화시킬 수 있다.
표적 세포의 배양 및 레트로 바이러스 벡터의 감염에는, 적절한 세포 배양용의 배지를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면 시판되는 배지나, 이것을 변형한 것을 사용할 수 있다. 또한 상기 배지는 성장 인자, 세포 증식 인자 등의 성분을 포함하고 있어도 무방하다.
본 발명에서, 임의의 레트로 바이러스 벡터의 감염에 제공된 세포에서 유전자가 도입된 세포만을 선택할 수 있다. 이 조작은 도입된 외래 유전자, 예를 들면, 상기의 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 그 유전자의 특징에 따른 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.
이렇게 하여 수득한 유전자가 도입된 세포는 인간 또는 비인간포유동물에 이식하여 도입된 유전자를 발현시켜, 원하는 작용, 예를 들면 질환에 대한 치료 효과나 예방 효과를 발휘시킬 수 있다. 통상, 유전자가 도입된 지방세포나 전구 지방세포는 피하 조직이나 지방조직 등에 이식되지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이식은 세포 현탁액을 원하는 부위에 주사하는 방법이나 외과적으로 절개한 목적 부위에 세포를 이식하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
상기의 구체예에서, 표적 세포가 되는 지방세포 또는 전구 지방세포의 증여자는 매우 적합하게는 수령자 자신이다. 그러나, 조직 적합성 항원의 일치도가 높은 경우에는 자신 유래가 아닌 유전자 도입 세포를 이식하는 일도 가능하다.
하기의 실시예로 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시 예의 범위에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예
: 1
GFP
발현
레트로
바이러스 벡터의 제조
플라스미드 pQBI25(Quantum Biotechnologies Inc. 사 제품)에 삽입되어 있는 Red-shift Green Fluorescent Protein(이하 GFP로 약칭한다)를 코딩하는 유전자를 pDON-AI플라스미드(다카라 바이오 사 제품, 3650)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pDON-GFP를 작제하였다. GFP 발현 레트로 바이러스 벡터의 제조는 Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오 사 제품, 6161)로, 293T/17 세포(ATCC CRL-11268)와 상기 pDON-GFP를 이용하여, 키트 내에 첨가된 프로토콜에 따라 수행하였다. 또한, GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(배양 상청액)는 트랜스팩션 48 시간 후에 회수한 것(실시예 1에서 사용) 및 72 시간 후에 회수한 것(실시예 2에서 사용)의 2종류를 제조하여 하기의 실험에 사용하였다. 회수한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터는 80℃에서 보존하고, 사용 전에 37℃ 수 중에서 급속 용해하여 사용하였다. 또한 실시예 1의 실험에서는 Preadipocyte Growth Medium(이하 PGM 배지, Cambrex 사 제품 B8000으로 제조)으로 10배, 40배, 160배 희석한 상청액을, 실시예 2의 실험에서는 10% 우태아 혈청(FBS : Cambrex 사 제품)을 함유한 둘베코코 개량 이글 배지(시그마 사 제품, D6046)(이하 DMEM 배지)로 4배, 16배, 64배 희석한 상청액을 각각 사용하였다.
실시예
1: 인간 전구 지방세포로
레트로넥틴을
이용한 유전자 도입
(1)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
비처리한 24 웰 배양 플레이트(Becton-Dickinson 사 제품, 351147)의 각각의 웰에 20 ㎍/mL이 되도록 인산 완충 생리 식염수(PBS)에 용해시킨 레트로넥틴(등록상표, 다카라 바이오 사 제품, TI00A) 용액을 500 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 고정화시켰다. 그 후, 각각의 웰에서 용액을 제거하고, 2% 우혈청알부민을 함유하는 PBS를 500 ㎕씩 첨가한 다음 실온에서 30분 이상 방치하였다. 이렇게 하여 작제된 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트를 PBS로 1회 세정한 후에 각각의 실험에 제공하였다.
(2)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
제조예 1에 따라 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액을 (1)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 500 ㎕씩 첨가하고 CO2 배양기 내에서 32℃로 6 시간 배양하였다. 그 후, 각각의 웰에서 상청액을 제거하고PBS로 1회 세정 후, 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지에 현탁시킨 인간 전구 지 방세포(Cambrex 사 제품, PT5020)를 500 ㎕씩 각각의 웰에 접종하여, CO2 배양기 내에서 37℃로 4일간 배양하였다. 배양 완료 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(3)
레트로넥틴
SN
법에 의한 유전자 도입
4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지에 현탁시킨 인간 전구 지방세포를 500 ㎕씩 튜브에 넣고, 1,500 × g으로 5분간 실온으로 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 튜브에, 제조예 1에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액을 500 ㎕씩 첨가하고 침전(세포)을 현탁시켰다. 이 현탁액을 (1)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서 37℃로 4일간 배양하였다. 배양 완료후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(4)
폴리브렌
SN법에 의한
유전자 도입
대조군으로서 레트로넥틴을 이용하지 않는 폴리브렌 SN법에 의한 유전자 도입을 실시하였다. 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지에 현탁시킨 인간 전구 지방세포를 500 ㎕씩 24 웰 배양 플레이트(Becton-Dickinson 사 제품, 353047)에 접종하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 그 후, 배양 상청액을 제거하고, 제조예 1에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액에 최종 농도 8 ㎍/mL이 되도록 폴리브렌(헥사디메틸렌 브로마이드, Aldrich 사 제품, 10768-9) 수 용액을 첨가한 것을 500 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 배양 상청액을 제거하고 새로운 PGM 배지를 각각의 웰에 500 ㎕씩 첨가하고 다시 3일간 배양한 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(5) 유전자 도입 효율의 측정
(2), (3), (4)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, GFP 발현 세포의 비율을 유세포 분석기(Cytomics FC500, Beckman Coulter 사 제품)로 측정하여 유전자 도입 효율을 평가하였다. 즉, 배양 후의 각 세포를 트립신· EDTA 용액(Gibco-BRL 사 제품, 25200-056)으로 배양 플레이트로부터 분리한 후, PGM 배지로 현탁시켜, 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1은 각각 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 40배 희석 | 160배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 73.15 | 63.96 | 34.26 |
| 레트로넥틴 SN법 | 82.09 | 70.98 | 43.31 |
| 폴리브렌 SN법 | 55.51 | 45.63 | 22.33 |
표 1에 나타내었듯이, 레트로넥틴 결합법, 레트로넥틴 SN법 모두 대조군으로서 수행한 폴리브렌 SN법보다 높은 유전자 도입 효율을 나타내므로, 지방세포로의 유전자 도입에 있어서 레트로넥틴의 유용성을 나타내었다.
실시예
2: 마우스 전구 지방세포로의
레트로넥틴을
이용한 유전자 도입
(1)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
실시예 1-(1)과 같은 방법으로 수행하였다.
(2)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
제조예 1에서 제조한 각각의 희석 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 (1)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 500 ㎕씩 첨가하고 CO2 배양기 내에서, 32℃로, 6 시간 배양하였다. 그 후, 각각의 웰에서 상청액을 제거하고 PBS로 1회 세정 후, 각각의 웰에 4 × 104 세포/mL이 되도록 DMEM 배지로 현탁시킨 마우스 전구 지방세포주 3T3-L1(ATCC CCL-92.1)을 500 ㎕씩 접종하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 1일간 배양하였다. 배양 상청액을 제거하고 새로운 DMEM 배지를 각각의 웰에 500 ㎕씩 첨가한 다음 CO2 배양기 내에서, 37℃로 3일간 배양 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(3)
레트로넥틴
SN법에 의한
유전자 도입
4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지에 현탁시킨 3T3-L1세포를 500 ㎕씩 튜브에 넣고, 1,500 × g으로, 5분간 실온에서 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 튜브에, 제조예 1에서, 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액을 500 ㎕씩 첨가하고, 침전(세포)을 현탁시켰다. 이 현탁액을 (1)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 1일간 배양하였다. 배양 상청액을 제거하고 새로운 DMEM 배지를 각각의 웰에 500 ㎕씩 첨가한 다음 CO2 배양기 내에서, 37℃로 3일간 배양 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(4)
폴리브렌
SN법에 의한
유전자 도입
대조군으로서 레트로넥틴을 이용하지 않는 폴리브렌 SN법에 의한 유전자 도입을 실시하였다. 세포로 3T3-L1세포, 배지로 DMEM 배지를 사용한 것 외에는, 실시예 1-(4)와 같은 방법으로 수행하였다.
(5) 유전자 도입 효율의 측정
(2), (3), (4)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, GFP 발현 세포의 비율을 유세포 분석기로 측정하여, 유전자 도입 효율을 평가하였다. 즉, 배양 후의 각 세포를 트립신·EDTA 용액으로 배양 플레이트로부터 분리한 후, DMEM 배지로 현탁시켜, 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2 는 각각 4배 희석, 16배 희석, 64배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용해 각각의 방법으로, 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 4배 희석 | 16배 희석 | 64배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 71.68 | 49.79 | 17.33 |
| 레트로넥틴 SN법 | 54.07 | 45.74 | 21.86 |
| 폴리브렌 SN법 | 16.60 | 23.05 | 12.51 |
표 2에 나타내었듯이, 레트로넥틴 결합법, 레트로넥틴 SN법의 모두는, 대조군으로서 수행한 폴리브렌 SN법보다 높은 유전자 도입 효율을 나타내므로, 레트로넥틴의 유용성을 나타내었다.
제조예 2: 생산 세포가 다른 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터의 제조
제조예 1과 같은 방법으로, GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 제조하였다. 생산 세포로서 293T/17 세포 외에, G3T-hi세포(다카라 바이오 사 제품, 6163)도 사용하였다. 각각의 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(배양 상청액)는, 트랜스팩션 48 시간 후에 회수한 것과 72 시간 후에 회수한 2 종류를 제조하고, 회수 후에는 각각 -80℃에서 동결보존 하였다.
실시예
3: 유전자 도입 세포의 분화 유도
(1) 세포의
전배양
피하지방 유래의 인간 전구 지방세포(Cambrex 사 제품, PT5020)를 구입 후 해동하고, PGM 배지와 225 ㎠ 플라스크(CORNING 사 제품, 431082)를 이용해, 약 48 시간의 배양을 실시하여 세포 수를 증가시킨 다음, 90% FBS/10% DMSO(SIGMA 사 제품)로 구성된 보존액에 현탁시키고, 다시 액체 질소 중에서 보존하였다.
유전자 도입시에는, 보존 인간 전구 지방세포를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 세정한 후, 175 ㎠ 플라스크(Becton-Dickinson 사 제품, 353028)에 약 4000 세포/0.2 mL/㎠의 조건으로 접종하고, 약 48 시간의 배양을 실시하였다. 배양한 세포는 트립신·EDTA 용액을 이용하여 회수하고, 일부는 후술의 (6)의 폴리브렌법의 실험에 사용하고, 나머지는 다시, 175 ㎠ 플라스크에 접종하여, 다시 약 24 시간의 배양을 실시한 후, 후술의 (4)(5)의 레트로넥틴법의 실험에 제공하였다.
(2)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
실시예 1-(1)과 같은 방법으로 수행하였다. 다만 플레이트는 처리하지 않은 48 웰 배양 플레이트(Becton-Dickinson 사 제품, 351178)를 사용하였고, 웰에 첨가하는 레트로넥틴 용액의 양은 200 ㎕로 하였다.
(3) 바이러스 벡터 용액의 제조
제조예 2에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(생산 세포 293T/17 세포, 트랜스팩션 48 시간 후에 회수)를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 10배 희석, 40배 희석하여 실험에 제공하였다.
(4)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
(3)에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액을 (2)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 200 ㎕씩 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 32℃로 5 시간 배양하였다. 그 후, 각각의 웰에서 상청액을 제거하고 인산 완충 수용액으로 1회 세정한 후, (1)에서 전배양을 실시한 인간 전구 지방세포를 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지에 현탁시키고, 200 ㎕씩 각각의 웰에 접종, CO2 배양기 내에서, 37℃로 4일간 배양하였다. 배양 완료 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(5)
레트로넥틴
SN법에 의한
유전자 도입
(1)에서 전배양을 실시한 인간 전구 지방세포를 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지로 현탁시켜, 200 ㎕씩 튜브에 넣고, 약 1800 × g으로, 5분간, 실온에서 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 튜브에 (3)에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액을 200 ㎕씩 첨가하고, 침전(세포)을 현탁시켰다. 이 현탁액을 (2)에서 제조한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 4일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(6)
폴리브렌
SN
법에 의한 유전자 도입
대조군으로서 레트로넥틴을 이용하지 않는 폴리브렌 SN법에 의한 유전자 도입을 실시하였다. (1)에서 전배양을 실시한 인간 전구 지방세포를 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지로 현탁시켜, 200 ㎕씩 48 웰 세포 배양용 플레이트(Becton-Dickinson 사 제품, 3530 78)에 접종하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 그 후, 배양 상청액을 제거하고, (3)에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 희석액에 총 농도 8 ㎍/mL이 되도록 폴리브렌 수용액을 첨가한 것을 200 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 24 시간 배양하였다. 배양 상청액을 제거하고, 새로운 PGM 배지를 각각의 웰에 200 ㎕씩 첨가한 다음, 3일 동안 배양한 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(7) 유전자 도입 효율의 측정
(4), (5), (6)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, 실시예 1-(5)와 같은 방법으로 GFP 발현 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3은 각각 10배 희석, 40배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 40배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 45.17 | 40.55 |
| 레트로넥틴 SN법 | 42.66 | 38.68 |
| 폴리브렌 SN법 | 38.82 | 38.23 |
표 3에 나타내었듯이, 레트로넥틴 결합법, 레트로넥틴 SN법의 모두는, 대조군으로서 수행한 폴리브렌 SN법보다 높은 유전자 도입 효율을 나타내므로, 지방세포로의 유전자 도입에 있어서의 레트로넥틴의 유용성을 나타내었다.
(8) 유전자 도입 세포의 분화 유도 및 분화한 지방세포의 유전자 도입 효율의 측정
유전자 도입을 실시한 인간 전구 지방세포가 지방세포로의 분화능을 유지하고 있는지를 평가하기 위하여, 도입 세포의 분화 유도를 실시하였다. (4), (5), (6)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, 배양 상청액을 제거한 후, 지방세포 분화 배지(Adipocyte Differentiation Medium; 이하 ADM 배지로 약칭함, Preadipocyte Growth Medium BulletKit, Cambrex 사 제품, PT8000으로부터 제조)를 각각의 웰에 250 ㎕씩 첨가하고, 각각의 웰에 동량의 250 ㎕ PGM 배지를 첨가하여 혼합하고, 7일간의 배양을 실시하는 것으로 분화 유도를 실시하였다. 분화 유도 후의 지방세포는 (7)에서와 같이 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4는 각각 10배 희석, 40배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여, 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시한 후, 분화 유도에 의해 지방세포로 분화한 세포의 GFP 발현 세포 비율(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 40배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 47.60 | 40.09 |
| 레트로넥틴 SN법 | 45.44 | 37.96 |
| 폴리브렌 SN법 | 35.92 | 34.65 |
표 4에 나타내었듯이, 어떠한 방법으로든지 유전자가 도입된 세포에 대하여, GFP 발현 세포의 비율은 표 3의 유전자 도입 효율의 값과 비교하면 변화는 거의 볼 수 없다. 즉, 전구 지방세포로 도입된 유전자는 지방세포에 분화한 후에도 안정적으로 유지되고 있는 것이 확인되었다.
(9)
트리글리세리드
축적량 측정에 의한 지방세포로의
분화능의
평가
분화 유도 후 유전자 도입 세포의 트리글리세리드 축적량을 측정하는 것으로 그 분화능을 평가하였다. (4), (5), (6)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포 및 대조군으로서 바이러스를 포함하지 않는 배지에서 유전자 도입 조작을 실시한 세포에 대하여, (8)에서와 같은 방법으로 분화 유도를 실시한 후, 배양 상청액을 제거하고, 인산 완충 수용액으로 2회 세정하고, 이소프로판올과 헥산을2:3의 비율로 혼합한 용액을 각각의 웰에 250 ㎕씩 첨가하였다. 실온에서 30분간 방치한 후 상청액을 회수하고, 다시 이와 같은 방식으로 이소프로판올과 헥산의 혼합액을 첨가하고, 방치, 회수하는 조작을 반복하였다. 회수한 혼합액으로부터 농축건조에 의해 용매를 제거하고 수득한 트리글리세리드를 디메틸포름아미드(와코 순약공업 사 제품, 047-25475)에 재차 용해하였다. 이렇게 하여 수득한 시료를 트리글리세리드 E-Test Wako(와코 순약공업 사 제품,432-40201)와 반응시킨 후, 흡광 플레이트 리더(MicroReader4, Hyperion 사 제품)를 이용하여 570 nm의 흡광도를 측정하여, 시료 중의 트리글리세리드 함유량을 산출하였다.
트리글리세리드 회수 후의 세포로부터, 1 N 수산화 나트륨(나카라이테스크 사 제품, 31 511-05보다 제조) 용액을 각각의 웰에 250 ㎕씩 첨가하고, 30분간 실온에 방치하여 단백질을 회수하였다. 회수한 단백질을 Micro BCA Protein Ass ay Reagent Kit(PIERCE 사 제품, 23235)를 이용하여 농도를 산출하였다. 각 시료의 트리글리세리드 축적량을 단백질 양으로 나누는 것으로 보정하여 단위 단백질 양 당 트리글리세리드 양을 구하였다. 이러한 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5는 바이러스를 포함하지 않는 PGM 배지(mock), 10배 희석, 40배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터 용액을 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시한 세포에 대하여, 분화 유도 후 각각의 웰의 트리글리세리드 축적량(TG로 표기, 단위는 ㎍), 단백질 양(protein으로 표기, 단위는 ㎍) 및, 단위 단백질 양 당 트리글리세리드 양(TG / protein으로 표기, 단위는 ㎍)을 나타낸 것이다.
| 도입 방법 | mock | 10배 희석 | 40배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | TG protein TG / protein | 31.39 73.57 0.43 | 30.50 66.08 0.46 | 24.54 65.81 0.37 |
| 레트로넥틴 SN법 | TG protein TG / protein | 27.67 67.26 0.41 | 25.51 64.74 0.39 | 27.82 65.97 0.42 |
| 폴리브렌 SN법 | TG protein TG / protein | 30.12 68.60 0.45 | 31.46 69.29 0.46 | 31.61 84.23 0.38 |
표 5에 나타내었듯이, 모든 방법에 대하여 분화 유도 후, 유전자 도입 세포에서 트리글리세리드의 축적이 나타났다. 이 때, mock 세포와 레트로넥틴을 이용하여 유전자 도입된 세포를 비교하여도 큰 차이는 볼 수 없었다. 또한, 유전자 도입이 되어 있지 않은 인간 전구 지방세포에 같은 분화 유도를 실시하여 수득한 세포에서도 동일한 정도의 TG/protein 값을 수득하였다. 이와 같이, 유전자 도입에 의한 전구 지방세포의 분화능의 저하는 일어나지 않은 것으로 나타났다.
실시예
4: 다른 생산 세포로부터 제조한 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
실시예 3-(1)과 같은 방법으로 수행하였다.
(2)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다.
(3) 바이러스 벡터 용액의 제조
제조예 2에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석하여 실험에 제공하였다. GFP 발현 레트로 바이러스 벡터로 트랜스팩션한 293T/17 세포, G3T-hi세포를 각각 72 시간 배양한 후 회수한 배양 상청액을 실험에 제공하였다.
(4)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(4)와 같은 방법으로 수행하였다.
(5)
레트로넥틴
SN
법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다.
(6) 유전자 도입 효율의 측정
실시예 3-(7)과 같은 방법으로 수행하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 표 6은 각각 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석한 각종 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 도입 방법 | 생산세포 | 10배 희석 | 40배 희석 | 60배 희석 |
| 레트로넥틴 결합법 | 293T/17 G3T-hi | 44.01 51.13 | 34.16 45.96 | 13.02 28.78 |
| 레트로넥틴 SN법 | 293T/17 G3T-hi | 36.99 55.28 | 26.01 52.95 | 11.81 34.45 |
표 6에 나타내었듯이, G3T-hi 세포를 이용하여 제조한 바이러스 벡터를 이용하여도, 레트로넥틴법에 의한 유전자 도입이 가능한 것으로 나타났다.
실시예
5: 인간 혈청 함유
PGM
배지를 이용한 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
실시예 3-(1)과 같은 방법으로 수행하였다. 다만, 전배양은 75 ㎠ 플라스크(Becton-Dickinson 사 제품, 353110)를 사용하고, 약 9000 세포/0.2 mL/㎠의 조건에서 접종하여 배양을 실시하였다.
(2)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다.
(3) 바이러스 벡터 용액의 제조
제조예 2에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(생산 세포 293T/17 세포, 트랜스팩션 72 시간 후 회수)를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, 10% FBS 대신으로 10% 인간 AB 혈청(Cambrex 사 제품)을 포함하는 PGM 배지(이하 10HPGM 배지라고 기재한다)로 10배, 40배, 160배 희석하여 실험에 제공하였다.
(4)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(4)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만, 배지로는 10HPGM 배지를 사용하였다.
(5)
레트로넥틴
SN법에 의한
유전자 도입
실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만, 배지로는 10HPGM 배지를 사용하였다.
(6)
폴리브렌
SN
법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(6)과 같은 방법으로 수행하였다. 다만, 배지로는 10HPGM 배지를 사용하였다
(7) 유전자 도입 효율의 측정
실시예 3-(7)과 같은 방법으로 수행하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7은 각각 10HPGM 배지를 이용하여 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 40배 희석 | 160배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 23.30 | 21.58 | 12.99 |
| 레트로넥틴 SN법 | 34.45 | 25.88 | 18.38 |
| 폴리브렌 SN법 | 11.45 | 9.08 | 3.27 |
표 7에 나타내었듯이, 인간 혈청 함유 배지를 이용한 유전자 도입도 가능하다. 인간 혈청 함유 배지를 이용한 유전자 도입에 있어서도, 레트로넥틴법이 폴리브렌법보다 도입 효율이 높으므로, 레트로넥틴의 유용성이 나타났다.
실시예
6:
전배양
조건이 다른 인간 전구 지방세포로의 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
실시예 3-(1)과 같은 방법으로 수행하였다. 다만 전배양 시, 세포를 12.5 ㎠ 플라스크(Becton-Dickinson 사 제품, 353107)에 약 13000 세포/0.2 mL/㎠, 25 ㎠ 플라스크(Becton-Dickinson 사 제품, 353108)에 약 6600 세포/0.2 mL/㎠, 75 ㎠ 플라스크에 약 2200 세포/0.2 mL/㎠의 3종류의 조건으로 접종하였다. 3종류의 조건에 있어서, 약 72 시간 배양을 실시한 세포와 약 48 시간의 배양 후에 한 번 세포를 분리하여 회수하고, 그 일부를 같은 면적의 플라스크에 재차 거의 같은 세포 밀도로 접종하여 약 24 시간 배양한 세포, 2 종류를 제조하여 유전자 도입에 사용하였다.
(2)
레트로넥틴을
배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다.
(3) 바이러스 벡터 용액의 제조
제조예 2에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(생산 세포 G3T-hi세포, 트랜스팩션 72 시간 후에 회수)를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석하여 실험에 제공하였다.
(4)
레트로넥틴
SN
법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다.
(5) 유전자 도입 효율의 측정
실시예 3-(7)과 같은 방법으로 수행하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다. 표 8은 전배양의 조건이 다른 세포에 있어서, 10배 희석, 40배 희석, 160배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여, 레트로넥틴 SN법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 전배양 조건 | 세포밀도 | 10배 희석 | 40배 희석 | 160배 희석 |
| 72 시간 배양 | 13000 세포/mL 6600 세포/mL 2200 세포/mL | 13.05 13.83 29.70 | 10.03 8.66 28.72 | 4.70 5.32 16.02 |
| 48 시간 후 계대 | 13000 세포/mL 6600 세포/mL 2200 세포/mL | 27.88 38.83 45.81 | 20.16 34.28 42.26 | 10.54 19.06 24.57 |
표 8에 나타내었듯이, 전배양의 조건에 의해 도입 효율에 변화가 생기는 것으로 나타났다. 세포의 배양이나 계대의 조건을 최적화하는 것으로 레트로넥틴법에 있어서 도입 효율을 더욱 상승시키는 것이 가능한 것으로 나타났다.
실시예
7: 내장 지방 유래의 인간 전구 지방세포로의 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
내장 지방 유래의 인간 전구 지방세포(Cambrex사 제품, PT5005)를 구입 후 해동하고, PGM 배지와 225 ㎠ 플라스크를 이용해, 약 48 시간의 배양을 실시하여, 세포 수를 증가시킨 다음, 90% FBS(Cambrex 사 제품)/10% DMSO(SIGMA 사 제품)로구성된 보존액에 현탁시킨 다음, 액체 질소 중에서 보존하였다.
유전자 도입시에는 보존 전구 지방세포를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PG M 배지로 세정한 후, 75 ㎠ 플라스크에 약 3700 세포/0.2 mL/㎠의 조건으로 접종하고, 약 48 시간의 배양을 실시하였다. 배양한 세포는 트립신·EDTA 용액을 이용하여 회수하고, 일부는 후술의 (6)의 폴리브렌법의 실험에 사용하고, 나머지는 다시 75 ㎠ 플라스크에 접종하여, 약 24 시간의 배양을 실시한 후, 후술의 (4)(5)의 레트로넥틴법의 실험에 제공하였다.
(2) 레트로넥틴을 배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다.
(3) 바이러스 벡터 용액의 제조
제조예 2에서 제조한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터(생산 세포 293T/17 세포, 트랜스팩션 48 시간 후에 회수)를 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 10배, 40배로 희석하여 실험에 제공하였다.
(4)
레트로넥틴
결합법에 의한 유전자 도입
실시예 3-(4)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 세포는 상기 (1)의 내장 지방 유래의 인간 전구 지방세포를 사용하였다.
(5)
레트로넥틴
SN법에 의한
유전자 도입
실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 세포는 상기 (1)의 내장 지방 유래의 인간 전구 지방세포를 사용하였다.
(6)
폴리브렌
SN법에 의한
유전자 도입
실시예 3-(6)과 같은 방법으로 수행하였다. 다만 세포는 상기 (1)의 내장 지방의 인간 전구 지방세포를 사용하였다.
(7) 유전자 도입 효율의 측정
실시예 3-(7)과 같은 방법으로 수행하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다. 표는 각각 10배 희석, 40배 희석한 GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(GFP 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 40배 희석 | |
| 레트로넥틴 결합법 | 61.19 | 53.27 |
| 레트로넥틴 SN법 | 65.47 | 59.57 |
| 폴리브렌 SN법 | 28.66 | 25.98 |
표 9에 나타내었듯이, 내장 지방 유래의 인간 전구 지방세포를 대상으로 할 경우에도, 피하지방 유래의 세포 시와 같은 유전자 도입이 가능한 것으로 나타났다. 레트로넥틴 결합법, 레트로넥틴 SN법의 모두는 대조군으로서 수행한 폴리브렌 SN법보다 높은 유전자 도입 효율을 나타내므로, 레트로넥틴의 유용성을 나타내었다.
제조예
3:
ZsGreen
발현 레트로 바이러스 벡터의 제조
pDON-AI플라스미드의 복수 클로닝 부위(multiple cloning site)에 플라스미드 pZsGreen1-N1(Clontech Laboratories 사 제품, 632448)에 삽입되어 있는 형광 단백질 ZsGreen을 코딩하는 유전자를 삽입하여, 플라스미드 pDON-ZsGreen을 작제하였다. ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터의 제조는 상기 pDON -ZsGreen을 이용하여, 제조예 1과 같은 방법으로 수행하였다. 회수한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터는 80℃로 보존하고, 사용 전에 37℃ 수 중에서 급속 용해하고, PGM 배지로 10배 희석, 100배 희석하여 실험에 제공하였다.
실시예
8: CH-271에 의한 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
실시예 3-(1)과 같은 방법으로 피하지방 유래의 인간 전구 지방세포를 전배양하여 이하의 실험에 사용하였다.
(2) CH-
271를
배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 레트로넥틴이 아닌, CH-271을 고정화시켰다. 이 때, 고정화에 사용하는 용액 중의 CH-271의 농도는 77 ㎍/㎖로 하였다.
(3) CH-271 결합법에 의한 유전자 도입
제조예 3에서 제조한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액과 (2)에서 제조한 CH-271 고정화 배양 플레이트를 이용하여 실시예 3-(4)와 같은 방법으로 수행하였다.
(4) CH-271
SN법에 의한
유전자 도입
제조예 3에서 제조한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액과 (2)에서 제조한 CH-271 고정화 배양 플레이트를 이용하여 실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다.
(5)
프로타민
SN법에 의한
유전자 도입
대조군으로서 레트로넥틴 또는 CH-271 등의 폴리펩티드를 이용하지 않는, 프로타민 SN법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. (1)에서 전배양을 실시한 인간 전구 지방세포를 4 × 104 세포/mL이 되도록 PGM 배지로 현탁시키고, 200 ㎕씩 48 웰 세포 배양용 플레이트에 접종하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 그 후, 배양 상청액을 제거하고, 제조예 3에서 제조한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액에 총 농도 4 ㎍/mL이 되도록 노보 황산 프로타민(모치다 제약 사 제품)을 첨가한 다음, 200 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, CO2 배양기 내에서, 37℃로 24 시간 배양하였다. 배양 상청액을 제거하고, 새로운 PGM 배지를 각각의 웰에 200 ㎕씩 첨가한 다음 3일간 배양한 후, 세포를 유세포 분석기 분석에 제공하였다. 또한 실험은 모두 2회 반복 수행하였다.
(6) 유전자 도입 효율의 측정
(3), (4), (5)의 각각의 방법에 의해 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, 실시예 1-(5)와 같은 방법으로 ZsGreen 발현 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다. 표 10은 각각의 PGM 배지에서 10배 희석, 100배 희석한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액을 이용하여, 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(ZsGreen 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 100배 희석 | |
| CH-271 결합법 | 62.47 | 34.37 |
| CH-271 SN법 | 60.24 | 43.54 |
| 프로타민 SN법 | 31.52 | 16.80 |
표 10에 나타내었듯이, 피브로넥틴 유래의 레트로 바이러스 결합 부위와 VLA-5에 결합할 수 있는 영역으로 구성되어 있는 CH-271을 이용할 경우에도, 레트로넥틴과 유사하게, 인간 전구 지방세포로의 유전자 도입이 가능한 것이 분명해졌다. 또한, CH-271 결합법, CH-271 SN법의 모두는 대조군으로서 수행한 프로타민법보다 높은 유전자 도입 효율을 얻을 수 있으므로 CH-271을 이용한 표적 세포와 레트로 바이러스 벡터를 공배치하는 도입법의 유효성이 나타났다.
실시예
9: H-296에 의한 유전자 도입
(1) 세포의
전배양
실시예 3-(1)과 같은 방법으로 피하지방 유래의 인간 전구 지방세포를 전배양하였다. 단지 배지로는 Preadipocyte Growth Medium-2(이하 PGM-2 배지, Cambr ex 사 제품; PT-8002로부터 제조)를 이용하였다.
(2) H-296을 배양 플레이트로 고정화
실시예 3-(2)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 레트로넥틴이 아닌, H-296으로 고정화시켰다. 이 때, 고정화에 사용하는 용액 중의 H-296의 농도는 100 ㎍/㎖로 하였다.
(3) H-296 결합법에 의한 유전자 도입
제조예 3에서 제조한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액과 (2)에서 제조한 H-296 고정화 배양 플레이트를 이용하여 실시예3 -(4)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 배지로는 PGM-2 배지를 사용하였다.
(4) H-296
SN
법에
의한
유전자 도입
제조예 3에서 제조한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액과 (2)에서 제조한 H-296 고정화 배양 플레이트를 이용하여 실시예 3-(5)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 배지로는 PGM-2 배지를 사용하였다.
(5)
프로타민
SN법에 의한
유전자 도입
실시예 8-(5)와 같은 방법으로 수행하였다. 다만 배지로는 PGM-2 배지를 사용하였다.
(6) 유전자 도입 효율의 측정
(3), (4), (5)의 각각의 방법으로 유전자 도입 처리를 실시한 세포에 대하여, 실시예 1-(5)와 같은 방법으로, ZsGreen 발현 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 표 11은 각각의 PGM-2 배지에서 10배 희석, 100배 희석한 ZsGreen 발현 레트로 바이러스 벡터 용액을 이용하여 각각의 방법으로 유전자 도입을 실시할 경우의 유전자 도입 효율(ZsGreen 발현 세포 비율)(%)을 나타낸 것이다.
| 10배 희석 | 100배 희석 | |
| H-296 결합법 | 28.57 | 9.20 |
| H-296 SN법 | 32.49 | 10.97 |
| 프로타민 SN법 | 16.68 | 6.33 |
표 11에 나타내었듯이, 피브로넥틴 유래의 레트로 바이러스 결합 부위와 VLA-4에 결합할 수 있는 영역으로 구성되어 있는 H-296을 이용할 경우에도, 레트로넥틴과 유사하게, 인간 전구 지방세포로의 유전자 도입이 가능한 것이 분명해졌다. 또한, H-296 결합법, H-296 SN법의 모두는 대조군으로서 수행한 프로타민법보다 높은 유전자 도입 효율을 얻을 수 있으므로 H-296을 이용한 표적 세포와 레트로 바이러스 벡터를 공배치하는 도입법의 유효성이 나타났다.
본 발명에 의하면, 지방세포, 전구 지방세포에 대하여 유용한 유전자를 고효율로 도입하는 것이 가능해진다. 상기의 유전자 도입된 세포는 질병의 치료나 예방에 유용한 유전자 산물을 생물 개체 내에서 발현하는 것이 가능해지므로 본 발명에 따른 해당 세포의 이식에 의한 유전자 치료 방법이 제공된다.
서열목록
프리
텍스트
서열번호 4: 피브로넥틴의 세포-결합 도메인 및 헤파린-결합 도메인을 갖는 폴리펩티드.
서열번호 6: 피브로넥틴의 세포-결합 도메인 및 헤파린-결합 도메인을 갖는 폴리펩티드.
SEQUENCE LISTING
<110> TAKARA BIO INC.
<120> Method for gene transfer into adipocyte or preadipocyte
<130> 666816
<150> JP 2005-175690
<151> 2005-06-15
<150> JP 2006-65710
<151> 2006-03-10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 271
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35 40 45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
95 100 105
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
110 115 120
Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
125 130 135
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
140 145 150
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
155 160 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
170 175 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
185 190 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
200 205 210
Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
215 220 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
245 250 255
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
260 265 270
Thr
<210> 2
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110 115 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
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Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
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Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
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Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu Ile Asp
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
1 5 10 15
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 25
<210> 4
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Polypeptide having heparin-binding domain and cell-binding domains of fibronectin.
<400> 4
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110 115 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260 265 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350 355 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
425 430 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440 445 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser
455 460 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
470 475 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
515 520 525
Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
530 535 540
Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu
545 550 555
Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp
560 565 570
Val Pro Ser Thr
<210> 5
<211> 296
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35 40 45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
95 100 105
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
110 115 120
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125 130 135
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140 145 150
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155 160 165
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170 175 180
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185 190 195
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200 205 210
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230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
245 250 255
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260 265 270
Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu
275 280 285
His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
290 295
<210> 6
<211> 549
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Polypeptide having heparin-binding domain and cell-binding domains of fibronectin.
<400> 4
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1 5 10 15
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395 400 405
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410 415 420
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425 430 435
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440 445 450
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455 460 465
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470 475 480
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
485 490 495
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530 535 540
Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
545
Claims (5)
- 레트로 바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자 중에 갖는 물질 또는 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 물질과 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 물질과의 혼합물의 존재 하에 외래 유전자를 갖는 레트로 바이러스 벡터를 지방세포 또는 전구 지방세포에 감염시키는 공정을 포함하고, 여기에서 상기 표적 세포 결합 부위는 VLA-5에 결합할 수 있는 영역 및/또는 VLA-4에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방세포 또는 전구 지방세포로의 유전자 도입 방법.
- 제 1항에 있어서, 레트로 바이러스 결합 부위가 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 부위, 폴리리신 및 DEAE 덱스트란으로부터 선택되는 물질로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 표적 세포 결합 부위가 피브로넥틴 유래의 VLA-5 및/또는 VLA-4에 결합하는 영역인 방법.
- 제 3항에 있어서, 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열과 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 3 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 존재 하에 레트로 바이러스 벡터에 의한 감염이 실시되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 레트로 바이러스 벡터가 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터인 방법.
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2006
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