JP2020501501A - 細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020501501A JP2020501501A JP2018549154A JP2018549154A JP2020501501A JP 2020501501 A JP2020501501 A JP 2020501501A JP 2018549154 A JP2018549154 A JP 2018549154A JP 2018549154 A JP2018549154 A JP 2018549154A JP 2020501501 A JP2020501501 A JP 2020501501A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nrf2
- cell
- enhanced
- stem cells
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
(1)体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させて、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る工程と、
(2)前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を指向性誘導分化させ、NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を得る工程と、を含む。
ヒトゲノムのNRF2遺伝子の1と2番目のイントロン(intron1-exon2-intron2)の遺伝子断片における、NRF2遺伝子に対応するcDNA配列の245位のヌクレオチドサイトを、野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させるとともに、他の配列が変わらないようにすることにより、突然変異後の断片を得る。
前記突然変異後の断片をpCIHDAdGT8-4ベクターのAscIとSpeI制限酵素切断サイトに挿入し、組換えプラスミドを得る。
PI-SceI(NEB)により前記組換えプラスミドを酵素切断し、線状化プラスミドを得、前記線状化プラスミドをヘルパーウイルスAdHPBGF35とともにパッケージング細胞に導入して組換えアデノウイルスのパッケージングを行い、組換えアデノウイルス粒子を得る。前記パッケージング細胞は、具体的には、ヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞である。
組換えアデノウイルス粒子によりヒト多能性幹細胞を感染させ、スクリーニングにより、1つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞を得、NRF2AG/+hESC細胞と表記する。
(b1)NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を胚様体分化させ、胚様体を得る工程と、
(b2)前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養し、さらに継代培養し、そのうちCD73、CD90、CD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を選別する工程と、を含む。
c1)細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
c2)腫瘍発生の抵抗、
c3)悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
c4)細胞移植治療、
c5)損傷した血管の再生及び/又は修復。
d1)細胞老化に抵抗し、及び/又はそれを遅延させる製品の製造、
d2)腫瘍発生に抵抗する製品の製造、
d3)悪性腫瘍形成・形質転換に抵抗する製品の製造、
d4)細胞移植治療用製品の製造、
d5)損傷した血管を再生及び/又は修復する製品の製造。
機能が次のm1)〜m5)のいずれかである。
m1)細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
m2)腫瘍発生の抵抗、
m3)悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
m4)細胞移植治療、
m5)損傷した血管の再生及び/又は修復。
前記細胞老化の抵抗及び/又は遅延は、次のn1)〜n6)のいずれかで表現される。
n1)外来刺激物による刺激下で細胞の活力が向上すること、
n2)体外で連続して継代培養する過程においてより強い増殖能を発現すること、
n3)有害代謝物を除去する能力が向上すること、
n4)具体的には、p16遺伝子、p21遺伝子及びGATA4遺伝子である、細胞老化に関連する遺伝子の発現レベルが低下すること、
n5)より完全な細胞核構造を有すること、
n6)人又は動物の体内での滞在期間がより長いこと。
前記悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗は、次のe1)〜e3)のいずれかで表現される。
e1)腫瘍化細胞の増殖能が低下すること、
e2)腫瘍形成に関連する足場非依存性増殖能が低下すること、
e3)体内で腫瘍を形成させる能力が低下すること。
前記応用又は前記製品において、前記細胞移植治療は、細胞移植修復治療である。
(1)CDF12培地の処方:
DMEM/F12培地(インビトロジェン、11320-033)、
0.1mM非必須アミノ酸(インビトロジェン、11140-050)、
1mM GlutaMAX(インビトロジェン、35050-061)、
20%(容量%での含有量)Knockout血清代替物(インビトロジェン、N10828-028)、
1%(1g/100ml)ペニシリン/ストレプトマイシン(インビトロジェン、15070-063)、
55μM β-メルカプトエタノール(インビトロジェン、21985-023)、
10ng/mlヒトFGF2(Joint Protein Central)。
MEM培地(インビトロジェン、12571071)、
10%(容量%での含有量)ウシ胎児血清(インビトロジェン、10091148)、
1%(1g/100ml)ペニシリン/ストレプトマイシン(インビトロジェン、15070-063)、
10ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子(JPC、bFGF)、
MSC分化培地に5ng/ml TGFβ(Humanzyme、HZ1131)を追加して添加した。
ヒト胚性幹細胞H9細胞株:WiCell社製、品番:WA09(H9)-DL-7。
ヒト胚性腎細胞293T:ATCCから購入、品番CRL-3216。
(1)H9細胞を、マイトマイシン(米国Sigma社製、品番:M0503)で不活性化されたマウス胚線維芽細胞(米国インビトロジェン社製、品番:S1520-100)を予め培養した培養用プレートに播種し、ヒト胚性幹細胞培地(CDF12培地)によりマウス胚線維芽細胞とともに培養した。
(1)組換えアデノウイルスパッケージングで用いられる生物材料は以下のとおりである。
pCR2.1-TOPOベクター:インビトロジェン社製。
ヘルパーアデノウイルスベクターであるpCIHDAdGT8-4ベクター:詳細は、「An HSV amplicon-based helper system for helper-dependent adenoviral vectors. Shuji Kubo, et al. BBRC. 2003. 307(4):826-830」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
トランスフェクションされるヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞:詳細は、「Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Palmer D. and Ng P. Molecular Therapy. 2003. 8(5):846-52.」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
ヘルパーアデノウイルスAdHPBGF35:詳細は、「Genome Size and Structure Determine Efficiency of Postinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-Modified Adenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner. Dmitry M. Shayakhmetov, et al., Journal of Virology. 2004. 78(18):10009-10022.」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
レトロウイルスベクター及びパッケージングプラスミドは、いずれもAddgeneから購入され、品番は、pBABE-neo-hTERT(1774)、pBABE-zeo-large T genomic(1778)、pBABE-puro-HRAS V12(1768)、gag/pol(14887)、VSV-G(8454)である。
過剰発現ルシフェラーゼluciferaseのレンチウイルスベクタープラスミド:詳細は、「SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2. Pan et. al., Cell research.(2016)26:190-205.」を参照し、中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
P53がノックダウンされたレンチウイルスベクタープラスミドPLVTHM-shP53:詳細は、「PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Duan et. al., Nature communication.(2015)10. 1038.」を参照し、中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Addgeneから購入され、品番は、psPAX(12260)、pMD2.G(12259)である。
ルシフェリンFITCで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD90抗体、BD Biosciences、品番:555595。
ルシフェリンPEで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD73抗体、BD Biosciences、品番:550257。
ルシフェリンAPCで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD105抗体、BD Biosciences、品番:17-1057-42。
ルシフェリンAPCで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番:555751。
ルシフェリンPEで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番:555749。
ルシフェリンFITCで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番:555742。
抗ヒトFOXA2抗体、Cell Signaling Technology、品番:8186S。
抗ヒトSMA抗体、中杉金橋、品番:ZM-0003。
抗ヒトTUJ1抗体、Sigma、品番:T2200。
抗ヒトLAP2抗体、BD Biosciences、品番:611000。
抗ヒトラミンB1抗体、Santa Cruz Biotechnology、品番:sc-6217。
抗ヒトKi67抗体、Vector Laboratories、品番:VP-RM04。
抗ヒトP16抗体、BD Biosciences、品番:550834。
抗ヒトP21抗体、Cell Signaling Technology、品番:2947。
一、NRF2強化型多能性幹細胞の製造
本発明は、多能性幹細胞(Pluripotent Stem Cell、PSC)におけるヒトストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトを標的編集することにより、NRF2遺伝子(Gene Bank ID:4780)のcDNA配列の245位を野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させ、NRF2タンパク質のアミノ酸配列の82位をグルタミン酸(E)からグリシン(G)に変異させ、NRF2強化型多能性幹細胞を得た。具体的な工程は以下のとおりである(具体的な工程は、図1Aを参照する)。
まず、RP11-483K11 BAC DNAライブラリー(BACPAC Resources)からPCR増幅によりヒトゲノムのNRF2遺伝子の1と2番目のイントロン(intron1-exon2-intron2)にわたる遺伝子断片を得た。その後、部位特異的突然変異キット(インビトロジェン、品番:A13282)により当該断片上のNRF2遺伝子に対応するcDNA配列の245位のヌクレオチドサイト(A245G)を、野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させるとともに、他の配列が変わらないようにすることにより、突然変異後の断片を得、突然変異後の断片をpCIHDAdGT8-4ベクターのAscIとSpeI制限酵素切断サイトに挿入し、組換えプラスミドを得た。
PI-SceI(NEB)酵素により工程1で得られた組換えプラスミドを切断し、線状化プラスミドを得、当該線状化プラスミドをヘルパーウイルスAdHPBGF35とともにヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞に導入して組換えアデノウイルスパッケージングを行い、超高速遠心により精製して組換えアデノウイルス粒子を得た。
組換えアデノウイルス粒子によりhESCs細胞(H9)を感染させ(1×107個の細胞であり、ウイルスの使用量が15 bgal-transducing units(btu)であり、ウイルスの使用量の単位は、文献「Palmer, D. J. & Ng, P. Physical and infectious titers of helper-dependent adenoviral vectors:a method of direct comparison to the adenovirus reference material. Mol Ther 10, 792-798(2004).」及び「Suzuki, K. et al. Highly efficient transient gene expression and gene targeting in primate embryonic stem cells with helper-dependent adenoviral vectors. Proc Natl Acad Sci USA 105, 13781-13786(2008).」を参照できる)、感染後2〜4日目に、G418(25〜400g/ml、インビトロジェン社製)を加えて陽性のスクリーニングを行い、感染後10〜13日目に、4μM Ganciclovir(GANC、インビトロジェン社製)を加えて陰性のスクリーニングを行った。最後、生存してきた細胞をシーケンス同定し(PCRプライマーがNRF2A245GseqF:ACCATTTGTGACTTTGCCCTTTAGTGACCTCTACCATC及びNRF2A245GseqR:AACCTGCCATAACTTTCCCAAGAACTGAであり、シーケンシングプライマーがaaaaacagaaaaaacttgaaである)、1つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞を得、NRF2AG/+hESC細胞と表記した。
1、NRF2強化型多能性幹細胞のシーケンス同定
NRF2強化型多能性幹細胞に対してシーケンス同定を行ったところ、NRF2強化型多能性幹細胞におけるNRF2遺伝子のA245Gサイトが正確に編集され(図1B)、NRF2強化型成体細胞におけるNRF2遺伝子の二本の相同染色体の245位が、いずれも塩基Aから塩基Gに突然変異したことが示された。
NRF2強化型多能性幹細胞に対して形態同定を行い、NRF2AG/AGhESCの形態同定結果は、図1Cに示される。また、図面から分かるように、NRF2強化型多能性幹細胞は、依然として、体内で内中外の三胚葉細胞に分化する能力を有する。
それぞれ野生型ヒト胚性幹細胞H9細胞株(NRF2+/+)、NRF2AG/+hESC細胞(NRF2AG/+hESC)及びNRF2AG/AGhESC細胞(NRF2AG/AGhESC)での、多能性幹性遺伝子OCT4、SOX2、NANOGを発現させる発現レベルを検出した。PCR同定に用いられるプライマーは以下のとおりである。
18S-F:GTAACCCGTTGAACCCCATT、
18S-R:CCATCCAATCGGTAGTAGCG、
OCT4-F:GGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCA、
OCT4-R:GCCCCCACCCTTTGTGTT、
SOX2-F:CAAAAATGGCCATGCAGGTT、
SOX2-R:AGTTGGGATCGAACAAAAGCTATT、
NANOG-F:ACAACTGGCCGAAGAATAGCA、
NANOG-R:GGTTCCCAGTCGGGTTCAC。
本発明は、実施例1で得られたNRF2強化型多能性幹細胞を、NRF2強化型間葉幹細胞(NRF2強化型MSC)にさらに分化させた。そして、実験により、NRF2強化型MSCにおいてNRF2が能動的に活性化され、体内でも体外でもストレス抵抗性、細胞老化抵抗性及び悪性形質転換抵抗性という特性を発現したことが証明された。具体的な工程は以下のとおりである。
1、NRF2AG/AGhESCを胚様体(EB)分化させ、具体的な工程としては、300〜500個の細胞を含有し、大きさが均一なNRF2AG/AGhESCクローンを準備し、室温PBSで一回洗浄し、Dispase(インビトロジェン社、品番17105041)で37℃で20〜30min消化させた。ESCクローンが球体を形成した後、CDF12培地により再懸濁させ、その後、低接着培養プレート(Corning社、品番3471)に加え、37℃、5%CO2の条件で1〜3日培養した後、胚様体を形成した。
前記工程におけるNRF2AG/AGhESCを野生型ヒト胚性幹細胞H9細胞株に置き換え、他の工程が変わらないようにし、指向性誘導分化させて野生型間葉細胞を得、NRF2+/+MSCと表記した。
1、NRF2強化型MSCの表現型同定
工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCの表面マーカーを検出した。
結果は、図1Eに示される。図面から分かるように、工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCは、いずれも、関連していないCD34、CD43及びCD45を発現させることなく、MSC特異的表面マーカーCD73、CD90及びCD105を発現させることができた。
(1)NRF2強化型MSCにおけるNRF2タンパク質の量
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、供試細胞におけるNRF2タンパク質の量を検出した。具体的な工程としては、RIPA細胞溶解液(Beyotime、P0013B)を用いて供試細胞を溶解させた後、BCAタンパク質定量キット(Beyotime、P0010)により供試細胞におけるタンパク質の濃度を測定し、最後に、それぞれタンパク質を20μg取ってウェスタンブロット実験を行った。一次抗体にNRF2(abcam、62352)、二次抗体にヤギ抗ウサギIgG/HRP(中杉金橋、ZDR-5306)を用いた。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、それぞれ細胞質及び核質におけるNRF2タンパク質の含有量を検出した。具体的な工程としては、細胞核タンパク質及び細胞質タンパク質抽出キット(Beyotime、P0028)を用いて、それぞれ細胞質及び核質画分タンパク質を抽出した後、等量のタンパク質を取ってそれぞれウェスタンブロット実験を行い、細胞質マーカーであるβ-チューブリン及び核質マーカーであるラミンB1をコントロールとした。
1)リアルタイム定量PCR実験
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、それぞれ供試細胞のRNAを抽出してcDNAに逆転写し、それぞれ次のプライマーを用いてリアルタイム定量PCRを行い、供試細胞におけるストレス抵抗性遺伝子NRF2の下流の標的遺伝子であるNQO1遺伝子、HO-1遺伝子、GCLC遺伝子、GCLM遺伝子、GR遺伝子、TXN遺伝子、TRXR1遺伝子の発現量を検出した。
NQO1-F:CGCAGACCTTGTGATATTCCAG、
NQO1-R:CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG、
HO1-F:AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC、
HO1-R:AAAGCCCTACAGCAACTGTCG、
GCLC-F:GGATTTGGAAATGGGCAATTG、
GCLC-R:CTCAGATATACTGCAGGCTTGGAA、
GCLM-F:TGCAGTTGACATGGCCTGTT、
GCLM-R:TCACAGAATCCAGCTGTGCAA、
GSR-F:TTGTCGGGCTTGGAAGTCAG、
GSR-R:TGGTAGCCTACCGGGAACTG、
TXN-F:GTGAAGCAGATCGAGAGCAAG、
TXN-R:CGTGGCTGAGAAGTCAACTACTA、
TRXR1-F:GGGCAATTTATTGGTCCTCA、
TRXR1-R:GGTCTTTCACCAGTGGCAAT。
(1)外来刺激下での高い活力
酸化ストレス、小胞体ストレス、DNA損傷ストレス及びアポトーシス刺激を含む外来刺激物によりMSCを処理した。具体的な工程としては、供試細胞NRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを96ウェルプレートに広げ、それぞれ次の外来刺激物(括弧内は、外来刺激物の最終濃度及び購入先である)により供試細胞を48時間刺激した。
1)酸化ストレス:DMSO(0.1%、Sigma)、PQ(2mM、パラコート、Sigma)、PX12(50μM、Santa Cruz Technology)、TBH(100μM、tert-ブチルヒドロペルオキシド、Sigma)、L-BSO(500μM、L-ブチオニンスルホキシイミン、Sigma)、
2)小胞体ストレス:TM(6μg/mL、ツニカマイシン、Sigma)及びTG(1.5μg/mL、タプシガルギン、Sigma)、
3)DNA損傷:4NQO(100μM、4-ニトロキノリンN-オキシド、Sigma)及びAAT2(50μM、Apoptosis Activator 2、TOCRIS)、
4)アポトーシス:CCCP(100μM、カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン、Sigma)。
細胞カウンターにより、連続して継代培養されたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCの増殖能を測定した。
細胞老化関連β-ガラクトシダーゼ染色とは、老化時のSA-beta-Gal(senescence-associated beta-galactosidase)の活性レベルの上昇に基づいて老化細胞又は組織を染色検出する方法である。それぞれ工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCをSA-β-Gal染色し、普通の光学顕微鏡で細胞又は組織の老化状況を観測でき、さらに、2つのグループの細胞におけるSA-β-Gal染色陽性細胞の割合を定量的統計分析した。具体的な工程は以下のとおりである。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし(初期世代EP:第5世代、後期世代LP:第11世代)、1μM酸素ラジカルプローブDCFDA(インビトロジェン、品番:C6827)とともに30分間インキュベートし、フローサイトメーターによりDCFDA強度(即ち、プローブによる細胞内の活性酸素の含有量)を検出した。詳しい工程は、インビトロジェン社の説明書を参照できる。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし(初期世代EP:第5世代、後期世代LP:第11世代)、ウェスタンブロット実験により供試細胞における老化高発現遺伝子p16、p21、GATA4のタンパク質発現状況を検出した。一次抗体にp16(BD、550834)、P21(Cell signaling、2947)、GATA4(Santa cruz、SC-1237)を用いた。対応する二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG/HRP(中杉金橋、ZDR-5307)、ヤギ抗ウサギIgG/HRP(中杉金橋、ZDR-5306)及びウサギ抗ヤギIgG/HRP(中杉金橋、ZDR-5308)であった。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし(初期世代EP:第5世代、後期世代LP:第11世代)、免疫蛍光染色法により増殖活力に関連するKi67の発現を検出した。具体的な工程としては、供試細胞を円形スライドガラスに広げ、4%パラホルムアルデヒドにより定着させた後、0.4%TritonX-100を透過させた。透過した細胞をロバ血清で1hブロッキングした後、一次抗体で一晩インキュベートし、一次抗体にKi67(Vector Laboratories、品番:VP-RM04)を用いた。対応する二次抗体で45分間インキュベートした後、共焦点レーザー顕微鏡により細胞の写真を撮影した。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし(初期世代:第5世代、後期世代:第11世代)、免疫蛍光染色法により核膜タンパク質ラミンB1及びLAP2の発現を検出した。具体的な工程としては、供試細胞を円形スライドガラスに広げ、4%パラホルムアルデヒドにより定着させた後、0.4%TritonX-100を透過させた。透過した細胞をロバ血清で1hブロッキングした後、一次抗体で一晩インキュベートし、一次抗体にラミンB1(Abcam、品番:16048)及びLAP2(BD、品番:611000)を用いた。対応する二次抗体で45分間インキュベートした後、共焦点レーザー顕微鏡により細胞の写真を撮影した。
(1)NRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCの製造
体外悪性形質転換システムにより、それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCに腫瘍形成因子を導入し、非腫瘍性のMSCを腫瘍性のMSC(transformed MSC、以下、TMSCという)に転換し、それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCを得た。その後、腫瘍に関連する特性を検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
腫瘍細胞は、接着できない寒天でクローンになることができるが、非腫瘍性の細胞ではできないので、足場非依存性増殖能は、腫瘍細胞が固形腫瘍を形成することに密接に関連する。それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCを溶解状態のアガロース(0.35%)と均一に混合し、細胞培養ディッシュに速やかに広げ、アガロースが凝固した後TMSC培地を覆って培養し、足場非依存性増殖能を観察した。
それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSC(3×106個の細胞)をヌードマウス(系統:Balb/C nude mice)の後肢関節近傍に移植した。接着培養されたTMSCを単核球に消化させ、20%Matrigel(BD Biosciences、354277)を混合したPBS(Gibco、10010023)溶液に再懸濁させ、通常の注射器により細胞懸濁液を後肢関節近傍の筋肉に注射した。移植後2〜3ヶ月後、後肢に明らかに腫れが隆起した場合、マウスを致死させた。後肢を切り取り天秤で秤量し、相対質量(相対質量=NRF2+/+TMSCが移植された後肢の質量/NRF2AG/AGTMSCが移植された後肢の質量)を計算した。
実施例2で得られたNRF2強化型間葉幹細胞(NRF2強化型MSC)は、ストレス抵抗、細胞老化抵抗及び腫瘍発生抵抗特性を有するので、本発明は、実施例2で得られたNRF2強化型間葉幹細胞を細胞移植治療に用いた。具体的な工程は以下のとおりである。
1、それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCに対してルシフェラーゼ標識を行った。具体的な工程としては、過剰発現ルシフェラーゼluciferaseのレンチウイルスベクタープラスミドをレンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX及びpMD2.Gと293T細胞に同時トランスフェクションさせ、培養上澄みを回収し、超高速遠心によりウイルス粒子を精製した。精製により得られたウイルスでNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを感染させ、それぞれルシフェラーゼで標識されたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを得た。
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを後肢虚血の免疫不全マウスの筋肉に移植し、レーザードップラー血流計により移植後0、4、8、12、16日目のマウスの後肢の血流回復状況を検出した。同時に、PBS溶液(control)(Gibco、10010023)をコントロールとした。
Claims (16)
- (1)体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させ、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る工程と、
(2)前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を指向性誘導分化させ、NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を得る工程と、
を含む間葉幹細胞の製造方法。 - 工程(1)において、前記体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させる方法は、NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させることであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させる方法は、部位特異的ゲノム編集であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記部位特異的ゲノム編集方法は、ZFN編集、TALEN編集、CRISPR/Cas9編集又はHdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記部位特異的ゲノム編集方法は、HdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 工程(2)において、前記指向性誘導分化方法は、
(b1)NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を胚様体分化させ、胚様体を得る工程と、
(b2)前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養し、さらに継代培養し、そのうちCD73、CD90、CD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を選別する工程と、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞H9細胞株であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞。
- 請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は請求項10に記載のNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のc1)〜c5)のいずれかへの応用。
c1)細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
c2)腫瘍発生の抵抗、
c3)悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
c4)細胞移植治療、
c5)損傷した血管の再生及び/又は修復。 - 請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は請求項10に記載のNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のd1)〜d5)のいずれかへの応用。
d1)細胞老化に抵抗し、及び/又はそれを遅延させる製品の製造、
d2)腫瘍発生に抵抗する製品の製造、
d3)悪性腫瘍形成・形質転換に抵抗する製品の製造、
d4)細胞移植治療用製品の製造、
d5)損傷した血管を再生及び/又は修復する製品の製造。 - 請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を活性成分とし、
機能が次のm1)〜m5)のいずれかである製品。
m1)細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
m2)腫瘍発生の抵抗、
m3)悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
m4)細胞移植治療、
m5)損傷した血管の再生及び/又は修復。 - 前記細胞老化の抵抗及び/又は遅延は、次のn1)〜n6)のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
n1)外来刺激物による刺激下で細胞の活力が向上すること、
n2)体外で連続して継代培養する過程においてより強い増殖能を発現すること、
n3)有害代謝物を除去する能力が向上すること、
n4)細胞老化に関連する遺伝子の発現レベルが低下すること、
n5)より完全な細胞核構造を有すること、
n6)人又は動物の体内での滞在期間がより長いこと。 - 前記悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗は、次のe1)〜e3)のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
e1)腫瘍化細胞の増殖能が低下すること、
e2)腫瘍形成に関連する足場非依存性増殖能が低下すること、
e3)体内で腫瘍を形成させる能力が低下すること。 - 前記細胞移植治療は、細胞移植修復治療であることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611192461.9 | 2016-12-21 | ||
CN201611192461.9A CN106591228B (zh) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | 一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法 |
PCT/CN2017/080393 WO2018113145A1 (zh) | 2016-12-21 | 2017-04-13 | 一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020501501A true JP2020501501A (ja) | 2020-01-23 |
Family
ID=58602284
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018549154A Pending JP2020501501A (ja) | 2016-12-21 | 2017-04-13 | 細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2020501501A (ja) |
CN (1) | CN106591228B (ja) |
WO (1) | WO2018113145A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109097333B (zh) * | 2018-07-17 | 2019-07-23 | 杭州观梓健康科技有限公司 | 抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途 |
CN109055428A (zh) * | 2018-09-19 | 2018-12-21 | 上海市第人民医院 | 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 |
CN111257565A (zh) * | 2018-12-03 | 2020-06-09 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法 |
CN112280800B (zh) * | 2020-10-19 | 2022-06-07 | 上海市东方医院(同济大学附属东方医院) | 一种构建体及其在制备动物衰老细胞示踪和衰老细胞清除药物中的应用 |
CN112941106B (zh) * | 2021-03-15 | 2022-03-15 | 安可来(重庆)生物医药科技有限公司 | 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101135636B1 (ko) * | 2009-10-27 | 2012-04-17 | 서울대학교산학협력단 | 인간 만능줄기세포로부터 중배엽 줄기세포를 생산하는 방법 및 이에 의해 생성된 중배엽 줄기세포 |
JP5814128B2 (ja) * | 2010-01-07 | 2015-11-17 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | 肝疾患治療薬 |
CN104419683A (zh) * | 2013-09-10 | 2015-03-18 | 中国科学院生物物理研究所 | 制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法及其应用 |
CN103740757B (zh) * | 2014-01-21 | 2016-04-20 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种利用重编程制备猪神经干细胞的方法 |
CN104726496B (zh) * | 2015-03-27 | 2017-07-07 | 中国科学院生物物理研究所 | 携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法 |
CN104877967A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-09-02 | 中山大学附属第三医院 | 一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用 |
-
2016
- 2016-12-21 CN CN201611192461.9A patent/CN106591228B/zh active Active
-
2017
- 2017-04-13 WO PCT/CN2017/080393 patent/WO2018113145A1/zh active Application Filing
- 2017-04-13 JP JP2018549154A patent/JP2020501501A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106591228B (zh) | 2019-06-18 |
WO2018113145A1 (zh) | 2018-06-28 |
CN106591228A (zh) | 2017-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020501501A (ja) | 細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法 | |
JP6530452B2 (ja) | 合成メッセンジャーrnaを使用したヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導 | |
Chen et al. | Mesenchymal stem cells overexpressing MiR-126 enhance ischemic angiogenesis via the AKT/ERK-related pathway | |
Takeda et al. | Can the life span of human marrow stromal cells be prolonged by bmi‐1, E6, E7, and/or telomerase without affecting cardiomyogenic differentiation? | |
CA2465653C (en) | Method for inducing differentiation of mesodermal stem cells, es cells, or immortalized mesodermal stem cells into neural cells | |
WO2014153346A1 (en) | Engineering a heterogeneous tissue pluripotent stem cells | |
JP3953399B2 (ja) | 不死化骨髄間葉系幹細胞 | |
US20220401518A1 (en) | Mesenchymal stem cell expressing hepatocyte growth factor, and use thereof | |
Kucharski et al. | Current standards and pitfalls associated with the transfection of primary fibroblast cells | |
Rosenqvist et al. | Activation of silenced transgene expression in neural precursor cell lines by inhibitors of histone deacetylation | |
US20100260731A1 (en) | Propagation of primary cells and the use thereof | |
CN104726496A (zh) | 携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法 | |
Tashiro et al. | Efficient adenovirus vector‐mediated PPAR gamma gene transfer into mouse embryoid bodies promotes adipocyte differentiation | |
WO2005024004A1 (ja) | 間葉系幹細胞の肝細胞への分化方法及び人工ヒト肝臓細胞 | |
WO2020082647A1 (zh) | 一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
Wang | Myocardial reprogramming medicine: The development, application, and challenge of induced pluripotent stem cells | |
WO2011118819A1 (ja) | サービビンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクターによる造血器腫瘍の遺伝子治療 | |
KR100985191B1 (ko) | 가역적으로 불멸화된 후각 초성 세포 및 신경세포 재생을촉진시키기 위한 그의 용도 | |
WO2019183042A1 (en) | Autologous mitochondrial extraction and expansion | |
CN110628824B (zh) | Dj-1功能丧失的细胞模型的构建方法与应用 | |
WO2012156721A1 (en) | Methods for providing human cells comprising a human artificial chromosome | |
Sun et al. | Ectopic expression of factor VIII in MSCs and hepatocytes derived from rDNA targeted hESCs | |
JP5913984B2 (ja) | 多能性幹細胞の製造のための核酸 | |
JPWO2019009419A1 (ja) | 脱分化誘導剤及びその使用 | |
Tian et al. | Purification and functional assessment of smooth muscle cells derived from mouse embryonic stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190829 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190829 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190829 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20190207 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20191031 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191112 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200207 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200414 |