CN111257565A - 一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN111257565A CN201811465286.5A CN201811465286A CN111257565A CN 111257565 A CN111257565 A CN 111257565A CN 201811465286 A CN201811465286 A CN 201811465286A CN 111257565 A CN111257565 A CN 111257565A
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Abstract

本发明提供了一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体；本发明通过整合多步骤多方法所需试剂，以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，并创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，特异性高效检测衰老细胞，结果直观，数据准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。

Description

一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
衰老是一切生物体所共有的现象。在多细胞生物中，衰老的标志为多种细胞和组织功能的持续下降。衰老的最突出的特征之一是功能的逐渐丧失或退化，这种功能的丧失或退化发生在包括分子、细胞、组织和个体各个水平。在具有可再生组织的生物体中，衰老的另一标志还在于增生水平的提高，其中最为严重的即是癌症的发生。与其他衰老相关的退行性疾病类似，癌症的发病率大约在个体的整个寿命期的中期开始明显增加。越来越多的证据表明，细胞衰老这一压力应答机制与多种衰老相关病症直接或间接相关联。近年的研究结果(Baker DJ et al.2016Naturally occurring p16-positive cells shortenhealthy life span.Nature 530，184–189)支持细胞衰老在年龄相关的肿瘤发生率提高中所起到的作用，实验结果显示在小鼠体内去除衰老细胞后肿瘤发生的水平显著降低。细胞衰老是指当细胞经受潜在的致瘤压力时，细胞产生的基本上不可逆的增殖停顿的状态(Campisi J，d’Adda di Fagagna F.2007Cellular senescence:when bad things happento good cells.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.8:729–40)，衰老细胞的增殖停顿不可逆这一现象提示细胞的衰老应答形成的原因之一可能就是抑制肿瘤发生。
细胞衰老的诱因主要包括端粒的缩短、基因组损伤、丝裂原与增殖相关信号、表观遗传损伤和肿瘤抑制基因的激活。目前已经确证细胞的衰老至少涉及两条主要的肿瘤抑制相关的通路：p53/p21通路和p16INK4a/pRB通路。两条通路在上游都有调控因子，在下游都有效应因子，也都具有分支通路，并且相互间还存在交叉调控(Levine AJ，OrenM.2009.The first 30years of p53:growing ever more complex.Nat.Rev.Cancer 9:749–58；Chau BN，Wang JY.2003.Coordinated regulation of life and death byRB.Nat.Rev.Cancer 3:130–38)。p53与pRB是主要的转录调控因子，p21是p53通路的下游效应因子，而p16INK4a是pRB的上游正向调控因子。在高等的真核生物体内，肿瘤抑制蛋白pRB和p53在细胞衰老中起着关键的守门员的作用。p16INK4a是INK4基因家族的一个前体基因，编码CDK4和CDK6蛋白的抑制剂，其表达在多种人类的癌症中通过多种机制被关闭。因此细胞衰老与癌症的发生之间有密切的关系，鉴定衰老状态能够对个体的衰老状态和肿瘤发生风险的判断给出一定提示。
衰老细胞的代谢通常仍然处于活跃状态，且如上所述细胞增殖陷入不可逆的停顿；其形态上通常较正常细胞更加扩大，通常体积上会翻倍，如果贴壁时会呈现出扁平状的形态。目前已知衰老细胞会表达一些特定的标记基因，包括SA-βgal、p16INK4a、γH2AX等。p16INK4a在绝大多数正常细胞核组织中表达水平非常低，一般难以检测到，但当通过多种刺激诱导细胞衰老时则能够检测到。p16INK4a的表达水平在多种脊椎动物的组织中随着年龄的增加也逐渐提高，是鉴定衰老细胞的一种重要标记(Ressler S，Bartkova J，NiedereggerH，Bartek J，Scharffetter-Kochanek K，Jansen-Dürr P，Wlaschek M.2006.p16is arobust in vivo biomarker of cellular aging in human skin.Aging Cell 5:379–89)。在组织水平上，通过免疫组化的方法检测p16INK4a与其他标志物在组织样本的衰老细胞中的组合表达情况，能够获得与年龄大小趋势一致的结果(Waaijer ME，Parish WE，Strongitharm BH，van Heemst D，Slagboom PE，de Craen AJ Sedivy JM，Westendorp RG，Gunn DA，Maier AB.2012.The number of p16INK4a positive cells in human skinreflects biological age.Aging Cell 11:722–25)，表明在组织水平p16INK4a能够结合其他标志基因一起较为准确地检测到衰老细胞，进而反映出个体的衰老和健康状态，为肿瘤的预警提供了一定的佐证。但通过免疫组化法只能检测组织样本，对于待检测个体而言难度非常大，难以作为一种市场化的常规检测手段进行推广。有文章(Liu Y，Sanoff HK，ChoH，Burd CE，Torrice C，Ibrahim JG，Thomas NE，Sharpless NE.2009Expression of p16(INK4a)in peripheral blood T-cells is a biomarker of human aging.Aging Cell.8(4):439-48.)报道了一种检测人外周血T细胞p16INK4a表达水平的方法，该方法通过定量PCR方法检测外周血中T细胞的p16INK4aRNA水平，发现表达水平与样本的年龄趋势吻合较好。但T细胞是一类较为特殊的细胞，激活的T细胞均能够稳定表达p16INK4a，不能等同视为体内真正的衰老细胞，因此虽然其p16INK4a表达水平与年龄的趋势吻合程度较高，仍然不能有效地反映体内真实的细胞衰老的状态，难以为体内肿瘤发生的风险提供有效的预警。CN108531594A公开了一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒，所述联合基因为APC、NID2、p16，通过设计特异性甲基化引物分别检测APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对膀胱癌的早期筛查和辅助诊断。但该发明需要检测多种基因，且用于检测膀胱癌，并不能检测衰老细胞。
因此，目前仍然缺乏一种能够有效检测个体血液中的衰老细胞的方法，提供一种简洁高效的衰老细胞的检测方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，整合多步骤多方法所需试剂，并创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，特异性高效检测衰老细胞，结果直观，数据准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种衰老细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体。
优选地，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的载体，优选为偶联CD45抗体的磁珠。
优选地，所述p16抗体为偶联荧光基团的p16抗体，优选为偶联AlexaFluor488的p16抗体。
优选地，所述染色体核型检测试剂为染色体核型检测核酸探针，优选为偶联荧光基团的染色体核型检测核酸探针，进一步优选为偶联SpectrumOrange的CEP8 FISH DNA探针。
优选地，所述试剂盒还包括CD45抗体、细胞固定液、清洗液、样品稀释液、抗体清洗液、CD16阳性细胞负向富集试剂、CD19阳性细胞负向富集试剂和CD235a阳性细胞负向富集试剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述细胞固定液包括选自4％多聚甲醛、70％乙醇和赛特生物货号为FH-001R1的细胞固定液中的任一种。
优选地，所述清洗液包括选自溶于PBS的1％v/vFBS、溶于PBS的0.5％w/vBSA和赛特生物货号HC-001R1的CRC清洗液中的任一种。
优选地，所述样品稀释液包括选自溶于PBS的1％v/vFBS、溶于PBS的0.5％w/vBSA和赛特生物货号FH-001R2的样品稀释液中的任一种。
优选地，所述抗体清洗液包括含有NP-40的2×SSC缓冲液或赛特生物货号HC-001R5的抗体清洗液；
优选地，所述含有NP-40的2×SSC缓冲液为含有0.1％v/vNP-40的2×SSC缓冲液。
优选地，所述CD45抗体为偶联荧光基团的CD45抗体，优选为偶联AlexaFluor 594的CD45抗体。
优选地，所述CD16阳性细胞负向富集试剂为偶联CD16抗体的载体，优选为偶联AlexaFluor 488的CD16抗体的磁珠。
优选地，所述CD19阳性细胞负向富集试剂为偶联CD19抗体的载体，优选为偶联CD19抗体的磁珠。
优选地，所述CD235a阳性细胞负向富集试剂为偶联CD235a抗体的载体，优选为偶联CD235a的磁珠。
本发明中，发明人在长期科研实践过程中，深入调研衰老细胞的检测方法及报道，针对现有技术检测方法复杂、结果模糊的不足，以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，整合多步骤多方法所需试剂，创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，排除白细胞表达p16对检测结果的干扰，辅以染色体核型检测试剂进一步验证结果，本发明提供的试剂盒组成简洁，检测结果准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。
第二方面，本发明提供一种非诊断与治疗目的的检测衰老细胞的方法，采用如第一方面所述的试剂盒，所述方法包括如下步骤：
(1)将血液样品进行预处理，去除血细胞和白细胞；
(2)将步骤(1)预处理后的样品进行细胞表面抗原染色并固定；
(3)将步骤(2)细胞表面染色后的样品进行染色体荧光原位杂交；
(4)将步骤(4)杂交后的样品进行胞内抗原染色，检测细胞免疫荧光染色结果。
本发明所要检测的对象为血液中的存在的衰老细胞，类似于循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)，这类细胞将其定义为循环衰老细胞(Circulating AgingCell，CAC)；本发明通过密度梯度离心和偶联有CD45抗体的载体如磁珠，血液中的红细胞和白细胞先分别被去除，随后结合染色体核型荧光原位杂交，通过细胞免疫荧光染色法鉴定血液中CD45-p16+的染色体二倍体细胞，即为血液中的循环衰老细胞；CEP8是CTC的生物标志物，作为参考，本发明使用了靶向CEP8的核酸探针对经过处理后的血液样本中的细胞进行了FISH检测，作为细胞染色体核型的指示标志。本发明提供的方法以p16为主要检测标志物，创造性地将对p16表达结果产生干扰的白细胞进行了排除，并辅以染色体核型检测试剂，即靶向CEP8的核酸探针对检测结果进行辅助验证，验证了p16表达阳性的二倍体细胞与衰老细胞的相互关系，所述方法简洁高效，克服了免疫组化法或需要检测多种基因标志物的复杂性，以p16蛋白与染色体核型为直接检测对象，抗干扰性好，检测结果直观准确。
优选地，步骤(1)所述血液样品为外周血。
优选地，步骤(1)所述去除血细胞的方法为密度梯度离心。
优选地，步骤(1)所述去除白细胞的方法为：
向去除血细胞后的样品中加入第一方面所述CD45阳性细胞负向富集试剂，更优选地，加入第一方面所述CD45阳性细胞负向富集试剂和选自第一方面所述CD16阳性细胞负向富集试剂、CD19阳性细胞负向富集试剂和CD235a阳性细胞负向富集试剂中的任意一种或几种，混匀孵育，固液分离后吸取上清。
优选地，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的磁珠。
优选地，所述CD16阳性细胞负向富集试剂为偶联CD16抗体的磁珠。
优选地，所述CD19阳性细胞负向富集试剂为偶联CD19抗体的磁珠。
优选地，所述CD235a阳性细胞负向富集试剂为偶联CD235a抗体的磁珠。
优选地，所述固液分离为外加磁场吸附进行分离。
优选地，所述混匀孵育的时间为15-25min，例如可以是15min、18min、20min、22min、24min或25min，转速为100-150rpm，例如可以是100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm或150rpm。
优选地，步骤(2)所述细胞表面抗原染色并固定的方法为：
加入第一方面所述CD45抗体避光孵育，采用第一方面所述清洗液清洗，加入第一方面所述细胞固定液固定。
更优选地，具体操作为：加入第一方面所述CD45抗体避光孵育，然后与第一方面所述清洗液混匀并离心弃上清，最终加入第一方面所述细胞固定液吹打混匀，涂载玻片并干燥过夜。
优选地，所述CD45抗体的孵育时间为15-25min，例如可以是15min、18min、20min、22min、24min或25min。
优选地，所述干燥的温度为30-32℃，例如可以是30℃、31℃或32℃。
优选地，步骤(3)所述染色体荧光原位杂交的方法为：
将第一方面所述细胞固定液和样品稀释液混匀，清洗并脱水后，加第一方面所述染色体核型检测核酸探针，进行变性杂交。
更优选地，具体操作为：将所述细胞固定液和所述样品稀释液混匀后滴加在载玻片上，清洗并脱水后，加所述染色体核型检测核酸探针，进行变性杂交；
优选地，所述脱水通过无水乙醇进行。
优选地，所述变性的温度为74-78℃，优选为76℃，变性的时间为8-12min，优选为10min；
优选地，所述杂交的温度为35-38℃，优选为37℃，杂交的时间为2.8-3.2h，优选为3h；
优选地，步骤(4)所述胞内抗原染色的方法为：
用Triton孵育并清洗，加入第一方面所述p16抗体进行孵育并清洗，加入含DAPI的封片液后进行检测。
更优选地，具体操作为：首先用0.1％的Triton孵育并清洗后，然后加入所述p16抗体进行孵育并清洗，最终加入含DAPI的封片液后进行检测。
作为优选技术方案，一种用于非诊断与治疗目的的衰老细胞的检测方法，采用如第一方面所述的试剂盒，具体包括如下步骤：
(1)将血液样品进行预处理，密度梯度离心去除血细胞，向去除血细胞后的样品中加入第一方面所述偶联CD45抗体的磁珠混匀孵育，外加磁场吸附磁珠后吸取上清，获得预处理后的样品；
(2)将步骤(1)所述预处理后的样品进行细胞表面抗原染色并固定，包括：
加入第一方面所述CD45抗体避光孵育，采用第一方面所述清洗液清洗，加入第一方面所述细胞固定液固定，获得细胞表面染色后的样品；
(3)将步骤(2)所述细胞表面染色后的样品用第一方面所述染色体核型检测试剂进行染色体荧光原位杂交，包括：
将第一方面所述细胞固定液和样品稀释液混匀，清洗并脱水后，加第一方面所述偶联荧光基团的染色体核型检测核酸探针，进行变性杂交，获得变形杂交后的样品；
(4)将步骤(3)所述杂交后的样品用第一方面所述p16抗体进行胞内抗原染色，包括：用Triton孵育并清洗后，加入第一方面所述偶联荧光基团p16抗体进行孵育并清洗，加入含DAPI的封片液后进行检测。
目前检测细胞衰老的手段主要限于对组织样本进行免疫组化染色、取材困难；而通过血液样本的检测只有检测激活的T细胞中的p16的表达水平，无法视为对体内细胞衰老状态的真实反映，也不能有效地为体内肿瘤发生的风险提供预警。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的试剂盒及检测方法：1)能够检测到血液样本中的衰老细胞，降低了检测样本取材的难度；2)通过本发明的细胞免疫荧光检测方法还能同时检测血液样本中细胞的其他生物标志物，并能观察染色后的衰老细胞的外观形态和染色体形态，得到的检测数据综合其他相关标志物的数据进行进一步分析处理后，能为评估个体的健康状态特别是肿瘤发生风险的预警提供了有力的依据；3)与现有的染色体核型分析法检测异倍体细胞相比，本发明提供的CD45-p16+组合指标能够更准确地反映个体的肿瘤风险；4)本发明提供的试剂盒组成简单，使用方便，采用本试剂盒进行衰老细胞检测的方法步骤合理，简洁高效，检测结果直观准确。
附图说明
图1为本发明的CD45-p16+的二倍体细胞染色结果图；
图2为本发明的CD45+p16+二倍体细胞(图2细箭头)、CD45+p16-二倍体细胞(图2粗箭头)和CD45-p16-二倍体细胞(图2三角形)的染色结果图；
图3(A)为本发明的两组受试者p16+二倍体细胞平均数结果图；*：p<0.05；
图3(B)为本发明的两组受试者p16+二倍体细胞数量图；*：p<0.05；
图4(A)为本发明的两组受试者p16+异倍体细胞平均数结果图；
图4(B)为本发明的两组受试者p16+异倍体细胞数量图；
图5(A)为本发明的两组受试者异倍体细胞平均数结果图；
图5(B)为本发明的两组受试者异倍体细胞数量图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。未进行特殊说明的仪器、试剂或耗材等均为本领域常规的市售可得的产品。
CRC清洗液、细胞分离液为赛特生物人外周血CTC富集试剂盒组分，试剂盒购自赛特生物，货号：SHE-011；
FR1细胞固定液(FR1)、FR2样品稀释液(FR2)、FR3洗涤液(FR3)、抗体清洗液、偶联SpectrumOrange的CEP8FISH探针(CEP8-550探针)、偶联AlexaFluor 594的CD45抗体(以下简称CD45-594抗体)为赛特生物Vimentin-iFISH CTC检测试剂盒组分，试剂盒购自赛特生物，货号：FSH-002；
偶联AlexaFluor 488的p16抗体购自Abcam(p16-488抗体)，货号：(ab199756)；
偶联CD45抗体的磁珠(DynabeadsTMCD45)购自ThermoFisher，货号：11153。
本发明总共征集健康受试者31例，患癌受试者30例，受试者由上海白泽医学检验所征集，受试者签署知情同意书后进行血液样本的采集；对每名健康受试者还进行健康状况的简单问卷调查(是否吸烟、饮酒、熬夜、锻炼频率等)，对患癌受试者详细了解和记录其病史和治疗史。在以下实施例中所有受试者均匿名。
实施例1血液样本的预处理
1、采集外周血：2mL血弃掉，采集6mL血于枸橼酸钠抗凝管中，24小时内处理样本，采血管室温离心15分钟(200×g)，弃上清，并加清洗液1×CRC清洗液至原体积，尾颠倒混匀；
50mL管中加入3mL细胞分离液，将血细胞缓慢沿管壁加到分离液顶层，室温离心6分钟(350×g)；
离心后可见液体分层，将除最下面一层红细胞之外的溶液全部转移至新的离心管B中，竖直摇匀液体；
加入300微升DynabeadsTMCD45悬液于离心管B中，边加边摇动离心管以混匀，35°至40°角倾斜，固定于摇床上，125rpm，20分钟；
将管B置于磁力架上，2分钟后，使用5mL枪头伸入管底中央轻柔吹打，2分钟后使用同样枪头将液体转移至50mL离心管C中；
C管中加入1×CRC清洗液，颠倒混匀，离心5分钟(500×g)
弃上清，重复清洗一次，弃上清至100微升。
实施例2细胞免疫荧光染色
一、细胞表面抗原染色及固定
1.加入1μL CD45-594抗体，避光孵育20min；
2.1×CRC清洗液混匀，离心5分钟(500×g)，弃上清至100μL；
3.加入100微升FR1于样本中，吹打混匀，涂载玻片，30-32℃干燥箱过夜；
二、染色体荧光原位杂交(FISH)
1.配制20μL FR1+180μL FR2，震荡混匀，滴加载玻片上，避光孵育10min；
2.沿标本框内侧边角轻柔滴加200μL FR3，室温静置2分钟，吸弃溶液，共重复2次；
3.沿标本框内侧边角轻柔滴加200μL无水乙醇后，立即吸弃，共重复2次；
4.将玻片插入缸Ⅱ(无水乙醇)中静置2分钟，晾干，加CEP8-550探针，加盖玻片并用胶封片；
5.将玻片置于杂交仪中变性76℃，10分钟；杂交37℃，3小时；
6.取下胶，FR3缓冲液清洗使盖玻片自然脱落，静止5min，滤纸吸干残留液；
7.加抗体清洗液清洗，室温2min，重复两次。
三、胞内抗原染色
1. 0.1％Triton孵育5min，PBS清洗3次，每次2分钟；
2.加入2微升p16-488抗体，室温孵育2小时或者4度过夜；
3.PBS清洗3次，每次2分钟，将PBS用滤纸吸干，加入含DAPI的封片液；
检测结果见图1、图2、图3(A)和图3(B)所示；
其中，图1显示CD45-p16+的二倍体细胞(图1粗箭头所指)，DAPI表示细胞核染色，CEP8-550为靶向CEP8基因的核酸探针的FISH染色结果；
图2显示了CD45+p16+二倍体细胞(图2细箭头)、CD45+p16-二倍体细胞(图2粗箭头)和CD45-p16-二倍体细胞(图2三角形)；
根据图1和图2的结果显示，血液样品经过偶联有CD45抗体磁珠的负向富集后，通过细胞免疫荧光检测方法能够检测到p16+的细胞；图3(A)和图3(B)所进行的分析针对CD45-p16+的二倍体细胞群进行，p16+细胞即指CD45-p16+细胞，CD45-p16+的二倍体细胞为本发明中所指的循环衰老细胞。
表1和表2分别为健康受试者组与患癌受试者组的细胞免疫荧光染色检测结果的具体信息；
表1健康受试者组信息表
Figure BDA0001889595910000131
Figure BDA0001889595910000141
表2患癌受试者组信息表
Figure BDA0001889595910000142
Figure BDA0001889595910000151
Figure BDA0001889595910000161
表1的结果显示，健康受试者的CD45-p16+二倍体细胞的数量在0-5个；表的结果显示，患癌受试者的CD45-p16+二倍体细胞的数量在0-42个，不同个体间差异较大。
图3(A)和图3(B)显示CD45-p16+二倍体细胞在健康受试者组与患癌受试者组之间的差异，患癌受试者的CD45-p16+二倍体细胞(即循坏衰老细胞)数与健康受试者的相比有显著差异，患癌受试者的循环衰老细胞数明显更多，表明循环衰老细胞的数量增多与患癌风险的提高有关。
当染色体荧光原位杂交(FISH)中的抗体清洗液使用2xSSC+0.1％v/vNP40缓冲液替代时，也获得了类似的结果。
对比例1
对实施例2中健康受试者组和患癌受试者组的CD45-p16+异倍体细胞进行统计，结果如图4(A)和图4(B)所示。
图4(A)和图4(B)分别显示健康受试者组和患癌受试者组的CD45-p16+异倍体细胞的平均数和数量分布均不存在显著差异(p>0.05)，表明CD45-p16+异倍体细胞不能准确反应患癌风险的变化。
对比例2
对实施例2中健康受试者组和患癌受试者组的所有异倍体细胞进行统计，结果如图5所示。
图5(A)和图5(B)分别显示健康受试者组和患癌受试者组的总的异倍体细胞的平均数和数量分布均不存在显著差异(p>0.05)，表明总的异倍体细胞数不能准确反应患癌风险的变化。
CEP8检测核型为异倍体的细胞是目前所通用的检测循环肿瘤细胞(CTC)的标准之一；与之相比，图5的结果表明本发明试剂盒所采用的CD45-p16+结合核型分析的指标组合能够更准确地反应患癌风险的变化。
综上所述，本发明提供一种衰老细胞的检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒及方法以细胞免疫荧光染色和染色体原位杂交为原理，整合多步骤多方法所需试剂，并创造性地加入CD45阳性细胞负向富集试剂，特异性高效检测衰老细胞，结果直观，数据准确，为衰老细胞的检测及其后续应用分析提供有力工具。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种衰老细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CD45阳性细胞负向富集试剂、染色体核型检测试剂和p16抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CD45抗体、细胞固定液、抗体清洗液、样品稀释液、清洗液、CD16阳性细胞负向富集试剂、CD19阳性细胞负向富集试剂或CD235a阳性细胞负向富集试剂中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的载体，优选为偶联CD45抗体的磁珠；
优选地，所述p16抗体为偶联荧光基团的p16抗体，优选为偶联AlexaFluor488的p16抗体；
优选地，所述染色体核型检测试剂为染色体核型检测核酸探针，优选为偶联荧光基团的染色体核型检测核酸探针，进一步优选为偶联Spectrum Orange的CEP8 FISH DNA探针。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括选自溶于PBS的1％v/v FBS、溶于PBS的0.5％w/v BSA和CRC清洗液中的任一种；
优选地，所述细胞固定液包括选自4％多聚甲醛和/或70％乙醇；
优选地，所述样品稀释液包括选自溶于PBS的1％v/vFBS和/或溶于PBS的0.5％w/vBSA；
优选地，所述抗体清洗液为含有NP-40的2×SSC缓冲液；
优选地，所述含有NP-40的2xSSC缓冲液为含有0.1％v/v NP-40的2×SSC的缓冲液；
优选地，所述CD45抗体为偶联荧光基团的CD45抗体，优选为偶联AlexaFluor 594的CD45抗体；
优选地，所述CD16阳性细胞负向富集试剂为偶联CD16抗体的载体，优选为偶联AlexaFluor 488的CD16抗体的磁珠；
优选地，所述CD19阳性细胞负向富集试剂为偶联CD19抗体的载体，优选为偶联CD19抗体的磁珠；
优选地，所述CD235a阳性细胞负向富集试剂为偶联CD235a抗体的载体，优选为偶联CD235a的磁珠。
5.一种用于非诊断与治疗目的的检测衰老细胞的方法，采用如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将血液样品进行预处理，去除血细胞和白细胞；
(2)将步骤(1)预处理后的样品进行细胞表面抗原染色并固定；
(3)将步骤(2)细胞表面染色后的样品进行染色体荧光原位杂交；
(4)将步骤(3)杂交后的样品进行胞内抗原染色，检测细胞免疫荧光染色结果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样品为外周血；
优选地，步骤(1)所述去除血细胞的方法为密度梯度离心。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述去除白细胞的方法为：
向去除血细胞后的样品中加入权利要求1-4中任一项所述试剂盒中的CD45阳性细胞负向富集试剂；
优选地，向去除血细胞后的样品中加入权利要求1-4中任一项所述试剂盒中的CD45阳性细胞负向富集试剂和选自权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的CD16阳性细胞负向富集试剂、CD19阳性细胞负向富集试剂和CD235a阳性细胞负向富集试剂中的任意一种或几种，混匀孵育，固液分离后吸取上清；
优选地，所述CD45阳性细胞负向富集试剂为偶联CD45抗体的磁珠；
优选地，所述CD16阳性细胞负向富集试剂为偶联CD16抗体的磁珠；
优选地，所述CD19阳性细胞负向富集试剂为偶联CD19抗体的磁珠；
优选地，所述CD235a阳性细胞负向富集试剂为偶联CD235a抗体的磁珠；
优选地，所述固液分离为外加磁场吸附进行分离。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞表面抗原染色并固定方法为：
加入权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的CD45抗体避光孵育，采用权利要求2-4中任一项所述清洗液清洗，加入权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的细胞固定液固定。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述染色体荧光原位杂交的方法为：
将权利要求2-4中任一项试剂盒中的所述细胞固定液和样品稀释液混匀，清洗并脱水后，加入权利要求1-4中任一项所述试剂盒中的染色体核型检测核酸探针，进行变性杂交；
优选地，步骤(4)所述胞内抗原染色的方法为：用Triton孵育并清洗，加入权利要求1-4中任一项所述试剂盒中的p16抗体进行孵育并清洗，加入含DAPI的封片液后进行检测。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将血液样品进行预处理，密度梯度离心去除血细胞，向去除血细胞后的样品中加入权利要求3-4中任一项所述试剂盒中的偶联CD45抗体的磁珠混匀孵育，外加磁场吸附磁珠后吸取上清，获得预处理后的样品；
(2)将步骤(1)所述预处理后的样品进行细胞表面抗原染色并固定，包括：
加入权利要求2-4中任一项试剂盒中的所述CD45抗体避光孵育，采用权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的清洗液清洗，加入权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的细胞固定液固定，获得细胞表面染色后的样品；
(3)将步骤(2)所述细胞表面染色后的样品用权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的染色体核型检测试剂进行染色体荧光原位杂交，包括：
将权利要求2-4中任一项所述试剂盒中的细胞固定液和样品稀释液混匀，清洗并脱水后，加权利要求3-4中任一项所述试剂盒中的偶联荧光基团的染色体核型检测核酸探针，进行变性杂交，获得变性杂交后的样品；
(4)将步骤(3)所述变性杂交后的样品用权利要求3-4中任一项所述试剂盒中的偶联荧光基团的p16抗体进行胞内抗原染色，包括：
用Triton孵育并清洗后，加入权利要求3-4中任一项所述试剂盒中的偶联荧光基团的p16抗体进行孵育并清洗，加入含DAPI的封片液后进行检测。
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