JP5814128B2 - 肝疾患治療薬 - Google Patents

Description

本発明は、細胞内のユビキチン陽性封入体の形成を制御するｐ６２とＫｅａｐ１のタンパク質相互作用、前記相互作用を阻害又は抑制する物質を有する肝疾患治療薬および抗がん剤、前記相互作用を用いたスクリーニング方法などに関する。

肝臓はヒトにおける最大の代謝器官であり、生命維持に必須の臓器である。この臓器は、高カロリー・高脂肪の飲食、ストレスなどにより肝肥大、脂肪肝などを引き起こし、機能低下を招く。またウイルス感染やアルコール摂取などにより、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎を引き起こし、これらの障害が長期にわたると肝硬変や肝がんに至る。
しかしながら、これらの肝疾患に対する有効な薬剤が開発されていないのが現状である。そのため、様々な肝疾患に対して有効な薬剤の開発が望まれている。その中で、本発明者らのオートファジーの研究から有望な肝疾患治療薬および抗がん剤を提供する。
オートファジーは細胞成分の代謝回転、無用なオルガネラの除去、凝集易発性の変異タンパク質の除去などに関与する細胞内大規模分解経路である。オートファジーはまず、隔離膜が伸長し、細胞質構成成分を取り囲んだ脂質二重膜構造体（オートファゴソーム）を形成する。このオートファゴソームがリソソームと融合し、リソソームの加水分解酵素により囲い込まれた細胞質成分を分解する。酵母遺伝学の研究により、数多くのＡＴＧ遺伝子がオートファジーに必須の役割を担っていることが知られるようになった。オートファゴソームに局在するＬＣ３は酵母Ａｔｇ８のヒトホモログとして同定され、隔離膜の伸長に必須の役割を担っている。そのＬＣ３との結合因子としてｐ６２が取得された（非特許文献１：Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｅｌｌ）。
ｐ６２はシグナル伝達を担う多彩な分子群と相互作用する。またＣ末端にユビキチン会合ドメインを有しており、ユビキチン化タンパク質のプロテアソームへのシャトル分子として知られている（非特許文献２：Ｓｅｉｂｅｎｈｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４ ＭＣＢ）。またｐ６２はＬＣ３との相互作用を介してオートファジー・リソソーム系で分解されることから、オートファジーに対する選択的基質とされている（非特許文献３：Ｂｊｏｋｏｙ ｅｔ ａｌ．２００５ ＪＣＢ，非特許文献４：Ｐａｎｋｉｖ ｅｔ ａｌ．２００７ ＪＢＣ，非特許文献５：Ｉｃｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００８ ＪＢＣ）。実際にｐ６２のノックアウトマウスにおいて正常なオートファゴソーム形成およびリソソームによるタンパク質分解が確認されている。またｐ６２ノックアウトマウスは２型糖尿病を発症するが、オートファジー欠損マウスにおいて観察される肝障害や神経変性は確認されていない（非特許文献６：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ａ ２００６ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ）。
肝臓もしくは脳特異的Ａｔｇ７欠損マウスの肝臓もしくは脳において、ｐ６２が蓄積、不溶化し、最終的にｐ６２陽性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）が確認される。またＡｔｇ７欠失肝臓、脳において、ユビキチン化タンパク質とｐ６２は比例的に蓄積し、ほぼ全ての封入体がユビキチン・ｐ６２陽性である（非特許文献７：Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２００５ ＪＣＢ，非特許文献１：Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｅｌｌ）。封入体の形成過程は、変異タンパク質の折りたたみ異常、可溶性オリゴマー形成、そして可溶性オリゴマーの不溶化・封入体として蓄積の３段階よりなる。この封入体の形成は、様々な病態（アルコール性肝炎やパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＡＬＳなどの神経変性疾患）において観察されており、オートファジー欠損マウスでは、細胞内封入体形成を伴った肝細胞肥大、肝肥大を引き起こし、肝障害を発症する。Ａｔｇ７とｐ６２を同時に欠損させると、封入体の形成はほぼ完全に抑制され、またオートファジー不全で確認される肝肥大・肝障害を強く抑制した。このことは過度なｐ６２の蓄積が肝障害の主原因であることを示している（非特許文献１：Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｅｌｌ）。重要なことに、ユビキチン・ｐ６２陽性封入体の蓄積は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症，星状細胞腫などの神経性疾患や、アルコール性肝炎、脂肪肝、肝がん患者の肝臓組織においても同定されている（非特許文献８：Ｓｔｕｍｐｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｈｐａｔｏｌｏｇｙ，非特許文献９：Ｚａｔｌｏｕｋａｌ Ｋ ｅｔ ａｌ．ＡＭ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２）。
さらにオートファジー欠損肝臓においは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ），ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＮＱＯ１（ｑｕｉｎｉｎｅ １）など一連の解毒酵素群の転写が著しく誘導されている。これらの解毒酵素群の転写のほとんどは転写因子Ｎｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）によって制御されることが知られている。通常、Ｎｒｆ２はユビキチンリガーゼＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）に捕獲され、ユビキチン化を受けることによりプロテアソームによって分解されている。一方酸化ストレスないし親電子性物質に暴露されると、Ｋｅａｐ１の特定のシステイン残基が酸化されＮｒｆ２との結合を失う。その結果、分解を免れたＮｒｆ２は核内に移動し、ＧＳＴやＮＱＯ１などの解毒酵素群の転写を活性化することが明らかにされている（非特許文献１０：Ｔｏｎｇ ＫＩ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７）。またオートファジー欠損肝臓では、Ｎｒｆ２が核内に蓄積し、その蓄積はｐ６２の同時欠損で抑制される。これらの結果は，ｐ６２依存的なＮｒｆ２制御機構の存在を示唆する。

Ｃｅｌｌ １３１，１１４９−６３，２００７ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４，８０５５−６８，２００４ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７１，６０３−１４，２００５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，２４１３１−４５，２００７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，２２８４７−５７，２００８ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．３，２１１−２２，２００６ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６９，４２５−３４，２００５ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４６，８５１−６０，２００７ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６０，２５５−６３，２００２ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７，７５１１−２１，２００７

上記の各知見により、過度のユビキチン陽性封入体形成が肝疾患（肝細胞がんや肝障害など）を引き起こし、またｐ６２が封入体の形成に深く関与することが示唆されている。
そこで本発明は、ｐ６２の封入体形成の制御メカニズムを同定し、そのメカニズムに基づく新規な肝疾患治療薬および抗がん剤、あるいは診断薬を提供することを主な目的とする。

本発明者らは、ｐ６２がＫｅａｐ１と結合することを初めて見出した。またＫｅａｐ１におけるｐ６２の結合部位は、Ｎｒｆ２の結合と同じポケットを使用していることも明らかにした。オートファジー欠損によってｐ６２が蓄積すると、Ｋｅａｐ１とｐ６２の結合が増加し、それに伴いフリーのＮｒｆ２が増加する。そして蓄積したＮｒｆ２が核内へ移行し、解毒酵素群の転写を上昇させている。
また、本発明者らの実験によれば、オートファジー欠損の肝臓でＮｒｆ２も同時欠損させると、細胞内封入体の形成やそれに伴う肝肥大、肝障害を抑圧できた。これはＫｅａｐ１とｐ６２の結合増加が、直接Ｎｒｆ２の活性化、そして肝肥大や肝障害、そして肝臓がんを導くことを示す。したがって、ｐ６２とＫｅａｐ１の結合を阻害することでユビキチン−ｐ６２陽性封入体の形成を防ぎ、肝肥大、肝障害、肝臓がん治療あるいは、ユビキチン−ｐ６２陽性封入体形成が確認されている星状細胞腫の治療に繋がることが示唆される。
したがって、本発明は、以下の剤、診断方法、診断キット、診断剤、およびスクリーニング方法を提供する。
（１）Ｋｅａｐ１とｐ６２との結合の阻害または抑制剤。
（２）上記（１）に記載の剤であって、
ｉ）ｐ６２に特異的に結合する分子、または
ｉｉ）ｐ６２の発現阻害物質
を含有する剤。
（３）ｉ）ユビキチン陽性封入体形成の阻害又は抑制剤、
ｉｉ）肝疾患の治療剤、または
ｉｉｉ）抗がん剤
として使用される、上記（１）または（２）に記載の剤。
（４）上記ｐ６２に特異的に結合する分子が、
ｉ）ｐ６２のＫｅａｐ１相互作用領域に特異的に結合する物質、
ｉｉ）マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）中の３４９位のアスパラギン酸、３５０位のプロリン、３５２位のスレオニン、３５３位のグリシン、もしくは３５４位のグルタミン酸に特異的に結合する物質、または
ｉｉｉ）上記ｐ６２の発現阻害物質が、ｐ６２をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡ
である、上記（２）または（３）に記載の剤。
（５）上記ｐ６２に特異的に結合する分子が、ＬＣ３または抗ｐ６２抗体である、上記（２）に記載の剤。
（６）上記（３）に記載の肝疾患の治療剤の適用患者を判定する方法であって、
ｉ）被験者の肝生検によるｐ６２もしくはＮｒｆ２の発現量を測定する工程、または
ｉｉ）被験者の肝生検によるＮｒｆ２の活性を測定する工程、
を含む、方法。
（７）被験者の血液中のＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬＰ，またはγ−ＧＴＰの酵素活性を測定することをさらに含む、上記（６）に記載の方法。
（８）上記（６）に記載の方法に使用する診断キットまたは診断剤であって、
抗ｐ６２抗体または抗Ｎｒｆ２抗体を含み、
上記キットはさらに使用説明書
を含む、キットまたは剤。
（９）Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質（ａｇｅｎｔ）のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験物質の存在下および非存在下でＫｅａｐ１とｐ６２との結合量を測定する工程、および
ｉｉ）上記試験物質の存在下と非存在下との間でＫｅａｐ１とｐ６２との上記結合量を比較し、上記試験物質の存在下での上記結合量が上記試験物質の非存在下での上記結合量よりも低い場合に、当該試験物質をＫｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質として選択する工程
を含む、方法。
（１０）上記結合量を測定する工程において、プルダウン法、質量分析法、タンパク質間相互作用を蛍光シグナルとして検出する方法、または蛍光標識を用いたイメージングのいずれかが用いられる、上記（９）に記載の方法。
（１１）ユビキチン陽性封入体形成を阻害または抑制する物質のスクリーニングのために使用する、上記（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）肝疾患の治療剤のスクリーニングのために使用する、上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記結合量を測定する工程が、
ｉ）ｐ６２のＫｅａｐ１相互作用領域、または
ｉｉ）マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４５番から３５９番目のアミノ酸配列：ＳＫＥＶＤＰＳＴＧＥＬＱＳＬＱ（配列番号：５）
に対するＫｅａｐ１の結合量を測定することを含む、上記（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）上記物質が、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４９位のアスパラギン酸、３５０位のプロリン、３５２位のスレオニン、３５３位のグリシン、または３５４位のグルタミン酸に特異的に結合する、上記（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
本発明は、ユビキチン陽性封入体形成を制御するｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用の制御方法を提供する。
オートファジーが欠失することにより、細胞内のｐ６２タンパク質の蓄積と不溶化、ｐ６２−ユビキチン陽性封入体が蓄積、それに伴った肝障害が起こることが知られている。またこの封入体の蓄積がｐ６２の欠失により解消されることが知られている。
本発明者らは今回、ｐ６２とＫｅａｐ１が直接結合すること、その結合部位はＫＩＲ（Ｋｅａｐ１ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）配列（マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）における３４５番目から３５９番目アミノ酸残基からなる領域に相当する）で、その中でも特に５つのアミノ酸（３４９番目アスパラギン酸、３５０番目プロリン、３５２番目トレオニン、３５３番目グリシン、３５４番目グルタミン酸）が結合に重要であることを見出した。
またｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用は、Ｋｅａｐ１の不溶化、肝細胞における解毒酵素群の転写因子であるＮｒｆ２の安定化と活性化を導き、解毒酵素群（抗酸化タンパク質等）の発現、細胞内封入体の蓄積、肝機能の低下を誘発することを新規に見出した。
したがって、ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用（または結合）を制御（抑制または促進）することにより、Ｋｅａｐ１の不溶化、肝細胞における解毒酵素群の転写因子であるＮｒｆ２の安定化と活性化、解毒酵素群（抗酸化タンパク質等）の発現、細胞内封入体の蓄積、肝機能の低下等を制御できる。
本発明は細胞保護酵素遺伝子の転写を制御するメカニズムにおける、選択的オートファジーの新たな役割を見出した点において、重要な意義を有する。
続いて、本発明はｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する肝疾患の治療薬を提供する。
上述の通り、オートファジーの減弱が、様々な疾患で確認されるユビキチン・ｐ６２陽性封入体を伴った肝細胞がんや肝障害を引き起こす。これはｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を抑制することで解消されるため、ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質は、肝疾患治療薬および抗がん剤に適用できる可能性が高い。
Ｋｅａｐ１と結合するｐ６２の部位は、ｐ６２の他のタンパク質と相互作用する部位とは異なることから、この治療薬および抗がん剤によりオートファジーの異常が起きる可能性は低い。またＫｅａｐ１とｐ６２の相互作用がＮｒｆ２の安定化、活性化を導くが、ｐ６２−Ｋｅａｐ１の結合に伴うＮｒｆ２活性化システムは肝臓以外ではほとんど機能していないと考えられることから、ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する抗がん剤は、副作用が少ないと考える。
さらに、本発明は細胞内のｐ６２の量を抑制することでＫｅａｐ１とｐ６２の相互作用を阻害又は抑制する肝疾患の治療薬および抗がん剤を提供する。
上述の通り、オートファジーの減弱が、ｐ６２の蓄積を促し、肝細胞がんなどの肝疾患を引き起こす。この病変はｐ６２を欠損させることで大きく改善される。またｐ６２はＬＣ３と結合しオートファジーにより分解される。ｐ６２とＬＣ３が結合できない変異体を細胞に導入するのみで、ユビキチン陽性封入体が形成される。これらのことより、ｐ６２の発現そのものを抑制する物質や、ｐ６２を積極的分解に誘導できる物質は、肝疾患の治療薬に適用できる可能性が高い。

本発明は、新規な作用機序に基づく肝疾患治療薬および抗がん剤、診断薬またはそのスクリーニング方法などに応用できる。本発明の肝疾患治療剤は、副作用が少ないという利点を有する。

Ｋｅａｐ１の欠失変異構築物（左パネル）の模式図とそれに対応する免疫沈降アッセイ（右パネル）の結果を示す図である。 （ａ）ｐ６２の欠失変異構築物（左パネル）とそれに対応するインプット（右上パネル）およびプルダウンアッセイ（右下パネル）を示す図である。（ｂ）種々の種におけるｐ６２のホモログのＫｅａｐ１−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＫＩＲ；赤線部）およびＬＣ３認識配列（ＬＲＳ；緑線部）のアラインメントを示す。黒およびグレーを付した部分は、それぞれ、完全保存および部分的保存の同一のアミノ酸残基を示す。 ｐ６２の点変異構築物のリストおよびそれに対応するプルダウンアッセイを示す図である。ＧＳＴ−Ｋｅａｐ１−ＤＣ、ＭＢＰ−ｐ６２Ｍ８０およびその点変異、ならびにＭＢＰ−ｐ６２Ｍ８３が示されている。 免疫沈降アッセイの結果を示す図である。各ＦＬＡＧタグを付けたＫｅａｐ１およびリストされている点変異をＨｅｋ２９３Ｔ細胞において発現した。細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降し、得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ｐ６２抗体で免疫ブロットにより分析した。ＦＬＡＧ−Ｋｅａｐ１、内因性のｐ６２、Ｎｒｆ２、およびアクチンが示されている。３つの独立した実験からの結果を示す。 免疫沈降アッセイの結果を示す図である。ＦＬＡＧタグの付いたｐ６２およびＫｅａｐ１との相互作用ができない変異体（ｐ６２ Ｔ３５２Ａ）を、アデノウイルスシステムを用いて野生型初代マウス肝細胞において過剰発現させた。感染の４８時間後に、細胞を１０μＭラクタシスチンの非存在下（レーン１，３，および５）または存在下（レーン２，４，および６）で４時間培養した。細胞溶解物を、抗Ｎｒｆ２抗体で免疫沈降した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｎｒｆ２抗体および抗ユビキチン抗体で免疫沈降することにより分析した。Ｎｒｆ２、ユビキチン化Ｎｒｆ２、ＦＬＡＧ−ｐ６２、内因性ｐ６２、およびアクチンに対応するバンドが示されている。３つの独立した実験からの結果を示す。 Ｋｅａｐ１に対するｐ６２の競合的活性をルシフェラーゼアッセイによって測定した結果を示す図である。Ｎｒｆ２、Ｋｅａｐ１、およびｐ６２野生型またはその変異体についての発現プラスミドを、ｐＮｑｏ１−ＡＲＥレポータープラスミドおよび内部コントロールとしてのｐＲＬ−ＴＫっともにＨｅｐａ１細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後に、製造業者の指示書に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイは３連で２回行った。 （ａ）Ａｔｇ７欠損肝細胞におけるＫｅａｐ１の不溶化を示す図である。（ｂ）Ａｔｇ７欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）およびＡｔｇ７／ｐ６２欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：ｐ６２^−／−）肝臓の免疫ブロット分析の結果を示す図である。 マウス肝臓におけるＮｑｏ１およびＧｓｔｍ１の定量的リアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す図である。 ｐ６２およびＫｅａｐ１の細胞内局在の免疫蛍光分析の結果を示す図である。ｐＩｐＣ注入後２８日での図に示された遺伝子型のマウス由来の肝臓切片を抗ｐ６２抗体（上段パネル）および抗Ｋｅａｐ１抗体（中段パネル）で免疫染色した。下段パネルはＫｅａｐ１（グリーン）およびｐ６２（レッド）の画像を重ね合わせたものである。Ａｔｇ７欠損肝臓のパネルの中の各差し込み図は、四角で囲んだ領域の拡大図である。バーは２０μｍである。 Ａｔｇ７欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）およびＡｔｇ７／Ｎｒｆ２欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：Ｎｒｆ２^−／−）肝臓の免疫ブロッティングの結果を示す図である。 ｐ６２およびＫｅａｐ１の細胞内局在の免疫蛍光分析の結果を示す図である。 マウス肝臓中のＮｑｏ１、Ｇｓｔｍ１、およびＣｙ２ａ５の定量的リアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す図である。トータルＲＮＡを、ｐＩｐＣ注入後２８日目に図に示された遺伝子型の肝臓から調製した。値は、Ａｔｇ７^Ｆ／Ｆ肝臓におけるｍＲＮＡ量に対して正規化したものである。実験は３回行った。パネル（ｄ）−（ｈ）：Ａｔｇ７^Ｆ／Ｆ（コントロール）（パネル（ｄ））およびＡｔｇ７／Ｎｒｆ２欠損（Ａｔｇ７−／Ｎｒｆ２−）（パネル（ｅ）−（ｈ））肝臓の電子顕微鏡写真である。パネル（ｅ）および（ｇ）中の四角で囲んだ領域は拡大され、それぞれパネル（ｆ）および（ｈ）として示されている。コントロールの肝臓で容易に検出されるグリコーゲン領域（アスタリスク）は、大量の平滑ＥＲで占められ、多数のペルオキシソーム（そのいくつかはパネル（ｆ）およびパネル（ｇ）中、矢印で示されている）が周囲領域に蓄積していることに注意。パネル（ｇ）および（ｈ）はＡｔｇ７／Ｎｒｆ２欠損肝臓において観察される典型的な封入体を示す。バー：（ｄ）および（ｅ），５μｍ；（ｆ）および（ｇ），１μｍ；（ｈ），０．２μｍ。 （ａ）ｐＩｐＣ注入後２８日目における異なる遺伝子型のマウス肝臓の重量の測定結果を表す図である。データは、各グループについて５匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔテスト）。（ｂ）図に示された遺伝子型のマウスの典型的な肝組織学を示す。ｐＩｐＣ注入後２８日目の肝臓を、Ｈ＆Ｅ染色で処理した。高次の拡大写真は、下側のパネルに示されている。ＣＶは中心静脈、Ｐは門脈である。バー：１００μｍ。 図１３で使用したマウスの肝機能テストの結果を示す図である。 ヒト肝細胞癌の二重免疫蛍光顕微鏡画像を示す図である。典型的な封入体を含有する肝細胞癌の３つの症例（組織学的段階を示した）について、抗Ｋｅａｐ１抗体および抗ｐ６２抗体で免疫染色した。Ｋｅａｐ１（グリーン）およびｐ６２（レッド）の画像を重ね合わせたものを右側のパネルに示した。バーは１０μｍである。 Ｎｒｆ２の標的プロモーターであるＡＲＥにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を繋げたプラスミドを安定に保持する細胞株にアデノウイルス感染系を用いてｐ６２−ＷＴ、ｐ６２−Ｔ３５２Ａ（Ｋｅａｐ１と結合できない変異体）、Ｋｅａｐ１、ＧＦＰ（コントロール）を過剰発現させて、ルシフェラーゼ活性を測定したアッセイの結果を示す図である。 オートファジー欠損マウスの長期飼育により形成された腫瘍におけるＫｅａｐ１の不溶化およびＮｒｆ２の活性化は、ｐ６２依存的であることを示す図である。（Ａ）はＡｐｇ７^ｆ／ｆマウス（コントロール）およびＡｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（肝特異的オートファジー欠損マウス）の各月齢における肝臓の写真を示す。（Ｂ）は各１２月齢マウスの肝臓から調節した抽出液の免疫ブロッティングの結果を示す図である。（Ｃ）は各１２月齢マウスの肝臓から調整したＲＮＡを用いた定量的ＰＣＲの結果を示す図である。

１．ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害または抑制する物質
本発明は、１つの実施形態において、ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害または抑制する物質（ａｇｅｎｔ）を提供する。ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質は、肝疾患治療薬および抗がん剤として適用できる可能性がある。
「ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質」としては、
例えば
（１）ｐ６２の立体構造中の、Ｋｅａｐ１との結合部位に対して特異的に結合する物質、
（２）ｐ６２の立体構造中の、Ｋｅａｐ１との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害または抑制する物質、
（３）ｐ６２と結合して、ｐ６２の立体構造を変化させる物質、
（４）ｐ６２の発現を阻害することにより、相互作用を阻害又は抑制する物質、
（５）ｐ６２をオートファジーで分解することにより、相互作用を阻害又は抑制する物質、等が含まれる。
典型的には、「ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質」としては、
ｉ）ｐ６２に特異的に結合する分子、または
ｉｉ）ｐ６２の発現阻害物質
が含まれる。
「ｐ６２」は、ユビキチン結合タンパク質として知られている。ｐ６２のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、一般に利用可能な配列データベースから入手することができる。それらのデータベースのアクセッション番号のいくつかをここに記載する。［データベース名称：アクセッション番号（種名）］：ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００３８９１．１（ヒト）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００３９００．４（ヒト）、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０３５１４８．１（マウス）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿０１１０１８．２（マウス）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：００８６２３．１（ラット）、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿７８７０３７．２（ラット）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿１７５８４３．３（ラット）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ５ＲＢＡ５．１（オランウータン）。本明細書中で「ｐ６２」という場合、ヒトｐ６２に限定されず、ｐ６２の他の種（例えば、他の哺乳動物種（例えば、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラットなど）、は虫類、両生類、魚類など。）のホモログも含まれるものとする。そのようなホモログのアミノ酸配列は、例えば、ヒトｐ６２のアミノ酸配列（配列番号１）もしくはマウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはヒトｐ６２のアミノ酸配列（配列番号１）もしくはマウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）において１〜数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる。
「Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）」は、ＮＦ−Ｅ２関連因子２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（Ｎｒｆ２））とレドックス感受性な様式で相互作用し、細胞質でこのタンパク質が乖離するとＮｒｆ２は核へ移行することが知られている。この相互作用は、γグルタミルシステインシンセターゼの触媒サブユニットの発現を制御することが知られている。Ｋｅａｐ１のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、一般に利用可能な配列データベースから入手することができる。それらのデータベースにおけるアクセッション番号のいくつかをここに記載する。［データベース名称：アクセッション番号（種名）］：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ１４１４５．２（ヒト）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ９Ｚ２Ｘ８．１（マウス）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ３４６３９．１（マウス）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２００６３．１（マウス）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ６８４Ｍ４．１（ブタ）。本明細書中で「Ｋｅａｐ１」という場合、ヒトＫｅａｐ１に限定されず、ｋｅａｐ１の他の種（例えば、他の哺乳動物種（例：サル、ウシ、ブタ、マウス、ラットなど）、は虫類、両生類、魚類など。）のホモログも含まれるものとする。そのようなホモログのアミノ酸配列は、例えば、ヒトＫｅａｐ１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはヒトＫｅａｐ１のアミノ酸配列において１〜数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる。
本明細書中、「ｐ６２に特異的に結合する」分子とは、その分子が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、ｐ６２またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋ_ａ）が少なくとも１０^７Ｍ^−１、好ましくは、少なくとも１０^８Ｍ^−１、より好ましくは、１０^９Ｍ^−１、さらにより好ましくは、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１、１０^１２Ｍ^−１またはそれより高い、例えば、最高で１０^１３Ｍ^−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
「ｐ６２に特異的に結合する分子」の例には、下記のｉ）およびｉｉ）が含まれる。
ｉ）ｐ６２のＫｅａｐ１相互作用領域（Ｋｅａｐ１ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）〔ＳＫＥＶＤＰＳＴＧＥＬＱＳＬＱ（配列番号：５）、配列番号５のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列中に１〜数個（例：１、２、３個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列〕に特異的に結合する物質、
ｉｉ）マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４９位のアスパラギン酸、３５０位のプロリン、３５２位のスレオニン、３５３位のグリシン、もしくは３５４位のグルタミン酸に特異的に結合する物質。
本明細書中、「Ｋｅａｐ１相互作用領域（Ｋｅａｐ１ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：ＫＩＰ）」とは、マウスｐ６２のアミノ酸配列中の３４５位〜３５９位のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列の領域、またはマウス以外の哺乳動物種（例：ヒト、サル、ウシ、ラット等）もしくはその他の種（例：は虫類、両生類、魚類等）のｐ６２のアミノ酸配列中の上記部分アミノ酸配列の領域に対応する高度に保存されたアミノ酸配列の領域であって、Ｋｅａｐ１と特異的に結合するｐ６２上の領域を指すものとする（図２ｂを参照）。
ｐ６２はＫｅａｐ１と相互作用し、ｐ６２の過剰状態の際は、Ｋｅａｐ１と結合したｐ６２が増加し、ｐ６２−Ｋｅａｐ１複合体は不溶化状態となっている。Ｋｅａｐ１は通常ｐ６２と同じ領域でＮｒｆ２と結合しており、Ｎｒｆ２をユビキチン−プロテアソーム分解経路へと誘導する。しかしｐ６２が高発現すると、ｐ６２とＫｅａｐ１が結合・不溶化することでフリーのＮｒｆ２量が増大する。蓄積したＮｒｆ２は核内に移行し、下流因子の発現が誘導され、ｐ６２・ユビキチン陽性封入体が形成される。過剰な封入体形成は肝細胞がん、肝障害などの肝疾患を引き起こす。
したがって、上記阻害または抑制剤は、典型的には、ｉ）ユビキチン陽性封入体形成の阻害又は抑制剤、ｉｉ）肝疾患の治療剤、またはｉｉｉ）抗がん剤として使用され得る。
細胞内のｐ６２の量は、ＬＣ３との相互作用に対してオートファジーで規定されているので，この結合を増強させる物質の投与は細胞内でのｐ６２の量を減少させ、肝細胞がんや肝障害を抑える。
したがって、本発明のさらなる実施形態では、上記「ｐ６２に特異的に結合する分子」がＬＣ３である。
また、さらに別の実施形態では、上記「ｐ６２に特異的に結合する分子」は、ｐ６２に特異的に結合する抗体（抗ｐ６２抗体）である。
本明細書中、「ｐ６２の発現阻害物質」とは、ｐ６２遺伝子のｍＲＮＡへの転写および／またはｐ６２遺伝子（ｍＲＮＡ）のタンパク質への翻訳を阻害する物質のことを指す。
「ｐ６２の発現阻害物質」の例には、下記のｉｉｉ）およびｉｖ）が含まれる。
ｉｉｉ）前記ｐ６２の発現阻害物質が、ｐ６２をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡ、
ｉｖ）ｐ６２遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸。
本明細書中、「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ここでいう「核酸」は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであって良い。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていて良く、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明の肝疾患の治療剤またはがん治療剤においては、ｐ６２遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、１９〜３０塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），Ｆｅｂ．，１８０−１８３；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），Ａｐｒｉｌ，２４０−２４４；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｐｅ．２１，４０７：６８０２，３１９−２０；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），Ａｐｒ．１６，９４８−９５８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），１６ Ａｐｒ．，５５１５−５５２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），１９ Ａｐｒ．，５５０−５５３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｐｒ．３０，９９：９，６０４７−６０５２；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，４９７−５００；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，５００−５０８；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｍａｙ １５など）。
本発明で用いられるＲＮＡｉ効果を奏する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２０〜２７塩基、より好ましくは２１〜２５塩基、最も好ましくは２１〜２３塩基である。
本明細書中、「アンチセンス核酸」、または「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、ある対象となるＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドを有し、そのポリヌクレオチドが当該領域の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる核酸のことをいう。本発明のアンチセンス核酸またはアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。それらは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するものなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。
遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相補性を有する。
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも約１０塩基以上（例えば、１０〜４０個程度）、好ましくは約１５塩基以上であり、より好ましくは約１００塩基以上であり、さらに好ましくは約５００塩基以上である。アンチセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる（例えば、平島および井上、新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３、ｐ．３１９−３４７）、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ．Ｖｏｌ．８，ｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３など参照）。
本明細書中、「リボザイム活性」とは、ターゲットとする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを部位特異的に切断する核酸のことをいう。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（タンパク質核酸酵素、１９９０、３５、ｐ．２１９１）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，ｐ．２２８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，ｐ．２８５；タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，ｐ．２１９１；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８９，１７，ｐ．７０５９などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，ｐ．３４９；Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９，．６７５１；菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，ｐ．１１２などを参照することができる。このようなリボザイムを用いてｐ６２遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
これらの物質によりｐ６２の発現が抑制された場合、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２の結合が回復し、Ｎｒｆ２が不活性化することで、肝細胞がんや肝障害を抑えることができる。
したがって、本発明のさらなる実施形態では、ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害または抑制する物質を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する、肝疾患および／またはがんの治療方法が提供される。
２．ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害または抑制する物質を含有する剤
本発明のさらなる（ｆｕｒｔｈｅｒ）実施形態では、Ｋｅａｐ１とｐ６２との結合の阻害または抑制剤が提供される。この剤（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、典型的には、上記のｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を含有する。具体的には、この剤は、
ｉ）ｐ６２に特異的に結合する分子、または
ｉｉ）ｐ６２の発現阻害物質
を含有する。
本発明の上記剤は、肝疾患またはがんの治療用製剤として使用され得る。このような製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、上記のｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を、慣用されている製剤担体とを混合することにより製造することができる。
製剤担体は、投与形態に応じて、適宜、組み合わせて用いればよく、例えば、乳糖等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の結合剤；マクロゴール等の界面活性剤；炭酸水素ナトリウム等の発泡剤；シクロデキストリン等の溶解補助剤；クエン酸等の酸味剤；エデト酸ナトリウム等の安定化剤；リン酸塩等のｐＨ調整剤などが挙げられる。
それを必要とする患者に投与する際には、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤および、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤、吸入剤等として用いることもできる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。また錠剤には舌下錠、口腔内貼付錠、口腔内速崩壊錠などが含まれる。
このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのままか、または賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤・乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、および点鼻剤等が含まれる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により製造、調製される。
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造、調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
３．本発明のスクリーニング方法
本発明は、さらに別の実施形態において、Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質（ａｇｅｎｔ）のスクリーニング方法を提供する。この方法は、典型的には、
ｉ）試験物質の存在下および非存在下でＫｅａｐ１とｐ６２との結合量を測定する工程、および
ｉｉ）前記試験物質の存在下と非存在下との間でＫｅａｐ１とｐ６２との前記結合量を比較し、前記試験物質の存在下での前記結合量が前記試験物質の非存在下での前記結合量よりも低い場合に、当該試験物質をＫｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質として選択する工程、を包含する。
ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質は、肝疾患治療薬および抗がん剤に適用し得る。ｐ６２とＫｅａｐ１のタンパク質間相互作用を阻害又は抑制する物質を探索することにより、肝疾患の治療のための新規薬剤をスクリーニングすることができる。
相互作用の検出は、プルダウン法（例：図３）、質量分析計を用いた方法、タンパク質間相互作用を蛍光シグナルとして検出する方法、蛍光標識を用いたイメージング等の方法により行うことができる。
本発明のスクリーニング方法のより具体的な実施形態では、「試験物質の存在下および非存在下でＫｅａｐ１とｐ６２との結合量を測定する工程」が、ｐ６２のＫＩＲ配列（例：ＳＫＥＶＤＰＳＴＧＥＬＱＳＬＱ（配列番号：５）、配列番号５のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列中に１〜数個（例：１、２、３個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列）に対するＫｅａｐ１の結合量を測定することを含む。
本発明のスクリーニング方法のより具体的な実施形態では、「Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質」が、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４９位のアスパラギン酸、３５０位のプロリン、３５２位のスレオニン、３５３位のグリシン、または３５４位のグルタミン酸に特異的に結合する。
本発明のスクリーニング方法のより具体的な実施形態では、さらに、
ｉｉｉ）Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質を肝疾患モデル動物に投与して、Ｎｒｆ２の活性を測定する工程、および
ｉｖ）Ｎｒｆ２の活性が減少した場合に、上記物質を肝疾患の治療剤候補として選択する工程
を包含する。
このような本発明のスクリーニング方法により得られる物質の例としては、ＬＣ３、抗ｐ６２抗体などが挙げられるが、これらに限定されず、低分子化合物（天然または合成）、タンパク質またはペプチド、多糖、脂質、核酸などが含まれ得る。
ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質、あるいは細胞内のｐ６２の量を減少させる物質は肝疾患治療薬および抗がん剤に適用し得る。これらの物質はＫｅａｐ１と結合するｐ６２の量を低下させ、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２との結合を増大させることでＮｒｆ２を不活性化（分解）させる。ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質、あるいは細胞内のｐ６２の量を減少させる物質を肝疾患モデル動物（例：マウス）に投与して、Ｎｒｆ２の活性を測定することで、新規薬剤を見出し得る。
Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用の検出は、培養細胞（Ｈｕｈ−１，ＪＨＨ５，Ｈｅｐａ−１，ＨＥＫ２９３Ｔなど）へＮｒｆ２転写活性レポーターＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）をルシフェラーゼ遺伝子につなげたプラスミドを一過的に導入した、あるいは安定に保持する細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイ（図６および図１６を参照）によって、Ｎｒｆ２転写活性レポーターとβ−ラクタマーゼ遺伝子を繋げたＡＲＥ−ｂｌａを組み込んだ培養細胞によるβ−ラクタマーゼと蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いたＮｒｆ２転写活性レポーターアッセイによって、ｐ６２を過剰発現させた肝細胞を用いて、Ｎｒｆ２の下流因子の発現をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲによって、免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ（以下Ｉ．Ｂ．））によって、またはＲＴ−ＰＣＲ等によって確認することができる。
本発明のスクリーニング方法のより具体的な実施形態では、試験物質の存在下および非存在下でＫｅａｐ１とｐ６２との結合量の測定は、プルダウン法、質量分析法、タンパク質間相互作用を蛍光シグナルとして検出する方法、または蛍光標識を用いたイメージングのいずれかを用いて行われる。
ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質、あるいは細胞内のｐ６２の量を減少させる物質は肝疾患治療薬および抗がん剤に適用できる可能性がある。これらの物質は、マウスのオートファジーを欠失させた肝臓における細胞内のユビキチン陽性封入体の量を減少させる。Ｋｅａｐ１の相互作用を阻害又は抑制する物質、あるいは細胞内のｐ６２の量を減少させる物質をマウスに投与して、ユビキチン陽性封入体の量、Ｎｒｆ２の活性、肝障害のレベルを測定することで新規薬剤候補をスクリーニングすることができる。
ユビキチン陽性封入体の検出は、マウス肝臓組織の免疫染色を行うことができる（図９）。
Ｎｒｆ２の活性測定は、Ｎｒｆ２の下流因子である解毒酵素遺伝子群の発現をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲにより確認することができる（図８）。
肝障害のレベル測定は、肝臓の重量測定（図１３ａ），肝臓組織のＨＥ染色による肝細胞肥大と小葉構造の崩壊検出（図１３ｂ），肝機能テスト（ＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬＰ）（図１４）によって行うことができる。
本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、ｉ）ユビキチン陽性封入体形成の阻害又は抑制剤、ｉｉ）肝疾患の治療剤、またはｉｉｉ）抗がん剤として使用され得る。
４．肝疾患の診断方法、診断剤、及び診断用キット
本発明は、さらなる実施形態において、肝疾患の診断方法を提供する。特に、上記の本発明の肝疾患の治療剤の適用患者を判定または診断する方法を提供する。この方法は、典型的には、
ｉ）被験者の肝生検によるｐ６２もしくはＮｒｆ２の発現量を測定する工程、または
ｉｉ）被験者の肝生検によるＮｒｆ２の活性を測定する工程、
を含む。
肝疾患の被験者の肝生検によるｐ６２の発現量が正常者と比較して過剰であることが判明すれば、該被験者の肝疾患がｐ６２の過剰発現に起因している可能性が高い。そのような場合、上記の本発明の肝疾患の治療剤を、ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害もしくは抑制し、またはｐ６２の発現を阻害するために該疾患の治療を必要とする患者に適用することで有利な効果が得られると考えられる。したがって、このような治療の適用患者を判定または診断することは有用である。
また、肝疾患の被験者の肝生検によるＮｒｆ２の活性が正常者と比較して高いことが判明すれば、該被験者の肝疾患がＮｒｆ２の異常活性化に起因している可能性が高い。そのような場合、上記の本発明の肝疾患の治療剤を該疾患の治療を必要とする患者に適用すれば、ｐ６２とＫｅａｐ１との相互作用を阻害もしくは抑制し、またはｐ６２の発現を阻害することによって、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との相互作用と競合するｐ６２の量を減少させることができるため、遊離のＮｒｆ２の量が減少し、Ｎｒｆ２の活性化が抑制される。そのため、本発明の肝疾患の治療剤を該疾患の治療を必要とする患者に適用することで有利な効果が得られると考えられる。したがって、このような治療の適用患者を判定または診断することは有用である。
被験者の肝生検によるｐ６２の発現量の測定は、蛍光標識によるイメージング、免疫ブロット法、質量分析法等の当業者に周知の方法によって行うことができる。
被験者の肝生検によるＮｒｆ２の活性の測定は、Ｎｒｆ２の標的プロモーターを用いたルシフェラーゼアッセイ、免疫ブロットによる細胞核内のＮｒｆ２量測定、Ｎｒｆ２によって転写誘導される酵素（Ｎｑｏ１やＧｓｔｍなど）の、定量的ＰＣＲ、免疫ブロットや蛍光イメージングによる発現解析および酵素活性測定等の当業者に周知の方法によって行うことができる。
本発明の肝疾患の治療剤の適用患者を判定する方法のさらなる実施形態では、Ｎｒｆ２の活性測定、および／またはユビキチン陽性封入体の検出を行うことを含む。
本発明の肝疾患の治療剤の適用患者を判定する方法のさらなる実施形態では、被験者の血液中のＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬＰ，および／またはγ−ＧＴＰの濃度を測定することを含む。なお、γ−ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）は、肝臓の解毒作用に関係する酵素であり、肝臓や胆管の細胞が壊れると血液中にγ−ＧＴＰが血液の中に流れ出てくることから、「逸脱酵素」といわれ、肝臓や胆管の細胞が壊れたことの指標として一般に利用されている。
本発明のさらなる実施形態では、本発明の診断方法に用いられる診断用キットまたは診断剤が提供される。これらの診断用キットまたは診断剤は、典型的には、抗ｐ６２抗体または抗Ｎｒｆ２抗体を含む。さらに、これらの診断用キットまたは診断剤は、抗体を標識するための標識剤（例えば、蛍光標識）または蛍光標識された抗体を含んでいてもよい。診断用キットはさらに、使用説明書を含んでいてもよい。使用説明書には、キットに含まれる抗体、標識剤等の使用方法、免疫ブロッティングを含む実験の手順等が記載されていてもよい。
なお、本明細書中に現れるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と配列番号との関係は以下のとおりである
［配列番号１］
この配列は、ヒトｐ６２のアミノ酸配列を表す。
［配列番号２］
この配列は、ヒトｐ６２のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を表す。
［配列番号３］
この配列は、マウスｐ６２のアミノ酸配列を表す。
［配列番号４］
この配列は、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列を表す。
［配列番号５］
この配列は、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号３）の第３４５位〜第３５９位までの連続するアミノ酸残基からなる部分配列（ＫＩＲ配列）を表す。
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことはいうまでもない。

［実施例１］
実施例１では、ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用およびｐ６２に結合するＫｅａｐ１の領域を調べた。
Ｆｌａｇ−ｔａｇをＮ末に繋げたマウスＫｅａｐ１とＫｅａｐ１の各変異タンパク質を発現させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより溶解し、細胞抽出液を得た。次に抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｆｌａｇ−ｔａｇを付加したＫｅａｐ１あるいはそのｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ、およびその相互作用複合体を回収した。回収したタンパク質複合体と細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によりゲル内に展開し、抗Ｆｌａｇ抗体、抗ｐ６２抗体、抗Ｎｒｆ２抗体、抗ａｃｔｉｎ抗体の各抗体を用いて、免疫ブロッティング（Ｉ．Ｂ．）を行った。
結果を図１に示す。図１はＫｅａｐ１の機能ドメイン領域およびＦＬＡＧ−ｔａｇをつけたＫｅａｐ１およびその各ｍｕｔａｎｔの名称および模式図、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降を行った場合におけるＩ．Ｂ．の写真、および細胞抽出液を用いたＩ．Ｂ．の写真である。
模式図最上部にはＫｅａｐ１のドメイン領域とその名称を示している。ＮＴＲ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ），ＢＴＢ（Ｂｒｏａｄｃｏｍｐｌｅｘ，Ｔｒａｍｔｒａｃ，ａｎｄ Ｂｒｉｃ−ａ−Ｂｒａｃ），ＩＶＲ（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ），ＤＳＧ（ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｅｐｅａ ｒｏｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ）ａｎｄ ＣＴＲ（ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）。ＦＬＡＧ−ｔａｇを付加したタンパクの模式図とその左に名称を記す。抗ＦＬＡＧ抗体の免疫沈降によるＩ．Ｂ．の写真をＩＰ：ＦＬＡＧで示す。また細胞抽出液によるＩ．Ｂ．の写真をＣｒｕｄｅで表し、これは各細胞でのＫｅａｐ１，ｐ６２，ａｃｔｉｎ（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）の発現の確認を行う。Ｉ．Ｂ．の写真の左横には使用した抗体を示す。
図１に示すように、Ｆｌａｇ−Ｋｅａｐ１を発現させた細胞で免疫沈降を行った場合（レーン２）、内在性ｐ６２が検出されたことから、ｋｅａｐ１とｐ６２は複合体を形成することが分かった。Ｋｅａｐ１の各ｍｕｔａｎｔを発現させた細胞で免疫沈降を行った場合（レーン３−９）では、レーン９でｐ６２が検出され、レーン６とレーン８では検出されないことから、ｐ６２と複合体を形成する為に必要なＫｅａｐ１の部位はＤＣ領域（ＤＧＲ＋ＣＴＲ）であることが分かった。
［実施例２］
実施例２では、ｐ６２とＫｅａｐ１の直接の相互作用と、Ｋｅａｐ１に結合するｐ６２の領域を調べた。
まず、大腸菌に実施例１で示したｐ６２と結合する領域Ｋｅａｐ１−ＤＣとのＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）融合タンパク質、ＧＳＴタグのついたマウスＫｅａｐ１−ＤＣ（ＧＳＴ−Ｋｅａｐ１−ＤＣ）とマウスｐ６２あるいは各ｐ６２ ｍｕｔａｎｔのＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合タンパク質を産生させ、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｒｅｓｉｎとａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎをそれぞれ用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。これらの精製タンパク質をＴＮＥ ｂｕｆｆｅｒ中で混和させ、ａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎで沈殿させる。Ａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎ結合タンパク質を氷冷ＴＮＥで５回ｗａｓｈし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）染色を行った。
結果を図２に示す。図２はｐ６２の機能ドメイン領域およびＭＢＰ−ｔａｇをつけたマウスｐ６２とその各ｍｕｔａｎｔの名称および模式図、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色後の写真である。
模式図最上部にはｐ６２のドメイン領域とその名称を示している。ＰＢ１（Ｐｈｏｘ ａｎｄ Ｂｅｍｌｐ），Ｚｉｎｃ（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ），ＬＲＳ（ＬＣ３−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ａｎｄ ＵＢＡ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ）。ＭＢＰ−ｔａｇを付加したタンパクの模式図とその左に名称を記す。ＭＢＰ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＡＭ ｒｅｓｉｎは各タンパク質の発現を表し、ＭＢＰ−Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙでは各ｐ６２−ＭＢＰ融合タンパクへのＧＳＴ−Ｋｅａｐ１−ＤＣの結合を示す。
図２ａに示すように、ＭＢＰ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＡＭ ｒｅｓｉｎの図で各タンパク質の精製が全て確認された中で、ＭＢＰ−Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙを行うと、ｐ６２とＫｅａｐ１の結合が確認されたことから、ｐ６２とＫｅａｐ１は直接結合することが示された。またレーン５，６，７，８，１１，１２，１４（１４については図３を参照）でｐ６２の結合が確認されたことから、Ｋｅａｐ１へのｐ６２の結合領域は３４５−３５９アミノ酸の領域であることが分かった。また、この領域は、図２ｂに示すように種間で高度に保存されており、このアミノ酸配列の領域をＫＩＲ（Ｋｅａｐ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｋｅａｐ１相互作用領域）配列と名づけた。
［実施例３］
実施例３では、Ｋｅａｐ１の結合に重要なｐ６２−ＫＩＲ配列中のアミノ酸を調べた。
ＭＢＰ−ｐ６２Ｍ８０の−ＫＩＲ配列の各アミノ酸をそれぞれアラニンに置換したタンパク質と、ＧＳＴ−Ｋｅａｐ１−ＤＣを用いて実施例２と同様のプルダウンアッセイを行った。
結果を図３に示す。図の左上には各サンプル番号に対するアミノ酸の置換部位を示し、下部ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＣＢＢ染色後のゲルの写真、写真の右側にはバンドが示すタンパク質の名称を示す。
レーン６、７、９、１０、１１でＧＳＴ−Ｋｅａｐ１−ＤＣのバンドがほとんど見られず、結合が劇的に低下していることから、ｐ６２とＫｅａｐ１との結合にはｐ６２のＤ３４９，Ｐ３５０，Ｔ３５２，Ｇ３５３，Ｅ３５４の５アミノ酸が重要であることが分かった。
［実施例４］
実施例４では、ｐ６２とＮｒｆ２はＫｅａｐ１の同じポケットで結合していることを調べた。
タンパク質結晶化立体構造解析により、Ｋｅａｐ１−ＤＣのｐ６２あるいはＮｒｆ２との結合に重要なアミノ酸を予想した。これらのアミノ酸をそれぞれアラニンに置き換えたＫｅａｐ１−ＤＣ ｍｕｔａｎｔおよびＫｅａｐ１−ＤＣタンパク質にＦＬＡＧタグを付けＨｅｋ２９３Ｔ細胞に発現させた。これらの細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより溶解し、細胞抽出液を得た。次に実施例１と同様に免疫沈降およびＩ．Ｂ．を行った。
結果を図４に示す。図４の左には、各サンプル番号とその番号に対するアミノ酸置換部位を示す。抗ＦＬＡＧ抗体の免疫沈降によるＩ．Ｂ．の写真をＩＰ：ＦＬＡＧで示す。また細胞抽出液によるＩ．Ｂ．の写真をＣｒｕｄｅで表し、これは各細胞でのＫｅａｐ１，ｐ６２，ａｃｔｉｎ（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）の発現の確認を示す。Ｉ．Ｂ．の写真の右横には使用した抗体を示す。
図４で示すように、Ｒ４８３Ａ（レーン８）以外のＫｅａｐ１−ＤＣ ｍｕｔａｎｔにおいてｐ６２との結合が劇的に低下しており、またＲ４８３Ａを含めた全てのｍｕｔａｎｔにおいてＮｒｆ２との結合も劇的に低下していることから、ｐ６２とＮｒｆ２は、Ｋｅａｐ１の同じポケットを使用して拮抗的に結合していることが示された。
［実施例５］
実施例５では、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２の結合をｐ６２が拮抗的に阻害することを示す。
Ｆｌａｇ−ｔａｇをＮ末に繋げたｐ６２とｐ６２−Ｔ３５２Ａを発現させたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより溶解し、細胞抽出液を得た。次に抗Ｎｒｆ２抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｎｒｆ２およびその相互作用複合体を回収した。次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により、回収したタンパク質複合体と細胞抽出液をゲル内に展開し、抗ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体、抗Ｎｒｆ２抗体、抗ｐ６２抗体、抗ａｃｔｉｎ抗体の各抗体を用いて、Ｉ．Ｂ．を行った。
結果を図５に示す。抗Ｎｒｆ２抗体を用いて免疫沈降を行った場合におけるＩ．Ｂ．の写真をＩＰ：Ｎｒｆ２で示す。また細胞抽出液を用いたＩ．Ｂ．の写真をＣｒｕｄｅで示す。写真上部にはＦＬＡＧ−ｐ６２あるいはＦＬＡＧ−ｐ６２−Ｔ３５２Ａの過剰発現，Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ（プロテアソーム阻害剤）の存在の有無を＋−で示す。また図の左右に、Ｉ．Ｂ．に使用した抗体名、検出されたタンパク名を示す。
ｐ６２を過剰発現させていない細胞のＮｒｆ２免疫沈降（ＩＰ：Ｎｒｆ２のレーン１）では、ユビキチン化されたＮｒｆ２，Ｎｒｆ２そのものの検出レベルが低いが、プロテアソーム阻害剤を加える（レーン２）と顕著に高くなる。通常Ｎｒｆ２はｋｅａｐ１と結合しユビキチン化されプロテアソームにより分解されていることから説明できる。この状態でｐ６２を過剰発現させると、Ｎｒｆ２タンパク量が顕著に上昇した。一方、ユビキチン化されたＮｒｆ２が低下した（ＩＰ：Ｎｒｆ２のレーン３、４）。これはｐ６２がＫｅａｐ１と結合することにより、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１の結合が低下し、Ｎｒｆ２がユビキチン化および分解されないことから、Ｎｒｆ２が増加することを示す。またＫｅａｐ１と結合能が顕著に低下しているｐ６２−Ｔ３５２Ａを入れると（ＩＰ：Ｎｒｆ２のレーン５、６）ｐ６２を発現させない時と同様の状態（ＩＰ：Ｎｒｆ２のレーン１、２）を示すことから、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２の結合をｐ６２が拮抗的に阻害していることを示す。
［実施例６］
実施例６では、Ｋｅａｐ１とｐ６２の結合がＮｒｆ２下流因子の発現活性を増大させることを示す。
Ｎｒｆ２，Ｋｅａｐ１，そしてｐ６２ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅあるいはｐ６２ ｍｕｔａｎｔｓを発現するプラスミドをｐＮＱＯ１−ＡＲＥ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄとｐＲＬ−ＴＫ（リポフェクションの内部コントロール）と共にマウス肝細胞癌由来のＨｅｐａ１細胞に導入して、３６時時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図６に示す。Ｎｒｆ２，Ｋｅａｐ１，ｐ６２−ＷＴ，ｐ６２−ｍｕｔａｎｔｓ導入の有無を＋−で示し、発現ベクターを導入していない（カラム１）をスタンダードとして相対的なルシフェラーゼの活性を示す。
Ｎｒｆ２を過剰発現させると（カラム２）、活性が大幅に上昇し、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１の２重トランスフェクション（カラム３）ではＮｒｆ２がＫｅａｐ１に捕まえられプロテアソームにより分解される為カラム１と同程度まで活性が低下した。Ｎｒｆ２，Ｋｅａｐ１，ｐ６２−ＷＴの３重トランスフェクションでは、ｐ６２がＫｅａｐ１と結合することでフリーのＮｒｆ２が増加する為、ルシフェラーゼ活性が上昇したが、Ｎｒｆ２，Ｋｅａｐ１，ｐ６２−ｍｕｔａｎｔの３重トランスフェクション（カラム５−１０）では、ｐ６２はＫｅａｐ１と結合できない為、活性はカラム４と変わらなかった。またｐ６２−ＷＴ単独のトランスフェクションでも活性の上昇が見られ、ｐ６２−ｍｕｔａｎｔでは見られないことから、内在性のＫｅａｐ１に結合することで内在性Ｎｒｆ２が活性化したものと考えられる。以上の結果より、ｐ６２の過剰発現によりＫｅａｐ１と結合するｐ６２が増加し、Ｎｒｆ２の活性が上昇することを示唆している。
また、カラム４とカラム５−１０でルシフェラーゼ活性に大きな差が見られることから、カラム４での高活性状態において、ｐ６２とＫｅａｐ１の阻害剤を加えると確実に活性が低下すると予想される。また他の肝臓がん由来細胞等では、もともとｐ６２の発現量が高くＮｒｆ２の転写活性も高い細胞も存在することから、これらの細胞にｐＮＱＯ１−ＡＲＥ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄを安定に持たせた安定株を作成し、ルシフェラーゼアッセイを行うことで、ｐ６２とｋｅａｐ１の結合をモニターでき、また阻害剤が探索可能となることが示唆された。
［実施例７］
実施例７では、肝臓特異的にオートファジーを欠損させたマウスにおいて、ｐ６２と共にＫｅａｐ１が蓄積・不溶化し、Ｋｅａｐ１の不溶化はｐ６２に依存していることを示す。
結果を図７に示す。Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１はＡｔｇ７遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスで、マウスの腹腔内にピペラシリン（ＰＩＰＣ）を投与すると肝臓特異的にＡｔｇ７遺伝子が欠損し、オートファジーが機能しなくなるマウスである。またｐ６２−／−はｐ６２が欠損したマウスで、Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：ｐ６２−／−はｐ６２が欠損したＦ／Ｆ：Ｍｘ１マウス，Ｆ／ＦはＷＴマウスを指す。図７ａでは、ＰＩＰＣを投与後、肝臓をスクロースバッファー（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１ｍＭ ＤＴＴ）に回収し、ホモジナイズする。破砕液を０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００可溶性と不溶性に分画する。各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ｐ６２抗体、抗Ｋｅａｐ１抗体、抗ＬＣ３抗体、抗Ｎｑｏ１抗体、および抗ａｃｔｉｎ抗体（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）で免疫ブロットを行う。
図の左側には使用した抗体の種類、上部には投与後の日数、あるいはマウスの遺伝子型を示す。図の下部に示した、Ｔｏｔａｌは全細胞抽出液、Ｓｏｌ．は可溶性分画、Ｉｎｓｏｌ．は不溶性分画を示す。ＰＩＰＣ投与によりオートファジーが欠損されてから８−１２時間後には、ｐ６２が過剰に発現されるようになるが、Ｋｅａｐ１の発現はほとんど変化しない。またｐ６２の過剰発現に伴い不溶性のｐ６２が蓄積し、同時に不溶性Ｋｅａｐ１も蓄積する。また各遺伝子型マウスのＰＩＰＣ投与後１２時間では、Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１ではｐ６２の過剰発現、および不溶性のｐ６２とＫｅａｐ１の増加がみられるが、Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：ｐ６２−／−では見られない（図７ｂ）。これらの結果からオートファジーが欠損したマウスの肝臓においてｐ６２の過剰発現、および不溶性のｐ６２，Ｋｅａｐ１の蓄積がみられる。また不溶性ｋｅａｐ１の蓄積はｐ６２依存的であることが示された。
［実施例８］
実施例８では、実施例７で用いた遺伝子型マウスの肝臓でのＮｒｆ２の下流因子の発現状態をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
各遺伝子型マウスにＰＩＰＣ投与後１２時間後のマウス肝臓から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｍｉｃｒｏｇからｃＤＮＡを合成し、そしてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒｉｎ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使いＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで定量的ＰＣＲを行った。シグナルはβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）で標準化を行った。結果を図８に示す。
図８の上部には、遺伝子名、左部にはＦ／Ｆを１とした時のｍＲＮＡ量の比率、下部には各遺伝子型を記す。
示されたように、オートファジー欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）ではＮｑｏ１，Ｇｓｔｍ１共に、発現量が劇的に上昇している。このことからオートファジー欠損によりＮｒｆ２下流遺伝子の発現が上昇することが示された。一方ｐ６２を欠損させたマウス（ｐ６２およびＦ／Ｆ：Ｍｘ１：ｐ６２）では野生型マウス（Ｆ／Ｆ）とほとんど変わらないことから、オートファジー欠損によるＮｑｏ１，Ｇｓｔｍ１の活性化はｐ６２に依存していることが示された。
［実施例９］
実施例９では、Ｋｅａｐ１はｐ６２依存的に封入体へ隔離されることをマウスの肝細胞で示す。
実施例７で示された遺伝子型マウスにＰＩＰＣ投与後２８時間のマウスから得た肝臓を切断し、抗ｐ６２抗体、および抗Ｋｅａｐ１抗体を用いた２重免疫染色によりｐ６２とＫｅａｐ１の細胞内局在を蛍光観察した。結果を図９に示す。
図９の上段はｐ６２，中段はＫｅａｐ１、下段はｐ６２とＫｅａｐ１の局在を合わせたもの（Ｍａｒｇｅ）とし、核染色図の左上部にはそれぞれの遺伝子型を記す。Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１右上部の白四角枠で囲った領域の拡大図を左下に示す。
示されたように、オートファジー欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ）では白で示したｐ６２とＫｅａｐ１は凝集し封入体を形成しており、共局在観察では黄色で示されたようにｐ６２とＫｅａｐ１の局在がほぼ一致していることから、ｐ６２とＫｅａｐ１が同じ封入体を形成しているものと考えられる。またオートファジー欠損マウスでｐ６２を欠失させると（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ：ｐ６２−／−）、ｐ６２とＫｅａｐ１を含む封入体形成が見られなくなることから、Ｋｅａｐ１陽性封入体形成はｐ６２の発現に依存していることが示された。
これまでの結果より、オートファジー欠損により、過剰発現したｐ６２がＫｅａｐ１と結合することで、Ｋｅａｐ１を不溶化、封入体を形成させ、またＮｒｆ２の下流因子の発現が上昇することが分かった。オートファジー欠損させたマウスの肝臓では、ｐ６２の発現上昇と不溶化に伴いＫｅａｐ１も不溶化し、Ｋｅａｐ１にトラップされないＮｒｆ２が増え、抗酸化タンパク質の発現を増加すると考えられる。
［実施例１０］
実施例１０では、オートファジー欠損によるＫｅａｐ１の不溶化はＮｒｆ２に依存していることを示す。
オートファジー欠損によりｐ６２の発現依存的にＫｅａｐ１が不溶化し、Ｎｒｆ２の下流因子の発現も上昇する。そこでこれまで用いた実施例７で示したＦ／Ｆ、Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１に加えて、Ｎｒｆ２欠損マウス（Ｎｒｆ２−／−，Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：Ｎｒｆ２−／−）を作成し、実施例７と同様の方法でＫｅａｐ１の不溶化の検討を行った。
Ｎｒｆ２欠失によるＮｒｆ２の発現、さらにＮｒｆ２下流遺伝子（Ｎｑｏ１とＧｓｔｍ１）の発現も同時に確認している。結果を図１０に示す。
結果が示すように、オートファジー欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）で見られたｐ６２の過剰発現および不溶タンパクの蓄積は、Ｎｒｆ２を２重で欠損させると劇的に低下した。またＮｒｆ２は通常Ｋｅａｐ１と結合することで分解されていることから、ｐ６２の蓄積はＫｅａｐ１を捕らえて不溶化し、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２のｐａｔｈｗａｙの欠如を導いていることが分かった。
［実施例１１］
実施例１１では、オートファジー欠損によるｐ６２，Ｋｅａｐ１陽性封入体の蓄積はＮｒｆ２に依存していることを示す。
実施例１０の遺伝子型マウスを使用し、実施例９と同様の方法で免疫染色を行った。結果を図１１に示す。
結果が示すように、オートファジー欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）で見られたＫｅａｐ１陽性、ｐ６２陽性封入体の形成は、Ｎｒｆ２を欠損させると（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：Ｎｒｆ２−／−）劇的に減少した。これはｐ６２陽性Ｋｅａｐ１陽性の封入体形成はＮｒｆ２に依存していることを示す。
［実施例１２］
実施例１２では、オートファジー欠損によるＮｒｆ２下流遺伝子の過剰発現はＮｒｆ２に依存していることを示す。
実施例１０の遺伝子型マウスを使用し、実施例９と同様の方法でＮｒｆ２下流遺伝子（Ｎｑｏ１，Ｇｓｔｍ１，Ｃｙｐ２ａ５）のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。結果を、図１２に示す。
結果が示すように、オートファジー欠損（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）で見られたＮｒｆ２下流遺伝子（Ｎｑｏ１，Ｇｓｔｍ１，Ｃｙｐ２ａ５）の過剰発現は、Ｎｒｆ２を欠損させると（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：Ｎｒｆ２−／−）劇的に減少した。これはオートファジー欠損によるＮｒｆ２下流遺伝子の過剰発現はＮｒｆ２に依存していることを示す。
実施例１０、１１、１２より、ｐ６２の異常蓄積によるＫｅａｐ１が不溶化は、ｐ６２陽性Ｋｅａｐ１陽性封入体を形成し、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１ ｐａｔｈｗａｙを欠如させることが示された。
ｐ６２の過剰発現ではＫｅａｐ１と結合するＮｒｆ２の割合が減少することで、Ｎｒｆ２が蓄積し、Ｎｒｆ２の下流遺伝子の転写量が増大することが示唆される。
［実施例１３］
オートファジー欠損による肝障害はｐ６２の異常蓄積によるＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１ｐａｔｈｗａｙ欠如の結果であるかどうかを調べる為に、実施例１０の遺伝子型マウスを使用し、ｐＩｐＣ投与後２８日のマウス肝臓の重量を測定し、さらにＨＥ染色により、各遺伝子欠損マウスの肝細胞肥大を測定した。結果を、図１３ａおよび図１３ｂにそれぞれ示す。
オートファジー欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）では肝臓の重量が大きく増加し肝肥大を示すのに対し、オートファジー／Ｎｒｆ２ダブル欠損マウスでは上昇を示さないことから、ｐ６２の異常蓄積によるＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１ｐａｔｈｗａｙ欠如により肝肥大を引き起こすことが分かった。
［実施例１４］
実施例１４では、オートファジー欠損による肝障害はｐ６２の異常蓄積によるＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１ ｐａｔｈｗａｙ欠如の結果であるかどうかを調べる為に、肝障害の指標として、マウス血中ａｓｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ），ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）の酵素活性を測定した。結果を図１４に示す。
オートファジー欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１）ではＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬＰ全て野生型マウス（Ｆ／Ｆ）に比べて劇的な上昇を示すのに対し、オートファジー／Ｎｒｆ２ダブル欠損マウス（Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１：Ｎｒｆ２）では上昇を示さない（野生型と同レベルである）ことから、ｐ６２の異常蓄積によるＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１ｐａｔｈｗａｙ欠如により肝障害を引き起こすことが分かった。
［実施例１５］
実施例１５では、ヒトの肝細胞がん腫においてｐ６２，Ｋｅａｐ１陽性封入体が観察されることを示す。抗ｐ６２抗体と抗Ｋｅａｐ１抗体を使ったヒトの肝細胞がん組織アレイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃから購入）の免疫組織化学染色を行った。結果を、図１５に示す。
ヒト肝細胞がん腫２５サンプルのうち６サンプルについてｐ６２陽性の封入体が確認された。さらに重要なことにｐ６２陽性封入体が見られるサンプルにおいてＫｅａｐ１陽性封入体も確認された。さらにｐ６２，Ｋｅａｐ１ ２重染色による蛍光顕微鏡では、ｐ６２とＫｅａｐ１の共局在が観察された。これらの結果、ヒトの肝細胞がん腫でもＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１ ｐａｔｈｗａｙの異常調節が示唆された。
［実施例１６］
実施例１６では、肝がん由来細胞（Ｈｅｐａ−１）のＡＲＥ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を安定に保持するｃｅｌｌ ｌｉｎｅにおいて、ｐ６２蓄積におけるＮｒｆ２活性システムの存在を示すと共に、ｐ６２−Ｋｅａｐ１結合阻害剤のスクリーニングに使用できることを示す。実験の結果を図１６に示す。
Ｎｒｆ２の標的プロモーターであるＡＲＥにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を繋げたプラスミドを安定に保持する細胞株を作成し、この株にアデノウイルス感染系を用いてｐ６２−ＷＴ，ｐ６２−Ｔ３５２Ａ（Ｋｅａｐ１と結合できないｍｕｔａｎｔ），Ｋｅａｐ１，ＧＦＰ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を過剰発現させて、ルシフェラーゼ活性を測定した。Ｈｅｐａ−１はもともとＮｒｆ２の活性が高いので、Ｋｅａｐ１を過剰発現させるとルシフェラーゼ活性が低下することが示された。Ｋｅａｐ１の過剰発現状態で、ｐ６２−ＷＴあるいはｐ６２−Ｔ３５２Ａを過剰発現させると、感染度を高くするとｐ６２−ＷＴではルシフェラーゼ活性が上昇し、ｐ６２−Ｔ３５２Ａでは上昇を示さなかった。またｐ６２−ＷＴ単独の発現ではルシフェラーゼ活性が劇的な上昇を示すが、ｐ６２−Ｔ３５２Ａ単独の過剰発現では少し低下することがわかった。これはｐ６２−ＷＴが過剰発現されると、ｐ６２と結合するＫｅａｐ１の割合が多くなりＮｒｆ２が活性化状態になり、またｐ６２−Ｔ３５２Ａの過剰発現ではドミナントネガティブ効果により若干活性が低下することを示す。
このデータは、この細胞株でもｐ６２蓄積におけるＮｒｆ２活性システムの存在を示しており、またｐ６２−Ｋｅａｐ１の結合阻害剤を加えるとルシフェラーゼ活性低下を示すと予想されることから、ｐ６２−Ｋｅａｐ１結合阻害剤のスクリーニングに適している。
［実施例１７］
実施例１７では、オートファジー欠損マウスまたはオートファジー欠損ｐ６２ノックアウトマウスの肝臓における、腫瘍やＫｅａｐ１やＮｒｆ２下流因子の分子状態を示す。結果を図１７に示す。
左上図は、４、７、９、１２、１４、１６ヶ月齢のＡｐｇ７^ｆ／ｆマウス（コントロール）およびＡｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（肝特異的オートファジー欠損マウス）の肝臓の写真である。Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスでは、７ヶ月齢以降に小さな腫瘍（矢印）が確認され、加齢と共に腫瘍の数および大きさが増大した。左下図は１２月齢のＡｐｇ７^ｆ／ｆ（コントロール）マウス肝臓、ｐ６２ノックアウト肝臓、Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓非腫瘍部、肝臓腫瘍部およびＡｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅ；ｐ６２ノックアウト肝臓抽出液を用いたウエスタンブロット解析の結果である。Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓非腫瘍部、肝臓腫瘍部ともにｐ６２が過剰に蓄積・不溶化し、ｐ６２結合タンパク質Ｋｅａｐ１の不溶化も顕著であった。ｐ６２およびＫｅａｐ１の不溶化に伴い、Ｎｒｆ２の標的遺伝子産物であるＮｑｏ１のタンパク質量もＡｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓非腫瘍部、肝臓腫瘍部で増加していた。上記Ｋｅａｐ１の不溶化およびＮｑｏ１の発現上昇は、Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅ；ｐ６２ノックアウト肝臓において抑制されていた。右下は１２月齢のＡｐｇ７^ｆ／ｆ（コントロール）マウス肝臓、ｐ６２ノックアウト肝臓、Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓非腫瘍部、肝臓腫瘍部およびＡｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅ；ｐ６２ノックアウト肝臓から調整したＲＮＡを用いた定量的ＰＣＲ解析の結果である。Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓非腫瘍部、肝臓腫瘍部ともに、Ｎｒｆ２の標的遺伝子であるＮｑｏ１やＧｓｔｍ１の遺伝子発現が増加していた。これらの発現上昇は、Ａｐｇ７^ｆ／ｆ；Ａｌｂ−Ｃｒｅ；ｐ６２ノックアウト肝臓において抑制されていた。
これらの結果より、オートファジー欠損マウスの長期飼育により形成された腫瘍におけるＫｅａｐ１の不溶化およびＮｒｆ２の活性化は、ｐ６２依存的であることが明らかとなった。このことから、ｉｎ ｖｉｖｏ自然発症肝臓がんにおいても、ｐ６２−Ｋｅａｐ１のｐａｔｈｗａｙが機能していることが示唆される。

本発明は、新規な作用機序に基づく肝疾患治療薬および抗がん剤、診断薬またはそのスクリーニング方法などとして有用である。
［配列表］

Claims (6)

1. Ｋｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質（ａｇｅｎｔ）のスクリーニング方法であって、
   ｉ）試験物質の存在下および非存在下でＫｅａｐ１とｐ６２との結合量を測定する工程、および
   ｉｉ）前記試験物質の存在下と非存在下との間でＫｅａｐ１とｐ６２との前記結合量を比較し、前記試験物質の存在下での前記結合量が前記試験物質の非存在下での前記結合量よりも低い場合に、当該試験物質をＫｅａｐ１とｐ６２との相互作用を阻害または抑制する物質として選択する工程
   を含む、方法。
2. 前記結合量を測定する工程において、プルダウン法、質量分析法、タンパク質間相互作用を蛍光シグナルとして検出する方法、または蛍光標識を用いたイメージングのいずれかが用いられる、請求項１に記載の方法。
3. ユビキチン陽性封入体形成を阻害または抑制する物質のスクリーニングのために使用する、請求項１または２に記載の方法。
4. 肝疾患の治療剤のスクリーニングのために使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記結合量を測定する工程が、
   ｉ）ｐ６２のＫｅａｐ１相互作用領域、または
   ｉｉ）マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４５番から３５９番目のアミノ酸配列：ＳＫＥＶＤＰＳＴＧＥＬＱＳＬＱ（配列番号：５）
   に対するＫｅａｐ１の結合量を測定することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記物質が、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号：３）中の３４９位のアスパラギン酸、３５０位のプロリン、３５２位のスレオニン、３５３位のグリシン、または３５４位のグルタミン酸に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。