JP6418719B2 - 腫瘍の診断剤、医薬組成物及びスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明の一実施形態は、配列番号1のアミノ酸配列における351番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化p62タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部である。
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列における351番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化p62タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部である。
本明細書中、「抗リン酸化p62抗体」とは、マウスp62(配列番号1)においては351番目のセリン、または他の動物種においては当該セリンに対応するセリンがリン酸化されたリン酸化p62タンパク質を認識し、マウスp62においては351番目のセリン、または他の動物種においては当該セリンに対応するセリンがリン酸化されていないp62タンパク質(本明細書では「非リン酸化p62タンパク質」と称する)を認識しない抗体を意味する。この抗体は、リン酸化p62タンパク質と結合するが、非リン酸化p62タンパク質とは結合しない抗体、あるいは、リン酸化p62タンパク質と反応するが、非リン酸化p62タンパク質とは反応しない抗体であってもよい。また、抗体が認識する対象のp62の由来する動物種は特に限定されないが、哺乳類であることが好ましく、マウス、ラット、ヒトのp62であることがより好ましい。なお、抗体の抗原認識についての種特異性は特に限定されず、例えば、ヒトp62についてのみリン酸化p62と非リン酸化p62を識別できる抗体、マウスp62についてのみリン酸化p62と非リン酸化p62を識別できる抗体、ヒトとヒト以外のp62についてリン酸化p62と非リン酸化p62を識別できる抗体(例えば、ヒトとマウスについてリン酸化p62と非リン酸化p62を識別できる抗体や、ヒトとサルについてはリン酸化p62と非リン酸化p62を識別できるが、マウスについては識別できない抗体)、など、様々な認識パターンが考えられる。
抗リン酸化p62抗体またはそのフラグメントは、大腸菌や哺乳類の培養細胞などで機能するプロモーターを用いて発現ベクターを作製し、宿主細胞内に導入して抗体やそのフラグメントを発現させ、精製することによって作製しても良い。その際、シグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させるのが好ましい。
Keap1−DCに対する結合定数(Ka)は、実施例に示すように、非リン酸化p62のKIRが(5.67±1.19)x104M-1、Nrf2−ETGEが(6.83±2.16)x106M-1であるので、非リン酸化p62が存在しても、通常はKeap1とNrf2が優先的に結合している。しかしながら、リン酸化p62−KIRのKeap1−DCに対する結合定数は(5.12±1.80)x106M-1であり、非リン酸化p62のKIRより約100倍高く、Keap1−DCとNrf2−ETGEの結合定数と同レベルである。従って、p62は、リン酸化されることによって、Nrf2と共存していてもKeap1と結合できるようになり、Nrf2が遊離する。そして遊離Nrf2はその標的遺伝子群の発現を促すため、悪性化したがんの増殖において有利に働く。
本発明にかかる医薬組成物は、抗リン酸化p62抗体またはその一部、抗リン酸化p62抗体またはその一部をコードするDNAを含み、抗リン酸化p62抗体またはその一部を発現することができる発現ベクター、抗リン酸化p62抗体またはその一部をコードするDNAを有し、抗リン酸化p62抗体またはその一部を発現する細胞を含有し、例えば、抗腫瘍剤として用いることができる。この抗リン酸化p62抗体またはその一部は、リン酸化p62タンパク質がKeap1に結合することを阻害する阻害抗体であることが好ましく、特にKeap1−DCドメイン(例えば、aa309−624(配列番号27)の領域や、aa321-609(配列番号24)の領域)に結合することを阻害する阻害抗体であることが好ましい。
本発明にかかる抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、p62タンパク質に対し、候補物質が、配列番号1のアミノ酸配列における351番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンのリン酸化を阻害できるかどうか、あるいはリン酸化されたセリンを脱リン酸化できるかどうかを評価することにより行なうことができる。また、候補物質が、リン酸化p62タンパク質とKeap1の結合を阻害するかどうかを評価することによっても行うこともできる。実施例で示すように、これらの物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効である。よって、本発明にかかるスクリーニング方法によれば、抗腫瘍剤を効率的に得ることが可能になる。抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍としては、特に限定されないが、p62のリン酸化によって悪性化している腫瘍であればよく、例えば、肝がんであることが好ましい。また、候補物質は特に限定されず、抗体などのタンパク質や高分子であっても、化合物などの低分子であっても構わない。
本実施例では、p62がリン酸化することにより、Keap1に対する結合親和性が増強することについて示す。
等温滴定熱量測定によりマウスKeap1−DC(aa321-609、配列番号24)と、非リン酸化マウスp62のKIR(配列番号21)、リン酸化マウスp62のKIR(配列番号21)、およびマウスNrf2のETGEモチーフ(配列番号26)との相互作用の結合等温線を作成した(図2)。
Keap1−DCに対する結合定数(Ka)はそれぞれ、非リン酸化KIRが(5.67±1.19)x104M-1、リン酸化p62−KIRが(5.12±1.80)x106M-1、Nrf2−ETGEが(6.83±2.16)x106M-1であった。
配列番号1のアミノ酸配列における351番目のセリンをリン酸化し、さらにN末端にシステイン残基を付加したアミノ酸配列、CKEVDP(pS)TGELQSLQ(配列番号22)からなるペプチドを合成し、HPLCで精製した。この抗原ペプチドに対し、N末端システイン残基へKLH(Keyhole-limpet hemocyanin,スカシガイヘモシアニン)をキャリアとしてMBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)法で結合させた。作製したコンジュゲーションペプチド(合成ペプチド3mg+キャリアタンパク質2mg)を5mLのリン酸緩衝液で溶解し、免疫動物のウサギ1羽に対して、初回は、合成ペプチド200μgに相当する量を完全フロイントアジュバントと混合したエマルジョンを皮下注射によって投与した。14日後に、合成ペプチド100μgに相当する量を不完全フロイントアジュバントと混合したエマルジョンを皮下注射によって投与した。その後、14日毎に同様な抗原投与をさらに4回行った。初回の抗原投与から77日目に全採血し、20mLの抗血清を得た。次に、抗原に用いたリン酸化p62ペプチドを固相化したアフィニティーカラムを作製し、これを用いて抗血清に含まれるリン酸化p62と結合する抗体をアフィニティー精製した。精製抗体を、さらに非リン酸化p62ペプチドを固相化したアフィニティーカラムへ通すことで、素通り画分に回収された精製抗体を、リン酸化p62と特異的に結合する抗リン酸化p62抗体とした。
抗リン酸化p62抗体は、リン酸化p62タンパク質を認識し、非リン酸化p62タンパク質を認識しないことが確認できた。
FLAGタグを付けた配列番号1のp62w.t.(正常型)、配列番号1のp62の351番目のセリンをグルタミン酸に置換したS351E(配列番号2)(擬似リン酸化型p62)、配列番号1のp62の351番目のセリンをアラニンに置換したS351A(配列番号4)(非リン酸化型p62)、および配列番号1のp62の352番目のトレオニンをアラニンに置換したT352A(配列番号6)(Keap1との結合能の欠損型p62)を、アデノウイルス作製キット(タカラバイオ株式会社)により、野生型p62(p62w.t)(配列番号1).および変異型p62(p62S351E(配列番号2)、p62S351A(配列番号4)およびp62T352A(配列番号6))をコードするDNAをそれぞれ組み込んだアデノウイルスを作製した。次に、正常肝細胞を2mlの増殖培地(10%ウシ胎児血清,5U/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシンを含むウイリアムスE培地)中で24時間培養した後、その培地を、アデノウイルスをMOIが50となるように添加した培地と交換し、そのまま細胞を培養した。培地交換から24時間後、細胞全体の抽出液(Total)及び核画分の抽出液(Nucleus)を調製した。次に、細胞全体の抽出液を用いて、抗FLAG抗体(Sigma Chemical社)によって免疫沈降物(IP:FLAG(p62))を得た。次に、試料を12%ビス−トリスゲルおよびMOPS−SDSバッファーを用いてNuPAGE電気泳動システム(Invitrogen社)により分離し、PVDF膜にトランスファーした。そして、抗p62抗体(GP62C:Progen Biotechnik社)、抗Keap1抗体(Proteintech Group社)、抗リン酸化p62抗体、抗Nqo1抗体(Abcam社)、抗Actin抗体(MAB1501R:Millipore社)、抗Nrf2抗体(H-300:Santa Cruz Biotechnology社)、抗LaminB抗体(M-20:Santa Cruz Biotechnology社)を用いてイムノブロッティングを行った。実験は3回行い、その代表的な結果を図4に示す。
細胞内Keap1は、S351AよりもS351E(配列番号6)に結合した。また、S351Eを発現させた細胞内では、核内へのNrf2の著しい蓄積が生じ、さらにNrf2の標的であるNqo1のタンパク質の発現も誘導されていた。
FLAGタグをN末端に結合させたマウスKeap1(配列番号23)と、GFP、GFP−p62、GFP−S351E(配列番号2)またはGFP−S351A(配列番号4)を発現させたHEK293T細胞を、溶解用バッファーにより溶解して細胞抽出液を得た。次に抗FLAG抗体(Sigma Chemical社)を用いて免疫沈降を行い、FLAGタグを付加したKeap1およびKeap1と相互作用しているタンパク質複合体を回収した。細胞抽出液(crude)と回収したタンパク質複合体(IP:FLAG(Keap1))を12%ビス−トリスゲルおよびMOPS-SDSバッファーを用いてNuPAGE電気泳動システム(Invitrogen社)によりゲルに展開し、抗FLAG抗体(Sigma Chemical社)、抗GFP抗体(Invitrogen社)、抗p62抗体(GP62C:Progen Biotechnik社)、抗Nrf2抗体(H−300:Santa Cruz Biotechnology社)、抗アクチン抗体(MAB1501R:Chemicon International社)を用いて、イムノブロッティングを行った。結果を図5に示す。
S351Eの過剰発現により、Keap1と相互作用しているタンパク質複合体の中に、Nrf2が検出されなかった。すなわち、S351Eの過剰発現によってNrf2とKeap1の相互作用が消失した。
このように、p62はリン酸化されることによってKeap1との結合親和力が増強してKeap1と結合するようになり、それに伴って、Nrf2はKeap1から解離するようになる。
本実施例では、p62のリン酸化が腫瘍細胞の増殖に関係していることを示す。
ヒト肝細胞癌(細胞名:Huh−1)を、10%ウシ胎児血清、5U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを含有させたWillium’s E 培地中で培養した。
図6に示したように、ヒト肝細胞癌におけるp62陽性凝集体のp62はリン酸化されており、その凝集体にはKeap1が含まれていた。
まず、ヒトp62(配列番号7)の349番目のセリンをグルタミン酸に置換したS349E(配列番号8)(疑似リン酸化型p62)、ヒトp62の349番目のセリンをアラニンに置換したS349A(配列番号9)(非リン酸化型p62)、およびヒトp62の350番目のトレオニンをアラニンに置換したT350A(配列番号10)(Keap1との結合能の欠損型p62)をコードするp62cDNAを作製した。
p62(S349E)を[Huh−1_p62−/−]に導入した腫瘍細胞をヌードマウスに移植すると、in vivoで腫瘍細胞の増殖が有意に促進された(p<0.05、t検定)(図7(b))。
Claims (7)
- 配列番号1のアミノ酸配列における351番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されているリン酸化p62タンパク質を認識し、前記セリンがリン酸化されていない非リン酸化p62タンパク質を認識しない抗リン酸化p62抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするDNA。
- 請求項2に記載のDNAを含み、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現することができる発現ベクター。
- 請求項2に記載のDNAを有し、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞。
- 請求項1に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1に記載の抗リン酸化p62抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の診断剤。
- 前記腫瘍が肝がんであることを特徴とする、請求項6に記載の診断剤。
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