JP2013014558A - オートタキシンアイソフォーム特異的抗体および検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】オートタキシンを認識する抗体であって、Val−Glu−Pro−Lysからなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識する抗体、および前記抗体を用いたオートタキシンの測定方法および測定試薬により前記課題を解決する。
【選択図】図3
Description
(1)オートタキシンを認識する抗体であって、Val−Glu−Pro−Lys(配列番号1)からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを認識し、配列番号1からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシンを認識しない抗体。
(2)前記抗体がモノクローナル抗体である(1)に記載の抗体。
(3)前記オートタキシンがヒトオートタキシンである、(1)または(2)に記載の抗体。
(4)前記モノクローナル抗体が、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有した抗体である、(2)または(3)に記載の抗体。
(5)(1)から(4)のいずれかに記載の抗体を用いて、配列番号1からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを測定する方法。
(6)(1)から(4)のいずれかに記載の抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号1からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、配列番号1からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを測定する方法。
(7)(1)から(4)のいずれかに記載の抗体と、オートタキシンのアミノ酸配列のうち配列番号1からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、を含む、サンドイッチイムノアッセイによりオートタキシンを測定する試薬。
本発明の抗体は、オートタキシンのアミノ酸配列のうち、Val−Glu−Pro−Lys(配列番号1)からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン(以下、ATXwtと略す)を特異的に認識することを特徴としている。血液中に存在する自然状態のATXwtを検出するためには、前記自然状態のATXwt立体構造を認識する抗体が必要であるが、本発明の抗体は、前記自然状態のATXwtとの結合能を有する。そのため、本発明の抗体は、血清からのATXwtの吸収や酵素免疫測定法(エンザイムイムノアッセイ)などによる血清診断にも用いることができる。
(1)ヒトオートタキシン(GenBank No.AAB00855.1、配列番号4)の569番目から586番目までのアミノ酸からなるオリゴペプチド(Cys−Asp−Asp−Lys−Val−Glu−Pro−Lys−Asn−Lys−Leu−Asp−Glu−Leu−Asn−Lys−Arg−Leu、配列番号5)を定法に従い合成した。
(2)合成したペプチドを、Imject Keyhole Limpet Hemocyanin(PIERCE社;品番77153)を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることで免疫抗原を作製した。
(3)配列番号5からなるオリゴペプチド、および配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、5番目のバリンから8番目のリジンまでのアミノ酸(すなわち、配列番号1からなるアミノ酸配列)を欠損させたオリゴペプチド(Cys−Asp−Asp−Lys−Asn−Lys−Leu−Asp−Glu−Leu−Asn−Lys−Arg−Leu、配列番号6)を、Imject Bovine serum albumin(PIERCE社;品番77171)を用い、プロトコールに従って、コンジュゲーションすることでペプチド−BSA(Bovine serum albumin)を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
組み換え抗原への反応性確認のため、特許文献1に記載の方法に従い、スクリーニング用組み換え抗原を調製した。具体的な方法を以下に示す。
(1)Autotaxin−t(Genbank No.L46720)のうち、60番目から2648番目までのヌクレオチドからなるcDNA(配列番号7)をバキュロウイルス用トランスファーベクターpFASTBac−HT(インビトロジェン)に導入し、プロトコールに従い、ポリヒスチジンを付加した、配列番号1からなるアミノ酸配列を含むオートタキシン(ATXwt)発現用バキュロウイルスプラスミドを調製した。
(2)ポリヒスチジンを付加した、配列番号1からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシン(ATXδ)発現用プラスミドとして、(1)で作製したプラスミドを鋳型として、KOD−Plus−Mutagenesis Kit(東洋紡績)を用いて、配列番号7からなるポリヌクレオチドのうち1717番目から1728番目のヌクレオチド(GenBank No.L46720の1776番目から1787番目までのヌクレオチドに相当)を欠損したポリヌクレオチド(配列番号8)を含むプラスミドを調製した。
(3)(1)および(2)で作製したプラスミドを用い、Bac−to−Bacシステム(インビトロジェン)にて組み換えバキュロウイルスを調製した。
(4)(3)で調製したバキュロウイルスを用いて、常法に従い、sf9昆虫細胞に感染させることにより、ATXwtまたはATXδを含む発現培養上清を調製した。
(5)発現タンパク質の精製を特許文献4に従い実施した。具体的には以下に示す方法で実施した。
(5−1)抗オートタキシンモノクローナル抗体R10.7(特許文献1)をHiTrap NHS−activated HPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)に結合させ、ATXwtまたはATXδ発現培養上清を前記カラムにロードした。
(5−2)TBS(10mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.4)で十分洗浄を行なった。
(5−3)100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)により結合したATXwtまたはATXδを溶出した。
(1)WKYラット7週齢メスに対し、抗原250μgをフロイント完全アジュバント(DIFCO)と共に、エーテル麻酔下で後足に免疫を行なった。
(2)1カ月後、ラットより鼠頚リンパ節および腸骨リンパ節を採取し、B細胞を回収した。
(3)マウスミエローマ細胞株PAIとポリエチレングリコール存在下、常法に従い、細胞融合を行ない、約10日間のHAT培地による選択を行なった。
(4)実施例1で作製した、スクリーニング用ペプチド−BSAコンジュゲート抗原を用いATXwtと反応性を示し、かつATXδと反応性を示さないクローンを選択した。具体的には下記に示す方法で実施した。
(4−1)ペプチド−BSAコンジュゲート抗原50ng(1μg/mL溶液50μL)をTBSにより希釈し96穴イムノプレート(MaxiSorp、Nalge NUNC International、品番430341)に添加し、4℃にて一昼夜保存、コーティングした。
(4−2)続いてTBSにより3回の洗浄後、3%−BSAを含むTBS溶液を250μL/ウェルにて各ウェルに添加し、室温で2時間放置した。
(4−3)TBSにより3回洗浄を行ない、ハイブリドーマ細胞の培養上清を50μL/ウェルにて添加し、室温で2時間放置した。
(4−4)TBST(0.05%Tween 20を含むTBS)により6回洗浄を行なった後、HRP標識抗ラットイムノグロブリン抗体(5000倍希釈、American Qualex)および1% BSAを含むTBSTを50μL/ウェルにて添加し、室温で2時間放置した。
(4−5)TBSTにより6回洗浄を行ない、続いてTMB基質(Kirkegaard & Perry Laboratories、品番:50−76−00)を50μL/ウェルで添加し室温10分放置した。
(4−6)1M リン酸にて反応を停止しOD450の吸光度を測定し、目的のクローンを選択した。
(4−7)スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ないハイブリドーマとして樹立した。
(5)得られたハイブリドーマを、HT培地により約10日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ細胞培養用培地により培養を続けた。ハイブリドーマ細胞培養用培地は、GIT培地(大日本住友製薬)500mLに対し、NCTC−109培地(インビトロジェン)を27.5mL、不必須アミノ酸(インビトロジェン)を5.5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン酸(インビトロジェン)を5.5mLをろ過滅菌し添加したものを用いた。また、前記培地にHAT(Sigma−Aldrich、HYBRYMAX、品番:H0262)を添加したものをHAT培地として、HT(Sigma−Aldrich、HYBRYMAX,品番:H0137)を添加したものをHT培地として、それぞれ用いた。
(6)培養上清を回収し、ATXwtを特異的に認識するモノクローナル抗体ATXR4+4を回収した。
実施例3にて取得したATXwt特異的モノクローナル抗体ATXR4+4の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を決定した。
(1−1)重鎖遺伝子の増幅は、RNeasy Miniキット(QIAGEN)にてtotal RNAを回収した後、One−step RT−PCRキット(QIAGEN)を使用しプロトコールに従い実施した。PCRプライマーは、
(A)5’−ctgaggttctcccactc−3’(配列番号9、GenBank No.L22652の19番目から35番目までのヌクレオチドに相当)および5’−gtcacggtgactggctca−3’(配列番号10、GenBank No.L22652の588番目から605番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当)の組み合わせ、ならびに
(B)5’−ggagcccagtcctggac−3’(配列番号11、GenBank No.L22652の1番目から17番目までのヌクレオチドに相当)および5’−cagatggggctgttg−3’(配列番号12、GenBank No.L22652の494番目から508番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当)の組み合わせ
を用いた。
(1−2)(1−1)で得られた2種類のPCR産物を回収し、ABI PRISM 310(アプライドバイオシステムズ)にてそれぞれシークエンスによりヌクレオチド配列を取得後、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定した(配列番号15)。配列番号15の情報を基に翻訳した、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
(2−1)軽鎖遺伝子の増幅は、重鎖と同様に回収したtotal RNAを用いOne−step RT−PCRキットを使用しプロトコールに従い実施した。PCRプライマーは、5’−tgacacagtctcca−3’(配列番号13、GenBank No.BC088255の82番目から95番目までのヌクレオチドに相当)および5’−tggatggtgggaagat−3’(配列番号14、GenBank No.BC088255の420番目から435番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当)の組み合わせを用いた。
(2−2)(2−1)で得られたPCR産物を、重鎖と同様にシークエンスし塩基配列を決定した。なお、本方法では軽鎖可変領域全ての配列が決定できなかったため、5’−tggatggtgggaagat−3’(配列番号14、GenBank No.BC088255の420番目から435番目までのヌクレオチドの相補鎖に相当)を用い5’/3’RACEキット(ROCHE)を用い、プロトコールに従い、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を決定した(配列番号16)。配列番号16の情報を基に翻訳した、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号3に示す。
実施例2に従い調製したバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現させ、精製したATXwtおよびATXδを用い、ウエスタンブロッティングによりATXR4+4の反応性を検証した。なお、対照としてヒトオートタキシンN末端領域の大腸菌発現抗原を用い作製した抗オートタキシンモノクローナル抗体(R1.1A9、全てのオートタキシンN末端を認識する抗体)を用いた。具体的には以下に示す方法で実施した。
(1)ATXwtまたはATXδを80ng/レーンにて、還元条件下SDS−PAGE電気泳動を行なった。
(2)電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン膜にSemidry Transblot(BIORAD)を用い常法に従い転写した。
(3)非特異的結合を回避するために、転写後の膜を3%スキムミルクを含むTBS溶液にて2時間のブロッキングを行ない、その後1μg/mLのATXR4+4抗体またはR1.1A9抗体と反応させた。
(4)TBSTによる十分な洗浄後、1 Step NBT/BCIP試薬(PIERCE)により抗体の結合を検出した。
(1)天然状態ATXwtへの反応性の検証のため実施例2により調製したATXwtを、特許文献4に記載の方法でオートタキシンを吸着して除いた牛血清に添加し、ATXwtのみを含む試料を調製した。
(2)試料中のオートタキシン濃度を、特許文献1に記載のオートタキシン定量法により決定した。
(2−1)ATXR4+4抗体をNHS−Biotin(Sigma)試薬を用い常法に従いビオチン標識を施した。
(2−2)Dynabeads Streptavidin(ベリタス)懸濁液10μLに対し、10μgのビオチン標識ATXR4+4を添加した。
(2−3)10分後、TBSTにて十分洗浄した後、約0.4mg/LのATXwtを含む試料1mLを添加し、緩やかに撹拌を続けながら1時間室温にて反応させた。
(2−4)磁石にてATXR4+4抗体が結合したDynabeadsを回収し、上清中のオートタキシン濃度を測定した。なお、対照としてビオチン標識ATXR4+4抗体を添加せずDynabeadsのみで処理した同一試料の上清中のオートタキシン濃度を測定しバックグラウンド値とした。
ヒト血清中のATXwtおよびATXδの存在検出を以下の手順にて行なった。
(1)プロトコールに従い1mL容量のHiTrap NHS−activated HP(GEヘルスケアバイオサイエンス)カラムに5mgのモノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムを2種類作製した。一つは、ATX4+4モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムであり、本カラムに結合した物質にはATXwtが含まれ、本カラムの素通り画分にはATXδが含まれることが期待される。もう一つは、ATX全てに結合能を有するR10.23抗体(特許文献1および特許文献4)を結合させたアフィニティーカラムであり、本カラムの素通り画分にはATXwt、ATXδいずれも含まれないことが期待される。
(2)1.16mg/Lのオートタキシンを含む健常者ヒト血清7mLをATXR4+4結合アフィニティーカラムにロードした。なお、各試料のオートタキシン濃度は特許文献1に記載のオートタキシン定量試薬を用い、全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA−1800(東ソー、製造販売届出番号:13B3X90002000002)にて定量している。
(3)素通り画分を回収する一方、カラムは十分量のTBSにて洗浄後、100mMグリシン(pH2.5)溶液でカラムに結合した物質を溶出し、溶出画分はTBSにて十分透析した後に、解析用サンプルとした。
(4)素通り画分は続いてR10.23を結合させたアフィニティーカラムにロードした。本作業により、本カラムに結合した物質には(3)の素通り画分に残存したATXδが含まれ、素通り画分にはATXwt、ATXδいずれも含まれないことが期待される。
(5)(3)と同様に、素通り画分を回収する一方、カラムは十分量のTBSにて洗浄後、100mMグリシン(pH2.5)溶液でカラムに結合した物質を溶出し、溶出画分はTBSにて十分透析後解析用サンプルとした。2種類のカラムを共に素通りした画分中のオートタキシン濃度を定量した結果、0.00mg/mLであることを確認し、ヒト血清中に存在したオートタキシン全てを2種類のカラムで結合回収できたことを確認した。
(6)ATXR4+4結合カラムに結合後に溶出した画分(以下、ATXR4+4結合画分とする)、およびR10.23結合カラムに結合後に溶出した画分(以下、R10.23結合画分とする)を、実施例5同様、電気泳動、膜への転写を実施し、ATXR4+4抗体およびR1.1A9抗体にてオートタキシンを検出した。
(7)同様の実験を、異なるヒト健常人血清についても実施した。
特許文献1と同様の方法でATXwt特異的測定試薬の調製を行なった。具体的には以下に示す方法で実施した。
(1)水不溶性担体(内部にフェライトを練り込んだ粒子径約1.5mmのエチレンビニルアルコール製担体)に抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体(R10.23)を100ng/担体になるように30℃にて一昼夜物理的に吸着させ、その後1%BSAを含む100mMトリス緩衝液(pH8.0)にて40℃・4時間ブロッキングを行なうことで抗体固定化担体を調製した。
(2)抗ヒトオートタキシンモノクローナル抗体(ATXR4+4)をアルカリフォスファターゼ標識用キット−NH2(同仁化学研究所、品番:LK12)を用いてアルカリ性ホスファターゼと結合させることで標識抗体を調製した。
(3)磁力透過性の容器(容量1.2mL)に12個の抗体固定化担体を入れた後、0.7μg/mLの標識抗体を含む緩衝液(3%BSAを含むトリス緩衝液、pH8.0)50μLを容器に添加し凍結乾燥することでオートタキシン測定試薬を調製した。オートタキシン測定試薬は窒素充填下密閉封印シールを施し測定まで4℃にて保管した。
(4)既知濃度ヒトオートタキシン標準品を特許文献1に記載の方法で調製した。具体的には、下記に示す方法で実施した。
(4−1)オートタキシンモノクローナル抗体(R10.23)結合カラムを用い、牛血清中のオートタキシンを吸着させることで、オートタキシン非含有血清を調製した。
(4−2)実施例2に記載の方法で精製した組み換えATXwtを用い、オートタキシン非含有血清に適当な濃度添加することで、濃度の異なる5濃度(オートタキシン非含有血清を加えると6濃度)の標準品を作製した。標準品の濃度決定は特許文献1に記載のオートタキシン定量試薬にて決定した。
実施例8で調製した測定試薬を用い、健常者血清2種(オートタキシン濃度が低濃度の血清と中濃度の血清)、および健常者血清に、実施例2に記載の方法で精製した組み換えATXwtを添加した高濃度試料の計3種類の検体を10重測定した際のばらつき(CV(%))を検証した。表1に示す通り、いずれもCVは5%以下であり測定精度は良好であった。
実施例8で調製した測定試薬を用い、健常者血清を、実施例8(4−1)で調製したオートタキシン非含有血清を用い2倍希釈系列を調製した。前記希釈系列を5重測定し、測定値の平均とばらつき(CV(%))をプロットする(図5)ことで実効検出感度を算出した。CVが20%になる濃度を算出した結果68μg/Lとなり、実施例8で調製したATXwt特異的測定試薬がATXwtを非常に高感度に測定する試薬であることが確認された。
Claims (7)
- オートタキシンを認識する抗体であって、Val−Glu−Pro−Lys(配列番号1)からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを特異的に認識し、配列番号1からなるアミノ酸配列を含まないオートタキシンを認識しない抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記オートタキシンがヒトオートタキシンである、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有した抗体である、請求項2または3に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体を用いて、配列番号1からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを検出する方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体と、
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号1からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、
を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、配列番号1からなるアミノ酸配列を含むオートタキシンを検出する方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体と、
オートタキシンのアミノ酸配列のうち、配列番号1からなるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列を認識する抗体と、
を含む、サンドイッチイムノアッセイによりオートタキシンを検出する試薬。
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