WO2006134871A1 - 脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法 - Google Patents

脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法 Download PDF

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gene transfer
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retronectin
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Takahiro Marui
Tatsuji Enoki
Hiroaki Sagawa
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12N2810/857—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from blood coagulation or fibrinolysis factors

Definitions

  • the present invention relates to a technique for introducing a gene into an adipocyte or a preadipocyte with high efficiency, which is useful in fields such as medicine, cell engineering, and genetic engineering.
  • Genes used as therapeutic genes in gene therapy are usually introduced into tissues or organs where the genes need to be expressed. For example, a treatment that introduces the CFTR gene into respiratory epithelial cells of patients with cystic fibrosis.
  • gene expression may not be related to the tissue or organ.
  • factor VII a blood coagulation factor in plasma
  • a gene encoding the early factor is introduced into skeletal muscle cells to produce factor VII in the cells, Attempts have also been made to supply it into the plasma!
  • adipocytes and preadipocytes are easy to collect, culture, and transplant to individuals, and are attracting attention as target cells for gene transfer (Patent Document 1).
  • Patent Literature a method of infecting target cells with retroviruses in the presence of a functional substance that binds to retroviruses.
  • Patent Literature 2, 3, 4; Non-patent document 2.
  • substances that bind to target cells or substances that have target cell binding sites are used, but functional substances that can increase the infectivity of retroviruses in adipocytes or preadipocytes are not available. unknown.
  • Patent Document 1 International Publication No. 03Z106663 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. 95Z26200 Pamphlet
  • Patent Document 3 Pamphlet of International Publication No. 97Z18318
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 00Z01836
  • Non-Patent Document 1 Blood (101), pp. 2963-2972 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Nichiya-ichi Medine (Nature Medicine), 2nd pp. 876-882 (1996)
  • An object of the present invention is to develop a method for efficiently introducing a foreign gene into adipocytes and preadipocytes, and to provide a method for producing transformed cells effective for the treatment and prevention of diseases.
  • the present inventors When the functional substance having a binding region to VLA-5 and Z or VLA-4 is used, the present inventors have used a retrovirus vector and a retroviral vector together with a retrovirus vector. The inventors found that the virus efficiently infects adipocytes and preadipocytes, and completed the present invention.
  • the present invention is a method for gene transfer into an adipocyte or a preadipocyte, which has a retrovirus binding site and a target cell binding site in the same molecule or a retrovirus binding site Including the step of infecting adipocytes or preadipocytes with a retroviral vector having a foreign gene in the presence of a mixture of a substance having a target cell and another substance having a target cell binding site, and said target cell binding
  • the region is characterized by including a region capable of binding to VLA-5 and a region capable of binding to Z or VLA-4.
  • the retrovirus binding site used in the present invention includes fibronectin heparin II domain, fibroblast growth factor, insulin binding site of type V collagen, polylysine, DEAE dextran force, and retro derived from a selected substance.
  • a virus binding site is exemplified.
  • a target cell binding site which is a binding region to fibronectin-derived VLA-5 and Z or VLA-4 can be used.
  • the substance having the target cell binding site and having the retrovirus binding site has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in Z or SEQ ID NO: 3.
  • Polypeptides are exemplified.
  • the retroviral vector used in the present invention may be a replication-defective retroviral vector.
  • adipocytes and preadipocytes into which a useful foreign gene has been artificially incorporated.
  • the cells can be used for the treatment of various diseases, and are extremely useful medically.
  • the present invention provides a method for improving the efficiency of gene transfer into a cell by a retroviral vector by co-arranging a retroviral vector and an adipocyte or preadipocyte.
  • the present invention includes a substance having a retrovirus binding site and an adipocyte / preadipocyte binding site in the same molecule, or a substance having a retrovirus binding site and another substance having an adipocyte binding site. Mixtures can be used.
  • the retrovirus-binding site is not particularly limited as long as it has an activity of binding to a retrovirus vector.
  • fibronectin heparin-domain fibroblast growth factor, Insulin binding sites of type V collagen, polylysine, DAEAE dextran, etc.
  • a polypeptide having a retrovirus binding site derived from the heparin II domain of fibronectin, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (H-271) can be used.
  • a substance containing a binding region to VLA-5 and Z or VLA-4 can be used as a binding site for adipocytes and preadipocytes.
  • a substance containing a binding region to VLA-5 and Z or VLA-4 can be used as a binding site for adipocytes and preadipocytes.
  • a known VLA-5 or VLA-4 ligand, or an antibody that recognizes shihachi or shiha can be used.
  • VLA-5 from fibronectin Alternatively, a VLA-4 binding site can be used, and a polypeptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 (C-274) and a polypeptide including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 (CS 1) are exemplified. Is done.
  • a functional substance having both the retrovirus binding site and the adipocyte or preadipocyte binding site may be used.
  • the functional substance containing a retrovirus binding site and an adipocyte may be used.
  • a mixture of other functional substances having a preadipocyte binding site may be used.
  • a recombinant polypeptide derived from fibronectin for example, CH-2 96 (SEQ ID NO: 4) having all of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, shown in SEQ ID NOs: 1 and 3 H-296 (SEQ ID NO: 5) having an amino acid sequence and CH-271 (SEQ ID NO: 6) having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are used.
  • CH-2 96 SEQ ID NO: 4
  • H-296 SEQ ID NO: 5
  • CH-271 SEQ ID NO: 6
  • a mixture of H-271 which is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and C-274 which is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be used.
  • CH-296 The first half of CH-296, H-296, CH-271, H-271 and C-274 are published in Journal of Biochemistry (J. Biochem.), No. 110, pp. 284-291 (1991). It can be produced based on the description. Further, CH-296 is commercially available under the trade name of RetroNectin (registered trademark) (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the method for using the functional substance is not particularly limited.
  • the surface of a container used for a retrovirus vector infection operation on cells can be used by coating with the functional substance.
  • a known method may be used for the coating operation.
  • the retroviral vector used in the present invention is not particularly limited.
  • an artificially modified recombinant retrovirus that is, a retrovirus vector is usually used in the present invention.
  • a replication-defective retrovirus vector is preferred.
  • the vector is non-pathogenic, deficient in replication so that it cannot replicate in infected cells. These vectors can invade vertebrate cells, particularly host cells such as mammalian cells, and stably incorporate foreign genes inserted into the vectors into their chromosomal DNA.
  • Known replication-defective retrovirus vectors include MFG vector and ⁇ -SGC vector (International Publication No.
  • the foreign gene to be retained in the retroviral vector is not particularly limited. Any gene desired to be expressed in the target cell can be inserted, and a polypeptide (enzyme, hormone, growth factor) can be inserted. Examples include genes that encode RNAs that cause RNA interference, cytoplasmic force-in, receptors, structural proteins, etc.), antisense RNA, ribozymes, decoys, and the like. When the present invention is carried out for the purpose of gene therapy, a gene encoding a substance useful for treatment or prevention of a disease is introduced into a target cell.
  • the gene to be introduced is a polypeptide that is produced by cells and then moves outside the cells (for example, circulates in blood vessels) and acts.
  • those encoding secretory enzymes, hormones, growth factors, site force-in and the like are suitable.
  • the aforementioned foreign gene may be used by inserting it into a retrovirus vector under the control of an appropriate promoter, for example, the LTR promoter or the foreign promoter present in the retrovirus vector. it can.
  • an appropriate promoter for example, the LTR promoter or the foreign promoter present in the retrovirus vector.
  • other regulatory elements cooperating with the promoter and the transcription initiation site for example, an enhancer sequence may be present in the vector.
  • the introduced gene can contain a terminator sequence downstream thereof.
  • suitable marker genes that allow selection of the transfected cells (for example, drug resistance genes, genes encoding fluorescent proteins, genes encoding enzymes that can function as reporters such as j8-galactosidase luciferase, It has a gene that encodes a receptor protein).
  • the retroviral vector may be prepared by a known method and used in the present invention.
  • Retrovirus-producing cells suitable for the retrovirus vector to be used can be cultured, and the culture supernatant can be collected and used in the present invention.
  • the retrovirus-producing cells described above are those that stably produce retrovirus particles in the supernatant. Although retrovirus particles are produced transiently by transfection of the Torovirus vector plasmid, they can be shifted.
  • retrovirus-producing cells For the production of the above-mentioned retrovirus-producing cells, known packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL—10686), PA317 (ATCC CRL—9078), GP + E—86 and GP + envAm—12 ( US Pat. No. 5,278,056), Psi-Crip [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, No. 85, pp. 6460-6464 (1988)] and the like may be used.
  • retrovirus-producing cells can be prepared using 293 cells, 293TZ17 cells, and G3T-hi cells with high transfection efficiency.
  • a retrovirus produced by pseudotyped packaging having an envelope derived from a virus different from that derived from the genome of the retrovirus vector can also be used.
  • Moroni mouse leukemia virus Moroni mouse leukemia virus
  • GaLV gibbon leukemia virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • feline endogenous virus You can use second-type retroviruses.
  • a retrovirus vector having a sugar chain-modified protein on its surface produced using a retrovirus-producing cell into which an enzyme gene involved in sugar chain synthesis has been introduced can also be used in the present invention.
  • Precursor cells include cells that can directly differentiate into adipocytes, as well as mesenchymal stem cells and stromal cells that maintain the ability to differentiate into various cells including adipocytes.
  • Each of the cells may be a primary cultured cell collected from adipose tissue of a human or non-human mammal or a cultured cell line established. Examples of the adipose tissue collection source include, but are not limited to, subcutaneous fat and visceral fat.
  • Adipose tissue is suitable as a collection source for target cells because it is less likely to cause functional damage to an individual.
  • mesenchymal stem cells and stromal cells can be collected from bone marrow and other tissues.
  • a retroviral vector is added to the adipocytes and preadipocytes.
  • the obtained gene-transferred cells can be differentiated into fat cells by a known method to obtain the gene-transferred fat cells.
  • the present invention is not particularly limited, for example, the present invention can be carried out by infecting cells with a retroviral vector in a container whose surface is covered with the above-mentioned functional substance. it can.
  • the container is not particularly limited as long as it can be used for cell maintenance and culture, and a petri dish, a cell culture plate, a flask, a cell culture bag, and the like can be used.
  • the functional substance can be immobilized on the surface of the container by a known method suitable for the functional substance to be used.
  • Retronectin is immobilized in a state of being dissolved in sterilized distilled water, buffer solution or physiological saline. Can be used for firewood.
  • the method of infection with a retroviral vector is not particularly limited to the present invention.
  • the following two methods are exemplified.
  • Adipocytes or preadipocytes and a retrovirus vector are added to a container coated with a functional substance and incubated.
  • the latter is characterized in that it can remove infection-inhibiting substances that may be present in retrovirus-producing cells, but it is not always necessary to carry out this method.
  • an appropriate one may be selected from the above methods or other methods depending on the vector and cells to be used.
  • the cells being cultured with the retroviral vector are cultured while changing the medium or adding a new vector as necessary. After completion of the culture, the cells in the container can be collected, washed as necessary, and used for various purposes.
  • the gene-introduced cell is a preadipocyte, not only the cell is maintained as it is, but also the differentiation into a mature cell may be induced.
  • mesenchymal stem cells are suitable growth factors, differentiation inducers Can be differentiated into mature adipocytes.
  • An appropriate cell culture medium can be selected and used for target cell culture and retroviral vector infection.
  • a commercially available medium or a modified medium may be used.
  • the medium may contain components such as growth factors and cell growth factors.
  • the thus-introduced cells thus obtained can be transplanted into a human or non-human mammal to express the introduced gene and exert a desired action, for example, a therapeutic or preventive effect on a disease. it can.
  • gene-introduced adipocytes and preadipocytes are transplanted into subcutaneous tissue or adipose tissue, but are not particularly limited.
  • the transplantation can be performed by a method of injecting a cell suspension into a target site or a method of transplanting a cell into a surgically incised target site.
  • the donor of the adipocyte or preadipocyte serving as the target cell is preferably the recipient itself.
  • the degree of coincidence of histocompatibility antigens is high, it is possible to transplant non-self-derived transgenic cells.
  • pDON encodes Red-shift Green Fluorescent Protein (hereinafter abbreviated as GFP) inserted into plasmid PQBI25 (Quantum Biotechnologies Inc.) at the multicloning site of AI plasmid (Takara Bio, 3650) The gene was inserted to produce plasmid pDON-GFP.
  • GFP-expressing retrovirus vector using Retrovirus Packaging Kit Ampho (Tacarano, 6161) using 293TZ17 cells (ATCC CRL-11268) and the above pDON-GFP According to the genus protocol.
  • GFP-expressing retroviral vectors were prepared: those collected 48 hours after transfection (used in Example 1) and those collected in 72 hours (used in Example 2). And used in the following experiment.
  • the collected GFP-expressing retroviral vector was stored at -80 ° C and rapidly dissolved in a 37 ° C water bath before use.
  • Preadipocyte Growth Medium (hereinafter, PGM medium, prepared from Cambrex B8000), 10-fold, 40-fold, 160-fold diluted supernatant from Saiko, and 10% for the test of Example 2 Dulbecco's modified Eagle's medium (manufactured by Sigma, D6046) (hereinafter referred to as DMEM medium) containing urchin fetal serum (FBS: manufactured by Cambrex). .
  • PGM medium Preadipocyte Growth Medium
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS urchin fetal serum
  • Non-treatment 24-well culture plate (Betaton Dickinson, 351147) RetroNectin (registered trademark, Takara noio, T100A) dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to 20 gZmL in each well The solution was added in 500 / zL aliquots and fixed at 4 ° C for 1 hour. Thereafter, the solution was removed from each well, 500 L of PBS containing 2% bovine serum albumin was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more. The thus prepared retronectin-fixed sputum culture plate was washed once with PBS and subjected to each experiment.
  • PBS phosphate buffered saline
  • gene introduction was performed by the polyprene SN method without using retronectin. Seed human preadipocytes suspended in PGM medium to 4 ⁇ 10 4 cellsZmL each in a 24-well culture plate (Betaton's Dickinson Co., 353047).
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C in a 2 incubator. Thereafter, the culture supernatant was removed, and an aqueous solution of polyprene (hexadimethrine bromide; Aldrich, 10768-9) was added to the diluted GFP-expressing retrovirus vector prepared in Preparation Example 1 to a final concentration of 8 ⁇ gZmL. Add 500 liters of the supplemented product to each well and incubate at 37 ° C in a CO incubator. Cultivation
  • Polyprene SN method 55. 51 45. 63 22. 33 [0044] As shown in Table 1, the retronectin binding method and the retronectin SN method! /, Even in the case of deviation, showed higher gene transfer efficiency than the polyprene SN method used as a control, and in gene transfer into adipocytes The utility of retronectin was shown.
  • Example 1 Performed in the same manner as in (1).
  • 3T3-L1 cells suspended in PGM medium to 4 X 10 4 cellsZmL were placed in 500 ⁇ L tubes and centrifuged at 1,500 X g for 5 minutes at room temperature to remove the supernatant.
  • 500 ⁇ L each of the GFP-expressing retrovirus vector diluted solution prepared in Preparation Example 1 was added to suspend the precipitate (cells). This suspension was added to each well of the retronectin-fixed culture plate prepared in (1) and cultured at 37 ° C for 1 day in a CO incubator. On culture
  • the ratio of GFP-expressing cells was measured by flow cytometry for cells that had been subjected to gene transfer treatment by the methods (2), (3), and (4), and gene transfer efficiency was evaluated.
  • each cultured cell was peeled from the culture plate with trypsin 'EDTA solution, suspended in DMEM medium, and subjected to flow cytometry analysis.
  • the results are shown in Table 2.
  • Table 2 shows the gene transfer efficiency (GFP expression ratio) (%) when gene transfer was performed by each method using GFP-expressing retrovirus vectors diluted 4-fold, 16-fold, and 64-fold, respectively. is there.
  • a GFP-expressing retroviral vector was prepared in the same manner as in Preparation Example 1. In addition to 293TZ17 cells, G3T-hi cells (Tacarano, 6163) were also used as production cells. Each GFP-expressing retrovirus vector (culture supernatant) was prepared in two types: one collected 48 hours after transfection and one collected 72 hours after transfection, and each was frozen and stored at 80 ° C.
  • Human preadipocytes derived from subcutaneous fat (Cambrex, PT5020) were thawed after purchase and cultured for about 48 hours using PGM medium and a 225 cm 2 flask (CORNING, 431082). Then, 90% FBSZlO% DMSO (manufactured by SIGMA) was suspended in a stock solution and stored again in liquid nitrogen.
  • these preserved human preadipocytes are rapidly lysed in a 37 ° C water bath, washed with PGM medium, and then placed in a 175 cm 2 flask (Betaton's Dickinson, 353028) at about 4000 cells / 0.2 mL The seeding was performed under the condition 2 and the culture was performed for about 48 hours. The cultured cells are collected using trypsin 'EDTA solution, part of which is used in the polybrene method experiment described in (6) below, and the rest is seeded again in a 175 cm 2 flask, and further cultured for about 24 hours. Then, it was subjected to the retronectin method (4) and (5) described later.
  • Example 1 Performed in the same manner as in (1). However, a non-treatment 48-well culture plate (Betaton Dickinson, 351178) was used as the plate, and the amount of the retronectin solution added to the well was 200 ⁇ L.
  • a non-treatment 48-well culture plate Betaton Dickinson, 351178
  • the GFP-expressing retroviral vector prepared in Preparation Example 2 (producing cells 293TZ17 cells, collected 48 hours after transfer) is rapidly dissolved in a 37 ° C water bath, diluted 10-fold with PGM medium, 40-fold Diluted for experiment.
  • the human preadipocytes pre-cultured in (1) are suspended in PGM medium so as to be 4 ⁇ 10 4 cell S / mL, and 200 L each for 48-well cell culture plate (Betaton Dickinson, 3530 78) ) And cultured overnight at 37 ° C in a CO incubator. Then, culture supernatant
  • the ratio of GFP-expressing cells was measured in the same manner as in Example 1 (5) for cells that had been subjected to gene transfer treatment by the methods (4), (5), and (6). The results are shown in Table 3.
  • Table 3 shows the gene transfer efficiency (GFP-expressing cell ratio) (%) when gene transfer was performed by each method using GFP-expressing retroviral vectors diluted 10-fold and 40-fold, respectively.
  • both the retronectin binding method and the retronectin SN method showed higher gene transfer efficiency than the polyprene SN method used as a control, and the usefulness of retronectin for gene transfer into adipocytes was confirmed. Indicated.
  • ADM medium prepared from Preadipocyte Growth Medium Bullet Kit TM Cambrex, PT8000
  • ADM medium prepared from Preadipocyte Growth Medium Bullet Kit TM Cambrex, PT8000
  • Example 3 Performed in the same manner as in (1).
  • Example 3 Performed in the same manner as in (2).
  • the GFP-expressing retroviral vector prepared in Preparation Example 2 was rapidly dissolved in a 37 ° C water bath, and diluted 10-fold, 40-fold, and 160-fold with a PGM medium for use in experiments.
  • the GFP-expressing retrovirus vector the cultured supernatant collected after culturing the transfected 293TZ17 cells and G3T-hi cells for 72 hours was used for the experiment.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (4).
  • Example 3 Performed in the same manner as in (5).
  • Example 3 Performed in the same manner as in (7). The results are shown in Table 6.
  • Table 6 shows gene transfer efficiency (GFP expression cell ratio) (%) when gene transfer was performed by each method using various GFP-expressing retrovirus vectors diluted 10-fold, 40-fold, and 160-fold, respectively. Is shown.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (1). However, pre-culture is 75cm 2 flask (betaton 353110) ⁇ j3 ⁇ 4U 3 ⁇ 49000cells / 0.2 mLZcm 2 was seeded and cultured.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (2).
  • the GFP-expressing retroviral vector prepared in Preparation Example 2 (producing cells 293TZ17 cells, collected 72 hours after transfer) is rapidly dissolved in a 37 ° C water bath, and 10% humanAB serum (instead of 10% FBS) Diluted 10-fold, 40-fold, and 160-fold with PGM medium (hereinafter referred to as 10HPGM medium) containing Cambrex) and used for the experiment.
  • 10HPGM medium PGM medium
  • Example 3 Performed in the same manner as in (4). However, 10HPGM medium was used as the medium.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (5). However, 10HPGM medium was used as the medium.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (6). However, 10HPGM medium was used as the medium.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (7). The results are shown in Table 7. Table 7 shows the efficiency of gene transfer when GFP expression retroviral vectors diluted 10-fold, 40-fold, and 160-fold with 10 HPGM medium are used for gene transfer (GFP-expressing cells). (Ratio) (%).
  • Example 3 Performed in the same manner as in (1). However, at the time of pre-culture, the cells were placed in 12.5 cm 2 flask (Becken's Dickinson Company, 353107), about 13000 cells Z ⁇ 0.2 mL / cm 2 , 25 cm 2 flask (Betaton's Dickinson Company, 353108) 6600 cells Z0.2 2 mL / cm 2 and 75 cm 2 flasks were seeded under three conditions of about 2200 cells Z0.2 mL 2 cmZ2.
  • the cells that had been cultured for about 72 hours and the cells that had been cultured for about 48 hours were detached and collected once, and a portion of the cells were seeded again in a flask of the same area at approximately the same cell density.
  • Two types of cells cultured for about 24 hours were prepared and used for gene transfer.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (2).
  • the GFP-expressing retroviral vector prepared in Preparation Example 2 (producing cells G3T-hi cells, recovered 72 hours after transfection) is rapidly lysed in a 37 ° C water bath, diluted 10-fold, 40-fold, 160 It was diluted and used for the experiment.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (5).
  • Example 3 Performed in the same manner as in (7). The results are shown in Table 8. Table 8 shows the efficiency of gene transfer when transfection with the retronectin SN method was performed on cells with different pre-culture conditions using GFP-expressing retrovirus vectors diluted 10-fold, 40-fold, and 160-fold. GFP expressing cell ratio) (%).
  • adipose-derived human preadipocytes (Cambrex, PT5005) are thawed after purchase and cultured for about 48 hours using PGM medium and a 225 cm 2 flask.
  • % FBS manufactured by Cambrex
  • ZlO% DMSO manufactured by SIGMA was suspended in a preserving liquid and stored again in liquid nitrogen.
  • these preserved preadipocytes are rapidly lysed in a 37 ° C water bath, washed with PGM medium, and then seeded in a 75 cm 2 flask under conditions of about 3700 cells ZO 2 mLZcm 2 for about 48 hours. Culture was performed. The cultured cells are collected using trypsin 'EDTA solution, a part of which is used in the polybrene method experiment described in (6) below, and the rest is seeded again in a 75 cm 2 flask and further cultured for about 24 hours. After that, it was subjected to the retronectin method (4) and (5) described later.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (2).
  • the GFP-expressing retroviral vector prepared in Preparation Example 2 (producing cells 293TZ17 cells, collected 48 hours after transfusion) is rapidly dissolved in a 37 ° C water bath and diluted 10-fold or 40-fold with PGM medium. And used for the experiment.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (4). However, the cells are those of the visceral fat derived from (1) above. Pre-adipocytes were used.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (5). However, the visceral fat-derived human preadipocytes described in (1) above were used.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (6). However, the visceral fat human precursor fat cells of (1) above were used.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (7). The results are shown in Table 9. The table shows gene transfer efficiency (GFP expression cell ratio) (%) when transfection was carried out by each method using GFP-expressing retroviral vectors diluted 10-fold and 40-fold, respectively.
  • Retrone ⁇ r-SN SN method 65. 47 59. 57
  • a gene encoding the fluorescent protein ZsGreen inserted in the plasmid pZsGreenl-Nl was inserted into the multicloning site of the pDON-AI plasmid to prepare a plasmid pDON-ZsGreen.
  • a ZsGreen expression retroviral vector was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 using the above-mentioned pDON-ZsGreen.
  • the recovered ZsGreen-expressing retrovirus vector was stored at ⁇ 80 ° C., rapidly dissolved in a 37 ° C. water bath before use, and diluted 10-fold or 100-fold with PGM medium for use in experiments.
  • Example 3 Human preadipocytes derived from subcutaneous fat were pre-cultured in the same manner as in (1) and used for the following experiments.
  • Example 3 Performed in the same manner as in (2). However, CH-271 was fixed with retronectin. At that time, the concentration of CH-271 in the solution used for fixation was 77 gZml.
  • Example 3- (4) Using the ZsGreen-expressing retrovirus vector solution prepared in Preparation Example 3 and the C H-271 fixed yeast culture plate prepared in (2), the same procedure as in Example 3- (4) was performed.
  • Example 3- (5) Using the ZsGreen-expressing retrovirus vector solution prepared in Preparation Example 3 and the C H-271-fixed yeast culture plate prepared in (2), the same procedure as in Example 3- (5) was performed.
  • gene transfer was performed by the protamine SN method without using a polypeptide such as retronectin or CH-271.
  • the human preadipocytes pre-cultured in (1) are suspended in PGM medium to 4 ⁇ 10 4 cell sZmL, seeded on a 48-well cell culture plate in 200 ⁇ L, and placed in a CO incubator. Incubated overnight at 37 ° C. Then remove the culture supernatant,
  • the ratio of ZsGreen-expressing cells was measured in the same manner as in Example 1 (5) for the cells that had been subjected to gene transfer treatment by the methods (3), (4), and (5). The results are shown in Table 10.
  • Table 10 shows the gene transfer efficiency when gene transfer was performed by each method using ZsGreen expression retrovirus vector solutions diluted 10-fold and 100-fold in PGM medium, respectively. (ZsGreen expressing cell ratio) (%) is shown.
  • Example 3 Human preadipocytes derived from subcutaneous fat were pre-cultured in the same manner as in (1). However, Preadipocyte Growth Medium-2 (hereinafter PGM-2 medium, manufactured by Cambrex; prepared from PT-8002) was used as the medium.
  • PGM-2 medium manufactured by Cambrex; prepared from PT-8002
  • Example 3 The same method as in (2) was performed. However, Retro-Nectin immobilized H-296. At that time, the concentration of H-296 in the solution used for fixation was 100 gZml.
  • Example 3 Performed in the same manner as in Example 3— (4) using 296 fixed yeast culture plates. However, PGM-2 medium was used as the medium.
  • Example 8 The same method as in (5) was performed. However, PGM-2 medium was used as the medium.
  • the ratio of ZsGreen-expressing cells was measured in the same manner as in Example 1 (5) for the cells that had been subjected to gene transfer treatment by the methods (3), (4), and (5). The results are shown in Table 11.
  • Table 11 shows gene transfer efficiency (ratio of ZsGreen-expressing cells) (%) when gene transfer is performed using the ZsGreen expression retrovirus vector solution diluted 10-fold and 100-fold in PGM-2 medium, respectively. Is shown.
  • the gene-introduced cell can express a gene product useful for treatment or prevention of a disease in an individual organism, and the present invention provides a gene therapy method by transplanting the cell. .
  • SEQ ID NO: 4 Polypeptide having cell-binding domain and heparin—binding domains of
  • fibronectin SEQ ID NO: 6; Polypeptide having cell-binding domain and heparin—binding domains of

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Abstract

　レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質またはレトロウイルス結合部位を有する物質と標的細胞結合部位を有する他の物質との混合物の存在下に外来遺伝子を有するレトロウイルスベクターを脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞に感染させる工程を包含し、かつ前記の標的細胞結合部位がＶＬＡ－５に結合しうる領域および／またはＶＬＡ－４に結合しうる領域を含むことを特徴とする、脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法を提供する。

Description

明 細 書
脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法
技術分野
[0001] 本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学などの分野において有用な、脂肪細胞も しくは前駆脂肪細胞に高効率で遺伝子を導入する技術に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する遺伝病やがんなどの難病 について、正しい遺伝子情報の付カ卩によってその細胞の機能を修正したり、細胞が 本来持って ヽなカゝつた新 、「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療または予防 を行う行為である。
[0003] 遺伝子治療において治療用遺伝子として使用される遺伝子は、通常は前記遺伝 子が発現される必要のある組織、臓器に導入される。例えば、嚢胞性線維症患者の 呼吸器上皮細胞に CFTR遺伝子を導入する治療がこれに当たる。一方、遺伝子発 現がその組織、臓器を問わない場合もある。例えば血漿中の血液凝固因子である第 VII因子は肝臓で産生されることが知られているが、前期因子をコードする遺伝子を 骨格筋細胞に導入し、当該細胞で第 VII因子を産生させ、血漿中に供給しょうとする 試みも行われて!/ゝる（非特許文献 1)。
[0004] 後者のように、目的の遺伝子を発現させる細胞に特段の制約がない場合には、細 胞の取扱の容易さ等を考慮して被遺伝子導入細胞 (標的細胞)を選択することがで きる。例えば、脂肪細胞や前駆脂肪細胞は採取、培養、個体への移植が容易であり 、遺伝子導入用標的細胞として注目されて ヽる（特許文献 1)。
[0005] 一方、レトロウイルスベクターを標的細胞に高効率に感染させる方法として、レトロゥ ィルスに結合する機能性物質の存在下に標的細胞にレトロウイルスを感染させる方 法が開発されている (特許文献 2、 3、 4 ;非特許文献 2)。これらの方法では、標的細 胞に結合する物質もしくは標的細胞結合部位を有する物質が使用されるが、脂肪細 胞ゃ前駆脂肪細胞についてレトロウイルスの感染性を高めることができるような機能 性物質は知られていない。 [0006] 特許文献 1：国際公開第 03Z106663号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 95Z26200号パンフレット
特許文献 3 :国際公開第 97Z18318号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 00Z01836号パンフレット
非特許文献 1 :ブラッド（Blood)、第 101卷、第 2963〜2972頁（2003)
非特許文献 2：ネィチヤ一'メデイシン（Nature Medicine)、第 2卷、第 876〜882 頁（1996)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、脂肪細胞、前駆脂肪細胞に効率よく外来遺伝子を導入する方法 を開発し、疾患の治療や予防に有効な形質転換細胞の製造方法を提供することに ある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 VLA— 5および Zまたは VLA— 4への結合領域を有する機能性物 質を使用して脂肪細胞や前駆脂肪細胞とレトロウイルスベクターを共配置した場合に 、レトロウイルスが効率よく脂肪細胞、前駆脂肪細胞に感染することを見出し、本発明 を完成させた。
[0009] 本発明を概説すれば、本発明は脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞への遺伝子導入 方法であって、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する 物質またはレトロウイルス結合部位を有する物質と標的細胞結合部位を有する他の 物質との混合物の存在下に外来遺伝子を有するレトロウイルスベクターを脂肪細胞も しくは前駆脂肪細胞に感染させる工程を包含し、かつ前記の標的細胞結合部位が V LA— 5に結合しうる領域および Zまたは VLA— 4に結合しうる領域を含むことを特徴 とする。
[0010] 本発明に使用されるレトロウイルス結合部位としては、フイブロネクチンのへパリン IIドメイン、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合部位、ポリリジン 、DEAEデキストラン力 選択される物質に由来するレトロウイルス結合部位が例示さ れる。 [0011] 本発明には、フイブロネクチン由来の VLA— 5および Zまたは VLA— 4への結合 領域である標的細胞結合部位を使用することができる。前記の標的細胞結合部位を 有し、かつレトロウイルス結合部位を有する物質としては配列番号 1記載のアミノ酸配 列と、配列番号 2記載のアミノ酸配列および Zまたは配列番号 3記載のアミノ酸配列 とを有するポリペプチドが例示される。
[0012] 本発明に使用されるレトロウイルスベクターは、複製能欠損レトロウイルスベクターで あってもよい。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、有用な外来遺伝子を人為的に組み入れた脂肪細胞、前駆脂肪 細胞を効率よく製造することが可能となる。当該細胞は種々の疾患の治療に利用す ることができ、医療上、極めて有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明はレトロウイルスベクターと脂肪細胞または前駆脂肪細胞とを共配置させる ことにより、レトロウイルスベクターによる前記の細胞への遺伝子導入効率を向上させ る方法を提供する。
[0015] 本発明には、レトロウイルス結合部位と脂肪細胞、前駆脂肪細胞結合部位とを同一 分子中に有する物質、またはレトロウイルス結合部位を有する物質と脂肪細胞結合 部位を有する他の物質との混合物を使用することができる。
[0016] 前記の、レトロウイルス結合部位としては、レトロウイルスベクターに結合する活性を 有しているものであれば特に限定はないが、例えばフイブロネクチンのへパリン Πド メイン、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合部位、ポリリジン、 D EAEデキストラン等を使用することができる。特に好適には、配列番号 1 (H— 271) に示すアミノ酸配列からなる、フイブロネクチンのへパリン IIドメイン由来のレトロウイ ルス結合部位を有するポリペプチドを使用することができる。
[0017] また、脂肪細胞、前駆脂肪細胞との結合部位としては、 VLA— 5および Zまたは V LA— 4への結合領域を含む物質を使用することができる。前記領域の由来にも特に 限定はなぐ公知の VLA—5または VLA—4のリガンドゃ、 し八ー または し八ー を認識する抗体を使用することができる。好適にはフイブロネクチン由来の VLA - 5 または VLA— 4結合部位を使用することができ、それぞれ配列番号 2 (C— 274)記 載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号 3 (CS 1)記載のアミノ酸配列を含 むポリペプチドが例示される。
[0018] 本発明には、前記のレトロウイルス結合部位と脂肪細胞または前駆脂肪細胞結合 部位の両方を有する機能性物質を使用してもよく、レトロウイルス結合部位を含む機 能性物質と脂肪細胞または前駆脂肪細胞結合部位を有する他の機能性物質の混合 物を使用してもよい。特に好適な態様としては、フイブロネクチン由来の組み換えポリ ペプチド、例えば配列番号 1、 2、 3に示すアミノ酸配列のすべてを有している CH— 2 96 (配列番号 4)、配列番号 1、 3に示すアミノ酸配列を有している H— 296 (配列番 号 5)や配列番号 1、 2に示すアミノ酸配列を有している CH— 271 (配列番号 6)が使 用される。また、例えば配列番号 1に示されるアミノ酸配列のポリペプチドである H— 271と、配列番号 2に示されるアミノ酸配列のポリペプチドである C— 274との混合物 を使用してもよい。前期の CH— 296、 H— 296、 CH— 271、 H— 271、 C— 274は 、ジャーナル ·ォブ 'バイオケミストリー (J. Biochem. )、第 110卷、第 284〜291頁 (1991)の記載に基づいて作製することができる。さらに、 CH— 296はレトロネクチン (登録商標）の商品名で市販されて ヽる (タカラバイオ社製)。
[0019] 前記の機能性物質の使用方法にも特に限定はないが、例えば、細胞へのレトロウイ ルスベクター感染操作に使用される容器表面を当該機能性物質で被覆して使用す ることができる。前記の被覆操作には公知の方法を使用すればょ ヽ。
[0020] 本発明に使用されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。遺伝子導入を目 的とする場合には、通常、人為的に改変された組換えレトロウイルス、すなわちレトロ ウィルスベクターが本発明に使用される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止 する観点からは複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染 した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。こ れらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、 その染色体 DNA中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことが できる。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、 MFGベクターや α— SG Cベクター（国際公開第 92Ζ07943号パンフレット）、 pBabe [Nucleic Acids Res earch、第 18卷、第 3587〜3596頁（1990) ]、 pLXIN (クロンテック社製）、 pDON -AI (タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター [ヒト免 疫不全ウィルス (HIV)由来ベクター、サル免疫不全ウィルス（SIV)由来ベクター等] あるいはこれらを改変したベクターが例示される。
[0021] 前記のレトロウイルスベクターに保持させる外来遺伝子には特に限定はなぐ 目的 の細胞で発現させることが望まれる任意の遺伝子を挿入することができ、ポリべプチ ド (酵素、ホルモン、成長因子、サイト力イン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチ センス RNA、リボザィム、デコイ、 RNA干渉を起こす RNA等をコードする遺伝子が 例示される。遺伝子治療を目的として本発明が実施される場合には、疾患の治療ま たは予防に有用な物質をコードする遺伝子が標的細胞に導入される。脂肪細胞また は前駆脂肪細胞を標的細胞とする本発明においては、導入する遺伝子としては、細 胞により産生された後、細胞外に移行 (例えば血管内を循環)して作用を示すポリべ プチド、例えば分泌酵素、ホルモン、成長因子、サイト力イン等をコードするものが好 適である。
[0022] 本発明では、前記の外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスべ クタ一中に存在する LTRのプロモーターや外来プロモーターの制御下で、レトロウイ ルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成す るためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、ェ ンハンサー配列がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された 遺伝子はその下流にターミネータ一配列を含有することができる。さらに、遺伝子導 入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子 (例えば薬剤耐性遺伝子、 蛍光タンパク質をコードする遺伝子、 j8—ガラクトシダーゼゃルシフェラーゼのような レポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子、レセプタータンパクをコードする 遺伝子等）を有して 、てもよ 、。
[0023] 前記のレトロウイルスベクターは公知の方法で調製し、本発明に使用すればよ!、。
調製方法には特に限定はなぐ使用されるレトロウイルスベクターに適したレトロウイ ルス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して本発明に使用することができる。前 記のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レ トロウィルスベクタープラスミドのトランスフエクシヨンにより一過性にレトロウイルス粒子 を生産するものの 、ずれでも構わな 、。
[0024] 上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えば P G13 (ATCC CRL— 10686)、 PA317 (ATCC CRL— 9078)、 GP+E— 86や GP + envAm— 12 (米国特許第 5, 278, 056号）、 Psi— Crip [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA、第 85卷、第 6460〜6464頁（1988) ]等を使用してもよい。また 、トランスフエクシヨン効率の高い 293細胞や 293TZ17細胞、 G3T— hi細胞を用い てレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
[0025] 本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウィル ス由来のエンベロープを有する、シユードタイプ（pseudotyped)パッケージングによ つて作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニ一マウス白血病 ウィルス (MoMLV)、テナガザル白血病ウィルス (GaLV)、水泡性口内炎ウィルス ( VSV)、ネコ内在性ウィルス (feline endogenous virus)由来のエンベロープゃェ ンべロープとして機能しうるタンパク質を有するシユードタイプレトロウイルスを使用す ることができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウィル ス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレト ロウィルスベクターも本発明に使用できる。
[0026] 本発明において、標的細胞には成熟脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等） のみならず、脂肪細胞に分化しうる前駆脂肪細胞に該当する細胞を使用することが できる。前駆脂肪細胞には、直接脂肪細胞に分化しうる細胞の他、脂肪細胞を含む 多種の細胞への分化能を維持している間葉系幹細胞や間質系細胞が包含される。 前記の各細胞は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の脂肪組織等より採取した初代培養の 細胞であってもよぐ株化された培養細胞株であってもよい。脂肪組織の採取源とし ては皮下脂肪や内臓脂肪が例示されるが、これらに限定されるものではない。脂肪 組織は採取されることにより個体に与える機能障害のおそれが小さいことから、標的 細胞の採取源として好適である。また、間葉系幹細胞や間質系細胞は骨髄やその他 の組織より採取することができる。
[0027] 上記の機能性物質の存在下、脂肪細胞や前駆脂肪細胞にレトロウイルスベクター を感染させることにより、遺伝子が導入された脂肪細胞、前駆脂肪細胞を効率よく得 ることができる。また、前駆脂肪細胞に前記方法で遺伝子導入を行った場合、得られ た遺伝子導入細胞を公知方法により脂肪細胞に分化させ、遺伝子導入された脂肪 細胞を取得することもできる。さらに、遺伝子導入された前駆脂肪細胞を生体内に移 植して脂肪細胞への分ィ匕を図ってもょ 、。
[0028] 特に本発明を限定するものではないが、例えば前記の機能性物質でその表面を被 覆された容器中でレトロウイルスベクターの細胞への感染を行 ヽ、本発明を実施する ことができる。前記の容器は細胞の維持、培養に使用可能なものであれば特に限定 はなぐシャーレ、細胞培養用プレート、フラスコ、細胞培養用バッグ等が使用できる 。容器表面への機能性物質の固定化は、使用する機能性物質に適した公知の手法 によって実施すればよぐ例えばレトロネクチンは滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理 食塩水等に溶解した状態で固定ィ匕に使用することができる。
[0029] レトロウイルスベクターの感染の方法は、特に本発明を限定するものではないが、 例えば下記の 2つの方法が例示される。
( 1)機能性物質で被覆された容器中に脂肪細胞または前駆脂肪細胞とレトロウィル スベクター（例えばレトロウイルス産生細胞の上清）を添加し、インキュベートする。
(2)機能性物質で被覆された容器中にレトロウイルスベクターを添加してインキュべ ートし、この容器を洗浄してレトロウイルス産生細胞由来の不純物等を除いた後、脂 肪細胞または前駆脂肪細胞を添加してインキュベートする。
[0030] 後者はレトロウイルス産生細胞に存在する可能性のある感染阻害物質を除去できる ことが特徴であるが、必ずしもこの方法で実施する必要はない。感染方法は使用する ベクターや細胞に応じて上記の方法、あるいはそれ以外の方法のうちから適切なも のを選択すればよい。
[0031] レトロウイルスベクターとともに培養中の細胞は、必要に応じて培地の交換や新たな ベクターの添加を行いながら培養する。培養終了後、容器中の細胞を回収し、必要 に応じて洗浄し、種々の目的に使用することができる。また、遺伝子導入された細胞 が前駆脂肪細胞である場合には、細胞をそのまま維持するのみならず、成熟細胞へ の分ィ匕を誘導してもよい。例えば、間葉系幹細胞は適切な成長因子、分化誘導物質 を添加して培養することにより、成熟脂肪細胞に分化させることができる。
[0032] 標的細胞の培養、ならびにレトロウイルスベクターの感染には、適切な細胞培養用 の培地を選択し、使用することができる。例えば市販の培地や、これを改変したもの を使用すればよい。さらに、前記の培地は成長因子、細胞増殖因子等の成分を含ん でいてもよい。
[0033] 本発明では、任意に、レトロウイルスベクターの感染に供された細胞力 遺伝子導 入された細胞のみを選択してもよい。この操作は導入された外来遺伝子、例えば、前 期のマーカー遺伝子の発現を指標とし、その遺伝子の特徴に応じた公知の方法によ り実施することができる。
[0034] こうして得られた、遺伝子導入された細胞は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物に移植して 導入された遺伝子を発現させ、所望の作用、例えば疾患に対する治療効果や予防 効果を発揮させることができる。通常、遺伝子導入された脂肪細胞や前駆脂肪細胞 は、皮下組織や脂肪組織などに移植されるが、特に限定されるものではない。移植 は、細胞懸濁液を目的の部位に注射する方法や、外科的に切開した目的部位に細 胞を移植する方法により実施することができる。
[0035] 上記の態様では、標的細胞となる脂肪細胞または前駆脂肪細胞のドナーは、好適 にはレシピエント自身である。しかし、組織適合性抗原の一致度が高い場合には、非 自己由来の遺伝子導入細胞を移植することも可能である。
実施例
[0036] 以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲 に何ら限定されるものではな 、。
[0037] 調製例 1 GFP発現レトロウイルスベクターの調製
pDON— AIプラスミド（タカラバイオ社製、 3650)のマルチクローユングサイトにプ ラスミド PQBI25 (Quantum Biotechnologies Inc.社製）に挿入されている Red -shift Green Fluorescent Protein (以下 GFPと略称する）をコードする遺伝 子を挿入し、プラスミド pDON—GFPを作製した。 GFP発現レトロウイルスベクターの 調製は Retrovirus Packaging Kit Ampho (タカラノィォ社製、 6161)により、 2 93TZ17細胞（ATCC CRL— 11268)と前記の pDON— GFPを用いて、キット付 属のプロトコルに従って行った。なお、 GFP発現レトロウイルスベクター（培養上清） はトランスフエクシヨン後 48時間で回収したもの（実施例 1で使用）および 72時間で回 収したもの（実施例 2で使用）の 2種を調製して以下の実験に使用した。回収した GF P発現レトロウイルスベクターは― 80°Cで保存し、使用前に 37°C水浴中で急速溶解 して使用した。なお、実施例 1の試験には Preadipocyte Growth Medium (以下 PGM培地、 Cambrex社製 B8000より調製）〖こより 10倍、 40倍、 160倍希釈した上 清を、また実施例 2の試験には 10%ゥシ胎児血清 (FBS： Cambrex社製)含有ダル べッコ改良イーグル培地（シグマ社製、 D6046) (以下 DMEM培地）〖こより 4倍、 16 倍、 64倍に希釈した上清をそれぞれ使用した。
[0038] 実施例 1 ヒト前駆脂肪細胞へのレトロネクチンを用いた遺伝子導入
(1)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
ノントリートメント 24穴培養プレート（ベタトン'ディッキンソン社製、 351147)の各ゥ エルに 20 gZmLとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS)に溶解したレトロネク チン (登録商標、タカラノィォ社製、 T100A)溶液を 500 /z Lずつ添加し、 4°Cで一 晚固定ィ匕を行った。その後、各ゥエルより溶液を除去し、 2%牛血清アルブミンを含 有する PBSを 500 Lずつ添加してさらに室温で 30分以上放置した。こうして作製さ れたレトロネクチン固定ィ匕培養プレートは PBSで 1回洗浄した後に各実験に供した。
[0039] (2)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
調製例 1により調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液を（1)で調製したレ トロネクチン固定化培養プレートの各ゥエルに 500 μ Lずつ添カ卩して、 COインキュ
2 ベータ一中、 32°Cで 6時間インキュベートした。その後、各ゥエルより上清を除去して PBSで 1回洗浄後、 4 X 104cellsZmLとなるように PGM培地に懸濁したヒト前駆脂 肪細胞（Cambrex社製、 PT5020)を 500 Lずつ各ゥエルに播種し、 COインキュ
2 ベータ一中、 37°Cで 4日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に 供した。なお、実験は全て 2連で行った。
[0040] (3)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
4 X 104cellsZmLとなるように PGM培地で懸濁したヒト前駆脂肪細胞を 500 μ L ずつチューブにとり、 1, 500 X g、 5分間室温で遠心して上清を除去した。チューブ に、調製例 1で調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液を 500 Lずつ添カロ し、沈殿 (細胞)を懸濁した。この懸濁液を（1)で調製したレトロネクチン固定ィ匕培養 プレートの各ゥエルに添カ卩し、 COインキュベータ一中、 37°Cで 4日間培養した。培
2
養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て 2連で行った
[0041] (4)ポリプレン SN法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリプレン SN法により遺伝子導入を行った。 4 X 104cellsZmLとなるように PGM培地に懸濁したヒト前駆脂肪細胞を 500 μ Lず つ 24穴培養プレート（ベタトン'ディッキンソン社製、 353047)に播種し、 COインキ
2 ュベータ一中、 37°cで一晩培養した。その後、培養上清を除去し、調製例 1で調製し た GFP発現レトロウイルスベクター希釈液に終濃度 8 μ gZmLとなるようにポリプレン (へキサジメトリン.ブロミド；アルドリッチ社製、 10768— 9)水溶液を添カ卩したものを 5 00 Lずつ各ゥエルに添加し、 COインキュベータ一中、 37°Cでー晚培養した。培
2
養上清を除去して新しい PGM培地を各ゥエルに 500 μ Lずつ添カ卩しさらに 3日間培 養した後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て 2連で行った。
[0042] (5)遺伝子導入効率の測定
(2)、（3)、（4)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、 GFP発現 細胞の比率をフローサイトメトリー（CytomicsFC500、ベックマン'コールター社製） により測定し、遺伝子導入効率を評価した。すなわち、培養後の各細胞をトリプシン' EDTA溶液（ギブコ BRL社製、 25200-056)により培養プレートよりはがした後、 P GM培地に懸濁し、フローサイトメトリー解析に供した。その結果を表 1に示す。表 1は それぞれ 10倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクターを 用いて各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発現細胞比率） ( %)を示したものである。
[0043] [表 1]
表 1
10倍希釈 40倍希釈 160倍希釈
レ 卜ロネクチン bi nding法 73. 15 63. 96 34. 26
レ トロネクチン SN法 82. 09 70. 98 43. 31
ポリプレン SN法 55. 51 45. 63 22. 33 [0044] 表 1に示すように、レトロネクチン binding法、レトロネクチン SN法の!/、ずれにお ヽ ても、対照として行ったポリプレン SN法より高い遺伝子導入効率を示し、脂肪細胞へ の遺伝子導入におけるレトロネクチンの有用性が示された。
[0045] 実施例 2 マウス前駆脂肪細胞へのレトロネクチンを用いた遺伝子導入
(1)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 1— (1)と同様の方法で行った。
[0046] (2)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
調製例 1により調製した各希釈 GFP発現レトロウイルスベクターを（1)で調製したレ トロネクチン固定化培養プレートの各ゥエルに 500 μ Lずつ添カ卩し COインキュベー
2
ター中、 32°Cで 6時間インキュベートした。その後、各ゥエルより上清を除去し PBSで 1回洗浄後、各ゥエルに 4 X 104cellsZmLとなるように DMEM培地で懸濁したマウ ス前駆脂肪細胞株 3T3—L1 (ATCC CCL- 92. 1)を 500 Lずつ播種し、 CO
2 インキュベータ一中、 37°Cで 1日間培養した。培養上清を除去し新しい DMEM培地 を各ゥエルに 500 μ Lずつ添カ卩し、さらに COインキュベータ一中、 37°Cで 3日間培
2
養後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て 2連で行った。
[0047] (3)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
4 X 104cellsZmLとなるように PGM培地に懸濁した 3T3—L1細胞を 500 μ Lず つチューブにとり、 1, 500 X g、 5分間室温で遠心して上清を除去した。チューブに、 調製例 1で調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液を 500 μ Lずつ添加し、 沈殿 (細胞）を懸濁した。この懸濁液を（1)で調製したレトロネクチン固定ィ匕培養プレ ートの各ゥエルに添カ卩し、 COインキュベータ一中、 37°Cで 1日間培養した。培養上
2
清を除去して新しい DMEM培地を各ゥエルに 500 Lずつ添カ卩し、さらに COイン
2 キュベータ一中、 37°Cで 3日間培養後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。な お、実験は全て 2連で行った。
[0048] (4)ポリプレン SN法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリプレン SN法により遺伝子導入を行った。 細胞として 3T3— L1細胞、培地として DMEM培地を使用した他は、実施例 1一（4) と同様の方法で行った。 [0049] (5)遺伝子導入効率の測定
(2)、（3)、（4)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、 GFP発現 細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定し、遺伝子導入効率を評価した。すなわ ち、培養後の各細胞をトリプシン 'EDTA溶液により培養プレートよりはがした後、 D MEM培地に懸濁し、フローサイトメトリー解析に供した。その結果を表 2に示す。表 2 はそれぞれ 4倍希釈、 16倍希釈、 64倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクターを 用いて各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発現比率） (%)を 示したものである。
[0050] [表 2]
表 2
4倍希釈 16倍希釈 64倍希釈
レ トロネクチン bi nding法 71. 68 49. 79 17. 33
レ トロネクチン SN法 54. 07 45. 74 21. 86
ポリプレン SN法 16. 60 23. 05 12. 51
[0051] 表 2に示すように、レトロネクチン binding法、レトロネクチン SN法の!/、ずれにお ヽ ても、対照として行ったポリプレン SN法より高い遺伝子導入効率を示し、レトロネクチ ンの有用'性が示された。
[0052] 調製例 2 産生細胞が異なる GFP発現レトロウイルスベクターの調製
調製例 1と同様の方法で GFP発現レトロウイルスベクターを調製した。産生細胞とし て、 293TZ17細胞にカ卩えて、 G3T— hi細胞（タカラノィォ社製、 6163)も使用した 。それぞれの GFP発現レトロウイルスベクター（培養上清）は、トランスフエクシヨン後 4 8時間で回収したものと 72時間で回収したものの 2種類を調製し、回収後はそれぞれ 80°Cで凍結保存した。
[0053] 実施例 3 遺伝子導入細胞の分化誘導
(1)細胞の前培養
皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞 (Cambrex社製、 PT5020)は、購入後解凍し て、 PGM培地と 225cm2フラスコ（CORNING社製、 431082)を用いて、約 48時間 の培養を行い、細胞数を増加させてから、 90%FBSZlO%DMSO (SIGMA社製） カゝらなる保存液に懸濁し、再び液体窒素中にて保存した。 [0054] 遺伝子導入時には、これら保存ヒト前駆脂肪細胞を 37°C水浴中にて急速溶解し、 PGM培地で洗浄後、 175cm2フラスコ（ベタトン'ディッキンソン社製、 353028)に約 4000cells/0. 2mLZcm2の条件で播種し、約 48時間の培養を行った。培養した 細胞はトリプシン 'EDTA溶液を用いて回収し、一部は後述の（6)のポリブレン法の 実験に使用し、残りは再び 175cm2フラスコに播種して、更に約 24時間の培養を行 つた後、後述の (4) (5)のレトロネクチン法の実験に供した。
[0055] (2)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 1— (1)と同様の方法で行った。ただしプレートにはノントリートメント 48穴培 養プレート（ベタトン'ディッキンソン社製、 351178)を使用し、ゥエルに添加するレト ロネクチン溶液の液量は 200 μ Lとした。
[0056] (3)ウィルスベクター溶液の調製
調製例 2で調製した GFP発現レトロウイルスベクター（産生細胞 293TZ17細胞、ト ランスフエクシヨン後 48時間後に回収）を 37°C水浴中で急速溶解し、 PGM培地によ り 10倍希釈、 40倍希釈して実験に供した。
[0057] (4)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
(3)で調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液を、 (2)で調製したレトロネク チン固定化培養プレートの各ゥエルに 200 Lずつ添カ卩し、 COインキュベータ一中
2
、 32°Cで 5時間インキュベートした。その後、各ゥエルより上清を除去してリン酸緩衝 水溶液で 1回洗浄後、（1)で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を 4 X 104 CellsZmL となるように PGM培地に懸濁し、 200 Lずつ各ゥエルに播種、 COインキュベータ
2
一中、 37°Cで 4日間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した 。なお、実験は全て 2連で行った。
[0058] (5)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
(1)で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を 4 X 104cellS/mLとなるように PGM培 地に懸濁し、 200 Lずつチューブ〖ことり、約 1800 X g、 5分間、室温で遠心して上 清を除去した。チューブに (3)で調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液を 2 00 Lずつ添加し、沈殿 (細胞）を懸濁した。この懸濁液を (2)で調製したレトロネク チン固定化培養プレートの各ゥエルに添カ卩し、 COインキュベータ一中、 37°Cで 4日 間培養した。培養終了後、細胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全 て 2連で行った。
[0059] (6)ポリプレン SN法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンを用いないポリプレン SN法により遺伝子導入を行った。（ 1)で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を 4 X 104cellS/mLとなるように PGM培地に 懸濁し、 200 Lずつ 48穴細胞培養用プレート（ベタトン'ディッキンソン社製、 3530 78)に播種し、 COインキュベータ一中、 37°Cで一晩培養した。その後、培養上清を
2
除去し、 (3)で調製した GFP発現レトロウイルスベクター希釈液に終濃度 8 μ g/mL となるようにポリプレン水溶液を添カロしたものを 200 Lずつ各ゥエルに添カロし、 CO ト 2 インキュベータ一中、 37°Cで 24時間培養した。培養上清を除去して、新たに PGM 培地を各ゥエルに 200 Lずつ添加し、さらに 3日間培養した後、細胞をフローサイト メトリー解析に供した。なお、実験は全て 2連で行った。
[0060] (7)遺伝子導入効率の測定
(4)、（5)、（6)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例 1 (5)と同様の方法で、 GFP発現細胞の比率を測定した。その結果を表 3に示す。表 3 はそれぞれ 10倍希釈、 40倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクターを用いて、各 方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発現細胞比率） (%)を示し たものである。
[0061] [表 3]
10倍希釈 40倍希釈
レ卜ロネクチン bi nding法 40. 55
レトロネクチン SN法 42, 66
ポリプレン SN法 38, 82 38. 23
[0062] 表 3に示すように、レトロネクチン binding法、レトロネクチン SN法のいずれにおい ても、対照として行ったポリプレン SN法より高い遺伝子導入効率を示し、脂肪細胞へ の遺伝子導入におけるレトロネクチンの有用性が示された。
[0063] (8)遺伝子導入細胞の分化誘導と分化した脂肪細胞の遺伝子導入効率の測定
遺伝子導入を行ったヒト前駆脂肪細胞が、脂肪細胞への分化能を保持して 1ヽるか を評価するため、導入細胞の分化誘導を行った。（4)、（5)、（6)の各方法により遺伝 子導入処理を行った細胞について、培養上清を除去した後、 Adipocyte Differen tiation Medium (以下 ADM培地と略称する、 Preadipocyte Growth Mediu m BulletKitゝ Cambrex社製、 PT8000より調製）を各ゥエルに 250 μ Lずつ添カロし 、さらに各ゥエルに等量の 250 Lの PGM培地を添カ卩して混和、 7日間の培養を行う ことで分ィ匕誘導を行った。分化誘導後の脂肪細胞は、（7)と同様にフローサイトメトリ 一解析に供した。その結果を表 4に示す。表 4はそれぞれ 10倍希釈、 40倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行った後、分ィ匕誘 導によって脂肪細胞へと分化した細胞の GFP発現細胞比率（％)を示したものである
[0064] [表 4]
10倍希釈 40倍希釈
レトロネクチン bi nding法 47. 60 40. 09
レ トロネクチン SN法 45. 44 37. 96
ポリプレン SN法 35. 92 34. 65
[0065] 表 4に示すように、 ヽずれの方法で遺伝子導入された細胞にお!、ても、 GFP発現 細胞の比率は表 3の遺伝子導入効率の値と比較してほぼ変化は見られな 、。すなわ ち、前駆脂肪細胞に導入された遺伝子は脂肪細胞へ分化した後も安定に保持され ていることが確認された。
[0066] (9)トリダリセライド蓄積量測定による脂肪細胞への分化能の評価
分ィ匕誘導後の遺伝子導入細胞のトリグリセライド蓄積量を測定することで、その分 化能を評価した。（4)、 （5)、 （6)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞、およ び対照としてウィルスを含まな ヽ培地で遺伝子導入操作を実施した細胞にっ ヽて、 ( 8)と同様の方法で分化誘導を行った後、培養上清を除去、リン酸緩衝水溶液で 2回 洗浄し、イソプロパノールとへキサンを 2： 3の割合で混合した溶液を各ゥエルに 250 Lずつ添加した。室温で 30分間放置した後に上清を回収し、再び同様にイソプロ ノノールとへキサンの混合液を添加、放置、回収の操作を繰り返した。回収した混合 液力も濃縮乾固によって溶媒を除き、得たトリグリセライドをジメチルホルムアミド (和 光純薬工業社製、 047- 25475)に再度溶解した。こうして得られた試料は、トリダリ セライド Έ—テストヮコー（和光純薬工業社製、 432— 40201)と反応させた後、吸光 プレートリーダー（MicroReader4 Hyperion社製）で 570nmの吸光度を測定し、 試料中のトリダリセライド含有量を算出した。
[0067] トリグリセライド回収後の細胞から、 1規定水酸ィ匕ナトリウムけ力ライテスタ社製、 31 511— 05より調製)溶液を各ゥエルに 250 Lずつ添カ卩し、 30分間、室温に放置す ることでタンパク質を回収した。回収したタンパク質は、 Micro BCA Protein Ass ay Reagent Kit (PIERCE社製、 23235)を用いて濃度を算出した。各試料のトリ グリセライド蓄積量は、タンパク質量で割ることで補正し、単位タンパク質量あたりのト リグリセライド量を求めた。これらの結果を表 5に示す。表 5は、ウィルスを含まない PG M培地 (mock) 10倍希釈、 40倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクター溶液を 用いて各方法で遺伝子導入を行った細胞にっ ヽて、分化誘導後の各ゥエルのトリグ リセライド蓄積量 (TGと表記、単位は/ z g)、タンパク質量 (proteinと表記、単位は g)、および単位タンパク質量あたりのトリグリセライド量 (TGZproteinと表記、単位は μ §)を示したものである。
[0068] [表 5]
導入方法 mock 10倍希釈 40倍希釈
TG 30. 50
レトロネクチン
prote in 66, 08
b inding法
TG/ protein 0, 46
TG 27. 67 27. 82
レトロネクチン SN法
prote in 67. 26 65. 97
TG/ protein 0. 41 0. 39 0. 42
TG 31. 46 31. 61
ポリプレン SN法 prote in 68. 60 69. 29 84. 23
TG/protein 0. 45 0. 46 0. 38
[0069] 表 5に示すように、全ての方法において分化誘導後の遺伝子導入細胞のトリグリセ ライドの蓄積が示された。この際、 mock細胞とレトロネクチンを用いて遺伝子導入さ れた細胞とを比較しても大きな差は見られな力つた。また、遺伝子導入していないヒト 前駆脂肪細胞に同様の分化誘導を行って得られた細胞でも同程度の TGZprotein 値が得られた。このように、遺伝子導入により前駆脂肪細胞の分化能の低下は起こら ないことが示された。
[0070] 実施例 4 異なる産生細胞から調製したウィルスベクターを用いた遺伝子導入 (1)細胞の前培養
実施例 3— (1)と同様の方法で行った。
[0071] (2)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 3— (2)と同様の方法で行った。
[0072] (3)ウィルスベクター溶液の調製
調製例 2で調製した GFP発現レトロウイルスベクターを 37°C水浴中で急速溶解し、 PGM培地により 10倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈して実験に供した。 GFP発現レ トロウィルスベクターとして、トランスフエクシヨンした 293TZ17細胞、 G3T— hi細胞 をそれぞれ 72時間培養した後に回収した培養上清を実験に供した。
[0073] (4)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
実施例 3— (4)と同様の方法で行った。
[0074] (5)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (5)と同様の方法で行った。
[0075] (6)遺伝子導入効率の測定
実施例 3— (7)と同様の方法で行った。その結果を表 6に示す。表 6は、それぞれ 1 0倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈した各種 GFP発現レトロウイルスベクターを用いて 、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発現細胞比率）（％)を 示したものである。
[0076] [表 6]
導入方法 産生細胞 10倍希釈 40倍希釈 160倍希釈 レ トロネクチン 293T/17 44. 01 34. 16 13. 02 b indi ng法 G3T- hi 51. 13 45. 96 28. 78 レ トロネクチン SN法 293T/17 36. 99 26. 01 11. 81
G3T- hi 55. 28 52. 95 34. 45
[0077] 表 6に示すように、 G3T— hi細胞を用いて調製したウィルスベクターによっても、レト ロネクチン法による遺伝子導入が可能であることが示された。
[0078] 実施例 5 ヒト血清含有 PGM培地を用いた遺伝子導入
(1)細胞の前培養
実施例 3— (1)と同様の方法で行った。ただし前培養は 75cm2フラスコ（ベタトン'デ イツキンソン社製、 353110) ^j¾U ¾9000cells/0. 2mLZcm2の条件で播種 して培養を行った。
[0079] (2)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 3— (2)と同様の方法で行った。
[0080] (3)ウィルスベクター溶液の調製
調製例 2で調製した GFP発現レトロウイルスベクター（産生細胞 293TZ17細胞、ト ランスフエクシヨン後 72時間後に回収）を 37°C水浴中で急速溶解し、 10%FBSの代 わりに 10%humanAB血清（Cambrex社製）を含む PGM培地（以下 10HPGM培 地と記載する）により 10倍、 40倍、 160倍希釈し、実験に供した。
[0081] (4)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
実施例 3— (4)と同様の方法で行った。ただし、培地には 10HPGM培地を使用し た。
[0082] (5)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (5)と同様の方法で行った。ただし、培地には 10HPGM培地を使用し た。
[0083] (6)ポリプレン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (6)と同様の方法で行った。ただし、培地には 10HPGM培地を使用し た。
[0084] (7)遺伝子導入効率の測定
実施例 3— (7)と同様の方法で行った。その結果を表 7に示す。表 7はそれぞれ 10 HPGM培地を用いて 10倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈した GFP発現レトロウィル スベクターを用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発 現細胞比率）（％)を示したものである。
[0085] [表 7]
10倍希釈 40倍希釈 160倍希釈 レ トロネクチン bi nding法 23. 30 21. 58 12. 99
レトロネクチン SN法 34. 45 25. 88 18. 38
ポリプレン SN法 1 1. 45 9. 08 3. 27
[0086] 表 7に示すように、ヒト血清含有培地を用いた遺伝子導入も可能であることが示され た。ヒト血清含有培地を用いた遺伝子導入においても、レトロネクチン法の方がポリブ レン法よりも導入効率が高ぐレトロネクチンの有用性が示された。
[0087] 実施例 6 前培養条件が異なるヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入
(1)細胞の前培養
実施例 3— (1)と同様の方法で行った。ただし前培養の際、細胞を 12. 5cm2フラス コ（ベク卜ン 'ディッキンソン社製、 353107)に約 13000cellsZ〇. 2mL/cm2, 25c m2フラスコ（ベタトン'ディッキンソン社製、 353108)に約 6600cellsZ0. 2mL/cm 2、 75cm2フラスコに約 2200cellsZ0. 2mLZcm2の 3種の条件で播種した。更に、 3種それぞれの条件について、約 72時間培養を行った細胞と、約 48時間の培養後 に一度細胞をはがして回収し、その一部を同じ面積のフラスコに再度ほぼ同じ細胞 密度で播種して約 24時間培養した細胞、の 2種を調製し、遺伝子導入に使用した。
[0088] (2)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 3— (2)と同様の方法で行った。
[0089] (3)ウィルスベクター溶液の調製
調製例 2で調製した GFP発現レトロウイルスベクター（産生細胞 G3T— hi細胞、トラ ンスフエクシヨン後 72時間後に回収）を 37°C水浴中で急速溶解し、 PGM培地により 10倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈して実験に供した。
[0090] (4)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (5)と同様の方法で行った。
[0091] (5)遺伝子導入効率の測定
実施例 3— (7)と同様の方法で行った。その結果を表 8に示す。表 8は前培養の条 件が異なる細胞について、 10倍希釈、 40倍希釈、 160倍希釈した GFP発現レトロゥ ィルスベクターを用いて、レトロネクチン SN法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導 入効率 (GFP発現細胞比率） (%)を示したものである。
[0092] [表 8] 前培養条件 細胞密度 10倍希积 40倍希釈 160倍希釈
72時間培養 13000c el ls/mL 13. 05 10. 03 4. 70
6600c el ls/mL 13. 83 8. 66 5. 32
2200c el ls/mL 29. 70 28. 72 16. 02
48時間後継代 13000c el ls/mL 27. 88 20. 16 10. 54
6600c el ls/mL 38. 83 34. 28 19. 06
2200c el ls/mL 45. 81 42. 26 24. 57
[0093] 表 8に示すように、前培養の条件によって導入効率に変化が生じることが示された。
細胞の培養や継代の条件を至適化することで、レトロネクチン法における導入効率を 更に上昇させることが可能であると示された。
[0094] 実施例 7 内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入
(1)細胞の前培養
内蔵脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞 (Cambrex社製、 PT5005)は、購入後解凍し て、 PGM培地と 225cm2フラスコを用いて、約 48時間の培養を行い、細胞数を増加 させてから、 90%FBS (Cambrex社製） ZlO%DMSO (SIGMA社製）力らなる保 存液に懸濁し、再び液体窒素中にて保存した。
[0095] 遺伝子導入時には、これら保存前駆脂肪細胞を 37°C水浴中にて急速溶解し、 PG M培地で洗浄後、 75cm2フラスコに約 3700cellsZO. 2mLZcm2の条件で播種し、 約 48時間の培養を行った。培養した細胞はトリプシン 'EDTA溶液を用いて回収し、 一部は後述の（6)のポリブレン法の実験に使用し、残りは再び 75cm2フラスコに播種 して、更に約 24時間の培養を行った後、後述の (4) (5)のレトロネクチン法の実験に 供した。
[0096] (2)レトロネクチンの培養プレートへの固定化
実施例 3— (2)と同様の方法で行った。
[0097] (3)ウィルスベクター溶液の調製
調製例 2で調製した GFP発現レトロウイルスベクター（産生細胞 293TZ17細胞、ト ランスフエクシヨン後 48時間に回収）を 37°C水浴中で急速溶解し、 PGM培地により 1 0倍、 40倍に希釈して実験に供した。
[0098] (4)レトロネクチン binding法による遺伝子導入
実施例 3— (4)と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（1)の内臓脂肪由来のヒ ト前駆脂肪細胞を使用した。
[0099] (5)レトロネクチン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (5)と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（1)の内臓脂肪由来のヒ ト前駆脂肪細胞を使用した。
[0100] (6)ポリプレン SN法による遺伝子導入
実施例 3— (6)と同様の方法で行った。ただし細胞は上記（1)の内臓脂肪のヒト前 駆脂肪細胞を使用した。
[0101] (7)遺伝子導入効率の測定
実施例 3— (7)と同様の方法で行った。その結果を表 9に示す。表はそれぞれ 10倍 希釈、 40倍希釈した GFP発現レトロウイルスベクターを用いて、各方法で遺伝子導 入を行ったときの遺伝子導入効率 (GFP発現細胞比率） (%)を示したものである。
[0102] [表 9]
10倍希釈 40倍希釈
レ トロネク ΐ f~ン bi nding法 61. 19 53. 27
レ トロネク ΐ r-ン SN法 65. 47 59. 57
ポリプレン S N法 28. 66 25. 98
[0103] 表 9に示すように、内臓脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を対象とした時も、皮下脂肪 由来の細胞の時と同様の遺伝子導入が可能であることが示された。加えてレトロネク チン binding法、レトロネクチン SN法のいずれにおいても、対照として行ったポリブレ ン SN法より高 、遺伝子導入効率を示し、レトロネクチンの有用性が示された。
[0104] 調製例 3 ZsGreen発現レトロウイルスベクターの調製
pDON—AIプラスミドのマルチクロー-ングサイトに、プラスミド pZsGreenl—Nl ( Clontech Laboratories社製、 632448)に挿入されている蛍光タンパク質 ZsGree nをコードする遺伝子を挿入し、プラスミド pDON— ZsGreenを作製した。 ZsGreen 発現レトロウイルスベクターの調製は、前記の pDON— ZsGreenを用いて、調製例 1 と同様の方法で行った。回収した ZsGreen発現レトロウイルスベクターは— 80°Cで 保存し、使用前に 37°C水浴中で急速溶解し、 PGM培地によって 10倍希釈、 100倍 希釈して実験に供した。
[0105] 実施例 8 CH— 271による遺伝子導入 (1)細胞の前培養
実施例 3— (1)と同様の方法で皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を前培養し、以 下の実験に使用した。
[0106] (2) CH— 271の培養プレートへの固定化
実施例 3— (2)と同様の方法で行った。ただしレトロネクチンではなぐ CH— 271を 固定ィ匕した。その際、固定ィ匕に使用する溶液中の CH— 271の濃度は 77 gZmlと した。
[0107] (3) CH— 271 binding法による遺伝子導入
調製例 3で調製した ZsGreen発現レトロウイルスベクター溶液と、 (2)で調製した C H— 271固定ィ匕培養プレートを用いて、実施例 3— (4)と同様の方法で行った。
[0108] (4) CH- 271 SN法による遺伝子導入
調製例 3で調製した ZsGreen発現レトロウイルスベクター溶液と、 (2)で調製した C H— 271固定ィ匕培養プレートを用いて、実施例 3— (5)と同様の方法で行った。
[0109] (5)プロタミン SN法による遺伝子導入
対照として、レトロネクチンや CH— 271等のポリペプチドを用いない、プロタミン SN 法により遺伝子導入を行った。（1)で前培養を行ったヒト前駆脂肪細胞を 4 X 104cell sZmLとなるように PGM培地に懸濁し、 200 μ Lずつ 48穴細胞培養用プレートに播 種し、 COインキュベータ一中、 37°Cで一晩培養した。その後、培養上清を除去し、
2
調製例 3で調製した ZsGreen発現レトロウイルスベクター溶液に、終濃度 4 g/mL となるようにノボ硫酸プロタミン (持田製薬社製)を添加してから、 200 Lずつ各ゥェ ルに添カ卩し、 COインキュベータ一中、 37°Cで 24時間培養した。培養上清を除去し
2
て、新たに PGM培地を各ゥエルに 200 μ Lずつ添カ卩し、さらに 3日間培養した後、細 胞をフローサイトメトリー解析に供した。なお、実験は全て 2連で行った。
[0110] (6)遺伝子導入効率の測定
(3)、（4)、（5)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例 1 (5)と同様の方法で、 ZsGreen発現細胞の比率を測定した。その結果を表 10に示 す。表 10はそれぞれ PGM培地で 10倍希釈、 100倍希釈した ZsGreen発現レトロゥ ィルスベクター溶液を用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入効率 (ZsGreen発現細胞比率） (%)を示したものである。
[表 10]
10倍希釈 100倍希釈
CH-271 bi ndi ng法 62. 47 34. 37
CH-271 SN法 60. 24 43. 54
プロタミン SN法 31. 52 16. 80
[0112] 表 10に示すように、フイブロネクチン由来のレトロウイルス結合部位と VLA— 5に結 合しうる領域で構成されて ヽる CH— 271を用 、た場合でも、レトロネクチンと同様に 、ヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。また、 CH- 271 binding法、 CH— 271 SN法のいずれにおいても、対照として行ったプロタミ ン法よりも高 、遺伝子導入効率が得られており、 CH— 271を用いた標的細胞とレト ロウィルスベクターを共配置する導入法の有効性が示された。
[0113] 実施例 9 H— 296による遺伝子導入
(1)細胞の前培養
実施例 3— (1)と同様の方法で皮下脂肪由来のヒト前駆脂肪細胞を前培養した。た だし培地には Preadipocyte Growth Medium—2 (以下PGM— 2培地、Cambr ex社製； PT— 8002より調製)を用いた。
[0114] (2) H— 296の培養プレートへの固定化
実施例 3—（2)と同様の方法で行った。ただしレトロネクチンではなぐ H— 296を固 定化した。その際、固定ィ匕に使用する溶液中の H— 296の濃度は 100 gZmlとし た。
[0115] (3) H— 296 binding法による遺伝子導入
調製例 3で調製した ZsGreen発現レトロウイルスベクター溶液と、 (2)で調製した H
— 296固定ィ匕培養プレートを用いて、実施例 3— (4)と同様の方法で行った。ただし 培地には PGM - 2培地を使用した。
[0116] (4) H— 296 SN法による遺伝子導入
調製例 3で調製した ZsGreen発現レトロウイルスベクター溶液と、 (2)で調製した H
— 296固定ィ匕培養プレートを用いて、実施例 3— (5)と同様の方法で行った。ただし 培地には PGM - 2培地を使用した。 [0117] (5)プロタミン SN法による遺伝子導入
実施例 8— (5)と同様の方法で行った。ただし培地には PGM— 2培地を使用した。
[0118] (6)遺伝子導入効率の測定
(3)、（4)、（5)の各方法により遺伝子導入処理を行った細胞について、実施例 1 (5)と同様の方法で、 ZsGreen発現細胞の比率を測定した。その結果を表 11に示 す。表 11はそれぞれ PGM— 2培地で 10倍希釈、 100倍希釈した ZsGreen発現レト ロウィルスベクター溶液を用いて、各方法で遺伝子導入を行ったときの遺伝子導入 効率 (ZsGreen発現細胞比率） (%)を示したものである。
[表 11]
10倍希釈 100倍希釈
H-296 binding法 28. 57 9. 20
H-296 SN法 32. 49 10. 97
プロタミン SN法 16. 68 6. 33
[0119] 表 11に示すように、フイブロネクチン由来のレトロウイルス結合部位と VLA— 4に結 合しうる領域で構成されて ヽる H— 296を用いた場合でも、レトロネクチンと同様に、 ヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。また、 H- 29 6 binding法、 H— 296 SN法のいずれにおいても、対照として行ったプロタミン法 よりも高い遺伝子導入効率が得られており、 H— 296を用いた、標的細胞とレトロウイ ルスベクターを共配置する導入法の有効性が示された。
産業上の利用可能性
[0120] 本発明によれば、脂肪細胞、前駆脂肪細胞に対して有用な遺伝子を高効率で導 入することが可能となる。前記の、遺伝子導入された細胞は、疾病の治療や予防に 有用な遺伝子産物を生物個体内で発現することが可能であることから、本発明により 当該細胞の移植による遺伝子治療方法が提供される。
配列表フリーテキスト
[0121] SEQ ID NO :4; Polypeptide having cell-binding domain and heparin— binding domains of
fibronectin. SEQ ID NO:6; Polypeptide having cell-binding domain and heparin— binding domains of
fibronectin.

Claims

請求の範囲
[1] 脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法であって、レトロウイルス結合 部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質またはレトロウイルス結合部 位を有する物質と標的細胞結合部位を有する他の物質との混合物の存在下に外来 遺伝子を有するレトロウイルスベクターを脂肪細胞もしくは前駆脂肪細胞に感染させ る工程を包含し、かつ前記の標的細胞結合部位が VLA— 5に結合しうる領域および
Zまたは VLA— 4に結合しうる領域を含むことを特徴とする遺伝子導入方法。
[2] レトロウイルス結合部位力 フイブロネクチンのへパリン— IIドメイン、線維芽細胞増 殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合部位、ポリリジン、 DEAEデキストランから 選択される物質に由来することを特徴とする請求項 1記載の遺伝子導入方法。
[3] 標的細胞結合部位が、フイブロネクチン由来の VLA— 5および Zまたは VLA— 4 への結合領域である請求項 1記載の方法。
[4] 配列番号 1記載のアミノ酸配列と、配列番号 2記載のアミノ酸配列および Zまたは 配列番号 3記載のアミノ酸配列とを有するポリペプチドの存在下にレトロウイルスべク ターの感染が実施される請求項 3記載の遺伝子導入方法。
[5] レトロウイルスベクター力 複製能欠損レトロウイルスベクターである請求項 1記載の 方法。
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