JPWO2008108344A1 - Ｌｃａｔ欠損症の遺伝子治療用細胞並びに遺伝子治療用細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、外来遺伝子としてのＬＣＡＴコードヌクレオチドを効率よく標的細胞で発現させることができる、患者に投与される遺伝子治療用細胞を産生するためのＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター、及び当該レトロウイルスベクターを産生するのに用いられるプラスミドを提供することにある。その解決手段としての本発明の複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドは、レトロウイルス由来の５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、外来遺伝子としてＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が挿入され、かつ、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の５’側にコザックのコンセンサス配列及び前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列が連結されていることを特徴とする。
Description
本発明は、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症の遺伝子治療用細胞を産生するのに用いられるＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター、前記レトロウイルスベクターの産生に使用するプラスミド、及び前記レトロウイルスベクターを接種することでＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を含むＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞、及び前記遺伝子治療用細胞と液状担体とを含むＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞組成物に関する。
遺伝子治療に際して、目的の外来遺伝子を標的細胞に導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法がある。ウイルスベクターを遺伝子治療に使用する方法は、ウイルスベクターを直接体内に導入する方法（ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療法）と、患者より標的細胞となる組織若しくは細胞を取り出し、ウイルスベクターにより外来遺伝子を標的細胞に導入した後、当該標的細胞を患者に戻す方法（ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法）とに大別される。
ウイルスベクターのうち、レトロウイルスを使用する方法は、目的の外来遺伝子が標的細胞の染色体に導入されることから、長期間にわたって、目的の外来遺伝子を安定的に発現させることができ、しかも標的細胞の分裂後も目的の外来遺伝子が確実に伝搬されるという特徴があることから、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法として用いられることが多い。
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療用のレトロウイルスベクターは、例えば、マウス由来のレトロウイルスを基にベクター骨格が構成されているが、マウス由来のレトロウイルスの外膜タンパク質はｅｃｏｔｏｒｏｐｉｃであることから、このままではヒトの標的細胞に接種しても目的の外来遺伝子を当該細胞に導入することができない。そのため、外膜タンパク質の発現遺伝子をヒトにも感染する遺伝子に代替されていることが多い。最も多用されているのは、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃな外膜タンパク質の発現遺伝子としてのａｍｐｈｏ遺伝子である。
ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃな外膜タンパク質をもつレトロウイルスベクターは、当該外膜タンパク質が脆弱であるため、遠心分離操作等による濃縮を行うことができないという特殊性がある。また、プロデューサー細胞から産生されたレトロウイルスベクターのうち、有効に目的の外来遺伝子をヒトの標的細胞に導入できるベクターとそうでないベクターの分離を行なうことは困難であることから、遺伝子治療用細胞の調製には両方のベクターが混在したベクター含有液を用いることになる。このため、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃな外膜タンパク質をもつ遺伝子治療用レトロウイルスベクターの治療能力は、ウイルスベクタータイターに大きく依存することになる。従って、高タイターのレトロウイルスベクターを産生可能な構造をもつプラスミドの構築とウイルス産生能力の高いプロデューサー細胞の選択が重要となる。
効率的なタンパク質の発現、翻訳を導く方法としては、例えば特表２００４−５１６８３０３において、プラスミドに最適なコザック配列を含有させることが提案されている。
また、特表平１１−５１１６５１では、遺伝子治療に用いるレトロウイルスベクターにおいて、効率のよい転写と翻訳を可能にするために、コザック配列を目的の外来遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）付近に導入することが提案されている。
また、特表平１１−５１１６５１では、遺伝子治療に用いるレトロウイルスベクターにおいて、効率のよい転写と翻訳を可能にするために、コザック配列を目的の外来遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）付近に導入することが提案されている。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、外来遺伝子としてのＬＣＡＴコードヌクレオチドを効率よく標的細胞で発現させることができる、患者に投与される遺伝子治療用細胞を構築、製造するためのＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター、及び当該レトロウイルスベクターを産生するのに用いられるプラスミドを提供することにある。
本発明の複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドは、レトロウイルス由来の５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、外来遺伝子としてＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が挿入され、かつ、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の５’側にコザックのコンセンサス配列及び前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列が連結されていることを特徴とする。
前記コザックのコンセンサス配列は、ＬＣＡＴの１番目のアミノ酸（Ｍｅｔ）をコードするコドン（ＡＴＧ）の直前に連結されていることが好ましく、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の３’側に、終止コドンとして、「ＴＧＡ」が連結されていることが好ましい。また、前記コザックのコンセンサス配列は、「ＣＣＡＣＣ」又は「ＧＣＡＣＣ」であることが好ましい。
本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターは、遺伝子として、レトロウイルス由来のＬＴＲ配列を１組有し、５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列、コザックのコンセンサス配列、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列及び終止コドンを、５’側からこの順序で有していることを特徴とする。前記コザックのコンセンサス配列は、「ＣＣＡＣＣ」又は「ＧＣＡＣＣ」であって、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列における開始コドンの直前に連結されていることが好ましい。
本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターの産生方法は、上記本発明のプラスミドを、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子を発現させることができるパッケージング細胞にトランスフェクトすることで調製したプロデューサー細胞をインキュベートする工程を含むことを特徴とする。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞は、上記本発明のプラスミドを、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子を発現させることができるパッケージング細胞にトランスフェクトすることで調製したプロデューサー細胞をインキュベートすることにより得られるＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを接種することでＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を含むことを特徴とする。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞組成物は、上記本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞と、液状担体とを含むことを特徴とする。
また、本発明は、外来遺伝子が１以上のコピー数で導入され、かつ、導入から少なくとも１２ヶ月以内に肉眼所見においてがん化が認められない遺伝子治療用細胞を産生するために脂肪細胞を使用する方法に関する。
尚、本明細書において、「脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）」とは、球形で脂肪を蓄えた成熟脂肪細胞（ｍａｔｕｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）や成熟前の脂肪を蓄えていない前脂肪細胞（ｐｒｅ−ｆａｔ ｃｅｌｌ）の他、脂肪細胞に分化する能力を有する脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）などを意味する。成熟脂肪細胞に蓄えられた脂肪はｏｉｌ ｒｅｄ ０染色によって確認することができ、成熟脂肪細胞は一般的にインスリンに応答してレプチンを分泌する。
また、本明細書において、「ＬＣＡＴコードヌクレオチド」といえば、プラスミドの場合、ＬＣＡＴをコードするＤＮＡをいい、レトロウイルスベクターの場合、ＲＮＡをいい、遺伝子治療用細胞においてはＤＮＡをいう。
本発明の複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドを用いれば、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する高タイターのレトロウイルスベクターを産生することができ、さらに、治療有効性が高いＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞及び遺伝子治療用細胞組成物を提供することができる。
〔ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミド〕
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドは、レトロウイルス由来の５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、外来遺伝子としてＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が挿入され、かつ、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の５’側にコザックのコンセンサス配列及び前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列が連結されていることを特徴とする。
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドは、レトロウイルス由来の５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、外来遺伝子としてＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が挿入され、かつ、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の５’側にコザックのコンセンサス配列及び前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列が連結されていることを特徴とする。
複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子の全部又は一部を削除することによって、レトロウイルスの複製及び増殖を不能にしたプラスミドである。削除されたレトロウイルスの構造遺伝子に代えて、遺伝子治療の目的となるタンパク質をコードする外来遺伝子のヌクレオチド（ｃＤＮＡ）が挿入される。
複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドの作製に用いられるレトロウイルスは、特に限定されず、例えば、ＨＩＶウイルス、ＳＩＶウイルス、ＦＩＶウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶウイルスなどを用いることができる。パッケージング細胞やパッケージングベクターと組合わせて、組換えウイルス粒子の産生キットとして開発や市販されているものを使用してもよい。
図１は、本発明の複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドにおいて、挿入された外来遺伝子（ＬＣＡＴ遺伝子）近傍の配列の概略を示しており、具体的には、５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列との間の配列を示す概略図である。
５’側のＬＴＲ配列及び３’側のＬＴＲ配列は、いずれもレトロウイルス由来のＬＴＲ（ロングターミナルリピート）配列であり、ＬＴＲ配列で挟まれている領域のヌクレオチドをレトロウイルス粒子中に取り込むために必要とされる。５’側のＬＴＲ配列には、ＬＣＡＴ遺伝子の転写や翻訳に必要なプロモーター、組み込みに必要なａｔｔ部位、ｐｏｌｙＡ配列が含まれている。
５’側のＬＴＲ配列及び３’側のＬＴＲ配列は、いずれもレトロウイルス由来のＬＴＲ（ロングターミナルリピート）配列であり、ＬＴＲ配列で挟まれている領域のヌクレオチドをレトロウイルス粒子中に取り込むために必要とされる。５’側のＬＴＲ配列には、ＬＣＡＴ遺伝子の転写や翻訳に必要なプロモーター、組み込みに必要なａｔｔ部位、ｐｏｌｙＡ配列が含まれている。
ＬＣＡＴ遺伝子としては、例えば、配列番号１に示すようなヒトの正常のレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＮＰ０００２２０、遺伝子ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ｂｃ０１４７８１）のメチオニン（Ｍｅｔ）からグルタミン酸（Ｇｌｕ）までの４４０個のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）からなるものが挙げられるが、ＬＣＡＴ遺伝子は、このヌクレオチド配列に対して、１又は２以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列からなるものであってもよいし、このヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列からなるものであってもよい。
ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の開始コドンの５’側には、コザックのコンセンサス配列が連結されている（図１中、「Ｋｏｚａｋ」）。ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列における開始コドン（ＡＴＧ）とコザックのコンセンサス配列の間には、プラスミドの機能に対して影響を及ぼさないヌクレオチド配列が介在していてもよいが、コザックのコンセンサス配列の直後に開始コドンが連結されていることが好ましい。また、コザックのコンセンサス配列は、「ＣＣＡＣＣ」又は「ＧＣＡＣＣ」であることが好ましい。一方、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の３’側には、終止コドンが連結されている。終止コドンは、天然型のＬＣＡＴ遺伝子の終止コドンである「ＴＡＡ」であってもよいが、好ましくは「ＴＧＡ」又は「ＴＣＧ」、より好ましくは「ＴＧＡ」である。ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の３’側は、グルタミン酸のコード配列である「ＧＡＡ」であることから、天然型の終止コドンが連結された場合、「ＧＡＡＴＡＡ」という配列となり、この部分がポリＡシグナル配列のような作用をして、転写終結を起こしやすくしてしまうことがある。従って、終止コドンを「ＴＧＡ」又は「ＴＣＧ」に変更することで、ＬＣＡＴ遺伝子が本来有していたポリＡシグナルの類似配列による影響を取り除くことが可能となり、高タイターのレトロウイルスベクターの産生を期待でき、ひいては、レトロウイルスベクターの産生量を増大できる傾向にある。
コザックのコンセンサス配列の５’側に、さらに連結されているパッケージングシグナル配列（ψ）は、ウイルスゲノムＲＮＡがウイルス粒子中に包み込まれるときに必要な配列である。パッケージングシグナル（ψ）配列はＬＴＲ配列に含まれている場合もある。
５’側のＬＴＲ配列とパッケージングシグナル配列との間、パッケージングシグナル配列とコザックのコンセンサス配列との間、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の３’側に連結された終止コドンと３’側のＬＴＲ配列との間には、プラスミドの機能に対して影響を及ぼさないヌクレオチド配列が介在していてもよいし、介在していなくてもよい。
介在していてもよいヌクレオチド配列としては、ＬＣＡＴコードヌクレオチドの転写や翻訳、レトロウイルスの産生効率といったプラスミドの機能に影響を及ぼさない選択マーカー遺伝子配列が挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子として機能する遺伝子配列が介在していてもよい。また、プラスミド作製にあたり、コザックのコンセンサス配列とＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の組合わせをクローニング部位に連結させるための、制限酵素の認識部位を含むリンカー配列が含まれていてもよい。
介在していてもよいヌクレオチド配列としては、ＬＣＡＴコードヌクレオチドの転写や翻訳、レトロウイルスの産生効率といったプラスミドの機能に影響を及ぼさない選択マーカー遺伝子配列が挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子として機能する遺伝子配列が介在していてもよい。また、プラスミド作製にあたり、コザックのコンセンサス配列とＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の組合わせをクローニング部位に連結させるための、制限酵素の認識部位を含むリンカー配列が含まれていてもよい。
本発明の複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドの作製に際しては、例えば、タカラバイオ株式会社から提供されている組換えウイルス粒子の産生キットに含まれる組換えレトロウイルスベクタープラスミドであるｐＤＯＮ−ＡＩベクターを使用してもよい。この場合、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのマルチクローニングサイトに、コザックのコンセンサス配列とＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の組合わせに終止コドンを連結させた断片、例えば、配列番号２に示すようなヌクレオチド配列を挿入すればよい（ｐＤＯＮ−ＡＩベクターはパッケージングシグナル配列を５’側のＬＴＲ配列と５’側のマルチクローニングサイトの間に有する）。
〔レトロウイルスベクター産生細胞（プロデューサー細胞）〕
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターの産生細胞は、空のレトロウイルス様粒子を産生できるパッケージング細胞に、上記本発明のプラスミドをトランスフェクトすることで調製することができる。
空のレトロウイルス様粒子を産生できるパッケージング細胞とは、外膜タンパク質をコードするａｍｐｈｏ遺伝子、内部コア構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子、プロテアーゼや逆転写酵素などの特定酵素をコードするｐｏｌ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子が染色体に組み込まれていて、レトロウイルス粒子の形成に必要なタンパク質を供給することができるが、ＬＴＲ配列は組み込まれていないものである。
パッケージング細胞を調製するための細胞（ヘルパー細胞）としては、特に限定されないが、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃであることが好ましく、具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞など、すでにパッケージング細胞株として樹立されたものが挙げられる。このような細胞に、産生させようとするレトロウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含む構造遺伝子を有するパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトすることにより、パッケージング細胞を調製することができる。
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターの産生細胞は、空のレトロウイルス様粒子を産生できるパッケージング細胞に、上記本発明のプラスミドをトランスフェクトすることで調製することができる。
空のレトロウイルス様粒子を産生できるパッケージング細胞とは、外膜タンパク質をコードするａｍｐｈｏ遺伝子、内部コア構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子、プロテアーゼや逆転写酵素などの特定酵素をコードするｐｏｌ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子が染色体に組み込まれていて、レトロウイルス粒子の形成に必要なタンパク質を供給することができるが、ＬＴＲ配列は組み込まれていないものである。
パッケージング細胞を調製するための細胞（ヘルパー細胞）としては、特に限定されないが、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃであることが好ましく、具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞など、すでにパッケージング細胞株として樹立されたものが挙げられる。このような細胞に、産生させようとするレトロウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含む構造遺伝子を有するパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトすることにより、パッケージング細胞を調製することができる。
空のレトロウイルス様粒子を産生できるパッケージング細胞に、上記本発明のプラスミドをトランスフェクトした後、溶液を限界希釈して、各ウェルに細胞が１個となる割合まで限界希釈し、最もレトロウイルス産生能力の高いウェルをプロデューサー細胞として選択する。さらに、この培養上清を用いたときの遺伝子導入効率が高いウェルを選ぶことが好ましい。産生されるレトロウイルスベクターには、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するものと保持していないものが混在し、さらにＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するものであっても、外膜タンパク質の状態等により、標的細胞への遺伝子導入効率が一様でないからである。
尚、プロデューサー細胞の調製方法は、以上のような、パッケージング細胞を調製した後、上記本発明のプラスミドをトランスフェクトする方法に限定されず、パッケージング細胞を製造するためのパッケージングベクターと、本発明のプラスミドを、ヘルパー細胞にコトランスフェクトする方法であってもよい。
〔ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクター及びその製造方法〕
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターは、標的細胞に外来遺伝子としてのＬＣＡＴ遺伝子を導入するためのレトロウイルス粒子であって、少なくともＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が１つ以上、発現可能な状態で含まれているものである。具体的には、遺伝子として、レトロウイルス由来のＬＴＲ配列を１組有し、５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列、コザックのコンセンサス配列、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列及び終止コドンを、５’側からこの順序で有している。
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターは、標的細胞に外来遺伝子としてのＬＣＡＴ遺伝子を導入するためのレトロウイルス粒子であって、少なくともＬＣＡＴコードヌクレオチド配列が１つ以上、発現可能な状態で含まれているものである。具体的には、遺伝子として、レトロウイルス由来のＬＴＲ配列を１組有し、５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列、コザックのコンセンサス配列、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列及び終止コドンを、５’側からこの順序で有している。
複製欠損性レトロウイルスとは、レトロウイルス由来のｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含む構造遺伝子の全部又は一部が削除されていることにより、複製及び増殖が不能なレトロウイルスである。このようなレトロウイルスは、ウイルス本来の毒性がなく、保持させた外来遺伝子を、標的細胞に導入するためのベクターとしての役割を果たすことができる。
本発明のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターは、上記プロデューサー細胞を、所定時間インキュベートすることで得られる培養上清に含まれる。
〔ＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞〕
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞は、標的細胞である脂肪細胞に、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを接種することでＬＣＡＴコードヌクレオチドを遺伝子導入したものである。
標的細胞となる脂肪細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療に用いられる細胞で、患者から採取した脂肪細胞が好ましく用いられる。
標的細胞である脂肪細胞への複製欠損性レトロウイルスベクターの接種は、脂肪細胞と、複製欠損性レトロウイルスベクターを接触させることにより行なうが、当該レトロウイルスベクターの調製の際に得られた培養上清を用いて、この培養上清と、脂肪細胞の培養液を、ポリブレン若しくは硫酸プロタミンを加えて混合し、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２〜７２時間インキュベートすることにより行なうことが好ましい。本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターは、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現可能な状態で保持するレトロウイルスベクターの含有割合が高く、しかも遺伝子導入効率が高いので、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持していないレトロウイルスベクター等が混在していても、所定時間インキュベートすることで、有効量のＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を得ることが可能である。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞は、標的細胞である脂肪細胞に、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを接種することでＬＣＡＴコードヌクレオチドを遺伝子導入したものである。
標的細胞となる脂肪細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療に用いられる細胞で、患者から採取した脂肪細胞が好ましく用いられる。
標的細胞である脂肪細胞への複製欠損性レトロウイルスベクターの接種は、脂肪細胞と、複製欠損性レトロウイルスベクターを接触させることにより行なうが、当該レトロウイルスベクターの調製の際に得られた培養上清を用いて、この培養上清と、脂肪細胞の培養液を、ポリブレン若しくは硫酸プロタミンを加えて混合し、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２〜７２時間インキュベートすることにより行なうことが好ましい。本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターは、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現可能な状態で保持するレトロウイルスベクターの含有割合が高く、しかも遺伝子導入効率が高いので、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持していないレトロウイルスベクター等が混在していても、所定時間インキュベートすることで、有効量のＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を得ることが可能である。
標的細胞である脂肪細胞への複製欠損性レトロウイルスベクターの接種により、ＬＣＡＴコードヌクレオチドが脂肪細胞の染色体内に遺伝子導入される。ＬＣＡＴコードヌクレオチドが染色体内に遺伝子導入された脂肪細胞は、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを転写、翻訳して、ＬＣＡＴを細胞外に分泌することができる。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞、即ち、ＬＣＡＴ遺伝子組換え脂肪細胞は、増殖時だけでなく、分化後も、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現することができ、長期間にわたってＬＣＡＴを分泌し続けることができる。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞、即ち、ＬＣＡＴ遺伝子組換え脂肪細胞は、増殖時だけでなく、分化後も、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現することができ、長期間にわたってＬＣＡＴを分泌し続けることができる。
なお、今回の本発明者らの研究によって、脂肪細胞は外来遺伝子を多コピー導入することが可能であり（外来遺伝子にもよるが少なくとも１０コピーは可能）、しかも、１以上のコピー数で外来遺伝子を導入しても長期にわたってがん化しないという極めて優れた特性を有することが明らかになった。
〔遺伝子治療用細胞組成物〕
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞組成物は、上記のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞と、液状担体とを含む。この組成物は、例えば、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを含む培養上清中で、脂肪細胞を所定時間インキュベートすることにより得られた遺伝子治療用細胞を液状担体に分散させることにより調製することができる。
本発明のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞組成物は、上記のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞と、液状担体とを含む。この組成物は、例えば、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを含む培養上清中で、脂肪細胞を所定時間インキュベートすることにより得られた遺伝子治療用細胞を液状担体に分散させることにより調製することができる。
上記のＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを含む培養上清には、前述のプロデューサー細胞から産生された、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターの他、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持していないレトロウイルスベクターやＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持していても発現可能な状態では保持していないレトロウイルスベクターなどが含まれる。しかしながら、本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターは、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現可能な状態で保持するレトロウイルスベクターの含有割合が高く、しかも遺伝子導入効率が高いので、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持していないレトロウイルスベクター等が混在していても、所定時間インキュベートすることで、有効量のＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を得ることが可能である。
ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを含む培養上清中で、脂肪細胞を所定時間インキュベートした後、ウイルス含有液を分離除去し、脂肪細胞群（本発明の遺伝子治療用細胞）を得、これを液状担体に分散させることにより、本発明の遺伝子治療用細胞組成物を調製することができる。本発明の遺伝子治療用細胞組成物には、ＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞だけでなく、遺伝子導入されていない脂肪細胞も含まれている。脂肪細胞は付着細胞であるため、双方の脂肪細胞を分離することは困難であるが、患者由来の脂肪細胞であれば、双方の脂肪細胞が含まれていてもよい。
液状担体としては、生理食塩水やリン酸緩衝液などを用いることができる。本発明の遺伝子治療用細胞組成物は、注射剤として用いられることが好ましい。標的細胞として取り出した脂肪細胞は、取り出した元の部位に注射によって戻すことができる。その際、本発明の遺伝子治療用細胞組成物に、コラーゲン溶液やマトリゲルなどの細胞の生着を向上させる液状物質を混合してもよい。
以上のようにして患者に投与されたＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞は、ＬＣＡＴ遺伝子組換え脂肪細胞として、増殖時だけでなく、分化後も、ＬＣＡＴコードヌクレオチドを発現することができ、長期間にわたってＬＣＡＴを分泌し続けることができる。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
実施例１：本発明の複製欠損性レトロウイルスベクターの調製とその有用性の検討
〔ヒトＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片〕
ヒト肝がん細胞株であるＨｅｐＧ２のｃＤＮＡライブラリーから調製した配列番号１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの５’側に、コザックのコンセンサス配列を連結するか又は連結せずに、ＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を連結した。また、上記ｃＤＮＡの３’側に終止コドン、場合によってＢＧＨのＰｏｌｙＡ配列、ＳａｌＩ認識配列（ＧＴＣＧＡＣ）を連結した。
〔ヒトＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片〕
ヒト肝がん細胞株であるＨｅｐＧ２のｃＤＮＡライブラリーから調製した配列番号１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの５’側に、コザックのコンセンサス配列を連結するか又は連結せずに、ＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を連結した。また、上記ｃＤＮＡの３’側に終止コドン、場合によってＢＧＨのＰｏｌｙＡ配列、ＳａｌＩ認識配列（ＧＴＣＧＡＣ）を連結した。
〔脂肪細胞〕
脂肪細胞としては、ＣＡＭＢＲＥＸ社から購入したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（初代培養細胞、ロット番号３Ｆ０７３９）（以下７３９Ｆ細胞）を用いた。
脂肪細胞としては、ＣＡＭＢＲＥＸ社から購入したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（初代培養細胞、ロット番号３Ｆ０７３９）（以下７３９Ｆ細胞）を用いた。
〔プラスミド〕
図２に示す構造を有するｐＤＯＮ−ＡＩベクターに適宜改変を加えて使用した。このＤＮＡベクターのマルチクローニングサイトであるＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片を挿入した。
図２に示す構造を有するｐＤＯＮ−ＡＩベクターに適宜改変を加えて使用した。このＤＮＡベクターのマルチクローニングサイトであるＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片を挿入した。
〔培地〕
（１）脂肪細胞の増殖培地
ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（シグマアルドリッチ社）に、ウシ胎児血清２０％を含むものを用いた。
（２）脂肪細胞の分化培地
東洋紡社製の分化培地（ｃａｔ＃ＴＭＴＡＤＭ２５０）を用いた。
（１）脂肪細胞の増殖培地
ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（シグマアルドリッチ社）に、ウシ胎児血清２０％を含むものを用いた。
（２）脂肪細胞の分化培地
東洋紡社製の分化培地（ｃａｔ＃ＴＭＴＡＤＭ２５０）を用いた。
〔測定評価方法〕
（１）ウイルスベクタータイター
ウイルスベクター含有液から、ウイルスベクターＲＮＡを抽出し、精製後、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片のヌクレオチド配列と相補性を有する下記の５’側プライマー（配列番号３）と３’側プライマー（配列番号４）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法で、ウイルス核酸量を定量した。ウイルス核酸を含有するウイルス粒子数を単位体積あたりで表し、ウイルスベクタータイターとした。
５’側プライマー：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧ−３’
３’側プライマー：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣ−３’
（１）ウイルスベクタータイター
ウイルスベクター含有液から、ウイルスベクターＲＮＡを抽出し、精製後、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片のヌクレオチド配列と相補性を有する下記の５’側プライマー（配列番号３）と３’側プライマー（配列番号４）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法で、ウイルス核酸量を定量した。ウイルス核酸を含有するウイルス粒子数を単位体積あたりで表し、ウイルスベクタータイターとした。
５’側プライマー：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧ−３’
３’側プライマー：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＴＣＴＣ−３’
（２）ＬＣＡＴ発現量
ＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入されたヒト脂肪細胞から、ＲＮＡを抽出し、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片のヌクレオチド配列と相補性を有する上記のプライマーセットを用いて、定量性リアルタイムＰＣＲ法によりＬＣＡＴのｍＲＮＡ量を測定した。
ＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入されたヒト脂肪細胞から、ＲＮＡを抽出し、調製したＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片のヌクレオチド配列と相補性を有する上記のプライマーセットを用いて、定量性リアルタイムＰＣＲ法によりＬＣＡＴのｍＲＮＡ量を測定した。
コントロールとして、ヒト肝臓細胞から同様にしてＲＮＡを抽出し、上記のプライマーセットを用いて、定量性リアルタイムＰＣＲ法によりＬＣＡＴのｍＲＮＡ量を測定した。
ヒト肝臓細胞におけるＬＣＡＴのｍＲＮＡ量を１として、ＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入されたヒト脂肪細胞のＬＣＡＴのｍＲＮＡ量の相対比率を算出した。
ヒト肝臓細胞におけるＬＣＡＴのｍＲＮＡ量を１として、ＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入されたヒト脂肪細胞のＬＣＡＴのｍＲＮＡ量の相対比率を算出した。
〔レトロウイルス製造用プラスミドの構築〕
表１に示すような、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターとＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片の組合せからなる、８種類のｐＤＯＮ−ＡＩ／ｈＬＣＡＴプラスミド（Ｎｏ．１〜８）を構築した。
表１に示すような、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターとＬＣＡＴコードヌクレオチド修飾断片の組合せからなる、８種類のｐＤＯＮ−ＡＩ／ｈＬＣＡＴプラスミド（Ｎｏ．１〜８）を構築した。
（１）プラスミドＮｏ．１（比較例）
終止コドンとして、天然の終止コドン「ＴＡＡ」を連結した修飾断片（以下、「天然タイプのＬＣＡＴ含有断片」という）を、図２に示すｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（２）プラスミドＮｏ．２（比較例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、天然タイプのＬＣＡＴ含有断片を導入したもの。
（３）プラスミドＮｏ．３（実施例）
天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（４）プラスミドＮｏ．４（実施例）
天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結し、終止コドンを「ＴＡＡ」から「ＴＧＡ」に変更した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（５）プラスミドＮｏ．５（実施例）
プラスミド４で使用した修飾断片の３’側に、ＢＧＨのＰｏｌｙＡ配列を連結した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（６）プラスミドＮｏ．６（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、プラスミド４で使用した修飾断片を導入したもの。
（７）プラスミドＮｏ．７（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結した修飾断片を導入したもの。
（８）プラスミドＮｏ．８（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、プラスミド５で使用した修飾断片を導入したもの。
終止コドンとして、天然の終止コドン「ＴＡＡ」を連結した修飾断片（以下、「天然タイプのＬＣＡＴ含有断片」という）を、図２に示すｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（２）プラスミドＮｏ．２（比較例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、天然タイプのＬＣＡＴ含有断片を導入したもの。
（３）プラスミドＮｏ．３（実施例）
天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（４）プラスミドＮｏ．４（実施例）
天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結し、終止コドンを「ＴＡＡ」から「ＴＧＡ」に変更した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（５）プラスミドＮｏ．５（実施例）
プラスミド４で使用した修飾断片の３’側に、ＢＧＨのＰｏｌｙＡ配列を連結した修飾断片を、ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に導入したもの。
（６）プラスミドＮｏ．６（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、プラスミド４で使用した修飾断片を導入したもの。
（７）プラスミドＮｏ．７（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、天然タイプのＬＣＡＴ含有断片の開始コドン（ＡＴＧ）の直前に、コザックのコンセンサス配列として「ＣＣＡＣＣ」を連結した修飾断片を導入したもの。
（８）プラスミドＮｏ．８（実施例）
ｐＤＯＮ−ＡＩベクターのＳａｌＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位の間の配列を除去することにより、Ｇ４１８（ＮＥＯ）抗生物質耐性タンパク質発現遺伝子配列を除去したＤＮＡベクターを使用し、このＤＮＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間に、プラスミド５で使用した修飾断片を導入したもの。
〔プラスミドのパッケージング細胞へのトランスフェクション及び組換えレトロウイルスベクターの生産〕
上記で構築したプラスミドＮｏ．１〜８のそれぞれについて、遺伝子導入試薬：Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃４４−００５２）を用い、本キットに添付の取扱説明書に従って各種プラスミド（５μｇ）との混合液（０．３２ｍＬ）Ｎｏ．１〜８を調製した。
１．７×１０６個のパッケージング細胞（ＡｍｐｈｏＰａｃｋ２９３細胞、ＢＤ ｃａｔ＃６３１５０５）を６０ｍｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、最終濃度２５μＭとなるように、クロロキンを培養液中に添加し、さらに１時間培養後、上記で調製したプラスミド混合液を滴下してさらに１２時間培養した。その後、新鮮な培地に交換し、さらに２４時間培養した。３００×ｇ、室温で５分間遠心後の培養上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をウイルスベクター含有液として、使用するまで−８０℃で保存した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ＃５２９０４）でウイルスベクター含有液の一部からウイルスベクター含有液中のウイルスＲＮＡを精製し、上述の方法に従って、ウイルスベクタータイターを求めた。測定結果を表１にまとめて示す。
上記で構築したプラスミドＮｏ．１〜８のそれぞれについて、遺伝子導入試薬：Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃４４−００５２）を用い、本キットに添付の取扱説明書に従って各種プラスミド（５μｇ）との混合液（０．３２ｍＬ）Ｎｏ．１〜８を調製した。
１．７×１０６個のパッケージング細胞（ＡｍｐｈｏＰａｃｋ２９３細胞、ＢＤ ｃａｔ＃６３１５０５）を６０ｍｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、最終濃度２５μＭとなるように、クロロキンを培養液中に添加し、さらに１時間培養後、上記で調製したプラスミド混合液を滴下してさらに１２時間培養した。その後、新鮮な培地に交換し、さらに２４時間培養した。３００×ｇ、室温で５分間遠心後の培養上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をウイルスベクター含有液として、使用するまで−８０℃で保存した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ＃５２９０４）でウイルスベクター含有液の一部からウイルスベクター含有液中のウイルスＲＮＡを精製し、上述の方法に従って、ウイルスベクタータイターを求めた。測定結果を表１にまとめて示す。
〔遺伝子導入脂肪細胞の製造〕
１．５×１０４個の７３９Ｆ細胞を２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ウイルスベクター含有液を培地へ加え、さらに最終濃度が４μｇ／ｍＬとなるようポリブレンを添加し、１２時間培養後、新鮮な培地に交換し、４８時間培養して、７３９Ｆ細胞に対するウイルスベクターの接種を行った。
１．５×１０４個の７３９Ｆ細胞を２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ウイルスベクター含有液を培地へ加え、さらに最終濃度が４μｇ／ｍＬとなるようポリブレンを添加し、１２時間培養後、新鮮な培地に交換し、４８時間培養して、７３９Ｆ細胞に対するウイルスベクターの接種を行った。
培養後、培地を吸引除去し、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ＃７４１０４）を用いて細胞よりＲＮＡを抽出し、上述の方法に従って、ＬＣＡＴの発現量（増殖時）を測定した。
一方、培養後、培地を吸引除去し、細胞に分化培地を１ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１４日間培養した。培地を吸引除去し、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ｃａｔ＃７４１０４）を用いて細胞よりＲＮＡを抽出し、上述の方法に従って、ＬＣＡＴの発現量（分化後）を測定した。
増殖時及び分化後のコントロールに対する発現量比率を算出した結果を、表１に示す。
表１からわかるように、コザックのコンセンサス配列を有するプラスミドの方がＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターの産生量が高く、さらには選択マーカーを有しない方が生産量が高いことがわかる。また、終止コドンは、「ＴＡＡ」でも「ＴＧＡ」でもよい。
増殖時及び分化後のコントロールに対する発現量比率を算出した結果を、表１に示す。
表１からわかるように、コザックのコンセンサス配列を有するプラスミドの方がＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターの産生量が高く、さらには選択マーカーを有しない方が生産量が高いことがわかる。また、終止コドンは、「ＴＡＡ」でも「ＴＧＡ」でもよい。
実施例２：本発明の遺伝子治療用細胞の有用性の検討（その１）
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９８６）３１：４２−４９に従った天井培養法（以下同じ）によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、約１コピー／細胞となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２１日目に細胞を回収し、回収した細胞を１×１０５個／ｂｏｄｙにてＣ５７ＢＬ６由来のＬＣＡＴノックアウトマウス（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．２５，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｊｕｎｅ ２０，ｐｐ．１５７７７−１５７８１，１９９７）の背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与前と投与後１週間目に血液を採取し、その血清の総コレステロール値とＨＤＬ−コレステロール値をＨＰＬＣ法によって測定した。結果を表２に示す。
表２から明らかなように、本発明の遺伝子治療用細胞を投与することで、ＬＣＡＴノックアウトマウスの総コレステロール値とＨＤＬ−コレステロール値が上昇したことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、ＬＣＡＴノックアウトマウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９８６）３１：４２−４９に従った天井培養法（以下同じ）によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、約１コピー／細胞となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２１日目に細胞を回収し、回収した細胞を１×１０５個／ｂｏｄｙにてＣ５７ＢＬ６由来のＬＣＡＴノックアウトマウス（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．２５，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｊｕｎｅ ２０，ｐｐ．１５７７７−１５７８１，１９９７）の背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与前と投与後１週間目に血液を採取し、その血清の総コレステロール値とＨＤＬ−コレステロール値をＨＰＬＣ法によって測定した。結果を表２に示す。
表２から明らかなように、本発明の遺伝子治療用細胞を投与することで、ＬＣＡＴノックアウトマウスの総コレステロール値とＨＤＬ−コレステロール値が上昇したことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、ＬＣＡＴノックアウトマウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
実施例３：本発明の遺伝子治療用細胞の有用性の検討（その２）
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、天井培養法によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、低コピー群（約１コピー／細胞）と高コピー群（約５コピー／細胞）となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２８日目に細胞を回収し、回収した細胞を５×１０６個／ｂｏｄｙにて別のＣ５７ＢＬ６マウスの背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与後２週間目に血液を採取し、その血清を抗ヒトＬＣＡＴ抗体にて免疫沈降させた後、ウエスタンブロット法により、血液中のヒトＬＣＡＴを検出した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、使用した抗体はマウスＬＣＡＴも認識するため、ウエスタンブロットではマウスＬＣＡＴのバンドが認められるが、低コピー群でも低コピー群でも、その下側にヒトＬＣＡＴのバンドが認められたことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、マウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、天井培養法によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、低コピー群（約１コピー／細胞）と高コピー群（約５コピー／細胞）となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２８日目に細胞を回収し、回収した細胞を５×１０６個／ｂｏｄｙにて別のＣ５７ＢＬ６マウスの背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与後２週間目に血液を採取し、その血清を抗ヒトＬＣＡＴ抗体にて免疫沈降させた後、ウエスタンブロット法により、血液中のヒトＬＣＡＴを検出した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、使用した抗体はマウスＬＣＡＴも認識するため、ウエスタンブロットではマウスＬＣＡＴのバンドが認められるが、低コピー群でも低コピー群でも、その下側にヒトＬＣＡＴのバンドが認められたことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、マウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
実施例４：ヒトＬＣＡＴ遺伝子導入マウス前脂肪細胞の移植によるマウスのがん化の検討
実施例３において本発明の遺伝子治療用細胞を投与したＣ５７ＢＬ６マウスの一般状態を毎日観察し、体重および摂餌量を１〜２週間に１度測定した。また、週に１度、移植部位付近を触診にて腫瘤の有無を確認した。細胞投与から１年後に剖検し、各臓器の重量、血液学的検査、各臓器、組織の肉眼所見および病理組織学的検査を行った結果、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の導入コピー数にかかわらず、異常は認められなかった。従って、脂肪細胞は、外来遺伝子のコピー数で１以上であっても長期にわたってがん化しないという極めて優れた特性を有することがわかった。
実施例３において本発明の遺伝子治療用細胞を投与したＣ５７ＢＬ６マウスの一般状態を毎日観察し、体重および摂餌量を１〜２週間に１度測定した。また、週に１度、移植部位付近を触診にて腫瘤の有無を確認した。細胞投与から１年後に剖検し、各臓器の重量、血液学的検査、各臓器、組織の肉眼所見および病理組織学的検査を行った結果、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の導入コピー数にかかわらず、異常は認められなかった。従って、脂肪細胞は、外来遺伝子のコピー数で１以上であっても長期にわたってがん化しないという極めて優れた特性を有することがわかった。
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療用のレトロウイルスベクターは、例えば、マウス由来のレトロウイルスを基にベクター骨格が構成されているが、マウス由来のレトロウイルスの外膜タンパク質はｅｃｏｔｒｏｐｉｃであることから、このままではヒトの標的細胞に接種しても目的の外来遺伝子を当該細胞に導入することができない。そのため、外膜タンパク質の発現遺伝子をヒトにも感染する遺伝子に代替されていることが多い。最も多用されているのは、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃな外膜タンパク質の発現遺伝子としてのａｍｐｈｏ遺伝子である。
実施例３：本発明の遺伝子治療用細胞の有用性の検討（その２）
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、天井培養法によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、低コピー群（約１コピー／細胞）と高コピー群（約５コピー／細胞）となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２８日目に細胞を回収し、回収した細胞を５×１０６個／ｂｏｄｙにて別のＣ５７ＢＬ６マウスの背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与後２週間目に血液を採取し、その血清を抗ヒトＬＣＡＴ抗体にて免疫沈降させた後、ウエスタンブロット法により、血液中のヒトＬＣＡＴを検出した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、使用した抗体はマウスＬＣＡＴも認識するため、ウエスタンブロットではマウスＬＣＡＴのバンドが認められるが、低コピー群でも高コピー群でも、その下側にヒトＬＣＡＴのバンドが認められたことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、マウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
Ｃ５７ＢＬ６マウスから皮下脂肪組織を採取し、天井培養法によりマウス前脂肪細胞を単離培養した。マウス前脂肪細胞に対し、低コピー群（約１コピー／細胞）と高コピー群（約５コピー／細胞）となるように、実施例１のプラスミドＮｏ．６を用いて調製したヒトＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持するレトロウイルスベクターを用いてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した。導入後２８日目に細胞を回収し、回収した細胞を５×１０６個／ｂｏｄｙにて別のＣ５７ＢＬ６マウスの背部の脂肪組織内に注射して投与した。細胞投与後２週間目に血液を採取し、その血清を抗ヒトＬＣＡＴ抗体にて免疫沈降させた後、ウエスタンブロット法により、血液中のヒトＬＣＡＴを検出した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、使用した抗体はマウスＬＣＡＴも認識するため、ウエスタンブロットではマウスＬＣＡＴのバンドが認められるが、低コピー群でも高コピー群でも、その下側にヒトＬＣＡＴのバンドが認められたことから、本発明の遺伝子治療用細胞を用いれば、マウスの体内でヒトＬＣＡＴを発現させることができることがわかった。
Claims (10)
- 複製欠損性レトロウイルスベクター産生用プラスミドであって、レトロウイルス由来の５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、外来遺伝子としてレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）をコードするヌクレオチド（以下、「ＬＣＡＴコードヌクレオチド」という）配列が挿入され、かつ、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の５’側にコザックのコンセンサス配列及び前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列が連結されていることを特徴とするプラスミド。
- 前記コザックのコンセンサス配列は、ＬＣＡＴの１番目のアミノ酸（Ｍｅｔ）をコードするコドン（ＡＴＧ）の直前に連結されている請求項１に記載のプラスミド。
- 前記コザックのコンセンサス配列は、「ＣＣＡＣＣ」又は「ＧＣＡＣＣ」である請求項１に記載のプラスミド。
- さらに、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列の３’側に、終止コドンとして、「ＴＧＡ」が連結されている請求項１に記載のプラスミド。
- 遺伝子として、レトロウイルス由来のＬＴＲ配列を１組有し、５’側のＬＴＲ配列と３’側のＬＴＲ配列の間に、前記レトロウイルスのパッケージングシグナル配列、コザックのコンセンサス配列、ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列及び終止コドンを、５’側からこの順序で有していることを特徴とする複製欠損性レトロウイルスベクター。
- 前記コザックのコンセンサス配列は、「ＣＣＡＣＣ」又は「ＧＣＡＣＣ」であって、前記ＬＣＡＴコードヌクレオチド配列における開始コドンの直前に連結されている請求項５に記載の複製欠損性レトロウイルスベクター。
- ＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターの産生方法であって、請求項１に記載のプラスミドを、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子を発現させることができるパッケージング細胞にトランスフェクトすることで調製したプロデューサー細胞をインキュベートする工程を含むことを特徴とする産生方法。
- 請求項１に記載のプラスミドを、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びａｍｐｈｏ遺伝子を少なくとも含むレトロウイルスの構造遺伝子を発現させることができるパッケージング細胞にトランスフェクトすることで調製したプロデューサー細胞をインキュベートすることにより得られるＬＣＡＴコードヌクレオチドを保持する複製欠損性レトロウイルスベクターを接種することでＬＣＡＴコードヌクレオチドが遺伝子導入された脂肪細胞を含むことを特徴とするＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞。
- 請求項８に記載のＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞と、液状担体とを含むことを特徴とするＬＣＡＴ欠損症の遺伝子治療用細胞組成物。
- 外来遺伝子が１以上のコピー数で導入され、かつ、導入から少なくとも１２ヶ月以内に肉眼所見においてがん化が認められない遺伝子治療用細胞を産生するために脂肪細胞を使用することを特徴とする方法。
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| JPH11511651A (ja) * | 1995-05-10 | 1999-10-12 | イントロヘーネ ベスローテン フェンノートシャップ | 遺伝子治療に特に適した改良型レトロウイルスベクター |
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