JPH11501518A - レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼを発現する組換えウイルス及び遺伝子治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）又はその変異体の全部又は一部をコードする少なくとも１種の挿入遺伝子を含む欠損組換えウイルス、これらのウイルスを含む医薬組成物、及びリポタンパク異常血症に関連する疾病の治療又は予防のためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼを 発現する組換えウイルス及び遺伝子治療におけるその使用 本発明は新規組換えウイルス、その製造及び遺伝子治療において所望の遺伝子 をインビボ導入発現させるためのその使用に関する。より詳細には、本発明はレ シチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）又はその変異体 の全部又は一部をコードする挿入遺伝子を含む新規組換えウイルスに関する。本 発明は更に、前記組換えウイルスを含む医薬組成物にも関する。より詳細には、 本発明は欠損組換えウイルスと、心臓血管及び神経レベルに重大な影響を及ぼす として知られているリポタンパク異常血症に関連する疾病の予防又は治療のため のその使用に関する。 リポタンパク異常血症は、コレステロールやトリグリセリド等の脂質を血液及 び末梢体液に輸送するのに関与するリポタンパク質の代謝不全である。リポタン パク異常血症は、特にアテローム性動脈硬化症等の高コレステロール血症又は高 トリグリセリド血症に夫々結びつけられる重大な疾病を誘発する。アテローム性 動脈硬化症は、組織学的には大及び中動脈（大動脈、 冠動脈、頚動脈）の壁における脂質及び他の血液誘導体の沈着（脂質又は繊維脂 質斑）として定義される多元性合併症である。これらの斑は進度に応じて多少な りとも石灰化しており、病変に相関していると考えられ、主にコレステロールエ ステルから構成される脂肪沈着の動脈蓄積に結び付けられる。これらの斑は動脈 壁の肥厚をもたらし、平滑筋の肥厚、泡状細胞の出現及び繊維組織の蓄積を伴う 。アテローム斑は壁から非常に著しく突出しているので狭窄性をもち、重度患者 に突発するアテローム、血栓症又は塞栓症による血管閉塞の原因となる。このた め、コレステロール過剰血症は梗塞、突然死、心臓代償不全、脳血管発作等の非 常に重度の心臓血管病を誘発し得る。 従って、所定の疾病状態で血漿コレステロール濃度を低下させ、更には末梢組 織のレベルでコレステロールの流出（コレステロールの逆輸送）を刺激し、アテ ローム斑の形成に関連して細胞に蓄積したコレステロールを除去することが可能 な治療を実施できることが、特に重要である。コレステロールは血液中で低密度 リポタンパク質（ＬＤＬ）と高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む種々のリポ タンパク質により運搬される。ＬＤＬは肝レベルで合成され、末梢組織にコレス テロールを供給する ことができる。他方、ＨＤＬは末梢組織のレベルでコレステロールを捕獲し、肝 臓に運搬して貯蔵及び／又は分解させる。 現在、脂血症、特に高コレステロール血症は、コレステロールの生合成（ヒド ロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼの阻害剤、スタチン）、胆汁コレ ステロールの捕獲及び除去（キレート剤又は樹脂）、又は分子面でまだ解明され ていない作用モードによる脂肪分解（フィブレート）に作用する化合物を用いて 主に治療されている。従って、この適応症で使用されている広い分類の全医薬（ キレート剤、フィブレート又はスタチン）は、アテローム斑の形成の予防のみに 向けられており、実際にアテロームの治療は目的としていない。冠動脈発作後の アテロームの現在の治療はコレステロールのホメオスタシスに介在するのではな く、外科処置（冠動脈バイパス、血管形成術）であるため、対症療法に過ぎない 。 遺伝子治療によるこれらの疾病の治療の最初のアプローチは国際出願公開第Ｗ Ｏ９４／２５０７３号に記載されている。このアプローチは特に、アポリポタン パク質をコードする遺伝子の直接導入に関する。本発明はリポタンパク異常血症 に関連する疾病の治療のための新規治療アプローチである。本発明はよ り詳細には、コレステロールの異化作用に関与する酵素をコードする遺伝子の導 入に関する。特に、本発明によるＬＣＡＴのインビボ導入及び発現は、循環ＨＤ Ｌ率のみならず、コレステロールの逆輸送に結び付けられるその酵素活性にも働 きかきることができるという利点がある。従って、本発明のアプローチはコレス テロールを肝臓に戻すことを目的とする二重の刺激効果がある。本発明は更に、 コレステロールの代謝酵素をコードする遺伝子を肝レベルで導入発現させ、循環 系で前記酵素を分泌させ、高い効率でその活性を発揮させることが可能なウイル スの使用に関する。後述する実施例では特に、アデノウイルスがレシチン−コレ ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）をコードする遺伝子を投与方 法に応じて細胞毒性作用なしに長期間有効に導入発現できることを示す。 従って、本発明の第１の目的は、レシチン−コレステロールアシルトランスフ ェラーゼ（ＬＣＡＴ）及びその変異体の全部又は一部をコードする少なくとも１ 種の挿入遺伝子を含む欠損組換えウイルスにある。 本発明の別の目的は、リポタンパク異常血症に関連する疾病の治療又は予防用 医薬組成物の製造のための、前記欠損組換え ウイルスの使用である。 ヒトレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）は６５ 〜６９ｋＤの相対分子量をもつ４１６アミノ酸の糖タンパク質である。ＬＣＡＴ をコードする遺伝子及びｃＤＮＡは夫々４２００及び１７４４ｂｐの長さであり 、クローニング及び配列決定されている（ＭｃＬｅａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８３（１９８６）２３３５及びＭｃＬｅａｎら，Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（２３）（１９８６）９３９７）。ＬＣＡＴ はコレステロールのヒドロキシル残基にホスファチジルコリンのアシル基を転移 して遊離コレステロールのエステル化を触媒し、コレステロールのエステルとリ ゾホスファチジルコリンを形成する酵素である。ＬＣＡＴはヒトでは肝臓で特異 的に合成され、血漿中に遊離され（６μｇ／ｍｌ）、抗アテローム原性リポタン パク質である高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と結合する。これらの粒子は細胞 中に過剰に存在するコレステロールを受容することができ、その後、ＬＣＡＴに よりエステル化される。コレステロールエステル濃度の高いＨＤＬは肝臓で捕獲 された後、排出される。生物から過剰のコレステロールを排出できるこのメカニ ズムはコレステロールの逆輸送と呼ばれ、アテローム原性の予防に明らかに関係 がある（Ａｎａ Ｊｏｎａｓ ＢＢＡ １０８４（１９９１）２７３及びＪｏｈ ｎｓｏｎら，ＢＢＡ １０８５（１９９１）２０５）。ＬＣＡＴは細胞膜と循環 リポタンパク質の間に遊離コレステロール勾配を生じることにより、このプロセ スで重要な役割を果たすとほぼ確信される。 血漿中のＬＣＡＴ酵素の活性の部分的又は完全な不在による生理的影響は、「 魚眼」症候群（フィッシュアイ病、ＦＥＳ）や一般ＬＣＡＴ欠損症に見られる病 変として現れる。ＦＥＳの臨床症状は不透明角膜と腎障害及び貧血である。後者 ２つの症状は低αリポタンパク血症と血漿トリグリセリド濃度の上昇に結び付け られる。これらの症状は血漿中のＬＣＡＴ活性の生化学的定量によっても検出で きる。一般ＬＣＡＴ欠損症患者ではコレステロールの血漿エステル化活性は検出 できないが、ＦＥＳ特徴をもつ患者ではＬＣＡＴ残留活性が観察される。本発明 によるＬＣＡＴ遺伝子の導入は、心臓血管病の治療のための新規アプローチとな る。本発明によると、この遺伝子をインビボ導入し、ＬＣＡＴを過剰発現させる ことができるため、循環ＨＤＬ率の増加とこれらのＨＤＬの酵素活性の増加とい う両面で、 コレステロール流出に二重の刺激活性作用を発揮することができる。 本発明のウイルスでは、挿入遺伝子は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮ Ａ（ｇＤＮＡ）フラグメントでもよいし、例えばｃＤＮＡに１個以上のイントロ ンを挿入するなどしたハイブリッド構築物でもよい。遺伝子は合成配列でも半合 成配列でもよい。上述のように、遺伝子はＬＣＡＴ又はその変異体の全部又は一 部をコードする遺伝子であり得る。本発明によると、変異体なる用語はＬＣＡＴ の少なくとも１種の生物学的性質をもつ任意の突然変異体、フラグメント又はペ プチドと、ＬＣＡＴの全天然変異体を意味する。これらのフラグメント及び変異 体は当業者に公知の任意の技術により得られ、特に遺伝子及び／又は化学的及び ／又は酵素修飾、又はその生物活性に応じて変異体の選択が可能な発現によるク ローニングを利用できる。遺伝子修飾としては、抑圧、欠失、突然変異等が挙げ られる。 本発明における挿入遺伝子は、ヒトＬＣＡＴの全部又は一部をコードする遺伝 子が好ましい。ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡがより好ましい。 一般に、挿入遺伝子は感染細胞におけるその発現を可能にす る配列も含む。このような配列は、該配列が感染細胞で機能し得るときに挿入遺 伝子の発現に天然に関与する配列であり得る。（他のタンパク質又は合成タンパ ク質の発現に関与する）別の起源の配列でもよい。特に、遺伝子の転写を特異的 又は非特異的に誘導的又は非誘導的に刺激又は抑制する真核もしくはウイルス遺 伝子の配列又は誘導配列が挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノム、又 はウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、特にアデノウイルスのＥ１Ａ ，ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶプロモーター等を挙げ ることができる。真核プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲ Ｔ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミ ン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモーター、治療遺伝 子プロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子型等）、組織特異的プロモー ター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、 平滑筋細胞のαアクチンプロモーター、肝特異的プロモーター、アポＡＩ、アポ ＡＩＩ、ヒトアルブミン等）又は刺激応答プロモーター（ステロイドホルモンレ セプター、レチノイン酸レセプター等）を挙げることができる。更 に、活性化配列、調節配列等を加えてこれらの発現配列を修飾してもよい。また 、挿入遺伝子が発現配列を含まない場合には、このような配列の下流で欠損ウイ ルスのゲノムに挿入してもよい。 更に、挿入遺伝子は一般に標的細胞の分泌経路に合成ポリペプチドを誘導する シグナル配列をコーディング配列の上流に含む。このシグナル配列はＬＣＡＴの 天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能シグナル配列又は人工シグナル配 列でもよい。 本発明によるウイルスは欠損ウイルスであり、即ち標的細胞で自律的に複製で きないウイルスである。従って、一般に本発明の範囲で使用される欠損ウイルス のゲノムは感染細胞で少なくとも該ウイルスの複製に必要な配列を欠失している 。これらの領域は（完全又は部分的に）除去してもよいし、非機能的にしてもよ いし、他の配列、特に挿入遺伝子で置換してもよい。他方、欠損ウイルスはウイ ルス粒子のパッケージングに必要なそのゲノムの配列を保存することが好ましい 。 本発明によるウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は レトロウイルスに由来し得る。好適態様によ ると、ウイルスはアデノウイルスである。 構造と性質が多少異なる種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの 血清型のうちでは、本発明の範囲では２もしくは５型のヒトアデノウイルス（Ａ ｄ２又はＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（国際公開第ＷＯ９４／２６９ １４号参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲で使用可能な動物起源のア デノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭａｖ１，Ｂｅａｒｄら ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリ又はサル（ 例えばＳＡＶ）起源のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは動物起 源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡ Ｖ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］で ある。本発明の範囲ではヒトもしくはイヌ由来のアデノウイルス又は混合アデノ ウイルスを使用するのが好ましい。 好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスはＩＴＲと、パッケージングを可能 にする配列と、有用核酸を含む。より好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲ ノムにおいて少なくともＥ１領域は非機能的である。着目ウイルス遺伝子は当業 者に公知 の任意の技術、特に完全抑圧、置換、部分欠失、又は着目遺伝子への１個以上の 塩基の付加により非機能的にすることができる。このような改変は例えば遺伝子 工学技術又は突然変異誘発物質で処理することにより、（単離したＤＮＡで）イ ンビトロ又はｉｎ ｓｉｔｕで得られる。特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７）、 Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２ ６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（ＷＯ９５／０２６９７）等の他の領 域も改変できる。好適態様によると、本発明によるアデノウイルスはＥ１及びＥ ４領域に欠失を含む。別の好適態様によると、前記アデノウイルスはＥ１領域に 欠失を含み、このレベルにＥ４領域とＬＣＡＴをコードする配列を挿入する（仏 国特許出願第ＦＲ９４ １３３５５号参照）。 本発明による欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術により 作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９ ５，ＥＰ１８５ ５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１ ７）。特に、アデノウイルスと特に有用ＤＮＡ配列をもつプラスミドの相同組換 えにより作製することができる。相同組換えは前記ア デノウイルスとプラスミドを適当な細胞系に同時トラクスフェクション後に生じ る。使用する細胞系は、（ｉ）前記要素により形質転換可能であり、（ｉｉ）好 ましくは組換えの危険を避けるように組み込み形態で欠損アデノウイルスのゲノ ムの部分を相補することが可能な配列を含んでいることが好ましい。細胞系の例 としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノ ムに組込んだ２９３ヒト胎児腎細胞系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ ｌ．３６（１９７７）５９）や、特に国際公開第ＷＯ９４／２６９１４号及びＷ ０９５／０２６９７号に記載されているようなＥ１及びＥ４機能を相補すること が可能な系を挙げることができる。 その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するような慣用分子生物学技 術により回収精製する。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、感染細胞のゲノムに安定且つ部位特異的に 組み込まれる比較的小寸法のＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは細胞 増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。ま た、ヒトの病理に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既にクローニングさ れ、配列及び特性を決定されている。このようなゲノ ムは約４７００塩基を含み、各末端にウイルス複製起点として機能する約１４５ 塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの残余はパッケージング機能を もつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側はウイルス複製とウイルス遺伝子の 発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側はウイルスのキャプシドタン パク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。 ＡＡＶに由来するベクターを遺伝子のインビトロ及びインビボ導入に使用する ことは文献に記載されている（特に国際出願公開第ＷＯ９１／１８０８８号、同 ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第５，１３９， ９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。これらの特許出願はＡＡＶ に由来し、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠失し、有用遺伝子で置換した種々 の構築物と、前記有用遺伝子を（培養細胞に）インビトロ又は（生物に直接）イ ンビボ導入するための前記構築物の使用について記載している。本発明による欠 損組換えＡＡＶは、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）に挟まれた有用核 酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのパッケージング遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ 遺伝子）をもつプラスミドとをヒト補助ウイルス（例えばアデノウイルス）に感 染させた細 胞系に同時トランスフェクトすることにより作製できる。生成した組換えＡＡＶ をその後、慣用技術により精製する。従って、本発明はＡＡＶから誘導される組 換えウイルスであって、そのゲノムがＡＡＶのＩＴＲに挟まれたＬＣＡＴをコー ドする配列を含む組換えウイルスにも関する。本発明は更に、ＡＡＶの２つのＩ ＴＲに挟まれたＬＣＡＴをコードする配列を含むプラスミドにも関する。このよ うなプラスミドは、場合によりリポソームベクター（プソイドウイルス）に組み 込み、ＬＣＡＴの配列を導入するためにそのまま使用できる。 レトロウイルスについては、組換えベクターの構築が文献に広く記載されてお り、特にヨーロッパ特許第４５３２４２号及び同１７８２２０号； Ｂｅｒｎｓ ｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７ （１９８５） ２３５； ＭｃＣｏｒｍ ｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ （１９８５） ６８９等を参照され たい。特に、レトロウイルスは分裂中の細胞に感染する組込みウイルスである。 レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、１つのパッケージング配列と、 ３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルス に由来する組換えベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺 伝子は一般に全部又は一部が欠失しており、有用異種核酸配列で置換されている 。これらのベクターは特にＭｏＭｕＬＶ(「モロニーマウス白血病ウイルス」、 ＭｏＭＬＶとも呼ぶ)、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ （「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「 ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等の種々のレトロウイルスから作 製することができる。 本発明によるＬＣＡＴをコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築す るためには、一般には特にＬＴＲとパッケージング配列と前記コーディング配列 を含むプラスミドを構築した後、プラスミドに欠損レトロウイルス機能をトラン ス付加することが可能な所謂パッケージング細胞系にトランスフェクトするため に使用する。従って、パッケージング系は一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝 子を発現することが可能である。このようなパッケージング系は従来技術に記載 されており、特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣ ＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６号）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９ ／０７１５０号）が挙げられる。更に、組換えレトロウイルスはＬＴＲのレベル に転写活性を抑制するため の修飾を含んでいてもよく、ｇａｇ遺伝子の一部を含む延長パッケージング配列 を含んでもよい（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１ （１９８７） １６ ３９）。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。 本発明は、１種以上の上記のような欠損組換えウイルスを含む医薬組成物にも 関する。このような組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮 下、眼内等の経路で投与するように調合することができる。 好ましくは、本発明による組成物は注射用調合物に医薬的に許容可能なキャリ ヤーを含有する。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液（一塩基リン酸塩 、二塩基リン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグ ネシウム等、又はこれらの塩類の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生 理的血清を加えると注射可能な溶質を構成できる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成 物が挙げられる。 リポタンパク異常血症に関連する疾病の治療に使用するには、本発明による欠 損組換えアデノウイルスは種々の方法、特に静脈注射により投与できる。門脈の レベルに注射するのが好ましい。レトロウイルスについては、場合により新臓器 （ＷＯ９４ ／２４２９８）としてインビボ再移植する目的で感染細胞をエクスビボ利用でき るという利点がある。 注射に使用するウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法 、該当疾病、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明による組 換えウイルスは１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの用量で調合及び投与される。ＡＡ Ｖ及びアデノウイルスでは、１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの用量も使用できる。 ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はビリオン懸濁液の感染能に対応し、 適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に４８時間後の感染細胞のプラー ク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されてい る。 更に、本発明の医薬組成物はアポリポタンパク質をコードする挿入遺伝子を含 む１種以上の欠損組換えアデノウイルスも含んでいてもよい。これらの２種の遺 伝子を組み合わせることにより、ＨＤＬの活性とコレステロールの逆輸送に相乗 効果を発揮することができる。アポリポタンパク質をコードする挿入遺伝子を含 むアデノウイルスの構築については国際公開第ＷＯ９４／２５０７３号に記載さ れている。好ましい組み合わせの１ 例は、本発明によるアデノウイルスとアポリポタンパク質ＡＩ又はアポリポタン パク質ＡＩＶをコードする遺伝子を含むアデノウイルスである。 本発明は特に心筋梗塞、アンギナ、突然死、心臓代償不全、脳血管発作、アテ ローム性動脈硬化症又は再発狭窄症等の心臓血管疾患の分野で、リポタンパク異 常血症に関連する疾病の治療又は予防に非常に有効な新規手段を提供する。より 広義には、本発明のアプローチは各症例でＬＣＡＴの遺伝又は代謝不全を緩和で きる非常に有望な治療手段を提供する。 更に、この治療はヒトだけでなく、ヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコ等）、ウ マ、魚類等の全動物に適用できる。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は非限定 的な例示とみなすべきである。図面の説明 図１ ：プラスミドｐＸＬ２６３９の模式図。図２ ：プラスミドｐＸＬ２６４０の模式図。図３ ：アデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴによるＨｅｐ３Ｂ細胞のトランスフェクシ ョン。Ｈｅｐ３Ｂ細胞にアデノＡｄＣＭＶｈＬＣＡＴ（白四角）又はアデノＡｄ ＣＭＶ βｇａｌ（黒四 角）を感染多重度１０、２５、５０、１００、２５０及び５００で感染させた。 ７２時間後に上清中のＬＣＡＴ活性を測定した。測定は２回行い、各値は平均± 標準偏差を表す。図４ ：感染又は非感染マウスの肝臓から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析 。対照マウス（１）、アデノＡｄＣＭＶ βｇａｌ感染マウス（２）又はアデノ ＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ感染マウス（３）の肝臓から完全ＲＮＡを採取した。Ｒ ＮＡ１０μｇをホルムアルデヒド−１．２％アガロース電気泳動により分離し、 ナイロン膜に移してヒトＬＣＡＴ及びマウスアポＥの各プローブとハイブリダイ ズさせた。図５Ａ及び５Ｂ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入が血漿中の総コレステロール濃度 及びＨＤＬコレステロール濃度に及ぼす効果。対照マウス（白四角）又はヒトア ポリポタンパク質Ａ−Ｉを発現するトランスジェニックマウスに１×１０⁹ｐｆ ｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（白丸）もしくは１×１０⁹ｐｆｕのアデノ ＡｄＣＭＶ βｇａｌ（黒四角）を注射後の血漿中の総コレステロール濃度及び ＨＤＬコレステロール濃度（平均±標準偏差）。＊：アデノＡｄＣＭＶ βｇａ ｌを感染させたマウスとの差Ｐ＜０．０００１。図６ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入が血漿のヒトアポＡ−Ｉ濃度に及ぼす効果。 対照マウス（白四角）又はヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉを発現するトランスジ ェニックマウスに１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（白丸）も しくは１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ βｇａｌ（黒四角）を注射後の血 漿中のヒトアポＡ−Ｉ濃度（平均±標準偏差）。＊：アデノＡｄＣＭＶ βｇａ ｌを感染させたマウスとの差Ｐ＜０．０００１。図７ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入がコレステロールのリポタンパク質分布に及 ぼす効果。５×１０⁸ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（黒四角）もしく は１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（黒丸）の注射から５日後 のマウス又は対照マウス（白四角）から血漿を採取した。血漿をゲル濾過クロマ トグラフィーによりＳｕｐｅｒｏｓｅ−６カラムで分離し、各溶出フラクション 中のコレステロールを測定する。図８ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入がＨＤＬ粒子の寸法に及ぼす効果。１×１０⁹ ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴの注射から５日後のマウス（実線）又 は対照マウス（破線）から血漿を採取した。血漿をポリアクリルアミドゲル（勾 配４→２ ０％）上で分離し、ウェスタンブロットにより展開した後、ヒト抗アポＡ−Ｉ特 異抗体によりヒトアポＡ−Ｉを検出する。その後、ブロットをデンシトメーター によりスキャンする。図９ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入がアポＡ−Ｉを含む粒子の移動度に及ぼす効 果。１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ βｇａｌ（１）、５×１０⁸ｐｆｕの アデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（２）又は１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ ｈＬＣＡＴ（３）の注射から５日後にマウスから血漿を採取した。血漿２μｌ を使用してアガロースゲル電気泳動によりＨＤＬを分離した後、脂質をスーダン ブラックで着色する。図１０ ：ヒトＬＣＡＴの遺伝子の導入が血清のコレステロール流出促進能に及ぼ す効果。１×１０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶｈＬＣＡＴ（白丸）もしくは１× １０⁹ｐｆｕのアデノＡｄＣＭＶ βｇａｌ（黒四角）の注射から５日後のマウ ス又は対照マウス（白四角）から血漿を採取した。２．５％に希釈した血清を、 放射性コレステロールを予め添加しておいたＦｕ５Ａｈ細胞と共にインキュベー ション後に培地と細胞中の放射能を測定することによりコレステロール流出を計 算する。＊：対照マウスとの差Ｐ＜０．０１。＊＊：対照マウス又はアデノＡｄ ＣＭ Ｖ βｇａｌを感染させたマウスとの差Ｐ＜０．０００５。一般分子生物学技術 プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離 、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離 精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中 のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子 生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載 されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，１９８２； Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ.ら(編),“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ型のプラスミド及びＭ１３系ファージは市販品である（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ−ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。 連結については、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電 気泳動によりその寸法に応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホル ム混合物で抽出し、エタノール沈降させた後、製造業者の指示に従ってファージ Ｔ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする。 付着５’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤ ＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントにより実施できる。付着３’末端の 破壊は、ファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のポリメラーゼＤＮＡを製造業者の指 示に従って使用することにより実施される。付着５’末端の破壊はヌクレアーゼ Ｓ１処理により実施される。 合成オリゴヌクレオチドによるインビトロ突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍ から市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９〜８７６４］により開発 された方法に従って実施することができる。 所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０〜１３５４； Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ． Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７） ３３５〜３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマルサ イクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従っ て使用することにより実施することができる。 ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより市販されているキットを 使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３〜５４６７］により開発された方法により 実施することができる。実施例 実施例１：ヒトレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ｈＬＣＡ Ｔ）の遺伝子を含む欠損組換えアデノウイルスゲノムの構築： 上述のように、特に挿入したい遺伝子をもつプラスミドとアデノウイルスを適 当な細胞系に同時トランスフェクション後に相同組換えさせて欠損組換えアデノ ウイルスを作製した。Ａ．ヒトＬＣＡＴの遺伝子をもつプラスミドの作製： １．プラスミドｐＸＬ２６１６の構築 プラスミドｐＸＬ２６１６はヒトレシチン−コレステロールアシルトランスフ ェラーゼをコードするｃＤＮＡを含む。 このプラスミドは次のように構築した。 ＨｅｐＧ２細胞の完全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＣＡＴのｃＤＮＡに 対応するＤＮＡフラグメントを単離した（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 合成キット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ｃＤＮＡはヘキサヌクレオチドプローブを 用いてポリアデニル化ＲＮＡの逆転写により作製した。次に、ＬＣＡＴの配列の ５’ＣｌａＩ部位と３’ＳａｌＩ部位を付加することが可能なヒトＬＣＡＴの配 列の特異的オリゴヌクレオチドＳｑ５２０９：ＣＣＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＡＡＴ ＡＡＡ （配列番号１）及びＳｑ５２８７:ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＧＡＧ（配列番号２）（Ｍａｃ Ｌ ｅａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３，１９８６）を用い てこれらのｃＤＮＡでＰＣＲ反応を行った。得られた１７５０ｂｐフラグ メントをプラスミドｐＣＲ−ＩＩ（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ）にクローニングし、その配列を確認した。得られたプラスミドをｐＸＬ２ ６１６と命名した。 ２．プラスミドｐＸＬ２６３９（図１）及びｐＸＬ２６４０（図２）の構築 プラスミドｐＸＬ２６３９及びｐＸＬ２６４０は夫々ＣＭＶの初期プロモータ ーとＲＳＶウイルスのＬＴＲプロモーターの制御下にヒトＬＣＡＴのｃＤＮＡを 含む。 これらのプラスミドは、 −国際公開第ＷＯ９４／２５０７３号に記載されているプラスミドｐＸＬ２３７ ５（ＣＭＶプロモーター）及びｐＸＬ２３７６（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター） をＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化してアポＡ−ＩのｃＤＮＡを切り出し、次いで −予め消化しておいた上記プラスミドにヒトＬＣＡＴのｃＤＮＡを含むプラスミ ドｐＸＬ２６１６のＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメントを挿入することにより構築 した。Ｂ．ヒトレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼのインビトロ発現 こうして構築したベクター（ｐＸＬ２６３９及びｐＸＬ２６ ４０）を２９３細胞に一過性トランスフェクション後に酵素の発現と機能性を試 験した。 Ｗｉｌｇｅｒら，Ｃｅｌｌ，１１（１９７７）２２３の方法に従ってリン酸カ ルシウム−ＤＮＡ複合体によりＤＮＡを導入した。 トランスフェクションから６０時間後に、ＣｈｅｎとＡｌｂｅｒｓ，ＪＬＲ， ２３（１９８２）６８０の方法に従って細胞上清でＬＣＡＴ活性を測定した。測 定は、アポＡ−Ｉ、１４Ｃコレステロール及びホスファチジルコリンを０.８： １２.５：２５０のモル比で３０分間３７℃でインキュベートすることより調製 したプロテオリポソームを外来基質として使用することにより実施した。活性は 、基質を血漿又は培養上清４μｌと共に３７℃で２時間インキュベーション後に １４Ｃコレステロールから１４Ｃコレステロールエステルへの転化を測定するこ とにより決定する。形成されたエステルを石油エーテル−ジエチルエーテル−酢 酸の７６：２０：１混合物によりシリカプレート上で薄層クロマトグラフィー分 離し、液体シンチレーションスペクトル分析により放射能を測定する。 得られた結果は、トランスフェクトした２９３細胞により分 泌されるヒトＬＣＡＴが機能的であることを示す。Ｃ．組換えアデノウイルスの作製 次に、Ａで作製したプラスミドを直鎖化し、アデノウイルスのＥ１領域（Ｅ１ Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランス付加するヘルパー細胞（２９ ３系）に同時トランスフェクトし、欠損アデノウイルスベクターとの組換えを行 った。 アデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＬＣＡＴは、酵素ＸｍｎＩにより直鎖化したプラ スミドｐＸＬ２６３９とＣｌａＩにより直鎖化したアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶ βｇａｌをリン酸カルシウムの存在下で２９３系に同時トランスフェクトして相 同組換えさせるというプロトコールに従い、アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａ ｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅ ｓｔ ９０（１９９２）６２６）とプラスミドｐＸＬ２６３９の相同組換えによ り得た。こうして生成した組換えアデノウイルスをプレート上で精製して選択す る。単離後、組換えアデノウイルスを２９３細胞系で増幅し、約１０¹⁰ｐｆｕ／ ｍｌの力価をもつ非精製欠損組換えアデノウイルスを含む培養上清を得る。 公知技術(特にＧｒａｈａｍら,Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２(１ ９７３)４５６参照)に従ってウイルス粒子を塩化セシウム勾配上で遠心分離によ り精製する。アデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＬＣＡＴを２０％グリセロール中で− ８０℃で保存する。 同一プロトコールをプラスミドｐＸＬ２６４０で繰り返し、組換えアデノウイ ルスＡｄ．ＲＳＶＬＣＡＴを得た。実施例２：欠損組換えアデノウイルスに媒介されるヒトＬＣＡＴの遺伝子のイン ビトロ発現 Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝細胞系）に組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶ−ｈＬＣ ＡＴを１０、２５、５０、１００、２５０及び５００のＭＯＩで感染させた後に 酵素の発現及び機能性を試験した。組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶβｇａｌを 対照として使用した。ＣｈｅｎとＡｌｂｅｒｓ，ＪＬＲ，２３（１９８２）６８ ０の方法に従い、感染から７２時間後に細胞上清上でＬＣＡＴ活性（培地１００ μｌ中に１時間に生産されるコレステロールエステルの総量）を測定した。結果 （図３）は、培地に分泌されるヒトＬＣＡＴが機能的であり、酵素の発現レベル が細胞中のウイルス濃度に依存することを示す。実施例３：欠損組換えアデノウイルスに媒介されるヒトＬＣＡＴの遺伝子のイン ビボ発現 ヒトアポＡ−ＩのトランスジェニックＣ５７Ｂ１／６マウスの尾静脈に組換え アデノウイルスＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴ（５×１０⁸又は１×１０⁹ｐｆｕ）、Ａ ｄＣＭＶ−βｇａｌ（１×１０⁹ｐｆｕ）又は非ウイルス溶液を注射して感染さ せた。ＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスの血漿中には注射から５日後 に非常に高レベルのＬＣＡＴ活性（３２６６±２９２〜９０６８±８１２ｎｍｏ ｌ／ｍｌ／ｈ）が検出されたが、非感染マウス又はＡｄＣＭＶ−βｇａｌを感染 させたマウスで観察されたレベルはマウスの血漿の基礎ＬＣＡＴ活性に対応する 。 ＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスの肝臓のＲＮＡでノーザンブロッ トを実施した処、ヒトＬＣＡＴの完全ｃＤＮＡに対応するプローブとハイブリダ イズする単一種のメッセンジャーＲＮＡの発現を検出することができたが、対照 マウスの肝臓のＲＮＡで実施したノーザンブロットではハイブリダイゼーション は全く検出されなかった（図４）。実施例４：ヒトＬＣＡＴの発現が血漿中のリポタンパク質及びアポリポタンパク 質濃度に及ぼす効果 ヒトＬＣＡＴの一過性発現は循環脂質及びヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｈ アポＡ−Ｉ）濃度の有意変化をもたらした。 表Ｉに要約するように、感染から５日後に最大の変化が観察された。 １×１０⁹ｐｆｕのＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスの血漿中ＨＤ Ｌコレステロール及び総コレステロール（ＴＣ）濃度は、対照マウスで観察され た濃度の夫々７倍及び６倍であった（図５ａ及び５ｂ）。これらの変化に加え、 エステル化コレステロール（ＥＣ）及び遊離コレステロール（ＦＣ）は対照マウ スで得られた濃度の夫々８倍及び２．５倍に増加している。血漿中ＥＣ濃度が増 加すると、ＨＤＬフラクション中のＣＥ／ＴＣ比が増加する。１×１０⁹ｐｆｕ のＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスのヒトアポＡ−Ｉ濃度は、対照マ ウスに比較して２．５倍の増加を示す（図６）。 実施例５：ヒトＬＣＡＴの発現がリポタンパク質中のコレステロールの分配、Ｈ ＤＬの寸法及び電気泳動移動度に及ぼす効果 ゲル濾過分析クロマトグラフィーによりマウスの血漿プールからリポタンパク 質フラクション中にコレステロールを分配させた（図７）。溶出フラクション中 のＴＣ及びヒトアポＡ−Ｉ濃度を測定した。これらの分析によると、１×１０⁹ ｐｆｕのＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスでは対照マウスに比較して ＨＤＬフラクション中のコレステロールの多量の蓄積とＨＤＬの寸法の増加が検 出される。ヒトアポＡ−ＩはＨＤＬの寸法の粒子に結合していることが認められ る。 ヒトアポＡ−ＩのトランスジェニックマウスにおけるアポＡ−Ｉを含むリポタ ンパク質の寸法の分布はバイモーダルであり、９．４ｎｍと１１ｎｍの寸法のピ ークがある。対照マウスではこの同一分布が保たれるが、ＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡ Ｔを感染させたマウスでは分布が変化する。１×１０⁹ｐｆｕのＡｄＣＭＶ−ｈ ＬＣＡＴを感染させたマウスでは、小さいほうのピークが消え、より大きい１３ ．３及び１４．２ｎｍの２つのピークが出現する（図８）。 血漿リポタンパク質を非変性アガロースゲルで電気泳動によ り分離した後、脂質を検出した。図９に示すように、ＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを 感染させたマウスの血漿にはプレα移動度をもつＨＤＬが検出され、ＨＤＬの寸 法だけでなくＨＤＬの表面電荷も変化していることが認められる。 要約すると、ヒトアポＡ−ＩのトランスジェニックマウスにおけるヒトＬＣＡ Ｔの強い一過性発現は、ＨＤＬコレステロール及びヒトアポＡ−Ｉ濃度の増加と ＨＤＬの寸法及び電荷の増加をもたらし、アテローム原性の低いリポタンパク質 特徴を形成する。実施例６：ヒトＬＣＡＴの発現が細胞コレステロールの流出に及ぼす効果 Ｆｕ５ＡＨラットの肝癌細胞を感染又は非感染マウスの血漿プールと共にイン キュベーション後に細胞コレステロールの流出を測定した。図１０は、ＡｄＣＭ Ｖ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスの血漿ではＡｄＣＭＶ βｇａｌを感染させ たマウスの血漿に比較して６５％の流出の増加が得られることを示す。この増加 はＡｄＣＭＶ−ｈＬＣＡＴを感染させたマウスにおける高濃度のヒトアポＡ−Ｉ 及びＨＤＬ−コレステロールに相関していることが明らかである。これらの結果 はヒトＬＣＡＴの 強い発現によりコレステロールの逆輸送の効果を高めるのに有利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラタ−マイユ，マルテイーヌ フランス国、エフ−94220・シヤラントン −ル−ポン、リユ・ドウ・パリ、141 (72)発明者 セギユレ，サンドリーヌ フランス国、エフ−78180・モンテイニー −ル−ブルトヌー、リユ・シヤルル−リ ネ、13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）又はその 変異体の全部又は一部をコードする少なくとも１種の挿入遺伝子を含む欠損組換 えウイルス。 ２．感染細胞におけるその複製に必要なそのゲノムの領域を欠失していることを 特徴とする請求項１に記載のウイルス。 ３．好ましくはＡｄ５又はＡｄ２型のアデノウイルスであることを特徴とする請 求項１又は２に記載のウイルス。 ４．動物、好ましくはイヌ起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求項 １又は２に記載のウイルス。 ５．挿入遺伝子がヒトＬＣＡＴ又はその変異体の全部又は一部をコードすること を特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のウイルス。 ６．挿入遺伝子がヒトＬＣＡＴをコードすることを特徴とする請求項５に記載の ウイルス。 ７．挿入遺伝子がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一 項に記載のウイルス。 ８．挿入遺伝子がｇＤＮＡであることを特徴とする請求項１か ら６のいずれか一項に記載のウイルス。 ９．挿入遺伝子が感染細胞におけるその発現を可能にする配列を含むことを特徴 とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス。 １０．挿入遺伝子が標的細胞の分泌経路に合成ポリペプチドを誘導するシグナル 配列を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のウイルス。 １１．Ｅ１領域の全部又は一部の欠失を含むことを特徴とする請求項３又は４に 記載のアデノウイルス。 １２．更にＥ４領域の全部又は一部の欠失を含むことを特徴とする請求項１１に 記載のアデノウイルス。 １３．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることを特徴とする請求項１又は２に 記載のウイルス。 １４．そのゲノムが２個のＩＴＲに挟まれたレシチン−コレステロールアシルト ランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）又はその変異体の全部又は一部をコードする遺伝 子を含むことを特徴とする請求項１３に記載のウイルス。 １５．レトロウイルスであることを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス 。 １６．リポタンパク異常血症に関連する疾病の治療又は予防用医薬組成物の製造 のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載のウイルスの使用。 １７．アテローム性動脈硬化症及び／又は再発狭窄症の治療用医薬組成物の製造 のための請求項１６に記載の使用。 １８．請求項１から１５のいずれか一項に記載の１種以上の欠損組換えウイルス を含む医薬組成物。 １９．注射可能な形態であり、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌのアデノウイルスを 含むことを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。 ２０．アポリポタンパク質をコードする１種以上の欠損組換えアデノウイルスを 更に含むことを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成物。