CZ286897A3 - Recombinant viruses expriming lecithincholesterol-acyltransferase and their use in gene therapy - Google Patents

Recombinant viruses expriming lecithincholesterol-acyltransferase and their use in gene therapy Download PDF

Info

Publication number
CZ286897A3
CZ286897A3 CZ972868A CZ286897A CZ286897A3 CZ 286897 A3 CZ286897 A3 CZ 286897A3 CZ 972868 A CZ972868 A CZ 972868A CZ 286897 A CZ286897 A CZ 286897A CZ 286897 A3 CZ286897 A3 CZ 286897A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lcat
virus
adenovirus
acyltransferase
cholesterol
Prior art date
Application number
CZ972868A
Other languages
English (en)
Inventor
Patrice Denefle
Nicolas Duverger
Mahieu Martine Latta
Sandrine Seguret
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of CZ286897A3 publication Critical patent/CZ286897A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových rekombinantních virů, jejich přípravy a jejich použití v genové terapii pro přenos a expresi in vivo požadovaných genů. V rámci přesnějšího vymezení se vynález týká nových rekombinantních virů, které obsahují vložený gen kódující celek nebo část lecitincholesterol-acyltransferázy (LCAT) nebo její variantu. Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic, které obsahují uvedené rekombinantní viry. Vynález se zejména týká defektních rekombinantních virů a jejich použití pro prevenci nebo léčení patologií spojených s dyslipoproteinemiemi, které jsou známé pro jejich vážné následky v kardiovaskulární nebo neurologické úrovni.
Dosavadní stav techniky
Dyslipoproteinemie jsou poruchami metabolismu lipoproteinů zodpovědných za transport lipidů, jakými jsou cholesterol a triglyceridy, do krve a do periferních tekutin. Uvedené poruchy vedou k důležitým patologiím, sdruženým s hypercholesterolemií resp. hypertriglyceridemií, mezi které patří tejména ateroskleróza. Ateroskleróza je komplexní polygenová nemoc, která je definována v histologické rovině depozity (lipidové nebo fibrolipidové pláty) lipidů a dalších krevních derivátů na stěně velkých tepen (srdečnice, koronární tepny, karotida). Tyto pláty,v průběhu postupující nemoci více či méně kalcifikované, mohou být spojeny s lézemi a mají za následek akumulaci mastných depozitů tvořených hlavně estery cholesterolu v tepnách. Tyto pláty vedou ke zhutnění tepenné stěny, hypertrofii hladkých svalů, výskytu pěnitých buněk a k akumulaci vláknité tkáně. Ateromatózní plát tvoří na tepenné stěně reliéf, v důsledku čehož má stenozní charakter a je takto zodpovědný za vaskulární okluze ateromy, trombózu nebo embolii, ke kterým dochází u pacientů, kteří jsou nemocí postiženi nejvíce.
Hypercholesterolemie mohou tedy vést k velmi vážným kardiovaskulárním patologiím, jakými jsou infakt, náhlá smrt, srdeční selhání, cerebro-vaskulární příhody, a podobně.
Je tedy velmi důležití mít k dispozici lečebné postupy umožňující v některých patologických situacích snížit hladinu cholesterolu v plasmě nebo dokonce stimulovat odvod cholesterolu (transport cholesterolu v opačném směru) v úrovni periferních tkání za účelem odlehčení buněk, které naakumulovaly cholesterol v rámci tvorby ateromatózního plátu. Cholesterol je v krvi tansportován různými lipoproteiny, zastoupenými nízkohustotními lipoproteiny (LDL) a vysokohustotními lipoproteiny (HDL). Nízkohustotní lipoproteiny jsou syntetizovány v úrovni jater a umožňují zásobovat periferní tkáně cholesterolem. Naopak vysokohustní lipoproteiny zachycují cholesterol v úrovni periferních tkání a transportují ho směrem k játrům, kde je ukládán nebo/a rozkládán.
V současné době se dyslipidemie a zejména hypercholesterolemie v podstatě léčí za použití sloučenin, které působí na biosyntézu cholesterolu (inhibitory hydroxymethylglutarylkoenzym A-reduktázy, statiny) nebo na zachycování a eliminaci žlučového cholesterolu (sekvestrační činidla nebo pryskyřice) anebo na lipolýzu mechanismem účinku, který bude třeba objasnit v molekulární rovině (fibráty). Všechny početné skupiny léčiv, které byly až dosud použity v rámci výše specifikované indikace (sekvestrační činidla, fibráty nebo statiny) se takto soustřeďují pouze na preventivní aspekt tvorby ateromatózních plátů a nikoliv na léčení ateromů. Současná léčení ateromu po koronární příhodě jsou pouze paliativní, poněvadž nepůsobí na homeostázu cholesterolu a jsou tvořena chirurgickými zákroky (koronární by-pass, angioplastie).
První pokus o léčení uvedených patologií genovou terapií byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO94/25 073. Tento způsob genetického léčení spočívá zejména v přímém přenosu genů kódujících apolipoproteiny.
Vynález představuje nový terapeutický přístup k léčení patologií spojených s dyslipoproteinemiemi.
Podstata vynálezu
Vynález zejména spočívá v přenosu genů kódujících enzymy implikované při katabolismu cholesterolu. Přenos a exprese in vivo enzymu LCAT podle vynálezu umožňuje výhodně působit nejen na hladinu cirkulujících vysokohustotních lipo proteinů, nýbrž také na jejich enzymatickou aktivitu spojenou s opačným transportem cholesterolu. Tento přístup má tedy dvojí stimulační účinek zaměřený na opětovné přivedení cholesterolu do jater. Vynález rovněž spočívá na použití virů, které umožňují přenos a expresi genů kódujících enzymy metabolismu cholesterolu v úrovni jater a vylučování uvedených enzymů do oběhového systému, kde tyto enzymy realizují s vysokou účinností svojí aktivitu. Dále zařazené příklady ukazují, že zejména adenoviry jsou schopné v závislosti na způsobu podání, přenášet a exprimovat velmi účinně, po významnou dobu a bez cytopathologického účinku gen kódují cí lecitincholesterol-acyltransferázu (LCAT).
Prvním předmětem vynálezu je tedy defektní rekombinantní vir obsahující alespoň vložený gen kódující celek nebo část lecitincholesterol-acyltransferázy (LCAT) nebo její varianty.
Předmětem vynálezu je rovněž použití takového defektního rekombinantního viru pro přípravu farmaceutické kompozi ce určené pro léčení nebo prevenci patologií spojených s dys lipoproteinemiemi.
Lidská lecitincholesterol-acyltransferáza (LCAT) je glykosylovaným proteinem se 416 aminokyselinami majícím relativní molekulovou hmotnost 65 až 69 kD. Jak gen, tak i DNAc kódující enzym LCAT, které mají délku 4200 resp. 1744 párů bází, již byly klonovány i sekvencovány (Mc Lean a kol., Proč.Nati.Acad Sci.83 (1986) 2335 a Mc Lean a kol., Nucleic Acids Res.14(23) (1986) 9397). Acyltransferáza LCAT je enzymem, který katalyzuje esterifikaci volného cholesterolu přenosem acylové skupiny z fosfatidylcholinu na hydroxylový zbytek cholesterolu za vzniku esteru cholesterolu a lysofosfatidylcholinu. Tento enzym je u člověka syntetizován specificky v játrech a je uvolňován do plasmy (6/Ug/ml), kde je sdružen s vysokohustotními lipoproteiny (HDL), které bývají označované jako antiaterogenní lipoproteiny.
Tyto částice vysokohustotnícn lipoproteinů mají schopnost přijímat cholesterol nacházející se v buňkách v přebytku, který je potom esterifikován. Vysokohustotní lipoproteiny obohacené estery cholesterolu jsou zachycovány játry, kde jsou potom eliminovány. Tento mechanismus, který umožňuje odstranění nadbytečného cholesterolu z organismu, bývá označován jako obrácený transport cholesterolu, je jednoznačně implikován při prevenci aterogeneze (Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 a Johnos a kol. BBA 1085 (1991)205). Acyltransferáza LCAT, která vytváří gradient volného cholesterolu mezi plasmovými membránami a cirkulujícími lipoproteiny, hraje velmi pravděpodobně hlavní úlohu při uvedeném procesu.
Fyziologické důsledky částečné nebo úplné absence aktivity acyltransferázy LCAT v plasmě jsou ilustrovány pathologickými změnami pozorovanými v rámci syndromu rybí oko (Fish Bye Disease, FES) a v rámci klasické nedostatečnosti acyltransferázy LCAT. Klinickými symptomy syndromu rybího oka jsou opacita rohovky, jakož i poškození ledvin a anemie. Tyto dva syndromy jsou spojené s hypoalfalipoproteinemií a se zvýšením plasmových triglyceridů. Mohou být rozlišeny biochemickým stanovením'aktivity acyltransferázy LCAT v plasmě. U pacienta trpícího klasickou nedostatečnost LCAT nelze zjistit jakoukoliv esterifikační aktivitu cholesterolu v plasmě, zatímco u pacienta vykazujícího profil syndromu rybího oka lze pozorovat reziduální aktivitu acyltransferázy LCAT.
Přenos genu acyltransferázy LCAT podle vynálezu představuje nový přístup k léčení kardiovaskulárních patologií. Schopnost přenášet tento gen a superexprimovat acyltransferázu in vivo umožňuje v rámci vynálezu indukovat dvojí stimulační aktivitu na odvádění cholesterolu, týkající se jednak zvýšení hladiny cirkulujících vysokohustotních lipoproteinů a jednak zvýšení enzymatické aktivity uvedených vysokohustotních lipoproteinů.
Ve viru podle vynálezu může být vloženým genem fragment komplementární DNA (DNAc), genomové DNA (DNAg) nebo hybridní konstrukce tvořená například DNAc, do které by byly vloženy jeden nebo několik intronů. Rovněž se může jednat o syntetické nebo polosyntetické sekvence.
Jak již bylo uvedeno výše, může se jednat o gen kódují cí celek nebo část acyltransferázy LCAT nebo její varianty.
V rámci tohoto vynálezu se výrazem její varianta rozumí každý mutant, fragment nebo peptid mající alespoň část biologické vlastnosti acyltransferázy LCAT, jakož i všechny přirozené varianty acyltransferázy LCAT. Tyto fragmenty a varianty mohou být získány libovolnou o sobě známou technikou a zejména genetickými nebo/a chemickými nebo/a enzymatickými modifikacemi anebo také klonováním expresí umožňujícím vybírat varianty podle jejich biologické aktivity. Genetické modifikace zahrnují suprese, delece, mutace a podobně.
Vloženým genem v rámci vynálezu je výhodně gen kódující celek nebo část lidské acyltransferázy LCAT. Výhodně se jedná o DNAc nebo DNAg.
Obecně vložený gen obsahuje rovněž sekvence umožňující jeho expresi v infikované buňce. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvedeného genu v případě, že jsou tyto sekvence schopné této funkce v infikované buňce. Může se jednat o sekvence různého původu (zodpovědné za expresi ostatních proteinů nebo dokonce o syntetické sekvence). Zejména se může jednat o sekvence eukaryontních nebo virálních genů nebo o odvozené sekvence stimulující nebo potlačující transcripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. Jako příklad lze uvést, že se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována nebo z genomu viru a zejména o promotory genů El A adenovirů nebo o promotor viru CMV nebo viru LTR-RSV, a podobně. Jako příklady eukaryontních promotorů lze uvést zejména ubikvitární promoto ry (HPRT, vimentin, alfa-aktin, tubulin, atd.), promotory intermediárních vláken (desmin, neurofilamenty, keratin,
GFAP, atd.), promotory terapeutických genů (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.), specifické tkáňové promotory (pyruvatkináza, villin, promotor intestinálního vazebného proteinu mastných kyselin, promotor alfa-aktinu buněk hladkého svalu, promotory specifické pro játra, Apo AI, Apo AII, lidský albumin, atd) nebo také promotory s odezvou na stimul (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinoové, atd.).
Kromě toho mohou být tyto expresní sekvence modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí a dalších sekvencí. V případě, že vložený gen neobsahuje expresní sekvence, potom může být vložen do genomu defektního viru až za takovou sekvenci.
Jinak vloženy gen obecně obsahuje před kódující sekvencí signální sekvenci regulující syntetizovaný polypeptid do sekrekčních cest cílové buňky. Touto signální sekvencí může být přirozená signální sekvence acyltransferázy LCAT, avšak může se rovněž jednat o libovolnou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci.
Ί
Viry podle vynálezu jsou defektními viry, to znamená viry, které nejsou schopné replikovat se autonomním způsobem v cílové buňce. Obecně je genom defektních virů použitých v rámci vynálezu tedy zbaven alespoň sekvencí nezbytných pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být bu5 eliminovány (úplně nebo částečně), nebo učiněny nefunkčními, nebo nahrazeny jinými sekvencemi a zejména nahrazeny vloženým genem. Nicméně výhodně si defektní vir zachová ty sekvence jeho genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.
Vir podle vynálezu může být odvozen od adenoviru, adeno sdruženého viru (AAV) nebo od retroviru. V rámci výhodné formy provedení vynálezu se jedná o adenovir.
Existují různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Z těchto serotypů se v rámci vynálezu výhodně používají lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (o tom viz WO94/26914).
Z adenoviru zvířecího původu použitelných v rámci vynálezu lze uvést adenoviry psího, bovinního, murinního (například Mav1, Beard a kol., Virology 75 (1990)81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (například SAV). Výhodné se používá adenovir zvířecího původu, kterým je psí adenovir, výhodně adenovir CAV2 /kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR800), například/. Výhodně se v rámci vynálezu používají adenoviry lidského nebo psího anebo smíšeného původu.
Výhodně defektní adenoviry podle vynálezu obsahují sekvence obrácené repetice ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a zainteresovanou nukleovou kyselinu. Ještě výhodněji je alespoň oblast E1 v genomu adenoviru podle vynálezu nefunkční. Uvažovaný virální gen může být učiněn nefunkčním libovolnou o sobě známou technikou a zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika bází v uvažovaném genu nebo v uvažovaných genech. Takové modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například za použití technik genového inženýství nebo také působením mutagenních činidel. Modifikovány mohou být také další oblasti a to zejména oblasti E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). V rámci výhodné formy provedení obsahuje adenovir podle vynálezu deleci v oblastech E1 a E4. V rámci jiného výhodného provedení vynálezu obsahuje uvedený adenovir deleci v oblasti E1, v jejíž úrovni jsou vloženy oblast E4 a sekvence kódující acyltransferátu LCAT (viz FR94 1 3355 ) .
Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny libovolnou o sobě známou technikou (Levrero a kol., Gene 101 (1991)195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Tyto adenoviry mohou být zejména připraveny homologní rekombinací mezi adenovirem a plasmidem nesoucím mezi jiným i zainteresovanou sekvenci DNA. Uvedená homologní rekombinace se realizuje po kotransfekci uvedeného adenoviru a plasmidu do příslušné buněčné řady. Použitá buněčná řada musí výhodně 1) být transformovatelná uvedenými prvky, 2) obsahovat sekvence schopné komplementovat část genomu defekt ního adenoviru, výhodně v integrované formě, aby se zamezilo rekombinačním rizikům. Jako příklad takové řady je možné uvést lidskou emryonální renální řadu 293 (Graham a kol., J. Gen.Virol.36(1977)59), která obsahuje v integrované formě ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %), nebo buněčné řady, které jsou schopné komplementovat funkce E1 a E4 a které jsou popsané zejména v mezinárodních patentových přihláškách WO94/26914 a WO95/02697.
Multiplikované adenoviry se potom izolují a purifikují klasickými technikami molekulární biologie, jak to bude ilustrováno v dále zařazených příkladech.
Pokud jde o adeno-přidružené viry (AAV), jedná se o viry s DNA mající relativně malou velikost, které se integru jí do genomu buněk, které infikují, stabilním a místně specifickým způsobem. Tyto adeno-přidružené viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukovaly jakýkoliv účinek mající vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Není jinak známo, že by tyto adeno-přidružené viry byly implikovány v některé z lidských patologiích. Genom adeno-přidružených virů již byl klonován, sekvencován a charakterizován. Tento genom obsahuje asi 4700 bází a má na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) s asi 145 bázemi, která slouží jako počátek replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen na dvě hlavní oblasti nesoucí enkapsidační funkce: levá část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný ve virální replikaci a expresi virálních genů, a pravá část genomu, která obsahuje gen cap kódující proteiny kapsidy viru.
Použití vektorů odvozených od adeno-přidružených virů AW) pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO91/18088, WO93/09239, US 4,797,368,
US 5,139,941, EP 488 528). V těchto patentových dokumentech se popisují různé konstrukce odvozené od adeno-přidružených virů, ve kterých jsou geny rep nebo/a cap eliminovány delecí a nahrazeny zainteresovaným genem, a jejich použití pro přenos in vitro (do buněčných kultur) nebo in vivo (přímo do organismu) uvedeného zainteresovaného genu. Defektní rekombinantní adeno-přidružené viry podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí plasmidu obsahujícího zainteresovanou nukleo vou sekvenci lemovanou dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) adeno-přidruženého viru a plasmidu nesoucího enkapsidační geny (geny rep a cap) adeno-přidruženého viru do buněčné řady infikované lidským pomocným virem (například adenovirem). Produkované rekombinantní adeno-přidružené viry se potom purifikují klasickými technikami.
Vynález se tedy rovněž týká rekombinantního viru odvozeného od adeno-přidružených virů, jehož genom obsahuje sekvenci kódující acyltransferázu LCAT lemovanou sekvencemi obrácené repetice ITR adeno-přidružených virů.
Vynález se rovněž týká plasmidu obsahujícího sekvenci kódující acyltransferázu LCAT lemovanou dvěma sekvencemi obrácené repetice ITR adeno-přidruženého viru. Pro přenos sekvence acyltransferázy může být takový plasmid použit jako takový anebo případně inkorporovaný do liposomálního vektoru (pseudovir).
Pokud jde o retroviry, byla konstrukce vektorů na bázi retrovirů obsáhle popsána v literatuře: viz zejména EP 453242, EP178220, Bernstein a kol·., Genet.Eng.7(1985)235, McCormick, BioTechnology 3 (1985)689, atd.. Retroviry jsou integrativními viry infikujícími buňky ve stádiu dělení. Genom retrovirů v podstatě obsahuje dvě sekvence LTR, enkapsidaění sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů jsou geny gag, pol a env obvykle zcela nebo částečně eliminovány delecí a nahrazeny sekvencí zainteresované heterologní nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být realizovány z různých typů retrovirů, jakými jsou zejména MoMuLV (vir Moloneyovy murinní leukemie, který bývá také označován zkratkou MOMLV), MSV (vir Maloneyova murinního sarkomu), HaSV (vir Harveyova sarkomu), SNV (vir slezinné nekrozy), RSV (vir Rousova sarkomu) nebo také Friendův vir.
Za účelem konstrukce rekombinantních retrovirů obsahujících sekvenci kódující acyltransferázu LCAT podle vynálezu se nejdříve konstruuje plasmid obsahující sekvence LTR, enkapsidaění sekvenci a uvedenou kódující sekvenci, který se potom použije pro transfekci tak zvané enkapsidaění buněčné řady schopné přinést v konfiguraci trans do plasmidu deficitní retrovirální funkce. Obecně jsou enkapsidační řady tudíž schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové enkapsidační řady již byly popsány v rámci dosavadního stavu techniky a to zejména řady PA317 (US 4,861,719), PsiCRIP (WO90/02
806) a GP+envAm-12 (WO89/07150. Jinak mohou rekombinantní retroviry obsahovat modifikace v úrovni sekvencí LTR za účelem potlačení transkripční aktivity, jakož i rozlehlé enkapsi dační sekvence obsahující část genu gag (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987)1639). Produkované rekombinantní retroviry se potom purifikují klasickými technikami.
Vynález se rovněž týká farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo několik defektních rekombinantních virů, které byly popsány v předcházejícím textu. Takové kompozice mohou být formulovány způsobem, který je vhodný pro topické, perorální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární a obdobné podání.
Výhodně farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje farmaceuticky přijatelné nosiče vhodné pro injikovatelnou formulaci. Může se zejména jednat o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, atd. nebo směsi těchto solí) mající sterilní a isotonický cha rakter nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované kompozice, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožňují rekonstituci injikovatelných tekutin.
Při použití pro léčení patologií spojených s dyslipoproteinemiemi mohou být rekombinantní adenoviry podle vynálezu podávány různými způsoby a zejména intravenózní injekcí. Výhodně jsou defektní rekombinantní adenoviry injikovány v úrovni žíly vrátnicové. Jedná-li seo retroviry, potom může být výhodné použít buňky infikované ex vivo s ohledem na jejich reimplantaci in vivo, případně ve formě neo-orgánů (WO 94/24298 ) .
Dávky viru použité pro injekci mohou být závislé na různých faktorech, zejména na použitém způsobu podání, léčené patologii nebo také na požadované době léčení. Obecně se rekombinantní viry podle vynálezu formulují a podávají ve formě dávek obsahujících 10^ až 101^ pfu/ml. V případě adeno-přidružených viru (AVV a adenovirů mohou být rovněž použity dávky 10 až 10 pfu/ml. Výraz pfu (plaque forming unit ) odpovídá infekční schopnosti virální suspenze, přičemž hodnota této schopnosti se stanoví infekcí příslušné buněčné kultury a změřením, obvykle po 48 hodinách, počtu plaků infikovaných buněk. Techniky stanovení hodnoty pfu virálního roztoku jsou dobře dokumentované v příslušné odborné literatuře.
Jinak mohou farmaceutické kompozice podle vynálezu rovněž obsahovat jeden nebo několik defektních rekombinatních adenovirů obsahujících vložený gen kódující apolipoprotein. Sdružení těchto dvou typů genů umožňuje dosáhnout synergického účinku na aktivitu vysokohustotních lipoproteinů a také na obrácený transport cholesterolu. Konstrukce adenovirů obsahujícího vložený gen cholesterolu kódující apolipoprotein byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO94/25 073. Výhodné sdružení uvedeného typu obsahuje adenovir podle vynálezu a adenovir obsahující gen kódující apolipoprotein AI nebo apolipoprotein AIV.
Vynález poskytuje nový velmi účinný prostředek pro léčení nebo prevenci patologií spojených s dyslipoproteinemiemi, zejména v oblasti kardiovaskulárních chorob, jakými jsou infarkt myokardu, náhlá smrt, selhání srdeční, cerebrovaskulární poruchy, ateroskleróza nebo restenoza. Obecně tento nový přístup poskytuje velmi slibný terapeutický prostředek pro všechny situace, kdy může být korigován deficit enzymu LCAT genetického nebo metabolického charakteru.
Kromě toho se takový způsob léčení může týkat jak člověka, tak i libovolného zvířete, jakými jsou například ovce, hovězí dobytek, domácí zvířata (psy, kočky, atd.), koně a ryby.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, které mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nárokků.
Stručný popis obrázků
Na připojených výkresech
-obr.1 znázorňuje konfiguraci plasmidu pXL2639,
-obr.2 znázorňuje konfiguraci plasmidu pXL2640.
-Obr.3 znázorňuje transfekci buněk Hep3B za použití adeno-AdCMV hLCAT.
Buňky Hep3B byly infikovány pomocí adeno-AdCMV hLCAT (prázdné čtverečky) nebo pomocí adeno-AdCMV beta-gal (plné čtverečky) při infekční intenzitě 10, 25, 50,
100, 250 a 500. Aktifita acyltransferázy LCAT byla měřena v supernatantu po 72 hodinách. Stanovení byla provedena dvakrát a každá hodnota představuje průměrnou hodnotu + standardní odchylka.
-Obr.4 znázorňuje analýzu Nothern blot RNA izolované z jater infikovaných a neinfikovaných myší. Celková RNA pochází z jater kontrolních myší (1), myší infikovaných pomocí adeno-AdCMV beta-gal (2) a myší infikovaných pomocí adeno-AdCMV hlCAT (3). 10 mikrogramů RNA bylo odděleno elektroforézou na agarosovém gelu obsahujícím 1,2 % formaldehydu, potom přeneseno na nylonovou membránu a hybridizováno s různými sondami lidské LCAT a murinního apoE.
-Obr. 5A a 5B znázorňují vliv přenosu genu acyltransferázy LCAT lidského původu na koncentrace celkového ho cholesterolu a komplexu cholesterol-HDL v plasmě. Plasmové koncentrace celkového cholesterolu a komplexu cholesterol-HDL (střední hodnota + standardní odchylka) u kontrolních myší (prázdné čtverečky) nebo po injekci 1x10 pfu adeno-AdCMV hLCAT (prázdné kroužky) anebo po injekci 1 x 101 pfu adeno-AdCMV beta-gal (plné čtverečky) u transgenních myší exprimujících lidský apolipoprotein A-I.
hvězdička: odlišný výsledek od myší infikovaných pomocí adeno-AdCMV-beta-gal, P menší než 0,0001.
-Obr.6 znázorňuje vliv přenosu genu acyltransferázy LCAT lidského původu na koncentrace lidského apoA-I v plasmě. Plasmové koncentrace lidského apoA-I (střední hodnota + sdandardní odchylka) u kontrolních myší (prázdné čtverečky) nebo po injekci 1x10 pfu adeno9
AdCMV hLCAT (prázdné kroužky) anebo po injekci 1x10 pfu adeno-AdCMV-beta-gal (plné čtverečky) u transgenních myší exprimujících lidský apolipoprotein A-I. hvězdička: odlišný výsledek od myší infikovaných pomocí adeno-AdCMV-beta-gal, P menší než 0,0001.
-Obr.7 znázorňuje vliv přenosu genu acyltransferázy lidského původu na lipoproteinovou distribuci choles8 terolu. Plasmy pochází z myší 5 dnů po injekci 5.10 pfu adeno-AdCMV hlCAT (plné čtverečky), 1 x 10 pfu adeno-AdCMV hLCAT (plné kroužky) nebo z kontrolních my ší (prázdné čtverečky). Plasma se rozdělí na sloupci produktu Superose-6 chromatografií na bázi gelové filtrace a cholesterol se stanoví v každé eluované frakci
-Obr.8 znázorňuje vliv přenosu genu acyltranferázy LCAT lidského původu na velikost částic HDL. Plasma pochází z myši 5 dnů po injekci 1x10 pfu adeno-AdCMV hLCAT (plná čára) nebo z kontrolních myší (přerušovaná čára). Plasma se rozdělí na polyakrylamidovém gelu (gradient 4-20 %) a přenese pomocí Western blot a lidský apoA-I se vyvolá protilátkami specifickými pro lidský apoA-I (lidský anti-apoA-I). Blot se potom skanuje densitometricky.
-Obr.9 znázorňuje vliv přenosu genu acyltransferázy
LCAT na mobilitu částic obsahujících apoA-I. Plasmy pochází z myší 5 dnů po injekci 1x10 pfu adenoAdCMV-beta-gal (1), 5 χ 10θ pfu adeno-AdCMV hLCAT (2) nebo 1 x 10^pfu adeno-AdCMV hLCAT (3). 2 mikrogramy plasmy se použijí pro rozdělení vysokhustotních lipoproteinů (HDL) elektroforézou na agarosovém gelu, načež se provede vybarvení lipidů sudánskou černí.
-Obr.10 znázorňuje vliv přenosu genu acyltransferázy
LCAT lidského původu na schopnost séra podporovat odvod cholesterolu. Plasmy pochází z myší 5 dnů po 9 .
injekci 1 x 10 pfu adeno-AdCMV hLCAT (prázdné kroužky), x 10 pfu adeno-AdCMV-beta-gal (plné čtverečky) nebo z kontrolních myší (prázdné čtverečky). Odvod cholesterolu se vypočte změřením radioaktivity v prostředí a v buňkách po inkubaci séra zředěného na koncentraci
2,5 % s buňkami Fu5Ah předběžně obohacenými radioaktivním cholesterolem.
hvězdička: odlišný výsledek od kontrolních myší,
P menší než 0,01, dvě hvězdičky: odlišný výsledek od kontrolních myší nebo od myší infikovaných adeno-AdCMVbeta-gal, P menší než 0,0005.
Obecné techniky molekulární biologie
Metody klasicky používané v molekulární biologii, jakými jsou preparativní extrakce plasmidové DNA, odstředění plasmové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, precipitace DNA v solném prostředí ethanolem nebo isopropanolem, transformace v Escherichia coli atd, jsou odborníkům v daném oboru velmi dobře známé a hojně popsané v literatuře /Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. a kol. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
New York, 1987/.
Plasmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories).
Za účelem provedení ligací mohou být fragmenty DNA rozděleny podle velikosti elektroforézou na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, vysráženy ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Naplnění proeminentních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy I z E.coli (Biolabs) podle instrukcí dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA-polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provádí šetrným zpracováním nukleázcuSI.
Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylor-em a kol. /Nucleic Acids Res.13(1985)8749-8764/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Enzymatická amplifikace fragmentů DNA takzvanou technikou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol., Science 230(1985)1350-1354, Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth.Enzym.155(1987) 335-350/ může být provedena za použití činidla DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podle návodu výrobce.
Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sanger-em a kol. /ProcNatl.Acad.Sci.USA,74 (1977)5463-5467/ za použití soupravy distribuované firmou
Amersham.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce defektního rekombinantního adenoviru obsahujícího gen lidské lecitincholesterol-acyltransferázy (hLCAT)
Jak již bylo uvedeno výše, připravují se defektní rekombinantní adenoviry homologní rekombinací mezi adenovirem a plasmidem nesoucím mezi jiným také gen, který má být vložen, po kotransfekci'uvedených prvků do příslušné buněčné řady.
A. Příprava plasmidů nesoucích gen lidské LCAT
1. Konstrukce plasmidů pXL2616
Plasmid pXL2616 obsahuje DNAc kódující lidskou lecitincholesterol-acyltransf erázu .
Tento plasmid byl připraven následujícím způsobem:
Technikou RT-PCR byl z celkových RNA buněk HepG2 (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia) izolován fragment DNA odpovídající DNAc acyltransferázy LCAT. DNAc byly produkovány inverzní transkripcí polyadenylovaných RNA pomocí hexanukleotidových zárodků. Na získaných DNAc byla potom provedena reakce PCR s oligonukleotidem Sq5209:
CCC TCG AGG CCATCG ATG AGG CCT GAC TTT TTC AAT AAA (SEQ ID n°1) a s nukleotidem Sq5287:
GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID n°2), které jsou specifickými oligonukleotidy sekvence lidské acyltransferázy LCAT (Mac Lean a kol., Proč.Nati.Acad. Sci., 83, 1986) a které umožňují přidání místa Clal v poloze 5' sekvence acyltransferázy LCAT a místa Sáli v poloze 3'. Získaný fragment se 1750 páry bází byl klonován do plasmidu pCR-II (TA cloning Kit, Invitrogen) a jeho sekvence byla potom ověřena. Rezultující plasmid byl označen jako pXL2616.
2. Konstrukce plasmidu pXL2639 (obr.1) a pXL2640 (obr.2)
Plasmidy pXL2639 a pXL2640 obsahují DNAc lidské acyltransferázy LCAT pod kontrolou raného promotoru viru CMV resp. promotoru LTR viru RSV.
Uvedené plasmidy byly konstruovány následujícím způsobem:
- digesce plasmidu pXL2375 (promotor CMV) a pXL2376 (promotor RSV-LTR), popsaných v mezinárodní přihlášce WO94/25073 enzymy Clal a Sáli má za následek vyštípnutí DNAc apolipoproteinu apoA-I, načež se provede
- vložení fragmentu Clal-Sall plasmidu pXL2616 obsahujícího DNAc lidské acyltransferázy LCAT do výše popsaných předběžně digerovaných plasmidu.
B. Exprese lidské lecitincholesterol-acyltransferázy in vitro
Po přechodné transfekci buněk 293 takto konstruovanými vektory (pXL2639 a pXL2640) byla testována exprese a funkčnost enzymu.
DNA byla zavedena prostřednictvím komplexu fosforečnan vápenatý-DNA metodou podle Wilger-a a kol., Cell,11(1977) 223.
Aktivita acyltransferázy LCAT byla měřena na buněčných supernatantech 60 hodin po transfekci metodou podle Chen-a a Albers-e, JLR,23(1982)680. Toto měření spočívá v použití proteoliposomů jako exogenního substrátu, přičemž uvedené proteoliposomy byly připraveny 30 minutovou inkubací apolipo1 4 proteinu ApoA-I, C-cholesterolu a fosfatidylcholinu v molárním poměru 0,8:12,5:250 při teplotě 37 °C. Uvedená aktivita se stanoví měřením míry konverze 1^C-cholesterolu na 1^Cester cholesterolu po inkubaci substrátu se 4 mikrolitry plasmy nebo kultivačního supernatantu po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Vytvořené estery se oddělí chromatografií na tenké vrstvě silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí petroletheru, diethyletheru a kyseliny octové v poměru 76:20:1, přičemž radioaktivita se změří kapalinovou scintilační spektroskopií .
Získané výsledky ukazují, že lidská acyltransferáza LCAT vylučovaná transfekovanými buňkami 293 je funkční.
C. Příprava rekombinantních adenovirů
Plasmidy připravené v části A se potom linearizují a kotransfekují za účelem rekombinace s deficitním adenovirálním vektorem do buněk helper (řada 293) přinášejících v konfiguraci trans funkce kódované oblastmi E1 (ElA a E1B) adenovirů.
Adenovir Ad.CMVLCAT byl získán homologní rekombinací in vivo mezi adenovirem Ad.RSVbeta-gal (Stratford-Perricaudet a kol., J.Clin.Invest 90 (1992)626) a plasmidem pXL2639 podle následujícího protokolu: plasmid pXL2639 linearizovaný enzymem XmnI a adenovir Ad.RSVbeta-gal linearizovaný pomocí Clal se kotransfekují do řady 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem umožnění homologní rekombinace. Takto generované rekombinantní adenoviry se potom selekují purifikací na desce. Po izolaci se rekombinantní adenovir amplifikuje v buněčné řadě 293, což vede k supernatantu nad buněčnou kulturou obsahujícímu nepurifikovaný defektní rekombinantní adenovir mající titr asi 1010 pfu/ml.
Virální částice se potom purifikují odstředěním v gradientu chloridu česného o sobě známou technikou (viz zejména
Graham a kol., Virology 52 (1973)456). Adenovir Ad.CMVLCAT se přechovává při teplotě -80 °C ve 20% glycerolu.
Stejný protokol byl použit v případě plasmidu pXL2640, přičemž byl získán rekombinantní adenovir Ad.RSVLCAT.
Příklad 2
Exprese in vitro genu lidské acyltransferázy mediovaná defekt ním rekombinantním adenovirem
Exprese a funkčnost enzymu byly testovány po infekci buněk Hep3B (buněčná řada lidských hepatocytů) rekombinantním adenovirem AdCMV-hLCAT při infekční intenzitě 10, 25, 50, 100, 250 a 500. Jako kontrolní subjekt byl použit rekombinantní adenovir AdCMVbeta-gal. Aktivita acyltransferázy LCAT (celkové množství esterů cholesterolu produkované v průběhu jedné hodiny ve 100 mikrolitrech kultivačního prostředí) bylo měřeno v buněčných supernatantech 72 hodin po infekci metodou podle Chen-a a Albers-e, JLR, 23(1982)680. Získané výsledky ukazují (viz obr.3), že lidská acyltransferáza LCAT vylučovaná do kultivačního prostředí je funkční a že hladina exprese enzymu je závislá na koncentraci virů v buňkách.
Příklad 3
Exprese in vivo genu lidské acyltranferázy LCAT mediovaná defektním rekombinantním adenovirem
Myší C57B1/6 transgenní pro apolipoprotein apoA-I lidského původu byly infikovány injekcí do ocasní žíly rekomz fi Q binantniho adenoviru AdCMV-hLCAT (5 x 10 nebo 1 x 10 pfu),
AdCMV-beta-gal (1 x 10 pfu) nebo nevirálního roztoku. V plasmě myší infikovaných pomocí AdCMV-hLCAT (od 3266+292 do
9068+812 nmol/ml/h) 5 dnů po infekci byly stanoveny velmi vysoké míry účinnosti acyltransferázy LCAT, zatímco u neinfikovaných myší nebo u myší infikovaných pomocí AdCMVbeta-gal byly pozorovány míry účinnosti odpovídající bazální aktivitě acyltransferázy LCAT myší plasmy.
Analýza Nothern blot, provedená s RNA z myších jater infikovaných pomocí AdCMV-hLCAT, umožnila zjistit expresi jediného druhu mediátorové RNA hybridizující se se sondou odpovídající DNAc lidské acyltransferázy LCAT, zatímco analýza Nothern blot, provedená s RNA z jater kontrolních myší neprokázala jakoukoliv hybridizaci (viz obr.4).
Příklad 4
Vliv exprese lidské acyltransferázy LCAT na hladiny lipoproteinů a apolipoproteinů v plasmě
Přechodná exprese lidské acyltransferázy LCAT způsobila významnou změnu v koncentraci cirkulujících lipidů a lidského apolipoproteinů A-I (hapoA-I). Nejvýraznější změny byly pozorovány 5 dnů po infekci, přičemž tyto změny jsou uvedeny v následující tabulce I.
Myši infikované 1x10 pfu AdCMV-hLCAT mají hladiny komplexu vysokohustotních lipoproteinů (HDL) s cholesterolem a celkového cholesterolu (CT) v plasmě 7- a 6-krát vyšší než hladiny stanovené u kontrolních myší (viz obr.5a a 5b). Tyto změny jsou spojeny se zvýšením jak esterifikovaného cholesterolu (CE), tak i volného cholesterolu (CL) a to 8 resp. 2,5krát vzhledem k hladinám stanoveným u kontrolních myší. Zvýšení plasmového esterifikovaného cholesterolu vede ke zvýšení poměru CE/CT ve frakci HDL. Myši infikované 1 x 10 pfu AdCMV-hLCAT vykazují 2,5-násobné zvýšení koncentrace lidského apolipoproteinů apoA-I oproti odpovídající koncentraci sta noveně u kontrolních myší (viz obr.6).
Tabulka I
Lipidové a apolipoproteinové parametry v plasmě myší s přenosem lidského apoA-I a to jednak kontrolních myší a myší infikovaných adenoviry
řfcntralní nyši (n=5) řfyši infikované AdCMV Bgal (n=5) 1 x 109 pfu/.pyš tyši infikované AdCMV- LCAT (n=2) 5 x 10θ pfu/hyš řfyši infikxané AdCMV- LCAT (n=5) 1 x 109 pfu/m/š
OáLkcvý chdLesfceral (CT) 132 ± 14 139 ±18 462±116c 827±49a
ELtery chaLesterolu (CE) 68 ±8 71 ±10 319 ± 22b 587±41a
Valný ctolesteral(FC) 63 ±11 68± 9 143 ± 37c 239 ±62b
CE/CT 0,52 ± 0,06 0,51 ± 0,07 0,69 ± 0,04c 0,71 ± 0,04c
(VLDL+LDL) -TC 15 ±3 20 ±6 33 ± 12d 30 ± 3c>e
TriglyErifý 49±3 50 ±7 90±5c 140 ± 7b
rbsfalipidy 313 ±40 309 ± 20 773 ±-53c 954 ± 65b
h apoA-I 247 ± 14 246 ±30 542 ± 32c 616 ±17a
Aktivita ILKT (nmol/ml/h) 45 ±2 45 ±3 3266 ± 292a 9068 ± 812a
Ifychlast endogenní esterifikaoe (nmol/ml/h) 149 ±11 161 ± 17 ND 340 ±5C
HDL-TC 117 ± 12 119 ±14 429 ± 127c 797 ± 48a
HDL-CE 66 ±8 67 ±10 317± llb 570 ± 20a
HDL-FC 51 ±11 52 ±12 112±26c 227 ± 53b
CE/CT v HDL 0,56 ± 0,05 0,57 ± 0,05 0,74 ± 0,03c 0,72 ± 0,03c
Všechny hodnoty lipidů a lipoproteinů jsou vyjádřeny v mg/dl.
p menší než 0,0001, p menší než 0,0004, p menší nez 0,01, p - NS odlišné od kontrolních myší a myší infikovaných
Z C Z v. Z pomoci adeno-AdCMV-beta-gal-infik., p =NS odlišné od myši infikovaných pomocí adeno-AdCMV-beta-gal-infik.
Příklad 5
Vliv exprese lidské acyltransferázy LCAT na rozdělení cholesterolu v lipoproteinech a na velikost a elektroforetickou mobilitu vysokohustotních lipoproteinů HDL
Rozdělení cholesterolu v lipoproteinových frakcích bylo realizováno z podílů myší plasmy analytickou chromatografií za použití filtrace na gelu (viz obr.7). Koncentrace celkového cholesterolu CT a apolipoproteinu lidského původu apoA-I byly stanoveny v eluovaných frakcích. Tyto analýzy prokázaly výraznou akumulaci cholesterolu ve frakci HDL, jaKož i zvětšení velikosti vysokohustotních lipoproteinů HDL u myší infikovaných 1x10 pfu AdCMV-hLCAT oproti kontrolním myším. Bylo prokázáno, že lidský apoA-I je sdružen s částicemi HDL.
Bylo také prokázáno, že distribuce velikosti lipoproteinů obsahujících apoA-I u myší s přenosem genu pro apoA-I lidského původu je bimodální, přičemž velikost obou píku činí Í9,4 resp. 11 nm. Zatímco u kontrolních myší zůstává tato distribuce zachována, změní se u myší infikovaných pomo, . 9 cí AdCMV-hLCAT. U myší, kterým bylo podáno 1x10 pfu AdCMVhLCAT, zmizel nejmenší pík ve prospěch dvou větších píku s 13,3 resp. 14,2 nm (viz obr.8).
Plasmové lipoproteiny byly rozděleny elektroforézou na nedenaturujícím agarosovém gelu, načež byly detekovány lipidy Jak je to patrné z obr.9, objevují se HDL mající mobilitu pre-alfa v plasmě myší infikovaných pomocí AdCMV-hLCAT, což demonstruje skutečnosž, že dochází k ovlivnění nejen velikost HDL, nýbrž také povrchových nábojů HDL.
Uvedené výsledky lze shrnout tak, že silná a přechod24 ná exprese lidské acyltransferázy u myší s přenosem genu pro apoA-I lidského původu vede ke tvorbě méně aterogenního lipoproteinového profilu díky zvýšení koncentrace komplexu HDL-cholesterol a lidského apoA-I, jakož i díky zvětšení velikosti a náboje vysokohustotních lipoproteinů HDL.
Příklad 6
Vliv exprese lidské acyltransferázy LCAT na odvod buněčného cholesterolu
Odvod (odliv) buněčného cholesterolu byl stanoven po inkubaci buněk krysího hepatomu Fu5AH s podíly plasmy infikovaných nebo neinfikovaných myší. Obr. 10 ukazuje, že se dosáhne 65% zvýšení odlivu cholesterolu v případě plasmy myší infikovaných pomocí AdCMV-hLCAT oproti plasmě myší infikovaných pomocí AdCMV-beta-gal. Ukázalo se, že toto zvýšení je v relaci se zvýšenými koncentracemi lidského apoA-I a HDLcholesterol u myší infikovaných pomocí AdCMV-hLCAT. Tyto výsledky mluví ve prospěch vyšší účinnosti obráceného transportu cholesterolu rezultujícího ze silné exprese lidského LCAT.
Seznam sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID n°1: Charakteristika sekvence: délka: 39 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne
Popis sequence: SEQ ID n°1:
CCCTCGAGGC CATCGATGAG GCCTGACTTT TTCAATAAA
39.
Informace o sekvenci SEQ ID n°2:
Charakteristika sekvence:
délka: 33 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární tyo molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne
Popis sekvence: SEQ ID n°2:
GCGTCGACAG CTCAGTCCCA GGCCTCAGAC GAG 33

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1 . Defektní rekombinantní vir obsahující alespoň vložený gen kódující celek nebo část lecitincholesterol-acyltransferázy (LCAT) nebo její varianty.
  2. 2. Vir podle nároku 1,vyznačený tím, že je zbaven oblastí svého genomu, které jsou nezbytné pro jeho replikaci v infikované buňce.
  3. 3. Vir podle nároku 1 nebo 2,vyznačený tím, že se jedná o adenovir, výhodně typu Ad 5 nebo Ad 2.
  4. 4. Vir podle nároku 1 nebo 2,vyznačený tím, že se jedná o adenovir zvířecího původu, výhodně psího původu.
  5. 5. Vir podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že vložený gen kóduje celek nebo část lidské LCAT nebo její varianty.
  6. 6. Vir podle nároku 5,vyznačený tím, že vložený gen kóduje lidskou LCAT.
    7. Vir podle některého z nároků 1 až 6, v y z nace n ý tím , že vloženým genem je DNAc. 8. Vir podle některého z nároků 1 až 6, v y z n a č e n ý tím , že vloženým genem je DNAg.
  7. 9. Vir podle některého z nároků 1 až 8, vyznačený t í m , že vložený gen obsahuje sekvence umožňující jeho expresi v infikované buňce.
  8. 10. Vir podle některého z nároků 1 až 9, vyznačený t í m , že vložený gen obsahuje signální sekvenci vedoucí syntetizovaný polypeptid do sekrečních cest cílové buňky.
  9. 11. Adenovir podle nároku 3 nebo 4, vyznačený tím, že obsahuje deleci celku nebo části oblasti E1.
  10. 12. Adenovir podle nároku 11, vyznačený tím, že navíc obsahuje deleci celku nebo části oblasti E4.
  11. 13. Vir podle nároku 1 nebo 2,vyznačený tím, že se jedná o adeno-přidružený vir (AAV).
  12. 14. Vir podle nároku 13,vyznačený tím, že jeho genom obsahuje gen kódující celek nebo část lecitincholesterol-acyltransferázy (LCAT) nebo její varianty lemovaný dvěma oblastmi ITR.
  13. 15. Vir podle nároku 1 nebo 2,vyznačený tím, že se jedná o retrovir.
  14. 16. Použití viru podle některého z nároků 1 až 15 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení nebo prevenci patologií spojených s dyslipoproteinemiemi.
  15. 17. Použití podle nároku 16 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení aterosklerózy nebo/a restenozy.
  16. 18. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo několik defektních rekombinantních virů podle některého z nároků 1 až 15.
  17. 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, v y z n ačená tím, že má injikovatelnou formu a že obsahuje 4-14
    10 az 10 pfu/ml adenoviru.
  18. 20. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, v y z n a č e n á t i m, že rovněž obsahuje jeden nebo několik defektních rekombinantních adenovirů kódujících apolipoprotein
CZ972868A 1995-03-14 1996-03-12 Recombinant viruses expriming lecithincholesterol-acyltransferase and their use in gene therapy CZ286897A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9502943A FR2731710B1 (fr) 1995-03-14 1995-03-14 Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique
PCT/FR1996/000381 WO1996028553A1 (fr) 1995-03-14 1996-03-12 Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisation en therapie genique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ286897A3 true CZ286897A3 (en) 1997-12-17

Family

ID=9477007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ972868A CZ286897A3 (en) 1995-03-14 1996-03-12 Recombinant viruses expriming lecithincholesterol-acyltransferase and their use in gene therapy

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20010014319A1 (cs)
EP (1) EP0815239A1 (cs)
JP (1) JPH11501518A (cs)
KR (1) KR19980703008A (cs)
AU (1) AU711381B2 (cs)
BR (1) BR9607757A (cs)
CA (1) CA2214010A1 (cs)
CZ (1) CZ286897A3 (cs)
FR (1) FR2731710B1 (cs)
HU (1) HUP9801214A3 (cs)
IL (1) IL117466A0 (cs)
NO (1) NO974179L (cs)
SK (1) SK124897A3 (cs)
WO (1) WO1996028553A1 (cs)
ZA (1) ZA961998B (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2236982C (en) * 1995-11-09 2010-07-27 The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services The use of lecithin-cholesterol acyltransferase (lcat) in the treatment of atherosclerosis
FR2755975B1 (fr) * 1996-11-15 1999-05-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants bicistroniques utiles pour le traitement de pathologies liees aux dyslipoproteinemies
DE69836626T2 (de) 1997-04-11 2007-04-05 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Proteine mit lecithin-cholesterin acetyltransferase-ähnlicher aktivität, deren herstellung und verwendung
MXPA03012043A (es) * 2001-06-19 2005-07-01 Paxflow Holdings Pte Ltd Sistema de localizacion comunicacion y rastreo.
CA2488414C (en) * 2002-06-18 2011-04-26 Eisai Co., Ltd. Primary cultured adipocytes for gene therapy
EP2037740A4 (en) * 2006-06-07 2011-12-28 Reddys Lab Ltd Dr COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE REVERSE CHOLESTER INTRANSPORT
CA2787343C (en) 2006-06-26 2016-08-02 Amgen Inc. Compositions comprising modified lcat and uses thereof
JPWO2008108344A1 (ja) * 2007-03-02 2010-06-17 セルジェンテック株式会社 Ｌｃａｔ欠損症の遺伝子治療用細胞並びに遺伝子治療用細胞組成物
CN109790550B (zh) 2016-09-20 2024-02-09 勃林格殷格翰动物保健有限公司 新颖的启动子
MX2019003158A (es) 2016-09-20 2019-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vectores de adenovirus canino.
CN110072546B (zh) 2016-09-20 2023-10-31 勃林格殷格翰动物保健有限公司 新的猪流感疫苗
TWI817933B (zh) 2016-09-20 2023-10-11 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 新穎ehv插入位點orf70

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8424757D0 (en) * 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
US5049488A (en) * 1985-11-08 1991-09-17 Genentech, Inc. Method and nucleic acid for the preparation of lecithin:cholesterol acyltransferase
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2705361B1 (fr) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
BR9405507A (pt) * 1993-07-13 1999-05-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus recombinante defeituoso linhagem celular e composição farmaceutica

Also Published As

Publication number Publication date
NO974179D0 (no) 1997-09-10
NO974179L (no) 1997-09-10
MX9706569A (es) 1997-11-29
AU5008296A (en) 1996-10-02
FR2731710A1 (fr) 1996-09-20
WO1996028553A1 (fr) 1996-09-19
HUP9801214A2 (hu) 1998-08-28
SK124897A3 (en) 1998-02-04
HUP9801214A3 (en) 2000-08-28
AU711381B2 (en) 1999-10-14
CA2214010A1 (fr) 1996-09-19
EP0815239A1 (fr) 1998-01-07
BR9607757A (pt) 1999-01-26
FR2731710B1 (fr) 1997-04-30
ZA961998B (en) 1996-09-26
JPH11501518A (ja) 1999-02-09
US20010014319A1 (en) 2001-08-16
KR19980703008A (ko) 1998-09-05
IL117466A0 (en) 1996-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5652224A (en) Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
USRE38556E1 (en) Recombinant adeno viruses comprising an inserted gene encoding apolipoprotein and their use in gene therapy for dyslipoproteinemias
JP2004500880A (ja) 肝臓特異的な遺伝子発現カセット、及びその使用法
CZ286897A3 (en) Recombinant viruses expriming lecithincholesterol-acyltransferase and their use in gene therapy
US20130210898A1 (en) Recombinant viruses and their use for treatment of atherosclerosis and other forms of coronary artery disease and method, reagent, and kit for evaluating susceptibility to same
AU721654B2 (en) Bicistronic recombinant viruses useful for the treatment of dyslipoproteinemia-related pathologies
US20130164262A1 (en) Recombinant Viruses and their Use for Treatment of Atherosclerosis and Othe Forms of Coronary Artery Disease and Method, Reagent, and Kit for Evaluating Susceptibiity to Same
AU747449B2 (en) Recombinant viruses, preparation and use thereof in gene therapy
MXPA97006569A (es) Virus recombinantes que expresan la lecitina-colesterol aciltransferasa y sus usos en terapia genica
Vaessen et al. Gene therapy in disorders of lipoprotein metabolism
Raper et al. Gene transfer strategies for metabolic diseases
Belalcazar et al. Somatic gene therapy for dyslipidemias
MXPA99004301A (es) Adenovirus recombinantes bicistronicos para el tratamiento de patologias relacionadas a las dislipoproteinemias

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic