CA2214010A1 - Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisation en therapie genique - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des virus recombinants défectifs contenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci, les compositions pharmaceutiques comprenant ces virus, et leur utilisation pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
Description
WO 96/28553 PcT~ 38l VIRUS RECOMBINANTS EXPRTMANT LA LECITHINE CHOLESTEROL
ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne de nouveallx virus rec-~mhin~nts, leur ~ ~aL~LLon et leur utilisation en thérapie génique, pour le transfert et l'expression in 5 vivo de gènes désirés. Plus préÇi~ement, elle c-)nc.?rne de nouveau~ virus recomhin~nt.s comprenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine ~h~ eterol a~:yl~la,~rérase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci. La présente invention c( nc~?rn~ également des compositions ph~rm~ceutiques comprenant lesdits virus recomhin~nt.s. Plus particulièrement, la présente invention concerne des virus 0 recombinants défectifs et leur lltili~tion pour la prévention ou le traitement des pathologies liées aux dyslipo~ ~)téinémies, qui sont connues pour leurs conséquences graves au niveau cardiovasculaire et neurologique.
Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholestérolémie ou l'h~ertriglycéridémie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépots (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses arteres
ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne de nouveallx virus rec-~mhin~nts, leur ~ ~aL~LLon et leur utilisation en thérapie génique, pour le transfert et l'expression in 5 vivo de gènes désirés. Plus préÇi~ement, elle c-)nc.?rne de nouveau~ virus recomhin~nt.s comprenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine ~h~ eterol a~:yl~la,~rérase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci. La présente invention c( nc~?rn~ également des compositions ph~rm~ceutiques comprenant lesdits virus recomhin~nt.s. Plus particulièrement, la présente invention concerne des virus 0 recombinants défectifs et leur lltili~tion pour la prévention ou le traitement des pathologies liées aux dyslipo~ ~)téinémies, qui sont connues pour leurs conséquences graves au niveau cardiovasculaire et neurologique.
Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholestérolémie ou l'h~ertriglycéridémie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépots (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses arteres
2 o (aorte, artères coronaires, carotide) . Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à
l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accomp~gn.?nt d'un ép~iSsiss~ment de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation 25 de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints.
Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-
l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accomp~gn.?nt d'un ép~iSsiss~ment de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation 25 de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints.
Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-
3 PCTIFR96100381 vasculaires très graves telles que l'"~ar~;Lus, la mort subite, la ~i~co,~ ensation cardiaque, les ~cçi(l~nt.e cérébro-vasculaires, etc.
n est donc particulièrement important de pouvoir disposer de tr~item~nt~
p~rmett~nt de rlimiml~r dans certaines cih1~tion~ pathologiques les taux de cholestérol 5 pl~m~tique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du ~h~lest~rol) au niveau des tissus périph~ri(lues afin de décharger les cellules ayant ~cc1~ml-1é du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipop~(~Leilles dont les lipo~L~)Lé.-les de faible densité (LDL) et les lipop.-~éilles de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées 0 au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et~ou dégradé.
~ ctl-ell~m~nt, les dy~lipi~l~mies et en particulier les hyperrh~ ct~rolémies sont traitées essentiellement au moyen de composés ~gi~ nt soit sur la biosynthèse du cholestérol (inhibiteurs de l'hydl~yllléthylglutaryl-coenzymeA re~l-lct~e, les statines), soit sur la captation et l'~limin~tion du cholestérol biliaire (les séquestrants ou résines), soit encore sur la lipolyse par un mode d'action qui reste à élucider sur le plan m~)léc~ ire (les fibrates). Par conséquent, toutes les grandes classes de médicaments, qui ont été utilisées dans cette indication (séquestrants, fibrates ou 20 statines), s'adressent sel~l~m~nt à l'aspect ~vt:llLif de la formation de la plaque d'athérome et non en fait au traitement de l'athérome. Les traitements actuels de l'athérome, post accident coronarien, ne sont que palliatifs puisqu'ils n'interviennent pas sur l'homéostase du cholestérol et qu'ils sont des actes chirurgicaux (by-pass coronarien, angioplastie).
Une première approche pour le traitement de ces pathologies par la thérapie génique a été décrite dans la c~em~n~ W094/25073. Cette approche repose en particulier sur le lldn~rel~ direct de gènes codant pour des apolipo~l~,Léines. La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dy~ o~ téillémies. Elle repose plus particulièrement sur le CA 02214010 1997-09-0~
transfert de gènes codant pour des enzymes impliquées dans le catabolisme du ~hol~stérol. En particulier, le transfert et l'~x~ ssion in vivo de la LCAT selon l'invention permet de manière avantageuse d'agir non se~ m~nt sur le taux de HDLcirculants, mais é~ m~nt sur leur activité enzymatique liée au transport inverse du 5 cholestérol. Cette approche a donc un double effet stimUl~nt visant à ramener le cholestérol vers le foie. La présente invention repose ég~l~m~nt sur l'utilisation de virus qui permettent de transférer et d'exprimer des gènes codant pour des enzymes du métabolisme du cholestérol au niveau du foie, et de sécréter lesdites enzymes dans le système circulatoire où elles exercent leur activité avec une grande ~fflc~cité
0 Les exemples présentés plus loin indiquent notamment que les adénovirus sont capables, selon le mode d~a~ dLion~ de transférer et d'exprimer effiç~cf~m~nt pour une durée importante et sans effet cytopathologique, le gène codant pour lalécithine cholestérol acyltransférase (LCAT).
Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif c~)ntf~n~nt au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lérithin~
cholestérol a~;ylka-~féldse (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
L'invention a ég~lement pour objet l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
La lécithine-cholestérol acyltransférase (LCAT) hllm~in~ est une protéine de 416 acides aminés, glycosylée et ayant une masse moléculaire relative de 65 à 69 kD.
Le gène, ainsi que l'ADNc, codant pour la LCAT, longs respectivement de 4200 et 1744 pb, ont été clonés et séquencés (Mc Lean et coll., Proc.Natl.Acad Sci. 83 (1986) 2335 et Mc Lean et coll., Nucleic Acids Res. 14(23) (1986) 9397). La LCAT est une enzyme qui catalyse l'~st~rific~tion du cholestérol libre par transfert d'un groupement acyl de la phosphatidyl~holine sur un résidu hydroxyle du cholestérol, avec formation d'ester de cholestérol et de lysoph-~ph~ti-lylcholine. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et elle est libérée dans le plasma (6,ug/ml), où elle est associée au lipoprotéines de haute densité (HDL), dites lipo~ioLéi.les antiathérogènes.
CA 022l40l0 l997-09-0~
Ces particules pos~è-i~nt la ç~pacite d'accepter le cholestérol se trouvant en excès dans les c~ , qui est alors estérifié par la LCAT. Les HDL riches en esters de cholestérol sont captées par le foie pour y être ensuite ~limin~-s~ Ce m~ni~me, qui permet l'épuration du ~h<~ rol e~t~é~ nt~ire de l'organisme, est appelé transport 5 inverse du cholestérol et est clairement impliqué dans la pL~:v~l~ion de l'athérogénèse (Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 et Johnson et coll. BBA 1085 (1991)205). La LCAT, en créant un gradient de ch~lest~rol libre entre les membranes plasmiques et les lipoprotéines circ~ ntes, joue très vr~ mhl~hlf~m~nt un rôle majeur dans ce processus.
0 Les conséquences physiologiques d'une ~hs~nre partielle ou totale d'activité
de l'enzyme LCAT dans le plasma sont illustrées par les changements pathologiques observés dans le syndrome de "l'oeil de poisson" (Fish Eye Disease, FES) et de la ~l~fi~ n~e classique en LCAT. Les ~yln~ulnes cliniques de la FES sont l'opacité de la cornée ainsi qu'une atteinte rénale et une anémie. Ces deux syndromes sont associés à
une hypo~lph~ Lule"-~mie et une élévation des triglycérides p l~m~tiques. ns peuvent être distingués par le dosage biochimique de l'activité LCAT dans le plasma.
Aucune activité d'estérification pl~matique du cholestérol n'est décelable chez un patient atteint de la déficience classique en LCAT alors que chez un patient ayant un profil de FES, une activité résiduelle en LCAT est observée. Le transfert du gène de la 2 o LCAT selon l'invention constitue une nouvelle approche pour le traitement des pathologies cardiovasculaires. La capacité de transférer ce gène et de surexprimer la LCAT in vivo permet selon l'invention d'exercer une double activité de stimulation sur l'efflux du cholestérol, liée d'une part à l'~l-gm~nt~til n du taux de HDL circulants et d'autre part à l'augmentation de l'activité enzymatique de ces HDL.
Dans les virus de l'invention, le gène inséré peut être un fragment d'ADN
complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride con~i~t~nt par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques.Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la LCAT ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant -CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/li~G~ 81 désigne tout mutant, fragment ou peptide poe~é~l~nt au moins une propriété
biologique de la LCAT, ainsi que tous v~i~ll~ naturels de la LCAT. Ces fr~gment.s et vcLLiallL~ peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mm~nt par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore 5 par clonage par expression, permettant la sélection de v~;allL~ en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques in~ nt les suppr~eeione, délétions, ml~t~ti~ne, etc.
Le gène inséré au sens de l'invention est ~erél~."i~ ment le gène codant pour tout ou partie de la LCAT humaine. Il s'agit plus ~ri~ Liellement d'un ADNc0 ou d'un ADNg.
Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont natur~ ?m~nt responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut e~lem~nt s'agir de5 séquences d'origine difré~ L~ (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de fa~con in~llctihle ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou 20 du génome d'un virus, et not~mm~nt les promoteurs des gènes ElA, MLP
d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, cc-actine,tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofil~m~nts, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, C~lK, 2 s facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine c~
des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie; Apo AI, Apo AII, Albumine hllm~inf~ etc) ou encore les promoteurs répondant à un stim~ s (récepteur des hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoique, etc,). En outre, ces séquences 30 d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de CA 02214010 1997-09-0~
régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le ~;~nC)m~ du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ~illP~ , le gène inséré co~ rend genPr~l~m~nt, en amont de la séquence 5 codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide syn~héti~e dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la LCAT, mais il peut ég~l~m~nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de0 se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nece~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit ~limin~ (en tout ou en partie), soit rendues non-f~ncti~)nn~lles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène 15 inséré. Pler~lell~iellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont néc~ ires à l'~n~p~ tion des particules virales.
Le virus selon l'invention peut être dérivé d'un adénovirus, d'un virus adéno-associé (AAV) ou d'un rétrovirus.Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus htlm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir ~em~n~le WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De erélellce, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/~9G/1,~:~81 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine h11m~ine ou canine ou mixte.
E'l~r~ iPllPmPnt les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permPtt~nt l'ene~rci-1~tion et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus pLereL~ pllempntJ dans le genomP des adénovirus de l'inventionJ la région E1 au moins est non fnnçtionnelle Le gène viral c-)n~i~1Pré peut être rendu non foncti--nnPI
par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totaleJ substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles mo~ifiç:~tions peuvent être obtenues in vitro (sur de 0 l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent é~lemPnt être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il col-lplelld une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour la LCAT (Cf FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~midf~ dans une lignée cellulaire appropliée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits elémen~, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient not~mm~nt intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o) ou des lignées ç~r~hlP~ de c~mrlPmPnt~r les fonctions E1 et CA 02214010 1997-09-0~
E4 telles que ~ rit~.s not~mm~nt dans les ~l~m~ntlç.e n~ WO 94/26914 et W095/02697.
Fn~uite, les adénovirus qui se sont mllltirli~s sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie molécl-l~ire, comme illustré dans les exemrles.
Cnn~rn~nt les virus adéno~ or-iés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de ce11l~lç~, sans induire d'effet sur la cr i.c.~nce, la morphologie ou la différenciation celll-l~ires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des patholc,gies chez 0 l'h-)mme Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque ~ILelniL~ une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'~nc~psi~i~tion: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent 20 lirrélell~es constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intéret, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un org~ni.~m~) ledit gène d'intéret. Les AAV recomhin~nt.s défectifs selon l'invention peuvent etre préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par 25 exemple un adénovirus), d'un plasmide c~ nt~n~nt la séquence nucléique d'intéret bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un pl~.~mi~l.? portant les gènes d'.?n~ r~ tion (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc ég~lçment un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/liR96/00381 séquence codant pour la LCAT bordée des ITR de l'AAV. L'invention c-)n~rnç
é~lem~nt un p1~mi~1e co~ enant une séquence codant pour la LCAT bordée de deux ITR d'un AAV. Un tel pl~mi~e peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de la LCAT, évPntl~llçm~nt incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-5 virus).
Concernant les les l~lrovil~ls, la construction de vecteurs recombinants a étélarge,.~l" décrite dans la liLL~Ia~ voir not~mmçnt EP 453242, EP178220, B~rn~çin et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689,etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en 0 division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'en~rsi~tion et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs rec~-mhin~nt~ dérivés des l~ vil,ls, les gènes gag, pol et env sont généralementdélétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de L~ VilllS tels que no~mm~nt le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des l~lr~vi~ lls recombinants comportant une séquence 20 codant pour la LCAT selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes 25 gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et lalignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les ll;~ Vil ~lS recombin~nt~
peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité
transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'çn~p~ tion ét~n~ues, comportant une WO 96/28553 PCT/1~96/00381 partie du gène gag (Bender et al.J J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
La présente invention cnncerne ég~lem~nt une composition ph~rm~eutique coI~L~llant un ou plusieurs virus recomhin~nts défectifs tels que décrits 5 précé(le-mment De telles compositions peuv~lll être formulées en vue d'une ~lmini~tration par voie topique, orale, pdLeIl~é~ale, intr~n~s~I~, inlldv~ e--ceinLL,~ sc--l~ire, sous-cutanée, intraoculaire, etc.
P~r~r~ iell~m~nt, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en o particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, pof~ssil~m, c~kilIm ou m~gnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Dans leur lItili~ti~n pour le traitement des pathologies liées au~;
dyslipopI~ inémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être ?~lmini~strés selon dirré~ ~ modes, et notamment par injection intraveineuse.
liellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. S'agissant des le~ viius, ils peut être avantageux d'utiliser des cellules infectées ex vivo en vue de 20 leur r~impl~nt~tion in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (W094/24298).
Les doses de virus ntili~é~s pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de clirréI-ell~ paramètres, et notamment en fonction du mode d'~-lministration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une25 manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et ~minis~rés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfulml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 10l~ pfu!ml peuvent ég~lem~nt être lItiIi~ées Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension devirions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appI~liée, et mesure, WO 96/28553 PCr/FR96/00381 génér~lem~nt après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~let~rmin~tion du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la lille.a~
Par ~ r~, les compositions ph~rms~-el-tiques de l'invention peuvent 5 ég~l~m~nt cc,-,lPi1ir un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt.~ défectifs c~nt~n~nt un gène inséré codant pour une apolipupruLéille. L'association de ces deux types de gènes permet d'exercer un effet synergique sur l'activité des HDL et ainsi sur le transport inverse du cholestérol. La construction d'adénovirus c~-nten~nt un gène inséré codant pour une apolipopro~éille a été décrite dans la ciem~n~1e W094/25073. Une 0 association préférée comprend un adénovirus selon l'invention et un adénoviruscontenant un gène codant pour l'apolipoprotéine AI ou l'apolipoprotéine AIV.
La présente invention offre un nouveau moyen très ~~ffi~ce pour le tr~it.?m~nt ou la pl~vt~ ion des pathologies liées aux dyslipo~ inémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la déco"~pensa~ion cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, l'athérosclérose ou la resténose. Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de la LCAT peut être corrigé.
En outre, ce tr;litem~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel 20 que les ovins, les bovins, les ~nim~llx domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non l;,~ ir~i.
LEGENDE DES FIGURES
25 Fg~ ure l: Représentation du plasmide pXL2639.
Fi~ure 2: Représentation du plasmide pXL2640.
Fi~ure3: Transfection des cellules Hep3B par un adéno AdCMV hLCAT. Les cellules Hep3B ont été infectées par un adéno AdCMV hLCAT (Carrés vides) ou adéno AdCMV J3gal (carrés pleins) à des ml~ltipli~it~s d'infection de 10, 25, 50, 100, 250 and 500. L'activité LCAT a été mesurée dans le sl1rn~nt à 72 h. Les 5 ~letermin~tions ont été faites en double et chaque valeur représente la moyenne i écart-type.
Fi~ure 4: Analyse de l'ARN par Northern blot, isolé de foie de souris infectées ou non infectées. L'ARN total provient des foies des souris témoins (1), infectées par l'adéno AdCMV 13gal (2) et l'adéno AdCMV hLCAT (3). 10 ~g d'ARl~- ont été
0 séparés par électrophorèse en f~)rm~kl~hyde-1,2% agarose, transférés sur une membrane de Nylon et hybridés avec dif~ Les sondes LCAT hllmz~in~ et apoE de souris Fi~ures 5A et 5B: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations pl~cm~tiques de cholestérol total et cholestérol-HDL.
Concentrations pl~m~tillues de cholestérol total et cholestérol-HDL (moyenne +
écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV ~gal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-I hllm~in~
*: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV ~3gal, P < 0.0001.
20 Fi~ure 6: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations plasmatiques d'apoA-I hl-m~ine. Concentrations p!~m~tiques d'apoA-I humaine (moyenne + écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV
~3gal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolip~ L~ine A-I
25 hllm~ine *: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV J3gal, P < 0.0001.
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WO 96/28553 PCT/1;~96/00381 Fi~ure 7: Effet du transfert du gène de la LCAT h-~n~ine sur la distribution lipoprotéique du cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 5 108 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (carrés pleins), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds solides) ou témoins (carrés ouverts). le plasma est séparé sur 5 une colonne Superose-6 par chr~m~tographie de gel-filtration, et le cholestérol mesuré dans chaque fractions éluées.
FisJure 8: Effet du transfert du gène de la LCAT h-- n~ine sur les tailles des particules HDL. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ligne pleine) et témoins (ligne discontinue). Les 0 plasma ont été séparés sur un gel de polyaclylamide (gradient 4-205ro) et llal~rér~s par Western blot et l'apoA-I ht~m~ine est alors révélée par des anticorps spécifiques anti-apoA-I hllm~in~ Le blot est ensuite scanné par densitomètrie.
Fi~ure 9: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la mobilité des particules cont~ns~nt l'apoA-I. Les plasma proviennent des souris, 5 jours aprèsl'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV 13gal (1), 5 x 108 pfu d'adéno AdCMV
hLCAT (2) ou 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (3). 2 ,ul de plasma sont utilisés pour séparer les HDL par électrophorèse sur gel d'agarose suivit d'une coloration des lipides au noir Soudan.
Fi~ure lO: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la capacité du 2 o sérum à promouvoir des efflux de cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (cercles ouverts), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV J3gal (carrés solides) ou souris témoins (carrés ouverts).L'efflux de cholestérol est calculé en mesurant la radioactivité dans le milieu et dans les cellules après l'incubation du sérum dilué à 2.5% avec des cellules Fu5Ah 2 5 pr~echargées en cholestérol radioactif.
*: différent des souris témoins, P < 0.01. **: dirrél~nt des souris témoins ou souris infectées avec l'adéno AdCMV 13gal, P _ 0.0005.
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TECHNIOUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les méthodes classiquement llt~ ép~c en biologie moléculaire telles que les extractions pLèpaLdLLvèS d'ADN pl~mi~ ue, la centrifugation d'ADN pl~mi~lique engradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 5 pl1rifi~tion de fr~mPnt~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlor~rolllle, la précipitation d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de l'isopr~allol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 10 Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubei F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmi(1ps de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fr~gm~ntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~tions du fournisseur.
Le remplissage des exLIé,lliLés 5' pr~min(?nt~s peut être effectué par le fragment de ~lenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli (Biolabs) selon les 20 spé-ific~tions du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommz~n~ tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proçmin~ntes esteffectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en lltili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fr~gm~nt~ d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed_hain_eaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCTf~96/00381 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en llfili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérific~tion des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- :
5467] en ~tili~ nt le kit distribué par Amersham.
EXEMPLES
Exemple 1: Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant le ~ène de la lécithine cholestérol acvltransférase humaine (hLCAT):
0 Comme indiqué avant, les adénovirus recombinants défectifs ont été préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer, après co-transfection dans une lignée cellulaire ap~l~pliée.
A. Pl~pal~lion des plasmides portant le gène de la LCAT humaine:
1. Construction du plasmide pXL2616 Le plasmide pXL2616 contient l'ADNc codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase h1lm~ine n a été construit de la manière suivante:
Le fragment d'ADN correspondant à l'ADNc de la LCAT a été isolé par la technique de RT-PCR à partir des ARN totaux des cellules HepG2 (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia). Les cDNA ont été produits par transcription inverse des ARN polyadénylés à l'aide d'amorces hexanucléotidiques. Une réaction de PCR a alors été réalisée sur ces ADNc avec les oligonucléotides Sq5209: CCC TCG AGG
CCA TCG ATG AGG CCT GAC l l l TTC AAT AAA (SEQ ID n~ 1) et Sq5287:
GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID n~ 2) spécifiques de la séquence de la LCAT hllm~in~ (Mac Lean et coll., Proc. Natl. Acad.
CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/FR~)G~381 Sci., 83, 1986) et qui permettent l'ajout d'un site ClaI en 5' de la séquence de la LCAT
et d'un site SalI en 3'. Le fragment de 1750 pb obtenu a été cloné dans le pl~mi~e pCR-II (TA cloning Kit, Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le pl~mi~ résultant a été appelé pXL2616.
2. Construction des plasmides pXL2639 (fi~ 1) et pXL2640 (fi~ 2) Les pl~mi~e pXL2639 et pXL2640 c~nti~nn~nt l'ADNc de la LCAT
h1lm~ine, sous le contrôle respectivement du promoteur précoce du CMV et du promoteur LTR du virus RSV.
Ils ont été construits de la manière suiv~:
- digestion des pl~mi~le~ pXL2375 (promoteur CMV) et pXL2376 (promoteur RSV-LTR), décrits dans la ~i~m~n~l~ W094/25073, par ClaI et SalI, ce qui aboutit à l'excision de l'ADNc de l'apoA-I, puis, - insertion du fragment ClaI-SalI du plasmide pXL2616, contf~!nz~nt l'ADNc de la LCAT humaine, dans les pl~cmifles préalablement digérés décrits ci-dessus.
B. Expression de la lécithine cholestérol acvltransférase humaine in vitro L'expression et la fonctionnalité de l'enzyme ont été testées après transfectiontransitoire de cellules 293 par les vecteurs ainsi construits (pXL2639 et pXL 2640).
L'ADN a été introduit par l'int~rmés~i~ire d'un complexe phosphate de calcium-ADN
selon la méthode de Wilger et coll., Cell, 11 (1977) 223.
L'activité LCAT a été mesurée sur les surnageants cellulaires 60 heures après la transfection, selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. La mesure repose sur l'utilisation de protéoliposomes comme substrat exogène, préparés parinc1lh~tion de 30 minutes d'apoA-I, de 14C cholestérol, de phosphatidylcholine à un ratio molaire de 0,8:12,5:250 à 37~C. L'activité est ~ t~rmin~e en mesurant la conversion de 14C- cholestérol en 14C-ester de cholestérol après incllh~tion du substrat avec 4~L1 de plasma ou de surnageant de culture pendant 2 heures à 37~C. Les CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCTIFR!) 'I~, ~ 3 81 esters formés sont séparés par chromatographie sur couche mince sur plaques de silice à l'aide d'un mélange éther de pétrole-diéthyl éther-acide acétique 76:20:1 et la r~io~ctivité est déterminée par spectrométrie à sl~intill~tion liquide.
Les résultats obtenus montrent que la LCAT hl1m~ine sécrétée par les cellules 5 293 transfectées est fonctionn~lle C. ~al dLion des adénovirus recombinants Les rl~mi~l~c préparés en A ont ensuite été lin~ri~és et cotransfectés pour la recomhin~i~on avec le vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en ~ans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) 0 d'adénovirus.
L'adénovirus Ad.CMVLCAT a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSV~3gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le rl~mi~e pXL2639 selon le protocole suivant: le plasmide pXL2639 linéarisé par l'enzyme XmnI et l'adénovirus Ad.RSV~gal linéarisé par ClaI sont co-5 transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre larecombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est ~mrlifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture c-)ntf~n~nt l'adénovirus défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 1010 20 pfu/ml.
Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad.CMVLCAT est conservé à -80~C dans 20 % de glycérol.
25Le même protocole a été reproduit avec le plasmide pXL2640 con~ iC~nt à
l'adénovirus recomhin~nt Ad.RSVLCAT.
- -CA 02214010 1997-09-0~
Exemple 2: Expression in vitro du ~ène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif L'~ ~sion et la fonctit-nn~lite de l'enzyme ont été testées après infection de cellules Hep3B (lignée cellulaire d'hépatocytes hllm~in~) par l'adénovirus recomhin~nt 5 AdCMV-hLCAT à des MOI de 1OJ 25, 50J 1OOJ 250 et 500. L'adé~novin~s recomhin~nt AdCMV13gal a été utilisé comme contrôle. L'activité LCAT (quantité
totale dJesters de cholestérol produits en 1 heure dans 100 ~1 de milieu de culture) a été mesurée sur les surnageants cellulaires 72 heures après l'infectionJ selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. Les résultats (fig. 3) montrent que la 10 LCAT hllm~in~ sécrétée dans le milieu de culture est fonctionnelle et que le niveau d'expression de l'enzyme est dépendant de la concentration virale dans les cellules.
Exemple 3: Expression in vivo du ~ène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif Des souris C57B1/6 transgéniques pour l'apoA-I hllm~in~ ont été infectées par injection dans la veine de la queue d'adénovirus recombinant AdCMV-hLCAT (5 x 108 ou 1 x 109 pfu), AdCMV-~Gal (1 x 109 pfu) ou de solution non virale. Des niveaux très élevés d'activité LCAT ont été détectés dans le plasma des souris infectées par l'AdCMV-hLCAT (de 3266+292 à 9068+812 nrnol/mVh) 5 jours après l'injection, tandis que les niveaux observés chez les souris non infectées ou infectées 20 par l'AdCMV-~Gal correspondent à l'activité LCAT basale du plasma de souris.
Un Northern blot, réalisé avec les ARN de foie de souris infectées par l'AdCMV-hLCAT, a permis de révéler l'expression d'une seule espèce d'ARN messager s'hybridant avec une sonde correspondant à l'ADNc complet de la LCAT h1lm~ine, tandis qu'un Northern blotting, réalisé avec les ARN de foie des souris contrôles n'a 25 mis en évidence aucune hybridation (fig.4).
Exemple 4: Effets de l'expression de la LCAT humaine sur les niveaux plasmatiques des li~!o~ téines et apolipoprotéines.
L'e,~p ~e~ion transitoire de la LCAT h~ -.? a entraîné un ~h~n~m~nt ~ignifiç~tif des concentrations en lipides circulants et en apolipopl-~L~le A-I hllmsline (hapoA-I). Les 5 variations les plus importantes ont été observées 5 jours après l'injection et sont r~ me~ dans la Table I.
Les souris infectées par 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT ont des niveaux de HDL-cholestérol et de cholestérol total (CT) pl~m~ti~lues 7 et 6 fois supérieurs, respectivement, aux niveallx obtenus chez les souris contrôles (figure 5a et 5b). Ces 0 variations sont associées à une augmentation à la fois du cholestérol estérifié (CE) et du cholestérol libre (CL), respectivement de 8 et 2,5 fois par rapport aux niveaux obtenus chez les souris contrôles. L'augmentation du CE pl~m~ti~lue conduit à une augmentation du rapport CE/CT dans la fraction HDL. Les souris infectées par l x109 pfu d'AdCMV-hLCAT prés.?ntent un accroissement de 2,5 fois de la 5 concentration en apoA-I hllm~ine par rapport aux souris contrôles (figure 6).
CA 022l40l0 l997-09-05 Table I. Paramètres lipidiques et apolipoprotéiques dans le plasma des souris tr~n~g~niques apoA-I hllm~ines témoins et infectées par des adénovirus.
Souris Souris infectées Souris ;~)re~e~ Souris infectées témoins par AdCMV Bgal par AdCMV- par AdCMV-(n=5) (n=5) LCAT (n=2) LCAT (n=5) 1 x lOg pfu/mioe 5 x 108 pfulrnio- 1 x 109 pfu/mioe ~h~ ct~rol 132 i 14 139 i 18 462 i 116C 827 i49a total (CT) Esters de 68 i 8 71 i 10 319 i 22b 587 i 41a rh~lPctf~rol (CE) ~h~ stf~rol libre (FC) 63 i 11 68 i 9 143 i 37C 239 i62b CE/CT 0,52 i 0,06 0,51 i 0,07 0,69 i 0,04C 0,71 i 0,04C
(VLDL+LDL) 15 i 3 20 i 6 33 i 12d 30 i 3c,e -TC
Triglycérides 49 i 3 S0 i 7 90 i 5c 140 i 7b Phospholipides 313 i 40 309 i 20 773 i 53c 954 i 65b h apoA-I 247 i 14 246 i 30 542 i 32C 616 i l7a Activité LCAT 45 i 2 45 i 3 3266 i 292a 9068 i 812a (nmoVml~) Vitesse d'esterification 149 i 11 161 i 17 ND 340 i 5C
endo~ène (nmol/mVh) HDL-TC 117 i 12 119 i 14 429 i 127C 797 i 48a HDL-CE 66 i 8 67 i 10 317 i 11b 570 i 2oa HDL-FC 51ill 52il2 112i26C 227_53b CE/CT dans 0,56 i 0,05 0,57 i 0,05 0,74 i 0,03C 0,72 i 0,03C
les HDL
Toutes les valeurs de lipides et lipop~ es sont exprimées en mg/dl. ap<0.0001, bp<o 0004, Cp<0 01, dp=NS. Différent des souris témoins et des souris infectées par 5 l'adéno AdCMV J3gal-infected. ep=NS Différent des souris infectées par l'adénoAdCMV ~gal-infected CA 02214010 1997-09-0~
WO96/285S3 PCTIFR~ 3Bl Exemple 5: Effets de l'~ . ~ion de la LCAT humaine sur la répartition du cholestérol dans les lipoprotéines. Ia taille et la mobilité électrophorétique des HDL
La i~alLi~ion du ~~h~lest~rol dans les fractions lipopr.~eiques a été réalisée à partir de 5 pools de pl~m~c de souris par chromatographie analytique par filtration sur gel (fig.7). Les concentrations de CT et d'apoA-I hnm~in~ ont été clétermin~s dans les fractions éluées. Ces analyses révèlent une accl~mlll~ti- n importante de cholestérol dans la fraction HDL ainsi qu'une augmentation de taille des HDL pour les sourisinfectées par 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT par rapport aux souris contrôles.
0 L'apoA-I humaine est ~:ILuuv~e associée aux particules de la taille des HDL.
Il a été montré que la distribution en taille des lipoprotéines c-~nten~nt de l'apoA-I
chez les souris tr~n~niques pour l'apoA-I h~lm~int~ était bimodale, avec des tailles de pics de 9,4 nm et 11nm. Alors que chez les souris contrôles, cette même distribution est conservée, elle est altérée chez les souris infectées par l'AdCMV-hLCAT. Pour les 5 souris ayant reçu 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT, le pic le plus petit disparaît au profit de deux pics plus grands de 13,3 et 14,2 nm (fig.8).
Les lipoprotéines pl~m~tiques ont été séparées par électrophorèse dans un gel d'agarose non dénaturante, suivie par une détection des lipides. Comme le montre la figure 9, des HDL possédant une mobilité pré-alpha apparaissent dans les plasmas des 20 souris infectées par l'AdCMV-hLCAT, révélant que non sel-lem~nt la taille des HDL
est affectée mais ég~lem~nt les charges à la surface des HDL.
En résumé, l'expression forte et transitoire de la LCAT hnm~in~ chez les souris transgéniques pour l'apoA-I hllm~in~ conduit à la formation d'un profil lipoprotéique moins athérogène, grâce à l'augme~ ti~n des concentrations en HDL-cholestérol et25 en apoA-I hllmsline, ainsi que l'augmentation de taille et de charge des HDL.
Exemple 6: Effets de l'expression de la LCAT humaine sur l'emux de cholestérol cellulaire CA 02214010 l997-os-05 Wo 96/28553 PCT/FR96/00381 L'efflux du cholestérol c~ ire a été déterminée après inc~ ation des cellules d'hépa~onle de rat Fu5AH avec des pools de plasmas de souris infectées ou non. La figure 10 montre qu'une ~llgm~nt~tion de 65~ de l'efflux est obtenu avec le plasma des souris infectées par l'AdCMV-hLCAT par rapport au plasma des souris infectées 5 par l'AdCMV Bgal. Il s'avère que cette ~llgmentsltinn est en relation avec lescon~ntrations plus élevées d'apoA-I hllms~in~ et de HDL-cholestérol chez les souris infectées par l'AdCMV-hLCAT. Ces résultats sont en faveur d'une plus grande efficacité du transport inverse du cholestérol résultant de la forte expression de LCAT
hnm~int~
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LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION:VIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA LECITHINE
CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: double 35 - (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) ~ESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFOR~L~TIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (b) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc W 096/28553 PCTA~R96/00381 (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
n est donc particulièrement important de pouvoir disposer de tr~item~nt~
p~rmett~nt de rlimiml~r dans certaines cih1~tion~ pathologiques les taux de cholestérol 5 pl~m~tique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du ~h~lest~rol) au niveau des tissus périph~ri(lues afin de décharger les cellules ayant ~cc1~ml-1é du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipop~(~Leilles dont les lipo~L~)Lé.-les de faible densité (LDL) et les lipop.-~éilles de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées 0 au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et~ou dégradé.
~ ctl-ell~m~nt, les dy~lipi~l~mies et en particulier les hyperrh~ ct~rolémies sont traitées essentiellement au moyen de composés ~gi~ nt soit sur la biosynthèse du cholestérol (inhibiteurs de l'hydl~yllléthylglutaryl-coenzymeA re~l-lct~e, les statines), soit sur la captation et l'~limin~tion du cholestérol biliaire (les séquestrants ou résines), soit encore sur la lipolyse par un mode d'action qui reste à élucider sur le plan m~)léc~ ire (les fibrates). Par conséquent, toutes les grandes classes de médicaments, qui ont été utilisées dans cette indication (séquestrants, fibrates ou 20 statines), s'adressent sel~l~m~nt à l'aspect ~vt:llLif de la formation de la plaque d'athérome et non en fait au traitement de l'athérome. Les traitements actuels de l'athérome, post accident coronarien, ne sont que palliatifs puisqu'ils n'interviennent pas sur l'homéostase du cholestérol et qu'ils sont des actes chirurgicaux (by-pass coronarien, angioplastie).
Une première approche pour le traitement de ces pathologies par la thérapie génique a été décrite dans la c~em~n~ W094/25073. Cette approche repose en particulier sur le lldn~rel~ direct de gènes codant pour des apolipo~l~,Léines. La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dy~ o~ téillémies. Elle repose plus particulièrement sur le CA 02214010 1997-09-0~
transfert de gènes codant pour des enzymes impliquées dans le catabolisme du ~hol~stérol. En particulier, le transfert et l'~x~ ssion in vivo de la LCAT selon l'invention permet de manière avantageuse d'agir non se~ m~nt sur le taux de HDLcirculants, mais é~ m~nt sur leur activité enzymatique liée au transport inverse du 5 cholestérol. Cette approche a donc un double effet stimUl~nt visant à ramener le cholestérol vers le foie. La présente invention repose ég~l~m~nt sur l'utilisation de virus qui permettent de transférer et d'exprimer des gènes codant pour des enzymes du métabolisme du cholestérol au niveau du foie, et de sécréter lesdites enzymes dans le système circulatoire où elles exercent leur activité avec une grande ~fflc~cité
0 Les exemples présentés plus loin indiquent notamment que les adénovirus sont capables, selon le mode d~a~ dLion~ de transférer et d'exprimer effiç~cf~m~nt pour une durée importante et sans effet cytopathologique, le gène codant pour lalécithine cholestérol acyltransférase (LCAT).
Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif c~)ntf~n~nt au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lérithin~
cholestérol a~;ylka-~féldse (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
L'invention a ég~lement pour objet l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
La lécithine-cholestérol acyltransférase (LCAT) hllm~in~ est une protéine de 416 acides aminés, glycosylée et ayant une masse moléculaire relative de 65 à 69 kD.
Le gène, ainsi que l'ADNc, codant pour la LCAT, longs respectivement de 4200 et 1744 pb, ont été clonés et séquencés (Mc Lean et coll., Proc.Natl.Acad Sci. 83 (1986) 2335 et Mc Lean et coll., Nucleic Acids Res. 14(23) (1986) 9397). La LCAT est une enzyme qui catalyse l'~st~rific~tion du cholestérol libre par transfert d'un groupement acyl de la phosphatidyl~holine sur un résidu hydroxyle du cholestérol, avec formation d'ester de cholestérol et de lysoph-~ph~ti-lylcholine. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et elle est libérée dans le plasma (6,ug/ml), où elle est associée au lipoprotéines de haute densité (HDL), dites lipo~ioLéi.les antiathérogènes.
CA 022l40l0 l997-09-0~
Ces particules pos~è-i~nt la ç~pacite d'accepter le cholestérol se trouvant en excès dans les c~ , qui est alors estérifié par la LCAT. Les HDL riches en esters de cholestérol sont captées par le foie pour y être ensuite ~limin~-s~ Ce m~ni~me, qui permet l'épuration du ~h<~ rol e~t~é~ nt~ire de l'organisme, est appelé transport 5 inverse du cholestérol et est clairement impliqué dans la pL~:v~l~ion de l'athérogénèse (Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 et Johnson et coll. BBA 1085 (1991)205). La LCAT, en créant un gradient de ch~lest~rol libre entre les membranes plasmiques et les lipoprotéines circ~ ntes, joue très vr~ mhl~hlf~m~nt un rôle majeur dans ce processus.
0 Les conséquences physiologiques d'une ~hs~nre partielle ou totale d'activité
de l'enzyme LCAT dans le plasma sont illustrées par les changements pathologiques observés dans le syndrome de "l'oeil de poisson" (Fish Eye Disease, FES) et de la ~l~fi~ n~e classique en LCAT. Les ~yln~ulnes cliniques de la FES sont l'opacité de la cornée ainsi qu'une atteinte rénale et une anémie. Ces deux syndromes sont associés à
une hypo~lph~ Lule"-~mie et une élévation des triglycérides p l~m~tiques. ns peuvent être distingués par le dosage biochimique de l'activité LCAT dans le plasma.
Aucune activité d'estérification pl~matique du cholestérol n'est décelable chez un patient atteint de la déficience classique en LCAT alors que chez un patient ayant un profil de FES, une activité résiduelle en LCAT est observée. Le transfert du gène de la 2 o LCAT selon l'invention constitue une nouvelle approche pour le traitement des pathologies cardiovasculaires. La capacité de transférer ce gène et de surexprimer la LCAT in vivo permet selon l'invention d'exercer une double activité de stimulation sur l'efflux du cholestérol, liée d'une part à l'~l-gm~nt~til n du taux de HDL circulants et d'autre part à l'augmentation de l'activité enzymatique de ces HDL.
Dans les virus de l'invention, le gène inséré peut être un fragment d'ADN
complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride con~i~t~nt par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques.Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la LCAT ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant -CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/li~G~ 81 désigne tout mutant, fragment ou peptide poe~é~l~nt au moins une propriété
biologique de la LCAT, ainsi que tous v~i~ll~ naturels de la LCAT. Ces fr~gment.s et vcLLiallL~ peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mm~nt par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore 5 par clonage par expression, permettant la sélection de v~;allL~ en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques in~ nt les suppr~eeione, délétions, ml~t~ti~ne, etc.
Le gène inséré au sens de l'invention est ~erél~."i~ ment le gène codant pour tout ou partie de la LCAT humaine. Il s'agit plus ~ri~ Liellement d'un ADNc0 ou d'un ADNg.
Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont natur~ ?m~nt responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut e~lem~nt s'agir de5 séquences d'origine difré~ L~ (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de fa~con in~llctihle ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou 20 du génome d'un virus, et not~mm~nt les promoteurs des gènes ElA, MLP
d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, cc-actine,tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofil~m~nts, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, C~lK, 2 s facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine c~
des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie; Apo AI, Apo AII, Albumine hllm~inf~ etc) ou encore les promoteurs répondant à un stim~ s (récepteur des hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoique, etc,). En outre, ces séquences 30 d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de CA 02214010 1997-09-0~
régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le ~;~nC)m~ du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ~illP~ , le gène inséré co~ rend genPr~l~m~nt, en amont de la séquence 5 codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide syn~héti~e dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la LCAT, mais il peut ég~l~m~nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de0 se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nece~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit ~limin~ (en tout ou en partie), soit rendues non-f~ncti~)nn~lles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène 15 inséré. Pler~lell~iellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont néc~ ires à l'~n~p~ tion des particules virales.
Le virus selon l'invention peut être dérivé d'un adénovirus, d'un virus adéno-associé (AAV) ou d'un rétrovirus.Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus htlm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir ~em~n~le WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De erélellce, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/~9G/1,~:~81 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine h11m~ine ou canine ou mixte.
E'l~r~ iPllPmPnt les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permPtt~nt l'ene~rci-1~tion et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus pLereL~ pllempntJ dans le genomP des adénovirus de l'inventionJ la région E1 au moins est non fnnçtionnelle Le gène viral c-)n~i~1Pré peut être rendu non foncti--nnPI
par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totaleJ substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles mo~ifiç:~tions peuvent être obtenues in vitro (sur de 0 l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent é~lemPnt être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il col-lplelld une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour la LCAT (Cf FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~midf~ dans une lignée cellulaire appropliée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits elémen~, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient not~mm~nt intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o) ou des lignées ç~r~hlP~ de c~mrlPmPnt~r les fonctions E1 et CA 02214010 1997-09-0~
E4 telles que ~ rit~.s not~mm~nt dans les ~l~m~ntlç.e n~ WO 94/26914 et W095/02697.
Fn~uite, les adénovirus qui se sont mllltirli~s sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie molécl-l~ire, comme illustré dans les exemrles.
Cnn~rn~nt les virus adéno~ or-iés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de ce11l~lç~, sans induire d'effet sur la cr i.c.~nce, la morphologie ou la différenciation celll-l~ires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des patholc,gies chez 0 l'h-)mme Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque ~ILelniL~ une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'~nc~psi~i~tion: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent 20 lirrélell~es constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intéret, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un org~ni.~m~) ledit gène d'intéret. Les AAV recomhin~nt.s défectifs selon l'invention peuvent etre préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par 25 exemple un adénovirus), d'un plasmide c~ nt~n~nt la séquence nucléique d'intéret bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un pl~.~mi~l.? portant les gènes d'.?n~ r~ tion (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc ég~lçment un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCT/liR96/00381 séquence codant pour la LCAT bordée des ITR de l'AAV. L'invention c-)n~rnç
é~lem~nt un p1~mi~1e co~ enant une séquence codant pour la LCAT bordée de deux ITR d'un AAV. Un tel pl~mi~e peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de la LCAT, évPntl~llçm~nt incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-5 virus).
Concernant les les l~lrovil~ls, la construction de vecteurs recombinants a étélarge,.~l" décrite dans la liLL~Ia~ voir not~mmçnt EP 453242, EP178220, B~rn~çin et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689,etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en 0 division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'en~rsi~tion et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs rec~-mhin~nt~ dérivés des l~ vil,ls, les gènes gag, pol et env sont généralementdélétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de L~ VilllS tels que no~mm~nt le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des l~lr~vi~ lls recombinants comportant une séquence 20 codant pour la LCAT selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes 25 gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et lalignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les ll;~ Vil ~lS recombin~nt~
peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité
transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'çn~p~ tion ét~n~ues, comportant une WO 96/28553 PCT/1~96/00381 partie du gène gag (Bender et al.J J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
La présente invention cnncerne ég~lem~nt une composition ph~rm~eutique coI~L~llant un ou plusieurs virus recomhin~nts défectifs tels que décrits 5 précé(le-mment De telles compositions peuv~lll être formulées en vue d'une ~lmini~tration par voie topique, orale, pdLeIl~é~ale, intr~n~s~I~, inlldv~ e--ceinLL,~ sc--l~ire, sous-cutanée, intraoculaire, etc.
P~r~r~ iell~m~nt, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en o particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, pof~ssil~m, c~kilIm ou m~gnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Dans leur lItili~ti~n pour le traitement des pathologies liées au~;
dyslipopI~ inémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être ?~lmini~strés selon dirré~ ~ modes, et notamment par injection intraveineuse.
liellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. S'agissant des le~ viius, ils peut être avantageux d'utiliser des cellules infectées ex vivo en vue de 20 leur r~impl~nt~tion in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (W094/24298).
Les doses de virus ntili~é~s pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de clirréI-ell~ paramètres, et notamment en fonction du mode d'~-lministration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une25 manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et ~minis~rés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfulml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 10l~ pfu!ml peuvent ég~lem~nt être lItiIi~ées Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension devirions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appI~liée, et mesure, WO 96/28553 PCr/FR96/00381 génér~lem~nt après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~let~rmin~tion du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la lille.a~
Par ~ r~, les compositions ph~rms~-el-tiques de l'invention peuvent 5 ég~l~m~nt cc,-,lPi1ir un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt.~ défectifs c~nt~n~nt un gène inséré codant pour une apolipupruLéille. L'association de ces deux types de gènes permet d'exercer un effet synergique sur l'activité des HDL et ainsi sur le transport inverse du cholestérol. La construction d'adénovirus c~-nten~nt un gène inséré codant pour une apolipopro~éille a été décrite dans la ciem~n~1e W094/25073. Une 0 association préférée comprend un adénovirus selon l'invention et un adénoviruscontenant un gène codant pour l'apolipoprotéine AI ou l'apolipoprotéine AIV.
La présente invention offre un nouveau moyen très ~~ffi~ce pour le tr~it.?m~nt ou la pl~vt~ ion des pathologies liées aux dyslipo~ inémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la déco"~pensa~ion cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, l'athérosclérose ou la resténose. Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de la LCAT peut être corrigé.
En outre, ce tr;litem~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel 20 que les ovins, les bovins, les ~nim~llx domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non l;,~ ir~i.
LEGENDE DES FIGURES
25 Fg~ ure l: Représentation du plasmide pXL2639.
Fi~ure 2: Représentation du plasmide pXL2640.
Fi~ure3: Transfection des cellules Hep3B par un adéno AdCMV hLCAT. Les cellules Hep3B ont été infectées par un adéno AdCMV hLCAT (Carrés vides) ou adéno AdCMV J3gal (carrés pleins) à des ml~ltipli~it~s d'infection de 10, 25, 50, 100, 250 and 500. L'activité LCAT a été mesurée dans le sl1rn~nt à 72 h. Les 5 ~letermin~tions ont été faites en double et chaque valeur représente la moyenne i écart-type.
Fi~ure 4: Analyse de l'ARN par Northern blot, isolé de foie de souris infectées ou non infectées. L'ARN total provient des foies des souris témoins (1), infectées par l'adéno AdCMV 13gal (2) et l'adéno AdCMV hLCAT (3). 10 ~g d'ARl~- ont été
0 séparés par électrophorèse en f~)rm~kl~hyde-1,2% agarose, transférés sur une membrane de Nylon et hybridés avec dif~ Les sondes LCAT hllmz~in~ et apoE de souris Fi~ures 5A et 5B: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations pl~cm~tiques de cholestérol total et cholestérol-HDL.
Concentrations pl~m~tillues de cholestérol total et cholestérol-HDL (moyenne +
écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV ~gal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-I hllm~in~
*: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV ~3gal, P < 0.0001.
20 Fi~ure 6: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations plasmatiques d'apoA-I hl-m~ine. Concentrations p!~m~tiques d'apoA-I humaine (moyenne + écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV
~3gal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolip~ L~ine A-I
25 hllm~ine *: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV J3gal, P < 0.0001.
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WO 96/28553 PCT/1;~96/00381 Fi~ure 7: Effet du transfert du gène de la LCAT h-~n~ine sur la distribution lipoprotéique du cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 5 108 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (carrés pleins), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds solides) ou témoins (carrés ouverts). le plasma est séparé sur 5 une colonne Superose-6 par chr~m~tographie de gel-filtration, et le cholestérol mesuré dans chaque fractions éluées.
FisJure 8: Effet du transfert du gène de la LCAT h-- n~ine sur les tailles des particules HDL. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ligne pleine) et témoins (ligne discontinue). Les 0 plasma ont été séparés sur un gel de polyaclylamide (gradient 4-205ro) et llal~rér~s par Western blot et l'apoA-I ht~m~ine est alors révélée par des anticorps spécifiques anti-apoA-I hllm~in~ Le blot est ensuite scanné par densitomètrie.
Fi~ure 9: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la mobilité des particules cont~ns~nt l'apoA-I. Les plasma proviennent des souris, 5 jours aprèsl'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV 13gal (1), 5 x 108 pfu d'adéno AdCMV
hLCAT (2) ou 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (3). 2 ,ul de plasma sont utilisés pour séparer les HDL par électrophorèse sur gel d'agarose suivit d'une coloration des lipides au noir Soudan.
Fi~ure lO: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la capacité du 2 o sérum à promouvoir des efflux de cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (cercles ouverts), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV J3gal (carrés solides) ou souris témoins (carrés ouverts).L'efflux de cholestérol est calculé en mesurant la radioactivité dans le milieu et dans les cellules après l'incubation du sérum dilué à 2.5% avec des cellules Fu5Ah 2 5 pr~echargées en cholestérol radioactif.
*: différent des souris témoins, P < 0.01. **: dirrél~nt des souris témoins ou souris infectées avec l'adéno AdCMV 13gal, P _ 0.0005.
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TECHNIOUES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les méthodes classiquement llt~ ép~c en biologie moléculaire telles que les extractions pLèpaLdLLvèS d'ADN pl~mi~ ue, la centrifugation d'ADN pl~mi~lique engradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 5 pl1rifi~tion de fr~mPnt~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlor~rolllle, la précipitation d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de l'isopr~allol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 10 Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubei F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmi(1ps de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fr~gm~ntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~tions du fournisseur.
Le remplissage des exLIé,lliLés 5' pr~min(?nt~s peut être effectué par le fragment de ~lenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli (Biolabs) selon les 20 spé-ific~tions du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommz~n~ tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proçmin~ntes esteffectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en lltili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fr~gm~nt~ d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed_hain_eaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCTf~96/00381 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en llfili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérific~tion des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- :
5467] en ~tili~ nt le kit distribué par Amersham.
EXEMPLES
Exemple 1: Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant le ~ène de la lécithine cholestérol acvltransférase humaine (hLCAT):
0 Comme indiqué avant, les adénovirus recombinants défectifs ont été préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer, après co-transfection dans une lignée cellulaire ap~l~pliée.
A. Pl~pal~lion des plasmides portant le gène de la LCAT humaine:
1. Construction du plasmide pXL2616 Le plasmide pXL2616 contient l'ADNc codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase h1lm~ine n a été construit de la manière suivante:
Le fragment d'ADN correspondant à l'ADNc de la LCAT a été isolé par la technique de RT-PCR à partir des ARN totaux des cellules HepG2 (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia). Les cDNA ont été produits par transcription inverse des ARN polyadénylés à l'aide d'amorces hexanucléotidiques. Une réaction de PCR a alors été réalisée sur ces ADNc avec les oligonucléotides Sq5209: CCC TCG AGG
CCA TCG ATG AGG CCT GAC l l l TTC AAT AAA (SEQ ID n~ 1) et Sq5287:
GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID n~ 2) spécifiques de la séquence de la LCAT hllm~in~ (Mac Lean et coll., Proc. Natl. Acad.
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WO 96/28553 PCT/FR~)G~381 Sci., 83, 1986) et qui permettent l'ajout d'un site ClaI en 5' de la séquence de la LCAT
et d'un site SalI en 3'. Le fragment de 1750 pb obtenu a été cloné dans le pl~mi~e pCR-II (TA cloning Kit, Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le pl~mi~ résultant a été appelé pXL2616.
2. Construction des plasmides pXL2639 (fi~ 1) et pXL2640 (fi~ 2) Les pl~mi~e pXL2639 et pXL2640 c~nti~nn~nt l'ADNc de la LCAT
h1lm~ine, sous le contrôle respectivement du promoteur précoce du CMV et du promoteur LTR du virus RSV.
Ils ont été construits de la manière suiv~:
- digestion des pl~mi~le~ pXL2375 (promoteur CMV) et pXL2376 (promoteur RSV-LTR), décrits dans la ~i~m~n~l~ W094/25073, par ClaI et SalI, ce qui aboutit à l'excision de l'ADNc de l'apoA-I, puis, - insertion du fragment ClaI-SalI du plasmide pXL2616, contf~!nz~nt l'ADNc de la LCAT humaine, dans les pl~cmifles préalablement digérés décrits ci-dessus.
B. Expression de la lécithine cholestérol acvltransférase humaine in vitro L'expression et la fonctionnalité de l'enzyme ont été testées après transfectiontransitoire de cellules 293 par les vecteurs ainsi construits (pXL2639 et pXL 2640).
L'ADN a été introduit par l'int~rmés~i~ire d'un complexe phosphate de calcium-ADN
selon la méthode de Wilger et coll., Cell, 11 (1977) 223.
L'activité LCAT a été mesurée sur les surnageants cellulaires 60 heures après la transfection, selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. La mesure repose sur l'utilisation de protéoliposomes comme substrat exogène, préparés parinc1lh~tion de 30 minutes d'apoA-I, de 14C cholestérol, de phosphatidylcholine à un ratio molaire de 0,8:12,5:250 à 37~C. L'activité est ~ t~rmin~e en mesurant la conversion de 14C- cholestérol en 14C-ester de cholestérol après incllh~tion du substrat avec 4~L1 de plasma ou de surnageant de culture pendant 2 heures à 37~C. Les CA 02214010 1997-09-0~
WO 96/28553 PCTIFR!) 'I~, ~ 3 81 esters formés sont séparés par chromatographie sur couche mince sur plaques de silice à l'aide d'un mélange éther de pétrole-diéthyl éther-acide acétique 76:20:1 et la r~io~ctivité est déterminée par spectrométrie à sl~intill~tion liquide.
Les résultats obtenus montrent que la LCAT hl1m~ine sécrétée par les cellules 5 293 transfectées est fonctionn~lle C. ~al dLion des adénovirus recombinants Les rl~mi~l~c préparés en A ont ensuite été lin~ri~és et cotransfectés pour la recomhin~i~on avec le vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en ~ans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) 0 d'adénovirus.
L'adénovirus Ad.CMVLCAT a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSV~3gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le rl~mi~e pXL2639 selon le protocole suivant: le plasmide pXL2639 linéarisé par l'enzyme XmnI et l'adénovirus Ad.RSV~gal linéarisé par ClaI sont co-5 transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre larecombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est ~mrlifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture c-)ntf~n~nt l'adénovirus défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 1010 20 pfu/ml.
Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad.CMVLCAT est conservé à -80~C dans 20 % de glycérol.
25Le même protocole a été reproduit avec le plasmide pXL2640 con~ iC~nt à
l'adénovirus recomhin~nt Ad.RSVLCAT.
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Exemple 2: Expression in vitro du ~ène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif L'~ ~sion et la fonctit-nn~lite de l'enzyme ont été testées après infection de cellules Hep3B (lignée cellulaire d'hépatocytes hllm~in~) par l'adénovirus recomhin~nt 5 AdCMV-hLCAT à des MOI de 1OJ 25, 50J 1OOJ 250 et 500. L'adé~novin~s recomhin~nt AdCMV13gal a été utilisé comme contrôle. L'activité LCAT (quantité
totale dJesters de cholestérol produits en 1 heure dans 100 ~1 de milieu de culture) a été mesurée sur les surnageants cellulaires 72 heures après l'infectionJ selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. Les résultats (fig. 3) montrent que la 10 LCAT hllm~in~ sécrétée dans le milieu de culture est fonctionnelle et que le niveau d'expression de l'enzyme est dépendant de la concentration virale dans les cellules.
Exemple 3: Expression in vivo du ~ène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif Des souris C57B1/6 transgéniques pour l'apoA-I hllm~in~ ont été infectées par injection dans la veine de la queue d'adénovirus recombinant AdCMV-hLCAT (5 x 108 ou 1 x 109 pfu), AdCMV-~Gal (1 x 109 pfu) ou de solution non virale. Des niveaux très élevés d'activité LCAT ont été détectés dans le plasma des souris infectées par l'AdCMV-hLCAT (de 3266+292 à 9068+812 nrnol/mVh) 5 jours après l'injection, tandis que les niveaux observés chez les souris non infectées ou infectées 20 par l'AdCMV-~Gal correspondent à l'activité LCAT basale du plasma de souris.
Un Northern blot, réalisé avec les ARN de foie de souris infectées par l'AdCMV-hLCAT, a permis de révéler l'expression d'une seule espèce d'ARN messager s'hybridant avec une sonde correspondant à l'ADNc complet de la LCAT h1lm~ine, tandis qu'un Northern blotting, réalisé avec les ARN de foie des souris contrôles n'a 25 mis en évidence aucune hybridation (fig.4).
Exemple 4: Effets de l'expression de la LCAT humaine sur les niveaux plasmatiques des li~!o~ téines et apolipoprotéines.
L'e,~p ~e~ion transitoire de la LCAT h~ -.? a entraîné un ~h~n~m~nt ~ignifiç~tif des concentrations en lipides circulants et en apolipopl-~L~le A-I hllmsline (hapoA-I). Les 5 variations les plus importantes ont été observées 5 jours après l'injection et sont r~ me~ dans la Table I.
Les souris infectées par 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT ont des niveaux de HDL-cholestérol et de cholestérol total (CT) pl~m~ti~lues 7 et 6 fois supérieurs, respectivement, aux niveallx obtenus chez les souris contrôles (figure 5a et 5b). Ces 0 variations sont associées à une augmentation à la fois du cholestérol estérifié (CE) et du cholestérol libre (CL), respectivement de 8 et 2,5 fois par rapport aux niveaux obtenus chez les souris contrôles. L'augmentation du CE pl~m~ti~lue conduit à une augmentation du rapport CE/CT dans la fraction HDL. Les souris infectées par l x109 pfu d'AdCMV-hLCAT prés.?ntent un accroissement de 2,5 fois de la 5 concentration en apoA-I hllm~ine par rapport aux souris contrôles (figure 6).
CA 022l40l0 l997-09-05 Table I. Paramètres lipidiques et apolipoprotéiques dans le plasma des souris tr~n~g~niques apoA-I hllm~ines témoins et infectées par des adénovirus.
Souris Souris infectées Souris ;~)re~e~ Souris infectées témoins par AdCMV Bgal par AdCMV- par AdCMV-(n=5) (n=5) LCAT (n=2) LCAT (n=5) 1 x lOg pfu/mioe 5 x 108 pfulrnio- 1 x 109 pfu/mioe ~h~ ct~rol 132 i 14 139 i 18 462 i 116C 827 i49a total (CT) Esters de 68 i 8 71 i 10 319 i 22b 587 i 41a rh~lPctf~rol (CE) ~h~ stf~rol libre (FC) 63 i 11 68 i 9 143 i 37C 239 i62b CE/CT 0,52 i 0,06 0,51 i 0,07 0,69 i 0,04C 0,71 i 0,04C
(VLDL+LDL) 15 i 3 20 i 6 33 i 12d 30 i 3c,e -TC
Triglycérides 49 i 3 S0 i 7 90 i 5c 140 i 7b Phospholipides 313 i 40 309 i 20 773 i 53c 954 i 65b h apoA-I 247 i 14 246 i 30 542 i 32C 616 i l7a Activité LCAT 45 i 2 45 i 3 3266 i 292a 9068 i 812a (nmoVml~) Vitesse d'esterification 149 i 11 161 i 17 ND 340 i 5C
endo~ène (nmol/mVh) HDL-TC 117 i 12 119 i 14 429 i 127C 797 i 48a HDL-CE 66 i 8 67 i 10 317 i 11b 570 i 2oa HDL-FC 51ill 52il2 112i26C 227_53b CE/CT dans 0,56 i 0,05 0,57 i 0,05 0,74 i 0,03C 0,72 i 0,03C
les HDL
Toutes les valeurs de lipides et lipop~ es sont exprimées en mg/dl. ap<0.0001, bp<o 0004, Cp<0 01, dp=NS. Différent des souris témoins et des souris infectées par 5 l'adéno AdCMV J3gal-infected. ep=NS Différent des souris infectées par l'adénoAdCMV ~gal-infected CA 02214010 1997-09-0~
WO96/285S3 PCTIFR~ 3Bl Exemple 5: Effets de l'~ . ~ion de la LCAT humaine sur la répartition du cholestérol dans les lipoprotéines. Ia taille et la mobilité électrophorétique des HDL
La i~alLi~ion du ~~h~lest~rol dans les fractions lipopr.~eiques a été réalisée à partir de 5 pools de pl~m~c de souris par chromatographie analytique par filtration sur gel (fig.7). Les concentrations de CT et d'apoA-I hnm~in~ ont été clétermin~s dans les fractions éluées. Ces analyses révèlent une accl~mlll~ti- n importante de cholestérol dans la fraction HDL ainsi qu'une augmentation de taille des HDL pour les sourisinfectées par 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT par rapport aux souris contrôles.
0 L'apoA-I humaine est ~:ILuuv~e associée aux particules de la taille des HDL.
Il a été montré que la distribution en taille des lipoprotéines c-~nten~nt de l'apoA-I
chez les souris tr~n~niques pour l'apoA-I h~lm~int~ était bimodale, avec des tailles de pics de 9,4 nm et 11nm. Alors que chez les souris contrôles, cette même distribution est conservée, elle est altérée chez les souris infectées par l'AdCMV-hLCAT. Pour les 5 souris ayant reçu 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT, le pic le plus petit disparaît au profit de deux pics plus grands de 13,3 et 14,2 nm (fig.8).
Les lipoprotéines pl~m~tiques ont été séparées par électrophorèse dans un gel d'agarose non dénaturante, suivie par une détection des lipides. Comme le montre la figure 9, des HDL possédant une mobilité pré-alpha apparaissent dans les plasmas des 20 souris infectées par l'AdCMV-hLCAT, révélant que non sel-lem~nt la taille des HDL
est affectée mais ég~lem~nt les charges à la surface des HDL.
En résumé, l'expression forte et transitoire de la LCAT hnm~in~ chez les souris transgéniques pour l'apoA-I hllm~in~ conduit à la formation d'un profil lipoprotéique moins athérogène, grâce à l'augme~ ti~n des concentrations en HDL-cholestérol et25 en apoA-I hllmsline, ainsi que l'augmentation de taille et de charge des HDL.
Exemple 6: Effets de l'expression de la LCAT humaine sur l'emux de cholestérol cellulaire CA 02214010 l997-os-05 Wo 96/28553 PCT/FR96/00381 L'efflux du cholestérol c~ ire a été déterminée après inc~ ation des cellules d'hépa~onle de rat Fu5AH avec des pools de plasmas de souris infectées ou non. La figure 10 montre qu'une ~llgm~nt~tion de 65~ de l'efflux est obtenu avec le plasma des souris infectées par l'AdCMV-hLCAT par rapport au plasma des souris infectées 5 par l'AdCMV Bgal. Il s'avère que cette ~llgmentsltinn est en relation avec lescon~ntrations plus élevées d'apoA-I hllms~in~ et de HDL-cholestérol chez les souris infectées par l'AdCMV-hLCAT. Ces résultats sont en faveur d'une plus grande efficacité du transport inverse du cholestérol résultant de la forte expression de LCAT
hnm~int~
CA 02214010 1997-09-0~
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION:VIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA LECITHINE
CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: double 35 - (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) ~ESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFOR~L~TIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (b) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc W 096/28553 PCTA~R96/00381 (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Claims (20)
1. Virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
2. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée.
3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2.
4. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine.
5. Virus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène inséré code pour tout ou partie de la LCAT humaine ou d'un variant de celle-ci.
6. Virus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène inséré code pour la LCAT humaine.
7. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNc.
8. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNg.
9. Virus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le gène inséré comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée.
10. Virus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le gène inséré comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
11. Adénovirus selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion de tout ou partie de la région E1.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion de tout ou partie de la région E4.
13. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un virus adéno-associé (AAV).
14. Virus selon la revendication 13 caractérisée en ce que son génome comprend le gène codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci bordé de 2 ITR.
15. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un rétrovirus.
16. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'athérosclérose et/ou de la resténose.
18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable et en ce qu'elle comprend de 10 4 à 10 14 pfu/ml d'adénovirus.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'elle contient également un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs codant pour une apolipoprotéine.
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