MXPA99004301A - Adenovirus recombinantes bicistronicos para el tratamiento de patologias relacionadas a las dislipoproteinemias - Google Patents

Abstract

La presente invención concierne a un virus recombinante defectuoso y de preferencia a un adenovirus caracterizado porque comprende al menos dosácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/o co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, dichosácidos nucleicos que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES. Se refiere además a construcciones plasmídicasútiles para preparar estos adenovirus, a células transformadas por estos plasmadosóadenovirus y a composiciones farmacéuticas que contienen dichos adenovirus.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTES BICISTRONICOS PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGÍAS RELACIONADAS A LAS DISLIPOPROTEINEMIAS La presente invención concierne a nuevos virus recombinantes, su preparación y su utilización en terapia genética, para la transferencia y la expresión in vivo de genes deseados. Más precisamente, concierne a virus recombinantes que comprenden al menos dos genes insertados y cuyos productos de expresión intervienen al nivel del transporte inverso del colesterol. Se refiere igualmente a los plásmidos transportadores útiles para la producción de adenovirus conformes a la invención. Más particularmente, la presente invención concierne a los adenovirus recombinantes defectuosos y su utilización para la prevención ó el tratamiento de las patologías relacionadas a las dislipoproteinemias, que son conocidas por sus consecuencias graves al nivel cardiovascular y neurológico.

Las dislipoproteinemias son alteraciones del metabolismo de las lipoproteinas, responsables del transporte, en la sangre y los fluidos periféricos, de lipidos como el colesterol y los triglicéridos. REF. 30006 Conducen a patologías importantes, relacionadas respectivamente a la hipercolesterolemia ó hipertriglicéridemia, tales como particularmente la arterieesclerosis .

La arterieesclerosis es una enfermedad compleja, poligenética, que está definida sobre el plano histológico por depósitos (placas lipidicas ó fibro-lipidicas) de lipidos y de otros derivados sanguíneos en la pared de las grandes arterias (aorta, arterias coronarias, carótida) . estas placas, mas ó menos clasificadas según el avance del proceso, pueden estar acompañadas de lesiones y están relacionadas a la acumulación en las arterias de depósitos grasosos constituidos esencialmente de esteres de colesterol. Estas placas se acompañan de un engrosamiento de la pared arterial, con hipertrofia del músculo liso, aparición de células espumosas y acumulación de tejido fibroso. La placa artero atosa está muy netamente en relieve sobre la pared, lo que le confiere un carácter estenosante responsable de las oclusiones vasculares por arteroma, trombosis ó embolia que sobreviene en los pacientes más aquejados. Las hipercolesterolemias pueden entonces conducir a patologías cardiovasculares muy graves tales como los infartos, la muerte súbita, la descompensación cardiaca, los accidentes cerebro-vasculares, etc.

Es entonces particularmente importante poder disponer de tratamientos que permitan disminuir en ciertas situaciones patológicas los índices de colesterol plasmático hasta estimular el efluvio de colesterol (transporte inverso del colesterol) al nivel de los tejidos periféricos a fin de descargar las células que tengan acumulado colesterol en el contexto de la formación de una placa de arteroma. El colesterol es vehículado en la sangre por diversas lipoproteínas de las cuales las lipoproteínas de leve densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL) . Las LDL son sintetizadas al nivel del hígado y permiten proveer los tejidos periféricos en colesterol. al contrario, los HDL captan el colesterol al nivel de los tejidos periféricos y lo transportan hacia el hígado en donde es almacenado y/ó degradado.

Entre las dislipemias más corrientes figuran aquellas caracterizadas por un índice de colesterol LDL (lipoproteína de leve densidad) elevado y la hipoalfalipoproteinemia. Esta última se caracteriza por un índice de colesterol HDL (lipoproteínaa de alta densidad) inferior a 35 mg/dl y representa 40 % de los casos de las dislipemias (Genest y colaboradores, 1992) . La hipoalfalipoproteinemia parece relacionada a una deficiencia genética de una ó varias proteínas implicadas en la síntesis, la maduración y el catabolismo de las partículas HDL y tiene seguido por consecuencia la aprición prematura de enfermedades cardiovasculares (Dammermann y colaboradores, 1995) . De una forma general, existe una correlación inversa entre la incidencia de estas últimas y el índice de partículas HDL (Miller y colaboradores, 1987) .

El efecto protector de los HDL contra las enfermedades cardiovasculares ha sido demostrado por experiencias de transporte de gen in vivo sobre las cepas de ratones susceptibles de desarrollar las lesiones arterioesclerosas y en las cuales el aumento del número de partículas HDL inhibe el desarrollo de estas lesiones (Rubin y colaboradores, 1991) ; Plump y colaboradores, 1994) . Se ha propuesto que el efecto protector de las partículas HDL sea debido a su papel en el transporte inverso del colesterol (Reiche y colaboradores, 1989) . el transporte inverso es el proceso por el cual el colesterol en exceso es transferido del tejido periférico hacia el hígado para su eliminación (figura 1) . Está compuesto de una serie de etapas que comprenden la tomada a cargo y la esterificación del colesterol sobre las partículas HDL, así como su transporte sobre las partículas lipoproteícas de leve densidad que son recaptadas ulteriormente por el hígado y este proceso implica implícitamente la aplicación de cierto número de proteínas - como la CETP, de enzimas cuyo colesterol aciltransferasa y la lipasa hepática y/ó sus co-factores como las apolipoproteínas AI y AIV.

Ya que existen tratamientos eficaces para disminuir el índice del colesterol LDL y de triglicéridos fundados sobre medicamentos hipolipidémicos y antihipertensores, los tratamientos actuales de la hipoalfalipoproteína no ofrecen más que una eficiencia limitada.

La presente invención se interesa presisamente en el tratamiento, por terapia genética, de las patologías relacionadas a la hipolipoproteinemia.

La aproximación terapéutica deducida por la presente invención contempla aumentar la cinética del transporte inverso del colesterol a fin de inducir la regresión de las lesiones arterioesclerosas ó bien prevenir su formación. Ventajosamente este objetivo es alcanzado según la invención vía una expresión simultánea y eficaz, en las células a tratar, de al menos dos de las proteínas, enzimas ó cofactores que intervienen al nivel del transporte inverso del colesterol.

En el sentido de la invención, una proteína, enzima y/ó • uno de sus co-factores es considerado como estando implicado en el transporte inverso del colesterol en la medida en la que toda perturbación al nivel de su concentración celular, afecta automáticamente el proceso inverso del colesterol.

A título representativo de las enzimas concernidas se puede más particularmente citar la lecitina colesterol aciltransferasa y la lipasa hepática.

La lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT) es una glicoproteína de 67 kDa, sintetizada por el hígado, que cataliza el transporte de un grupo acil de la lecitina al colesterolproduciendo la lisofosfatidilcolina y esteres de colesterol (Glomset, 1968) . El cofactor de esta enzima es la apolipoproteína AI que está ligada a la superficie de las partículas HDL. Manteniendo el gradiente de concentración en colesterol entre las células periféricas y los HDL, juega un papel principal en la primera etapa del transporte inverso del colesterol.

La lipasa hepática (LH) humana es una glicoproteína de 66 kDaen las actividades triglicérida hidrolasa y fosfolipasa, sintetisada y secretada apor los hepatocitos. Ligada a la superficie de las células hepáticas, vía los sulfatos de proteoglicanos heparina, participa en el metabolismo de los kilomicrones, de los IDL (lipoproteínas de densidad intermediaria) y de los HDL. La LH tiene una afinidad particular para las partículas grandes HDL de las cuales degrada los fosfolípidos y los triglicéridos generando partículas discoidales de HDL que tienen la propiedad de aceptar el colesterol celular. La deficiencia en LH en el hombre se caracteriza por una cantidad elevada de LDL ricas en triglicéridos, grandes partículas HDL y el desarrollo precoz de la arterioescelrosis (Hegele y colaboradores, 1993) .

En lo que concierne a las proteínas, se trata en el seno de la invención más preferencialmente de la proteína de transporte de los esteres del colesterol (CETP) , de las apolipoproteínas AI y AIV ó de una de sus variantes .

La proteína de transferencia de los esteres del colesterol (CETP) es una glicoproteína de 74 kDa sintetizada en el tejido adiposo y el hígado, en el plasma, está principalmente asociada a los HDL. Es ahí que cataliza el transporte de los esteres de colesterol de los HDL hacia las lipoproteínas de leve densidad. Este transporte es seguido del paso de los triglicéridos de las lipoproteínas de leve densidad hasta los HDL. La sobre-expresión de la CETP en los ratones transgénicos hipertriglicemídicos inhibe el desarrollo de las lesiones arterioesclerosas (Hayek y colaboradores, 1995) . Esta experiencia está de acuerdo con la observación, en los individuos deficientes en CETP, de un desarrollo precoz de enfermedades cardiovasculares (Zhong y colaboradores, 1996) .

La apolipoproteína AI es una proteína constituida de 243 ácidos a inados, sintetizada bajo la forma de una prepropéptido de 267 residuos, que tienen una masa molecular de 28,000 daltones. Esta sintetizda en el hombre específicamente en el hígado y el intestino y constituye la proteína esencial de las partículas HDL (70 %) de su masa en proteínas). Ella es abundante en el plasma (1.0-1.2 g./l.) Su actividad mejor caracterizada sobre el plano bioquímico es la activación de la lecitina-colesterol acil-transferasa (LCAT) , pero otras numerosas actividades le son atribuidas, como particularmente la estimulación del flujo del colesterol celular. La apolipoproteína AI juega un papel mayor en la resitencia a la arterieesclerosis relacionada con el transporte inverso del colesterol. su gen, largo de 1863 bp, ha sido clonado y secuenciado (Sharpe y colaboradores, Nucleic Acid Res. 12(9). (1984) 3917). entre los productos proteicos con actividad de tipo apolipoproteína AI, se puede citar particularmente las variantes naturales descritas en la especialidad anterior.

La apolipoproteína AIV (apoIV) es una proteína constituida de 376 ácidos aminados, sintetizada específicamente en el intestino bajo la forma de un precursor de 396 residuos. En lo que concierne su actividad fisiológica, se sabe que puede activar in vitro la lecitina-colesterol-acriltransferasa (LCAT) (Steinmetz y colaboradores, 1985, J. Biol. Chem., 260 : 2258-2264) y que puede, como la apolipoproteína AI, interferir con la fijación de las partículas de HDL sobre las células endoteliales aórticas bovinas (Savion y colaboradores, 1987, Eur. J. Biochem, 257 : 4171-4178) . Estas dos actividades indican que la apoAIV interviene muy plausiblemente como mediador del transporte inverso del colesterol. El gen de la apoAIV ha sido clonado y descrito en la especialidad anterior (ver particularmente WO 92/05253) . Entre los productos proteicos con actividad de tipo apolipoproteina AIV, se puede citar particularmente los fragmentos y derivados descritos en la solicitud de patente FR 92 00806.

Más precisamente, la presente invención descansa sobre la utilización de virus recombinantes que permiten transferir y expresar al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores implicados en el transporte inverso del colesterol.

De manera inesperada, la solicitanteha también puesto en evidencia que era posible asegurar eficazmente el transporte y la expresión de al menos dos ácidos nucleicos a partir de un mismo virus recombinante, integrando estos ácidos nucleicos en dicho virus bajo la forma de una unidad bicistrónica. Es claro que el empleo de un único virus y no de dos presenta numerosos intereses sobre el plano terapéutico.

Primeramente, es mas ventajoso construir un único virus recombinante incorporando los dos genes que dos virus recombinantes respectivos.

Asimismo, la aplicación sobre el plano terapéutico de un vector tal como el reivindicado pe ite reducir a la mitad las cantidades de virus recombinantes necesarias para la expresión de dichos genes. Esto es muy particularmente benéfico considerando la respuesta inmunitaria clásicamente manifestada en relación a las células infectadas por virus recombinantes . Esta respuesta inmunitaria se traduce ordinariamente por una destrucción de las células infectadas y/ó una respuesta inflamatoria importante. Es claro que estas dos manifestaciones son fuertemente perjudiciales al nivel de la duración de expresión de los genes terapéuticos y entonces del efecto terapéutico esperado.

En fin, un transporte eficaz y a concentración igual de dos virus recombinantes distintos es un evento incierto y quenecesita entonces ser controlado por menipulaciones suplementarias. En el caso de la aplicación de un virus recombinante según la invención, puede franquearse ventajosamente este tipo de control.

Ventajosamente, los virus reivindicados son capaces de transferir y de expresar eficazmente, para una duración importante y sin efecto citopatológico, dos ácidos nucleicos que codifican para proteínas, enzimas y/ó co-factores implicados en el transporte inverso del colesterol.

Un primer objeto de la invención reside pues en un virus recombinante defectuoso que comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó cofactores, distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, dichos ácidos nucleicos estando relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES.

Los ácidos nucleicos son de preferencia seleccionados entre los genes que codifican para toda ó parte de la lecitina colesterol-aciltransferasa (LCAT) , la proteína de transporte de los esteres del colesterol (CETP)-, la lipasa hepática LH) , las apolipoproteínas AI y AIV ó alguna de sus variantes .

Los ácidos nucleicos insertados pueden ser fragmentos de ADN complementario (ADNc) , de ADN genómico (ADNg) , ó construcciones híbridas consistentes por ejemplo en un ADNc en los cuales serían insertados uno ó varios intrones. Puede igualmente tratarse de secuencias sintéticas ó semisintéticas . Como se indicó anteriormente, puede tratarse de un gen que codifica para toda ó parte de una de las enzimas, proteína y/ó co-factores implicados en el transporte inverso del colesterol ó de una variante de éstas, en el sentido de la invención, el término variante designa todo mutante, fragmento ó péptido que posea al menos una propiedad biológica del producto proteico considerao, así como, en caso contrario, sus variantes naturales respectivas.

Estos fragmentos y variantes pueden ser obtenidos por toda técnica conocida por el experto en la materia, y particularmente por modificaciones genética y/ó química y/ó enzimática. Las modificaciones genéticas incluyen las supresiones, eliminaciones, mutaciones, etc.

Los ácidos nucleicos insertados en el sentido de la invención son preferencialmente los gnes que codifican para todo ó parte de las enzimas, proteínas y/ó co-factores correspondientes humanos. Se trata mas preferencialmente de ADNc ó ADNg.

' Cada ácido nucleico insertado puede igualmente comprender secuencias de activación, de regulación, etc. Por otra parte, comprende generalmente, hacia el inicio de la secuenica codificante, una secuenica indicadora que dirige el polipéptido sintetizado en las vías de secreción de la célula objetivo. Esta secuencia indicadora puede ser su secuencia indicadora natural, pero puede igualmente tratarse de cualquier secuencia indicadora funcional, ó de una secuneica indicadora artificial.

Según una modalidad de realización particular de la invención, los virus recombinantes reivindicados comprenden al menos un ácido nucleico que codifica para la LCAT. Mas preferencialmente, el segundo ácido nucleico insertado codifica para la LH, la CETP ó la apoAI .

Corrióse explicó precedentemente, la co-expresión de dos ácidos nucleicos considerados es asegurada vía preliminarmente la formación de un ARN único que es después traducido para conducir a las dos enzimas respectivas. Para estos fines, el virus recombinante incorpora además las dos secuencias de ácidos nucleicos, al menos un promotor transcripcional, un sitio de poliadenilacion y una secuencia IRES.

Este promotor transcripcional ' está relacionado operacionalmente a los ácidos nucleicos que codifican de manera de producir el ARN bicistrónico y de conducir la expresión de las dos enzimas respectivas a partir de dicho ARNm. Según una modalidad preferida de la invención, es colocado directamente en el inicio del primer ácido nucleico.

Este promotor transcripcional puede particularmente ser seleccionado entre las secuencias que son naturalmente responsables de la expresión de dicho ácido nucleico en frente del cual está colocado en el inicio bajo reserva, por supuesto, de que estas secuencias sean susceptibles de funcionar en la célula infectada. Puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, ó aún sintéticas) . Particularmente, se puede tratar de secuenicas de ácidos nucleicos eucarotas ó virales ó de secuencias derivadas, que simulan ó reprimen la transcripción de un gen de manera específica ó no y de manera inducible ó no. A título de ejemplo, puede tratarse de secuenicas promotoras procedentes del genoma de la célula que se desea infectar, ó del genoma de un virus, y particularmente, los promotores de los genes E1A, MLP de adenovirus, el promotor CMV, LTR-RSV, MT-1, SV40 etc. Entre los promotores eucariotas, se puede citar igualmente los promotores ubiquitarios (HPRT, vimentina, a-actina, tubulina, etc.), los promotores de los filamentos intermediarios (desmina, neurofilaraentos, queratina, GFAP, etc) los promotores de genes terapéuticos (tipo MDR, CFTR, factor VIII, etc.) los promotores específicos de tejidos (piruvato cinasa, villina, promotor de la proteína intestinal de relación de los ácidos grasos, promotor de la actina a de las células del músculo liso, promotores específicos para el hígado; Apo AI, Apo AII, albúmina humana etc.) ó aún los promotores que responden a un estímulo (receptor de las hormonas esferoides, receptor del ácido retinoico, etc.). Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por adición de secuenicas de activación, de regulación, etc.

En lo que concierne a la secuencia IRES, deriva de preferencia de unpicornavirus . Más precisamente, esta secuencia IRES de picornavirus es procedente ya sea del virus encefalomiocarditis ó bien de poliovirus. Se trata mas preferencialmente del fragmento procedente del encefalomiocarditis presente en el vector pCITE-2a+ de NOVAGEN.

Para fines de claridad de lenguaje, la construcción definida por el promotor transcripcional, los dos ácidos nucleicos, el sitio de poliadenilación y la secuencia IRES presente entre los dos ácidos nucleicos, será identificada a continuación bajo la denominación de cartucho bicistrónico.

Los virus según la presnte invención son defectuosos, es decir incapaces de replicarse de forma autónoma en la célula objetivo. Generalmente, el genoma de los virus defectuosos en el marco de la presente invención está aún desprovisto al menos de las secuencias necesarias para la réplica de dicho virus en la célula infectada, estas regiones pueden ser ya sea eliminadas ( en todo ó en parte) , ya sea convertidas en no-funcionales, ó bien substituidas por otras secuencias y particularmente por el cartucho bicistrónico definido anteriormente. Preferencialmente, el virus defectuoso conserva sin embargo las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsulación de las partículas virales.

El virus según la invención puede ser derivado de un adenovirus, de un virus adenoasociado (AAV) ó de un retrovirus. Según una modalidad de realización preferida, se trata de un adenovirus.

Existen difernetes serotipos de aenovirus, cuya estructura y propiedades varían un poco. entre estos serotipos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus humanos de tipo 2 ó 5 (Ad 2 ó Ad 5) ó los adenovirus de origen animal (ver solicitud W094/26914) . entre los adenovirus de origen animal utilizables en el marco de la presente invención se puede citar los adenovirus de origen canino, bovino, murina, (ejemplo: Mavl, Beard y colaboradores, Virology 75 (1990) 81) , ovino, porcino, aviar ó aun simiano (ejemplo: SAV) . De preferencia, se utiliza en el marco de la invención adenovirus de origen humano ó canino ó mixto.

Preferencialmente, en el genoma de los adenovirus de la invención, la región El al menos es no funcional. El gen viral considerado puede ser convertido no funcional por toda técnica conocida por el experto en la materia, y particualrmente por supresión total, substitución, eliminación parcial, ó adición de una ó varias bases en el ó los genes considerados. Tales modificaciones pueden ser obtenidas in vitro (sobre el ADN aislado) ó in situ, por ejemplo, por medio de técnicas de ingeniería genética, ó aun por tratamiento por medio de agentes mutágenos. Otras regiones pueden igualmente ser modificadas, y particularmnete la región E3 (WO95/02697) , E2 (W094/28938) , E4 <W094/28152, WÓ94/12649, WO95/02697) y L5 (WÓ95/02697) . Según una modalidad preferida de aplicación, el adenovirus según la invención comprende al menos una eliminación en la región El y una eliminación en la región E3. en los virus de la invención, la eliminación en la región El se extiende preferencialmente de los nucleótidos 455 a 3329 sobre la secuencia del aenovirus Ad5. Según otra modalidad de realización preferida, el cartucho bicistrónico es insertado al nivel de la eliminación en la región El.

Una modalidad particular de la presente invención concierne aún a un adneovirus recombinante defectuoso caracterizado en que comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, dichos ácidos nucleicos que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interna del ribosoma IRES.

A título de adenovirus recombinantes preferidos según la invención se citará mas particularmente los adenovirus recombinantes defectuosos que comprendan al menos un ácido nucleico que codifica para la LCAT y un ácido nucleico que codifica ya sea para la LH, la CETP ó la apoAI, dichos ácidos nucleicos que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES.

A título representativo de estos adenovirus se puede particularmente hacer mención del representado en la figura 2, que contiene los genes que codifican respectivamente para la LCAT y la CETP y procedente de la recombinación homologa entre el pXL 2974 y el pXL2822.

Los adenovirus recombinantes defectuosos según la invención pueden ser preparados por toda técnica conocida por el experto en la materia (Levrero y colaboradores, .Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). en particular, pueden ser preparados por recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que contenga entre otros el cartucho bicistrónico. La recombinación homologa se produce después de co-transfección de dichos adenovirus y plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe de preferencia (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) , contener las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectuoso, de preferencia bajo forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea, se puede mencionar la línea de riñon embrionario humano 293 (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene particularmente, integrado en su genoma, la parte izquierda de genoma de un adenovirus Ad5 (12%) ó de las líneas capaces de complementar las funciones El y ' E4 tales como se describieron particularmente en las solicitudes no. WO 94/26914 y WO95/02697. A continuación, los adenovirus que se han multiplicado son recuperados y purificados según las técnicas clásicas de biología molecular, como se ilustró en los ejemplos.

Sin embargo, según una modalidad privilegiada de la invención, los adenovirus reivindicados son preparados según un procedimiento original descrito en la solicitud de patente WO96/25506 que aplica a título de plásmido transportador, un plásmido procariota que comprende un genoma de adenovirus recombinante bordeado por uno ó varios sitios de restricción no presentes en dicho genoma. Este protocolo es particularmente ilustrado en la figura 2. Este procedimiento es particularmente interesante ya que permite franquearse del empleo de una segunda construcción que aporta otra parte del genoma viral, y dé la etapa, de recombinación en la línea de transcomplementación.

Un segundo objeto de la presente invención apoya precisamente plásmidos procariotas particulares aplicados para la producción de los adenovirus reivindicados.

Según una modalidad preferida de la invención, estos plásmidos procariotas integran el cartucho bicistrónico precedentemente descrito.

Más precisamente, la presente invención tiene igualmente por objeto un plásmido procariota que comprende un genoma de adenovirus y al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, los dos ácidos nucleicos que está relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interna del ribosoma, IRES.

De manera preferencial, los plásmidos procariotas según la invención, comprenden una primera región que permite la réplica en las células procariotas y una segunda región que contiene el genoma adenoviral bordeado de uno ó varios sitios de restricción no presentes en dicho genoma y en la que están presnetes al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e" implicados en el transporte inverso del colesterol, estos dos ácidos nucleicos que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuenica que codifica para un sitio de entrada interna del ribosoma, IRES.

En lo que concierne las definiciones de las enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos é implicados en el transporte inverso del colesterol, el promotor transcripcional, el sitio de poliadenilación y la secuencia IRES misma en lo que toca su organización en el seno de dicho cartucho se atribuirá lo que ha sido descrito precedentemente .

La región que permite la réplica en las células procariotas, utilizada en los plásmidos reivindicados, puede ser todo origen de réplica funcional en las células seleccionadas. Puede tratarse de un origen de réplica procedente de un plásmido del grupo de incompatibilidad P (ejemplo = pRK290) que permite la réplica en las cepas de E.coli pol A. Más generalmente, puede tratarse de todo origen de réplica- procedente de un plásmido que se replica en las células procariotas. Este plásmido puede ser un derivado de RK2, de pBR322 (Bolívar y colaboradores, 1977), un derivado de pUC (Viera y Messing, 1982), ó de otros plásmidos que. derivan del mismo grupo de incompatibilidad, es decir de ColEl ó de pMBl por ejemplo, estos plásmidos pueden ser seleccionados por otra parte en otros grupos de incompatibilidad que se replican en Escherichia coli. Puede tratarse de plásmidos derivados de plásmidos pertenecientes a los grupos de incompatibilidad A, B, Fl, FII, FUI, FIV, Hl, Hll, II, Y2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z ó 9 por ejemplo. Otros plásmidos pueden aún ser utilizados, entre los cuales plásmidos que no se replican en E. coli sino en otros huéspedes tales como B. subtilis, Strptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Strptomyces preistinaespiralis, enterococcus faecium ó Clostridium. A título preferencial, se utiliza los orígenes de réplica procedentes de plásmidos que se replican en E. coli.

Co o se indicó precedentemente, el genoma adenoviral presente en los plásmidos de la invención es ventajosamente un genoma completo ó funcional, es decir que no necesita la aportación de otras regiones, por recombinación ó ligadura, para la producción de las reservas virales en las líneas de • encapsulación seleccionadas.

Preferencialmente, el genoma adenoviral recombinante comprende al menos secuencias ITR y una secuencia -que permite la encapsulación. En una modalidad de realización preferida de la invención, este genoma del adenovirus utilizado está desprovisto de toda ó parte de la región El. venta osamente, el genoma del adenovirus utilizado está desprovisto de una parte de la región El comprendida entre los nucleótidos 454 a 3328 (fragmento PvuII-BglII) ó 382 a 3446 (fragmento HinflI- Sau3A) .

Según una modalidad de realización particularmente ventajoso, el genoma del adenovirus utilizado está igualmente desprovisto de toda ó parte de la región E3 y/ó E4. Según una modalidad de realización particular de la invención, se trata de un genoma de adenovirus desprovisto en regiones El y E3.

Más precisamente, los plásmidos procariotas reivindicados que comprenden en orientación 5' -3' al menos un origen de réplica funcional en las células procariotas, una primera parte de un genoma adenoviral que comprende las secuencias virales ITR?, un promotor transcripcional, un primer ácido nucleico que codifica para una enzima, proteína y/ó un co-factor implicado en el transporte inverso del colesterol, un sitio de poliadenilación y una segunda parte de un genoma adenoviral que comprenda la región pIX-lVA2.

Ventajosamente, los plásmidos procariotas reivindicados según la invención comprenden igualmente una región que permite la selección de las células procariotas que contengan dicho plásmido. Esta región puede estar constituida particularmente por todo gen que confiera la resitencia a un producto, y particularmente a un antibiótico. Así, se puede citar las secuencias de ácidos nucleicos que confierna una resitencia a la kanamicina (Karir) , a la ampicilina (Ampr) , a la tetraciclina (tetr) ó a la espectinomicina, por ejemplo, que son corientemente utilizados en biología molecular (Maniatis y colaboradores, 1989) . La selección de plásmidos puede hacerse por otras secuencias de ácidos nucleicos como de los genes que codifican para marcadores de resitencia a un antibiótico, de una manera general, se trata de un gen que da ala bacteria una función que no posee mas (esto puede corresponder a un gen que ha sido eliminado sobre el cromosoma ó convertido en inactivo) , el gen sobre el plásmido que restablece esta función. A título de ejemplo puede tratarse de un gen de un ARN de trasnporte que restablece una función cromosómica deficiente (Somoes y colaboradores, 1991) .

Según una modalidad preferida, el plásmido procariota reivindicado comprende .al menos un ácido nucleico que codifica para la LCAT, el segundo ácido nucleico que es seleccionado entre aquellos que codifican para la CETP, la LH ó la ApoAI.

A título representativo de estos plásmidos procariotas se puede particularmente citar el plásmido pXL2974 y pXL3058, representados respectivamente en figuras 4 y 6. el plásmido pXL2974 comprende en orientación 5' -3', un origen de réplica, un gen de resistencia a la espectinomicina, el gen Sac B de sensibilidad a la sacarosa, las secuenicas virales ITR?, el promotor RSV, los dos transgenes LCAT y CETP seprados por la IRES, el sitio de poliadenilación y las secuencias virales pIX y IVA2. El plásmido pXL3058 comprende en orientación 5'-3' , un origen de réplica, un gen de resitencia a la kanamicina, las secuencias virales ITR?, el promotor RSV, los dos transgens LCAT e intron+ApoAI separados por el IRES, el sitio de poliadenilación, las secuencias virales pIX e IVA2 y el gen Sac B de sensibilidad a la sacarosa.

La presente invención se extiende igualmente a las construcciones plasmídicas aplicadas para la construcción de estos plásmidos procariotas y que comprenden igualmente el cartucho bicistrónico definido según la invención.

Los plásmidos procariotas reivindicados según la invención pueden particularmente ser obtenidos por transformación de un plásmido transportador inicial que contenga el cartucho bicistrónico definido según la invención para saber comprender la secuencia que codifica para un promotor transcripcional relacionado operacionalmente a dos ácidos nucleicos que codifican para dos enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos implicados en el transporte inverso del colesterol, un sitio de poliadenilación y una secuencia IRES situada entre dichos ácidos nucleicos.

A título representativo de estos plásmidos transportadores, se puede particularmente citar los plásmidos pXL2970 y pXL2984 descritos respectivamente en figuras 3 y 5.

En lo que concierne a las definiciones de las enzimas implicadas en el transporte inverso del colesterol, el promotor transcripcional y la secuencia IRES, de la misma forma en lo que toca su organización en el seno de dicho cartucho se tomará en cuenta lo que se ha descrito precedentemente .

Otro objeto de la presente solicitud concierne a toda célula procariota que contenga un plásmido procariota tal como se definió anteriormente. Puede tratarse en particular de toda bacteria para la cual existe un sistema de vector en donde el ADN recombinante puede ser introducido. Citemos por ejemplo Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacilus subtilis, Pseudomona putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti ó las bacterias del género Streptomyces . Estas células son obtenidas ventajosamente por transformación según las técnicas conocidas del experto en la materia.

Contempla igualmente la utilización de un virus recombinante, de un adenovirus recombinante defectuoso ó de una construcción plasmídica transportadora tal como se definió anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento ó a la prevención de las patologías relacionadas a la hipoalfalipoproteinemia de los cuales más particularmente la arterioesclerosis y/ó la restenosis.

La presente invención concierne igualmente a una composición farmacéutica que comprenda uno ó varios virus recombinantes defectuosos de los cuales adenovirus tales como los descritos precedentemente. Tales composiciones pueden ser formuladas- en vista de una administración vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular, etc.

Preferencialmente, la composición según la invención contiene vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Puede tratarse en particular de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio ó magnesio, etc. ó de mezclas de tales sales) , estériles, isotónicas, ó de composiciones secas, particularmente liofilizadas, que por añadidura, según el caso, de agua esterilizada ó de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables.

Las dosis de los virus utilizados para la inyección pueden ser adaptados en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del modo de administración utilizado, de la patología concernida, ó aún de la duración del tratamiento investigado. De una manera general, los virus recombinantes según la invención son formulados y administrados bajo forma de dosiss comprendidas entre 104 y 10? pfu/ml. El término pfu ("unidad formadora de placas"), corresponde al poder infeccioso de una suspensión de viriones, y es determinado por infección de un cultivo celular apropiado, y medido, generalmente después de 48 horas, del número de playas de células infectadas. Las técnicas de determinación del título pfu de una solución viral están bien documentados en la literatura.

La presente invención ofrece un nuevo medio muy eficaz para el tratamiento ó la prevención de las patologías relacionadas a la hipoalfalipoproteinemia, en particular en el campo de las afecciones cardiovasculares como el infarto del miocardio, la angina, la muerte súbita, la descompensación cardíaca, los accidentes cerebro-vasculares, la arterioesclerosis ó la restenosis.

Además, este tratamiento puede concernir también al hombre como a todo animal tales como los ovinos, los bovinos, los animales domésticos (perros, gatos, etc.), los caballos, los pescados, etc.

La presente invención es más completamente descrita con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos SUBTÍTULOS DE LAS FIGURAS Figura 1: Representación esquemática del presunto ecanismo del transporte inverso del colesterol.

Figura 2: Representación del protocolo de producción de adenovirus por recombinación homologa en E. Coli.

Figura 3: Protocolo de construcción del plásmido transportador bicistrónico pXL2970 que comprende RSV-LCAT-IRES-CETP.

Figura 4 : Protocolo de construcción del plásmido prócariota pXL2974 que comprende RSV-LCAT-IRES-CETP.

Figura 5: Protocolo de construcción del plásmido pXL2984 que comprende RSV-LCAT-IRES-LH.

Figura 6: Representación del plásmido procariota pXL3058 que comprende RSV-ApoAI-IRES-LCAT.

I. MATERIALES Y MÉTODOS 1-1. MATERIALES 1) Los plásmidos utilizados para la construcción de los adenovirus recombinantes bicistrónicos LCAT-IRES-CETP, LCAT-IRES-LH y LCAT-IRES-ApoAI son: - pSK IRES (comercializado por NOVAGEN) - pXL 2616 ADNc LCAT Séguret-Macé y colaboradores. Circulation 1996, 94 (9) : .2177-2184 - pCRII (comercializado por INVITROGEN) - pXL 2794 (WO96/25506) - pXL 2757 (WO96/25506) 2) Los ARN totales que provengan de los hepatocitos y de las células HepG2 3) Las células 293, células de riñon humanas, que contengan el gen que codifica para la proteína El adenoviral (Graham y colaboradores, 1977) 4) Las bacterias Escherichia coli: sub-tipo DH5a de genotipo EndAl, hsd R17, supE44,I-, thy-1, gyrA, reí Al, lacZD M15, deoR+, F+, dam+, dcm+ (Woodcock y colaboradores, 1989) .

) Las enzimas y los reguladores de restricción son proporcionados por New Englan Biolabs . 1-2 MÉTODOS TÉCNICAS GENERALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular tales como las extracciones preparatorias de ADN plasmídica, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa ó de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, las extracciones de proteínas al fenol ó al fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino por etanol ó isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc... son bien conocidas por el expero en la materia y son abundantemente descritas en la literatura [Maniatis T. y colaboradores, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", cold Spring Harbor Laboratoey, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. y colaboradores (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley F Sons, New York, 1987] .

Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories) .

Para las ligaduras, los fragmentos de ADN pueden estar separados según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa ó de acrilamida, extractos al fenol ó por una mezcla fenol/cloroformo, precipitados al etanol luego incubadas en presencia del ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor.

El llenado de los extremos 5' prominentes puede ser efectuado por el fragmento Klenow del ADN polimerasa Y de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes es efectuada en' presencia del ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes es efectuada por un tratamiento arreglado por la nucleasa SI.

La mutagénesis dirigida in vitro por oligonucleótidos sintéticos puede ser efectuada según el me'todo desarrollado por Taylor y colaboradores [Nucleic Acids Res. 13 (1985)8749-8764] utilizando el equipo distribuido por Amersham.

La amplificación enzimática de fragmentos de ADN por la técnica dicha de PCR [Polimerase-catalized Chain Reaction, Saiki R. K. y colaboradores, Science 230 (1985) 1350-1354; Mullís K.B. y Faloona F.A., meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] puede ser efectuada utilizando un "ciclador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.

La verificación de las secuencias nucleotídicas puede ser efectuada por el método desarrollado por Sanger y colaboradores [Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] utilizando el equipo distribuido por Amersham.

TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR a) Cultivo de las células Las células 293 son cultivadas sobre medio de Eagle (MEM, gibco BRL) adicionado de 10 % de suero de ternera fetal (SVF, Gibco BRL) a 37 °C y en 5 % de CO2. b) Transfección de las células en cultivo Las células 293 cultivadas en las cajas de 10 mm sobre medio MEM y suplementadas con 10 % de suero de ternera fetal son transfectadas con 1 µg de ADN por la lipofectamina (Gibco BRL) . Seis horas mas tarde, el medio es retirado y las células son incubadas en medio completo (MEM+10 % SVF) . Los sobrenadantes de cultivo de células transfectadas por los plásmidos recombinantes RSV LCAT-IRES-CETP, RSV LCAT-IRES-ApoAI y RSV LCAT-IRES-LH-LH así como los controles ß-galactosidasa y el sobrenadante de las células no transíectadas han sido recolectadas 72 horas después de transfección y conservadas a 4 °C. Los exámenes de actividad de las enzimas LCAT, CETP, ApoAI y LH son efectuadas sobre fracciones de 10 a 30 µl de sobrenadante de células utilizando el plasma humano como testigo. c) Producción y purificación de los adenovirus recombinantes El ADN adenoviral bicistrónico es obtenido por recombinación homologa en e. coli. A continuación, es linearizado por Pací y el virus producido después de transfección de las células 293. Las células 293, transcomplementantes para la proteína El, son transfectadas, por la lipofectamina, con 10 µg de ADN adenoviral linearizado. Después de recubrimiento por agar de las células 293 en el medio MEM suplementado con 4 % del SVF y la incubación de 8 días a 37 °C, las playas que contienen el virus recombinante son muestreadas y su perfil de restricción analizado. d) Infección de las células en cultivo La infección por 0.25, 0.5 y 1 mi. de sobrenadante que contiene el adenovirus recombinante bicistrónico es realizada sobre una placa de 12 depósitos que contengan aproximadamente 4 X 105 células 293. Después de incubación de 72 horas en 2 mi. del MEM suplementado con 2 % de SVF, el sobrenadante de las células infectadas es muestreado y las actividades enzimáticas son dosificadas.

VALIDACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS RESOLTADOS IN VITRO a) Dosificación de la actividad LCAT La actividad LCAT es estimada midiendo la conversión del ?C-colesterol esterificado utilizando los proteoliposomas como substrato de la manera descrita por Chen y colaboradores (1982) . Los proteoliposomas son preparados a partir de fosfatidil-colina, del colesterol, del ?4C-colesterol y de la apolipoproteína AI y puesto en incubación con 20 µl de sobrenadante de cultivo de transfección a examinar. Los productos (i4C-colesterol libre y i4C-colesterol esterificado) de la reacción sons eparados, por diferencia de su solubilidad en el solvente orgánico, en cromatografía sobre capa fina y detectados por autoradiografía sobre Instant Imager (Packard) . La actividad LCAT es expresada en porcentaje del 14C-colesterol esterificado por hora y por 20 µl de sobrenadante examinado. b) Dosificación de la actividad CETP La actividad CETP es determinada midiendo la capacidad de esta enzima de transferir ésters de colesterol de una partícula lipoproteíca de alta densidad (donador) a una partícula lipoprotéica de leve densidad (aceptador) . Los substratos de esta reacción han sido proporcionados por un equipo Wak-Chemie, Medical GmbH. La fluorescencia del linoleato del colesterol contenido en la partícula donadora es extinguida hasta el estado nativo de ésta última y solo en presencia de la CETP activa, que va a catalizar el transporte de la molécula fluorescente hasta que la fluorescencia de la partícula aceptadora se pueda detectar a 535 nm. La actividad CETP es expresada en valor de intensidad de fluorescencia emitida a 535 nm para 30 µl de sobrenadante de cultivo examinado y por hora. c) Dosificación de la actividad LH La actividad lipasa ' hepática es estimada utilizando un substrato triglicerídico sintético proporcionado por un equipo Progen Biotechnik GmbH. Este substrato contiene un grupo fluorescente pireno que es enmascarado por el trinitrofenol en el estado nativo de la molécula y la hidrólisis de esta última tiene por efecto la emisión de fluorescencia a 400 nm. Midiendo la intensidad de fluorescencia emitida a 400 nm después de incubación del substrato con la muestra a examinar y gracias al plasma estándar proporcionado por el equipo se puede estimar la cantidad (en pmol/min.) de LH en 20 µl de sobrenadante. d) Dosificación de la apolipoproteína AI La actividad Apo AI es estimada utilizando un anticuerpo monoclonal anti ApoAI. Para esto, placas de Inmulon II (Dynatech) son revestidas con un anticuerpo monoclonal anti ApoAI (10 mg/ml. en regulador carbonato pH 9.6), por incubación una noche a 4 °C, luego saturadas por 2 % de BSA en PBS pH 7.4 una hora a 37 °C. Los sobrenadantes celulares son a continuación incubados una hora a 37 °C, eventualmente después de dilución en PBS 2 % BSA. La revelación es a continuación efectuada por incubación una hora a 37 °C con una mezcla de anticuerpos monoclonales anti ApoAI marcados a la peroxidasa, y diluido al 1/5000. La fijación de los anticuerpos perosidados es finalmente revelada por incubación con 250 µl de TMB (KPL) y lectura de las placas a 630 nm.

TÉCNICA DE CONSTRUCCIÓN DE LOS PLASMIDOS TRANSPORTADORES Las construcciones de los plásmidos bicistrónicos son detalladas en las figuras 3 a 5. Los plásmidos bicistrónicos obtenidos son, al mismo tiempo, los plásmidos transportadores ya que contienen las secuenicas adenovirales pIX-IVa2 necesarias a la recombinación con el genoma viral. Esta recombinación se produce ya sea por contrafección con un genoma dividido que viene de un virus ß-galactosidasa (vector transportador clásico), ó bien por doble recombinación en E. coli (vector transportador Coli) .

La conformidad de secuencia de diferentes estructuras plasmídicas es examinada por análisis de su perfil de restricción. Este examen permite seleccionar clones recombinantes que servirán a las clonaciones ulteriores así como validar los resultados de las clonaciones. Las enzimas de restricción son seleccionadas de manera de tener la información la mas completa posible sobre la integralidad del ADNc clonado y el número de sitios estratégicos para la clonación. No obstante, este control no permite excluir la existencia de ciertas mutaciones tales como mutaciones puntuales de substitución ó de no-sentido que pueden producirse en toda etapa de la clonación. Tales mutaciones no pueden ser puestas en evidencia mas que por secuenciación completa del ADNc en cuestión, el último control de la validez de las construcciones obtenidas es hecho por exámenes bioquímicos de actividades enzimáticas de LCAT, de CETP y de LH in vitro, ó la detección de la presencia de la apoA-1.

EJEMPLO 1: Construcción de los plásmidos transportadores LCAT-IRES-CETP 1. Construcción del vector transportador clásico pXL 2970 El vector de expresión pXL 2968 RSV LCAT poliA bGH es obtenido por división de los plásmidos pXL2916, que contiene el ADNc de la CAT, de una parte y del plásmido pXL LPL, bajo el control del promotor de RSV y hacia el inicio del indicador de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, de otra parte, por las enzimas de restricción Sal Y y Clal y ligación de los fragmentos resultantes por T4 DNA ligasa.

Para hacer esto: Los plásmidos pXL RSV LPL (2 µg) y pXL 2616 (2 µg) son cada uno digeridos por 10 unidades (u) de Clal, en regulador 4 (20 mM de Tris Acetato, 10 mM de Mg-acetato, 50 mM de K-acetato y 1 mM de DTT) suplementado con 100 µg/ml. de BSA acetilado, durante 90' a 37 °C. 100 mM del NaCl y 10 u de Salí son añadidos y la mezcla reaccionante es puesta en incubación a 37 °C durante aún 90'. Después de migración en electroforesis sobre gel de agarosa a 0.7 % de los productos de las digestiones, las bandas de 6.5 y de 1.7 kb correspondientes a pXLRSV y al ADNc LCAT son recortadas sobre gel y extraídas por un equipo Qiaquick. Las dos bandas son ligadas por 400 u de T4 DNA ligasa después de incubación de una noche a 14 °C.

El plásmido recombinante pXL 2969 IRES-CETP es generado a partir del plásmido "bluescript" que posee el ADNc de la CETP modificada en su extremo 5' por introducción de un sitio Ncol por cebos PCR 5' GCCTGATAAC CATGGTGGCT GCCACAG 3' (SEC ID No. 1) . el plásmido así modificado es dividido por Ncol y Sal y clonado hacia el final de la secuencia IRES adenoviral incluida en el plásmido pSKIRES dividido por las mismas enzimas de restricción de la manera siguiente: 2.5 µg del plásmido CETP y 2.5 µg del plásmido pSK IRES son digeridos por 10 u de Ncol durante 90' a 37 °C en regulador 3 (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgC12, 10 mM de NaCl y 1 mM de DTT) seguido de la digestión por 10 u de Salí durante 90' a 37 °C. Los productos de las digestiones son puestas en migración electroforética y las bandas de 1.5 Kpb (ADNc CETP) y de 3.5 Kpb son extraídas y ligadas en las mismas condiciones descritas en el párrafo precedente.

Para obtener el plásmido pXL2970, se procede como sigue: ' Cuatro µg del plásmido pXL 2968 son linearizados por 10 u del Salí (regulador 3 + BSA, 90' a 37 °C) . El ADN es, a continuación, extraído por el equipo Qiaquick y recuperado en 50 µl de agua precalentada a 50 °C. Los pedazos cohesivos resultantes de la división de Salí son franqueadas por incubación con y u de polimerasa Klenow durante 15' a 25 °C, el ADN es re-extraído en el equipo Qiaquick y desfosforilado por 2 u de fosfatasa intestinal de ternera (CIP) durante 60' a 37 °C. el plásmido pXL 2969 (4 µg) es primeramente digerido por 5 U de Smal (tampon 4, 90' a 25 °C) luego por 5 U de HincII (regulador 3 + BSA, 100 mM de NaCl, 90 ' a 37 °C) . Los productos de las digestiones de los dos plásmidos son sometidos a una migración electroforética sobre gel de agarosa a 0.7 % y las bandas de ADN de 8.5 Kpb (pXL 2968) y de 2.2 Kpb (ADNc IRES CETP) son extraídas en el equipo Qiaquick y ligadas por 400 u de T4 Dna ligasa (Fig. 3) Las actividades LCAT y CETP del plásmido pXL2970 son dosificadas sobre el sobrenadante de cultivo de las células 293 tres días después de transfección.

La actividad LCAT de este plásmido corresponde a 3.5 % de esteres de colesterol formados por hora y la actividad CETP a 120 % (Tabla 1 a continuación) . Estos valores de actividad, muestran que el plásmido pXL2970 sintetiza bien la LCAT y el CETP que son catalíticamente activos . 2) El plásmido transportador-coli LCAT-IRES-CETP En esta tecnología, el vector transportador debe comprender: - las secuencias ITR-repeticiones terminales inversas y ? secuencia de encapsulación, necesarias para la recombinación homologa en E. coli, rodeando la secuencia LCAT-IRES-CETP. un origen de réplica col El que convierte el plásmido en no replicativo en la cepa C2110 E. coli y permiten, así, la clonación del plásmido recombinante. - un gen suicida sacarosa B (letal para la bacteria en cultivo sobre sacarosa) y un gen de resistencia a la espectinomicina que permitirán la selección del clon recombinante.

Para hacer esto, el plásmido bicistrónico transportador PXL2970 RSV LCAT-IRES-CETP es dividido por BstEII y Spel a fin de introducir ahí secuencias ITR y ? son aisladas por digestión del plásmido pXL 2794 por BstEII y Xbal . el fragmento en los extremos francos que contienen el cartucho espectinomicina-sacarosa B, obtenido por digestión del pXL2757 por EcoRV y Smal ha sido introducido en el plásmido transportador pXL2970 + 2794 linearizado por bFspI (Fig. 4) .

Experimentalmente se procede según el protocolo siguiente: Tres ug del plásmido pXL 2970 son digeridos por 20 u de BstEII (regulador 2: 10 mM de TrisHCl, 10 mM de MgC12, 50 mM de NaCl, 1 mM de DTT; 90 ? a 60 °C, luego por 10 u de Spel (90' a 37°C) .

El fragmento de ADN resultante es extraído en el equipo Qiquick y desfosforilado por 2 u de la CIP (60' a 37 °C) . el plásmido pXL 2794 es digerido por 20 u de BstEII (regulador 2, 90' a 60 °C) seguido de 20 u de Xbal (90' a 37 °C) . Las bandas de 6.5 Kpb (pXL2970) y de 2.9 Kpb (ITR ? y Kanr del pXL2794), extraídas después de migración electroforética, son ligadas por T4 DNA ligasa (40 Ou) .

El plásmido pXL 2970 + 2794 resultante (1.5 µg) es dividido por 5 u de Fspl (regulador 4, 60' a 37 °C) , extraído en el equipo Qiquick, y ligado (T4 DNA ligasa, 400 u) con el fragmento de ADN de 3.8 Kpb extraído del gel que contiene el cartucho sacB-spectr procedente de la digestión del plásmido pXL 2757 por 10 u de Smal (regulador 4, 90' a 25 °C) seguido de 10 u de EcoRV (90' a 37 °C) .

El plásmido transportador pXL2 74 LCAT-IRES-CETP sufre una primera selección sobre medio de espectomicina y medio espectomicina + sacarosa. Los resultados de las digestiones Ncol (6.2 + 3 + 2.2 + 2), Notl (13.5 Kpb) y EcoRV (1 +3+9.5 Kpb) son de conformidad con la carta de restricción de dicho plásmido.

La actividad LCAT del plásmido pXL297 corresponde a 2 % de esteres de colesterol formados por hora y aquella de la CETP a 114 % (Tabla 1) . Se encuentra las actividades LCAT y CETP al nivel del plásmido transportador-coli LCAT-IRES-CETP.

TABLA 1 Actividad LCAT Actividad CETP Plásmido transportador 3.5+/-0.2% 120+/-2% LCAT-IRES-CETP Plásmido transportador -coli 2+/-0.2% 114+/-2% LCAT-IRES-CETP EJEMPLO 2: Construcción del plásmido transportador RSV LCAT-IRES-LH El ADNc de la LH es clonado dtrás del IRES en el vector "bluescript" y el fragmento IRES-LH a continuación incluídoo de una manera análoga en el vector LCAT-IRES-CETP según el protocolo siguiente: El plásmido pXL 2971 (4 µg) es digerido, a fin de eliminar un sitio Ncol, por 40 U.I. de BglII (regulador 3, 90' a 37 °C) y luego por 40 u de Salí durante 90' a 37 °C. el fragmento de ADN de 2.5 Kpb (de masa aproximada de 0.5 µg) procedente de estas digestiones es sometida, después de migración y extracción sobre gel, a una digestión arreglada por Ncol (0.1-1 u Ncol/µg de ADN) en regulador 4 durante 60' a 37 °C. Los productos de digestión son analizados por migración sobre gel de agarosa a 0.7 % y la banda de 1.5 Kpb que contenga el ADNc LH ABC, obtenida con 0.5 u de Ncoll, es ligada (T4 DNA ligasa, 400 u) con el fragmento pSK IRES (1.3 µg) que resultan de las digestiones Ncoll y Salí (1 u de cada enzima, regulador 3, 37 °C) .

El vector final es presentado en la figura 5. El plásmido bicistrónico transportador LCAT-IRES-LH correspondiente lleva el nombre de pXL2984.

TABLA 2 ACTIVIDAD LCAT ACTIVIDAD LH Plásmido transportador 1.2+/-0.2% 47+/-2% LCAT-IRES-LH EJEMPLO 3 Construcción del plásmido transportador ApoAI- RES-LCAT El principio general de esta construcción es idéntica a las precedentes. La LCAT. es mutada por PCR incluyendo un sitio suplementario Neo que permita su ligación en buen lugar detrás del IRES. Su secuencia ha sido enteramente verificada. El fragmento IRES-LCAT es a continuación ligada detrás del apoA-I. el vector resultante es procedente directamente de la tecnología Coli y lleva el nombre de pXL 3058 (figura 6) . Después de las dobles recombinaciones habituales el vector viral resultante ha sido verificado en actividad. La apoA-I ha sido detectada en manchado western y la actividad LCAT evaluada a 1.3 % (interferencia de 2 %) .

LISTADO DE SECUENCIAS (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A. (B) CALLE: 20, Avenue Raymond Aron (C) CIUDAD: Antony (E) PAÍS: FRANCIA (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (G) TELEFONO: 01. 55. 71. 69. 22 (H) TELEFAX: 01. 55. 71. 72. 96 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: VIRUS RECOMBINANTES BICISTRONICOS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGOIAS RELACIONADAS A LAS DISLIPOPROTEINAS . (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA DE DECIFRAR POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE SOPORTE: Cinta (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFT WARE: Patentin Reléase no. 1.0 versión no. 1.30 (OEB) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: Lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1 GCCTGATAAC CATGGTGGCT GCCACAG Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes,

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Virus recombinante defectuoso que está caracterizado porque comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, dichos ácidos nucleicos que est n ligados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribossma IRES.

2. Virus recombinante defectuoso según la reivindicación 1 que está caracterizado porque los ácidos nucleicos insertados son seleccionados entre los genes que codifican para todas ó parte de la lecitina colesterol acetiltransferasa (LCAT) , la proteína de transferencia de los esteres del colesterol (CETP) , la lipasa (LH) , las apolipoproteínas AI ó AIV, ó una variante de éstas.

3. Virus recombinante defectuoso según la reivindicación 1 ó 2 que está carcaterizado porque los ácidos nucleicos son preferencialmente los genes que codifican para todas ó parte de las enzimas, proteínas y/ó co-factores correspondientes humanos .

4. Virus recombinante defectuoso según las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque los ácidos nucleicos son mas preferencialmente ADNc ó ADNg.

5. Virus recombinante defectuoso según una de las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque uno de los ácidos nucleicos codifica para la LCAT.

6. Virus recombinante defectuoso según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el segundo ácido nucleico codifica para la CETP, la LH ó la ApoAI.

7. Virus recombinante defectuoso según una de las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque el promotor transcripcional es de preferencia seleccionado entre los promotores de las secuencias de ácidos nucleicos E1A, MLP de adenovirus, el promotor CMV, LTR-RSV, MT-1, SV40.

8. Virus recombinante defectuoso según una de las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque la secuencia IRES deriva de un picornavirus .

9. Virus recombinante defectuosos seg n ,1a reivindicación 8 que está caracterizada porque la secuencia IRES de picornavirus es procedente ya sea del virus de la encéfalomiocarditis ó del poliovirus.

10. Virus recombinante defectuoso según una de las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque está desprovisto al menos de las regiones de su genoma que son necesarias para su réplica en la célula infectada.

11. Virus recombinante defectuoso según una de las reivindicaciones precedentes que está caracterizado porque se trata de preferencia de un adenovirus, de preferencia de tipo Ad5 ó Ad 2 humano ó de origen animal.

12. Adenovirus recombinante defectuoso que está caracterizado porque comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, dichos ácidos nucleicos están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES.

13. Adenovirus recombinante defectuoso según la reivindicación 12 que está caracterizado porque comprende al menos un gen que codifica para la LCAT y un gen que codifica pra la LH, dichos genes que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES.

14. Adenovirus recombinante defectuoso según la reivindicación 12 que está caracterizado porque comprende al menos un gen que codifica para la LCAT y un gen que codifica para la apoA-1, dichos genes que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma IRES.

15. Adenovirus recombinante defectuoso según la reivindicación 12 que está caracterizado porque comprende al menos un gen que codifica para la LCAT y un gen que codifica para la CETP, dichos genes que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de netrada interno del ribosoma IRES.

16. Adenovirus recombinante defectuoso según la reivindicación 15 que está caracterizado porque es derivado de la recombinación homologa entre el pXL2974 y el pXL2822.

17. Adenovirus recombinante según una de las reivindicaciones 12 a 16 que está caracterizado porque comprende al menos una eliminación en la región El y una eliminación en la región E3.

18. Plásmido procariota que comprende un genoma de adenovirus y al menos dos ácidos nucleicos que codifican para proteínas, enzimas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, los dos ácidos nucleicos que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma, IRES.

19. Plásmido procariota que está caracterizado porque comprende una primera región que permite la réplica en las células procariotas y una segunda región que contiene el genoma denoviral bordeado de uno ó varios sitios de restricción no presentes en dicho genoma y en la cual están presnetes al menos dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas, y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, estos dos ácidos nucleicos que están ligados operacionalmente a un promotor transcripcional y separados el uno del otro por una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma, IRES.

20. Plásmido procariota según la reivindicación 18 ó 19 que está caracterizado porque el genoma adenoviral es eliminado de sus regiones El y E3.

21. Plásmido procariota según una de las reivindicaciones 18 a 20 que está caracterizado porque comprende las secuencias virales ITR y ?.

22. Plásmido procariota según una de las reivindicaciones 18 a 21 que está caracterizado porque el origen de réplica es procedente de un plásmido bacteriano seleccionado entre RK2, pBR322 y pUC.

23. Plásmido procariota que comprende en orientación 5' - 3' al menos un origen de réplica funcional en las células procariotas, una primera parte de un genoma adenoviral que comprende las secuencias virales ITR y ?, un promotor transcripcional, un primer ácido nucleico que codifica para una enzima, proteína y/óco-factor implicado en el transporte inverso del colesterol, una secuencia IRES, unsegundo ácido nucleico que codifica para una enzima, proteína y/ó co-factor implicado en el transporte inverso del colesterol, un sitio de poliadenilación y una segunda parte de un genoma adenoviral constituida por la región pIX-IVa2.

24. Plásmido procariota según una de las reivindicaciones 18 a 23 que está caracterizado porque comprende además una región que permite la selección de las células procariotas que contienen dicho plásmido.

25. Plásmido procariota según una de las reivindicaciones 18 a 24 que está caracterizado porque comprende al menos uno de los ácidos nucleicos que codifica para la LCAT y el segundo ácido nucleico es seleccionado entre aquellos que codifican para la LH, ApoAI ó la CETP.

26. Plásmido procariota según la reivindicación 25 que está caracterizado porque se trata del pXL 2974 que contiene los ácidos nucleicos que codifican respectivamente para la LCAT y la CETP.

27. Plásmido procariota según la reivindicación 25 que está caracterizado porque se trata del pXL 2974 que contiene los ácidos nucleicos que codifican respectivamente para la LCAT y la ApoAI.

28. Plásmido transportador que está caracterizado porque comprende dos ácidos nucleicos que codifican para enzimas, proteínas y/ó co-factores distintos e implicados en el transporte inverso del colesterol, los dos ácidos nucleicos. que están relacionados operacionalmente a un promotor transcripcional, un sitio de poliadenilación y una secuencia que codifica para un sitio de entrada interno del ribosoma, IRES situado entre los dos ácidos nucleicos.

29. Plásmido transportador según la reivindicación 28 que está caracterizado porque se trata del plásmido pXL2984 que comprende dos ácidos nucleicos que codifican respectivamente para la LH y la LCAT.

30. Plásmido transportador según la reivindicación 28 que está caracterizado porque se trata del plásmido pXL2970 que comprende dos ácidos nucleicos que codifican respectivamente para la LCAT y la CETP.

31. Célula procariota que está caracterizada porque está transformada con un plásmido procariota según una de las reivindicaciones 18 a 27.

32. Utilización de un virus recombinante .defectuoso según una de las reivindicaciones 1 a 11, de un adenovirus recombinante según una de las reivindicaciones 12 a 17 ó de un plásmido según una de las reivindicaciones 28 a 30 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento ó a la prevención de las patologías relacionadas a la hipoalfalipoproteínemia.

33. Utilización según la reivindicación 32 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de la arterioesclerosis y/ó de la restenosis.

34. Composición farmacéutica que comprende uno ó varios virus recombinantes defectuosos según una de las reivindicaciones 1 a 11, un adneovirus según una de las reivindicaciones 12 a 17 ó un plásmido según una de las reivindicaciones 28 a 30.

35. Composición farmacéutica según la reivindicación 34 que está caracterizada porque se presenta bajo forma inyectable y en que comprende de 104 a 10?4 pfu/ml de adenovirus .