KR19990021828A - 아포지질단백질 에이-아이의 신규 변이체 - Google Patents

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에릭 브룩케르
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장-찰스 프루차트
제랄드 룩
제라르 터핀
하랄트 푼케
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자끄 사비나
롱프랑 로라 소시에테 아노님
장 르메르
엥스티튀 파스퇴르 드 릴레
유니베르시테 피에르 에 마리에 쿠리에
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Abstract

본 발명은 151번 위치에 시스테인을 포함하는 인간 아포지질단백질 A-I의 변이체, 이에 상응하는 핵산 및 이를 함유하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 상기 구성원소들을 포함한 약학 조성물과 특히, 유전자 치료에서의 이의 활용에도 관한 것이다.

Description

아포지질단백질 에이-아이의 신규 변이체
아포지질단백질 A-I (apoA-I)은 콜레스테롤, 인지질 및 트리글리세리드로 구성된 거대분자 복합체인 고밀도 지질단백질 (HDL)의 주요 구성성분이다. apoA-I은 267 잔기의 전전단백질(preproprotein)의 형태로 합성되며 28,000 달턴의 분자량을 지닌 243 아미노산으로 이루어진 단백질이다. apoA-I의 전전 유형은 인간의 경우, 간 및 장에서 합성된다. 이후, 이 유형의 단백질은 전단백질로 절단되어 혈장 내로 분비된다. 맥관 구획 내에서, proapoA-I는 칼슘-의존성 단백질분해효소의 작용에 의하여 성숙 단백질 (243 아미노산)로 전환된다. apoA-I는 지질단백질 대사에 있어서 구조적 역할 및 활성적 역할을 수행한다: 특히, apoA-I는 혈장 콜레스테롤의 에스테르화에 책임이 있는 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LCAT)의 보조인자이다.
HDL 분획 내에 함유된 콜레스테롤 수준 및 apoA-I의 혈장 농도는 인간의 경우에 아테롬성동맥경화증의 발달에 있어서 음성 위험 인자이다. 피부학적 연구는 HDL 콜레스테롤 및 apoA-I의 농도와 심장혈관질환의 출현빈도 사이에 역 상관관계가 있음을 나타낸다[참고문헌: E.G. Miller et al., Lancet, 1977: 965-968]. 반대로, 장수는 HDL 콜레스테롤의 고수준과 연관된 것으로 나타날 것이다. 최근에, apoA-I의 보호 역할이 인간 아포지질단백질 A-I을 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델에서 밝혀졌다[참고문헌: Rubin et al., Nature]. 유사하게도, 토끼에서의 HDL 주입은 병변의 퇴행을 유도한다[참고문헌: Badimon et al., J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990]. HDL의 보호 역할, 특히, 콜레스테롤의 역-전달에 있어서의 HDL의 역할 및 HDL의 항산화제 작용을 설명하기 위해서 상이한 기작이 제안되었다[참고문헌: 각각 Fruchart et al., Circulation, 87: 22-27, 1993, Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364, 1994].
apoA-I 암호화 유전자는 클로닝되어 서열화되었다[참고문헌: Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917]. 길이 1863 bp인 유전자는 4개의 엑손과 3개의 인트론을 포함한다. apoA-I를 암호화하는 cDNA도 또한 기술되었다[참고문헌: Law et al., PNAS 81 (1984) 66]. 이 cDNA는 840 bp를 포함한다(서열번호 1). apoA-I의 야생형 이외에도, 상이한 천연 변이체가 선행기술에 기술되어 있으며, 이들 변이체와 야생형 단백질 사이의 상이점은 하기 표 1에 제시한다.
변이체 돌연변이
밀라노말버그뮌스터2B기에센뮌스터3A뮌스터3B뮌스터3C뮌스터3D뮌스터4예임 Arg173CysLys107φAla158GluPro143ArgAsp103AsnPro4ArgPro3ArgAsp213GlyGlu198LysAsp13TyrAsp213Gly
본 발명은 아포지질단백질 A-I의 신규 변이체에 관한 것이다. 또한, 이 신규 변이체를 암호화하는 임의의 핵산 서열에도 관련된다. 추가로, 치료 목적용으로의 이 단백질 또는 이들 핵산의 용도에도 관련된다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 특히, 151번 위치에 변이를 함유한 아포지질단백질 A-I의 신규 변이체에 관한 것이다.
도 1 : 플라즈미드 PXL2116의 제한효소 지도
도 2 : 환자의 엑손 4를 운반하는 M13 파아지의 작제도
도 3 : 변이된 PXL2116를 운반하는 벡터의 작제도
도 4 : 온도 함수로서의 혼탁도측정 연구도
도 5 : 겔 여과 단면도
도 6 : 상이한 복합체에 대한 각 분획에서의 트립토판 형광도 및 인지질 농도
본 발명은 아포지질단백질 A-I의 변이체의 신규 시리즈의 생산에 관한 것이다. 이러한 일련의 변이체는 특히, 151번 위치의 아르기닌 잔기가 시스테인 잔기로 대체되어있다. 본 발명에 따른 apoA-I 변이체는 현저한 치료 성질을 보인다. 특히, 이는 중요한 항-아테로제닉(atherogenic) 보호 성질을 지닌다. 이리하여, 과트리글리세리데미아(hypertriglyceridaemia)와 연관된, HDL 분획 내 콜레스테롤의 극히 저수준의 상황에서, 이러한 변이체의 존재는 이러한 변이 apoA-I에 특이적인 임의의 아테롬성동맥경화증의 발생을 저해하는데, 이는 아주 효력있는 보호 역할을 입증한다. 게다가, 본 발명에 따른 apoA-I 내 시스테인의 존재는 디설파이드 브릿지를 통해 연결되는 이량체 및 다른 복합체 형성을 유발한다. 이러한 apoA-I는 혈장 내에 유리된 형태 또는 이량체로 자체 결합되어 존재하거나 또는 HDL과 연관된 또 다른 중요 단백질이며 또한 서열 내에 시스테인을 지니는 아포지질단백질 A-II과 결합된 채 존재한다. 더군다나, 151번 위치에서의 아르기닌과 결부된 전하 손실은 apoA-I의 면역 개시에 뒤따른 혈장 단백질의 등전 포커싱에 의하여 이들 변이체의 상견을 가능케한다.
특히 현저한 항-아테로제닉 성질의 면에서, 본 발명에 따른 신규 단백질은 심장혈관병리의 치료 및 예방에 있어서 실질적 치료 잇점을 제공한다.
이리하여, 본 발명의 첫번째 요지는 151번 위치에 시스테인을 포함하는 인간 아포지질단백질 A-I의 일련의 변이체에 관한 것이다. 참고로, apoA-I의 아미노산 서열은 문헌에 기술되어 있다(상기 인용 문헌 중 Law 참조). 전전 영역(1부터 24까지의 잔기)을 포함하는 서열은 서열 번호 1로 제시된다. 이리하여, 본 발명에 따른 변이체의 특징은 참조 서열 내의 아르기닌을 대체하는 성숙 apoA-I의 151번 위치에서의 시스테인(서열번호 1의 175번 위치에 상응)의 존재에 놓여 있다. 본 발명에 따른 바람직한 변이체는 서열번호 2의 펩티드 서열을 포함하며, 더욱 바람직하게는 175번 잔기가 시스테인에 의해 대체되어 있으며 서열번호 1의 서열의 68번 및 267번 잔기 사이에 놓여 있는 펩티드 서열이다.
본 발명에 따른 변이체는 특히, apoA-I 파리(Paris)에 의해 표현되는데, 이는 천연 apoA-I과 비교하여 151번 위치가 시스테인인 apoA-I을 의미한다. 본 발명에 따른 변이체는 또한 참조 아포지질단백질 A-I에 대하여 다른 구조적 변형, 특히 기타 돌연변이, 결실 및/또는 첨가를 거칠 수도 있다. 특정 양태에 따르면, 본 발명의 변이체는 또한 시스테인으로의 잔기 대체를 이끄는 다른 돌연변이를 포함한다. 이리하여, 또 다른 특정 변이체는 apoA-I 파리 및 apoA-I 밀라노 변이체 내에 존재한 돌연변이를 조합한다. apoA-I의 성질을 상당히 변형시키지 않으면서 잔기에 영향을 주는 다른 돌연변이가 존재할 수도 있다. 이들 변이체의 활성은 특히, 콜레스테롤 유출 테스트에 의해서 입증될 수 있다.
본 발명에 따른 변이체는 상이한 방식으로 수득될 수 있다. 먼저, 그들은 펩티드 합성기를 사용하여 당업자에게 알려진 테크닉에 의하여 화학적으로 합성될 수 있다. 그들은 또한, 돌연변이에 의하여 참조 apoA-I으로부터도 수득될 수도 있다. 유리하게도, 문제의 단백질은 재조합 단백질로서, 즉, 하기에 기술되는 세포 숙주 내에서 이에 상응되는 핵산의 발현에 의하여 수득된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 변이체는 단량체 유형 또는 이량체 유형일 수 있다. 본 발명의 변이체의 서열 내에 적어도 하나의 시스테인의 존재는 디설파이드 결합에 의하여 이량체의 형성을 가능케한다. 이량체는 동종이량체, 즉 본 발명에 따른 변이체를 포함하는 이량체(예; diApoA-I Paris)이거나; 이종이량체, 즉 본 발명에 따른 변이체 및 유리된 시스테인을 지니는 또 다른 분자를 포함하는 이량체(예; ApoA-I Paris:ApoA-II)일 수 있다.
본 발명의 요지는 상기 정의된 아포지질단백질 A-I 변이체 암호화 핵산에 있다. 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA 중에서, 상보적 DNA(cDNA), 게놈 DNA(gDNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반-합성 서열이 사용될 수 있다. 게다가, 핵산 서열은 예컨대, 뉴클레아제에 의한 내성, 세포 침투 또는 세포 표적화, 치료 효율 등을 증진시키기 위할 목적으로, 화학적으로 변형되는 것일 수도 있다. 이들 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스, 합성 등의 기원일 수 있다. 그들은 당업자에게 잘 알려진 임의의 테크닉, 특히 라이브러리의 스크리닝, 화학 합성에 의하거나 또는 라이브러리 스크리닝에 의하여 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의하여 수득될 수 있다.
유리하게도, 핵산은 cDNA 또는 gDNA이다.
바람직하게도, 본 발명에 따른 핵산은 서열번호 2의 서열을 포함한다. 좀 더 바람직하게는, 이는 서열번호 10의 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산은 유리하게도 표적 세포 또는 표적 유기체에서 기능적인 전사 프로모터 영역, 및 전사 종결 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 특정짓는 3'말단에 위치한 영역을 포함한다. 이런 엘리먼트 세트는 발현 카세트를 구성한다. 프로모터 영역에 관하여, 이들은 apoA-I에 대한 유전자의 발현에 천연적으로 책임을 지닌 프로모터 영역일 수 있거나 관여된 세포 또는 유기체 내에서 기능할 수 있는 ApoA-I 변이체로부터의 프로모터 영역일 수 있다. 프로모터 영역은 또한 상이한 기원의 영역(타 단백질의 발현에 책임이 있는 영역 또는 심지어는 합성 영역)을 포함할 수도 있다. 특히, 이는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이는 표적 세포의 게놈으로부터 유도되는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 진핵세포 프로모터 중에는, 유전자의 전사를 특이적으로 또는 유도적으로, 강하게 또는 약하게 자극하거나 억제하는 임의의 프로모터 또는 유도 서열을 사용하는 것이 가능하다. 특히, 편재하는 프로모터(HPRT, PGK, 비멘틴, α-액틴, 튜블린 등의 유전자의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터 (예컨대, MDR, CFTR, VIII 인자 등의 유전자의 프로모터), 조직-특이적 프로모터 (피루베이트 키나아제, 빌린, 장 지방산 결합 단백질, 평활근 α-액틴 등의 유전자의 프로모터) 또는 자극에 반응하는 프로모터 (스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)가 사용될 수 있다. 유사하게도, 바이러스의 게놈으로부터 유도하는 프로모터 서열, 예컨대 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, RSV LTR 프로모터 등이 사용될 수 있다. 게다가, 이들 프로모터 영역은 활성 또는 조절 서열, 또는 조직-특이적 또는 과발현을 허용하는 서열을 가함에 의하여 변형될 수 있다.
더군다나, 핵산은 또한 합성된 산물을 표적 세포의 분비 경로로 향하게 하는 시그널 서열을 포함할 수도 있다. 이 시그널 서열은 apoA-I의 천연 시그널 서열일 수도 있지만, 이는 또한 여타 기능적인 시그널 서열 또는 인공적인 시그널 서열일 수도 있다.
본 발명에 따른 핵산은 재조합 숙주 세포 내에서의 발현에 의하여 재조합 ApoA-I 변이체를 생성하는데 사용될 수 있거나, 직접 유전자 또는 세포 치료의 적용에 있어서 의약 산물로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 변이체의 생산을 위하여, 핵산은 유리하게도 자가 복제할 수 있거나 통합형 벡터인 바이러스 또는 플라즈미드 벡터 내로 통합된다. 이후, 이 벡터는 선택된 세포군을 형질감염하거나 감염시키는데 사용된다. 이리하여 수득된 형질감염 또는 감염된 세포는 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양되고, 본 발명에 따른 apoA-I 변이체는 단리된다. 재조합 수단에 의하여 본 발명의 재조합 변이체의 생산에 사용될 수 있는 세포 숙주는 진핵세포이거나 원핵세포 숙주이다. 적절한 진핵세포 숙주중에는 동물 세포, 효모 또는 진균이 언급될 수 있다. 특히, 효모에 관하여, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 피치아, 스와니오마이세스 또는 한세눌라 속의 효모가 언급될 수 있다. 동물 세포에 관하여는, COS, CHO, CI27, NIH-3T3 등의 세포가 언급될 수 있다. 진균 중에는, 아스퍼질러스 종 또는 트리코더마 종이 특히 언급될 수 있다. 원핵 숙주로서는, 하기의 박테리아가 사용되는 것이 바람직하다: 이. 콜라이, 바실러스 또는 스트렙토마이세스. 이리하여, 단리된 변이체는 치료 용도의 관점에서 패키징될 수 있다.
특히 유리한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 핵산은 유전자 또는 세포 치료 적용에서 의약 산물로서 직접 사용된다. 이와 관련하여, 투여의 관점에서 보아 치료될 부위로 직접 주입함에 의하거나 세포와 함께 배양함에 의하여 사용될 수 있다. 사실상, 네이키드 핵산이 특별한 벡터 없이도 세포내로 들어갈 수 있음이 보고된 바 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 맥락에서는 투여용 벡터를 사용하는 것이 i) 세포 침투의 효율, ii) 세포 표적화 및 iii) 세포 밖 및 세포 내 안정도를 증진시킬 수 있도록 하기 위하여 바람직하다.
특정 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
상이한 유형의 벡터가 사용될 수 있다. 이 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터이다.
바이러스 벡터의 사용은 바이러스의 본래적인 형질감염 성질에 기초를 두고 있다. 그래서, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스 또는 백시니아 바이러스를 사용하는 것이 가능하다. 이들 벡터들은 형질감염의 관점에서 특히 효능을 입증한다.
좀 더 특히 아데노바이러스에 관하여, 구조 및 성질이 다소 다양한 상이한 혈청형이 규명되었다. 이들 혈청형 중에서, 본 발명의 맥락에서는 인간 아데노바이러스 2 또는 5 유형 (Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용하는 것이 바람직하다(WO94/26914 참조). 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에는, 개, 소, 쥐(예컨대, Mav1, 참고문헌: Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예; SAV) 기원을 언급할 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스이며, 좀 더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다[예: 맨하탄 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 맥락내에서 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITR, 캡슐화를 허용하는 서열 및 해당 핵산을 포함한다. 좀 더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈 내에서 적어도 E1 영역은 비-기능적이다. 문제의 바이러스 유전자는 당업자에게 알려진 기술, 특히 전체 제거, 치환, 부분 결실 또는 문제의 유전자(들) 내에 하나 이상의 염기 첨가에 의하여 비-기능적으로 될 수 있다. 상기 변형은 시험관내에서(단리된 DNA 상에서) 또는 현장에서, 예컨대 유전 공학 기술에 의하여, 또는 변이제의 처리에 의하여 수득될 수 있다. 다른 영역, 특히 E3 영역(WO95/02697), E2 영역 (WO94/28938), E4 영역 (WO94/28152), WO94/12649, WO95/02697) 및 L5 영역(WO95/02697)도 또한 변형될 수 있다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 재조합 E1 및 E4 영역의 전부 또는 일부의 결실을 지닌 아데노바이러스가 본 발명의 맥락에서 사용된다. 이런 유형의 벡터는 사실상 특히 유리한 안전성을 제공한다.
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 알려진 기술에 의해서 제조될 수 있다[참고문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185,573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히, 그들은 아데노바이러스와 본 발명에 따른 핵산 또는 카세트를 나르는 플라즈미드간의 상동성 재조합에 의하여 제조될 수 있다. 상동성 재조합은 상기 아데노바이러스 및 상기 플라즈미드의 적절한 세포주 내로의 공형질감염(cotransfection) 후에 일어난다. 사용되는 세포주는 바람직하게는, (i) 상기 엘리먼트에 의한 형질전환에 응하기 용이해야 하며, (ii) 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈의 일부를 보충할 수 있는 서열을 함유하고 있어야 하는데, 재조합의 위험을 피하기 위하여 일체형으로 존재하는 것이 바람직하다. 세포주의 예로는 인간 배아 신장주 293 (human embryonic kidney line 293) [참고문헌: Gragam et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]를 언급할 수 있는데, 이는 특히, 게놈 내에 일체형으로 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 부위측 일부(12%)를 포함한다. 다른 세포주는 출원 WO94/26914 및 WO95/02697 호에 기재되어 있다.
따라서, 증식된 아데노바이러스는 실시예에 예시된 바와 같이 분자 생물학의 표준 기술에 따라서 회수 및 정제된다.
아데노-수반 바이러스(AAV)에 관하여, 후자는 그들이 감염되는 세포의 게놈 내에서 안정적으로 및 부위-특이적으로 통합되는 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 그들은 생장, 형태 또는 세포 분화에 영향을 유도하지 않고서도 다양한 범위의 세포를 감염시킬 수 있다. 더군다나, 그들은 인체에서 병변을 수반하는 것으로도 보이지 않는다. AAV 게놈이 클로닝되고 서열화되고 규명되었다. 이는 대략 4700 염기로 구성되며 바이러스의 복제 오리진으로서 역할할 대략 145 염기의 역전 반복 영역(ITR)을 각 말단에 함유한다. 게놈의 나머지는 캡슐화 기능을 수행할 2개의 필수 영역으로 나뉘며; 게놈의 좌측부는 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 함유하며; 게놈의 우측부는 바이러스의 캡시드 단백질 암호화 cap 유전자를 함유한다.
시험관내에서 및 생체내에서 유전자 전달을 위하여 AAV로부터 유도된 벡터의 사용은 문헌에 기술되어 있다[참고: 특히, WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528]. 이들 출원은 AAV로부터 유도된 서로 상이한 작제물에 대하여 기술하고 있으며, 여기에서 rep 및/또는 cap 유전자는 결실되어 해당 유전자에 의하여 대체되어 있으며, 시험관내에서(배양체의 세포 상에서) 또는 생체내에서(직접 체내로) 해당 유전자의 전달에 대하여 기술하고 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노 AAV는, 두 개의 AAV 역전 반복 영역(ITR)에 의해 플랭킹된 본 발명의 핵산 또는 카세트를 함유한 플라즈미드 및 AAV 캡슐화 유전자를 나르는 플라즈미드를 인간 헬퍼 바이러스(예; 아데노바이러스)로 감염된 세포주내로 공형질감염함에 의하여 제조될 수 있다. 생성된 재조합 AAV는 표준 기술에 의하여 정제된다(참조: 특히, WO95/06743).
허피스바이러스 및 레트로바이러스에 관하여, 재조합 벡터의 작제는 문헌상에 풍부하게 기술되어 있다[참조; 특히, Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453,242, EP 178,220, Bernstein et al., Genet, Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등]. 특히, 레트로바이러스는 분열되는 세포를 선택적으로 감염시키는 통합 바이러스이다. 그래서, 그들은 암 적용을 위한 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 두 개의 LTR, 캡슐화 서열 및 세 개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, gag, env 및 env 유전자는 일반적으로 전체 또는 일부가 결실되어서 해당 이종 핵산 서열에 의해서 대체된다. 이들 벡터는 상이한 유형의 레트로바이러스, 특히, MoMuLV(몰로니 뮤린 류케미아 바이러스, MoMLV로도 명명됨), MSV (몰로니 뮤린 사코마 바이러스), HaSV (하베이 사코마 바이러스), SNV (스플린 네크로시스 바이러스), RSV (라우스 사코마 바이러스) 또는 프렌드 바이러스로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 카세트를 함유한 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, 특히, LTR, 캡슐화 서열 및 핵산 또는 카세트를 함유하는 플라즈미드가 작제된 다음, 플라즈미드 내에 결손된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는, 소위 캡슐화 세포주를 형질감염시키는데 사용된다. 일반적으로, 캡슐화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 상기 캡슐화 세포주는 선행기술, 특히 PA317 세포주 (US 4,861,719), PsiCRIP 세포주 (WO90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주 (WO89/07150)에 기술되어 있다. 더군다나, 재조합 레트로바이러스는 gag 유전자의 일부를 함유하는 신장된 캡슐화 서열 뿐만 아니라, 전사 활성을 없애기 위해서 LTR 내에 변형을 함유할 수 있다[참고문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 생성된 재조합 레트로바이러스는 이후, 표준 기술에 의해서 정제된다.
본 발명을 수행하기 위해서, 결손 재조합 아데노바이러스 또는 레트로바이러스를 사용하는 것이 가장 특히 유리하다. 이들 벡터는 사실상, 아포지질단백질에 대한 암호화 유전자를 전달하는데 있어서 특히 유리한 성질을 지닌다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 생체내에서 정제된 현탁액의 직접 투여용으로 또는 이식의 관점에서 세포, 특히 동종세포의 생체밖 형질전환용으로 특히 유리하다. 더욱이, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 게다가 상당한 잇점, 예컨대, 특히, 고효율의 감염, 즉 작은 용적의 바이러스 현탁액으로부터 감염이 생성될 수 있게끔 하는 잇점을 보인다.
이와 관련하여, 본 발명은 게놈 내로 삽입되는, 전술한 바와 같은 아포지질단백질 A-I 변이체의 암호화 DNA를 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스에 바람직하게 관련된다.
본 발명의 특히 유리한 다른 양태에 따르면, ApoA-I 변이체 암호화 서열을 함유한 레트로바이러스 벡터를 생산하는 세포주는 생체내 이식에 사용된다. 이런 목적을 위해 사용될 수 있는 세포주는, 본 발명에 따라 ApoA-I 변이체에 대한 암호화 핵산 서열을 함유한 레트로바이러스의 생산을 허용하도록 변형된 특히, PA317 (US 4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) 및 GP+envAm-12 (US 5,278,056)세포이다.
본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 사용되는 벡터는 화학적 벡터이다. 본 발명에 따른 벡터는 사실상, 핵산을 진핵 세포내로 전달하고 그 곳에서 발현시킬 수 있는 비-바이러스성 약제일 수 있다. 화학적 또는 생화학적 벡터는 특히, 편리함 및 안전성, 및 형질감염되는 DNA의 크기에 이론적 제한이 없기 때문에 천연 바이러스에 대한 유리한 대안이 된다.
합성 벡터는 두 개의 주기능, 즉, 핵산을 형질감염되도록 응축시키고, 세포와의 결합 및 원형질막과 적절한 곳에서의 두 개의 핵막의 통과를 촉진시키는 기능을 가진다. 핵산의 다음이온 성질을 경감시키기 위해서, 비-바이러스성 약제는 모두 다가양이온 전하를 지닌다.
개발된 합성 벡터 중에서, 폴리리신의 양이온 중합체, (LKLK)n, (LKKL)n, 폴리에틸렌아민 및 DEAE-덱스트란 유형 또는 양이온 지질 또는 리포펙턴트가 가장 유리하다. 그들은 DNA를 응축하고 세포막과의 결합을 촉진시키는 성질을 지닌다. 후자의 벡터 중에서, 리포폴리아민(리포펙타민, 트랜스펙탐 등) 및 상이한 양이온성 또는 천연 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등)이 언급될 수 있다. 좀 더 최근에는, 수용체-매개 표적 형질감염이란 개념이 개발되었는데, 이는 양이온성 중합체에 의하여 DNA를 응축하는 반면에, 그래프팅을 원하는 세포 유형의 표면에 존재하는 막 수용체에 대한 리간드와 양이온성 중합체 사이에 화학적 커플링에 의하여 복합체를 막에 결합하도록 배향짓는 원리에 근거를 둔다. 이리하여, 트랜스페린 또는 인슐린 수용체 또는 헤파토사이트의 아시알로글리코단백질 수용체의 표적화가 기술되었다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 아포지질단백질 A-I 변이체에 대한 암호화 핵산의 삽입에 의하여 유전적으로 변형된 임의의 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 유리하게도 생체내에서 투여 가능하고 이식가능한 포유류 세포이다. 그들은 특히, 섬유아세포, 근원세포, 간세포, 케라티노사이트, 내피, 외피 또는 신경교 세포 등일 수 있다. 세포는 바람직하게는 인간 기원이다. 이는 동종의 세포, 즉 다시말해서, 환자로부터 세포를 제거하여 치료 성질을 제공하기 위한 목적으로 본 발명에 따른 핵산으로 생체밖에서 변형한 다음, 환자에게 이를 재투여하기 위해 특히 유리하다.
본 발명에 따른 세포는 일차 배양으로부터 기원할 수 있다. 그들은 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의하여 제거될 수 있으며, 이후, 증식을 허용하는 배양 조건하에서 배양된다. 섬유아세포의 경우에 좀 더 구체적으로 얘기하자면, 이들은 예컨대, Ham에 기재된 기술에 따른 생검으로부터 용이하게 수득될 수 있다[참고문헌: Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255]. 이들 세포는 본 발명의 핵산의 삽입을 위하여 직접 사용되거나(바이러스 또는 화학적 벡터에 의하여) 동결과 같은 방법에 의하여, 후속 사용의 관점에서 동종 뱅크의 성립을 위하여 저장될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 또한 예컨대, 미리-성립된 뱅크로부터 수득된 이차 배양일 수 있다(참조, 예 EP 228,458, EP 289,034, EP 400,047 및 EP 456,640).
배양체 내의 세포는 특히, 그들에게 생물학적으로 활성인 apoA-I 변이체를 생산하는 성능을 부여하기 위하여 본 발명의 재조합 바이러스로 감염될 수 있다. 감염은 당업자에게 잘 알려진 기술에 따라서 시험관내에서 수행된다. 특히, 사용되는 세포 유형 및 세포 당 바이러스의 원하는 복제 수에 따라서 당업자는 다양한 감염 및 수행되는 적절한 감염 사이클 횟수를 채택할 수 있다. 이들 단계들은 세포가 생체 투여용으로 의도될 때, 적절한 멸균 조건하에서 수행되어야 한다. 세포의 감염을 위하여 사용되는 재조합 바이러스의 투여량은 원하는 목적에 따라서 당업자가 채택할 수 있다. 생체 투여를 위해 상기에서 기술된 조건은 시험관내 감염에 적용될 수 있다. 레트로바이러스로의 감염을 위하여, 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 생산하는 세포로 감염하는 것이 바람직한 세포를 공배양하는 것이 가능할 수도 있다. 이는 레트로바이러스의 정제에 대한 필요가 회피되도록 가능케한다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 정의된 핵산의 삽입에 의하여 유전적으로 변형된 포유류 세포와 세포외 매트릭스를 포함하는 이식체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이식체는 105내지 1010세포를 포함한다. 좀 더 바람직하게는, 그들은 106내지 108세포를 포함한다. 또한 세포는 상기에서 정의된 핵산을 게놈 내로 삽입하여 함유하고 있는 재조합 바이러스를 생산하는 세포일 수 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명의 이식체에서, 세포외 매트릭스는 겔화 화합물 및 적절한 곳에서의 세포 고착을 허용하는 지지체를 포함한다.
본 발명에 따른 이식체의 제조를 위하여, 상이한 유형의 겔화제가 사용될 수 있다. 이 겔화제는 세포 함침물을 위해 겔 구성성분을 지닌 매트릭스 내에 사용되는데, 세포가 적절한 지지체에 고착되는 것을 촉진시킨다. 상이한 세포 고착제가 겔화제로서 사용될 수 있다. 예컨대, 콜라겐, 젤라틴, 글리코사미노글리칸, 파이브로넥틴, 렉틴 등이다. 바람직하게는, 콜라겐이 본 발명의 맥락에서 사용된다. 콜라겐은 인간, 소 또는 쥐 기원일 수 있다. 좀 더 바람직하게는, 유형 I의 콜라겐이 사용된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게도 세포의 고착을 허용하는 지지체를 포함한다. 고착이란 용어는 세포와 지지체간의 고착 및/또는 결합을 야기하는 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적인 상호작용을 의미한다. 더군다나, 세포는 사용되는 지지체를 코팅할 수 있거나 이 지지체 내에 들어갈 수도 있으며 또는 둘 다 할 수도 있다. 본 발명의 맥락에서는, 비-독성 및/또는 생물학적으로 적합한 고형 지지체가 사용되는 것이 바람직하다. 특히, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 섬유 또는 생물학적 기원의 지지체(산호, 뼈, 콜라겐 등)가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 이식체는 몸의 상이한 위치에 이식될 수 있다. 특히, 이식은 복강 내, 피하 조직 내 (상치골 영역, 장골 또는 서혜와 등), 기관, 근육, 종양 또는 중추 신경계 또는 점막에 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 이식체는 그들이 apoA-I 변이체의 체내로의 방출을 조절할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 이는 다양한 감염 및 이식된 세포의 수에 의하여 일차적으로 결정된다. 이후, 방출은 이식체의 회수에 의해 치료를 한정적으로 중단하거나, 또는 치료 유전자의 발현을 유도 또는 억제할 수 있는 조절 발현 시스템의 사용에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 변이체의 특히 현저한 항-아테로제닉 성질의 결과에 따라서, 핵산은 심장혈관 병리(아테롬성동맥경화증, 재협착증 등)의 치료 및 예방에 있어서의 신규한 의약 산물을 구성한다.
이 목적을 위해서, 본 발명은 아포지질단백질 A-I 및/또는 핵산 및/또는 벡터 및/또는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 임의의 약학 조성물에도 관련되며, 이는 상기에서 기술되었다.
이리하여, 본 발명은 특히 심근 경색, 앙기나(angina), 급사, 재협착층, 심기능대상부전 및 발작과 같은 심장혈관 호소증 분야에 있어서 변지질단백질혈증(dyslipoproteinaemias) 관련 병리의 치료 또는 예방을 위한 신규 수단을 제공한다. 좀 더 일반적으로, 이러한 접근은 유전적 또는 대사적 특성에 의한 아포지질단백질 A-I 결실이 치료될 수 있는 각각의 경우에 있어서 치료 중재의 활실한 수단을 제공한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 자세히 기술될 것이며, 이는 예시적이고, 비-제한적인 것으로 고려되어야 한다.
실시예 1- ApoA-I 변이체의 표현
ApoA-I 파리 변이체는 동정되고 특정 지질 균형의 결과로서 선택된 환자로부터 단리된다. 좀 더 구체적으로, 환자는 하기의 지질 균형을 보인다(샘플의 특성: 혈청).
정 상
총 콜레스테롤 4.59 mmol/l 4.54-6.97
트리글리세리드 2.82 mmol/l 0.74-1.71
HDL 콜레스테롤 0.25 mmol/l 0.88-1.60
LDL 콜레스테롤 3.06 mmol/l 2.79-4.85
아포지질단백질 A-I 0.50 g/l 1.20-2.15
아포지질단백질 B 1.38 g/l 0.55-1.30
apoE 표현형: 3/3
예기치않게도, 극저농도의 HDL 및 과트리글리세리데미아에도 불구하고 환자는 아테롬성동맥경화증에 어떠한 증상도 보이지 않았다. 이는 출원인이 이러한 보호의 기원을 찾도록 하였다.
혈장으로부터 apoA-I 파리를 함유하는 HDL의 단리
밤새 단식한 후에, apoA-I 파리 유전자를 나르는 피실험자로부터 혈액을 채취한다. 4℃에서 혈액의 느린 원심분리에 의하여 혈장을 준비한다(2000 g, 30분). 1.063-1.21 g/ml의 밀도에서 순차적인 초원심분리에 의하여 고밀도의 지질단백질을 준비한다[참고문헌: Havel, J. Clin. Invesst. 34; 1345-54, 1955]. 이후, HDL을 함유하는 분획을 10 mM Tris-HCl 완충액, 0.01% 나트륨 아지드, pH 7.4로 투석한다.
apoA-I 파리 이량체의 표현
투석된 HDL 분획을 디에틸 에테르/에탄올 (3:1, v/v) 혼합물 내에서 탈지질화한 다음, 라우리 방법에 의하여 단백질 농도를 측정한다[참고문헌: Lowry et al., J. Biol. chem., 193; 265-75, 1951]. 비-환원 조건 하에서 SDS가 존재하는 폴리아크릴아미드 젤 상에서 HDL 분획의 단백질을 이동시킨다. 이러한 이동은 환자의 HDL의 상이한 단백질의 크기를 나타내도록 가능케한다. 정상-크기의 apoA-I 및 apoA-2에 상응하는 단백질의 존재 외에도, 상기 분석은 apoA-I 이량체 및 apoA-I 및 apoA-II 복합체에 상응하는 고분자량의 단백질의 존재를 드러낸다. 이들 복합체 내 apoA-I 및 apoA-II의 존재는 특이 면역 개시 기술에 의하여 입증된다.
변이 apoA-I의 전하에 있어서의 상이점의 표현
혈장 상의 직접적인 변이 apoA-I의 탐지는 하기 프로토콜에 따라 수행된다[참고문헌: Menzel, H. J., and Utermann, G., Electroforesis, 7: 492-495, 1986]: 20 ㎕의 혈장을 에탄올/에테르 혼합물과 함께 밤새 탈지질화시키고 응용 완충액내에서 재현탁시킨다. 5 ㎕의 표본을 등전 포커싱 젤(pH 4-6.5, Pharmolyte) 상에서 전기영동한 다음, 단백질을 나일론 멤브레인 상으로 이동시킨다. apoA-I에 상응하는 밴드를 항-인간 apoA-I 항체를 사용하여 면역 반응에 의하여 탐지한다.
변이 apoA-I의 탐지도 또한 HDL 단백질 상에서 수행될 수 있다. 투석된 HDL 분획을 디에틸 에테르/에탄올(3:1, v/v) 혼합물 내에서 탈지질화한 다음, 라우리 방법에 의하여 단백질 농도를 측정한다[참고문헌: Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951]. 대략 100 ㎍의 단백질이 등전 포커싱 젤(pH 4-6.5, Pharmolyte) 상에서 전기영동된 다음, 쿠마시 블루 염색에 의하여 단백질이 드러난다. 이러한 기술은 변이를 가진 환자의 apoA-I의 거대한 이소형태가 양극으로 이동하는 것을 나타내도록 가능케하며, 정상 apoA-I의 전하와 비교하여 -1의 전하 차이에 상응한다.
실시예 2- 유전자 및 변이의 동정
환자의 게놈 DNA는 Madisen 일행의 기술에 의하여 총혈액으로부터 단리된다[참고문헌: Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987]. 이후, apoA-I 유전자는 PCR 기술에 의하여 증폭된다. 이 목적을 위해서, 증폭 반응은 하기의 혼합물 내로 도입된 1 ㎍의 정제된 게놈 DNA 상에서 수행된다:
- 10 ㎕의 10 x 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 8.3; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2; 0.1% (w/v) 젤라틴)
- 10 ㎕의 2 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
- 20 pmol 의 각 프라이머
- 2.5 U의 Taq 중합효소 (Perkin-Elmer)
- qs 100 ㎕의 H2O
증폭에 사용되는 프라이머는 하기와 같다:
Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3' (서열번호 3)
Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3' (서열번호 4)
Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (서열번호 5)
Sq5493: 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3' (서열번호 6)
Sq5490 및 Sq5491 프라이머는 apoA-I 유전자의 2 및 3 엑손에 상응하는 508-bp 단편을 증폭시키고, Sq5492 및 Sq5493 프라이머는 이 유전자의 4 엑손에 상응하는 664-bp 단편을 증폭시킨다.
다음에는 증폭 산물(508 및 664 bp의 두 개의 PCR 단편)을 서열화한다. 이를 위해서, PCR 단편을 위한 서열화 키트를 사용하여 직접 서열화하는 것으로 이루어진 첫번째 방법이 사용된다(Amersham). 서열화를 위해 사용되는 프라이머는 PCR 프라이머이나, 또한 단백질 내부의 프라이머를 사용하는 것도 가능하다(참고: 하기의 프라이머 S4, S6 및 S8).
PCR 단편을 M13 mp28 벡터 내로 클로닝하는 것으로 이루어진 두번째의 서열화 기술도 또한 사용된다. M13 이중-가닥 DNA를 EcoRV로 절단한 다음, 탈인산화시키고, PCR 단편을 클레나우로 처리하고 인산화시켜서 M13 벡터와 연결한다. 다음, 깨끗한 플라크를 제거하고, 증폭되어 촉매(Applied Biosystem) 상에서 정제된 단일-가닥 DNA를 형광 -20 프라이머(PRISM dye primer kit and Protocol No. 401386, Applied Biosystem) 또는 후자의 방향 이후의 단편 내부의 프라이머로 서열화한다. 이후, 형광 디데옥시뉴클레오티드 기술이 사용된다(DyeDeoxyTerminator kit and Protocol No. 401388, Applied Biosystem).
S8 5'-TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG-3' (서열번호 7)
S4 5'-CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG-3' (서열번호 8)
S6 5'-GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT-3' (서열번호 9)
여러 개의 클론으로부터 기원하는 서열을 모아서 ApoA-I 서열과 비교한다. 성숙 ApoA-I의 148 부터 154의 아미노산은 하기와 같다(서열번호 1의 172-178 잔기에 상응).
ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala
151
아미노산 151의 암호화 코돈의 첫번째 염기 내에서 C-T 돌연변이에 의하여 시스테인을 암호화하게 되면,(하기 서열번호 2 서열 참조) 서열 분석된 클론의 일부가 바뀐다. 이리하여, 이러한 변이는 선택된 환자에서 이형접합체 상에 존재한다.
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala
151
본 발명에 따른 apoA-I 파리 변이체를 암호화하는 전체 cDNA를 서열화한다. 이 서열의 일부는 서열번호 10에 존재한다.
실시예 3: 플라즈미드 발현 벡터(pXL2116mute)의 작제
ApoA-I 파리는 환자의 apoA-I 유전자의 엑손 4의 서열 내에 위치하는 점 돌연변이를 지닌다. 발현 벡터를 작제하는 원리는 apoA-I의 발현을 위해서(벡터 pXL2116, 도 1) 환자의 유전자로부터 기원하는 엑손 4에 상응하는 영역을 벡터 내로 대체하는 것으로 이루어진다.
3.1. M13 내로 클로닝된 환자의 엑손 4의 용도
엑손 4를 환자의 세포의 정제된 DNA로부터 PCR에 의하여 생산하고 M13mp28 파아지의 폴리링커의 EcoRV 부위에 삽입한다(도 2).
돌연변이를 나르는 M13으로부터 기원하는 단편에 의하여, apoA-I의 단편을 대체하는 돌연변이를 꾀한다. 이리하여, 두 개의 벡터에 대한 적절한 효소를 선택하는 것이 우리에게 남겨지는데, 후자는 분해된 pXL2116으로부터 기원하는 벡터와 분해된 이중-가닥 M13으로부터 기원하는 삽입체를 위한 점착 말단(cohesive end)을 생성한다.
3.2. 제한효소의 선택
- Bsu361은 M13 및 pXL2116 내 변이 상부에 유일한 제한효소 부위를 지닌다.
- BamHI으로 분해물은 클로닝 기술의 결과에 따라 apoA-I의 3' 말단에 유일한 제한효소 부위를 지니고 M13의 폴리링커 내 제한효소 부위를 지닌다:
1) pXL2116으로부터 기원하는 벡터 및 M13으로부터 기원하는 삽입체의 연결
2) 상기 연결은 폴리링커의 단편의 통합으로 일어나고, 이는 M13으로부터 기원하는 변이 단편의 삽입체의 효소적 분해에 의해서 입증하기에 유용할 것이다.
이러한 폴리링커의 단편은 정지 코돈 다음에 위치하기 때문에, apoA-I 암호화 서열을 바꾸지 않는 것으로 여겨져야 한다.
apoA-I의 5' 말단에서 뉴클레오티드 서열이 클로닝된 히스티딘-풍부 폴리펩티드도 또한 합성될 것이다.
3.3 벡터의 작제(도 3)
- 이중-가닥으로 만든 M13은 Bsu361/BamHI으로 분해되고 분해 산물은 젤에 적용된다. 이리하여 생성된 삽입체는 충분한 양으로 회수되고 또한 크기는 1Db이다.
- pXL2116은 동일 효소로 분해되나 정제되지는 않는다.
분해 산물의 재연결을 피하기 위해서, 분해는 XhoI으로 수행되는데, 이 제한 효소는 Bsu361-BamHI 단편 내 두 개의 제한효소 부위를 인식한다.
사실상, 탈인산화가 먼저 수행되나, 디쉬 상에서 저조한 결과를 제공하며 시험된 24개 중에서 양성 클론은 하나도 존재하지 않는다.
연결을 위한 벡터 및 삽입체의 최적량은 벡터의 경우 50 ng, 삽입체의 경우는 15 ng으로 평가되었다.
DH5α 균주는 하기의 세 개의 연결의 산물로 형질전환된다:
- 리가아제 없이 Bsu361 및 BamHI으로 분해된 벡터(음성 연결 대조군)
- 분해 산물 + 리가아제
- 분해 산물 + 삽입체 + 리가아제
또한, 형질전환의 효율을 시험하기 위하여 컴피턴트 세포도 pUC19로 형질전환된다.
클로람페니콜(BL21 균주 선별) 및 앰피실린(플라즈미드를 통합하는 균주의 선별)을 지닌 LB 배지디쉬 상에서 형질전환된 세포의 결과는 하기에서 재현된다.
페트리디쉬 상에서 수득된 결과
DH5a+형질 전환 결과 해석
pUC19 200 클론 형질전환 대조군
벡터(+단편) 0 클론 완전 분해, 재원형화되지 않은플라즈미드
벡터 (+단편) +리가아제 160 클론 매우 넓은 배경:아주 비효율적인 부가 분해 전략
벡터 (+단편) +리가아제 +삽입체 120 클론 종종 주시되는 리가아제의 감소 효과.박테리아는 정확한 변이 서열로 형질전환될 필요가 없다.
48개의 클론은 디쉬로부터 재단리된다.
양성 클론(M13의 변이 단편을 삽입한 것들을 의미)을 동정하기 위하여, 48개의 클론 각각에서 정제에 의해 수득한 플라즈미드 DNA를 NdeI 효소로 분해시킨다.
M13으로부터 기원하는 삽입체가 정말로 삽입된다면, 두 개의 단편은 젤 상에서 보일 것이다: 하나는 4.5 kb이고 하나는 1kb이다.
또 다른 연결 현상이 일어난다면, 여러개의 밴드가 수득될 수도 있거나, 단순히 하나의 선형화된 플라즈미드가 수득될 수도 있을 것이다.
젤로부터의 결과에 기초하여 7, 8, 13, 16 및 26 클론은 정확하게 보인다. 깨끗한 결과를 제공하는 클론을 선택한다.
- 선택된 클론의 서열을 완전히 입증하기 위하여, 여섯 개의 효소 분해를 수행한다.
폴리링커의 존재, 삽입체의 존재가 이러한 방식으로 해서 입증되나, 연결 현상도 또한 입증되어야 한다.
플라즈미드의 크기가 정확, 다시 말해서 pxl2116과 같기 때문에, 연결은 기대했던 대로이다.
매우 드문 돌연변이 현상이 일어나지 않았다면, 새로이 클로닝된 apoA-I의 서열은 정확해야 한다.
이리하여, 8개의 클론은 정확히 변이된 플라즈미드 pxl2116을 나른다.
실시예 4: 재조합 apoA-I 변이체의 발현
본 실시예는 재조합 apoA-I 변이체의 생산 방법을 기술한다. 이 방법은 박테리아 내에서 수행된다. 다른 발현 시스템이 본 목적을 위하여 사용될 수도 있다(효모, 동물 세포 등).
4.1. 원리
박테리아 내에서의 플라즈미드의 발현은 T7 프로모터 및 터미네이터의 조절하에 놓여진다. 락토오스의 오페론의 유도제로서 이소프로필 b-티오갈락토피라노시드(IPTG)는 본 시스템에서 T7 RNA 중합효소의 합성을 유도해서, 중합효소가 T7 프로모터에 특이적으로 결합하여 재조합 단백질에 대한 유전자의 전사를 개시하도록 한다. RNA 중합효소는 T7 터미네이터에 의하여 종결됨으로써, 전사가 해당 서열의 하단으로까지 진행되지 않도록 한다.
리팜피신은 이. 콜라이 내생 RNA 중합효소 활성을 억제하는 항생제이다. 따라서, 이는 박테리아 단백질의 합성 억제, 즉 두 개의 단백질분해효소의 합성을 억제하여, 이에 의하여 해당 단백질의 분해를 제한하고, 오염성 박테리아 단백질의 합성을 억제함에 의하여 해당 단백질의 발현을 증폭시킨다.
4.2. 프로토콜
발현에 사용되는 균주는 이. 콜라이 BL21 DE3 pLys S이다. 플라즈미드 DNA는 표준 기술에 따라 형질 전환에 의하여 이. 콜라이 내로 도입된다. 배양액은 25% 글리세롤의 존재 하에 -20℃에서 동결 현탁액의 형태로 500 ㎕ 분획으로 저장된다.
선배양액은 동결 현탁액 몇 방울을 10 ml의 M9-앰피실린 배지에 가함에 의하여 개시된 다음, 37℃에서 밤새 배양된다. 선배양액을 1 리터의 코니칼 플라스크에 접종한 다음, OD 값이 610 nm에서 0.5 내지 1이 될 때까지 37℃ 진탕배양기에서 배양시킨다. 이후, IPTG(Bachem Ref. Q-1280)를 1 mM 최종 농도에서 가한다. 37℃에서 15분간 배양한 후에, 리팜피신(Sigma)을 100 ㎍/ml 최종 농도에서 가한다. 다음, 1 시간 배양 후에, 세포를 원심분리(15분, 8000 rpm)에 의해 회수하고 15% 아크릴아미드 젤 상의 변성 조건 하에서의 전기영동과 면역블로팅에 의하여 발현을 입증시킨다.
수득된 결과는 변이 단백질이 양호한 발현 수준에 따라서 발현됨을 보여주며, 즉, 사실상 항-apoA-I-폴리클로날 항체와 함께 개시된다.
실시예 5: 재조합 apoA-I 변이체의 정제
본 실시예는 본 발명에 따른 재조합 apoA-I 변이체의 정제를 가능케하는 효율적인 방법을 기술한다. 다른 방법도 또한 사용될 수 있는 것으로 고려되어야 한다.
단백질이 이. 콜라이의 세포질 내에서 발현되기 때문에, 이의 추출이 첫 단계에서 필요한데 세포 용균을 수행한 다음, 핵산의 제거가 뒤따른다.
5.1. 박테리아 용균
배양액의 원심분리 후에, 박테리아 펠렛을 단백질 분해효소 억제제 및 β-머캡토에탄올의 존재하의 용균 완충액 내에서 부드럽게 휘저어서 재현탁시킨다.
β-머캡토에탄올은 시스테인 잔기 간에 형성된 디설파이드 브릿지를 절단하는 환원제이다. 디설파이드 브릿지가 이. 콜라이의 세포질내에서는 형성이 되지 않으나, 환원제의 존재는 일단 단백질이 추출되면 필요하다. 사실상, 용균 완충액으로의 β-머캡토에탄올의 첨가는 박테리아 단백질 및 재조합 단백질의 시스테인 잔기간에 형성된 브릿지를 회피하도록 가능케한다.
세포 용균은 얼음에서 3회에 걸친 5분의 초음파처리에 의하여 수득된다(Vibracells sonics material, pulsed mode, output control 5); 이후, 10,000 rpm에서의 원심분리(1시간, 4℃ on Beckman J2-21 M/E, JA10 rotor)에 의하여 세포 잔해가 제거된다. 브래드포드 비색측정(Bradford colormetric) 방법에 의하여 상층액 상에서 단백질 분석이 행해진다.
5.2. 핵산의 침전
본 방법은 단백질 10 g 당 10 ml 비율로 스트렙토마이신 설페이트의 10% 용액과 함께 용균 상층액 상에서 수행되며, 4℃에서 1시간동안 부드럽게 자석 휘젓기를 행한다. 핵산을 10,000 rpm에서의 원심분리(1시간, 4℃ on Beckman J2-21 M/E, JA10 rotor)에 의하여 제거하고, 상층액의 단백질 농도를 비색측정 분석법에 의하여 측정한다.
이러한 2 단계 말기에, 기지 농도의 단백질 용액을 수득하는데, 여기에는 해당 단백질을 포함하여 모든 세포내 단백질이 함께 존재한다. 해당 단백질은 크로마토그래피 기술에 의하여 정제된다.
- 젤 여과에 의한 크로마토그래피
- 친화 크로마토그래피
5.3. 젤 여과에 의한 크로마토그래피
본 단계의 목적은 친화 크로마토그래피를 위해 필요한 조건을 방해하는 분자인 EDTA를 제거하는 것이다. 본 목적을 위하여, 지지체 트리스-아크릴 GF 05 (Sepracor)를 선택한다. 이 젤은 분자량이 300 내지 2500 달턴인 분자의 분리를 허용하며, 단백질을 포함하여 분자량이 2500 달턴 이상인 분자를 배제한다. 더군다나, 이 젤은 양호한 내압성을 지닌 잇점을 가짐으로 인해서, 해상도를 변형시키지 않으면서 고 유동율에서 작업할 수 있다. 박테리아 용균물의 크로마토그래피는 pH 8 인산 완충액 내에서 수행된다. 배제 용적 내의 단백질 농도가 측정되며, 적절하게는, pH 8 인산 완충액 내에서 희석에 의하여 4 mg/ml 로 조정된다.
본 단계는 2 x 10 리터의 PBS로 투석에 의하여 대체될 수 있다. 단백질 용액은 다음 25 mM Hecameg에 노출되는데, 이 세제는 단백질-단백질 상호작용을 감소시킴에 의하여 다음 단계의 정제를 돕는다.
5.4. 친화 크로마토그래피
원리
재조합 단백질과 연결된 6회 연속의 히스티딘 잔기의 존재는 니켈 이온(Ni2+) (15)에 대한 고도의 친화도를 지니도록 한다. 이러한 Ni2+이온은 니트릴로아세트산 (NTA)에 의하여 아가로스 매트릭스에 결합된다. 히스티딘의 이미다졸과 니켈 이온간의 금속 킬레이트 결합이 생성되는데; 이 결합은 이온 결합보다는 강하고 공유결합보다는 약하다.
프로토콜
NiNTA-아가로스 젤(Qiagen)의 결합 성능은 젤 1 ml 당 단백질 2 mg이다. 이 젤은 25 mM Hecameg의 첨가로 pH 8의 완충액 내에서 평형된다. 오염성 박테리아 단백질은 pH 8에서 비-보유되거나 pH 6에서 제거되며, 해당 단백질은 pH 5에서 회수된다. 이러한 단계는 25 mM Hecameg의 존재하에서 수행된다.
pH 5에서 용출된 분획(2 ml)은 하기의 물질로 처리된다:
60 ㎕의 1 M NaOH (중화)
10 ㎕의 0.2 M PMSF
40 ㎕의 0.1 M EDTA
분획을 용출된 단백질의 농도 및 순도에 따라서 수집한다. 이들의 특성은 전기영동에 의하여 분석된다(15% SDS-EDTA).
pH 5에서 용출은 Ni2+-NTA 결합에 작용함으로써 니켈과 결합한 단백질을 분리시킨다. 이리하여, 재조합 단백질로부터 이런 양이온을 해리시키는 것이 필요하다. 본 단계는 50 mM 히스티딘의 존재하에서 1시간 동안 4℃에서 부드러운 자석 휘젓기를 하며 배양함에 의하여 경쟁에 의해서 수행된다.
5.5. 투석
본 단계는 히스티딘과 니켈이 제거되도록 가능케한다. 샘플을 2 mM 의 EDTA-PBS 완충액 10 리터로 5시간동안 4℃에서, 그리고 밤새 2회에 걸쳐서 투석한다(Spectra/Por membrane, MWCO 12-14,000 daltons). 단백질 분석을 최종적으로 수행한다.
본 방법은 apoA-I 파리 단백질이 오염성 단백질로부터 실질적으로 유리되어 정제된 형태로 수득되도록 가능케한다.
실시예 6: 재조합 apoA-I 파리 및 재조합 정상 apoA-I의 물리화학적 성질
6.1. 혼탁도 측정
6.1.1. 온도 함수로서의 혼탁도
apoA-I 존재하에서 325 nm에서의 DMPC 소낭의 흡광도 측정은 작은 크기의 원반형 단백질지질 복합체의 형성의 측정이다. 19 및 28℃ 간의 온도 변화 분석은 흡광도가 인지질의 전이 온도(23℃) 근처에서 감소함을 보여주는데, 이는 복합체의 형성을 확증한다. 도 4(이량체 형성을 피하기 위하여 GdnHDL의 존재 또는 부재하에서)는 천연 apoA-I 뿐만 아니라, 재조합 정상 apoA-I 및 재조합 apoA-I 파리를 지닌 이러한 복합체의 형성의 비교를 보여준다. 이들 세 종류의 단백질은 아주 유사한 행동특성을 지니나, apoA-I 파리의 경우에는 자신과 결합하여 이량체를 형성하는 경향이 있다.
6.1.2. 시간 함수로서의 혼탁도
apoA-I 분자의 배양후에 DMPC 소낭의 혼탁도에서의 감소는 GdnHDL의 존재 또는 부재하에서 시간의 함수로서의 해당 온도에서 뒤따른다. 시간 상수(1/t1/2, 이는 초기 혼탁도에서의 50% 감소에 상응)는 1/T(캘빈 온도)의 함수로서 측정된다. 결합율은 천연 apoA-I의 경우 빠르고, 재조합 apoA-I 분자, 특히 apoA-I 파리의 경우에는 조금 느리다. 더군다나, GdnHDL의 첨가는 단백질-지질 결합을 증가시킨다. 이는 재조합 apoA-I 분자, 특히 apoA-I 파리의 경우에 특히 현저하게 일어난다.
6.2. 트립토판 형광도 방출 스펙트럼
상이한 apoA-I 분자에서의 트립토판 형광도 방출 스펙트럼은 300 내지 400 nm 사이의 파장에서 측정된다(295 nm에서의 여기). apoA-I 분자 및 apoA-I/콜레스테롤/POPC 복합체에 대한 방출 최대량은 하기 표 3에 제시된다. 상이한 apoA-I 분자 및 복합체에서의 트립토판의 형광도 방출 최대량은 동일한데, 이는 모든 세 종류의 단백질에서 트립토판이 동일 환경에 있음을 알려준다.
산물 최대 방출량
A-I 파리 335
POPC/C/A-I 파리 332
재조합 A-I 334
POPC/C/A-I rec 332
A-I 플라즈마 336
POPC/C/A-I 플라즈마 333
6.3. apoA-I/지질 복합체의 단리 및 규명
apoA-I 및 POPC간의 복합체는 콜레이트 기술에 의하여 제조된다. 복합체는 수퍼로오즈 6PG 컬럼 상에서 젤 여과 크로마토그래피에 의하여 유리된 apoA-I로부터 분리되며, 이의 조성물은 분석된다. 젤 여과 단면도는 도 5에 도시되어 있다. 단일 동종 피크가 천연 apoA-I와의 복합체에서 수득되는 반면에, 재조합 apoA-I 분자의 경우에는 이종 군(heterogeneous population)이 관찰된다. 유리된 apoA-I 분자를 20 내지 24 분획에서 용출한다. 상이한 복합체에 대한 각 분획에서의 인지질 농도 및 트립토판 형광도는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 7- 변이 ApoA-I의 발현을 위한 아데노바이러스 벡터의 작제
성숙 ApoA-I의 151번 위치에서의 Arg-Cys 돌연변이를 함유하는, 본 발명에 따른 변이체 암호화 cDNA는 PCR에 의하여 수득된다.
프라이머는
Alm1: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (서열번호 11),
Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (서열번호 12),
Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (서열번호 13) 및
Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (서열번호 14)
가 사용된다. Alm1 및 Alm2 프라이머는 cDNA의 5' 및 3' 말단에 위치한 각각 ClaI 및 SalI 부위를 도입하는 반면에, 상보적인 Alm2 및 Alm3 프라이머는 돌연변이를 도입한다. Alm1-Alm2 및 Alm3-Alm4 프라이머 쌍과의 PCR 반응은 먼저, 변이되지 않은 ApoA-I의 cDNA 상에서 수행된다. PCR로부터 기원하는 단편은 이후, Alm1 및 Alm4 프라이머의 존재하에서 세번째 PCR 내로 재도입되어서 822-bp 단편을 생성시키고, 이는 서열의 입증을 위하여 pCRII(Invitrogen) 내로 클로닝된다. 이후, 변이 cDNA를 함유한 ClaI-SalI 단편은 동일 제한효소 부위를 통해서 셔틀 벡터 pXL-RSV-LPL 내로 도입되는데, 이 셔틀 벡터는 LPL cDNA를 대체하는 소 생장 호르몬의 폴리아데닐화 부위를 지니며 RSV LTR 프로모터의 조절하에서 LPL cDNA를 함유한다. 임의의 다른 셔틀 벡터가 사용될 수도 있다. 결과 만들어진 벡터는 선형화되고 293으로 공형질감염되어 재조합 아데노바이러스를 수득한다. 이리하여, 수득된 아데노바이러스는 플라크 상에서 증폭, 정제된 다음, 예를 들면 글리세롤 내에서 동결 저장될 수 있다. 이들의 치료 용도를 위하여, 이들은 임의의 약학적으로 허용되는 부형제와 배합될 수 있다. 상기 부형제는 특히, 멸균, 등장성 염 용액(일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 클로라이드 등 또는 이 염들의 혼합물) 또는 건조, 특히 동결건조된 조성물일 수도 있으며, 여기에 멸균수 또는 생리 식염수를 적절히 부가하여 주사가능한 용액을 만든다. 변지질단백질증과 결부된 병변의 치료용으로서, 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 상이한 방식으로 투여될 수 있으며, 특히 정맥 주사로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 그들은 문맥(門脈) 내로 주입된다. 주입에 사용되는 바이러스의 투여량은 상이한 변수에 따라서 조정될 수 있으며, 특히 사용되는 투여 방식, 문제의 병변 또는 원하는 치료 기간에 따라서 조정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 104내지 1014pfu/ml 사이의 투여량으로 배합되고 투여된다. AAV 및 아데노바이러스의 경우에는, 106내지 1010pfu/ml 투여량이 사용될 수 있다. pfu(플라크 형성 단위)란 용어는 비리온 현탁액의 감염력에 상응하는 것으로서, 적절한 세포 배양액에 감염시킨 다음, 일반적으로 48 시간 후에 감염된 세포의 플라크 수를 측정함에 의하여 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 적정의 측정 기술은 문헌에 잘 소개되어 있다.
서열 목록
(1) 일반 정보
(i) 출원인:
(A) 성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시: 앙토니
(D) 국가: 프랑스
(E) 우편번호: 92165
(i) 출원인:
(A) 성명: 유니버시티 피에르 앤드 마리에 쿠리에
(B) 거리:
(C) 도시:
(D) 국가: 프랑스
(E) 우편번호:
(i) 출원인:
(A) 성명: 엥스티튀 파스퇴르 드 리틀
(B) 거리:
(C) 도시:
(D) 국가: 프랑스
(E) 우편번호:
(ii) 발명의 명칭: 아포지질단백질 A-I의 신규 변이체
(iii) 서열 수: 14
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 테이프
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.30 (EPO)
(2) 서열번호 1에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 842 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 기원:
(A) 유기체: 호모 사피엔스
(ix) 특징:
(A) 이름/키(key): CDS
(B) 위치: 1..842
(D) 기타 정보: 산물=인간 apoA-I cDNA
(xi) 서열 기술: 서열번호 1:
(2) 서열번호 2에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 기원:
(A) 유기체: 호모 사피엔스
(ix) 특징:
(A) 이름/키(key): CDS
(B) 위치: 1..21
(D) 기타 정보: 산물=변이체 apoA-I cDNA
(xi) 서열 기술: 서열번호 2:
(2) 서열번호 3에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=Sq5490
(xi) 서열 기술: 서열번호 3:
(2) 서열번호 4에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=Sq5491
(xi) 서열 기술: 서열번호 4:
(2) 서열번호 5에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=Sq5492
(xi) 서열 기술: 서열번호 5:
(2) 서열번호 6에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=Sq5493
(xi) 서열 기술: 서열번호 6:
(2) 서열번호 7에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=S8
(xi) 서열 기술: 서열번호 7:
(2) 서열번호 8에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=S4
(xi) 서열 기술: 서열번호 8:
(2) 서열번호 9에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=S6
(xi) 서열 기술: 서열번호 9:
(2) 서열번호 10에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 603 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(vi) 기원:
(A) 유기체: 호모 사피엔스
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..603
(xi) 서열 기술: 서열번호 10:
(2) 서열번호 11에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=alml
(xi) 서열 기술: 서열번호 11:
(2) 서열번호 12에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=alm2
(xi) 서열 기술: 서열번호 12:
(2) 서열번호 13에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=alm3
(xi) 서열 기술: 서열번호 13:
(2) 서열번호 14에 관한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 산물=alm4
(xi) 서열 기술: 서열번호 14:

Claims (18)

151번 위치에 시스테인을 포함하는 인간 아포지질단백질 A-I의 변이체.
제 1 항에 있어서, 서열번호 2의 펩티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, apoA-I 파리임을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질임을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 형태인 변이체.
제 5 항에 있어서, 동종이량체임을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 아포지질단백질 A-I 암호화 핵산.
제 7 항에 있어서, cDNA임을 특징으로 하는 핵산.
제 7 항에 있어서, gDNA임을 특징으로 하는 핵산.
제 7 항에 있어서, RNA임을 특징으로 하는 핵산.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제 11 항에 있어서, 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
제 11 항에 있어서, 화학적 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 따른 아포지질단백질 A-I의 변이체 암호화 DNA를 게놈안에 삽입된 채 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스.
제 7 항에 따른 핵산 삽입에 의하여 유전적으로 변형된 세포.
제 7 항에 따른 핵산 삽입에 의하여 유전적으로 변형된 포유류 세포 및 세포외 매트릭스를 포함하는 이식체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 아포지질단백질 A-I의 변이체 및/또는 제 7 항에 따른 핵산 및/또는 제 12 항에 따른 벡터 및/또는 제 16 항에 따른 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 약학 조성물.
KR1019970708302A 1995-05-22 1996-05-20 아포지질단백질 에이-아이의 신규 변이체 KR19990021828A (ko)

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