FI120154B - Yhdistelmä-DNA-viruksia, niitä sisältävä farmaseuttinen koostumus, niillä tartutettu nisäkässolu ja soluja sisältävä istute - Google Patents

Description

Yhdistelmä-DNA-vIruksia, niitä sisältävä farmaseuttinen koostumus, niillä tartutettu nisäkässolu ja soluja sisältävä istute i 5 Esillä oleva keksintö koskee virusperäisiä yhdis- telmä-DNA-vektoreita, jotka ovat käyttökelpoisia etenkin sellaisten patologioiden hoitamisessa ja/tai estämisessä, jotka liittyvät lipoproteiiniäineenvaihdunnan häiriöihin. Tarkemmin ottaen se koskee, yhdistelmä-DWA-^viruksia, jotka 10 käsittävät DNA-sekvenssin,: joka koodittaa lipaasia, joka osallistuu lipoproteiinimetaboliaan.. Keksintö koskee niinikään näitä viruksia sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia, nisäkässoluja ja istutteita.

Lipoproteiiniaineenvaihduntaan liittyvät häiriöt ,15 ovat häiriöitä lipoproteiinien metaboliassa, jotka ovat vastuussa lipidien kuten kolesterolin ja triglyseridien kuljetuksesta veressä ja ääreisnesteissä. Ne jöhtavat merkittäviin patologioihin, joihin liittyy' vastaavasti kolesterolin tai triglyseridien liiallinen esiintyminen 20 veressä, kuten etenkin valtimoiden kovettuminen. Valtimoiden kovettuminen on kompleksinen polygeeninen sairaus, joka määritellään histologisella tasolla lipidien (lipidi-tai fibrolipidiplakit) ja muiden verijohdannaisten varastoina suurten valtimoiden seinämässä (aortta, sepel-25 valtimot, päänvaltimo). Nämä plakit, jotka ovat enemmän tai vähemmän kalsifioituja prosessin etenemisen mukaan, voivat liittyä vaurioihin ja liittyvät oleellisesti ko-lesteroliestereistä koostuvien rasvavarastoj en kerääntymiseen valtimoihin. Näihin plakkeihin liittyy valtimon 30 seinämän pakseneminen ja sileän lihaksen liikakasvu, vaahtosolujen ilmaantuminen ja sidekudoksen kerääntyminen. Valtimopalkki on hyvin selkeästi korkokuvana seinämällä, mikä antaa sille tukkeuttavan luonteen, joka on vastuussa verisuonitukoksista valtimotukoksen, verisuonitukoksen tai 35 veritulpan muodossa, joita esiintyy eniten sairaissa 2 potilaissa. Lipöpröteiinimetaboliän häiriöt voivat siis johtaa hyvin vakaviin sydänverisuonipatologioihin kuten infarkti, äkillinen kuolema, sydämen toimintavajaus, aivoveri Suonionnettomuudet jne· 5 Tällä hetkellä näitä patölQgioita ja erityisesti kolesterolin liiallista esiintymistä veressä hoidetaan oleellisesti yhdisteillä, jotka vaikuttavat joko kolesterolin biosynteesiin (hydroksimetyyliglutaryyli-koentsyymi-Ä-reduktaasi-inhibiittorit, statiinit) tai sapen koles-10 terolin sieppaukseen ja poistamiseen (sekvestx'antit tai hartsit), tai edelleen lipolyysiin vaikutustavalla, joka on molekyylitasolla edelleen selvittämättä (fibraatit}. Seurauksena kaikki suuret lääkeluokat, joita käytetään tässä indikaatiossa (sekvestrantit, fibraatit tai statii-15 nit) , kohdistuvat vain valtimon rasvakerros tumaplaltin muodostumisen estoon eikä itse asiassa rasvakerrostumien, valtimoiden seinämissä hoitoon. Rasvakerros tunti en valtimoiden seinämissä tämänhetkiset, sepelvaltimo-onnettomuuden jälkeiset hoidot ovat vain hätäratkaisuja, koska ne eivät 20 puutu kolesterolin homeostaasiin ja koska ne ovat kirurgisia toimenpiteitä (sepelvaltimoiden ohitusleikkaus, verisuonten uudel1eenmuovaaminen).

Esillä oleva keksintö muodostaa uuden terapeuttisen lähestymistavan lipoproteiinimetabolian häiriöihin 25 liittyvien patologioiden hoitamiseksi. Se esittää edullisen ratkaisun alan teleni s en tason mukaisiin huonoihin puoliin osoittaessaan mahdollisuuden hoitaa lipoproteiinimetabolian häiriöihin liittyviä patologioita geeniterapialla siirtämällä ja ilmentämällä in vivo geeni, joka 30 koodittaa lipaasia, joka osallistuu lipoproteiinien aineenvaihduntaan. Keksintö tarjoaa täten yksinkertaisen keinon;, joka mahdollistaa näiden patologioiden spesifisen ja tehokkaan hoidon.

Geeniterapia käsittää puutoksen tai epänormaaliu-35 den (mutaatio, poikkeava ilmentyminen jne.} korjaamisen i | 3 tai terapeuttisesti: kiinnostavan proteiinin ilmentymisen varmistamisen viemällä geneettistä tietoa sairaaseen soluun tai elimeen.. Tämä geneettinen tieto voidaan viedä joko ex vivo elimestä uutettuun soluun, minkä jälkeen mo-5 difioitu Solu viedään sitten takaisin organismiin, tai suoraan in vivo sopivaan kudokseen. Tässä toisessa tapauksessa on olemassa eri tekniikoita, joista, mainittakoon eri transfektointitekniikat, joissa käytetään kompleksina DNA:ta ja DEAE-dekstraania [Pagano et ai., J. Virol. 1 10 (1967) 891], DNA: ta ja tumaproteiineja [Kaneda et ai. ,

Seience 243 (1989) 375], DNA:ta ja lipidejä [Feigner et ai;. , PNAS 84 (1987) 7413] , liposomeja [Fraley et ai, , J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] jne. Nyttemmin virusten käyttö vektoreina geenien siirtämiseksi on ilmaantunut 15 lupaavaksi vaihtoehdoksi näille fysikaalisille transfek-tointitekniikoille. Tässä suhteessa on testattu eri virusten kykyä tartuttaa tiettyjä solupopulaatioita; erityisesti on testattu retroviruksia (RSV, HMS, MMS jne.), HSV-virusta, adenoliitteisiä viruksia ja adenoviruksia.

20 Esillä oleva keksintö muodostaa uuden terapeutti sen lähestymistavan lipoproteiinimetabolian häiriöihin liittyvien patologioiden hoitamiseksi, jonka lähestymistavan mukaan siirretään ja ilmennetään in vivo geenejä, jotka koodittavat lipaaseja, jotka liittyvät lipoproteii-25 nimetaboliaan. Erityisen edullisesti hakija on nyt osoittanut, että on mahdollista rakentaa yhdistelmä-DNA-viruksia, jotka sisältävät DNA-sekvenssin, joka koodittaa li-paasia, joka liittyy lipoproteiinien aineenvaihduntaan, antaa näitä yhdistelmä-DNA-viruksia In vivo, ja että tämä 30 anto mahdollistaa in vivo biologisesti aktiivisen lipaasin stabiilin ja tehokkaan iImentyrnisen ilman sytopatologisia vaikutuksia.

Esillä oleva keksintö on samoin seurausta sen osoittamisesta, että adenoviruksista saadaan erityisen 35 tehokkaita vektoreita tällaiseen geenien siirtoon ja il- 4 mentämiseen. Erityisesti esillä oleva keksintö osoittaa, että käyttämällä yhdi s t elinä-DNA- adenovi ruks i a vektoreina on mahdollista saada näiden geenien riittävän korkeita iImentyrnistasoj a halutun terapeuttisen vaikutuksen tuot-5 tamiseksi.

Esillä oleva keksintö tarjoaa täten uuden lähestymistavan lipopröteiiniaineenvaihd-unnan häiriöihin liittyvien sydänverisuonipatologioiden ja neurologisten patologioiden hoitamiseksi ja estämiseksi.

10 Esillä olevan keksinnön ensimmäinen kohde on siten defektrivinen yhdistelmä-DNÄ-virus, pois lukien phagemidi CDM8, joka yhdistelmä-DNA-virus käsittää nukleii-:ni sekvenssin.,· joka koodithan iipaasia, joka osallistuu 1ipoprotelinimetabo1iaan.

15 Keksintö koskee myös tällaisen defektiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen käyttöä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu sydänverisuonisairauksien hoitoon ja/tai estoon.

Esillä oleva keksintö koskee samoin geneettisesti 20 ex vivo edellä kuvatun mukaisella viruksella modifioitujen solujen käyttöä, tai näitä viruksia tuottavien solujen käyttöä, jotka organismiin istutettuina mahdollistavat biologisesti aktiivisen lipaasin pitkittyneen ja tehokkaan vapautumisen in vivo.

25 Keksinnön mielessä 1ipopro tei inien aineenvaihdun taan liittyvistä lipaaseista voidaan mainita edullisesti lipoproteiinilipaasi (LPL).

Lipoproteiinilipaasi (LPL) on entsyymi, joka mahdollistaa triglyseridien hydrolyysin, jotka sisältyvät 30 lipoproteiineihin, joiden tiheys on hyvin alhainen (VLDL), tai kylömikroneihin. Apolipoproteiinia CU, joka esiintyy näiden partikkelien pinnalla, käytetään kofaktorina tässä hydrolyysissä. Luonnollisesti LPL:ää syntetisoivat pääasiassa rasvasolut monome er i s en, 51 kDarn prekursorin muodos- | 35 sa, joka sitten glykosyloidaan (58 kDa) . Veressä LPL on 5 aktiivinen dimeefisessä muodossa. Aina 80 % juuri syntetisoidusta LPL:stä hajoäa: lysosomaalisessa osastossa, ennen kuin se on voitu erittää. LPL:n erityksen jälkeen sen s.ieppaa suonen endoteelisolujen huminaalipintä, johon se 5 kiinnittyy glykosaminoglykaanien välityksellä. Sillä On hyvin voimakas affiniteetti hepariinin suhteen, mikä mahdollistaa LPL:n syrjäyttämisen kiinnityskohdastaan endo-teelisolupinnalla, Ruiskuttamalla laskimonsisäisesti hepa-riinia on mahdollisia mitata LPL:n pitoisuus ja aktiivi-10 suus potilaissa. LPL:ää käytetään verisuonisolujen tasolla, mutta myös maksasolujen tasolla 1ipoproteiinisieppaajana, joka lisää niiden pidätystä solupinnalla ja suosii näin niiden sieppausta tai modifikaatiotä.

Ihmis-L,PL:ää koodittava cDNA on kloonattu ja sek-15 ventointu [Wion et ai. , Science 235 (1987) 1638 - 1641] .

On olemassa yhtäaikaa kaksi 1ähe11imuotoa, 3 350 ja 3 750 emäksen, pääasiassa rasva- ja lihaskudoksessa, ja ne ovat peräisin kahden polyadenylaatiokohdan käytöstä. Niihin sisältyy pitkä ei-luettu 3'-sekvenssi ja ne koodattavat 20 475 aminohapon preproteiinia, josta lohkeaa 27 aminohapon johtosekyenssi, jolloin syntyy kypsä monomeertinen proteiini , joka käsittää 448 tähdettä. LPL-geehi on .niinikään kloonattu [Kirchgessner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 262 (1987) 9647 - 9651]. LPL·:n synteesiä, prosessointia ja 25 eritystä säädellään kompleksisella tavalla kehityksen aikana ja. vasteena hormonaaliseen stimulaatioon. Merkittävä osa tästä säätelystä suoritetaan transkription tasolla [katsaus julkaisussa Auwerx et ai. , Critical Reviews, in Clinical Laboratory Sciences 29 (1992) 243 - 268].

30 Esillä oleva keksintö osoittaa, että on mahdollista sisällyttää LPL:ää koodittava DNA-sekvenssi virusvekto- j riin, ja että nämä vektorit mahdollistavat LPL:n kypsän, biologisesti aktiivisen (dimeerisen) muodon tehokkaan; ilmentämisen ja erityksen. Tarkemmin ottaen keksintö 35 osoittaa, että aktiivisen liPLin ilmentyminen in vivo voi- 6 daa.n saada antamalla suoraan adenovirus ta tai istuttamalla tuottajasolu tai solu, jota on geneettisesti modifioitu adenoviruksella tai retroviruksella, joka sisältää tällaista DKfÄtta.

5 Keksinnön mukaisia vektoreita voidaan etenkin käyttää mutaatioista LPL-geenissä johtuvien LPL-vajeiden korjaarniseksi. Tällaiset vajeet ovat suhteellisen yleisiä j:a niiden esiintymis tiheys voi olla joka 1:5 000 - 1: 10 000 tietyissä populaatioissa [S:, Santamarina-Fojo, 10 Curr. Op. Lloid. 3 {1992) 186 - 195] , Nämä vajeet voivat johtua geenin tasolla merkittävästä mutaatiosta, joka johtaa LPL-synteesin puuttumiseen tai typistetyn tai hyvin modifioidun proteiinin synteesiin. Itse asiassa tietyissä potilaissa on osoitettu insertio-, deleetiotyypin 15 mutaatioiden tai antisense-mutaatioiden läsnäolo [katsaus S. .Santamarina-Fojo, Curr. Op. Lipid. 3. (1992) 186 - 195]. Ne voivat samoin olla seurausta virheestä kataholisen kohdan tasolla, joka virhe voi johtua antisense-tyypin mutaatioista geenin tasolla. Ne voivat myös olla seurausta mo-20 difikaatiosta yhtä hyvin hepariinin sitoutumiskohdassa kuin katalyyttisessä kohdassa· Heterotsygoottivaiheessa nämä vajeet voivat edustaa merkittävää osaa tapauksista, joissa lipidien pitoisuus veressä on liian korkea, joista, tapauksista tavallisimpia ovat perheittäin esiintyvä tri-25 glyseridien liiallinen määrä veressä.* perheittäin esiintyvät yhdistetyt lipidien liialliset määrät veressä ja lipidien liialliset määrät veressä aterioiden jälkeen.

Esillä oleva keksintö on erityisen edullinen, koska se mahdollistaa EPInn kontrolloidun ja haitattoman il-30 mentymisen indusoirmin elimissä, joita tämän proteiinin ilmentyminen ei normaalisti koske. Erityisesti varsin edullinen vapautuminen saadaan istuttamalla soluja, jotka tuottavat keksinnön mukaisia vektoreita, tai jotka on tartutettu ex vivo keksinnön mukaisilla vektoreilla.

7

Esillä olevan keksinnön piirissä tuotettu lipaasi-aktiivisuus voi olla ihmis- tai eläinlipaasi. Esillä olevan keksinnön piirissä: käytetty nukleiinihapposekvenssi voi olla cDNA, genomi-DNA (gDNA) , USTA (retrpvix'usten ky-5 seessä olleen) tai hyhri&irakenne·:, joka koostuu esimerkiksi cDNA:sta, johon on insertoltu yksi tai Useampi introni. Kyseessä voivat myös: olla synteettiset tai puolisynteettiset sekvenssit:. Erityisen edullisesti käytetään cDNA:ta tai gDNA:ta. Erityisesti gDNA:n käyttö mähdo11is-10 taa paremman iImentyjftiSep ihmissaiuissa. Niiden sisällyttämisen keksinnön mukaiseen, virusvektoriin mahdollistamiseksi: näitä sekvenssejä edullisesti modifioidaan/ esimerkiksi kohdennetusti mutagenisoimalla, erityisesti sopivien, restriktiokohtien insertoimiseksi. Alan teknisen: tason 15 puitteissa kuvattuja sekvenssejä ei ole itse asiassa rakennettu keksinnön mukaiseen käyttöön, ja. edeltäpäin suoritetut adaptaatiot voivat osoittautua välttämättömiksi huomattavien iImentymistasojen saamiseksi. Esillä olevan keksinnön piirissä käytetään edullisesti nukleiinihap-20 posekvenssiä, joka koodittaa ihmislipaasia. Sitä paitsi on samoin mahdollista käyttää rakennetta, joka koodittaa näiden lipaasien johdannaista, erityisesti ihmis-LPL:n ja -LH:n johdannaista, LH {maksalipaasi) sijaitsee maksan en-doteelisolujen pinnalla. Se eroaa LPL:stä epäherkkyydes-25 sään apoC-II:n aktivoivalle vaikutukselle, LH osallistuu IDL--lipidien hydrolyysiin sekä HDL2-lipidien hydrolyysin, mikä johtaa niiden konversioon HDL3:ksi. Näiden lipaasien johdannainen käsittää esimerkiksi minkä tahansa sekvenssin, joka on saatu mutaatiolla, deleetiolla ja/tai addi-30 ti oi la na tiivis ta sekvenssistä, ja. joka koodit taa tuotetta, jolla on tallella lipaasiaktiivisuus. Nämä modifikaatiot voidaan suorittaa alan ammattilaiselle tutuilla tekniikoilla (katso jäljempänä aiol ekyy 1 ibi oiogian yleiset tekniikat). Näin saatujen johdannaisten biologinen aktii-35 visuus voidaan sitten helposti määrittää, kuten esitetään 8 etenkin esimerkissä 3. Keksinnön mukaiset johdannaiset; voidaan samoin saada hybridisaatiolla lähtien nukleiini-happopankeista käyttämällä koettimena natiivia sekvenssiä tai sen fragmenttia, 5 Nämä johdannaiset ovat etenkin molekyylejä, joilla on suurempi affiniteetti kiinnityskohtiensa suhteen, molekyylejä, joilla on parempi vastustuskyky pro teaas exile., molekyylejä, joilla on suurempi terapeuttinen teho tai. vähemmän sekundaarivaikutuksia, tai mahdollisesti uusia 10 biologisia ominaisuuksia. Johdannaisiin sisältyvät samoin modifioidut DNA-sekvenssit, jotka mahdollistavat paremman ilmentymisen in vivo.

Edullisista johdannaisista voidaan tarkemmin ottaen mainita luonnolliset variantit, molekyylit, joissa 15 tietyt N- tai Q-glykosylaatiokohdat on modifioitu tai supprimoitu, molekyylit, joissa yksi tai useampi tähde on substituoitu, tai molekyylit, jöissa kaikki kysteiinitähteet on substituoitu (muteliniti. Voidaan mainita samoin johdannaiset, jotka on saatu alueiden deleetiolla, jotka 20 eivät osallistu tai osallistuvat vain vähän vuorovaikutukseen sitoutumiskohtien kanssa, jotka ovat kyseessä, tai jotka ilmentävät epätoivottavaa aktiivisuutta, ja johdannaiset., jotka käsittävät suhteessa natiiviin sekvenssin ylimääräisiä tähteitä, kuten esimerkiksi eritys-25 signaalin ja./tai liittopeptidin.

Ensimmäisessä suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee defektiivistä yhdistelmä-DNA-virusta, pois lukien phagemidi CDM8, joka yhdistelmä-DNA-virus käsittää οΠΝΑ-sekvenssin, joka koodittaa lipaasia, joka osallistuu 30 lipoproteiinien aineenvaihduntaan. Keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa DNA-s ekvens s i on gDNA- sekvenssi.

Keksinnön mukaiset vektorit voidaan valmistaa lähtien eri tyyppisistä viruksista. Edullisesti käytetään 35 vektoreita, jotka ovat peräisin adenoviruksista, adeno- 3 liitteisista viruksista (AAV),, herpes-viruksista (HS?) tai retroviruksista. Aivan erityisen edullisesti käytetään adenovirusta suoraan antoon tai istutettavien solujen modifikaatioon ex vivo, tai retrovirusta, tuottajasolujen 5 istuttamiseksi.

Keksinnön laukaiset virukset ovat defektiivisiä, eli ne eivät, kykene replikoi tuma an autonomisesti kohdeso-lussa. Yleensä esillä olevan keksinnön piirissä käytettyjen defektiivisten virusten genomi on siten vailla vähin-10 tään mainitun viruksen repiikaatiolle tartutetussa solussa välttämättömiä sekvenssejä. Nämä alueet on voitu joko eliminoida (kokonaisuudessaan tai osittain) tai niistä on voitu tehdä ei--funktionaalisia, tai ne on voitu sutosti-tuoida muilla sekvensseillä ja etenkin lipaasia kooditta-15 valla nukleiinihapposekvenssillä. Edullisesti defektiivi-sellä viruksella on kuitenkin tallella genominsa sekvenssit, jotka ovat välttämättömiä viruspartikkelien kapsidaa-tiolle.

Mitä tulee tarkemmin ottaen adenovizuksiin, eri 20 serotyyppejä, joiden rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat jonkin verran, on karakterisoitu. Näistä serotyypeistä esillä olevan keksinnön piirissä käytetään edullisesti ihmisen tyypin 2 tai 5 adenoviruksia (Ad2 tai Ad5) tai eläinalkuperää olevia adenoviruksia (katso WO-hakemvjul-25 Raisu 94/26 914), Esillä olevan keksinnön piirissä käyt- tökelpoisista eläinalkuperää olevista adenoviruksista voidaan mainita koira-, nauta-, hiiri- [esimerkki: Mavl,

Beard et ai. , Virology 75 (1990) 81], lammas-, sika-, lintu- tai edelleen, apina- (esimerkki: SAV) adenovirukset.

30 Edullisesti eläinalkuperää oleva adenovirus on koira- ädenovirus, edullisemmin adenovirus GAV2 [kanya manhattan tai A26/61 (ATCC VR-800} esimerkiksi]. Edullisesti keksinnön piirissä käytetään ihmis-, koira- tai seka-alku- 1 perää olevia adenoviruksia. Edullisesti keksinnön mukaiset | 35 defektiiviset: adenovirukset käsittävät iTR-sekvenssit, j | j 10 kapsidaation mahdollistavan sekvenssin ja lipaasia ..koodit t avail sekvenssin. Edullisesti keksinnön mukaisten adenovirusten genomissa vähintään El-alueesta on tehty ei-funktionaalinen. Edelleen edullisemmin keksinnön mukaisten 5 adenovirusten genomissa El-geeni ja vähintään Yksi geeneistä Έ2, E4, L1-L5 on ei-funktionaalinen. Kyseessä olevasta virusgeenistä voidaan tehdä ei-funktionaalinen millä tahansa alan ammattilaiselle tutulla tekniikalla, ja etenkin täysin suppressoimalla, substituoimalla, osittain de-10 letoimalla täi lisäämällä yksi tai useampi emäs kyseessä olevaan geeniin tai geeneihin. Tällaisia modifikaatioita voidaan saada in vitro {eristetyllä DNA:11a) tai in situ, esimerkiksi geenimanipulaatiotekniikoiden avulla, tai edelleen käsittelemällä mutagenisoivilla ainella. Muitakin 15 alueita voidaan modifioida ja etenkin aluetta e3 (WO 9:5/02 6:97), E2 (WO 94/28 938), E4 (WÖ 94/28 152, WO 94/ 12 649, WO 95/02 697) ja L5 (WO 95/02 687). Edullisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mukainen adenovirus käsittää deleetion alueilla El ja E4 ja LPL;ää koodittava sekvenssi 20 on insertöltu inaktivoidulle El-alueelle. Toisen edullisen suorittismuodon mukaan se: käsittää deleetion alueella El, johon on insertöltu alue E4 ja LPL;ää koodittava sekvenssi (vrt. FR 9 413 355).

Keksinnön mukaiset defaktiiviset adenovirukset 25 voidaan valmistaa millä tahansa alan ämmät ti Täiselle: tutulla tekniikalla [Levrero e£ ai. , Gene 101 {1991) 195; julkaisussa EP 185 573; Graham, EMEO J, 3 (1984) 2917] .

Erityisesti ne voidaan valmistaa homologisella DNA-yhdistymisellä adenoviruksen ja pläsmidin välillä, joka käsit-30 tää muun muassa lipaasia koodittavan DNA-sekvenssin. Homologinen DNA-yhdistyminen tapahtuu kotransfektoimalla mainitut adenovirus ja plasmidi sopivaan solulinjaan. Käytetyn solulinjan, tulee edullisesti {i) olla transformoitavissa mainituilla yksiköillä, ja (ii) käsittää sekvenssit, 35 jotka kykenevät täydentämään adenoviruksen defektiivisen 11 genomiosan, edullisesti integroituun muotoon DNA-yhdisty-misvaaröjen välttämiseksi. Esimerkkinä soluiinjasta voidaan mainita ihmisalkion munuaissolulinja 293 [Graham et ai. , J. Gen. Virol. 3 6 (1977} 59] , joka sisältää etenkin 5 genomiinsa integroituneena adenoviruksen Ad5 genomin vasemmanpuoleisen osan (12 %) , tai solulinjat, jotka kykenevät täydentämään funktiot El ja E4, joita kuvataan etenkin patenttihakemusjulkaisuissa WO 94/26 914 ja W0 95702 697,: 10 Sitten monistuneet adenov i ruks e t otetaan talteen ja puhdistetaan molekyylibiologian tavanomaisten tekniikoiden mukaan, kuten esimerkeissä esitetään.

Mitä tulee adenoliitteisiin viruksiin (AAVj, kyseessä on suhteellisen pienikokoinen DNA-virus, joka in-15 tegroituu tartuttamiensa solujen genomiin stabiilisti ja paikkaspesifisesti.. Ne kykenevät tartuttamaan suuren valikoiman soluja vaikuttamatta solujen kasvuun, morfologiaan tai differentiaatioon. Sitä paitsi ne eivät vaikuta liittyvän ihmisen patologioihin. AAV:n genomi on kloonattu, 20 sekventoitu ja karakterisoitu. Se käsittää noin 4 700 emästä, ja sisältää kummassakin päässä noin 145 emäksen toistuvan käänteisen alueen (XTR), joka toimii viruksen replikaatiöalkukohtana. Genomin loppuosa jakautuu kahteen oleelliseen alueeseen, jotka käsittävät kapsidaatiofunk-25 tiot: genomin vasemmanpuoleinen osa, joka sisältää rep- geenin, joka osallistuu viruksen replikaatioon ja virus-geenien ilmentymiseen,* genomin oikeanpuoleinen osa, joka sisältää cap-geenin, joka koodittaa viruksen kapsidipro-teiineja.

30 AAV’Sta saatujen vektorien käyttöä geenisiirtoon in vitro ja in vrvo: on. kuvattu kirjallisuudessa (katso etenkin WG 91/18 088; WO 93/09 239; US- patenttihakemuksessa 4 797 368, US-patenttijulkaisussa 5 139 941, EP-hakemusjulkaisussa 488 528}. Näissä 35 patenttihakemuksissa kuvataan erilaisia AAV-peräisiä 12 rakenteita, joissa geenit rep ja/tai cap on deletoitu ja korvattu kiinnostavalla geenillä, ja niiden käyttöä mainitun kiinnostavan geenin siirtämiseksi in vitro (soluihin viljelmässä) tai in vivo (suoraan organismiin) .

5 Kuitenkaan missään näistä julkaisuista ei kuvata eikä ehdoteta yhdis telmä-DNA-AAV:n käyttöä 1-ipaasin siirtämiseksi ja ilmentämiseksi in vivo tai ex vivo, eikä tällaisen siirron etuja. Keksinnön mukaiset defaktiiviset yhdistelmä-DNA-AAV:t voidaan valmistaa kotransfektoima11a 10 solui in jaan, joka on tartutettu Ihmisapuviruksella (esimerkiksi adenovirus), plasmidi, joka sisältää lipaasia koodittavari sekvenssin AAV:n kahden toistuvan käänteisen alueen (TTR) rajaamana, ja plasmidi, joka käsittää AAVln kapsidaatiOgeehit (geenit rep ja cap). Tuotetut 15 yhdistelmä-DNA-AAV-sekvenssit puhdistetaan sitten tavanomaisin tekniikoin..

Mitä tulee herpesviruksiin ja retroviruksiin, yhdistelmä -dna- vektori en rakentamista on laajalti kuvattu kirjallisuudessa: katso etenkin Breakfield et ai., New 20 Biologist 3 (1991) 203; EP-hakemusjulkaisu 453 242; EP- hakemus julkaisu 178 220; Bernstein et ai., Genet. Eng. ,7 (1985) 235; McCormick, BioTechno 1 ocrv 3. (1985) 689 jne.

Erityisesti retrovirukset ovat integroituvia viruksia, jotka tartuttavat jakautumassa olevia soluja.

25 Retrovirusten genomi käsittää oleellisesti kaksi LTR:ää, yhden kapsidaatiosekvenssin ja kolme koodittavaa aluetta {gag:, pol ja envj . Retroviruksista saaduissa yhdistelmä-DNA-vektoreissa geenit gag, pol ja env on yleensä deletoitu,: kokonaisuudessaan tai osittain, ja korvattu kiin-30 nostavalla heterölogisella nukleiinihapposekvenssiliä.

Nämä vektorit voidaan valmistaa lähtien eri tyyppisistä ; retroviruksista kuten etenkin MoMuLV (hiiren Moloney-leu-kemiavirus, jotka kutsutaan edelleen MpMlVkksi), MSV (hiiren Moloney-sarko.omavirus) , HaSV (Harveyn sarkoomavi- 13 rus) ; SW (pernakuoliovirus) ; RSV (Rous-sarkoomavirus) tai edelleen Friendin virus.

Yhdistelmä-DNA-retrovirusten rakentamiseksi, jotka käsittävät keksinnön mukaista LPL:ää koodittayan sekvens-5 s in, rakennetaan yleensä plasmidi, joka käsittää etenkin LTR-sekvenssit, kapsidaatiosekvenssin ja mainitun koodit-tavan sekvenssin, minkä jälkeen sitä käytetään kapsidaa-tiosolulinjaksi kutsutun soluiinjan transfektoimiseksi, joka kykenee tuomaan mukanaan en trans defektiiviset ret-10 rovirusfunktiot plasmiäiin. Yleensä kapsidaatiosolulinjat kykenevät siten ilmentämään geenit gag, pol ja env. Tällaisia kapsidaatiosolulinjQja on kuvattu alan teknisen tason puitteissa, ja etenkin solulinjaa PA317 (JS-patent- t ihakemuks es s a 4 861 719); solulinjaa PsiCRIP (WO 90/ 15 02 806) ja solulinjaa GP+envAm-12 {WO 89/07 150) . Sitä paitsi yhdistelmä-DNA-retrovirukset voivat käsittää modifikaatioita LTRiien tasolla transkriptioaktiivisuuden sup-pressoimiseksi, sekä laajentuneita kapsidaatosekvenssejä, jotka käsittävät osan geenistä gag [Bender et ai. . J, 20 viro!:. 61 (1987) 1639] . Tuotettuja yhdistelmä-DNA-retro- viruksia puhdistetaan sitten tavanomaisin tekniikoin.

Esillä olevan keksinnön suorittamiseksi erityisen edullisesti käytetään derektiivistä yhdistelmä-DNA-adeno-yi.rus.ta. Jäljempänä esitetyt tulokset osoittavat itse 25 asiassa adenovirus ten; erityisen: kiinnostavat ominaisuudet proteiinin ilmentämiseksi in vivo, jolla on lipaasiaktii-visuutta. Keksinnön mukaiset adenovirusvektorit ovat erityisen edullisia puhdistetun suspension suoraksi antamiseksi in vivo tai solujen, etenkin autölogisten, trans-30 formoimiseksi ex vivo silmällä pitäen niiden istuttamista. Lisäksi keksinnön mukaiset adenovirusvektorit osoittavat muun muassa merkittäviä etuja, kuten etenkin niiden hyvin korkea tartutuskyky, joka mahdollistaa tartutusten suorittamisen lähtien pienistä virussuspensiotilavuuksis-35 ta. Erityisen edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mu- 14 kaari käytetään adenovirus ta, joka käsittää lipaasia koo-dittavan geenin lisäksi apolipoprotei.inia koodittavan geenin. Kyseessä on edullisesti maksalipaasi ja apolipopro-teiini., joka valitaan apoA-i:stä ja apoAIVtstä, Näitä S kahta geeniä käytetään edullisesti bikistronisen rakenteen muodossa:, joka viedään adenovirus vektori in edellä yhden yksittäisen geenin käsittävän adenoviruksen rakentamiseksi kuvatun protokollan mukaan. Edullisesti keksintö koskee yhdistelmä^DNA-adehovirustä, joka käsittää LH: ta 10 koodittavan geenin ja ApoA-I:ta koodittavan geenin inser-toituina El-alueelle, Adenoviruksen rakentamista, joka käsittää apö.a koodittavan. geeni, on kuvattu hakemusjulkaisussa PCT/FR 94/00 422, joka sisällytetään tähän viitteeksi .

15 Keksinnön toisen erityisen edullisen suoritusmuo don mukaan käytetään retx'ovirusvektorelta tuottavaa solu-linjaa, joka sisältää lipaasia koodittavan sekvenssin, istutukseen in vivo, Tähän tarkoitukseen käyttökelpoisia solulinjoja ovat etenkin PA317-solut fUS-patenttijulkai-20 sussa 4 861 719):* PsiCrip (WO 90/02 806): ja GP+envAm-12 (US-patenttljulkaisussä 5 278 056), joita on modifioitu retroviruksen tuotannon mahdollistamiseksi, joka sisältää keksinnön mukaista lipaasia koodittavan nukleiinihapposek-venssin.

25 Edullisesti keksinnön mukaisissa vektoreissa li paasia koodattava sekvenssi on sijoitettu signaalien kontrolliin, jotka mahdollistavat kyseessä olevan sek^ verissin ilmentymisen tartutetuissa soluissa. Kyseessä voivat olla homologiset tai heterologiset ilmentämissekvens-30 s it, eli signaalit, jotka poikkeavat signaaleista.,: jotka luonnollisesti ovat vastuussa lipaasin ilmentymisestä.

Kyseessä Voivat olla erityisesti Sekvenssit, jotka ovat vastuussa muiden proteiinien ilmentymisestä, tai synteet- | tiset sekvenssit. Etenkin kyseessä voivat olla eukaryoot-35 tisten tai vitaalisten geenien sekvenssit tai johdahhais- 15 sekvenssit, jotka stimuloivat tai tukahduttavat geenin transkriptiota spesifisesti tai ei ja indusoitavasti tai ei. Esimerkiksi kyseessä voivat olla promoottorisekvens-sit, jotka ovat peräisin sen solun genomista,: joka halu-5 taan tartuttaa, tai virusgenomista, ja etenkin adenovirus-geenien E1A-, MLP-promoottorit, promoottori CMV, LTR-RSV jne. Eukaryoottisista promoottoreista voidaan mainita samoin tavalliset promoottorit. (HPRT, vimentiini, cx-aktiini, tubuliini jne.), välifilatenttien promoottorit (desmiini, 10 neurofilamentit, keratiini, GFAP jne.), terapeuttisten geenien promoottorit (tyyppiä MDE, CFTR, tekijä VIII jne.), kudosspesifiset promoottorit (pyruvaattikinaasi, villiini, rasvahappojen suolisitoutumisproteiinin promoottori, sileän lihaksen, solujen a-aktiinipromoottori, mak-15 salle spesifiset promoottorit; Apo AI, Apo Ali, ihraisalbu-miini jne.) tai edelleen stimulaatioon reagoivat promoottorit (sterOidihormonireseptarit, retiinihapporeseptori jne.). Muun muassa näitä ilmentämissekvenssejä voidaan modifioida lisäämällä aktivaatio-, säätely- jne. sekvens-20 sejä. Sitä paitsi jos insertoitu geeni ei käsitä ilmentämissekvenssejä, se voidaan insertoida defektiivisen viruksen genomiin alavirtaan tällaisesta sekvenssistä.

Erityisenä suoritusmuotona keksintö koskee def.ek-tiivistä yhdi s telmä-DNA-virus ta, joka käsittää nukleiini-25 happosekvenssin, joka koodittaa lipaasia, joka osallistuu lipoproteiiniaineenvaihduntaän, promoottorin kontrollissa, joka valitaan L,TR~RSV:stä tai CMV-varhaispromoottorista.

Edullisemmin käytetty nukleiinihapposekvenssi kä- ; sittää samoin signaaleja, jotka mahdollistavat lipaasin 30 erityksen tartutettujen solujen toimesta. Tässä tarkoituksessa nukleiinihapposekvenssi käsittää yleensä ylävirtaan koodattavasta sekvenssistä signaalisekvenssin, joka ohjaa syntetisoidun lipaasin tartutetun solun eritvsrei-t exile. Tämä signaali sekvenssi voi olla syntetisoidun li-35 paasin luonnollinen signaalisekvehssi, mutta .kyseeseen voi 16 myös tulla mikä tahansa muu signsalisekvenssi, joka on funktionaalinen tartutetussa solussa, tai keinotekoinen signaalisekvenssi,

Kuten edellä mainittiin, esillä oleva keksintö 5 koskee samoin mitä tahansa edellä kuvatun viruksen käyttöä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu lipoproteiinien häiriintyneeseen aineenvaihduntaan liittyvien patologioiden hoitamiseksi ja/tai estämiseksi .

10 Esillä oleva keksintö koskee samoin farmaseuttista koostumusta, joka käsittää yhden tai useamman edellä kuvatun mukaisen defektiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen. Nämä farmaseuttiset koostumukset voidaan koostaa annettaviksi paikallisesti, oraalisesti, ruoansulatuskanavan ul-15 kopuolisesti, nenänsisäisesti, laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, silmänsisäisesti, ihon kautta jne. Edullisesti keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävää nestemäistä kantajaa ruiskeena annettavaan koostumukseen, 20 etenkin laskimonsisäiseen ruiskeeseen, kuten esimerkiksi potilaan pörttilaskimoon. Kyseessä voivat olla erityisesti steriilit, isotooniset liuokset tai kuivat, etenkin kylmäkuivatut, koostumukset, joista lisäämällä tapauksesta riippuen steriloitua vettä tai fysiologista seerumia on 25 mahdollista rekonstituöida ruiskeena annettavia liuoksia. Suora ruiske potilaan porttilaskimoon on edullinen, sillä sillä on mahdollista kohdentaa tartunta maksassa ja täten konsentroida terapeuttinen vaikutus tähän elimeen.

Käytetyt defektiivisen yhdisteImä-DNA-viruksen an-30 nokset voidaan sovittaa eri parametrien funktiona, ja etenkin virusvektorin, käytetyn antotavan, kyseessä olevan patologian tai edelleen hoidon halutun keston funktiona. Yleensä ottaen keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNÄ-adenovirukset koostetaan ja annetaan annoksina, jotka kä-35 eittävät lÖä - 1DU pmy/ml, ja edullisesti 10" -1010 piny/ml.

17

Ilmaisu pmy ("plakin muodostava yksikkö") vastaa virusliu™ oksien tartutuskykyä* ja se määritetään tartuttamalla: sopiva soluviljelmä, ja mittaamalla yleensä 48 tunnin kuluttua tartutettujen solujen plakkien lukumäärä, virusliuoksen 5 pmy-tiitterin määritystekniikat on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu.

Mitä tulee retröviruksiin, keksinnön mukaiset koostumukset voivat käsittää suoraan tuottajasoluja niiden istuttamista silmällä pitäen, 10 Tässä 'Suhteessa keksinnön toinen kohde on mikä ta hansa nisäkässolu, joka on tartutettu yhdellä tai useammalla edellä kuvatun mukaisella defaktiivisella yhdistelmä:- BNA- viruksella. Tarkemmin ottaen keksintö koskee mitä tahansa näiden virusten tartuttamaa ihmissplupopulaatiotä. 15 Kyseessä voivat olla erityisesti sidekudosmuodöstussolut, varhais1ihass olut, maksasolut, kerät inosyyt i t, en-doteelisolut, hermoston tukisolut jne.

Keksinnön mukaiset solut voivat olla peräisin pri-maariviljelmistä. Primaar i s o1u t voidaan ottaa millä tahan-20 sa alan ammattilaiselle tutulla tekniikalla ja siirtää sitten viljelmään niiden lisääntymisen salliviin olosuhteisiin. Kun kyseessä erityisesti ovat sidekudosmuodos-tussolut, näitä voidaan helposti saada kudosnäytteistä, esimerkiksi tekniikan mukaan, jota kuvaa Ham [Methods 25 Cell. Biol. 21a (1980} 255] , Näitä soluja voidaan käyttää suoraan tartutukseen viruksella tai ne voidaan säilöä esimerkiksi jäädyttämällä autologisten pankkien muodostamiseksi myöhempää käyttöä silmällä pitäen. Keksinnön mukaiset solut voidaan samoin saada sekundaariviljelmistä, 30 jotka saadaan esimerkiksi ennalta muodostetuista pankeista (katso esimerkiksi EP-hakemusjulkaisuissa 228 458, 289 034, 400 047, ja 456 640).

Solut viljelmässä tartutetaan, sitten yhdistelinä-DNA-viruksilla, jotta niille annettaisiin kyky tuottaa 35 biologisesti aktiivista 1ipaasia. Tartutus suoritetaan in 18 vitrö alan ammattilaiselle tutuilla tekniikoilla. Erityisesti käytetyn solutyypin ja viruskopioiden halutun lukumäärän solua kohden mukaan alan ammattilainen voi soveltaa tartutusmonikerran ja mahdollisesti suoritettujen .5 tartutussykiien lukumäärän. Huomattakoon, että nämä vaiheet on suoritettava sopivissa steriileissä olosuhteissa, jos solut on tarkoitettu antoon in vivo. Yhdistelmä-DMA-virusannokset, joita käytetään solujen tartuttamiseksi, voi alan ammattilainen soveltaa toivotun päämäärän mukaan.

10 Edellä antoon in vivo kuvattuja olosuhteita voidaan käyttää tartutukseen in vitro. Tartutukseen retro viruksilla on samoin mahdollista koviljellä soluja, jotka halutaan tartuttaa, solujen kanssa, jotka tuottavat keksinnön mukaisia yhdisteimä-DNA-retröviruksia. Tämä tekee mahdolliseksi 15 retrovirusten puhdistuksen poisjätön.

Toisena kohteena keksintö koskee istutetta, joka käsittää nisäkässoluja, jotka on tartutettu yhdellä tai useammalla edellä kuvatun mukaisella &efaktiivisella yh-distelmä-DNA-viruksella··, tai yhdi s t elmä-DNA-viruks ia 20 tuottavia soluja, ja solunulkoisen matriisin. Edullisesti keksinnön mukaiset istutteet käsittävät 105 - 1019 solua. Edullisenffnin ne käsittävät mainittuja 109 - 108 kpl.

Tarkemmin ottaen keksinnön mukaisissa istutteissa sqlunulkoinen matriisi käsittää geelittyvän. yhdisteen ja 25 mahdollisesti solujen ankkuroitumisen mahdollistavan tuen.

Keksinnön mukaisten istutteiden valmistamiseksi voidaan käyttää eri tyyppisiä geelitysaineita. Geelitysai-neita käytetään solujen sulkemiseksi matriisiin, jolla on geelikoostumus, sekä tarvittaessa solujen ankkuroitumisen 30 tukeen edistämiseksi. Erilaisia solutarttumisaineita voidaan siten käyttää geelitysaineina, kuten etenkin kollageenia, gelatiinia, glykosaminoglykaaneja, fibronektiiniä, | lektiinejä jne. Edullisesti esillä olevan keksinnön j piirissä käytetään kollageenia. Kyseeseen voi tulla ihmis- f 19 nauta- tai hiiriaikuperää oleva kollageeni. Edullisemmin käytetään, tyypin I kollageenia.

Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaiset koostumukset käsittävät edullisesti solujen ankkuroitumisen 5 mahdollistavan tuen. Ilmaisulla ankkuroituminen tarkoitetaan mitä tahansa biologisen ja/tai kemiallisen ja/tai fysikaalisen vuorovaikutuksen muotoa, joka tuo mukanaan solujen tarttumisen ja/tai kiinnittymisen tukeen. Sitä paitsi solut voivat joko peittää käytetyn tuen tai tun-10 keutua tämän tuen sisään, tai sekä että. Keksinnön piirissä käytetään edullisesti kiinteää tukea.* ei-myrkyllistä ja/tai feioyhteensopivaa. Erityisesti voidaan käyttää polytetrafluorietyleeni- (PTFE-) kuituja tai biologista alkuperää olevaa tukea.

15 Keksinnön mukaiset istutteet voidaan istuttaa eri kohtiin organismissa. Erityisesti istutus voidaan suorittaa vatsaonteloon, ihonalaiseen kudokseen (häpykarvoituksen alainen alue, suoliluun kuoppa tai nivus), elimeen, lihakseen, kasvaimeen, keskushermostoon tai edelleen 11-20 makalvon alle. Keksinnön mukaiset istutteet ovat erityisen edullisia siinä mielessä, että ne mahdollistavat lipaasin vapautumisen organismiin kontrolloinnin: tämän määräävät aivan ensiksi tartutusmonikerta ja istutettujen solujen lukumäärä. Sitten vapautumista voidaan kontrolloida joko 25 poistamalla istute, mikä yksikäsitteisesti keskeyttää hoidon, tai käyttämällä säädeltäviä ilmentämissysteemejä, mikä mahdollistaa terapeuttisten geenien ilmentymisen indusoinnin tai tukahduttamisen.

Esillä oleva keksintö tarjoaa täten hyvin 30 tehokkaan keinon lipoproteiinien häiriintyneeseen ! aineenvaihduntaan liittyvien patologioiden: hoitamiseksi tai estämiseksi, erityisesti liikalihavuuden,: triglyseridien liiallisen esiintymisen veressä, tai sydänverisuonisairauks ien, sydäninfarktin, tuskan, 20 äkillisen kuoleman, sydämen: toimintavajauksen ja aivoverisuoni onnettomuuksien alueella.

Lisäksi tämä hoito voi koskea yhtä hyvin ihmistä kuin mitä tahansa eläintä kuten lampaat, nautakarja, ko-5 tieläimet (koirat, kissat jne.), hevoset, kalat jne.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajaaviksi.

Kuvioselityksefc 10 Kuvio 1 vektorin pXL2418 rakenne.

Kuvio 2 vektorin pXL2419 rakenne.

Kuvio ,3 vektorin pXL CMV-LPL rakenne.

Kuvio 4 vektorin pXL RSV-LPL rakenne.

Kuvio 5 vektorin pXL RSV-LPLc rakenne.

15 Molekyylibiologian yleiset tekniikat

Molekyylibiologiassa tavanomaisesti käytetyt menetelmät, kuten plasmidi-DWÄ:n preparatiiviset uutot, plas-midi-DNÄ:n sentrifugointi seesiumgradienttia käyttäen, elektroforeesi agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä, DNA-20 fragmenttien puhdistaminen elektröeluutiölla, proteiinien uutot fenolilla tai fenoli/kloroformi11a, DNA:n saostami-nen suolaympäristössä etanolilla tai isopropanolilla, transförmointi Escherichia coliin jne., ovat alan ammattilaiselle, tuttuja ja niitä kuvataan runsaasti kirjalli-25 suudessa [Maniatis, T., et ai. , "Molecular Cloning: A

Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F.M. et al. {toim.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

30 Tyypin pBR322, pUG plasmidit ja sarjan Ml3 fagifc ovat kaupallista alkuperää {Bethesda Research Laboratories) .

Ligatointeja varten DNA-fragmentit voidaan erottaa koon mukaan, elektroforeesilla agaroosi- tai akryyliamidi-35 geeleissä, uuttaa fenolilla tai fenoli/kloroformi-seoksel- 21 la, saostaa etanolilla ja inkuboida sitten T4-fagin DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan suositusten mukaan.

Esiintyöntyvät 51-päät voidaan täyttää Ek, colin 5 DNÄ-polymeraasi-Iin Kl enow-fragmentilla· (Biolabs) toimittajan spesifikaatioiden mukaan,. Esiintyöntyvät 3' -päät tuhotaan T4-£agin DNA-polymeraasin (Biolabs) läsnä ollessa, jolloin polymeraasia käytetään vaimistajän suositusten mukaan. Es iiri työntyvät S '-päät tuhotaan käsittelemällä 10 rajoitetusti Sl-nUkleaasilla.

Kohdennettu mutageneesi in vitro synteettisillä oligodeoksinukleotideillä voidaan suorittaa menetelmän mukaan, jonka ovat kehittäneet Taylor et ai. fNucl. Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764] käyttäen Amershamin markkinoi-15 maa pakkausta.

DNA-fragmenttien entsymaattinen monistaminen PCR:ks i [Po1ymerase-catalyzed Chain Reaetien, Saiki, R.K., et ai. , Science 230 (1985) 1350 - 1354; MulliaK. B., ja Faloona, F.A, Meth. Enzvm. 155 (1987) 335 - 350] kutsutul-20 la tekniikalla voidaan suorittaa käyttäen DNA Thermal Cycler -laitetta (Perkin Elmer Cetus) valmistajan spesifi-kaa t i öiden mukaan.

Nukleotidisekvenssit voidaan todentaa Sangerin et ai. kehittämällä menetelmällä ΓProc. Natl. Acad. Sei. USA 25 7_4 (1977) 5463 - 5467] käyttäen Amershamin markkinoimaa pakkaus ta.

Esimerkkejä

Esimerkki 1

Vektorin pXL2418 rakentaminen, joka käsittää 30 LPD:ää koodittavan geenin sytomegaloviruksen (CMV) varhaispromoottorin kontrollissa (kuvio 1) Tässä, esimerkissä kuvataan vektorin rakentamista, joka käsittää LPDiää koodittavan cdna-sekvenssin promoottorin kontrollissa, jonka muodostaa sytoraegaloviruksen 35 (CMV) varhaispromoottori, sekä AdS-adenpvirusgenomin ho- 22 molotjisen DNA - yhdi s t ym i s en mahdollistavan alueen. Tämä vektori rakenne11.iin kuten jäljempänä kuvataan.

1,1» vektorin. pXii2375 rakentaminen

Vektori pXL2375 sisältää etenkin alueen Ad5-adeno-5 virusgenomista ja apolipoproteiinia AI CMV-promoottorin kontrollissa koodattavan DNA-sekvenssin. Tarkemmin ottaen käytetty CMy-promoottori ulottuu aina 51-pujoluovuttaja-kohtaan, joka liittyy eniten 3' sijaitseviin 107 ep:hen synteettistä intronia, jota kuvaavat 0'Gorman et ai. 10 ΓScience 251 (1991) 1351]. Tämän vektorin rakentamista on kuvattu yksityiskohtaisesti avoinna olevassa FR-hakemuk-sessa 9 305 125. Luonnollisesti alan ammattilainen voi valmistaa samankaltaisia rakenteita.

1.2. LPL: ää koodit tavan cDNA- sekvenssin rakemtami- 15 nen

Plasmidi pHLPL 26-1, jota kuvaavat Wion et ai .

ΓScience 235 (1987) 1638 - 1641] sisältää LPL cDNA:n epätäydellisen sekvenssin. Täten tämä plasmidi sisältää LPL:n cDNA:n emäkset 272 - 1 623, joita rajaavat kaksi EcoRi-20 kohtaa, kloonattuina plasmiäin pGEMl (Promega) EeoRI-köh-taan.

pHLPL 26-1:n EcoRI-fragmentti, joka sisältää LPL:n osa-cDNA:n, alakloonattiin plasmidin pMTL22 [Chambers et ai. . Gene 68 (1988) 138 - 149] EcöRI-kohtaan suuntaukses-25 sa, joka sijoitti cDNA:n 5'-emäkset pMTL22:n Bglll-kohdan puolelle. Saatu plasmidi nimettiin pXL2402:ksi.

Sitten uutettiin ihmisen rasvakudoksen RNÄ:ta Chromezynskin ja Sacchin tekniikan mukaan ΓAna1. Bioch em. 162 (1987) 156 - 159], Tästä RNA-valmisteesta suoritettiin 30 monistaminen RT-PCR:llä LPL-cDNAin puuttuvan osan eristämiseksi. Tähän tarkoitukseen käytettiin seuraavia alukkeita:

Sq4541: TTA GAT CTA TCG ATÄ GAT GGA GAG CAA AGC

CCC TG (sekvenssi tunnusnumero 1), 23 Tämä aluke mahdollistaa sekä Bglll-kohdan että Clai-kohdan viennin ylävirtaan ATG:stä.

Sg3 810; TAG ATT CCT GTT ÄCC GTC GAG CCA TGG ATG (sekvenssi, tunnusnumero 2), 5 25 mönistussyklillä saatu .26:0 ep: n PCR-fragment ti kloonattiin sitten plasmidiin pCR-ll (Invitrogen) ja sek-ventoitiin todentamisen suorittamiseksi, sitten se vietiin Bgill- ja NeoI-kohtien avulla vektoriin pXL24Q2, jolloin r ekons ti tuoIdaan täydellinen cDNA, jota edeltää Clal-kohta 10 ja seuraa Sali-kohta. Saatu plasmidi nimettiin pXL241,7Vksiy 1.3. Vektorin pXL2418 rakentaminen LPL: n CpNA insertoitiin lopuksi plasmidiin OXL2375 Sali- ja Gal-kohtien väliin sen jälkeen, kun näillä sa~ 15 mailla kahdella entsyymillä oli leikattu Apo Ai -cDNA.:ta. Saatu plasmidi nimettiin pXL2418:ksi (kuvio 1).

Esimerkki 2

Vektorin pXI.2413 rakentaminen, joka käsittää ItPIiiää koodittavan geenin Rous-sarkoomaviruksen LTR-pro-20 moottorin (LTR-RSV) kontrollissa (kuvio 2) Tässä esimerkissä kuvataan vektorin rakentamista, joka käsittää LPL:ää koodittavan cDNA:n promoottorin kontrollissa, jonka muodostaa Rous-sarkoomaviruksen LTR (LTR-RSV), sekä homologisen DNA-yhdistymisen mahdollista-25 van Ad5-adenovirusgenomialueen. Tämä vektori rakennettiin kuten kuvataan jäljempänä.

2.1. Vektorin pXL2244 rakentaminen

Vektori pXL2244 sisältää etenkin Ad5-adenovirusger nomialueen ja DNA-sekvenssin, joka koodittaa apolipoprote-3G iinia AI LTR-RSV-promoottorin kontrollissa.

2.2. LPliiää koodittavan cDNA-sekvenssin, rakentaminen Tässä esimerkissä käytetty LPL:ää koodittava cDNA-sekvenssi on sama kuin esimerkissä 1.2. kuvattu.

35 2.3. Vektorin pXL2419 rakentaminen 24 LPL-cDNA insertoitiin plasmidiin pXL2244 Sali- ja Clal-kohtien väliin sen jälkeen, kun näillä samoilla kahdella entsyymillä oli leikattu Apo Al:n cDNA. Saatu plas-midi nimettiin pXL2419:ksi (kuvio 2).

5 Esimerkki 3

Vektorien pXL RSV-LPL ja pXL CMV-LPL rakentaminen

Vektori pRC-CMV LPL sisältää LPL:n cDNA-fragmentin, joka käsittää emäkset 1 - 2 388 Wienin et ai julkistamasta sekvenssistä kloonattuna ilmentämisvektorin 10 pRC-CMV (Invitrogen) Hindlll- ja Xbal-kohtiin. Hindlll-kohta modifioitiin Clal-kohdaksi insertöimalla oligonuk-leotidi AGC TAO ATC GAT GT {sekvenssi tiinnusnumero 3) . LPL-cDNA ja nautakasvuliormonin polyadenylaatiokohta (joka alunperin sisältyy pRC-CMV:hen) erotetaan lopuksi pRCMV-15 LPL:stä leikkaamalla Sphl:llä, käsittelemällä T4-polyme-raasilla ja leikkaamalla Clal:llä. Nain saatu fragmentti kloonattiin vektoreihin pXL2418 (esimerkki 1} ja pXL2419 (esimerkki 2), joita oli leikattu Clal:llä ja ScoRV:llä, jolloin saatiin vastaavasti vektorit pXL CMV-lpl (kuvio 3) 20 ja pXL RSV-LPL (kuvio 4).

Esimerkki 4

Vektorin pXXL RSV-LPLc rakentaminen Tässä esimerkissä kuvataan vektorin rakentamista, joka on käyttökelpoinen yhdistelraä-DNA-virus ten muodosta-25 miseksi, jotka sisältävät LPL:ää koodittavan lyhyen CDNA:n.

Lyhin cDNA (emäkset 146 - 1 635 wipnin et ai. sekvenssistä) kloonattiin ihmisen rasvakudos-ΕΝΑ;sta. Käy-tettiin alukkeita ATC GGA TCC ÄTC GAT GCA GCT CCT CCA GAG 30 GGA CGC (sekvenssi tunnusnumero 4) ja ATC TCT AGA GTC GAC ATG CCG TTC TTT GTT CTG TAG (sekvenssi tunnusnumero 5} , jotka luovat vastaavasti BamHI-kohdan ja Clal-kohdän 5' LPL:n cDNA:siä sekä Xbal-kohdan ja Sali-kohdan 3' LPL:n cDNA:sta.

25 Tämä PCR-fragmentti kloonattiin PCR II:een ja sen sekvenssin, todennettiin täydellisesti. LPL-cDNA irrotettiin sitten BamHI- ja Xbal-kohtien avulla ja kloonattiin pcDNA3-ilmentämisvektoriin (Invitrogen) ilmentymisen to— 5 dentamiseksi, jolloin muodostui plasmidi pcDNA3-LPLc.

LPL-cHNA:n sisältävä Clal-Sall-fragmentti kloonattiin lopuksi samoihin kohtiin plasmidissa pXL RSV-LPL {esimerkki 3), jolloin muodostui sukkulapläsmidi pXL RSV-LPLc (kuvio 5).

10 Esimerkki 5

Keksinnön raukaisten vektorien funktionaalisuus: LPL-aktiivisuuden osoittaminen

Keksinnön mukaisten vektorien kykyä ilmentää soluviljelmässä LPL:n biologisesti aktiivista muotoa osoitet-15 tiin transfektoimalla tilapäisesti 293- tai Cosl-soluja. Tätä varten soluja (2 x 106 solua maljäa kohden, jonka halkaisija on 10 cm) transfektoitiin (8 pg vektoria) Transfectam-valmisteen läsnä ollessa. LPL:ää koodittavan sekvenssin ilmentyminen ja biologisesti aktiivisen pro-20 teiinih tuotanto osoitetaan joko määränä immuiniientsy-maattisen kokeen avulla (5.1.) tai, lipaasiaktiivisuutena (5.2. ) .

5.1. LPL s n määr ä!1inen mittaus ELISA Immulon I -levy (Dynatech) päällystetään 25 naudan monoklonaalisilla anti-LPL-vasta-aineilia, jotka ristireagoivat ihmisen LPL:n kanssa (20 pg/ml PBS:ssä, 50 μΐ/kuoppa). Kuopissa mahdollisesti jäljellä olevat kohdat salvataan (kyllästetään) sitten inkuboimalla l-%:isen gelatiinin läsnä ollessa 1 tunnin ajan ympäristön lämpöti-3 0 lassa:, Mitattavia näytteitä inkuboi.daan sitten 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Osoittaminen suoritetaan anti-LPL-Seerumilla laimennet tuna pitoisuuteen 10 μg/ml, 100 μΐ/kuoppa, jota seuraa peroksIdaasi11a leimattu vastaseerumi. Perqksidaa-35 siaktiivisuus todetaan substraatin TMB: (Kirkegaard & Perry 26

Laboratories Inc. pakkaus) avulla ja lukemalla absorbanssi 490 nm:ssä.

5.2. LPL-aktiivisuuden mittaaminen

Kokonais1ipaas iaktiivisuus mitataan substraatilla, 5 joka koostuu emulsiosta, jossa on 0,3 mg trioleiinia (Sigma), 75 nCi tri(l-^C)oleoyyliglyserolia (55 mCi/mmol, Amersham), 18 mg BSA: ta (fraktio V, Sigma) , 25 μΐ normaalia ihmisplasmaa ApoCII:n lähteenä 500 μΐ :n lopputilavuu-dessa 0,223 M Tris-puskuria, pH 8,5. Yleensä ottaen aktii-10 visuus mitataan 100 μΐ:sta transfektoitujen solujen super-natanttia tai 50 μΐ:sta hepariinikäsiteltyä plasmaa.

1 tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen reaktio keskeytetään lisäämällä 3,25 ml uuttopuskuria (kloroformi /metanoli/heptaani, 10:9:7, v/v/vj ja 0,75 ml karbonaat-15 ti/boraatti-puskuria, pH 10,5, ja orgaaninen faasi lasketaan vapautuneiden rasvahappojen määrän määrittämiseksi.

Spesifisesti LPL-liitteisen aktiivisuuden määrittämiseksi maksalipaasin aktiivisuusmittaus suoritetaan, kun läsnä on pitoisuus 1 M NaCl (inhiboi LPL:ää), minkä 20 jälkeen se vähennetään kokonäisaktiivisuudesta. On samoin mahdo 11 i sta. inhiboi da 1 ipaas i 1 ipopr o t ei ini akti ivi s uus spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella (Babirak et ai., Atheriosclerosis 9 (1989) 326 - 334].

Plasmidit. pXL RSV-LPL ja pXL CMV-LPL testattiin 25 transfektöimalla Cosl-soluja verraten plasmidiin pRC CMV-LPL. Tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1

Ilmentämisvektori Aktiivisuus supernatantissa 3 0 Päivä 1 pRC-CMV'-LPL 24,5 pXL RSV-LPL 15,1 pXL CMV-LPL 22,9 27

Plasmidi pcDNA-LPLc testattiin trans fektoiraalla 293-soluja verraten ilmentämisvektoriin pcDWA3, joka sisältää saman cDNA:n kuin vektori pRC-CMV-LpL. Tulokset esitetään taulukossa 2.

5 Taulukko 2

Ilment Miaisvektori Aktiivisuus supernatant!ssa Päivä 1 Päivä 2 p3DNA3-L.PL 106,4 MJ/ml 10 6,7 mU/ml pCDNA3-LPLc· 114 mU/ml 109,6 mU/ml 10

Esimerkki 6

Yhdi s t e lmä - DNA- adenovi ruksen Ad-CMV. LPL rakentaminen, joka sisältää lipaasi-LPLsää koodattavan sekvenssin

Esimerkeissä 1 ~ 4 valmistetut plasmidit lineari-15 soidaan ja kotransfektoidaan DMA-yhdistymistä varten de-fektiivisen adenovirusvektorin kanssa apusoluihin (solu-linja 293) , jolloin saadaan en trans adenoviruksen alueiden El (ElA ja EllB) koodittamat funktiot.

Tarkemmin ottaen adenovirus Ad.CMV.LPL saadaan ho-20 mologisella DMA-yhdis tyrni s e11ä in vivo adenoviruksen Ad.RSVSgal [S trat ford-Perri caudet et ai. , J Clin. Invest. 90 (1992) 626) ja plasmidin pXL2418 tai pXL CMV-LPL välillä seuraavan protokollan mukaan: Linearisoitu plasmidi pXL2418 tai pXL CMV-LPL ja adenovirus Ad.RSVSgal, joka on 25 linearisoitu Clal:llä, kotransfektoidaan solulinjaan 293 kalsiumfosfaatin läsnä ollessa homologisen DNA-yhdistyrni-sen mahdollistamiseksi. Mäin muodostetut yhdistelmä-dna-adenovirukset valikoidaan plakkipuhdistuksella. Eristyksen jälkeen yhdi st elmä-DMA-adenovirusta monistetaan solu-30 linjassa 293, mikä johtaa viljelmäsupernatanttiin, joka sisältää ei--puhdistettua defektiivistä yhdistelmä-DNA-adenovirusta, jonka tiitteri on noin 1011' pmy/ml.

Viruspartikkelit puhdistetaan sitten sentrifugoi-malla seesiumgradienttia käyttäen tuttujen tekniikoiden 35 mukaan [katso etenkin Graham et ai. , Virology 52 (1973) 28.

456] . Adenovirus: Ad-CMV.LPL voidaan säilyttää -80 0C:ssa 20-%:isessa glyserolissa.

Saraa protokolla toistetaan plasraidiila pXL2419 tai pXL RSV-LPL tai pXL RSV-LPLc, mikä johtaa yhdistelmä-DNA-5 adenovirnkseen Ad.RSV.LPL tai Ad. RSV. LPLc.

Esimerkki 7 LPL-geenin siirto in vivo yhdisfcelmä-DNA-adenovi -ruksella Tässä esimerkissä kuvataan LPL-geenin siirtoa in 10 vivo keksinnön mukaisen adenovirusvektörin avulla.

Ruiskutetut adenovirukset ovat adenovirukset Ad-iCMV.LPL ja Ad.LTR.LPL·, jotka valmistettiin esimerkissä 5, ja joita käytetään, puhdistetussa, muodossa (3,5 x 10' pmy/ ml) fosfasttipuskuroidussa suolaliuoksessa. Näitä viruksia 15 ruiskutetaan C57Bl:/6 hiiriin laskimonsisäisesti käyttäen liäntälaskimoa, silmäkuopantakaista onteloa tai porttilas-kimoa. LPL:n aktiivisen muodon ilmentyminen osoitetaan esimerkissä 5 kuvatuissa olosuhteissa.

29

Sekvenssin staus (1) yleinen informaatio (i) Hakija: (A) Nimi: Rhone-Poulenc Rorer S.A.

(B) Katu: 20, avenue Raymond Aron (C) Kaupunki: Antony (E) Maa: Ranska (F) Postikoodi: 92165 (ii) Keksinnön otsikko: Yhdistelmä-DMÄ-viruksia;, val mistus ja käyttö geeniterapiassa (iii) Sekvenssien lukumäärä; 5 (ivj Tietokonelukuinen muoto: (A) Tuen tyyppi: nauha (B) Tietokone: IBM PC -yhteensopiva

(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS

(D) Ohjelma: Patentin Release #1.0, 'versio.· #1.25 (OEB) (2) Informaatio sekvenssille tunnusnumero: 1 (i) Sekvenssin karakteristiset piirteet: (A) Pituus: 35 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeiden lukumäärä; yksi (D) Konfiguraatio:; lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA (ix) Karakteristiset piirteet: (D) Muu informaatio: /tuote = Sq4541

(xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi tunnusnumero 1: TTAGATCTAT CGATAGATGG AGAGCÄAAGC CCCTG

(2) Informaatio sekvenssille tunnusnumero; 2 (i) Sekvenssin karakteristiset piirteet: (A) Pituus: 30 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeiden lukumäärä: yksi (D) Konfiguraatio: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA (ix) Karakteristiset piirteet: (D) Muu informaatio: /tuote = Sg3810 30 {xi) Sekvenssin, kuvaus; sekvenssi tunnusnumero 2; TACATTCCTG ttaccgtcca gccätggatc (2) Informaatio sekvenssille tunnusnumero: 3 (i) Sekvenssin karakteristiset piirteet: (A) Pituus: 14 emäsparia (B) Tyyppi; nukleiinihappo (C) Säikeiden lukumäärä: yksi (D) Konfi guraa t i o: 1ineaar ihen

(ii) Molekyylin tyyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi tunnusnumero 3: ÄGCTACATCG ATGT

(2) Informaatio sekvenssille tunnusnumero: 4 (i) Sekvenssin karakteristiset piirteet* {A) Pituus: 36 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeiden lukumäärä: yksi CD) Konfiguraatio: lineaarinen

Cix} Molekyylin tyyppi: CDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi tunnusnumerO 4: ATCGGATCCA TCGATGCAGC TCCTCCÄGAG GGACGC

(2) informaatio sekvenssille tunnusnumero: 5 (i) Sekvenssin karakteristiset piirteet: (A) Pituus: 36 emäsparia (B) Tyyppi: nuklei in ihappo (C) Säikeiden lukumäärä: yksi (D) Konfiguraatio: lineaarinen

(li) Molekyylin tyyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi tunnusnumero 5: ATCTCTAGAG TCGACATGCC GTTCTTTGTT CTGTAG

Claims (25)

1. 31 Patentti-vaatimukset
2. 1. Defektiivinen yhdistelmä-DNA-virus pois lukien phagemidi CDM8, joka defektiivinen yhdi stelmä-DNA-virus kä-5 sittää nukleiinihapposekvenssin, joka koodit taa kokonaisuudessaan tai Osittain lipoproteiinilipaasia (LPL) tai tämän johdannaista.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen virus, tunnettu siitä, että DWA~sekvenssi on cDNA-sekvenssi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen virus, tunnet tu siitä, että DNA-sekvenssi on gDNA-sekvenssi.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen virus, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodi ttaa ihmisen LPL:ää.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen virus, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on sijoitettu sellaisten signaalien kontrolliin, jotka mahdollistavat sen ilmentymisen tartutetuissa soluissa.
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen virus, tunnet- 20 tu siitä, että ilmentämissignaalit valitaan viruspromoot- toreista,
8. 7, Patenttivaatimuksen 6 mukainen virus, tunnet-tu siitä, että ilmentämissignaalit valitaan promoottöreis-ta ElA, MLP, CMV ja LTR-RSV,
9. 8. Defektiivinen yhdistelmä-DNA-virus, joka käsit tää cDNä-sekvenssin, joka koodittaa iipoproteiinilipaasia sellaisen promoottorin kontrollissa, joka Valitaan LTR-RSV-promoottorista ja CMV-varhaispromoottorista.
10. 9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen 3. virus, tunnettu siitä, että se käsittää, sekvenssin, joka mahdollistaa lipoproteiiuilipaasin ohjaamisen tartutetun solun eritysreiteille.
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen virus, tunnettu siitä, että. erityssekvenssi on lipoproteiinilipaa- 35 sin nätiivi sekvenssi. 32
12. 11. Jorikin patenttivaatimuksen 1 - 10 mukainen virus, tunnettu siitä, että se on vailla genominsa alueita, jotka ovat välttämättömiä sen replikaatiolle koh-desolussa.
13. 12. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 11 mukainen vi rus, tunnettu siitä, että kyseessä on adenovirus.
14. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen virus, tunnettu siitä, että kyseessä on ihmisen adenovirustyyppi Ad2 tai Äid5 tai koiraeläinten virustyyppi CAV-2.
15. 14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen, defektiivinen yhdistelmä-DNA-adenovirus, joka käsittää lisäksi apdlipo;-proteiinia koodittavan geenin. 15;. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 11 mukainen virus, tunnettu siitä, että kyseessä on adenoliitteinen 15 virus.
16. 16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen virus, tunnettu siitä, että kyseessä on retrovirus.
17. 17. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 11 mukainen virus, tunnettu siitä, että kyseessä on herpesvirus 20 (HSV).
18. 18. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 17 mukaisen viruksen käyttö sellaisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu lipoproteiiniaineenvaihdun-nan häiriöihin liittyvien patologioiden hoitamiseksi ja/tai 2. estämi seks i.
19. 19. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää yhtä tai useampaa jonkin patenttivaatimuksen 1 - 17 mukaista de-fektiivistä yhdistelmä-DNA-virusta.
20. 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen farmaseuttinen 30 koostumus, tunnettu, siitä, että se on ruiskeena annettavassa muodossa.
21. 21. Patenttivaatimuksen 19 tai 20 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää 104 - 10ls proy/ml, ja edullisesti ΙΟ6 - 1010 pmy/ml, defek- j 35 tiivisiä yhdistelmä-DNA-adenoviruksia. 33
22. 22. Eristetty nisäkässolu, joka on tartutettu yhdellä tai useammalla jonkin patenttivaatimuksen 1 - 17 mukaisella defektiivisellä yhdistelmä-DNA-viruksella.
23. 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen solu, fcun-5 nett u siitä, että kyseessä on ihmissolu.
24. 24. Istute, joka käsittää patenttivaatimuksen 23 mukaisia soluja, tunnettu siitä, että solunulkoinen matriisi käsittää geelitysyhdistettä, joka valitaan edullisesti kollageenista, gelatiinista, glykosaminoglykaaneista, 10 fitoronektiinistä ja lektiineistä,
25. 25. Patenttivaatimuksen 23 mukaisia soluja käsittävä istute tai patenttivaatimuksen 24 mukainen istute, tunnettu siitä, että solunulkoinen matriisi käsittää lisäksi tuen, joka mahdollistaa tartutettujen solujen ank- 15 kuroi humisen,, 2:6. Patenttivaatimuksen 25 mukainen istute, tunnettu siitä, että tuki koostuu edullisesti polytetrafluo- rietyleenikuiduis ta. 34