KR19980703008A - 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 발현 재조합바이러스 및 유전자 치료에 있어서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 (LCAT) 또는 이들의 변이체의 전부 또는 일부를 코딩하는 삽입된 유전자를 함유하는 결손 재조합 아데노바이러스, 상기 바이러스를 함유하는 약학 조성물 및 디스리포프로티네미아 관련 질병을 예방 또는 치료하는데 있어서의 이들의 용도가 개시된다.

Description

레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 발현 재조합 바이러스 및 유전자 치료에 있어서의 이의 용도.
디스리포프로티네미아는 혈액 및 말초액에서의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드와 같은 지질의 수송에 책임 있는 지방 단백질의 대사 이상이다. 이들은 특히 동맥 경화증과 같이, 각각 하이퍼콜레스테롤레미아(hypercholesterolemia) 또는 하이퍼트리글리세리데미아(hypertriglyceridemia)와 관련한 주요 질병을 일으킨다. 동맥 경화증은 조직학적 관점에서 큰 동맥(대동맥, 관상 동맥, 경동맥)의 벽에서의 지질 및 기타 혈액 유도체의 침적물(지질 또는 섬유지질 플라그)에 의하여 정의되는 다인자적 복합성 질병이다. 이러한 플라그들은, 과정의 진척에 따라 더 크거나 적은 정도로 석회화되며, 병변과 관련될 수 있으며, 동맥 내에서 콜레스테롤 에스테르로 필수적으로 구성되는 지방 침적물의 축적에 연결될 수 있다. 이러한 플라그들은 평활근의 비대, 포말 세포의 출현 및 섬유 조직의 축적과 함께 동맥 벽의 두꺼워짐을 동반한다. 죽종 플라그는 벽 위에서 매우 뚜렷히 두드러지며, 이는 대부분의 감염 환자에게서 발생되는 죽종, 혈전증 또는 색전증에 의한 혈관 폐쇄에 대하여 책임 있는 협착 특성을 부여한다. 따라서, 하이퍼콜레스테롤레미아는 경색, 돌연사, 심기능 대상 부전, 뇌혈관 증상발작 등과 같은 매우 심각한 심장 혈관의 질병을 일으킬 수 있다.
따라서, 특정 병리적 상황에서 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시키거나, 죽종 플라그 형성 범위 내의 콜레스테롤이 축적된 세포를 배출하기 위하여 주변 조직 내에서 콜레스테롤의 유출(콜레스테롤의 역 수송)을 자극할 수 있는 유용한 치료를 할 수 있는 것이 중요하다. 콜레스테롤은 혈액 내에서 저밀도 지방 단백질(LDL) 및 고밀도 지방 단백질(HDL)을 포함한 다양한 지방 단백질에 의하여 운반된다. LDL은 간에서 합성되며, 주변 조직에 콜레스테롤을 공급하는 것을 가능케 한다. 대조적으로, HDL은 주변 조직 내의 콜레스테롤을 포착하여, 이것이 저장 및/또는 분해되는 간으로 운반한다.
현재로서는, 콜레스테롤의 생합성(히드록시메틸글루타릴 조효소 환원제의 저해제, 스타틴) 또는 담즙 콜레스테롤의 포착 및 제거(시퀘스트란트 또는 수지), 또는 대안적으로 분자적 관점에서 설명되는 작용의 방식에 의한 지방 분해(피브레이트)에 작용하는 화합물에 의하여, 디스리페미아(dyslipemia) 및 특히 하이퍼콜레스테롤레미아가 치료된다. 결과적으로, 이러한 적용에서 사용되는 의약(시퀘스트란트, 피브레이트 또는 스타틴)의 주요 범주는 죽종 플라그 형성의 예방적 측면만을 위한 것이며, 사실상 죽종의 치료를 위하여 고안된 것은 아니다. 죽종에 대한 현재의 치료는 콜레스테롤 항상성에 작용하는 것이 아니라 외과적 작용(관상 통과, 혈관 성형술)이므로, 관상 증상 발작에 따라 일시적으로 이를 완화하는 것 뿐이다.
유전자 치료에 의한 상기 병리 치료의 첫번째 접근은 출원 WO94/25073에 기술되어 있다. 이러한 접근은 특히 아폴리포프로틴(apolipoprotein)을 암호화하는 유전자의 직접적인 전달에 근거한 것이다. 본 발명은 디스리포프로티네미아와 관련된 병리의 치료에 대한 새로운 치료적 접근을 구성한다. 이는 보다 상세하게는 콜레스테롤의 이화에 수반되는 효소를 암호화하는 유전자의 전달에 근거한 것이다. 특히, 본 발명에 의한 생체 내에서의 LCAT의 전달 및 발현은, 유리하게 순환 HDL 수준에서 뿐아니라 콜레스테롤의 역 수송과 관련된 이들의 효소적 활성에 작용하는 것을 가능케 한다. 따라서, 이러한 접근은 콜레스테롤을 간으로 되돌려 보내는 것에 목적을 둔 이중 자극 효과를 가진다. 본 발명은 또한 간 내에서의 콜레스테롤 대사의 효소를 암호화하는 유전자를 전달 및 발현시키며, 상기 효소를 이들의 활성을 고효율로 발휘하는 순환 시스템으로 분비시키는 것을 가능케 하는 바이러스의 이용에 근거한 것이다. 후에 제시하는 실시예들은 특히 아데노바이러스가, 투여 방식에 따라, 장기간 세포 병리적 효과를 나타내지 않고, 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LACT) 발현 유전자를 효율적으로 전달 및 발현시킬 수 있음을 가리킨다.
본 발명은 생체 내에서 필요로 하는 유전자의 전달 및 발현을 위한 신규한 재조합 바이러스, 이들의 제조 방법 및 유전자 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LCAT) 또는 변이체 전부 또는 일부를 암호화하는 삽입된 유전자를 포함하는 신규한 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 결손 재조합 바이러스 및 심장 혈관 및 신경학적 수준에서의 심각한 결과로 알려져 있는 디스리포프로티네미아(dyslipoproteinaemia)와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1 : 플라스미드 pXL2639의 도식.
도 2 : 플라스미드 pXL2640의 도식.
도 3 : 아데노 AdCMV hLCAT로 Hep3B 세포의 형질감염.세포 Hep3B는, 10, 25, 50, 100, 250 및 500의 감염 중복도로, 아데노 AdCMV hLCAT (개방사각형) 또는 아데노 AdCMV βgal (폐사각형)로 감염된다. LCAT 활성이 72 h에서 상청액내에서 측정된다. 중복하여 측정하며, 각각의 값은 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 4 : 감염 또는 비감염된 쥐의 간으로부터 분리된 RNA의 노던-블랏(Northern-blot) 분석.아데노 AdCMV βgal (2) 및 아데노 AdCMV hLCAT (3)으로 감염된 실험 쥐(1)의 간으로부터 전체 RNA를 유도한다. 포름알데하이드-1.2% 내에서의 전기 영동에 의하여 10 ㎍의 RNA를 분리하고, 나일론 막으로 전달하고, 다양한 인간 LCAT 및 쥐의 apoE 프로브로 하이브리드화한다.
도 5A 및 5B : 전체 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 혈장 농도에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.대조 쥐(개방 사각형) 내의, 또는 인간의 아포리포프로틴 A-I를 발현하는 트랜스제닉 쥐 내에 아데노 AdCMV hLCAT (개방 고리) 1×109pfu 또는 대안적으로 아데노 AdCMV βgal (페사각형)의 주사 후의 전체 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 혈장 농도(평균±표준 편차).
*: 아데노 AdCMV βgal 로 감염된 다양한 쥐, P〈0.0001.
도 6 : 인간apoA-I의 혈장 농도에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.대조 쥐(개방 사각형) 내, 또는 인간의 아포리포프로틴 A-I를 발현하는 트랜스제닉 쥐 내에 아데노 AdCMV hLCAT (개방 고리) 1×109pfu 또는 대안적으로 아데노 AdCMV βgal (페사각형)의 주사 후의 인간 apoA-I의 혈장 농도,
*: 아데노 AdCMV βgal 로 감염된 다양한 쥐, P〈0.0001.
도 7 : 콜레스테롤의 지방 단백질 분포에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.아데노 AdCMV hLCAT (폐사각형) 5×108pfu, 아데노 AdCMV hLCAT(고리) 1×109pfu, 또는 대조물(개방 사각형)의 주사 5 일 후, 쥐로부터 유도된 혈장. 혈장을 수퍼로오즈-6 칼럼 상에서 겔-여과 크로마토그래피에 의하여 분리하고, 각각의 용출된 분획 내에서 콜레스테롤을 측정한다.
도 8 : HDL 입자의 크기에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.
1×109pfu의 아데노 AdCMV hLCAT (선) 및 대조물(점선)의 주사 5 일 후, 쥐로부터 얻어진 혈장. 폴리아크릴아미드 겔(4 내지 20 % 구배) 상에서 혈장을 분리하고, 웨스턴 블랏팅에 의하여 전달한 후, 특이적 항-인간 apoA-I 항체에 의하여 인간 apoA-I가 드러난다. 그리고 나서, 블랏을 밀도계로 스캐닝한다.
도 9 : apoA-I를 함유하는 입자의 유동성에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.1×109pfu의 아데노 AdCMV βgal (1), 5×108pfu의 아데노 AdCMV hLCAT (2) 또는 1×109pfu의 아데노 AdCMV hLCAT (3)의 주사 5 일 후, 쥐로부터 혈장을 얻는다. 아가로오스 겔 전기 영동후 Sudan black으로 지질의 염색에 의하여 HDL을 분리하는데 2 ㎕의 혈장을 이용한다.
도 10 : 콜레스테롤의 유출을 촉진하기 위한 혈청 능력에 대한 인간 LCAT 유전자 전달의 영향.1×109pfu의 아데노 AdCMV hLCAT (개방 원), 1×109pfu의 아데노 AdCMV βgal (완전한 사각형) 또는 대조 쥐(개방 사각)의 주사 5 일 후, 쥐로부터 혈장을 얻는다. 2.5%로 희석된 혈청을 방사성 콜레스테롤로 예비충전된 Fu5Ah 세포로 배양시킨 후, 매질 및 세포내의 방사능을 측정함으로써, 콜레스테롤의 유출을 계산한다.
*: 다양한 대조 쥐, P0.01.**: 다양한 대조 쥐 또는 아데노 AdCMV βgal로 감염된 쥐, P-0.0005
따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LCAT) 또는 이들의 변이체 전부 또는 일부를 암호화하는 적어도 하나의 삽입된 유전자를 함유하는 결손 재조합 바이러스에 있다.
본 발명의 목적은 또한 디스리포프로티네미아와 관련된 병리의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 그러한 결손 재조합 바이러스의 용도이다.
인간 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LCAT)는 65 내지 69 kD의 상대 분자 질량을 가진 416 아미노산의 글리코실화된 단백질이다. LCAT를 암호화하며, 각각 길이가 4200 및 1744 bp인 cDNA 뿐 아니라 유전자 또한 클로닝되고, 서열 분석된다(McLean et al., Proc. Natl. Acad Sci. 83 (1986) 2335 및 McLean et al., Nucleic Acids Res. 14(23) (1986) 9397). LCAT는 콜레스테롤 에스테르와 리소포스파티딜클로린을 형성하는 동시에, 포스파티딜클로린으로부터 콜레스테롤의 히드록시 잔기로 아실기를 전달함으로써 자유 콜레스테롤의 에스테르화를 촉매하는 효소이다. 이것은 인간에 있어서 특히 간에서 합성되며, 혈장으로 방출되어(6 ㎍/㎕), 항동맥경화성 단백질로 언급되는 고밀도 지방 단백질(HDL)과 결합된다. 이러한 입자들은 세포 내에 과량 존재하며, LCAT에 의하여 에스테르화되는 콜레스테롤을 수용할 능력이 있다. 콜레스테롤 에스테르 함유율이 높은 HDL은 간에 의하여 포착된 후, 그 안에서 제거된다. 체내로부터 과량의 콜레스테롤을 제거하도록 하는 상기 기작은 역 콜레스테롤 수송이라 언급되며, 동맥경화증의 예방에 수반된다(Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 및 Johnson et al., BBA 1085 (1991)205). LCAT는 원형질막과 순환하는 지방 단백질 사이에 자유 콜레스테롤의 구배를 창출함으로써, 상기 과정에서 주요한 역할을 한다.
혈장 내에 LCAT 효소 활성의 전부 또는 일부 부재의 생리학적 결과는 Fish Eye Disease(FES) 신드롬 및 전형적인 LCAT 결함 신드롬에서 관찰된 병리적 변화에 의하여 입증된다. FES의 임상적 증상은 신장의 손상 및 빈혈뿐 아니라 각막의 불투명이다. 이러한 두 증상들은 하이포알파리포프로티네미아 및 혈장 트리글리세라이드의 증가와 관련이 있다. 이들은 혈장 내의 LCAT 활성의 생화학적 분석에 의하여 구별될 수 있다. 혈장 콜레스테롤의 에스테르화 비활성은 전형적인 LCAT 결함 환자에게서 탐지할 수 있는 반면, FES 프로필을 가지는 환자에게서는 잔류 LCAT 활성이 관찰된다. 본 발명에 따른 LCAT 유전자의 전달은 심장혈관의 병리의 치료에 대한 세로운 접근을 구성한다. 본 발명에 의하면, 이러한 유전자를 전달하고, 생체 내에서 발현시킬 능력은 콜레스테롤의 유출에 이중 자극 활성을 부여하며, 이는 한편으로는 순환 HDL 수준의 증가를, 다른 한편으로는 상기 HDL의 효소 활성의 증가와 관련된다.
본 발명의 바이러스 내에서, 삽입된 유전자는 보족성 DNA 단편(cDNA), 게놈 DNA(gDNA) 또는 예를 들어 하나 이상의 인트론이 삽입되는 cDNA로 구성되는 하이브리드 작제물일 수 있다. 이는 또한 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 상기한 바와 같이, 이는 LCAT 또는 이들의 변이체 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 변이체라는 용어는 LCAT의 순수 변이체뿐 아니라, LCAT의 생물학적 특성의 적어도 하나를 가지는 임의의 돌연변이체, 단편 또는 펩티드일 수 있다. 상기 단편 및 변이체는 당업자에게 공지된 기술, 특히 유전학적 및/또는 화학적 및/또는 효소적 변형, 또는 대안적으로 변이체의 생물학적 활성에 따라 변이체를 선택하도록 하는 발현 클로닝에 의하여 수득될 수 있다. 상기 유전적 변형은 억제, 결실, 돌연변이 등을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여 삽입된 유전자는 바람직하게는 인간 LCAT의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자이다. 이는 더 바람직하게는 cDNA 또는 gDNA이다.
일반적으로, 삽입된 유전자는 감염된 세포 내에서 그 발현을 허용하는 서열을 또한 포함한다. 상기 서열들은 감염된 세포 내에서 작용할 수 있을 때, 근본적으로 상기 유전자의 발현에 대하여 책임 있는 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원(기타 단백질의 발현, 또는 합성에 대하여 책임 있는)의 서열일 수 있다. 특히, 이들은 특정 방식 및 유도할 수 있는 방식의 유전자 전사를 자극 또는 억제하는, 원핵세포 또는 바이러스 유전자 또는 유도 서열일 수 있다. 예로서, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열 및 특히 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, RSV-LTR 또는 CMV 프로모터 등일 수 있다. 원핵 세포의 프로모터 중에, 산재하는 프로모터(HRRT, 비멘틴, α-액틴, 튜뷸린 등), 중간 사상체의 프로모터(데스민, 신경 사상체, 케라틴, GFAP 등), 치료 유전자의 프로모터(MDR, CFTR, 인자 VIII 형 등), 조직 특이성 프로모터(피루베이트 카이나아제, 빌린, 지방산 결합 장 내 단백질의 프로모터, 평활근 세포의 α액틴의 프로모터, 간 특이성 프로모터;Apo AI, ApoAII, 인간 알부민 등) 또는 대안적으로 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬에 대한 수용체, 레티논 산에 대한 수용체 등)가 언급될 수 있다. 더욱이, 이러한 발현 서열은 활성 및 조절 서열 등의 첨가에 의하여 변형될 수 있다. 게다가, 삽입된 유전자가 발현 서열을 함유하지 않을 때, 이는 그러한 서열의 결손 바이러스 게놈 내로 삽입되 수 있다.
더욱이, 삽입된 유전자는 일반적으로 코딩 서열의 주류, 표적 세포의 분비 경로내에서 합성된 폴리펩티드를 가리키는 시그널 서열을 포함한다. 상기 시그널 서열은 LCAT의 순수 시그널 서열일 수 있으나, 이는 또한 기타 작용성 시그널 서열 또는 인공적 시그널 서열일 수 있다.
본 발명에 의한 바이러스는 불완전, 즉 표적 세포내에서 자발적으로 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에서의 결손 바이러스 게놈은 따라서 적어도 감염 세포내에서 상기 바이러스를 복제하는데 필요한 서열이 부족하다. 이러한 영역은 제거되거나(완전히 또는 부분적으로) 비작용성으로 되거나, 또는 기타 서열, 특히 삽입된 유전자에 의하여 치환될 수 있다. 바람직하게는, 그럼에도 불구하고 결손 바이러스는 각각의 게놈내에서 바이러스 입자를 캡시드화하는데 필요한 서열을 보존한다.
본 발명에 의한 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV)는 레트로바이러스로부터 유도될 수 있다. 바림직한 구체예에 의하면, 이는 아데노바이러스이다.
그 구조 및 특성이 약간 변화하는 다양한 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 상기 혈청형 중에서, 유형 2 또는 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(출원 WO94/26914 참조)의 사용이 본 발명의 범위 내에서 바람직하다. 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에, 개, 송아지, 쥐(예: MAV1, Beard etal., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 양서류 또는 대안적으로 원숭이(예: SAV) 기원이 언급될 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개의 아데노바이러스, 또는 더욱 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스 [예를 들면 Manhattan strain 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]이다. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 범위 내에서 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 캡시드화를 허용하는 서열인 ITR 및 관련 핵산을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈 내에, 적어도 E1 영역이 비작용성이다. 고려되는 바이러스 유전자는 당업자에게 공지된 기술, 특히 전체 억제, 치환 또는 부분 결실, 또는 고려되는 염기내에하나 이상의 염기의 첨가에 의하여 비작용성으로될 수 있다. 그러한 변형은 시험관내에서(분리된 DNA에서) 또는 현장에서, 예를 들면 유전 공학 기술 또는 돌연변이 유발제 처리에 의하여 행하여질 수 있다. 기타 영역, 특히 E3 (WO95/02697), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02597) 및 L5 (WO95/02697) 영역이 또한 변형될 수 있다. 바람직한 구체예에 의하면, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역내에 결실을 포함한다. 다른 바림직한 구체예에 의하면, E4 영역 및 LCAT-암호화 서열이 삽입되는 수준으로(FR94 13355 참조) E1 영역내에 결실을 수반한다.
본 발명에 의한 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 기술에 의하여 제조될 수 있다(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; gRAHAM, embo j.3 (1984) 2917). 특히, 이들은 아데노바이러스 및 관련 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 사이의 상동 재조합에 의하여 제조될 수 있다. 상동 재조합은 상기 아데노바이러스 및 플라스미드의 적절한 세포주로의 동시 형질 감염 후에 일어난다. 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소들에 의하여 형질변형될 수 있으며, (ii) 결손 아데노바이러스 게놈 부분을 보완할 수 있는 서열을, 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위하여 통합된 형태로 함유한다. 세포주의 예로서, 특히 Ad5 아데노바이러스 (12%)의 좌측 부를 게놈 내에 통합하여 함유하는 인간 태아의 신장 세포주 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1997) 59) 또는 출원 No. WO94/26914 및 WO95/02697에 기술된 바와 같은 E1 및 E4 작용을 보완할 수 있는 세포주가 언급될 수 있다.
다음, 증식된 아데노바이러스가 실시예에서 기술하는 바와 같은 전통적인 분자 생물학적 기술에 의하여 재생 및 정제된다.
아데노-수반 바이러스(AAV)는, 안정하고 부위 특이적 방식으로, 감염되는 세포의 게놈 내로 통합되는 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 어떠한 영향을 유도하지 않고 세포의 광 스펙트럼을 감염시킬 수 있다. 더욱이, 이들은 인간에게 있어서의 병리와 연관되지 않는 것으로 보인다. AAV의 게놈은 클로닝되고, 서열 분석되고, 특징지어 진다. 이는 약 4700 염기를 포함하며, 바이러스에 대한 복제 개시점으로 작용하는 약 145 염기의 역반복 서열을 각각의 말단에 함유한다. 게놈의 잔기는 인캡시드화 서열을 운반하는 두 개의 필수적 영역으로 분리된다: 바이러스 증식 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부.
시험관 및 생체내에서 유전자 전달을 위하여 AAV로부터 유도된 벡터의 사용은 참고 문헌에 기술되어 있다(특히 WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조). 상기 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되거나 관련 유전자에 의하여 대체된 AAV로부터 유도된 다양한 작제물 및 시험관내에서(배양 세포에서) 또는 생체내에서(유기체에 직접) 상기 관련 유전자의 전달에 있어서의 이들의 용도에 관하여 기술한다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 두 개의 AAV 역 반복 영역(ITR)에 접하고 있는 관련 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 인간 헬퍼 바이러스에 의하여 감염된 세포주로의 동시 형질 감염에 의하여 제조될 수 있다. 그리고 나서, 제조된 재조합 AAV는 전통적인 기술에 의하여 정제된다. 따라서 본발명은 또한 그 게놈이 AAV ITR에 접하는 LCAT-암호화 서열을 포함하는 AAV로부터 유도된 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AAV의 두 개의 ITR에 접하는 LCAT-암호화 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 상기 플라스미드는, 임의적으로 리포오좀 벡터(pseudo-virus) 내로 통합된 LCAT 서열을 전달하는데에 그 자체로서 사용될 수 있다.
레트로바이러스에 관하여, 재조합 벡터의 작제는 참고 문헌에 광범위하게 기술되어 있다: 특히 EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등 참조). 특히, 레트로바이러스는 분리된 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 필수적으로 두 개의 ITR, 캡시드화 서열 및 세 개의 코딩 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터내에서, gag, pol 및 env 유전자가 일반적으로 전부 또는 부분적으로 결실되어 있고, 관련 이형 핵산 서열에 의하여 대체되어 있다. 상기 벡터들은 특히 MoMuLV (쥐 Moloney 백혈병 바이러스, MoMLV로 도 언급됨), MSV (쥐 Moloney 육종 바이러스), HaSV (Harvey 육종 바이러스), SNV (비장 사멸 바이러스), RSV (Rous 육종 바이러스) 또는 대안적으로 Friend's 바이러스와 같은 다양한 유형의 레트로바이러스로부터 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 LCAT-암호화 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위하여, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 상기 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 일반적으로 작제된 후, 플라스미드에 결여된 레트로바이러스의 작용을 트랜스로 공급할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질 감염시키는데 사용된다. 일반적으로, 캡시드화 세포주는 따라서 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 상기 캡시드화 세포주는 종래 기술로서, 특히 PA317 세포주(US 4,816,719), PsiCRIP 세포주(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주 (wo 89/07150)에 기술되어 있다. 더욱이, 재조합 레트로바이러스는, 부분적인 gag 유전자(Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639)를 함유하는 연장된 캡시드화 서열뿐 아니라, 전사 활성을 억제하기 위하여, LTR 내에 변형을 함유할 수 있다. 그리고 나서, 제조된 재조합 레트로바이러스는 전통적인 기술에 의하여 정제된다.
본 발명은 또한 상기한 하나 이상의 결손 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 그러한 조성물은 국소적, 경구적, 비경구적, 비강내, 혈관내, 근육내, 피하의 또는 눈 내의 투여 등을 위하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 주사할 수 있는 형태로 약학적으로 수용할 수 있는 매개체를 함유한다. 이들은 특히 식염 용액(제 1 나트륨 또는 제 2 나트륨 인산염, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 상기 염들의 혼합물), 살균, 등장 또는 건조, 특히 경우에 따라 살균수 또는 생리 식염수를 가하면 주사할 수 있는 용액을 구성하는 냉동 건조 조성물일 수 있다.
디스리포프로티네미아와 관련된 병리의 치료에 있어서의 이들의 사용에 있어서, 본 발명에 의한 결손 재조합 아데노바이러스가 다양한 방식, 특히 혈관내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 문맥의 수준에서 주사된다. 레트로바이러스에 관해서는, 임의적으로 신생 기관의 형태로 생체내에서의 재이식을 위하여(WO 94/24298), 생체외에서 감염된 세포를 사용하는 것이 유리하다.
주사에 사용되는 바이러스 투여량은 다양한 변수, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리 또는 대안적으로 요구되는 치료 기간에 따라 변화할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104내지 1014pfu/ml의 투여량으로 제조 및 투여될 수 있다. AAV 및 아데노바이러스에 대해서는, 106내지 1010pfu/ml의 투여량이 사용될 수 있다. pfu(플라그 형성 단위)라는 용어는 비리온 현탁액의 전염성에 대응되는 것이며, 적절한 세포 배양액의 감염 및 일반적으로 48 시간 후 감염된 세포의 플라그 수의 측정에 의하여 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역치를 측정하기 위한 기술은 참고 문헌에 상세히 기술되어 있다.
더욱이, 본 발명의 약학 조성물은 또한 아포리포프로틴을 암호화하는 삽입된 유전자를 함유하는 하나 이상의 결손 재조합 바이러스를 함유할 수 있다. 상기 두 가지 유형의 유전자의 조합은 HDL 활성 및 따라서 콜레스테롤의 역 수송에 상승 효과를 부여한다. 아포리포프로틴을 암호화하는 삽입된 유전자를 함유하는 아데노바이러스 작제물은 출원 WO 94/25073에 기술되어 있다. 바람직한 조합은 본 발명에 따른 아데노바이러스 및 아포리포프로틴 AI 또는 아포리포프로틴 AIV를 암호화하는 유전자를 함유하는 아데노바이러스를 포함한다.
본 발명은 디스리포프로티네미아와 관련된 병리, 특히 심근 경색, 앙기나(angina), 돌연사, 심장 대상부전, 대뇌혈관 증상발작, 동맥경화증 또는 재협착증과 같은 심장 혈관 상태의 분야에 있어서의 병리의 예방 또는 치료를 위한 매우 효율적이며 신규한 방법을 제공한다. 보다 일반적으로, 이러한 접근은 LCAT의 유전적 또는 대사적 결함이 교정될 수 있는 각각의 경우에 대한 치료 방법에 있어서 매우 전망적인 수단을 제공한다.
더욱이, 이러한 치료는 인간 및 양, 집에서 기르는 동물(소, 개, 고양이 등), 말, 어류 등과 같은 임의의 동물에 모두 관련될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 기술될 것이며, 이는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
일반적인 분자 생물학적 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 염화세슘 구배하에 플라스미드 DNA의 여과, 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기 용출에 의한 DNA 단편의 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, 식염 매질 내에서 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 이. 콜라이 내에서 형질 변형 등과 같은 분자 생물학에서 전통적으로 사용되는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 참고 문헌에 상세히 기술되어 있다 [Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboartory, Cold Sp;ring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), Current Protocol in Molecular Biology, John WileySons, NewYork, 1987].
pBR322 및 pUC 유형 플라스미드 및 M13 연속 파지들은 상업적 기원이다(Bethesda Research Laboratories).
연결을 위하여, DNA 단편을 그 크기에 따라 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기 영동에 의하여 분리하고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하고, 에탄으로 침전시킨 후, 공급자의 권유에 따라 파지 T4 DNA 리가아제 (Biolabs)의 존재하에 배양시킬 수 있다.
공급자의 설명에 따라, 이.콜라이 DNA 중합 효소 I (Biolabs)의 Klenow 단편으로 돌출 5'말단을 충진시킬 수 있다. 제조업자의 권유에 따라 파지 T4 DNA 중합 효소 (Biolabs)의 존재하에 돌출 3' 말단을 분해할 수 있다. S1 뉴클레아제로 처리함으로써 돌출 5' 말단을 분해한다.
Taylor et al에 의하여 개발된 방법 [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의하여, Amersham에 의하여 분배된 도구를 이용하여 합성 올리고디옥시뉴클레오티드에 의한 시험관 내에서의 부위-특이성 돌연변이 유발을 수행할 수 있다.
제조업자의 권유에 따라 소위 PCR 기술 [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. 및 Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]에 의하여, DNA 열 사이클러 (Perkin Elmer Cetus)를 이용하여 DNA 단편의 효소 증식을 수행할 수 있다.
Sanger et al에 의하여 개발된 방법 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]에 의하여, Amersham에 의하여 분배된 도구를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다.
실시예 1: 인간 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(hLCAT) 유전자를 함유하는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제 :
상기한 바와 같이, 적절한 세포주로의 동시 형질 감염 후, 삽입하고자 하는 유전자를 운반하는 플라스미드와 아데노바이러스 간의 상동 재조합에 의하여 결손 재조합 아데노바이러스를 제조한다.
A. 인간 LCAT 유전자를 운반하는 플라스미드의 제조:
1. 플라스미드pXL2616의 작제
플라스미드 pXL2616은 인간 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제를 암호화하는 cDNA를 함유한다.
이는 하기의 방식으로 작제된다:
RT-PCR 기술에 의하여, HepG2 세포의 전체 RNA로부터 LCAT cDNA에 상응하는 DNA 단편을 분리한다 (제 1 본쇄 cDNA 합성 도구, Pharmacia). 헥사뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 폴리아데닐화된 RNA의 역 수송에 의하여, cDNA를 생산한다. 그리고 나서, 상기 cDNA 상에서, LCAT 서열의 5'에서 ClaI 영역 및 3'에서 SalI 영역의 첨가를 허용하는 올리고뉴클레오티드 Sq5209 : CCC TCG AGG CCA TCG ATG AGG CCT GAC TTT TTC AAT AAA (서열 번호 1) 및 Sq5287 : GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (서열 번호 2)를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. 얻어진 1750 bp 단편을 플라스미드 pCR-II로 클로닝(TA 쿨로닝 도구, Invitrogen)하고, 그 서열을 확인한다. 생성되는 플라스미드를 pXL2616이라 명명한다.
2. 플라스미드 pXL2639 (도.1) 및 pXL2640 (도.2)의 작제
플라스미드 pXL2639 및 플라스미드 pXL2640은, 각각 초기 CMV 프로모터 및 RSV 바이러스 LTR 프로모터의 통제하에, 인간 LCAT cDNA를 함유한다.
이들은 하기의 방식으로 작제된다:
-출원 WO 94/25073에 기술된 바와 같이, ClaI 및 SalI으로 플라스미드 pXL2375 (CMV 프로모터) 및 pXL2376 (RSV-LTR 프로모터)을 분해하여, apoA-I cDNA를 절단한 후,
-인간 LCAT cDNA를 함유하는 플라스미드 pXL2616의 CalI-SalI 단편을 미리 절단된 상기 플라스미드내로 삽입.
B. 시험관 내에서 인간 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제의 발현
작제된 벡터(pXL2639 및 pXL2640)로 세포 293을 단기 형질 감염시킨 후,효소의 작용성 및 발현을 시험한다. Wilger et al., Cell, 11 (1977) 233의 방법에 따라, 인산 칼슘-DNA 복합체에 의하여 DNA를 도입한다.
Chen 및 Albers, JLR, 23 (1982) 680 방법에 따라, 형질 감염 60 시간 후, 세포 상청액 상에서 LCAT 활성을 측정한다. 측정은 외생 기질로서 프로테오리포오좀의 사용에 근거하며, 이는 37℃하에 0.8:12.5:250의 몰 비율로 apoA-I, 14C 콜레스테롤, 포스파티딜클로린을 30 분 동안 배양함으로써 제조된다. 37℃하에서 2 시간 동안 4 ㎕의 혈장 또는 배양액 상청액으로 기질을 배양시킨 후, 14C-콜레스테롤의 14C-콜레스테롤에스테르로의 전환을 측정함으로써, 활성을 측정한다. 석유 에테르-디에틸 에테르-아세트산의 76:20:1 혼합물을 이용하여 실리카 판상에서 박층 크로마토그래피에 의하여, 형성되는 에스테르를 분리하고, 액체 신틸레이션 분광계에 의하여 방사능을 측정한다.
얻어지는 결과는 형질 감염된 세포 293에 의하여 분비된 인간 LCAT가 작용성임을 보여준다.
C. 재조합 아데노바이러스의 제조
A에서 제조된 플라스미드를 선형화하고, 재조합을 위하여, 결손 아데노바이러스 벡터를 이용하여, 아데노바이러스 E1 영역(E1A 및 E1B)에 의하여 암호화되는 작용성을 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포(세포주 293)로 동시 형질 감염시킨다.
하기의 방법에 의한, 생체 내에서 아데노바이러스 Ad.rsvβgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) 및 플라스미드 pXL2639 간의 상동 재조합에 의하여, 아데노바이러스 Ad.CMVLCAT를 수득한다 : 상동 재조합을 허용하기 위하여, 인산 칼슘의 존재하에, 효소 XmnI에 의하여 선형화된 플라스미드 pXL2639 및 ClaI에 의하여 선형화된 아데노바이러스 Ad.RSVβgal을 세포주 293으로 동시 형질 감염시킨다. 생성되는 재조합 아데노바이러스를 플라그 정제에 의하여 선별한다. 분리 후, 약 1010pfu/ml의 역치를 가지는 비정제된 결손 재조합 아데노바이러스를 함유하는 배양 상청액을 유도하는 세포주 293 내에서, 재조합 아데노바이러스를 증식시킨다.
공지 기술에 따라 염화 세슘 구배 여과에 의하여 바이러스 입자를 정제한다(특히 Graham et al., Virology 52 (1973) 456 참조). 아데노바이러스 Ad. CMVLCAT 를 -80℃에서 20% 글리세롤 내에 저장한다.
플라스미드 pXL2640으로 동일한 과정을 반복하여, 재조합 아데노바이러스 Ad. RSVLCAT를 유도한다.
실시예 2 : 결손 재조합 아데노바이러스에 의하여 전달된 인간 LCAT 유전자의 시험관 내에서의 발현
10, 25, 50, 100, 250 및 500의 MOI에서 재조합 아데노바이러스 AdCMV-hLCAT로 Hep3B 세포(인간 헤파토사이트 세포주)의 감염 후, 효소의 작용성 및 발현을 시험한다. 재조합 아데노바이러스 AdCMVβgal을 조절 인자로서 사용한다. Chen 및 Albers, JLR, 23 (1982) 680의 방법에 따라, 감염 후, 세포 상청액 상에서, LCAT 활성(100 ㎕의 배양 매질내에서 1 시간 동안 생산된 콜레스테롤 에스테르의 전체량)을 측정한다. 결과(도. 3)는 배양액 매질내로 분비되는 인간 LCAT가 작용성이며, 효소 발현의 수준이 세포 내의 바이러스 농도에 의존함을 보여준다.
실시예 3 : 결손 재조합 아데노바이러스에 의하여 전달된 인간 LCAT 유전자의 생체내에서의 발현
재조합 아데노바이러스 AdCMV-hLCAT (5×108또는 1×109pfu), AdCMV-βgal (1×109pfu)의 테일 또는 비바이러스 용액의 혈관내로 주사함으로써, 인간 apoA-1에 대하여 트랜스제닉한 C57B1/6을 감염시킨다. 주사 5 일 후, AdCMV-hLCAT로 감염된 (3266±292 내지 9068±812 nmol/ml/h) 쥐의 혈장 내에서, 고수준의 LCAT 활성이 탐지되는 반면, AdCMV-βGal로 감염되거나 감염되지 않은 쥐에서 관찰된 수준은 쥐 혈장의 기저 LCAT 활성에 해당한다.
AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐의 간으로부터 유도된 RNA로 수행된 노던 블랏팅은 인간 LCAT에 대한 완전한 cDNA에 해당하는 프로브로 하이브리드화하는 메신저 RNA의 발현을 드러내도록 하는 반면, 대조 쥐의 간으로부터 유도된 RNA로 수행된 노던 블랏팅은 하이브리드화를 나타내지 않는다.
실시예 4 : 지방 단백질 및 아포리포프로틴의 혈장 수준에 대한 인간 LCAT의 발현의 영향
인간 LCAT의 단기 발현은 순환 지질 및 인간 아포리포프로틴 A-I(hapoA-I)의 농도에 상당한 변화를 야기시킨다. 주사 5 일 후에 최고의 변형이 관찰되며, 이를 표 1에 요약한다.
1×109pfu의 AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐는, 대조 쥐에서 얻어지는 수준보다 각각 7 및 6 배 더 큰 HDL-콜레스테롤 및 전체 콜레스테롤(TC)의 혈장 수준을 가진다 (도 5a 및 도 5b). 이러한 변형은 에스테르화된 콜레스테롤(EC) 및 자유 콜레스테롤(FC) 모두의 대조 쥐에서 얻어진 수준과 비교하여 각각 8 내지 2.5 배 증가와 관련이 있다. 이러한 혈장 EC의 증가는 HDL 분획 내에서의 EC/TC 비의 증가를 유도한다. 1×109pfu의 AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐는 대조 쥐와 비교하여 인간 apoA-I의 농도에 있어 2.5 배 증가에 공헌한다 (도. 6).
대조 및 아데노바이러스-감염 인간 apoA-I 트랜스제닉 쥐의 혈장내의 지질 및 아포리포프로틴 지표
대조 쥐(n=5) AdCMV βgal로 감염된 쥐(n=5)1×109pfu/쥐 AdCMV-LCAT로 감염된 쥐(n=2)5×108pfu/쥐 AdCMV-LCAT로 감염된 쥐(n=5)1×109pfu/쥐
전체콜레스테롤(TC) 132 ± 14 139 ± 18 462 ± 116c 827 ± 49a
콜레스테롤의에스테르(EC) 68 ± 8 71 ± 10 319 ± 22b 587 ± 41a
자유 콜레스테롤(FC) 63 ± 11 68 ± 9 143 ± 37c 239 ± 62b
EC/TC 0.52 ± 0.06 0.51 ± 0.07 0.69 ± 0.04c 0.71 ± 0.04c
(VLDL+LDL)-TC 15 ± 3 20 ± 6 33 ± 12d 30 ± 3c,e
트리-글리세라이드 49 ± 3 50 ± 7 90 ± 5c 140 ± 7b
인지질 313 ± 40 309 ± 20 773 ± 53c 954 ± 65b
h apoA-I 247 ± 14 246 ± 30 542 ± 32c 616 ± 17a
LCAT 활성(nmol/ml/h) 45 ± 2 45 ± 3 3266 ± 292a 9068 ± 812a
내생 에스테르화 비율(nmol/ml/h) 149 ± 11 161 ± 17 ND 340 ± 5c
HDL-TC 117 ± 12 119 ± 14 429 ± 127c 797 ± 48a
HDL-EC 66 ± 8 67 ± 10 317 ± 11b 570 ± 20a
HDL-FC 51 ±11 52 ± 12 112 ± 26c 227 ± 53b
HDL의EC/TC 0.56 ± 0.05 0.57 ± 0.05 0.74 ± 0.03c 0.72 ±0.03c
모든 지질 및 지방 단백질 값은 mg/dl로 표현된다.ap0.0001,bp0.0004,cp0.01,dp=NS. 대조 쥐와 βgal 감염 아데노-AdCMV로 감염된 쥐와 상이함.ep=NS 대조 쥐와 βgal 감염 아데노-AdCMV로 감염된 쥐와 상이함.
실시예 5 : 단백질내에서의 콜레스테롤의 배분, HDL의 크기 및 전기 영동 유동성에 대한 인간 LCAT 발현의 영향
분석 겔 여과 크로마토그래피에 의하여, 쥐로부터 유도된 혈장을 이용하여, 지방 단백질 분획 내의 콜레스테롤 분배를 수행한다 (도. 7). 용출된 분획 내의 TC 및 인간 apoA-I 농도를 측정한다. 상기 분석은, 대조 쥐와 비교하여 1×109pfu의 AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐에 있어서 HDL의 크기의 증가뿐 아니라 실질적인 HDL 내의 콜레스테롤 축적을 드러낸다. 인간 apoA-I는 HDL의 입자 크기와 관련있는 것으로 나타난다.
인간 apoA-I에 대하여 트랜스제닉한 쥐의 apoA-I을 함유하는 지방 단백질의 크기 분포는, 9.4 nm 및 11nm의 피크 크기를 가지는 이중 방식이다. 대조 쥐에서는 이와 동일한 분포가 보존되는 반면, AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐에서는 변경된다. 1×109pfu의 AdCMV-hLCAT를 받은 쥐에서는, 최저 피크가 사라지고, 13.3 및 14.2 nm의 두 개의 큰 피크가 나타난다 (도. 8).
비변성 아가로오스 겔 상에서, 전기 영동에 의하여, 혈장 지방 단백질을 분리한 다음, 지질을 탐지한다. 도.9에 도시하는 바와 같이, AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐의 혈장 내에서, 예비-알파 유동성을 가지는 HDL이 나타남으로써, HDL의 크기뿐 아니라 HDL 표면에서의 전하 또한 영향을 받음을 드러낸다.
간단히 말하면, 인간 apoA-I에 대하여 트랜스제닉한 쥐에서의 인간 LCAT의 고도의 단기 발현이, HDL 크기 및 전하 뿐 아니라 HDL-콜레스테롤 및 인간 apoA-I 농도의 증가에 의하여, 동맥 경화증을 덜 유발시키는 지방 단백질 프로필의 형성을 유도한다.
실시예 6 : 세포 콜레스테롤의 유출에 대한 인간 LCAT 발현의 영향
감염 또는 비감염 쥐로부터 유도된 혈장 풀로 쥐 헤파토마 세포 Fu5ah를 배양시킨 후, 세포 콜레스테로롤의 유출을 측정한다. 도 10은, AdCMV βgal로 감염된 쥐의 혈장과 비교하여, AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐의 혈장에 있어서, 유출이 65% 증가되었음을 보여준다. 이러한 증가는 AdCMV-hLCAT로 감염된 쥐에 있어서의 고농도의 인간 apoA-I 및 HDL-콜레스테롤과 관련있음이 발견되었다. 상기 결과들은 인간 LCAT의 고도 발현에 의한 콜레스테롤의 역 수송에 있어서의 고효율을 뒷받침한다.
서열 목록
(1) 종합 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 롤 프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리명 : 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시명 : 앙토니
(E) 국명 : 프랑스
(F) 우편번호 : 92165
(G) 전화번호 : (1) 40, 91, 70, 36
(H) 팩스번호 : (1) 40, 91, 72, 91
(ii) 발명의 명칭 : 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 발현 재조합 바이러스 및 유전자 치료에 있어서의 이들의 용도
(iii) 서열 번호 : 2
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체형 : 테이프
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환 기종
(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn 발매 #1.0., 버젼 #1.30 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 유형 : 뉴클레오티드
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 기술 : 서열 번호 1 :
CCCTCGAGGC CATCGATGAG GCCTGACTTT TTCAATAAA
(2) 서열 번호 2에 대한 정보
(i) 서열 특징
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 유형 : 뉴클레오티드
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 기술 : 서열 번호 2 :
GCGTCGACAG CTCAGTCCCA GGCCTCAGAC GAG

Claims (20)

  1. 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 (LCAT) 또는 변이체 전부 또는 일부를 암호화하는 삽입된 유전자를 적어도 하나 함유하는 결손 재조합 바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 감염된 세포 내에서의 복제에 요구되는 게놈 영역이 결여된 것을 특징으로 하는 바이러스.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아데노바이러스, 바람직하게는 Ad5 또는 Ad2 유형임을 특징으로 하는 바이러스.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 동물, 바람직하게는 개 기원의 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 유전자가 인간 LCAT 또는 변이체 전부 또는 일부를 암호화하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  6. 제 5 항에 있어서, 삽입된 유전자가 인간 LCAT를 암호화하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 유전자가 cDNA임을 특징으로 하는 바이러스.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 유전자가 gDNA임을 특징으로 하는 바이러스.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 유전자가 감염된 세포내에서의 발현을 허용하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 유전자가 표적 세포의 분비 경로에서 합성 폴리펩티드를 유도하는 시그널 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  11. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, E1 영역의 전부 또는 일부 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  12. 제 11 항에 있어서, E4 영역의 전부 또는 일부 결실을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아데노-수반 바이러스(AAV)임을 특징으로 하는 바이러스.
  14. 제 13 항에 있어서, 게놈이 2 ITR에 접하는 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제(LCAT) 또는 변이체의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 레트로바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  16. 디스리포프로티네미아와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스의 용도.
  17. 제 16 항에 있어서, 동맥경화증 및/또는 재협착증의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 있어서의 용도.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 결손 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약학 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 주사할 수 있는 형태로 제공되고, 104내지 1014pfu/ml의 아데노바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 아포리포프로틴을 암호화하는 하나 이상의 결손 재조합 아데노바이러스를 또한 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
KR1019970706416A 1995-03-14 1996-03-12 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 발현 재조합바이러스 및 유전자 치료에 있어서의 이의 용도 KR19980703008A (ko)

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