JP3457332B2 - 平滑筋細胞発現のためのプロモーター - Google Patents

平滑筋細胞発現のためのプロモーター

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 政府は、公衆衛生総局からの助成番号R01 HL48257、U
01 AI34566、およびR01 HL51145に従って、本発明にお
ける権利を所有する。
本発明は、一般的には遺伝子発現、詳細には組織特異
的発現、そしてより詳細には平滑筋細胞特異的発現の分
野に関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、
バルーン血管形成に続く再狭窄、および喘息における気
道傷害物のような細胞増殖疾患に関する。
平滑筋細胞（SMC）の表現型柔軟性は、この筋細胞系
統が、動脈壁、子宮、呼吸器官、泌尿器官、および消化
器官を含む複数の組織における多様性機能に役立つこと
を可能にする。収縮性タンパク質イソ型を発現する前に
融合および一定期間に分化する速および緩（fast and s
low）骨格筋細胞に比べて、SMCは、筋原線維イソ型、細
胞表面レセプター、およびSMC制限酵素を含む、１対の
系統制限タンパク質を同時に増殖および発現し得る。さ
らに、特異的な生理学的および病態生理学的刺激に応答
して、SMCは、それらの表現型を、１対の収縮タンパク
質遺伝子をダウンレギュレートすることによって調節
し、そしてそうすることで、いわゆる「収縮表現型」か
ら分化しない「分泌表現型」に変換させる（Mosseら、L
ab Invest.53:556〜562,1985;Owensら、J.Cell.Biol.,1
02:343〜352,1986;Rovnerら、J.Biol.Chem.,261:14740
〜14745,1986;Taubmanら、J.Cell Biol.,104:1505〜151
3,1987;Uekiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:9049〜905
3,1987;Belkinら、J.Biol.Chem.263:6631〜6635,1988;G
lukhovaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:9542〜9546,1
988:Chaponnierら、Eur.J.Biochem.,190:559〜565,199
0;Gimonaら、FEBS Letters,274:159〜162,1990;Shanaha
nら、Circ.Res.,73:193〜204,1993）。
この表現型調節は、アテローム性動脈硬化症および冠
状動脈バルーン血管形成に続く再狭窄を含む多数の疾患
状態の原因に関係しており（Ross,N.Engl.J.Med.314:48
8〜500,1986;Schwartzら、Circ.Res.,58:427〜440,198
6;Zanellatoら、Arteriosclerosis,10:996〜1009,1990;
Ross,Am.J.Pathol.,43:987〜1002,1993;OlsonおよびKle
in,Genes Dev.,8:1〜8,1994）、そしてまた、喘息にお
いて見られる気道再構築に寄与し得る（Jamesら、Am.Re
v.Respir.Dis.,139:242〜246,1989）。冠状動脈バルー
ン血管形成に続く再狭窄は大きな問題であり、そしてこ
の手順の失敗率に40％寄与する（Schwartzら、1992;Liu
ら、Circ.79:1374〜1387,1989）。再狭窄は、平滑筋細
胞が刺激されて、血管形成後に増殖し、従って動脈壁を
ブロックするために生じる。再狭窄のため、バルーン血
管形成は、開口心臓外科手術について受容可能な候補者
ではない患者における緩和のために、主に使用される
（Scientific American Medicine,RubensteinおよびFed
erman（編）、1993年３月、第１章、XII、11頁）。それ
ゆえ、方法は、血管形成後の平滑筋細胞の増殖を制御ま
たは阻害するのに必要である。
RDAdは、インビボでのSMCの休止および増殖の両方を
効率的に伝達するが、それらの診療設定における使用の
潜在的な制限は、多くの異なる細胞系統および組織にお
けるトランスジーン発現を感染およびプログラムすると
いうそれらの能力である（Ohnoら、Science,265（517
3）:781〜784,1994;Haddadaら、Current Topics in Mic
robiology ＆ Immunolog,.199（Pt 3）:297〜306,199
5）。例えば、RDAdの局在化した動脈投与は、末梢細
胞、血管SMC、および外膜細胞の効率的な感染を生じる
（Frenchら、Circulation,90（５）:2402〜2413,1994;S
imariら、J.Clin.Invest.,98（１）:225〜235,1996）。
さらに、これらのベクターの静脈投与は、肝臓および肺
への高レベルの遺伝子移入を生じる（Kashyapら、J.Cli
n.Invest.96（３）:1612〜1620,1995;Johnsら、J.Clin.
Invest.96（２）:1152〜1158,1995;MillerおよびVile,F
ASEB Journal,9（２）:190〜199,1995）。いくつかのア
プローチが、この問題を回避するための試みにおいて使
用されている。第１に、エキソビボでウイルスに投与す
ることによる特異的細胞または組織へのウイルストラン
スジーンの発現を、制限することが可能である。しか
し、このアプローチは困難であり、そしてほとんどの血
管増殖障害の処置には実施されない。第２のアプローチ
は、血管系内（血管壁損傷部位へ）、または組織内での
局所的なアデノウイルス粒子の送達を包含する（Ohno
ら、1994;Changら、Science,267:518〜522,1995a;Guzma
nら、1994;Changら、Mol.Medicine,1:172〜181,1995
b）。コート化バルーンおよび血管内ステントを含む特
別に改変させたカテーテル送達系は、血管系内のアデノ
ウイルスの高い局所濃度を達成するために設計されてい
る（Marchら、Human Gene Therapy,6（１）:41〜53,199
5;Rajasubramanianら、ASAIO Journal.40（３）:M584〜
M589,1994;Kitoら、ASAIO Journal,40（３）:M260〜M26
6,1994）。しかしこれらのアプローチの有用性は、高頻
度の側鎖に起因して、ヒト冠状動脈循環内に制限され得
る。さらに、このようなカテーテル送達系は、血管壁に
おける特定の細胞型へのトランスジーンの発現を制限し
ない。最後に、いくつかのグループは、RDAdの組織向性
が、組織特異的細胞表面レセプターに特異的に結合し得
るリガンドに、アデノウイルスタンパク質を静電気的に
結合することによって改変され得ることが報告されてい
る（Krasnykhら、Journal of Virology,70（10）:6839
〜6846,1996）。このアプローチは、肝細胞および造血
性前駆体細胞株へRDAdを首尾良く標的するのに使用され
ている（Schwarzenbergerら、Blood,87（２）:472〜47
8,1996）。
組織特異的転写調節エレメントの使用は、インビボで
の特異的な細胞系統または組織へのアデノウイルのスト
ランスジーン発現を制限するための代替的なストラテジ
ーを表す（MillerおよびVile、1995）。理論的に明らか
であるが、このストラテジーは、潜在的に制限される。
なぜなら、アデノウイルスゲノムは、複数の細胞系統に
おいて種々の異なるプロモーターをトランス活性化し得
る、複数の高度に活性な転写エンハンサーを含むからで
ある（Haddadaら、1995）。このような標的ストラテジ
ーは、インビボで機能する平滑筋細胞特異的転写調節エ
レメントの欠如のために、平滑筋細胞において特に問題
がある。従って、他の細胞型において発現せず、かつ静
止細胞および増殖細胞の両方において構成的に発現し、
そして動物に投与された場合、その組織特異性を維持す
る平滑筋細胞特異的プロモーターの発見がなお必要であ
る。
発明の要旨 本発明は、組織特異的様式（特に平滑筋細胞）におい
て異種遺伝子の発現が可能なプロモーターを提供するこ
とによって、そしてプロモーターによって指向される発
現の制御が構成的および細胞周期非依存性であるという
さらなる利点を提供することによって、先行技術におけ
るこれらおよび他の弱点を克服するために探求する。従
って、本発明のプロモーターは、増殖細胞においてダウ
ンレギュレートされる他の公知の平滑筋細胞プロモータ
ーとは対称的に、休止および増殖細胞の両方において転
写を促進する。それゆえ、このプロモーターは、例え
ば、増殖平滑筋細胞における異種タンパク質またはmRNA
を発現するため、および増殖性疾患を制御するため、ま
たは血管形成を促進するために使用され得る。
本発明は、特定の実施態様において、異種遺伝子に作
動可能に連結しそしてこの遺伝子の発現を指向し得るSM
22αプロモーター配列を含む、単離された核酸セグメン
トとして記載され得る。単離されたSM22αプロモーター
は、マウスSM22α遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の領
域として記載され得る。本明細書中に記載されるよう
に、配列番号１の塩基899〜1382の配列を有する核酸セ
グメントはまた、平滑筋細胞における転写を促進するの
に効果的であり、そしてこの配列を有する核酸セグメン
トまたはこの配列の転写制御エレメントもまた、請求さ
れる本発明の範囲内にある。このような異種プロモータ
ーは、動物配列（例えばマウス、ブタ、ラット、ハムス
ター、ウサギ由来、もしくはヒトゲノムまたはcDNAライ
ブラリー由来でさえ）から、本明細書中に開示される任
意の配列を分子プローブとして用いて単離され得る。さ
らに、本発明の開示に基づいて、当業者は、種々の供給
源から得られたエレメント（化学的に合成された核酸分
子、または他の天然に存在するプロモーターもしくはSM
22αプロモーターから採取されたエレメントを含むが、
これらの限定されない）をスプライシングすることによ
って、このようなプロモーターを構築し得る。任意のこ
のようなプロモーター、または本明細書中に開示される
プロモーターの必須のエレメントを有しそして異種核酸
配列を発現するのに有用なプロモーターが、本明細書中
に請求される発明の精神および範囲によって包含される
ことが理解される。
本発明のプロモーター領域は、構造SM22α遺伝子のす
ぐ上流（5'）のゲノムの領域を含み、そしてこの遺伝子
の発現を制御するように定義され得る。例えば、プロモ
ーターは、SM22α遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の3
0、40、50、100、500、1,000、1,500、2,000まで、また
は5,000塩基までの領域を含み得、そしてより詳細に
は、本発明のSM22αプロモーターは、配列番号１の塩基
１〜1381（−1338〜＋41）の連続配列を含む単離された
核酸セグメントとして記載され得る。−1338〜＋41など
の表示は、転写開始部位（＋１）（これは、マウスゲノ
ムにおいて、本明細書中で配列番号１の塩基1341である
と開示される）との比較上の塩基の位置を示す。本発明
のプロモーターはまた、配列番号１の塩基899〜1381
（−441〜＋41）の連続配列を含む単離された核酸セグ
メントとして記載され得る。本開示を考慮にいれて同定
されるプロモーターの特定のエレメントは、開始部位の
TATAボックス29bp 5'、−534、−577、−865、−898、
−910bp、および−1267に位置する５つのコンセンサス
Ｅボックス/bHLH筋原性転写因子結合部位、−504、−82
8、−976bpに位置する３つのコンセンサスGATA−４結合
部位、−407および−770bpに位置する２つのATリッチ、
潜在的なMEF−2/rSRF結合部位、ならびに−435〜−416
によって含まれる少なくとも１つのシス作用性、ポジテ
ィブ転写調節エレメントである。さらに、本発明のプロ
モーターは、−150および−273bpに位置するコンセンサ
スCArG/SRF結合部位ならびに−104bpに位置する１つのC
ACCボックスを含む。
従って、本発明のプロモーターは、前段落に記載され
るいくつかまたは全てのエレメントを含み得る。このよ
うなエレメントは、当業者に公知の技術によって単離ま
たは組換えられて、構成的平滑筋細胞転写に必要な最小
配列として本明細書中に開示される、441〜482塩基より
も小さい平滑筋細胞特異的プロモーターを産生し得る。
プロモーターにおける配列の特定のストレッチが、シス
作用性エレメントの間隔に必要であり、そしてヘアピン
ループまたは他の有害な構造特徴を分与しない任意の配
列が、間隔および構造が同様のままである限りはこれら
の領域に置換され得ることもまた公知である。全てのこ
のようなプロモーターが、本発明によって包含されるこ
とが理解される。
本発明の単離された核酸セグメントはまた、端子され
たSM22αプロモーター配列に作動可能に連結される核酸
配列または遺伝子ですら含むように定義され得る。作動
可能に連結されるとは、遺伝子が、プロモーターが遺伝
子に対して5'に配向されおよびプロモーターが転写開始
部位から適切な距離であるようなプロモーター領域に結
合して、その結果遺伝子の転写が、プロモーター配列に
依存するかまたは制御されることを意味することが理解
される。プロモーター−遺伝子構築物の構築に使用され
る制限酵素および核酸連結の技術は、Maniatisら、Mole
cular Cloning,A Laboratory Manual.Cold Spring Horb
or,New York,1982（本明細書中で参考として援用する）
によって例示されるように、当該分野で周知である。そ
れゆえ、標準的な技術を用いて、制限酵素消化によっ
て、SM22αプロモーターの下流に連結される適切な末端
配列、または平滑末端ですら有するように遺伝子を調製
する。制限酵素認識部位は、天然に存在する配列、また
は部位特異的変異誘発、PCRTMプライマー配列、もしく
は当該分野に公知の任意の他の手段によって作製された
配列であり得る。あるいは、遺伝子もしくは遺伝子フラ
グメントまたは適切な制限酵素認識配列を含むオリゴヌ
クレオチドを化学的に合成し得るか、あるいは当該分野
で公知のいくつかの方法のいずれかによって遺伝子を調
製し得る。
遺伝子または核酸セグメントは、例えば、全長タンパ
ク質、タンパク質の部分もしくは一部をコードする構造
遺伝子、または平滑筋細胞において発現することを所望
するペプチドであり得る。遺伝子はまた、RNA配列（例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列）または別
の遺伝子（単数または複数）の発現に影響を及ぼす調節
配列をコードし得る。本発明の特定の好ましい実施態様
において、遺伝子は、網膜芽細胞腫（Rb）遺伝子、リン
酸化欠損Rb遺伝子、p53、p21、p16、p27、細胞周期依存
性キナーゼインヒビター、E2Fインヒビター、CDKキナー
ゼ、またはサイクリン遺伝子のような細胞周期制御遺伝
子であり；あるいは、遺伝子は、VEGF、iNOS、eNOS、塩
基性FGF、またはFGF−５のような血管形成遺伝子であ
り、または遺伝子は単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝
子のような細胞傷害性遺伝子または任意の他の遺伝子で
あり得、その発現は、その遺伝子が発現される平滑筋細
胞、および／もしくはこのような方法において新規な血
管の増殖に影響を及ぼすような方法における末梢細胞の
増殖に影響を及ぼす。あるいは、核酸セグメントは、細
胞周期制御遺伝子または調節配列の発現を阻害するのに
効果的なアンチセンスRNAをコードし得る。アンチセン
ス構築物は、制御領域に相補的なヌクレオチドを含むか
またはDNA分子のセグメント（例えば、遺伝子またはcDN
A）をコードする、オリゴまたはポリヌクレオチドであ
る。このような構築物は、両方のプロモーターのアンチ
センスバージョン、ならびに他の制御領域、エキソン、
イントロン、および遺伝子のエキソン：イントロン境界
線を含み得る。アンチセンス分子は、所定の遺伝子また
は構築物の転写、翻訳、またはその両方を阻害するよう
に設計され、その結果、得られたタンパク質産物のレベ
ルは、減少または低減される。アンチセンスRNA構築
物、またはこのようなアンチセンスRNAをコードするDNA
は、ヒト被験体を含む宿主動物内のような宿主細胞内
で、インビボまたはインビトロのいずれかで、遺伝子転
写、または翻訳、またはその両方を阻害するために使用
され得る。もちろん、アンチセンス構築物は、本明細書
中に記載される核酸ハイブリダイゼーションの型に有用
な証拠を有する。遺伝子はまた、抗原性配列および細胞
表面への輸送に必要なリーダー配列をコードし得るか、
あるいは、酵素または細胞内シグナルタンパク質もしく
はペプチドをコードし得るか、あるいはSM22α遺伝子ま
たはSM22αcDNA遺伝子ですらコードし得る。特に好まし
いのは、Changら、1995a（本明細書中で参考として援用
する）に記載される、細胞増殖を阻害するRb遺伝子産物
の構造的な活性形態である。
本発明はまた、特定の実施態様において、適切な宿主
細胞において複製可能であり、そして本明細書中で開示
されるようなSM22αプロモーター配列（遺伝子または核
酸セグメントに作動可能に連結するSM22αプロモーター
を含む）を含む組換えベクターを記載し得る。好ましい
ベクターとしては、プラスミド、ラウス肉腫ウイルス
（RSV）ベクター、p21ウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルスベクター、またはアデノウイルスベクターが挙げ
られるがこれらに限定されない。さらに、レトロウイル
スベクター、単純ヘルペスウイルス（米国特許第5,288,
641号、本明細書中で参考として援用される）、サイト
メガロウイルスなどのような種々のウイルスベクター
が、Millerによって記載されるように使用され得る（Mi
crobiol.Immunol.,158:1,1992、本明細書中で参考とし
て援用される）。組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）お
よびAAVベクターもまた、米国特許第5,139,941号（本明
細書中で参考として援用する）に記載されるもののよう
に使用され得る。組換えアデノウイルスベクターが、現
在好ましい。複製欠損感染性ウイルスを調製するための
技術は、Ghosh−ChoudhuryおよびGraham,biochem.Bioph
ys.Res.Comm.,147:964〜973（1987）;McGroryら、Virol
ogy,163:614〜617,（1988）；およびGluzmanら、Eukary
otic Viral Vectors（Gluzman,Y.編）187〜192頁、Cold
Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York,
（1982）（各々を本明細書中で参考として援用する）に
よって例示されるように、当該分野で周知である。Trip
athyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10876〜80,1996に
記載されるもののような、増加した発現のために設計さ
れたプラスミドベクターもまた好ましい。
本発明の実施において使用される好ましいアデノウイ
ルスは、複製欠損性であり、そして特に、初期遺伝子領
域E1または初期遺伝子領域E1およびE3を欠如するアデノ
ウイルスである。例えば、本発明の平滑筋特異的転写調
節配列のような、目的の外来DNAは、アデノウイルスゲ
ノムの欠失したE1およびE3領域の領域に挿入され得る。
この方法において、全体の配列は、外来遺伝子を感染可
能な宿主細胞に移入し得るビリオンに封入され得る。好
ましいアデノウイルスは、５型アデノウイルスおよびSM
22αプロモーターであり、そしてコード配列は、アデノ
ウイルス５型配列によって好ましく隣接される。
本発明は、好ましい実施態様において、複製欠損アデ
ノウイルスベクターを記載し得、ここでベクターは、平
滑筋細胞特異的転写調節セグメントを含む。好ましい平
滑筋細胞特異的転写調節セグメントとしては、SM22αプ
ロモーター、平滑筋カルポニンプロモーター、平滑筋ミ
オシン重鎖プロモーター、平滑筋αアクチンプロモータ
ー、平滑筋αアクチンエンハンサー、テロキン（teloki
n）プロモーター、平滑筋γアクチンプロモーター、ま
たは平滑筋γアクチンエンハンサーが挙げられるが、こ
れらに限定されない。さらに、エンハンサーエレメント
は、本発明のアデノウイルスベクターにおいて、プロモ
ーターセグメントと組み合わせて含まれ得る。本発明の
平滑筋細胞特異的転写調節セグメントは、哺乳動物また
は鳥類（例えば、マウス、ブタ、ラット、ウサギ、ヒ
ト、またはニワトリを含むがこれらに限定されない）の
ような任意の供給源から単離され得る。このようなセグ
メントの特定の例としては、マウス平滑筋カルポニンプ
ロモーター（Genbank登録番号U38929の塩基１〜1216、
またはGenbank登録番号U37071のプロモーター配列、ま
たはGenbank登録番号L49022の塩基１〜631）；マウス
（Genbank登録番号U53469の塩基１〜1536）、ラット（G
enbank登録番号U55179の塩基１〜1699またはGenbank登
録番号U83321）、またはウサギ（Genbank登録番号U1551
4の塩基１〜2267）由来の平滑筋ミオシン重鎖プロモー
ター；ヒト平滑筋αアクチンプロモーター（Genbank登
録番号D00618の塩基１〜1746、またはGenbank登録番号J
05193の塩基１〜892）またはヒト平滑筋αアクチンエン
ハンサー（Genbank登録番号D00618の塩基1789〜555
9）；ニワトリ平滑筋αアクチンプロモーター（Genbank
登録番号M13756、D00041、N00041の塩基１〜1013）、マ
ウス平滑筋αアクチンプロモーター（Genbank登録番号M
57409、M35194の塩基１〜1074）、ラット平滑筋αアク
チンプロモーター（Genbank登録番号S76011）；ウサギ
テロキンプロモーター（Genbank登録番号U40712の塩基
１〜3460）；マウス平滑筋γアクチンプロモーター（Ge
nbank登録番号U19488の塩基１〜1076）またはマウス平
滑筋γアクチンエンハンサー（Genbank登録番号U19488
の塩基1123〜5703）が挙げられる（この段落において議
論された全ての配列を、本明細書中で参考として援用す
る）。
平滑筋細胞特異的調節エレメントまたはセグメント
は、先に定義されるような遺伝子または核酸セグメント
に作動可能に連結され得る（すなわち、網膜芽腫細胞
（Rb）遺伝子、リン酸化欠損Rb遺伝子、p53、p21、p1
6、p27、細胞周期依存性キナーゼインヒビター、E2Fイ
ンヒビター、CDKキナーゼまたはサイクリン遺伝子のよ
うな細胞周期制御遺伝子であり得るか；あるいは、遺伝
子は、VEGF、iNOS、eNOS、塩基性FGF、またはFGF−５の
ような血管形成遺伝子であるか、または遺伝子は単純ヘ
ルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような細胞傷害性遺伝
子であり得る）。
本発明の特定の実施態様において、本発明のベクター
は、薬学的または薬理学的に受容可能な溶液に分散され
る。好ましい溶液としては、リン酸、乳酸、Trisなどで
緩衝化した中性生理食塩水溶液が挙げられる。もちろ
ん、ベクターを充分に精製し、ベクターが、所望でない
夾雑物（例えば、アデノウイルス粒子、またはエンドト
キシン、および他の発熱因子を妨害する欠損）を本質的
に含まないようにすることを所望し、その結果ベクター
構築物を受ける個体において有害な反応を全く生じな
い。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配
（例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）の使用を含む。
本発明はまた、特定の実施態様において、平滑筋細胞
において遺伝子を発現する方法として記載され得、これ
は以下の工程を含む:SM22αプロモーター領域に作動可
能に連結する遺伝子を含む単離された核酸セグメントを
得る工程；この核酸セグメントを平滑筋細胞に導入する
工程；および平滑筋細胞を、遺伝子を発現するのに有効
な条件下で維持する工程。本発明のこの方法において、
SM22αプロモーター領域は、好ましくは、SM22α遺伝子
の塩基−441〜＋41（配列番号１の899〜1382）またはマ
ウスSM22α遺伝子の塩基−441〜＋１（配列番号１の899
〜1341）さえ含み、そしてSM22αプロモーターの5,000
塩基までを含み得る。本発明の方法の実施において、異
種遺伝子は、好ましくはレポーター遺伝子、細胞周期制
御調節遺伝子、血管形成遺伝子、単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ（Changら、1995b）のようなウイルス
的にコードされた遺伝子、アンチセンス分子であるか、
または筋肉収縮阻害ペプチドをコードし得、そして配列
MIRICRKK（配列番号19）を有するRb遺伝子産物もしくは
ペプチド、または任意の遺伝子もしくは上記の任意の遺
伝子の明らかな改変体をコードし得る。Rb遺伝子は、野
生側Rb遺伝子であり得るか、または改変された遺伝子で
あり得、その結果遺伝子産物はリン酸化欠損である。本
発明の開示から、本発明の方法の実施において遺伝子産
物を集める必要があり得ないことは明らかである。例え
ば、遺伝子産物が、細胞周期調節エレメント、または収
縮阻害ペプチドである場合、細胞自身は、その効果の標
的であり、そしてこの方法の有用性は、タンパク質産物
を回収または同定することにさえ依存しない。しかし、
特定の遺伝子産物は、遺伝子発現のマーカーとして、そ
して組換え細胞によって産生される有用なタンパク質ま
たはペプチドとしての有用性を有する。
さらに、本発明は、平滑筋細胞増殖を阻害する方法と
して記載され得、以下の工程を含む:SM22αプロモータ
ー領域に作動可能に連結する細胞周期調節遺伝子を含む
単離された核酸セグメントを得る工程；核酸セグメント
を平滑筋細胞に導入してトランスフェクト細胞を得る工
程；および細胞周期調節遺伝子を発現するのに有効な条
件下で平滑筋細胞を維持する工程；ここで細胞周期調節
遺伝子の発現は、平滑筋細胞の増殖を阻害する。本方法
の実施において、SM22αプロモーター領域に作動可能に
連結する細胞周期調節遺伝子は、ウイルスベクター、プ
ラスミドベクターを含み得るか、またはアデノウイルス
ベクターを含み得る。さらに、細胞周期調節遺伝子は、
好ましくは、例えば、Rb、リン酸化欠損Rb遺伝子、p5
3、p21、p16、p27、細胞周期依存性キナーゼインヒビタ
ー、E2Fインヒビター、CDKキナーゼ、またはサイクリン
遺伝子をコードし得る。
本発明はまた、特定の幅広い局面において、被験体に
おける、例えば、冠状動脈、腎臓動脈、末梢動脈、また
は頸動脈のいずれかのバルーン血管形成に続く再狭窄を
防ぐ方法として記載され得る。さらに、本発明は、特定
の幅広い実施態様において、被験体における、冠状動脈
バイパス手術において使用されるような静脈、または末
梢において使用され得る他の生物人工器官移植片のバル
ーン血管形成に続く再狭窄を防ぐ方法として記載され得
る。この方法は、薬学的に受容可能な溶液中に分散され
たSM22αプロモーター領域に作動可能に連結する細胞周
期調節遺伝子を含むウイルスベクターを得る工程、およ
び溶液を被験体に投与する工程を含む。被験体は動物被
験体であり得、そして好ましくはヒト被験体である。本
方法の実施において、ウイルスベクターは、好ましく
は、複製欠損アデノウイルスベクターであり、そして遺
伝子は、好ましくは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、
p53、Rb、リン酸化欠損Rb遺伝子、p53、p21、p16、p2
7、細胞周期依存性キナーゼインヒビター、E2Fインヒビ
ター、CDKキナーゼ、またはサイクリン遺伝子をコード
し得る。
本発明の局面はまた、平滑筋細胞特異的転写制御エレ
メント、そして特に、トランスで機能するエレメントを
同定するためのスクリーニング方法である。本明細書中
に提供される方法は、その組換え宿主において、場合に
よっては発現されるか阻害されるかのいずれかである容
易に検出可能な表現型を与えるレポーター遺伝子を使用
する。一般的には、レポーター遺伝子は、（ａ）宿主細
胞によって他の方法では産生されないポリペプチド；ま
たは（ｂ）より低いレベルであるが、宿主細胞によって
産生されるタンパク質もしくは因子；または（ｃ）宿主
細胞によって産生されるポリペプチドの変異形態をコー
ドする。好ましくは、遺伝子は、宿主細胞において、イ
ンサイチュ分析によって検出可能であり、そして転写活
性の定量的または半定量的機能である比色定量的または
蛍光定量的変化を生じる酵素をコードする。例示的な酵
素としては、エステラーゼ、ホスファターゼ、プロテア
ーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナ
ーゼ）、および当業者に公知のような発色団または発蛍
光団を作製する活性によって検出され得る他の酵素が挙
げられる。
このようなレポーター遺伝子の例は、E.coliβガラク
トシダーゼ（β−gal）およびホタルルシフェラーゼ遺
伝子である。β−gal酵素は、βガラクトシダーゼを発
現する細胞による、インジゴ生成物質、インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシドの切断の際に色変化を生じる。従っ
て、この酵素は、候補体活性因子で処理した形質転換体
を含むマイクロタイターウェルにおいて直接的な、発現
の自動プレートリーダー分析を容易にする。また、哺乳
動物細胞における内因性βガラクトシダーゼ活性は、通
常、極めて低いので、βガラクトシダーゼを用いる分析
用スクリーニング系は、宿主細胞バックグランドによっ
て妨害されない。この酵素は、発現が、以下に記載の組
織分析によって、インビボでモニターされ得るというさ
らなる利点を提供する。
宿主細胞において検出可能な特徴を付与するレポータ
ー遺伝子の別のクラスは、ポリペプチド（一般的には酵
素）をコードするもの、それらの形質転換体に毒素に対
する耐性を付与するもの（例えば、neo遺伝子、これ
は、抗生物質G418の毒性レベルに対して宿主細胞を保護
する）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（これは、メトトレ
キセートに対する耐性を付与する）をコードする遺伝
子、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（CAT）遺伝子である。本明細書中のスクリーニ
ングアッセイにおいて使用するための他の遺伝子は、固
有の細胞表面抗原（例えば、HIV gp120またはヘルペスg
Dのようなウイルスenvタンパク質、これらはイムノアッ
セイによって容易に検出可能である）を発現するように
宿主を形質転換し得るものである。
特定の実施態様において、本発明は、遺伝子の発現を
制御する位置において遺伝子に隣接する位置にある単離
されたSM22αプロモーターを含む組換えベクターとして
記載され得る。核酸配列のスプライシングは、上記のよ
うに当該分野で周知であり、そしてこのような遺伝子の
ベクターへの挿入もまた、当該分野で周知である。本発
明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージミド、
複製欠損アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または
レトロウイルスであり得る。ベクターの型は、本発明の
定義内およびそれ自身に必要ではなく、それゆえ特定の
実施態様において、その細胞において発現される細胞へ
遺伝物質の移入し得る任意のベクターは、本発明におい
て有用である。核酸セグメントが、リポソーム、レセプ
ターリガンドキャリア、エレクトロポレーションなどの
ような機械的手段のような手段によって細胞へ移入され
得ること、および全てのこのような実施態様は、本願発
明内に包含されることもまた、理解される。
しかし、本発明の組換えベクターは、好ましくは、複
製欠損アデノウイルス、または遺伝子に作動可能に結合
するSM22αプロモーターを含む高発現プラスミドであ
り、そしてここで、遺伝子は、網膜芽細胞腫（Rb）遺伝
子、リン酸化欠損Rb遺伝子、p53、p21、p16、p27、細胞
周期依存性キナーゼインヒビター、E2Fインヒビター、C
DKキナーゼまたはサイクリン遺伝子のような細胞周期制
御遺伝子であり得るか；あるいは遺伝子は、VEGF、iNO
S、eNOS、塩基性FGF、またはFGF−５のような血管形成
遺伝子であり得るか；または遺伝子は、単純ヘルペスチ
ミジンキナーゼ遺伝子のような細胞傷害性遺伝子であり
得る。
筋肉収縮を阻害する方法は、筋肉細胞収縮に起因する
種々の疾患の寛解の処置における有用性を有することが
理解される。このような疾患としては、目、腸、子宮、
膀胱、脾臓などにおける平滑筋細胞の収縮性障害におい
て、または麻痺犠牲における横紋筋痙攣においてすら、
プリンズメタル型狭心症、高血圧症、Reynaud現象、片
頭痛、ELSのような種々のコラーゲン血管疾患、強皮
症、肺高血圧症、冠状動脈血管痙攣を含むが、これらに
限定されない。
特定の幅広い局面において、本発明は、被験体におけ
る血管形成を促進する方法として記載され得、これは、
SM22αプロモーター領域に作動可能に連結する血管形成
因子遺伝子を含む核酸セグメントを得る工程；および核
酸セグメントを平滑筋細胞に移入して、トランスフェク
ト細胞を得る工程を含み；ここで、平滑筋細胞における
核酸セグメントの発現は、血管形成を促進する。本発明
の実施において、平滑筋細胞は、冠状動脈または静脈平
滑筋細胞であり得るか、または末梢動脈または静脈平滑
筋細胞であり得る。好ましい血管形成因子は、VEGF、iN
OS、eNOS、塩基性FGF、またはFGF−５である。本方法の
特定の実施態様において、SM22αプロモーター領域に作
動可能に連結する血管形成因子遺伝子を含む核酸セグメ
ントは、ウイルスまたはプラスミドベクターに含まれ、
そしてベクターは、被験体に投与される。特定の代替の
実施態様においては、移入はエキソビボで行われ、そし
て本方法はさらに、生物人工器官移植片またはステント
に、トランスフェクト細胞を播種して、播種された移植
片またはステントを得る工程；および播種された移植片
またはステントを、被験体の冠状もしくは末梢動脈また
は静脈に配置する工程を含む。
本発明はまた、特定の幅広い局面において、平滑筋増
殖を阻害する方法として記載され、これは、SM22αプロ
モーター領域に作動可能に連結する細胞周期調節遺伝子
を含む核酸セグメントを得る工程；核酸セグメントを一
次平滑筋細胞にインビボまたはエキソビボで移入して、
トランスフェクト細胞を得る工程；生物人工器官移植片
またはステントに、トランスフェクト細胞を播種して、
播種された移植片またはステントを得る工程；および播
種された移植片またはステントを、被験体の冠状もしく
は末梢動脈または静脈に配置する工程を含み、ここで、
細胞周期調節遺伝子の発現は、平滑筋細胞の増殖を阻害
する。
マウスSM22αcDNAについてのGenBank登録番号は、L41
154である。マウスSM22α遺伝子についてのGenBank登録
番号は、L41161である。
図面の簡単な説明 図１ 441bp SM22αプロモーターの細胞特異性。ｐ−
441 SM22luc（黒棒）およびpRSVL（斜線棒）プラスミド
を、原発性ラット大動脈SMC（VSMC）、A7r5、NIH3T3（3
T3）、COS−７、およびHep G2細胞に一過的に移入し、
そして各それぞれのプラスミドについての正常化ルシフ
ェラーゼ活性を決定した。データは、正常化ルシフェラ
ーゼ光単位±S.E.M.として示される。
図２ DNase IフットプリントおよびEMSA分析によっ
て同定される、SM22αプロモーターに結合するシス作用
性エレメントおよびトランス作用因子の模式図。６つの
核タンパク質結合部位を、それぞれSME−１−６と命名
された441−bp動脈SMC特異的SM22αプロモーターにおい
て、DNase Iフットプリント分析によって同定した。EMS
Aによって同定された、各核タンパク質結合部位に結合
するトランス活性化因子は、上記または以下のシス作用
性エレメントとして知られる。SRFおよび三元複合体因
子（Ｔ）（SME−１およびSME−４）、SP1（SME−１、−
２、−５、−６）、YY1（SME−３、−４、−６）、CREB
−１（SME−６）およびATF−１（SME−６）についての
結合部位を同定した。抗体スーパーシフト反応によって
ポジティブに同定され得ない核タンパク質複合体は、そ
れらが結合する核タンパク質結合部位の下のグレーに示
される。
図3A. AdSM22−lacZおよびAdCMV−lacZアデノウイル
スベクターの模式図。AdSM22−lacZベクター（下部パネ
ル）は、細菌lacZレポーター遺伝子（黒四角）およびウ
シ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（水平線の四
角）を、441−bpマウスSM22αプロモーター（対角線の
四角）および450−bpヒト4F2転写エンハンサー（白四
角）の転写制御下でコードする。Ad5Sub360アデノウイ
ルスゲノムのE1およびE3領域は欠失され（ΔF3）、ウイ
ルス複製欠損を付与する。AdCMV−lacZ制御ウイルス
は、lacZレポーター遺伝子（黒四角）を、サイトメガロ
ウイルス前初期遺伝子プロモーターエンハンサー（点で
満たされた四角）の転写制御下でコードする。
図3B. ラット大動脈平滑筋細胞（VMSC）およびヒト
臍静脈内皮細胞（HUVEC）の一次培養における、AdSM22
−lacZおよびAdCMV−lacZ制御ウイルスの活性の比較。V
SMCまたはHUVECの一次培養物を、１−、10−、および10
0−PFUのAdSM22−lacZ（黒四角−HUVECおよび黒丸−VSM
C）またはAdCMV−lacZ（白四角−HUVECおよび白丸−VSM
C）のいずれかに感染させ、そしてβガラクトシダーゼ
活性を発現する細胞の％を、感染後72時間で定量した。
データは、βgal活性を発現する細胞の平均割合±S.E.
M.として示される。
好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、天然に存在する状態においてSM22α遺伝子
の発現を制御する、平滑筋細胞特異的プロモーター領域
の単離および特徴付け、ならびにこの単離したプロモー
ター領域が、異種構造遺伝子に作動可能に結合され得、
そして平滑筋細胞および胚骨格筋細胞を含む他の筋原正
細胞系統における遺伝子の発現を特異的に制御するとい
う発見から起因する。本発明の重要なエレメントは、他
の公知の平滑筋細胞プロモーターとは異なり、SM22αプ
ロモーターが細胞周期非依存性であり、従って細胞が増
殖期に入る場合にダウンレギュレートされないことであ
る。本発明のプロモーター配列は、平滑筋細胞における
異種遺伝子の発現において、平滑筋細胞遺伝子発現に影
響するトランスおよびシス作用性転写コントロールエレ
メントの発見において、ならびにSM22α遺伝子およびプ
ロモーターを単離するためのプローブとして有用であ
る。特に、本発明は、バルーン血管形成または他の動脈
損傷に続く再狭窄の予防において、動脈硬化症または末
梢血管閉塞疾患の処置において、移植片またはステント
移植物における血管形成の促進において、そして喘息の
処置または予防において、他の平滑筋細胞増殖疾患の間
での使用を見いだす。
本発明の実施態様のように、組換え複製欠損アデノウ
イルスベクター（RDAd）（AdSM22−lacZと称される）を
作製し、これは、SMC特異的SM22αプロモーターの転写
制御下で、細菌lacZレポーター遺伝子を含む（Sloway
ら、J.Biol.Chem.,270（22）:13460〜13469,1995;Kim
ら、Mol.Cell.Biol.,（17）:2266〜2278,1997;Liら、J.
Cell.Biol.,132:849〜859,1996b）。本明細書中に示さ
れるように、このアデノウイルス構築物（AdSM22−lac
Z）は、培養細胞において、lacZレポーター遺伝子のSMC
特異的発現をプログラムする。さらに、AdSM22−lacZウ
イルスのSMC特異性は、動脈内、筋肉内、および静脈内
投与に続いて、インビボで維持される。最後に、AdSM22
−lacZは、内臓、ならびに血管SMCにおいてインビボで
トランスジーン発現をプログラムする。
本明細書中に開示されるように、RDAdによってコード
される組換え遺伝子産物の発現は、細胞系統制限様式に
おいて、正常細胞中の転写調節エレメントによってイン
ビボで調節され得ることは、重要な発見である。本発明
者らは、他の細胞系統特異的転写調節エレメントを含む
アデノウイルスベクターを以前に作製しており、そして
インビボで、アデノウイルスベクターの状況で試験した
場合、これらのエレメントの大部分が、細胞系統特異性
を欠失すことを観察している。同様に、Arbuthnotら
は、αフェトプロテイン（AFP）プロモーターの転写制
御下でトランスジーンを含むRDAdが、肝ガン細胞におい
て細胞系統制限遺伝子発現を媒介し得るが、正常肝臓実
質においては維持し得ないことを報告した（Arbuthnot
ら、Human Gene Therapy,7（13）:1503〜1514,1996）。
本発明を任意の特定の理論に対して制限せずに、マウス
SM22αロモーターは、アデノウイルスゲノム内に局在す
る潜在性転写調節エレメントの活性から保護し得る、隔
離エレメントまたは遺伝子座制御領域を含み得ることが
可能である。この点に関して、マウスSM22αプロモータ
ーは、SMCにおいて、最も強力なウイルスLTRと同じ程度
活性であり（Solwayら、1995）、そしてインビトロ、お
よびインビボでのトランスジェニックマウスの両方にお
いて、SMC特異的様式で機能する（Kimら、1997;Liら、1
996b;Moesslerら、Development,122:2415〜2425,199
6）。それゆえ、隔離エレメントは、SM22αプロモータ
ーから単離された場合、アデノウイルスベクターから発
現した場合に組織特異性を欠失する、これらの組織特異
的プロモーターに対する組織特異性を確認する手段とし
て有用であることが意図される。
さらに、トランスジェニックマウスにおいて、SM22α
プロモーターは、動脈SMCにおいて活性であるが、内臓S
MCにおいては活性ではない（Liら、Circ.Res.,78:188〜
195,1996a;Kimら、1997）。それゆえ、AdSM22−lacZに
よってコードされるlacZレポーター遺伝子が、内臓なら
びに血管SMCにおいて発現されるという、本明細書中に
記載される実証は、いくぶん驚くべきであった。再び、
任意の特定の理論を頼らずに、この差異は、アデノウイ
ルス感染細胞においてDNAがエピソームのままである一
方、トランスジェニックマウスにおいて、その転写活性
がクロマチン構造における変更によって調節され得る宿
主ゲノムに組み込まれるという事実を反映し得る。
RDAdは、アテローム性動脈硬化症および他の血管増殖
障害の分子原因研究にするために、特に有用なツールで
ある。アデノウイルスは、空間的および時間的に制限さ
れた様式において、大動物および小動物における正常血
管またはアテローム性動脈硬化症血管の両方における血
管壁に送達され得る（Frenchら、1994;Simariら、199
6）。しかし、これらのベクターを用いて、血管増殖性
疾患の原因を調査する以前の研究では、内皮または外膜
細胞における導入遺伝子発現から生じる効果から、血管
SMC遺伝子発現における変更に起因する効果を区別し得
なかった。この点に関して、導入遺伝子含有RDAdは、SM
22αプロモーターの制御下で、血管SMC増殖および新内
膜形成におけるSMC特異的導入遺伝子発現の効果を直接
決定し得る。さらに、SM22αを含有するRDAdは、内臓SM
Cにおける導入遺伝子発現をプログラムするので、これ
らのウイルスはまた、病因を試験し、そして内臓SMCに
よって媒介される疾患の処置に有用であり得る。このよ
うな疾患の例としては、喘息、無弛緩症、平滑筋肉腫、
過敏性腸症候群、および子宮平滑筋腫が挙げられる。
RDAdの効力は、血管増殖性疾患の大動物および小動物
のモデルにおいて確立されているが（Ohnoら、1994;Cha
ngら、1995a;Guzmanら、1994;Yangら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,93（15）:7905〜7910,1996;Changら、1995
b）、安全性の問題は、これらのウイルスのほとんどの
細胞および組織に感染する能力に起因して残っている。
この点に関して、SM22αプロモーター駆動アデノウイル
スは、ビヒクルとしての利点を改良して、治療用遺伝子
を、血管増殖障害の処置のために、血管壁に送達し得
る。細胞傷害性または細胞増殖抑制性の導入遺伝子発現
の、動脈損傷の限度での内皮細胞における欠失は、理論
的には、損傷した血管のより迅速な内皮化（endothelia
lization）を、隣接する内皮細胞の増殖および取り込み
を容易にすることによって促進するはずである（Ohno
ら、1994）。等しく重要なことに、他の組織および器官
における潜在的に細胞傷害性のアデノウイルスコード導
入遺伝子の異所発現から生じる全身毒性についての能力
は、SMC特異的SM22αプロモーターの使用によって減少
されるはずである。最後に、最近の報告は、アデノウイ
ルス感染細胞の免疫原性の多くは、外来導入遺伝子タン
パク質に対して特異的な細胞性免疫応答および体液性免
疫応答に起因することを実証してきている（Kashyap
ら、1995）。非SMC含有組織におけるアデノウイルスコ
ード導入遺伝子の異所発現を制限することによって、Ad
SM22ウイルスはまた、高用量のAdSM22−lacZのIV投与に
続く減少した肝臓毒性の知見によって示されるように、
ベクターの意図的または不慮の全身投与に続く、肝臓お
よび肺のような器官に対する免疫媒介性損傷を減少し得
る。
１つの局面において、本発明は、平滑筋における遺伝
子発現の指向および調節のプロセスを提供する。このプ
ロセスに従って、SM22αプロモーターに作動可能に連結
される遺伝子が、平滑筋細胞に送達され、次いで、平滑
筋細胞は、生理的条件下で、そして遺伝子が平滑筋細胞
に入るため、遺伝子が転写されるため、および特定の実
施態様において、この遺伝子の産物が発現されるために
十分な期間、維持される。送達は、プラスミドまたは高
発現プラスミド、複製欠損アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス、p21ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、あるい
は平滑筋細胞をトランスフェクトし得そして遺伝子産物
をコードするコード配列に作動可能に連結されるSM22α
プロモーターを含み得る他のウイルスベクター構築物で
のトランスフェクションによるものが好ましい。
アデノウイルスの細胞トランスフェクションのための
ベクターとしての使用は、当該分野で周知である。アデ
ノウイルスベクター媒介性細胞トランスフェクション
は、種々の細胞について報告されている（Stratford−P
erricaudetら、J.Clin.Invest.,90,626〜630,1992）。
本発明のアデノウイルスベクターは、複製欠損である。
ウイルスは、ウイルス初期領域１（E1）領域の欠失によ
って、複製欠損が付与される。E1領域を欠失するアデノ
ウイルスは、細胞（例えば、ヒト293細胞、これはその
細胞ゲノムからアデノウイルス初期領域１遺伝子を発現
する）においてのみ複製能を有する。従って、このよう
なアデノウイルスは、E1領域の初期遺伝子産物を提供し
ない細胞において、複製し得ない。好ましい実施態様に
おいて、本発明に使用されるアデノウイルスベクター
は、E1およびE3初期遺伝子領域の両方を欠失している。
従って、E1および／またはE3コード配列が除去されてい
る位置での遺伝子産物についてのコード配列を誘導する
のに最も簡便である（Karlssonら、EMBO J.,5:2377〜23
85,1986）。好ましくは、アデノウイルスのE1領域は、
コードDNA配列または遺伝子によって置換される。しか
し、アデノウイルス配列内の挿入の位置は、本発明に重
要ではない。このような複製欠損アデノウイルスを調製
するための技術は、Ghosh−Choudhuryら、1987:McGrory
ら、1988;およびGluzmanら、1982によって例示されるよ
うに、当該分野で周知である。
広範な種々のアデノウイルスベクターは、本発明の実
施において使用され得る。アデノウイルスベクターは、
亜群Ａ〜Ｆの42の異なる公知の血清型のいずれかであ
る。亜群Ｃのアデノウイルス５型は、複製欠損アデノウ
イルスベクターの産生のための、好ましい出発物質であ
る。アデノウイルス５型は、多量の生化学的情報および
遺伝子情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そ
してベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんど
の構築のために歴史的に使用されてきている。
ウイルスを複製するために、ベクターは、完全なアデ
ノウイルス５型ゲノムを有するプラスミドとともに293
細胞に同時トランスフェクトされる。好ましいプラスミ
ドはまた、適切な配列のウイルスゲノムへの挿入に起因
して、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与
し得る。組換えアデノウイルスを産生するのに使用され
る分子ストラテジーは、アデノウイルスのパッケージン
グの限界に起因して、プラスミドがそれ自身においてプ
ラークを十分に形成し得ないという事実に基づく。それ
ゆえ、トランスフェクト細胞内の所望の構築物と同時ト
ランスフェクトプラスミドとの間の相同組換えは、293
細胞においてのみパッケージングおよび形成され得る生
存可能なウイルスを生じる。
同時トランスフェクションは、当該分野で周知の標準
的な手順に従って実施される。例示の目的で、293細胞
は、10％ウシ胎児血清を含むDulbeccoの改変Eagle培地
において、湿潤５％CO2気圧において培養される。コン
フルエントな10cm皿は、３つの6cm皿に分割される。次
の日に、細胞は、HeLa DNAをキャリアとして含むリン酸
カルシウム中で同時トランスフェクトされる。DNAの細
胞への添加６時間後、15％グリセロールストックを使用
して、トラスフェクション効率を上昇させ、そして細胞
に、２％FCS、50mg/mlペニシリンＧ、10mg/ml硫酸スト
レプトマイシン、および0.25mg/ml fungizone（GIBCO,G
rand Island,NY）を含むDMEMにおいて、0.65％Noble寒
天を重層する。単層は、ウイルスプラークが出現するま
で、約10日間インキュベートされる。
これらのプラークを拾い、２％FCSを含むDMEMに懸濁
し、そして293細胞の新規な単層に感染させるために使
用する。細胞の90％以上が感染を示す場合、ウイルス溶
解物は、凍結／融解周期に供され、そしてこれを一次ス
トックと命名する。正しい構造を有する組換えウイルス
は、生産的に感染した293細胞からのウイルスDNAの調
製、制限分析、およびサザンブロッティングによって検
証される。続いて、二次ストックを、0.01の感染多重度
で293細胞を一次ウイルスストックに感染させ、そして
溶解するまでのインキュベーションによって作製する。
本発明の組換えアデノウイルスを増殖するのに使用し
た特定の細胞株は、本発明に重要ではない。組換えアデ
ノウイルスベクターは、例えば、ヒト293細胞におい
て、または条件付複製欠損アデノウイルス感染に許容的
な他の細胞株（例えば、条件付きの複製欠損ベクターに
おける欠損を相補するために、「イントランスで」アデ
ノウイルスE1遺伝子産物を発現するもの）において増殖
され得る。さらに、細胞は、プラスティック皿または懸
濁内容物のいずれかにおいて、それらのウイルスストッ
クを得るために増殖され得る。
ベクターが、動物被験体に送達されるためである場
合、好ましい方法は、アデノウイルスベクター構築物
を、静脈内または動脈内注射によって、天然またはバル
ーン損傷した平滑筋細胞を灌流する血管に経皮的に注入
することである（WO 9411506;Barrら、Gene Therapy,1
（１）:51〜58,1994;両方とも本明細書中で参考として
援用する）。外来DNAの送達の方法は、当該分野で公知
であり、例えば、リポソームにDNAを含ませること、お
よび調製物を動脈に注入すること（LeClercら、Circula
tion 85:543,1992、本明細書中で参考として援用す
る）、経胸部注射（Galら、Lab Invest.68:18〜25,199
3、本明細書中で参考として援用する）。送達の他の方
法は、外来DNAを含浸したポリマーでバルーンカテーテ
ルをコーティングする工程、および動脈硬化症の領域に
おいてバルーンを膨らませる工程、従ってバルーン血管
形成および遺伝子治療を組み合わせる工程を含み得る
（Nabelら、Cardiovascular Research,28:445〜455,199
4、本明細書中で参考として援用する）。
アデノウイルスベクター構築物の平滑筋細胞への送達
の後、その細胞は、生理学的条件下で、そしてアデノウ
イルスベクター構築物を心臓細胞に感染させるため、お
よび構築物に含まれるコード配列の細胞内発現のために
十分な期間維持される。生理学的条件は、平滑筋細胞の
生存に必要なものであり、そして温度、pH、重量モル浸
透圧濃度などの条件を含む。好ましい実施態様におい
て、温度は約20℃〜約50℃、より好ましくは約30℃〜約
40℃、およびさらにより好ましくは約37℃である。pH
は、好ましくは約6.0〜約8.0の値、より好ましくは約6.
8〜約7.8の値、そして最も好ましくは約7.4である。重
量モル浸透圧濃度は、好ましくは１リットルあたり約20
0ミリオスモル（mosm/L）から約400mosm/L、およびより
好ましくは約290mosm/L〜約310mosm/Lである。平滑筋細
胞生存度を確認するのに必要な他の生理学的条件は、当
該分野で周知である。
使用されるアデノウイルスベクターが複製欠損である
ので、究極的に感染される細胞において複製し得ないこ
ともまた注意されるべきである。さらに、アデノウイル
スのゲノム組込み頻度は、通常、相当低く、代表的に
は、約１％のオーダーであることが見い出されている。
従って、連続する処置が必要とされる場合、６カ月〜１
年ごとにウイルスを再導入することが必要であり得る。
それゆえ、これらの環境において、発現レベルが選択し
た間隔でモニターされる場合、長期治療を行うことが必
要であり得る。
アデノウイルスベクター構築物は、代表的には、生理
学的に受容可能なキャリアおよびアデノウイルスベクタ
ーを含む薬学的組成物の形態において送達される。この
ような組成物の有効な発現誘導量が送達される。本明細
書中で用いられるように、用語「有効な発現誘導量」
は、そのベクターに含まれるコード配列によってコード
される遺伝子産物の発現を達成するのに必要なウイルス
ベクター粒子の数を意味する。アデノウイルスベクター
構築物の有効な発現誘導量を決定するための手段は、当
該分野で周知である。有効な発現誘導量は、代表的に
は、約107プラーク形成単位（pfu）〜約1015pfu、好ま
しくは約108pfu〜約1014pfu、およびより好ましくは約1
09〜1012pfuである。
当該分野で周知のように、任意の特定の被験体につい
ての特定の用量レベルは種々の因子に依存し、これは、
アデノウイルスベクターの感染性、年齢、体重、一般的
な健康状態、性別、食餌、投与の時間、投与の経路、排
泄速度、および治療中の特定の疾患の重傷度を含む。
アデノウイルスがヒトを感染させるウイルスであると
いう点で、特定のアデノウイルスタンパク質に対する抗
体を発症している特定の個体が存在し得る。これらの環
境において、このような個体は、ウイルスに対する免疫
学的反応を発症することが可能である。従って、免疫学
的反応が可能であると考えられる場合、被験体を最初に
試験して、抗体の存在を決定することを所望し得る。こ
のような試験は、種々の受容可能な様式、例えば、単純
な皮膚試験を介して、またはアデノウイルス中性化抗体
の循環血液レベルの試験を介して実施され得る。実際、
このような環境下で、１×105〜１×106程度のウイルス
粒子のオーダーの試験用量を誘導することを所望し得
る。次いで、不都合な反応が見られない場合、用量は、
所望した投薬量が達成されるまでの期間にわたって、例
えば適切な等級のオーダーのますます増加する投薬量の
投与を介して、上昇され得る。
別の局面において、本発明は、生理学的に受容可能な
溶液または緩衝液に分散されたアデノウイルスベクター
遺伝子構築物を含み得る、薬学的組成物に関する。本発
明の組成物は、代表的には、標準的な、周知の、非毒性
での、生理学的に受容可能なキャリア、アジュバント、
および所望されるビヒクルを含む投薬量単位処方物にお
いて、非経口的に投与される。本明細書中で使用される
用語非経口的は、静脈内、筋肉内、動脈内注射、または
注入技術を含む。
注入剤調製物、例えば、滅菌注入水溶液または油性懸
濁物は、公知の分野に従って、適切な分散または湿潤剤
および懸濁剤を用いて処方される。滅菌注入可能調製物
また、非毒性の非経口的注入希釈剤または溶媒（例え
ば、1,3−ブタンジオールにおける溶液）において、滅
菌注入溶液または懸濁物であり得る。使用され得る受容
可能なビヒクルおよび溶媒に共通するのは、水、リンゲ
ル溶液、および等張塩化ナトリウム溶液である。さら
に、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として、慣
習的に使用される。この目的のために、任意の穏和な不
揮発性油が使用され得、これは、合成モノ−またはジグ
リセリドを含む。さらにオレイン酸のような脂肪酸は、
注入剤の調製において使用される。
好ましいキャリアは、リン酸塩、乳酸塩、Trisなどで
緩衝化した中性生理食塩水溶液を含む。もちろん、所望
でない夾雑物（例えば、アデノウイルス粒子またはエン
ドトキシンおよび他の発熱物質を阻害する欠損）を本質
的に含まないようにするのに十分なベクターを精製する
と、その結果ベクター構築物を受ける個体における不都
合な反応を全く生じない。ベクターを生成する好ましい
手段は、密度上昇勾配の使用（例えば、塩化セシウム勾
配遠心分離）を含む。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証す
ることが含まれる。以下の実施例において開示される技
術は、本発明者らによって発見された、本発明の実施に
十分機能する技術を表し、従って、実施のための好まし
い態様を構築すると考えられ得ることが、当業者によっ
て認識されるべきである。しかし、当業者は、本発明の
開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱せず
に、開示された特定の実施態様において多くの変更がな
され、そしてなお類似または同様の結果を得ることを認
識すべきである。以下の技術および物質は、他に示さな
い限りは、実施例の実施において使用された。
マウスSM22αcDNAクローンの単離 マウスSM22αcDNAのコード領域を、マウス子宮RNAお
よびラットSM22αcDNAの以前に公開された配列から構築
した合成の5'および3'オリゴヌクレオチドPCRTMプライ
マーを用いて、低ストリンジェンシーPCRTMを行うこと
によって単離した（Nishidaら、Gene,130:297〜302,199
3）。5'PCRTMプライマーを、5'EcoR I部位の付加を伴う
ラットSM22αcDNAの最初の34bpに同一であるように構築
した（5'ATCGAATTCCGCTACTCTCCTTCCAGCCC ACAAACGACCAA
GC 3'、配列番号10）。3'プライマーを、さらなる3'Hin
d III制限部位を伴うラットSM22αcDNAのbp759〜782の
逆向相補体を含むように構築した（5'ATCAAGCTTGGTGGGA
GCTGCCCATGTGCAGTC 3'、配列番号11）。PCRTM反応産物
を、他に記載される（ParmacekおよびLeiden,J.Biol.Ch
em.:264:13217〜13225,1989）のように、EcoR I/Hind I
II消化pGEM7Z（Promega.Madison,WI）にサブクローン化
した。マウスSM22αcDNAのヌクレオチド配列を、全長マ
ウスSM22αゲノムクローンの配列決定によって確認し
た。MacVector DNA配列決定ソフトウェア（Kodak/IBI,R
ochester,NY）を、DNA配列分析のために使用した。
SM22αcDNAの3'非翻訳領域を単離するために、オリゴ
−（dT）プライム化λgt11C2C12筋管cDNAライブラリー
からの５×105組換えクローンを、以前に記載のよう
に、［32P］標識化マウスSM22αcDNAプローブ（bp29〜8
11）でスクリーニングした（Parmacekら、Mol.Cell.Bio
l.,12:1967〜1976,1992）。12クローンを均質にまで精
製し、そして記載（Parmacekら、1992）のようなサザン
ロット分析によって分析した。２つの独立したクローン
（各々は、ポリ（Ａ）テイルを含んだ）を、EcoR I消化
pGEM72にサブクローン化し、そしてそれらのヌクレオチ
ド配列を決定した。5'非翻訳領域のヌクレオチド配列
を、SM22αゲノムクローンの配列から決定した。5'非翻
訳領域を、以下に記載のRNase保護およびプライマー伸
長分析に加えて、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンによってゲノムクローンに局在化させた。
マウスSM22αゲノムクローンの単離 マウス129SVλFIX IIゲノムライブラリー（Stratagen
e,LA Jolla,CA）からの約１×106組換えファージを、
［α−32P］dCTPで標識した783bpマウスSM22αcDNAプロ
ーブ（bp29〜811）でスクリーニングし、３つのポジテ
ィブクローンを、以前に記載（Parmacekら、1992）のよ
うに均質にまで精製した。１つのクローン（SM22−13
a）が、SM22α遺伝子の全体のコード領域および9kbの5'
隣接配列を含むことを見いだし、そして全ての続くサブ
クローニングおよび配列決定研究のために使用した。
サザンブロット分析 高分子量DNAを、以前に記載のように、129SV系統マウ
スの尾から調製した（Parmacekら、1992）。放射性標識
した783bpマウスSM22αcDNAプローブへのサザンブロッ
ティングおよびハイブリダイゼーションを、以前に記載
（Parmacekら、1992）のように行った。低ストリンジェ
ンシー洗浄条件は、２×SSC、0.1％SDS、50℃であっ
た。高ストリンジェンシー洗浄条件は、0.1×SSC、0.1
％SDS、68℃であった。
ノーザンブロット分析 組織を、以前に記載のように、12週齢129SVマウス（J
ackson Laboratories）から単離した（Parmacekら、198
9）。動物を、University of Chicago Laboratory Anim
al Medicine Veterinary FacilityにおけるNIH指針にし
たがって、収容し、そして世話した。RNAを、器官サン
プルから、そして初代ラット大動脈SMC、ラットSMC株A7
r5、ならびにマウスNIH 3T3細胞、マウスC3H10T1/2細
胞、サルCOS−７細胞、マウスC2C12筋芽細胞および筋
管、ヒトHepG2細胞、およびマウスEL−４細胞を含む非
平滑筋細胞株の培養から、単一工程のグアニジウムイソ
チオシアネートプロトコルによって調製した（Chomczyn
ski,Biotechniques,15:532〜537,1993）。ノーザンブロ
ットを、各株における28Sおよび18SリボソームRNAサブ
ユニットの定量を可能にするために、36mg/mlのエチジ
ウムブロマイドをRNA再懸濁緩衝液に添加したことを除
いて、以前に記載のように、１サンプルあたり10mgのRN
Aを用いて行った。プローブは、783bp（bp29〜811）マ
ウスSM22αcDNAおよび754bp（bp659〜1404）マウスカル
ポニンcDNAプローブを含んだ。定量画像分析を、Molecu
lar Dynamics PhosphorImager（Sunnyvale,CA）を用い
て行った。
プライマー伸長、5'RACE、およびRNase保護分析 SM22α遺伝子の塩基対＋80〜104の逆相補体を含むよ
うに構築した25マーのオリゴヌクレオチドプローブ（5'
TGCCGTAGGATGGACCCTTGTTGGC 3'、配列番号12）を、［γ
−32P］ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで5'末端
標識した。40mgのマウス子宮RNAを、２×106DPMの標識
したプローブにハイブリダイズし、そしてプライマー伸
張反応を、以前に記載のように、42℃、50℃、および56
℃にて行った（Parmacekら、1992）。5'RACEを、マウス
子宮RNAおよびマウスSM22αcDNAのbp234〜258に対応す
る合成アンチセンスcDNAプローブを用いて、製造業者の
説明書（Perkin Elmer,Norwalk,CT）に従って行った。R
Nase保護分析を、合成3'Hind IIIリンカーを含む−441
〜＋41マウスSM22αゲノムサブフラグメントを、Pst I/
Hind III消化pGEM4Zにサブクローニングし、そしてbp−
88〜＋44に対応するアンチセンスcRNAプローブを得るた
めに、Nco I線状化プラスミド（ゲノムクローンのbp−8
8でのNco I切断）のT7ポリメラーゼとのゲノムサブフラ
グメントのアンチセンス鎖のインビトロ転写を行うこと
によって行った。Hind IIIリンカーは、SM22αcDNAとの
配列同一性を共有し、SM22αゲノムクローンのbp＋44
（＋41ではない）で開始される配列同一性を有するcRNA
プローブを生じる。142bpローブを、［α−32P］UTPで
標識し、そしてRNase保護分析を、RPAIITMキット（Ambi
on,Austin,TX）を用いて、製造業者の説明書に従って行
った。α−［32P］UTPの取り込みによって放射性標識し
たアンチセンスcRNAプローブを、インビトロ転写によっ
て、線状化pBluescriptIIKST7−lacZ（T7 RNAポリメラ
ーゼプロモーターの上流にlacZ遺伝子を含む）から、Ma
xiScriptTMキット（Ambion,Austin,TX）を用い合成す
る。バンド強度を、上記のサザン分析について以前に記
載したようにPhsphorImagerTMによって定量する。
細胞培養 胚性胸大動脈に由来するラット細胞株A7r5を、10％ウ
シ胎児血清（GIBCO）および１％ペニシリン／ストレプ
トマイシンを補充したDulbecco's Modified Essential
Media（GIBCO）において増殖させた。ヒト肝細胞性ガン
細胞Hep G2を、10％ウシ胎児血清および0.1mM MEM非必
須アミノ酸（GIBCO）を補充したModified Eagle's Medi
um（GIBCO）において増殖させた。マウスリンパ腫由来E
L4細胞を、10％ウマ胎児血清（GIBCO）補充したDulbecc
o's modified Eagle Media（GIBCO）において増殖させ
た。マウスNIH 3T3細胞、C3H10T1/2細胞、C2C12筋芽細
胞、および筋管を、以前に記載のように増殖させた（Pa
rmacekら、J.Biol.Chem.,265:15970〜15976,1990;Parma
rkら、Mol.Cell.Biol.,14:1870〜1885,1994）。ラット
大動脈SMCの初代培養物を、以前に記載の方法を用いて,
12〜16週齢のSprague Dawleyラット（Charles River La
boratories,Wilmington,MA）から単離した（Chanら、Sc
ience,1995a）。実際に、この方法を用いて単離した全
ての細胞は、抗平滑筋アクチンモノクローナル抗血清で
陽性に染まる。全ての研究において、初期継代（２また
は３継代）ラット大動脈SMCのみが有用であった。細胞
周期分析のために、第３継代からのSMCを、以前に記載
のように（Changら、1995a）、G0/G1において細胞を同
調させるために、無血清培地（50％Dulbecco最小必須培
地（DMEM）、50％Ham's F−12、Ｌ−グルタミン（292mg
/ml）、インシュリン（5mg/ml）、トランスフェリン（5
mg/ml）、亜セレン酸（5ng/ml））に、72時間配置し
た。72時間の血清飢餓に続いて、細胞を刺激して、45％
DMEM、45％Ham's F−12、および10％FBSを含む培地中で
のインキュベーションによって増殖させた。マウスWEHI
Ｂ細胞およびマウス70Z/3プレＢリンパ球を、以前に記
載のように増殖させた（Morriseyら、Dev.Biol.,177:30
9〜322,1996）。
DNase Iフットプリンティング 核抽出物を、平滑筋細胞株A7r5（これは高レベルのSM
22αmRNAを発現する（Solwayら、1995））およびNIH 3T
3細胞から、以前に記載のように調製した（Parmacek
ら、1992）。482bp SM22αプロモーターを架橋する３つ
の重複ゲノムサブフラグメント（bp−441〜−256、bp−
256〜−89、およびbp−89〜＋41）を分析した。DNase I
フットプリント分析を、以前に記載のように（Parmacek
ら、1994）、平滑筋細胞株A7r5、またはNIH 3T3、なら
びにマウスSM22αプロモーターの末端標識センスおよび
アンチセンス鎖から調製した100〜150mgの核抽出物で行
った。標準的なMaxamおよびGilbert（Ｇ＋Ａ）配列決定
反応を、保護化配列を同定するのと平行して行った。
電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA） 核抽出物を、Dignamら、Nucleic Acids Res.11:1475,
（1983）によって記載されるように、低継代数の原発生
ラット大動脈SMC、A7r5細胞、NIH 3T3細胞、C3H10T1/2
細胞、C2C12筋管、WEHI、70Z/3、およびEL4細胞から調
製した。EMSAを、以前に記載のように（Ipら、Mol.Cel
l.Biol.,14:7517〜7526,1994）0.25×TBE（１×TBEは、
100mM Tris、100mMホウ酸、および2M EDTAである）にお
いて行った。以下の相補的オリゴヌクレオチド（DNase
Iフットプリント分析によって同定された核タンパク質
結合部位または同定された特異的変異（変異したヌクレ
オチドは下線を付す）を含む核タンパク質結合部位の各
々に対応する）を、BamH IおよびBg III突出末端ととも
に合成した： 非放射性競合研究のために、５〜100ngの非標識競合
オリゴヌクレオチドを、結合反応混合物中でインキュベ
ートした。抗体スーパーシフト研究のために、以前に記
載のように（Ipら、1994）、１μｌの免疫前ウサギ、ア
フィニティ精製したウサギまたはマウスIgG（Santa Cru
z）、α−SRFウサギポリクローナル抗血清（Santa Cru
z,sc−355X）、α−Sp1ウサギポリクローナルIgG（Sant
a Cruz,sc−059X）、α−YY1ウサギポリクローナルIgG
（Santa Cruz,sc−281X）、α−CREB−１マウスモノク
ローナルIgG2（Santa Cruz,sc−271）、α−ATF−１マ
ウスモノクローナルIgA（Santa Cruz,sc−243）、α−A
P2ウサギポリクローナルIgG（Santa Cruz,sc−184X）、
またはα−GATA−４ウサギポリクローナルIgG（Ipら、1
994）のいずれかを、結合反応前に、示された核酸抽出
物とともに、４℃にて20分間、インキュベートした。
プラスミド SM22αプロモーター内の同定した６つの核タンパク質
結合部位の各々の機能を評価するために、以前に記載の
ように（Morriseyら、1996）、一連のSM22α変異体プロ
モーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドを、PC
RTM媒介部位特異的変異誘発によって作製した。ラウス
肉腫ウイルス（RSV）LTR駆動ルシフェラーゼレポーター
プラスミドpRSVLおよびpMSVβgal参照プラスミドは、以
前に記載されている（Parmacekら、1992）。プロモータ
ーレスpGL2−Basicプラスミド（Promega,Madison,WI）
は、本明細書中に記載のルシフェラーゼレポータープラ
スミドの全てについてのクローニング中心として提供さ
れた。ｐ−5000/I1SM22lucプラスミドは、5kbのSM22α
5'隣接配列非翻訳SM22α第１エキソン、SM22α第１イン
トロン、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子の5'を
サブクローン化したSM22α遺伝子のエキソン２の最初の
12bを含む。8.5kb BamH I/Hind III SM22αゲノムサブ
フラグメント（5kbの5'隣接配列、エキソン１、および
3.5kbのイントロン１を含む）を、まずBgl II/Hind III
消化pGL−Basicベクターにサブクローン化することによ
って構築した。次に、488bp PCRTM作製されたHind III
連結SM22αゲノムサブフラグメント（その5'末端で、SM
22αイントロン1Hind III制限部位を含み、そしてSM22
αcDNAのbp＋76（これは12bpのエキソン２を含む）へ連
続する）を、Hind III消化ベクターにサブクローン化
し、そしてその正確な配向（ルシフェラーゼレポーター
遺伝子に関して5'から3'）を、DNA配列分析によって確
認した。ｐ−5000SM22lucプラスミド（ルシフェラーゼ
レポーター遺伝子の5'をサブクローン化した5kbのSM22
α5'隣接配列を含む）を、BamH I/EcoR I SM22αゲノム
サブフラグメント（bp−5000〜−2800に対応する）を、
BamH I/EcoR I消化pBluescriptIIKS（Stratagene,La Jo
lla,CA）に最初にサブクローン化することによって構築
した。次に、bp−1338〜−89に対応する1250bp EcoR I/
Nco I SM22αゲノムサブフラグメント、およびbp−88
（その5'末端でNco I部位を含む）〜＋41（その3'末端
でHind IIIリンカーを含む）を含む130−bp PCRTMサブ
フラグメントを、EcoR I/Hind III消化ベクターに連結
した。次いで、1.4kb EcoR I SM22αゲノムサブフラグ
メント（bp−2800〜−1339に対応する）を、EcoR I消化
プラスミドにサブクローン化し、そしてその配向を、DN
A配列分析によって確認した。最後に、bp−５〜＋41に
対応する得られたSM22αゲノムサブフラグメントを、Ba
mH IおよびHind IIIとともにBluescriptファージミドか
ら切り出し、そしてBgl II/Hind III消化pGL2−Basicに
サブクローン化した。pGL2−Basicベクターにおいてル
シフェラーゼレポーターの5'をサブクローン化した1379
bp SM22αゲノムサブフラグメント（bp−1338〜＋41）
を含むｐ−1338SM22αlucプラスミドを、1250bp EcoR I
/Nco I SM22αゲノムサブフラグメント（bp−1338〜−8
9）および本明細書中に記載の130bp（bp−88〜＋41）PC
RTM作製ゲノムサブフラグメントを用いて構築した。ｐ
−441SM22lucプラスミドは、Bgl II/Hind III消化pGL2
−Basicプラスミドにサブクローン化された482bp（bp−
441〜＋41）Pst I/Hind III SM22αゲノムサブフラグメ
ントを含む。ｐ−300SM22lucおよびｐ−162SM22lucルシ
フェラーゼレポータープラスミドは、それぞれ、Xho I/
Hind III消化pGL2−Basicベクターにサブクローン化さ
れた、PCRTM作製bp−300〜＋41、および−162〜＋41 SM
22αゲノムサブフラグメント（合成Xho I（5'末端）お
よびHind III（3'末端）リンカーを含む）を含む。全て
のPCRTM作製ゲノムサブフラグメントを、ジデオキシDNA
配列分析によって確認した。
以下のSM22α変異プロモーター−ルシフェラーゼレポ
ータープラスミドを作製し、そして変異したプロモータ
ー内の特定の核タンパク質結合部位（単数または複数）
にしたがって命名した（各核タンパク質結合部位内の変
異したヌクレオチドに下線を付す）： さらに、いくつかのSM22αプロモーター−ルシフェラ
ーゼレポータープラスミドを、SM22αプロモーター配列
における２つのシス作用性配列において変異を含むよう
にサブクローン化した。ｐ−441SM22μCArGは、SME−１
およびSME−４部位において、上記の変異を含み、そし
て、ｐ−441SM22μSME2/5は、SME−２およびSME−５部
位において、上記の変異を含む。各PCRTM作製SM22αプ
ロモーター変異を、以前に記載のように（Parmacekら、
1992）、DNA配列分析によって確認した。
インビホでSM22α遺伝子の発現を制御する機能的に重
要なシス作用性エレメントを同定するために、各々が、
天然または変異SM22αプロモーターフラグメントの転写
制御下で細菌lacZレポーター遺伝子をコードする４つの
トランスジェニックベクターをクローン化した。ｐ−50
00SM22−lacZ、ｐ−441SM22−lacZプラスミド、ｐ−441
SM22μCArG−lacZ、およびｐ−280SM22−lacZプラスミ
ドは、それぞれ、5kb SM22αプロモーター、441bp SM22
αプロモーター、SME−１およびSME−４（SRFの結合を
無効にする）において変異を有する441bp SM22αプロモ
ーター、ならびに280bp SM22αプロモーターを含み、改
変したpBluesucript IIKS（Stratagene）プラスミド中
に、細菌lacZレポーター遺伝子の5'の直後にサブクロー
ン化した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ １×106継代の３つの初代ラット大動脈SMC、C2C12筋
管、およびA7r5細胞を、以前に記載のように（Parmacek
ら、1992;Ipら、1994;Solwayら、1995）、それぞれ、ト
ランスフェクションの前に24時間分割およびプレーティ
ングし、そして50または100μｇのLipofectin試薬（Lif
e Technologies,Gaithersburg,MD）、15μｇのルシフェ
ラーゼレポータープラスミド、および５μｇのpMSVβga
l参照プラスミドでトランスフェクトした。１×106NIH
3T3またはCOS−７を、以前に記載のように（Ipら、199
4;Forresterら、J.Am.Coll.Cardiol.,17:758〜769,199
1）、20μｇのいずれかのLipofectin試薬、15μｇのル
シフェラーゼレポータープラスミド、および５μｇのpM
SVβgal参照プラスミドを用いてトランスフェクトし
た。１×106Hep G2細胞を、360μｇのLipofectamine試
薬（Life Technologies,Gaithersburg,MD）、26μｇの
ルシフェラーゼレポータープラスミド、および９μｇの
pMSVβgal参照プラスミドでトランスフェクションし
た。トランスフェクション後に、細胞溶解物を調製し、
タンパク質成分およびルシフェラーゼについて正規化
し、そしてβガラクトシダーゼアッセイを、以前に記載
のように行った（Parmacekら、1992）。全ての研究を、
少なくとも３回繰り返して、再現性を想定し、そして標
準誤差の計算を可能した。ルシフェラーゼ活性（光単
位）を、トランスフェクション効率における変化につい
て、細胞抽出物をβガラクトシダーゼ活性についてアッ
セイすることによって決定したように補正した。データ
を、正規化光単位±S.E.M.として表す。
トランスジェニックマウス トランスジェニックマウスを、以前に記載の標準的な
方法に従って、ｐ−5000SM22−lacZ、ｐ−441SM22−lac
Z、ｐ−441SM22μCArG−lacZ、およびｐ−280SM22−lac
Zトランスジーンを有するように産生した（Metzgerら、
Proc.Natl.Acad.USA,90:9036,1993）。トランスジェニ
ック基礎マウスを同定するために、サザンブロット分析
を、放射性標識化lacZプローブを用いて行い、そして高
分子量DNAを、各潜在的な基礎マウスの尾の生検から調
製した。１細胞あたりのコピー数を、ハイブリダイゼー
ションシグナル強度（DPM）を１、10、および100コピー
／細胞に対応する標準と比較することによって、Molecu
lar Dynamics PhosphorImagerTMを用いて定量した。各
トランスジーンを含む少なくとも４つの独立した基礎系
統を、以前に記載のように同定した（ParmacekおよびLe
iden,1989）。全体のマウント胚の固定の間に、0.02％N
P−40をPBSに添加した以外は以前に記載のように（Lin
ら、Circulation,82:2217〜2221,1990）、トランスジェ
ニック胚（ED15.5未満）および成体マウスからの組織切
片を固定し、βガラクトシダーゼ活性について染色し、
そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。
さらに、βガラクトシダーゼ活性についての染色に続い
て、マウス胚の動脈系を視覚化するために、胚を、メタ
ノール中で24時間脱水し、そして2:1（v/v）ベンジルベ
ンゾエート：ベンジルアルコール中で２時間清澄化し
た。
実施例１ マウスSM22αcDNAの単離および構造的特徴付け マウスSM22αcDNAクローンを、ラットSM22αcDNAの以
前に公開された配列（Nishidaら、1993）に由来する合
成オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、ポリ
メラーゼ連鎖反応を用いて単離した。全長マウスSM22α
cDNAのヌクレオチド配列を、本明細書中で配列番号８と
称する。マウスSM22αcDNAは、201アミノ酸ポリペプチ
ド（配列番号９）をコードし、22.5kDaの推定分子量を
有する。76bp 5'未翻訳領域、603bpオープンリーディン
グフレーム、および403bp 3'未翻訳領域から構成され
る。ポリ（Ａ）テイルの5'の23塩基対は、ポリアデニル
化シグナルとして機能し得るA/Tリッチ配列（AATATA）
が存在する。
マウスおよびヒトSM22αcDNAのコード配列の比較（Sh
anahanら、1993）は、２つの配列が、ヌクレオチドおよ
びアミノ酸レベルで、それぞれ91％および97％同一であ
ることを実証した。さらに、マウスSM22αcDNAとマウス
平滑筋細フィラメント調節タンパク質であるカルポニン
（Strasserら、Genbank登録番号Z19542,1992）とのコー
ド配列の比較は、これら２つの配列が、アミノ酸レベル
で23％同一であり、かつ32％保存されていることを実証
した。興味深いことに、マウスSM22αcDNAによってコー
ドされるタンパク質配列は、全体のcDNAにわたって、Dr
osophila筋タンパク質mp20の配列（Lees−Millerら、J.
Biol.Chem.,262:2988〜2993）と部分的に配列同一性を
示し、これは、これらの２つのタンパク質が、通常の祖
先遺伝子から進化していることを示す。２つのドメイン
は、これらのタンパク質の間で、特に十分に保存されて
いた。14/19アミノ酸同一性（マウスSM22αタンパク質
のアミノ酸104〜122に対応する）を有するドメインは、
EFバンド高次構造において配向されるカルシウム結合ド
メインを示し得る（Kretsinger,CRC Crit.Rev.Bioche
m.,8:119〜174,1980）。13/24アミノ酸同一性（マウスS
M22αタンパク質のアミノ酸158〜181に対応する）を有
する第２のＣ末端保存ドメインは、未知の機能ドメイン
である。
SM22αは単一コピー遺伝子によってコードされる EFハンド高次構造において配向される推定カルシウム
結合ドメインの知見は、SM22αが、細胞内カルシウム結
合タンパク質のトロポニンＣスーパー遺伝子ファミリー
（低／心臓トロポニンＣ、速骨格トロポニンＣ、カルモ
ジュリン、ミオシン軽鎖、およびパルブアルブミンを含
む）（Kretsinger,1980）の他のメンバーに関連し得る
ことを示唆した。SM22αが、マウスゲノムにおいて単一
コピー遺伝子によってコードされるかどうか、そしてSM
22αが、他のトロポニンＣスーパー遺伝子ファミリーメ
ンバーに関連するかどうかを決定するために、マウスSM
22αcDNAを使用して、高および低ストリンジェンシーの
両条件下でマウスゲノムDNAを含むサザンブロットをプ
ローブした。高ストリンジェンシー条件下では、マウス
SM22αcDNAローブは、１つまたは２つのBamH I、EcoR
I、Hind III、Pst I、およびXba Iバンドにハイブリダ
イズし、これは、SM22αが、マウスゲノムにおいて、単
一コピー遺伝子であることを示唆した。興味深いこと
に、低ストリンジェンシー条件下では、さらなるバンド
は実証されず、これは、SM22α遺伝子は、あるEFバンド
カルシウム結合ドメインを有し得るが、トロポニンＣス
ーパー遺伝子ファミリーの他のメンバーに密接に関連し
ないことを示唆した。
実施例２ SM22α遺伝子の発現 以前の研究により、SM22αタンパク質が、成体の平滑
筋含有組織において単独で発現され、そして平滑筋細胞
結合の最も初期のマーカーの１つであり得ることが示唆
された（Gimonaら、Eur.J.Biochem.,205:1067〜1075,19
92:Dubandら、Differentiation,55（１）:1〜11,1993;N
ishidaら、1993）。SM22α遺伝子発現のインビボでのパ
ターンを決定するために、SM22αcDNAを、12週齢マウス
の組織から調製したRNAを含むノーザンブロットにハイ
ブリダイズさせた。マウスSM22αcDNAプローブは、約1.
2kbの１つの優勢なmRNA種にハイブリダイズした。SM22
αmRNAは、大動脈、小腸、肺、脾臓、および子宮の平滑
筋含有組織において、高レベルで発現される。さらに、
延長したオートラジオグラフィー曝露は、非常に低いレ
ベルであるが、検出可能なレベルのSM22αmRNAを、心
臓、腎臓、骨格筋、および胸腺において示した。
SM22α遺伝子発現の細胞特異性を決定するために、SM
22αcDNAプローブを、ラット大動脈血管SMC、ラットSMC
株A7r5、マウスNIH 3T3およびC3H10T1/2線維芽細胞、SV
40形質転換サル腎臓細胞株COS−７、マウスC2C12筋芽細
胞および筋管、ヒト腎臓細胞ガン細胞株Hep G2、ならび
にマウスリンパ球細胞株EL4から調製されたRNAを含むノ
ーザンブロットにハイブリダイズした。高レベルのSM22
αmRNAを、初代ラット大動脈血管SMCおよび平滑筋細胞
株A7r5において検出した。mRNAの第２の1.5kb種の検出
は、SM22αプローブのマウスカルポニンmRNAへのクロス
ハイブリダイゼーションを示す。さらに、SM22αmRNA
は、未分化のC2C12筋芽細胞および最終分化したC2C12筋
芽細胞の両方において発現された。最後に、微かなハイ
ブリダイゼーションシグナルを、NIH 3T3、C3H10T1/2、
およびHep G2細胞において、オートラジオグラフィー曝
露の３日後に検出し得た。これらの低レベルのハイブリ
ダイゼーションシグナルの定量PhosphorImagerTM分析
は、SM22αmRNAが、これらの３つの非筋形成細胞株にお
いて、A7r5および初代SMCにおけるSM22α遺伝子発現の
強度の1.5％未満で発現されることを示した。従って、
初代SMCおよびSMC株に加えて、SM22αmRNAは、C2C12筋
芽細胞および筋管のような他の胎児性骨格筋細胞系統に
おいて発現されるが、他の非筋形成細胞系統においては
発現されない。
SM22αは細胞周期静止したSMCおよび増殖SMCの両方にお
いて発現される 動脈壁の中膜内において、血管SMCの大部分は、非増
殖停止状態に維持され、そして収縮タンパク質を発現す
る（Owensら、1986;Rovnerら、1986;Taubmanら、1987;U
ekiら、1987;Gimonaら、1990;Shanahanら、1993;Ross,N
ature,362:801,1993;Forresterら、1991）。しかし、血
管損傷に対する応答において、SMCは、中膜から内膜層
に移動し、増殖し、そして「合成表現型」をとる（Ros
s,1986;Schwartzら、1986;Zanellatoら、1990;Ross,199
3;Forresterら、1991;Schwartzら、1992;Liuら、198
9）。以前の研究により、血管SMC収縮タンパク質をコー
ドする多くの遺伝子が、このプロセスの間にダウンレギ
ュレートされることが実証された（Owensら、1986;Rovn
erら、1986;Uekiら、1987;Gabbianiら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78:298,1981）。従って、SM22α遺伝子は、
その発現が細胞周期を介する進行の間、差次的に調節さ
れない点で、独特であり得る。この問題に取り組むため
に、低継代数の初代ラット大動脈SMCの培養物を、72時
間の血清飢餓鎖によって細胞周期のG0/G1に同調させ
た。FACS分析により、これらの条件下で約90％の細胞
が、G0/G1に静止されることが示された（Changら、1995
a）。次いで、細胞を血清刺激し、そしてRNAを、血清刺
激時（t0）ならびに刺激後８時間、12時間、16時間、お
よび24時間に複製培養から調製した。血清刺激後、停止
した血管SMCは、約12時間で細胞周期のG1/Sチェックポ
イントを通過し始め、そして刺激後24時間までに、50％
以上の細胞が、細胞周期のＳおよびG2/M期にある（Chan
gら、1995a）。ノーザンブロット分析は、ハイブリダイ
ゼーションシグナルの定量的PhosphoroImageTM分析によ
って評価されるように、細胞周期停止したSMC対増殖SMC
において、SM22α遺伝子発現における差異を示さなかっ
た。従って、他の平滑筋短縮タンパク質（例えば、平滑
筋ミオシン重鎖（Rovnerら、1986）、平滑筋α鎖（Owen
sら、1986）、およびカルポニン）とは対称的に、SM22
αは、静止状態および増殖する血管SMCの両方におい
て、高レベルで構成的に発現されるようである。
実施例３ SM22αゲノムクローンの単離および構造特徴付け 20kbの全長マウスSM22αゲノムクローンを、高ストリ
ンジェンシー条件下でSM22αcDNAプローブを用いてマウ
ス129SVゲノムライブラリーをスクリーニングすること
によって単離した。エキソンを、特異的cDNAフラグメン
トとのハイブリダイゼーションによって同定し、そして
その境界をDNA配列分析によって確認した。ゲノムクロ
ーンの核酸配列を、本明細書中で配列番号１（エキソン
１を含む）、配列番号２（エキソン２、３、および４を
含む）、および配列番号６（エキソン５を含む）と称
す。配列番号１と配列番号２との間には約4kbのギャッ
プ、ならびに配列番号２と配列番号６との間には約450
ベースのギャップが存在する。アミノ酸配列は、エキソ
ン２、３、および４によってコードされ、そして本明細
書中で配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配
列番号７と称す。マウスSM22α遺伝子は、ゲノムDNAの
6.2kbにわたる５つのエキソンからなる。
SM22α遺伝子の転写開始部位を、RNase保護、プライ
マーエクステンション、および5'RACE PCRTM分析によっ
て同定した。SM22αcDNAの80〜104bpに対応するアンチ
センス合成オリゴヌクレオチドを利用するプライマーエ
クステンション分析は、56℃までの反応温度で産生され
た104bp（矢印）の主要な伸長産物を生じた。さらに、
5'RACE PCRTMを、SM22αcDNAの234〜258bpに対応するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行
った。８つのランダムな5'RACEクローンのDNA配列分析
は、８つのうちの７つのクローンにおける開始コドンの
5'の76bpの転写開始部位および８つのうちの１つのクロ
ーンにおける開始コドンの5'の72bpを明らかにした。RN
ase保護分析をまた、DNA配列およびサザンブロット分析
によって推定されるような、SM22αゲノム配列の−88〜
＋44bpに対応するアンチセンスcDNAプローブを用いて行
った。これらの分析は、開始コドンの5'の76bpの転写開
始部位に対応する44bp（矢印）の主要な保護フラグメン
トを示した。さらに、54bpの第２の微量な（20％相対シ
グナル強度）保護フラグメントもまた示された。まとめ
ると、これらのデータは、開始コドンの5'の76bpのマウ
スSM22α遺伝子の主要な転写開始部位の同定を可能にし
た。
SM22α遺伝子の完全なコード配列および1339bpの5'隣
接鎖を決定し、そして各々のスプライス接合部は、Brea
thnachおよびChambonによって記載されるような、コン
センサススプライスドナー−受容体パターンに一致する
（Breathnachら、Annu.Rev.Biochem,50,349〜383,198
1）。潜在的な転写調節エレメントを同定するために、
キャップ部位に隣接する5'配列の1339bpを、MacVector
DNA配列決定ソフトウェア（Kodak/IBI）を用いて、種々
の転写調節エレメントについて検索した。ヌクレオチド
配列TTTAAA（これはTATAボックスとして機能し得る）
は、開始部位の5'の29bpに存在した。コンセンサスCAAT
ボックスは、SM22α遺伝子のすぐ隣りの5'の隣接領域で
は同定されなかった。以前に記載された筋特異的および
／または骨格もしくは心臓筋結合制限転写調節エレメン
トについてのコンピューター相同性検索は、−534、−5
77、−865、−898、−910、および−1267bpに位置する
５つのコンセンサスＥボックス/bHLH筋形成転写因子結
合部位（CANNTG（Olson,Genes Dev.,4,1454〜1461,199
0;Tapscottら、J.Clin.Invest.,87:1133〜1138,1991;La
ssarら、Cell,58（５）:823〜31,1989））、−504、−8
28、−976bpに位置する３つのコンセンサスGATA−４結
合部位（WGATAR（Evansら、Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）,85:5976〜5980,1988））、および−407bp（TTtAAAA
TcG、配列番号14、小文字はコンセンサスMEF−２配列か
らのミスマッチを示す）および−770（TTcAAAATAG、配
列番号15）に位置する２つのATリッチな潜在的MEF−2/r
SRF結合部位（YTAWAAATAR、配列番号13（Gossettら、Mo
l.Cell.Biol.,9:5022〜5033,1989）を示した。さらに、
以前に特徴づけられている骨格および心臓特異的転写調
節エレメントにおいて同定されている機能的に重要な核
タンパク質結合部位は、−150および−273bpに位置する
２つのコンセンサスCArG/SRF結合部位（Mintyら、Mol.C
ell.Biol.,6:2125,1986）、および−104bpに位置する１
つのCACCボックス（Dierksら、Cell,32:695〜706,198
3）を含んでいた。最後に、４つのAP2（CCCMNSSS、配列
番号16（Mitchellら、Cell,50:847〜851,1987））、１
つのSP1（KRGGCKRRK、配列番号17（Dynanら、Cell,35:7
9〜87,1983））、および２つのNF−IL6（TKNNGNAAK、配
列番号18（Akiraら、EMBO J,9（６）:1897〜906,Cell,3
5:79〜87,1990））結合部位は、5'隣接領域に位置し
た。
実施例４ SM22α遺伝子発現を制御するシス作用性転写調節エレメ
ントの同定 SMCにおけるSM22α遺伝子の転写を調節する機能的に
重要なシス作用性配列を同定するために、一連の一過性
トランスフェクションを、SM22αルシフェラーゼレポー
ター構築物、ならびに初代ラット大動脈血管SMCおよびS
MC株A7r5（その両方が、高レベルのSM22αmRNAを発現す
る）を用いて行った。A7r5細胞のプラスミドｐ−5000/I
1SM22luc（5kbの5'隣接配列および全体の4kb SM22αイ
ントロン１配列（開始コドンはエキソン２に位置する）
を含む）でのトランスフェクションは、プロモーターを
含まないコントロールプラスミドpGL2−Basicと比較し
て、ルシフェラーゼ活性において250〜300倍の誘導を生
じた。このレベルの転写活性を、RSV含有ルシフェラー
ゼレポータープラスミドpRSVLとのA7r5細胞のトランス
フェクションの後に得られるものに匹敵した。この転写
活性が、SM22α遺伝子のすぐ隣の5'隣接領域に起因する
かどうか、あるいはSM22α遺伝子の最初のイントロン内
に位置する転写調節エレメントに起因するかどうかを決
定するために、ｐ−5000/I1SM22lucとｐ−5000SM22luc
プラスミドとの活性を比較した。Ｐ−5000SM22lucプラ
スミド（5kbの5'隣接領域のみを含む）でのA7r5細胞の
トランスフェクションは、ｐ−5000/I1SM22lucプラスミ
ドで得られるレベルに匹敵する（モルベースで）ルシフ
ェラーゼ遺伝子の高レベルの転写を生じた。従って、SM
22α遺伝子の5'隣接領域は、A7r5細胞において高レベル
の転写を必要とするシス作用性エレメントを含む。
SMCにおける高レベルの発現を指向するSM22α遺伝子
の5'隣接エレメントをさらに限局化するために、一連の
5'欠損変異体を、A7r5細胞および初代培養されたラット
大動脈血管平滑筋細胞の両方にトランスフェクトした。
A7r5細胞および初代血管SMCの両方において、ｐ−441SM
22lucプラスミド（441bpの5'隣接配列を含む）は、ｐ−
5000SM22lucプラスミドおよびｐ−1338SM22lucプラスミ
ドに匹敵するレベルにまでルシフェラーゼレポーターの
転写を増大した。しかし、A7r5細胞および初代血管SMC
のルシフェラーゼレポータープラスミドｐ−300M22luc
およびｐ−162SM22luc（それぞれ、5'隣接配列の300bp
および162bpを含む）両方での転写は、ｐ−441SM22luc
で得られたものと比較して、基準化したルシフェラーゼ
活性において、50％および90％の減少を生じた。これら
のデータは、441bpのSM22α5'隣接配列（内因性SM22α
プロモーターを含む）は、A7r5細胞および初代ラット大
動脈SMCの両方において高レベルの転写活性を指向する
のに十分であることを実証した。
実施例５ SM22αプロモーターの細胞特異性 SM22αプロモーター配列の細胞特異性を特徴づけるた
めに、プラスミドｐ−441SM22lucを含む441bp−SM22α
プロモーターの転写活性を、初代ラット大動脈SMC、平
滑筋細胞株A7r5、NIH 3T3線維芽細胞、COS−７、および
Hep G2細胞において、ラウス肉腫ウイルスLTRを含むポ
ジティブコントロールプラスミドpRSVLと比較した。こ
れらの細胞株において実証されたSM22αmRNA発現の系統
制限パターンに一貫して、プロモーター含有プラスミド
ｐ−441SM22lucは、初代ラット大動脈SMCおよびA7r5細
胞において活性であり、プロモーター非含有pGL−Bsic
プラスミドでのトランスフェクションによって誘導され
たもの上回って、それぞれ約2500倍および540倍、ルシ
フェラーゼレポーター遺伝子の転写を増大した（図
１）。このレベルのプロモーター活性を、RSV LTR駆動
ポジティブコントロールプラスミドでのこれらの細胞の
トランスフェクションで得られるレベルと匹敵した（図
１）。対照的に、441bp SM22αプロモーターは、NIH 3T
3、COS−７、およびHep G2細胞において不活性であった
（図１）。
DNA配列分析により、この441bpプロモーターが、２つ
のCArG/SRFボックス（Mintyら、1986）、CACCボックス
（Dierksら、1983）、および１つのA/Tリッチ潜在的MEF
−2/rSRF結合部位（Gossettら、1989）、シス作用性エ
レメントを含むことを明らかにした。これらは、骨格お
よび心臓筋特異的遺伝子発現を調節する転写プログラム
に関与することが実証されている。しかし、骨格筋特異
的転写調節エレメントのほとんどの以前の記載とは異な
り、この配列は、筋形成bHLH転写因子についての正準な
Ｅボックス結合部位を欠如する（Tapscottら、1991;Las
sarら、1989）。従って、内因性441bp SM22αプロモー
ターは、インビボで実証された、SM22α遺伝子発現の平
滑筋系統制限パターンを再利用するのに必要とされるシ
ス作用性配列エレメントの全てを含む。
実施例６ SM22α−βgalトランスジェニックマウスの作製 レポーター構築物を、441bp最小SM22αプロモーター
を、細菌性βガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の5'のす
ぐ隣にサブクローン化することによって、初めに調製し
た。トランスジェニックベクターを、ポリリンカー配列
に隣接するAsc 制限部位を含むpBluescript−KSファー
ジミドから作製した。この構築物を、本明細書中で、44
1SM22lacZと称する。移入遺伝子を、Metzgerら、1993
（本明細書中に参考として援用する）において記載され
るように、偽妊娠宿主に移植した卵母細胞にマイクロイ
ンジェクトした。トランスジェニック基礎マウスを同定
するために、サザンブロット分析を、放射性標識したla
cZプローブ、および各々の潜在的な基礎仔の尾の小片か
ら調製した高分子量DNAを用いて行った。放射性標識し
たlacZ cDNAプローブは、分析した17仔のうちの４仔の
予測した4.2kb BamH I消化バンドにハイブリダイズし
た。Molecular Dynamics PhosphorImagerTMを用いて、
ハイブリダイゼーションシグナル強度（DPM）を、１細
胞あたり１、10、および100コピーに対応する標準と比
較することによって評価した場合、４匹の基礎仔は、１
細胞あたり５〜160コピーを含んだ。
F1−441SM22lacZ＃14雄を、CD−１雌と交配させ、そ
してこの同腹仔からE11.5胎仔を単離し、遺伝子型分類
し（PCRTMを用いて）、固定化し、そしてβガラクトシ
ダーゼ活性について染色した。トランスジェニック胎仔
を、これらの非トランスジェニック同腹仔から、これら
の遠位体節に沿って染まる明白な青色によって容易に区
別した。このパターンは、発生中の体節において観察さ
れるSM22α遺伝子発現の一過性パターンと相関関係にあ
った。ED11.5胎仔において、内因性SM22α遺伝子は、原
始心臓管、発生中の体節、背側大動脈、および形成中の
分岐動脈の全体で発現される（Liら、1996a）。ED11.5
胎仔の全マウント染色は、発生中の動脈系全体で高レベ
ルのβガラクトシダーゼ活性を示した。青色染色を、背
側大動脈、頚動脈および椎骨動脈、脳動脈、臍動脈、な
らびに動脈開始の全体で観察した。腸骨動脈を介する高
出力区画は、lacZ移入遺伝子の発現が、動脈内皮細胞の
根底にある細胞の１〜２層に制限されることを示した。
さらに、βガラクトシダーゼ活性は、発達中の体節の節
分節成分内および球体幹領域（将来の流入路）内におい
て検出され、そして低レベルで、初期心臓の球体幹（将
来は右心室）内で検出された。βガラクトシダーゼ活性
は、胎仔発達のこの段階で、将来の左心室、左心房、ま
たは右心房内では検出されなかった。驚くべきことに、
SM22α遺伝子は、肺気道を裏打ちする平滑筋細胞におい
て、ならびに胃腸および尿生殖器路内の平滑筋細胞にお
いて高レベルで発現されるが、βガラクトシダーゼ活性
は、発達中の肺芽、胃腸粘膜、または子宮または膀胱粘
膜において、後期マウス胚形成または出生後発生の間に
検出されなかった。従って、441bp SM22αプロモーター
は、トランスジェニックマウスにおける系統制限様式に
おいて、血管SMCにおける転写を活性化するのに必要か
つ十分である。さらに、この最小プロモーターエレメン
トは、発達中の体節におけるSM22α遺伝子の転写を活性
化するのに必要なシス作用性配列を含む。これらのデー
タはまた、SM22α遺伝子発現が、転写レベルで調節され
ることを示す。
さらに、300bpプロモーターから得た基準化したルシ
フェラーゼ活性は、これらの一過性トランスフェクショ
ンアッセイにおいてプロモーター非含有コントロールプ
ラスミドで得られるもののさらに100倍であった。280bp
SM22αプロモーターフラグメント（−280〜＋41bp）
が、動脈SMC特異的遺伝子発現を指向するのに十分かど
うかを決定するために、本発明者らは、lzcZ遺伝子を28
0bp SM22αプロモーターの転写制御下に配置した８つの
独立した株のトランスジェニックマウスを作製した。こ
れらのマウスは、１細胞あたり２〜34コピーの移入遺伝
子を得た。280bpの5'隣接配列は、動脈SMCおよびED11.5
マウスの体節の節分節成分に高レベルのβガラクトシダ
ーゼ活性（青色染色）を指向するのに十分である。移入
遺伝子発現の実質的に同一のパターンが、コピー数が１
細胞あたり２〜34の間で変化するED11.5で分析した４つ
の独立した株において示された。興味深いことに、濃青
染色が心臓流入路（神経冠派生物）内で検出され、一
方、青色染色のいくらかまだらなパターンが発達中の動
脈系（これは、外側中胚葉および神経冠に由来する）に
存在した。高出力区画により、心臓流入路内の実質的に
全ての細胞が青色に染まったことを確認した。興味深い
ことに、濃青色染色は、ED11.5で存在する動脈肺らせん
中隔を構成する間葉細胞内で検出された。さらに、発生
中の動脈の上皮の根底にあるほとんどの（全てではな
い）細胞は、青色に染まった。まとめると、これらのデ
ータは、280bp SM22αプロモーターが、動脈SMCおよび
発達中の体節において、系統制限転写をプログラムする
のに十分であることを実証する。しかし、SM22α遺伝子
発現の内因性パターンとは対照的に、411bp（および280
bp）SM22αプロモーターは、内臓（胃腸、子宮、膀胱、
および気管支）または静脈SMCにおいても、あるいは原
始心臓管においてもSM22α転写を制御するシス作用性エ
レメントを含まない。最後に、本発明者らは、5000bp S
M22αプロモーターを用いて、トランスジェニックマウ
スにおいて、実質的に同じ動脈SMC特異的パターンの発
現を観察した。これらのデータは、個々の転写プログラ
ムが、SMCの組織制限サブセットを（血管系内でさえ）
区別することを強く示唆する。
Xgal組織染色 肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、精巣または卵巣、およ
び骨格筋を、安楽死させた動物から切除し、そしてβ−
ガラクトシダーゼ活性を明らかにするために染色する。
β−ガラクトシダーゼ活性が、非トランスジェニックマ
ウスにおいて明らかな場合、トランスジェニック系統
を、核局在化β−ガラクトシダーゼソ型を用いて作製
し、偽ポジティブ染色を最小化する（HughesおよびBla
u,1990）。β−ガラクトシダーゼ活性を明らかにするた
めに、組織をPBSで洗浄し、次いで1.25％グルタルアル
デヒド中に固定する（肺は以下のように固定する）。Ca
+2およびMg+2非含有緩衝液での洗浄後、Xgal溶液（50mM
Tris HCl pH7.5、2.5mMフェリフェロシアン化カリウム
（pottassium ferriferrocyanide）、15mM NaCl、1mM M
gCl2、0.5mg/ml Xgal）中で一晩暗所にてインキュベー
トし、次いでパラフィン包埋する;4ミクロン分画をエオ
シンで対比染色する。
データ分析 Xgal染色の組織および細胞分布（SM22αプロモーター
転写活性を反映する）を、研究した各トランスジェニッ
ク株について記録し、そして実験条件間で定量的に比較
する。肺および気管SM22αプロモーター転写活性の定量
評価もまた、RNase保護アッセイによって、lacZ mRNAに
ついて行う。これを、ANOVA、続いて多重範囲検定法を
用いて、研究グループ間を比較する。lacZ mRNAレベル
における潜在的な差異が、グループ間の異なる平滑筋量
に由来するかどうか検定するために、気道平滑筋面積対
外周曲線を、Jamesら（1989）によって記載されるよう
に、グループ間で比較する；肺動脈面積対外周曲線を、
同様に比較する。
実施例７ 肺におけるSM22αの発現 SM22αmRNAを、肺において、インサイチュハイブリダ
イゼーションによって検出する。マウスSM22αcDNA bp6
44〜1007の逆相補体に対応するジゴキシゲニン標識化cR
NAを、インビトロ転写によって調製した（MaxiScriptTM
Kit,Ambion,およびGeniusTM4 Kit,Boehringer Mannhei
m）。インサイチュハイブリダイゼーションを、肺疾患
を有さない患者から検死で得られた肺標本において行っ
た。ハイブリダイズしたプローブを、アルカリホスファ
ターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体で、免疫組織化
学的に検出する。SM22αcRNAは、気道平滑筋および肺血
管平滑筋に選択的に結合する；黒炭粉症色素もまた、こ
の標本で明らかであった（都会居住者の典型）。
実施例８ 異種遺伝子産物のインビトロでのアデノウイルス媒介発
現 441bpマウスSM22αプロモーターは、トランスジェニ
ックマウスにおける動脈SMC特異的遺伝子発現をプログ
ラムすることが、以前に示されている（Kimら、1997;Li
ら、1996b;Moesslerら、1996）。SM22αプロモーター
が、RDAdによってコードされる組換え遺伝子産物の発現
をSMCに制限するのに有用であり得るかどうか試験する
ために、RDAd（AdSM22−lacZ）を構築し、これはマウス
SM22αプロモーターの転写制御下で、細菌lacZレポータ
ー遺伝子を含む（図３、上部パネル）。ここに記載され
る研究において、AdSM22−lacZの活性を、細菌lacZレポ
ーター遺伝子が、偏在性の活性サイトメガロウイルス
（CMV）即時初期遺伝子プロモーター／エンハンサーの
転写制御下であるコントロールウイルスAdCMV−lacZ（T
ripathyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11557〜11561,
1994）のものと比較した（図3A、下部パネル）。
インビトロで形質導入した細胞におけるAdSM22−lacZ
の活性を評価するために、原発性ラット動脈SMCの複製
培養物を、１、10,および100プラーク形成単位（PFU）
／細胞のAdSM22−lacZまたはAdCMV−lacZのいずれかに
感染させ、そして組織化学的に同定可能なβ−ガラクト
シダーゼ活性（Xgalとの青色染色によって評価した）を
発現する細胞の画分を定量した。図3Bに示すように、細
胞の12、80、および88％は、AdSM22−lacZのそれぞれ
１、10、および100PFU/細胞での感染後、lacZトランス
ジーンを発現した。β−ガラクトシダーゼを発現する細
胞の画分は、複製培養物のコントロールAdCMV−lacZウ
イルスでの感染後に観察されたものと匹敵した（図3
B）。これらの発見に一致して、不死化A7r5血管SMCのそ
れぞれ10、70、および90％は、AdSM22−lacZの１、10、
および100PFU/細胞での感染後、lacZトランスジーンを
発現した。再び、トランスジーン発現のこの効率は、こ
の不死化SMC株のAdCMV−lacZコントロールウイルスでの
感染後に観察されたものと匹敵した。
SM22αプロモーターが、lacZレポーター遺伝子のSMC
に対する発現を制限したかどうかを決定するために、原
発性ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）およびNIH 3T3線維芽
細胞を、AdSM22−lacZまたはAdCMV−lacZコントロール
ウイルスに感染させた。原発性および不死化SMCのAdSM2
2−lacZ媒介感染に続いて観察されたトランスジーン発
現の高い効率とは対照的に（図3B）、β−ガラクトシダ
ーゼ活性は、AdSM22−lacZでの感染に続いてHUVECおよ
びNIH 3T3細胞において検出されなかった（図3B）。対
照的に、HUVECの10、60、および93％は、それぞれ１、1
0、および100PFUのAdCMV−lacZコントロールウイルスで
の感染後、組織化学的に検出可能なβ−ガラクトシダー
ゼ活性を発現した（図3B）。同様に、NIH 3T3細胞の約5
0％は、100PFUのAdCMV−lacZコントロールウイルスでの
感染後、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を発現し
た。
以前にAdSM22−lacZに72時間感染させたHUVECから採
取したDNAのサザンブロット分析は、これらの細胞にお
けるlacZトランスジーンの存在を実証した。ハイブリダ
イゼーションシグナルは、AdCMV−lacZコントロールウ
イルスに感染させたHUVECから採取したDNAで観察された
ものと強度において匹敵し、それにより、これらの細胞
のAdSM22−lacZによる有効な感染を確認した。この研究
において見られる異なるサイズのlacZハイブリダイズバ
ンドは、各アデノウイルスベクターのBgl IIでの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化の予測したパターンに一致する。
AdSM22−lacZおよびAdCMV−lacZの両方が、HUVECを感染
したという事実にもかかわらず、lacZトランスジーンmR
NAは、AdSM22−lacZ感染したHUVECにおいて、ノーザン
ブロット分析によって検出されなかった。対照的に、コ
ントロールAdCMV−lacZウイルスに感染したHUVECは、豊
富なlacZ mRNAを発現した。まとめると、これらのデー
タは、AdSM22−lacZが、インビトロで、SMC特異的トラ
ンスジーン発現をプログラムすることを実証し、そして
トランスジーンの系統制限発現が、転写または転写後レ
ベルで調節されたことを確認した。
pAdSM22プラスミドを、441bpマウスSM22αプロモータ
ー（Solwayら、1995）を、Cla I（5'末端）/Hind III
（3'末端）消化pAdEF1（KN）プラスミド（Tripathyら、
1994）にサブクローン化することによって作製した。pA
dSM22−lacZプラスミドを、Hind III（5'末端）/Bgl II
（3'末端）連結細菌lacZレポーター遺伝子を、Hind III
/Bgl II消化pAdSM22プラスミドにサブクローン化するこ
とによって作製した。マウスSM22αプロモーターおよび
ヒト4F2重鎖転写エンハンサー（Karpinskiら、Mol.Cel
l.Biol.,9:2588〜2597,1989）の転写制御下で細菌lacZ
レポーター遺伝子をコードするAdSM22−lacZを、293細
胞における、pAdSM22−lacZプラスミドDNAと以前に記載
のようにXba IおよびCla Iで消化したE1およびE3欠損Ad
5Sub360ゲノムDNA（Barrら、1994）との間での組換えに
よって作製した。このウイルスの構造を、サザンブロッ
ト分析によって確認した。サイトメガロウイルス（CM
V）即時初期遺伝子プロモーター／エンハンサーの転写
制御下で細菌lacZレポーター遺伝子をコードするAdCMV
−lacZ RDAdは、以前に記載されている（Barrら、199
4）。組換えウイルスは、複製コンピテントなウイルス
での汚染を回避するために３回精製したプラークであっ
た。高力価のアデノウイルスストックを、以前に記載の
ように、293細胞を１細胞あたり２〜５プラーク形成単
位（PFU）のウイルスに感染させることによって調製し
た（Barrら、1994）。各塩化セシウム精製したウイルス
ストックの力価を、260nmでの吸光度から決定し（１吸
光度単位＝1010PFU/ml）、そして以前に記載のように、
プラークアッセイによって確認した（Barrら、1994）。
この実施例に記載される研究を、以下のように行っ
た：原発性ラット大動脈SMCを、以前に記載のように、1
2〜16週齢のSprague Dawleyラットから単離し、そして
増殖させた（Changら、1995a）。実際に、全ての細胞株
は、この技術を用いて単離した場合、SM−α−アクチン
の発現についてポジティブに染色した（Solwayら、199
5）。全ての実験において、第３継代原発性ラット動脈S
MCのみを利用した。不死化したラット血管A7r5 SMC、第
４継代ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、およびマウスNIH
3T3線維芽細胞を、以前に記載のように増殖させた（Ki
mら、1997）。細胞を、２％ウシ胎児血清（FBS）を含む
培地に配置し、そして１、10、または100PFU/細胞のい
ずれかの精製アデノウイルスストックに感染させた。感
染に続いて、細胞を、PBSで洗浄し、そして10％FBSを含
む増殖培地に配置した。感染後72時間で、細胞を、DNA
およびRNAの調製のために採集するか、または以前に記
載のように、固定しそしてXgalでβ−ガラクトシダーゼ
活性について染色した（Linら、1990）。10の代表的な
高出力フィールドからの未染色および青色染色（β−ga
l+）細胞を、各区画において計数し、そしてβ−gal+細
胞の割合を計算した。データを、％β−ガラクトシダー
ゼポジティブ細胞±S.D.として示す。動物に関する全て
の実験は、University of Chicago Committee on Anima
l Care and Useによって承認された。Sprague Dawleyラ
ットを、University of ChicagoのA.J.Carlson Animal
Research FacilityにおけるNIHガイドラインにしたがっ
て、収容および世話した。
サザンおよびノーザンブロット分析を、以前に記載の
ように行った（ParmacekおよびLeiden,264:13217−1322
5,1989）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成した485
bp細菌lacZプローブ（これは、pCMVβプラスミド（Clon
etech）におけるbp962から1448に対応する）を放射性標
識し、そしてサザンおよびノーザンブロット分析のため
に使用した。定量的画像分析を、Molecular Dynamics P
hosphorImager（Sunnyvale,CA）を用いて行った。
実施例９ 無傷およびバルーン損傷（ballon−injured）したラッ
ト頚動脈におけるRDAdの動脈内投与 麻酔および挿管の導入後、以前に記載のように、成体
Sprague−Dawleyラットの左および右頚動脈を単離し、
そしてバルーン損傷を、2F Fogartyカテーテルで拡張さ
せることによって作製した（Changら、1995a）。24ゲー
ジの静脈内カテーテルを、無傷またはバルーン損傷した
動脈セグメントの管腔に導入し、そして２×109PFUのAd
SM22−lacZまたはAdCMV−lacZを、単離した動脈セグメ
ントに５分間滴下注入した。感染後７日で、ラットを安
楽死させ、そして頚動脈の単離したセグメントを摘出
し、1.25％グルタルアルデヒド中に固定し、そして以前
に記載のように、Ｘ−galでβ−ガラクトシダーゼ活性
について染色した（Linら、1990）。顕微鏡写真撮影
を、Kodak EPT 160フィルムおよびZeiss Axiophot顕微
鏡を用いて行った。
SM22αプロモーターが、インビボでアデノウイルス媒
介トランスジーン発現を動脈SMCに制限するために使用
され得るかどうかを決定するために、２×109PFUのAdSM
22−lacZまたはコントロールAdCMV−lacZウイルスを、
無傷およびバルーン損傷したラット頚動脈の単離したセ
グメントに導入した。血管内皮の拡散した青色染色が、
コントロールAdCMV−lacZウイルスの無傷のラット頚動
脈への投与後７日で観察された。さらに、外膜内のわず
かな細胞もまた、青色に染まった。対照的に、AdSM22−
lacZを、無傷のラット頚動脈に導入した場合、β−ガラ
クトシダーゼ活性は、内皮細胞内または外膜細胞内のい
ずれにおいても観察されなかった。しかし、わずかなla
cZ発現SMCが、中膜の表在（abluminal）層において観察
された。これらのデータは、AdSM22−lacZトランスジー
ン発現のSMC特異性は、無傷のラット頚動脈の単離され
たセグメントへのAdSM22−lacZの動脈内投与に続いて維
持されることを示唆した。
バルーン損傷したラット頚動脈におけるトランスジー
ン発現の細胞特異性を決定するために、２×109PFUのAd
SM22−lacZを、ラット頚動脈の単離されたセグメント
に、バルーン損傷直後に５分間滴下注入した。感染後７
日で、損傷した動脈セグメントを単離し、そしてβ−ガ
ラクトシダーゼ発現のパターンを、未感染のバルーン損
傷した反対側の動脈において観察されたものと比較し
た。AdSM22−lacZウイルスに感染した無傷の頚動脈にお
いて観察された低レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性と
は対照的に、高効率の遺伝子移入が、これらのバルーン
損傷した動脈セグメントにおいて達成された。β−ガラ
クトシダーゼ活性を発現するSMCの大部分は、中膜内に
局在した。さらに、新内膜（neointima）内のわずかな
細胞もまた、明青色に染まった。以前の報告に一致し
て、遺伝子移入は、新内膜増殖の部位の根底にあるSMC
において優先的に観察された。最後に、lacZトランスジ
ーン発現は、血管壁損傷の縁にある内皮細胞においては
観察されなかった（ここでは、内皮細胞は無傷なままで
あった）。まとめると、これらのデータは、AdSM22−la
cZウイルスが、動脈内投与後のトランスジーン発現のそ
のSMC特異的パターンを維持し、そしてバルーン損傷し
たラット頚動脈において動脈SMCを効率よく形質導入す
るのに使用され得ることを実証した。
実施例10 RDAdの静脈内投与 RDAdの静脈内投与は、肝臓および肺への高レベルの遺
伝子移入を生じ、それにより、いくつかの診断設定にお
いて、これらのウイルスの有用性を潜在的に限定する
（Kashyapら、1996;Johnsら、1995;MillerおよびVile,1
995）。12〜16週齢のSprague−Dawleyラットを、それぞ
れ109または1010PFUのAdSM22−lacZまたはAdCMV−lacZ
で静脈注射した。肝機能試験を、感染後７日で得られた
血清サンプルにおいて、Kodak DT60IIおよびDTSCH自動
分析器を用いて行った。コントロール、AdSM22−lacZ感
染、およびAdCMV−lacZ感染ラットの間で観察される肝
機能における変化の有意性を決定するために、スチュー
デントのｔ検定を行った。注射後７日で、ラットを安楽
死させ、そして注射した組織、ならびに肝臓、肺、腎
臓、および頚動脈を単離し、洗浄し、固定し、そして以
前に記載のようにＸ−galでβ−ガラクトシダーゼ活性
について染色した（Linら、1990）。
lacZ発現は、AdCMV−lacZコントロールウイルスに感
染したラットの肝臓全体にわたって観察された。さら
に、βgal+細胞の病巣斑が、AdCMV−lacZ感染したラッ
トの肺の血管周囲領域内で観察された。対照的に、AdSM
22−lacZでの感染後７日では、肝臓および肺の両方の組
織区画は、未感染のコントロールラットから得られたも
のと区別不可能であった。これらのデータは、ウイルス
性駆動および／または偏在性活性の転写調節エレメント
を含むRDAdとは対照的に、AdSM22−lacZは、静脈内投与
後、トランスジーン発現をSMCに制限することを示唆す
る。
AdSM22−lacZの静脈内投与が肝機能において異常を生
じるかどうかを、このウイルスによってコードされるla
cZレポーター遺伝子がこの組織において発現されないと
いう発見にもかかわらず、決定するために、成体Spragu
e−Dawleyラットを、1010PFUのAdSM22−lacZウイルスで
静脈内（IV）注射し、そして肝機能試験を、感染後７日
で得られた血清サンプルにおいて行った。血清アルカリ
ホスファターゼ（AP）、アラニンアミノトランスフェラ
ーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラー
ゼ（AST）、γグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、
全ビリルビン、全タンパク質、およびアルブミンにおけ
る統計学的に有意な上昇は、AdSM22−lacZウイルスに感
染したラットでは観察されなかった（表１を参照のこ
と）（ｐ＞0.05）。しかし、ALT、AST、APの平均血清濃
度における小さな（しかし一貫した）上昇が観察され
た。対照的に、ALTおよびAST血清濃度における統計学的
に有意な上昇は、1010PFUのAdCMV−lacZコントロールウ
イルスの静脈内投与後７日で観察された（ｐ＜0.05）。
さらに、APおよびビリルビンの増加した血清濃度が、１
×1010PFUのAdCMV−lacZウイルスを受けるラットにおい
て観察された（ｐ＜0.09）。従って、AdSM22−lacZの高
用量の静脈内投与は、肝機能試験において緩やかな上昇
を生じた。しかし、肝機能試験異常は、同一の用量のAd
CMV−lacZコントロールウイルスに感染したラットにお
いて観察されたものより有意に低かった。
実施例11 RDAdの内臓SMCおよび骨格筋への直接注射 AdSM22−lacZのSMC含有組織および骨格筋への直接注
射を、上記の麻酔および挿管の導入後に行った。109PFU
のAdSM22−lacZウイルスを、30ゲージ針で、尿管の壁、
膀胱壁、または筋肉内に直接注射した。各注射の部位
を、縫合糸によって印を付けた。注射の７日後、注射の
部位を単離し、固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活
性について以前に記載のように染色した（Linら、199
0）。
濃青色染色は、尿管の壁内のSMCの縦方向および周囲
層全体にわたって観察された。対照的に、β−ガラクト
シダーゼ活性は、尿管の管腔の内側に沿った上皮細胞内
においては観察されなかった。AdSM22−lacZの膀胱粘膜
への直接注射後、βgal+SMCの病巣斑は、注射の部位の
周りに観察された。対照的に、β−ガラクトシダーゼ活
性は、膀胱上皮内で観察されなかった。これらのデータ
は、AdSM22−lacZが、内臓SMC、ならびに血管SMCにおい
てトランスジーン発現をプログラムすることを実証し
た。
441bpマウスSM22αプロモーターは、胚骨格筋細胞お
よびトランスジェニックマウスの体節において活性であ
る（Kimら、1997）。AdSM22−lacZが、インビボで成体
骨格筋においてトランスジーン発現をプログラムするか
どうか決定するために、109PFUのAdSM22−lacZウイルス
を、ラット腹直筋および四頭筋に筋肉内注射した。濃青
色染色が、尿管および膀胱の壁への直接注射後に内臓SM
Cにおいて観察されたのと対照的に、β−ガラクトシダ
ーゼ活性は、腹直筋または四頭筋のいずれにおいても観
察されなかった。従って、AdSM22−lacZによってコード
されるlacZレポーター遺伝子は、動脈内、静脈内、また
は筋肉内投与された場合に、内臓SMCおよび血管SMCにお
いて独占的に発現される。
実施例12 細胞周期制御遺伝子のアデノウイルス媒介発現 Rbタンパク質は、多くの哺乳動物細胞型において、細
胞周期進行を阻害し（Hollingsworthら、Curr.Opin.Gen
et.Dev.,3:55,1993）、そして血管平滑筋増殖の重要な
調節因子であることが示されている（Changら、1995
a）。その非リン酸化状態において、Rb遺伝子産物は、
細胞周期進行に必要な特定の細胞転写因子に結合して不
活化し（Chenら、Cell,58:1193,1989）、そしてリン酸
化の際に、転写因子が放出され、細胞は、増殖周期を介
して進行する。リン酸化欠損Rb遺伝子産物をコードする
遺伝子は構築されており、そして複製欠損アデノウイル
スベクターにおけるラット大動脈平滑筋細胞にトランス
フェクトされた場合、平滑筋細胞周期増殖を構成的に阻
害することが示されている（Changら、1995a）。さら
に、Changの参照はまた、複製欠損アデノウイルスベク
ターが、損傷動脈の単離されたセグメントのアデノウイ
ルスへの直接曝露の際にインビボでラット頚動脈におい
て異種遺伝子を発現するのに使用され得ることを示す。
同様の研究を、単離されたブタ動脈において行い、そし
て再び、アデノウイルス移入構成的Rb遺伝子産物が、発
現され、そして平滑筋細胞増殖を阻害することが示され
た。
本発明の予測実施例において、このリン酸化欠損Rb遺
伝子産物はまた、本明細書中に開示されるように、アデ
ノウイルスベクターに含まれる平滑筋特異的プロモータ
ーの制御下で発現され得、従って、平滑筋細胞において
特異的にRb遺伝子産物の発現を指向する。このような投
与は、SM22αプロモーターからRbを発現する記載のベク
ターを、以前の実施例に記載のように、特に動脈バルー
ン傷害に続いて、動物またはヒト被験体に投与する場
合、平滑筋細胞増殖を阻止することを意図する。再狭窄
または他の平滑筋細胞増殖障害を予防するこの方法は、
静脈内注射のような侵襲性がより低い方法によるウイル
スベクターの投与の利点を提供する。他の細胞周期制御
遺伝子産物（例えば、p53）が、再狭窄を予防する本方
法において効果的であることもまた意図される。
実施例13 平滑筋特異的トランス作用性転写因子の同定 SM22αプロモーターにおける核タンパク質結合部位の同
定 441bp SM22αプロモーター内の核タンパク質結合部位
を同定するために、DNase Iフットプリント分析を行っ
た。482bp（bp−441〜＋42）SM22αプロモーターにわた
る３つの重複ゲノムサブフラグメント（bp−441〜−25
6、bp−256〜−89、およびbp−89〜＋41）を、SMC株A7r
5（これは、高レベルのSM22αmRNA）を発現する）およ
びNIH 3T3細胞からの核抽出物を用いる、DNase Iフット
プリント分析に供した。３つのゲノムサブフラグメント
のセンスおよびアンチセンス鎖を末端標識し、そしてDN
ase I（濃度は、5U/ml〜22.5U/mlで変化した）での部分
消化の前に、核抽出物のA7r5およびNIH 3T3の非存在下
（コントロール）または存在下（3T3）においてインキ
ュベートした。標準的なMaxamおよびGilbertプリン（Ｇ
＋Ａ）配列決定反応を、平行して行った。A7r5核抽出物
での両鎖において同定した６つの保護領域を、それぞ
れ、平滑筋エレメントSME−１〜SME−６と命名した。２
つのフットプリントした領域（SME−１（bp−279〜−25
6）およびSME−４（bp−171〜−136）は、埋め込まれた
SRE、またはCArGボックス（CCWWWWWWGG、配列番号47）
（MADSボックス転写因子SRFに結合することが以前に示
されている）を含み、そして骨格および心臓のαアクチ
ンをコードする遺伝子の転写の調節において重要な役割
を果たす（Mintyら、1986;Mossら、J.Biol.Chem.,269:1
2731,1994;Muscatら、Gene Exp.2:111,1992）。A7r5細
胞およびNIH 3T3細胞から調製した核抽出物の間の消化
パターンの良好な差異は、SME−４部位の全域について
区別され得る。いくつかの研究は、CArGボックス内に埋
め込まれているかおよび／またはこのボックスに隣接す
るヌクレオチドが、三部複合体因子（ternary complex
factor）（TCF）（etsのメンバーおよび転写因子のホメ
オドメインファミリーを含む）の結合を調節することを
示唆する。従って、PEA3モチーフ（bp−295〜−289）
（これは、インビトロでetsファミリーメンバーに結合
することが実証されている）が、SME−１モチーフから2
3bp分5'側に存在することが注目される。同様に、SME−
４は、GGAGモチーフ（bp−142〜bp−139）（これは、転
写因子のetsファミリーにおいてTCFに結合することが実
証されている）にわたる（JohansenおよびPrywes,Bioch
em.Biophys.Acta.1242:1〜10,1995）。さらに、SME−４
モチーフは、埋め込まれたモチーフATATGG（bp−146〜b
p−141）（これは、Csx/Nkx2.5を含むホメオボックス転
写因子に結合することが実証されている）を含む（Chen
ら、1996）。
SME−２核タンパク質結合部位（bp−249およびbp−21
6）は、偏在性発現される転写因子Sp1（KRGGCKRRK）お
よびAP2（CCCMNSSS）についてのコンセンサス結合モチ
ーフを含む。A7r5細胞およびNIH 3T3細胞から調製した
核抽出物の間の消化パターンの良好な差異は、この部位
にわたって区別され得る。SME−３核タンパク質結合部
位（bp−215〜bp−186）（これは、その5'および3'の両
方の境界でDNase I高感受性部位に隣接する）は、A7r5
から調製した核抽出物によってのみ保護され、NIH 3T3
細胞から調製した抽出物によっては保護されなかった。
この核タンパク質結合部位は、以前に記載されていな
い。SME−５核タンパク質結合部位（bp−86〜bp−66）
は、もう一度、コンセンサスSp1およびAP2モチーフを含
む。SME−６核タンパク質結合部位（bp−59〜−35）
は、非コンセンサスTATAボックス（TTTAA）のすぐ5'隣
に存在し、そしてサイクリックAMP応答エレメント（CR
E）結合タンパク質に結合することが以前に実証されて
いるヌクレオチド配列を含む（概説については、Lalli
およびSassone−Corsi,1994を参照のこと）。コンセン
サスMEF2結合モチーフ（Gossettら、1989）と8/10bpの
配列同一性を有するATリッチ配列（bp−408〜−415）
は、A7r5核抽出物でもNIH 3T3核抽出物でも保護されな
かった。まとめると、これらの研究は、マウスSM22αプ
ロモーター内の６つの核タンパク質結合部位を実証し
た。これらの結合部位のうちの３つ（SME−２、SME−
３、およびSME−４）は、A7r5およびNIH 3T3細胞から調
製した核抽出物とともにインキュベートした場合、異な
る消化パターンを実証した。
SM22αプロモーターに結合するトランス作用性因子の特
徴付け。
動脈SMC特異的SM22αプロモーターに結合する核タン
パク質の数、特異性、および正体を評価するために、一
連の電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行った。
SME−1/CArGおよびSME−4/CArGが、通常か、重複か、ま
たは個別のセットのトランス作用性因子を結合するかど
うかを決定するために、EMSAを、放射標識したSME−１
およびSME−４オリゴヌクレオチドプローブを用いて行
った。放射標識したSME−１オリゴヌクレオチドプロー
ブは、特異的および非特異的未標識競合因子オリゴヌク
レオチドの結合反応物への添加によって決定されたよう
に、３つの特異的な核タンパク質複合体（Ａ〜Ｃと称
す）に結合した。未標識のSME−４オリゴヌクレオチド
は、複合体Ａの結合に競合したが、複合体ＢおよびＣに
競合できなかった。未標識のSp1オリゴヌクレオチド
は、複合体Ｂ（複合体Ａと同時に移動する）ならびに複
合体Ｃの結合に競合した。抗体スーパーシフト研究は、
複合体ＡがSRF（または抗原性が関連するタンパク質）
を含み、そして複合体ＢはSp1（または抗原性が関連す
るタンパク質）を含むことを確認した。
放射標識したSME−４オリゴヌクレオチドプローブで
行ったEMSAは、特異的および非特異的競合因子オリゴヌ
クレオチドの添加によって決定されたように、４つの特
異的核タンパク質複合体（Ａ〜Ｄと称す）を実証した。
未標識のSME−１オリゴヌクレオチドの添加は、複合体
ＡおよびＢの結合についてのみ競合した。抗体スーパー
シフト研究は、これらの低移動度核タンパク質複合体の
両方が、SRFに同一かまたは抗原性が関連したタンパク
質を含み、一方、複合体ＣおよびＤは、YY1に同一かま
たは抗原性が関連したタンパク質を含むことを明らかに
した。まとめて考えると、これらのデータは、予測した
ように、SRF（またはSRF含有タンパク質複合体）が、SM
E−１部位およびSME−４部位の両方に結合することを実
証する。SRF（複合体ＡおよびＢ）を含む２つの低移動
度SME−４結合活性が実証されたことは、これらの複合
体の１つまたは両方が、さらなるトランス作用性因子を
含み得ることを示唆する。さらに、SME−１は、Sp1（複
合体Ｂ）、およびSME−４に結合しない１つの潜在的に
新規な核タンパク質複合体（複合体Ｃ）に結合した。逆
に、SME−４は、偏在的に発現しそして潜在的にネガテ
ィブな調節因子YY1（Gualbertoら、Mol.Cell.Biol 12:4
209,1992;Leeら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:9814,19
92;Leeら、Oncogene 9:1047,1994）（複合体Ｃおよび
Ｄ）に結合する一方、SME−１は結合しない。
SME−２部位およびSME−５部位の両方は、潜在的なSp
1およびAP2モチーフを含むGCリッチモチーフである。一
次ラット大動脈SMCから調製した核抽出物およびそれぞ
れSME−２およびSME−５核タンパク質結合部位に対応す
る放射標識したオリゴヌクレオチドで行ったEMSAは、同
一のバンドシフトパターンを明らかにし、これらの２つ
のモチーフが、トランス作用性因子の通常のセットに結
合し得ることを示唆した。各プローブは、未標識の特異
的および非特異的オリゴヌクレオチド競合因子の添加に
よって決定されたように、３つの特異的核タンパク質複
合体（ＡからＣと称す）に結合した。未標識のSME−２
オリゴヌクレオチドは、放射標識したSME−５プローブ
に結合した各核タンパク質複合体の結合について競合
し、またその逆も正しい。さらに、コンセンサスSp1モ
チーフを含むオリゴヌクレオチドは、複合体Ａ〜Ｃの結
合について競合した。抗体スーパーシフト研究は、SP1
特異的抗血清とのプレインキュベーションによって複合
体Ａが切断され、そしてスーパーシフトするが、コント
ロールマウスIgGまたはα−AP2抗血清とではそうではな
いことを明らかにした。これらの核タンパク質複合体の
各々はまた、リンパ系株（WEHIおよび70Z/3）を含む非S
MC系統から調製した核抽出物に存在した。これらのデー
タは、SME−２およびSME−５核タンパク質結合部位が、
３つの偏在性発現される核タンパク質複合体に各々結合
し、その少なくとも１つは、Sp1に同一かまたは抗原性
が関連するタンパク質を含むことを実証する。
上記で議論したように、SME−３は、A7r5細胞から調
製した核抽出物によってDNase I消化から保護された
が、NIH 3T3細胞から調製した抽出物によっては保護さ
れなかった。これは、この以前に記載されていないモチ
ーフが、１つ以上のSMC系統特異的トランス作用性因子
を結合し得ることを示唆する。放射標識したSME−３オ
リゴヌクレオチドプローブで行ったEMSAは、特異的およ
び非特異的競合因子オリゴヌクレオチドの添加によって
決定されたように、３つの特異的結合活性（Ａ〜Ｃと称
す）を明らかにした。抗体スーパーシフト研究は、複合
体ＢおよびＣがYY1（または抗原性が関連するタンパク
質）を含むことを明らかにした。コントロールIgGまた
はα−Sp1抗血清によってスーパーシフトした核タンパ
ク質複合体はなかった。任意のこれらの核タンパク質複
合体が、系統拘束様式において発現されるかどうかを決
定するために、EMSAを、SME−３プローブ、ならびに一
次ラット大動脈SMC、SMC株A7r5、C3H10T1/2およびNIH 3
T3線維芽細胞、およびマウスＴ細胞株EL4から調製した
核抽出物で行った。興味深いことに、複合体Ｃ（これ
は、ａ−YY1抗血清とのプレインキュベーションによっ
て切断された）は、一次ラット大動脈SMCおよびSMC株A7
r5にのみ存在するが、C3H10T1/2、NIH 3T3、およびEL4
核抽出物においては存在しない。さらに、３つのかすか
な複合体は、C3H10T1/2、NIH 3T3、およびEL4細胞にお
いては同定されたが、SMC抽出物には存在しなかった。
まとめて考えると、これらのデータは、SME−３核タン
パク質結合部位（以前に記載されていないモチーフ）
が、YY1および１つ以上の未だ未同定のSMC特異的および
／または系統拘束トランス作用性因子を結合することを
示唆する。さらに、放射標識SME−３プローブは、いく
つかの非SMC株に存在するが一次血管SMCまたはSMC株A7r
5には存在しない３つの核タンパク質複合体を結合す
る。
SME−６核タンパク質結合部位に対応する放射標識し
たオリゴヌクレオチドで行ったEMSAは、４つの特異的核
タンパク質複合体（それぞれ、Ａ〜Ｄと称す）を明らか
にした。これらの複合体の各々は、未標識のSME−６オ
リゴヌクレオチドと競合した。さらに、Ｔ細胞レセプタ
ーａエンハンサーに由来する未標識のコンセンサスCRE
オリゴヌクレオチドの添加は、複合体ＢおよびＣの結合
について、独占的に競合した。α−CREB−１抗血清との
結合反応のプレインキュベーションは、複合体Ｂを切断
しそしてスーパーシフトさせ、一方、複合体Ｃは、α−
ATF−１抗血清の添加によって切断されなかった。さら
に、複合体Ａは、α−Sp1抗血清とのプレインキュベー
ションによって切除されそしてスーパーシフトした。最
後に、複合体Ｄは、α−YY1抗血清の添加によって切断
された。対照的に、４つの複合体のうちで、コントロー
ルウサギもしくはマウスIgG、またはGATA−４もしくはS
RFを認識する抗血清とのプレインキュベーションに続い
て、切断またはスーパーシフトしたものはなかった。興
味深いことに、放射標識したSME−６オリゴヌクレオチ
ドプローブならびに非SMC株、C2C12筋管、C3H10T1/2お
よびNIH 3T3線維芽細胞、およびEL4細胞から調製した核
抽出物で行ったEMSAは、いくつかの核タンパク質複合体
（および／または新規な複合体）の移動度における良好
な差異、ならびにSME−６結合活性の各々における増加
した強度を明らかにした。まとめて考えると、これらの
データは、SME−６モチーフが、CREB−１およびATF−１
（その各々は、一次血管SMCにおいて発現される）、な
らびに偏在性発現される転写因子Sp1およびYY1を結合す
ることを明らかにした。
要約すると、図２に示すように、動脈SMC特異的SM22
αプロモーターは、６つの核タンパク質結合部位を含
み、これらは、それぞれ、平滑筋エレメントSME−１〜S
ME6と称される。SME−1/CArGは、SRF（および三重複合
体因子）、Sp1、およびSME−4/CArGオリゴヌクレオチド
によって交差競合されない１つの未同定の核タンパク質
複合体を結合する。SME−２は、３つの特異的核タンパ
ク質複合体を結合し、その少なくとも１つは、Sp1を含
み、その各々はまた、SME−５部位に結合する。SME−３
（以前に記載されていないモチーフ）は、YY1および２
つの未同定の核タンパク質複合体を結合し、その１つ
は、潜在的に新規な系統拘束トランス作用性因子を含
む。さらに、SME−３モチーフは、非SMCから調製した核
抽出物には存在するが、SMC抽出物には存在しないいく
つかのトランス作用性因子を結合する。SME−4/CArG
は、SRFおよびYY1関連タンパク質を含む核タンパク質複
合体を結合する。２つの高移動度複合体は、ａ−SRF抗
血清とのプレインキュベーションによって切断されそし
てスーパーシフトした。これは、これらの核タンパク質
複合体の一方または両方が、補助因子を含み得ることを
示唆する。最後に、SME−６は、CREB−１、ATF−１、YY
1、およびSp1を結合する。
実施例14 SM22αプロモーターの機能的特徴付け SM22αプロモーター内のシス作用性エレメントの各々
の機能的重要性を特徴づけるために、SM22αプロモータ
ー内に位置する核タンパク質結合部位への１つ以上のト
ランス作用性因子の結合を無効にする特異的変異を、ｐ
−441SM22lucレポータープラスミドの文脈内で作製し
た。各々の変異の効果を、各変異体SM22αプロモーター
ルシフェラーゼレポータープラスミドの一次ラット大動
脈SMCへの一過性トランスフェクション分析によって評
価した。SME−1/CArGおよびSME−4/CArG部位（各々がSR
Fを結合する）の機能を評価するために、それぞれ、SME
−１に対するSRF結合、ならびにSME−４に対するSRFお
よびYY1結合を無効にする変異を作製した。これらの変
異は、SME−１またはSME−４に対する任意の他の核タン
パク質複合体（EMSAによって実証した）の結合に影響し
なかった。トランスフェクション分析は、SME−１部位
の変異が、ｐ−441SM22lucプラスミドで得られたものと
比較して、正規化ルシフェラーゼ活性において55％の減
少を生じたことを明らかにした。著しく、SRF結合活性
を無効にしたSME−４部位における２つのヌクレオチド
置換は、野生型SM22αプロモーターで得られたものと比
較して、正規化ルシフェラーゼ活性において、88％の減
少を生じた。さらに、ｐ−441SM22μCArGプラスミド
（これは、SRFの結合を阻害するSME−１およびSME−４
の両方における変異を含む）は、一次ラット大動脈SMC
およびSMC株A7r5におけるSM22αプロモーターの転写活
性を、完全に無効にした。これらのデータは、SME−１
およびSME−４の核タンパク質結合部位は、インビトロ
で動脈SMCにおけるSM22αプロモーターの活性に必要と
されることを実証する。さらに、これらのデータは、SM
22αプロモーター活性が、SME−４部位、SRF、および／
またはSRFと相互作用するトランス作用性因子にきわど
く依存的であることを示唆する。
SM22αプロモーターにおける他の（非CArG含有）核タ
ンパク質結合部位の各々の機能的重要性を評価するため
に、１つ以上のトランス作用性因子の各部位への結合を
無効にする変異を、441bp SM22αプロモーター含有プラ
スミドｐ−441SM22lucの分脈内において作製した。SME
−２およびSME−５の核タンパク質結合部位は、各々
が、２つの他の通常の核タンパク質複合体に加えて、Sp
1を含む核タンパク質複合体を結合するので、変異を、
各トランス作用性因子のSME−２、SME−５、ならびにSM
E−２およびSME−５の両方への結合を無効にするｐ−44
1SM22lucプラスミドの文脈内において作製した。これら
のプラスミドの各々およびｐ−441SM22−lucプラスミド
の一次ラット大動脈SMCへのトランスフェクションは、S
ME−２、SME−５、ならびにSME−２およびSME−５の変
異が、それぞれ、正規化されたルシフェラーゼ活性に58
％、６％、および70％の減少を生じたことを実証した。
これらのデータは、SM22αプロモーターの文脈内で、SM
E−２およびSME−５の核タンパク質結合部位が、全ての
プロモーター活性のために必要とされるが、機能的に重
複してい得ることを示唆する。
３つすべてのSME−３結合活性（潜在的に新規な系統
拘束トランス作用性因子を含む）の結合を無効にするSM
E−３部位における変異は、天然のSM22αプロモーター
で観察された転写活性と比較して、転写活性において50
％の減少を生じた。これらのデータは、動脈SMCにおけ
るSM22αプロモーターの活性が、この潜在的に新規な系
統拘束トランス作用性因子にはそれほどきわどく依存し
ないこと、あるいは、この新規な系統拘束トランス作用
性因子についてのさらなる核タンパク質結合部位が、44
1bp SM22αプロモーター（DNase Iフットプリント分析
およびEMSAによって検出されなかった）に存在すること
のいずれかを示唆する。SME−６核タンパク質結合部位
の機能的重要性を評価するため、そしてSME−６内に位
置するCREが、プロモーター活性に必要とされるかどう
かを決定するために、−441SM22μCREB/SME−６プラス
ミド（これは、CRE関連複合体（YY1ではない）の各々の
結合を特異的に無効にする）を、ｐ−441SM22lucレポー
タープラスミドと比較した。CREBモチーフ内の１つの変
異は、転写活性を約60％減少させた。対照的に、CRE結
合活性を無効にしないSME−６内の変異は、転写活性を
有意に減少しなかった。これらのデータは、CREBファミ
リーメンバーが、VSMCにおけるSM22α遺伝子の転写にお
いて重要な機能的役割を果たし得ることを示唆する。
動脈SMC特異的SM22αプロモーターはインビボでCArG依
存性である 上記に示したように、SRFのSM22αプロモーターへの
結合を阻害したSME−1/CArGおよびSME−4/CArGエレメン
トの変異は、インビトロで、動脈SMCにおけるSM22αプ
ロモーター活性を全体的に無効にした。SME−１およびS
ME−４が、インビボで、動脈SMC（および体節の節分節
成分）におけるSM22αプロモーターの活性に必要である
かどうかを決定するために、SRFの結合を無効にするSME
−１およびSME−４の両方において変異を含む変異SM22
αプロモーターの転写制御下で細菌lacZレポーター遺伝
子をコードするトランスジーン（−441SM22μCArGと称
す）を含む、トランスジェニックマウスを産生した（上
記の通り）。13の独立した−441SM22μCArGトランスジ
ェニック系統を、１細胞あたり１〜730の範囲のコピー
数で産生した。動脈SMCにおいて、そして体節の節分節
内においてlacZトランスジーンを発現した−441SM22lac
Zトランスジェニックマウスとは対照的に、13の独立し
た−441SM22μCArG系統のうち12において、βガラクト
シダーゼ活性は、ED11.5で、動脈SMCにおいても、体節
の節分節内においても検出されなかった。−441SM22μC
ArGトランスジーンを有する１つの系統（１細胞あたり
５コピーを含んでいた）において、青色染色は、心臓流
出路内において独占的に検出されたが、背部大動脈もし
くは分岐動脈、体節、または任意の他の組織のSMC内で
は検出されなかった。このパターンのlacZ発現が観察さ
れる頻度が低いことを考えると、それは、隠れたエンハ
ンサーエレメント付近のトランスジーンの組み込みから
生じるようである。これらのデータは、動脈SMC特異的S
M22αプロモーター内に存在するSME−１およびSME−４
核のタンパク質結合部位が、インビボでのSM22αプロモ
ーター活性に必要とされることを実証する。さらに、こ
れらのデータは、SRFが、インビボでのSM22αプロモー
ターの活性の調節において重要な役割を果たすことを強
く示唆する。
本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様につ
いて記載されているが、本発明の概念、精神、および範
囲を逸脱せずに、本明細書中に記載される組成物、方
法、および方法の工程または工程の順序に改変が適用さ
れ得ることが、当業者には明らかである。より詳細には
化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤は、
同様または類似の結果を達成しながら本明細書中に記載
の薬剤と置き換えられ得ることが明らかである。当業者
には明らかであるすべてのこのような置換および変更
は、添付の請求の範囲によって定義されるように、本発
明の精神、範囲、および概念内であるとみなされる。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：アーチ ディベロップメント コーポ
レイション （Ｂ）番地：イースト 58番 ストリート 1101 （Ｃ）市：シカゴ （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:60637 （Ａ）名称：マイケル エス．パルマセック （Ｂ）番地：イースト 56番 ストリート 1225 （Ｃ）市：シカゴ （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:60637 （Ａ）名称：ジュリアン ソルウェイ （Ｂ）番地：グローブ ストリート 746 （Ｃ）市：グレンコー （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:60022 （ii）発明の名称：平滑筋細胞発現のためのプロモー
ター （iii）配列数:51 （iv）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 9/00 38/45 9/10 38/55 11/06 48/00 43/00 １０５ Ａ６１Ｍ 29/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 9/00 5/00 Ｂ 9/10 Ａ６１Ｋ 37/64 11/06 37/02 43/00 １０５ 37/52 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/24 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1995）Ｖ ｏｌ．270，Ｎｏ．22，ｐ．13460− 13469 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（1996）Ｖ ｏｌ．132，Ｎｏ．５，ｐ．849−859 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（1996）Ｖｏ ｌ．122，ｐ．2415−2425 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（1995）Ｖｏ ｌ．310，ｐ．1037−1043 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】SM22αプロモーターを含む単離された、血
    管平滑筋細胞特異的な翻訳調節核酸セグメントを含む、
    動物の血管平滑筋細胞を形質転換し、そして核酸配列の
    平滑筋細胞特異的な発現を維持する能力を有する組換え
    ウイルスベクターであって、該プロモーターがマウスSM
    22α遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の約5,000塩基の
    セグメント内にあり、そして該プロモーターが、該核酸
    配列に作動可能に連結し、 （ａ）該単離された核酸セグメントが、配列番号１の塩
    基899〜1339に記載の配列を有する核酸セグメントを含
    むか、または高ストリンジェントな条件下で配列番号１
    の塩基899〜1339の相補体にハイブリダイズ可能であ
    り、かつ血管平滑筋細胞における該核酸配列の転写を促
    進するのに効果的であるようにさらに定義され；そして
    ／または （ｂ）該プロモーター配列が、配列番号１の塩基899〜1
    382の連続配列を含むようにさらに定義され；そして／
    または （ｃ）該プロモーター配列が、配列番号１の塩基１〜13
    82の連続配列を含むようにさらに定義され；そして／ま
    たは （ｄ）該プロモーター配列が、配列番号１の塩基1060〜
    1382の連続配列を含むようにさらに定義される、 但し、該核酸配列が、マウスSM22α、ルシフェラーゼ、
    βガラクトシダーゼ、またはクロラムフェニコールアセ
    チルトランスフェラーゼをコードしない、ウイルスベク
    ター。
  2. 【請求項２】前記核酸配列が、筋肉収縮阻害分子をコー
    ドし、該分子は、ペプチドMIRICRKK（配列番号19）であ
    る、請求項１に記載のウイルスベクター。
  3. 【請求項３】前記核酸配列が、血管形成を誘導する能力
    のあるポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、VE
    GF、iNOS、eNOS、塩基性FGFまたはFGF−５ポリペプチド
    からなる群より選択される、請求項１に記載のウイルス
    ベクター。
  4. 【請求項４】前記核酸配列が、細胞周期調節分子をコー
    ドする、請求項１に記載のウイルスベクター。
  5. 【請求項５】前記細胞周期調節分子が、平滑筋細胞増殖
    を阻害する能力のある分子であり、該分子は、（ｉ）リ
    ン酸化欠損Rb細胞周期調節分子、構成的に活性なRb細胞
    周期調節分子、p53、p21、p16、p27、細胞周期依存性キ
    ナーゼ、E2Fインヒビター、CDKキナーゼ、またはサイク
    リンからなる群より選択され；あるいは（ii）RNAアン
    チセンス分子、である、請求項４に記載のウイルスベク
    ター。
  6. 【請求項６】前記核酸配列が、（ｉ）細胞傷害性遺伝子
    であって、該遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジン
    キナーゼ遺伝子である、遺伝子；または（ii）レポータ
    ー分子であって、該分子は、neo、DHFR、CAT、HIVgp12
    0、エステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、組
    織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、お
    よびヘルペスgDからなる群より選択される、のいずれか
    をコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。
  7. 【請求項７】前記ウイルスベクターが、ラウス肉腫ウイ
    ルスベクター、p21ウイルスベクター、レトロウイルス
    ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、サイトメガ
    ロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、および
    アデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択され
    る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルスベク
    ター。
  8. 【請求項８】前記ウイルスベクターが、複製欠損ウイル
    スベクターである、請求項７に記載のウイルスベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】前記平滑筋細胞が、内臓平滑筋細胞であ
    る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のウイルスベク
    ター。
  10. 【請求項１０】薬学的に受容可能な溶液に分散される、
    請求項１〜９のいずれか１つに記載のウイルスベクタ
    ー。
  11. 【請求項１１】請求項１〜10のいずれかに記載のウイル
    スベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞が、血
    管平滑筋細胞、またはA7r5細胞である、宿主細胞。
  12. 【請求項１２】宿主動物における血管平滑筋細胞におい
    てマウスSM22α以外のポリペプチドの特異的発現を維持
    するための医薬の製造のための、請求項１〜10のいずれ
    かに記載のウイルスベクターの使用。
  13. 【請求項１３】非ヒト宿主動物の血管平滑筋細胞におい
    てマウスSM22α以外のポリペプチドの特異的発現を維持
    する方法であって、該細胞に請求項１〜10のいずれかに
    記載のウイルスベクターを提供する工程、および該細胞
    において該ペプチドの発現を得る工程、を包含する、方
    法。
  14. 【請求項１４】以下の工程：（ｉ）前記細胞を被験体に
    移植する工程であって、該被験体は非ヒト被験体であ
    る、工程；または（ii）該細胞を生物人工器官に播種し
    て、播種された移植片またはステントを得、そして該播
    種された生物人工器官を、被験体の冠状動脈または静脈
    あるいは末梢動脈または静脈に配置する工程であって、
    該被験体は非ヒト被験体である、工程のいずれか、をさ
    らに包含する、請求項12に記載の医薬の製造のための使
    用。
  15. 【請求項１５】前記細胞が、静脈平滑筋細胞である、請
    求項12または14のいずれかに記載の医薬の製造のための
    使用。
  16. 【請求項１６】哺乳動物において血管平滑筋細胞増殖の
    特異的な調節を維持するための医薬の製造のための、請
    求項５、または７〜10のいずれか１項に記載のウイルス
    ベクターの使用。
  17. 【請求項１７】前記細胞周期調節分子が、血管壁におけ
    る平滑筋細胞において発現される場合に再狭窄を阻害す
    る能力があり、該再狭窄が、バルーン血管形成術後に、
    血管に対する機械的損傷から生じる、請求項16に記載の
    医薬の製造のための使用。
  18. 【請求項１８】前記血管が、冠状静脈、腎臓静脈、末梢
    静脈、または頸静脈のいずれかである、請求項17に記載
    の医薬の製造のための使用。
  19. 【請求項１９】前記ベクターが、カテーテルを介して、
    またはステント上のいずれかで、前記血管壁に送達され
    る、請求項17または18のいずれかに記載の医薬の製造の
    ための使用。
  20. 【請求項２０】前記ベクターが、前記構築物で、エキソ
    ビボにてトランスフェクトされた初代平滑筋細胞におい
    て前記血管壁に提供される、請求項17または18のいずれ
    かに記載の医薬の製造のための使用。
  21. 【請求項２１】哺乳動物における血管形成を促進するた
    めの医薬の製造のための、請求項３に記載のウイルスベ
    クターの使用。
  22. 【請求項２２】前記平滑筋細胞が、（ｉ）前記構築物
    が、ステント上で該平滑筋細胞に送達されるか、または
    該構築物が、該構築物で、エキソビボにてトランスフェ
    クトされた初代平滑筋細胞において前記哺乳動物に提供
    される、血管平滑筋細胞、あるいは（ii）該構築物が、
    カテーテルを介して該平滑筋細胞に送達される、冠状ま
    たは末梢平滑筋細胞、のいずれかである、請求項21に記
    載の医薬の製造のための使用。
  23. 【請求項２３】哺乳動物における血管に目的の分子を提
    供するための医薬の製造のための、第一の核酸セグメン
    トでトランスフェクトされた平滑筋細胞で播種された生
    物人工器官の使用であって、該第一の核酸セグメント
    は、マウスSM22α以外の該目的の分子をコードするDNA
    配列に作動可能に連結されたSM22αプロモーター領域を
    含み、該第一の核酸セグメントが、請求項１〜10のいず
    れかに記載のウイルスベクターを介してトランスフェク
    トされる、使用。
  24. 【請求項２４】播種された生物人工器官をエキソビボに
    て作製するためのキットであって、以下： （ａ）マウスSM22α以外の遺伝子に作動可能に連結され
    たSM22αプロモーター領域を含む、第一の核酸セグメン
    ト：および （ｂ）該第一の核酸セグメントを受容する能力がある、
    血管平滑筋細胞を含む、生物人工器官、 を含み、 ここで、第一の核酸セグメントが、請求項１〜10のいず
    れかに記載のウイルスベクター内で保持される単離され
    た核酸構築物である、キット。
  25. 【請求項２５】その表面上に、第一の核酸セグメントで
    トランスフェクトされた血管平滑筋細胞を含む生物人工
    器官であって、該第一の核酸セグメントは、マウスSM22
    α以外の該分子をコードするDNA配列に作動可能に連結
    されるSM22αプロモーター領域を含み、 ここで、第一の核酸セグメントが、請求項１〜10のいず
    れかに記載のウイルスベクター内で保持される単離され
    た核酸構築物である、生物人工器官。
  26. 【請求項２６】さらに、以下： （ｉ）被験体へ前記細胞を移植する工程であって、該被
    験体は、非ヒト被験体である、工程；または（ii）生物
    人工器官へ該細胞を播種して、播種された移植片または
    ステントを入手する工程、そして該播種された生物人工
    器官を、被験体の冠状動脈または静脈あるいは末梢動脈
    または静脈に配置する工程であって、該被験体は非ヒト
    被験体である、工程、 のいずれかを包含する、請求項13に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記細胞が動脈または静脈の平滑筋細胞
    である、請求項13または26のいずれかに記載の方法。
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