FR2756570A1

FR2756570A1 - Promoteur de la ve-cadherine et ses utilisations

Info

Publication number: FR2756570A1
Application number: FR9614801A
Authority: FR
Inventors: Philippe Huber; Monique Laurent; Sylvie Gory
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1996-12-03
Publication date: 1998-06-05
Anticipated expiration: 2016-12-03
Also published as: WO1998024892A1; EP0948611A1; FR2756570B1; CA2272994A1; US6524815B1; JP2001504708A

Abstract

L'invention est relative au clonage du promoteur de la VE-cadhérine, ce promoteur est en particulier utilisable pour l'expression tissu-spécifique d'un gène d'intérêt dans l'endothélium vasculaire. L'invention concerne également des cellules transformées et des animaux transgéniques comprenant lesdits promoteurs.

Description

PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE ET SES UTILISATIONS.

La présente Invention est relative à un promoteur actif dans l'endothélium vasculaire, et à son utilisation pour exprimer des gènes d'intérêt dans ce tissu.

L'endothélium vasculaire est une monocouche cellulaire formée d'environ mille milliards de cellules endothéliales, réparties dans l'ensemble de l'organisme.

L'endothélium contrôle la perméabilité vasculaire aux fluides et aux cellules sanguines et régule l'hémostase et la thrombose. L'altération de l'homéostasie vasculaire peut induire des pathologies graves, telles que l'artériosclérose, facteur majeur des maladies cardio-vasculaires qui représentent la première cause de mortalité dans les pays occidentaux, ou la prolifération vasculaire incontrôlée observée par exemple dans les maladies inflammatoires (arthrite rhumatoïde), la rétinopathie diabétique, l'angiogénèse tumorale ou les tumeurs vasculaires (angiosarcomes, sarcome de Kaposi).

La possibilité de moduler les réponses des cellules endothéliales en dirigeant l'expression d'un gène d'intérêt dans ces cellules peut trouver de nombreuses applications, telles que par exemple
- dans le cas des maladies cardio-vasculaires, la synthèse directe par la paroi vasculaire d'agents fibrinolytiques tels que les activateurs du plasminogène : uPA et tPA
- le contrôle de la prolifération vasculaire
* soit pour la stimuler, par exemple afin de recréer une surface anti-thrombotique après dénudation du vaisseau (artériosclérose), et éviter une resténose après angioplastie, ou afin de promouvoir une revascularisation de tissus ischémiés
* soit pour la freiner, par exemple pour inhiber la progression tumorale en détruisant la vascularisation des tissus cancéreux. Ceci peut être obtenu par exemple, par la fabrication de mutants dominant-négatifs pour des récepteurs de facteur de croissance (flk-l, flt-l, ...), ou par l'utilisation d'ARN antisens.

En outre, l'endothélium vasculaire étant en contact direct avec le sang, il est facilement accessible aux vecteurs de gènes introduits par voie veineuse, et les produits des gènes qu'il exprime peuvent être sécrétés directement dans le sang circulant. Ces propriétés peuvent être mises à profit pour obtenir la sécrétion de protéines (facteurs de coagulation, hormones, etc...) dans le flux sanguin.

Par ailleurs, du fait de leur présence, au niveau des capillaires, dans tout l'organisme, les cellules de l'endothélium vasculaire constituent un hôte particulièrement intéressant pour exprimer, près de leur site d'action, des effecteurs cellulaires tels que, par exemple, des récepteurs de cytokines ou des compétiteurs de ces récepteurs.

Enfin, les cellules endothéliales ont une durée de vie qui, chez l'homme, peut atteindre de 5 à 20 années [FAN et al. ; TIPS, 16, p. 57, (1995)] . Des cellules endothéliales transduites peuvent donc survivre et exprimer un transgène pendant un temps relativement long.

L'étude des fonctions in vivo de l'endothélium vasculaire, ainsi que la modification de ces fonctions dans un but thérapeutique nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant d'évaluer individuellement le rôle de chacune des protéines exprimées par les cellules endothéliales, qu'il s'agisse de sur-exprimer ou de sousexprimer une protéine produite naturellement par ces cellules, d'évaluer l'activité de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ou d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue.

Pour être en mesure d'utiliser effectivement les potentialités du transfert de gènes dans l'endothélium vasculaire, il faut disposer de vecteurs permettant d'obtenir une expression stable d'un gène d'intérêt dans les cellules endothéliales, in vitro et également in vivo ; cette expression doit en outre, dans certains cas, être spécifique de ce tissu, afin d'éviter les problèmes qui pourraient résulter d'une expression ubiquitaire.

On connaît actuellement un certain nombre de protéines, qui sont exprimées plus ou moins spécifiquement dans l'endothélium, et dont les promoteurs constituent des candidats potentiels pour l'expression tissu-spécifique d'un gène hétérologue le facteur Von
Willebrand [FERREIRA et al., Biochem. J. 293, p. 641-648, (1993)], PECAM-1 (CD31) [De LISSER et al., Immunol.

Today, 15, p. 490, (1994)], la préproendothéline-l [HARATS et al., J. Clin. Invest. 95, p. 1335, (1995)], l'intégrine avss3 [BROOKS et al., Science, 264, p. 569, (1994)], la P-sélectine [PAN et Mc EVER, J. Biol. Chem.

268, p. 22600, (1993)], la VE-cadhérine [LAMPUGNANI et al., J. Cell. Biol. 118, p. 1511-1522, (1992) ; BREIER et al., Blood, 87, p. 630-641, (1996)], la E-sélectine [WHITLEY et al., Mol. Cell. Biol., 14, p. 6464, (1994)], le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (Flk-l ou KDR) [MILLAUER et al., Cell. 72, p.

835-846, (1992)] et un récepteur tyrosine-kinase appelé tie-2 [SCHLAEGER et al., Development, 121, p. 1089-1098, (1995)]-
Certains des promoteurs régulant l'expression des gènes ci-dessus ont été clonés et étudiés in vitro en culture de cellules, en particulier ceux de la Esélectine, du facteur de Von Willebrand et de la préproendothéline-1 [INOUE et al., J. of Biol. Chem. 264, p. 14954-14959, (1989)]. Même si des séquences consensus pour la liaison de facteurs de transcription connus ont été identifiées dans certains de ces promoteurs, aucune séquence responsable de la spécificité endothéliale de l'expression n'a encore été caractérisée.

Par exemple, dans le cas du promoteur de la préproendothéline, on observe in vivo une expression qui n'est pas limitée à l'endothélium, mais se retrouve dans d'autres types cellulaires, tels que l'épithélium respiratoire et intestinal et les cellules de la media vasculaire [HARATS et al., J. Clin. Invest., 95, p. 1335, (1995)]-
En outre, dans de nombreux cas, les observations faites in vitro ne reflètent pas l'activité réelle et la spécificité de la séquence promotrice in vivo, d'autant qu'il a été rapporté que cette activité et cette spécificité pouvaient, dans le cas d'un gène hétérologue, différer de celles observées avec le gène endogène.

Par exemple, l'influence des régions promotrices de tie-2, du facteur de Von Willebrand et de la préproendothéline sur l'expression d'un gène rapporteur ont été étudiées in vivo chez des souris transgéniques.

SCHLAEGER et al., [Development 121, p. 10891098, (1995)] ont ainsi observé que le promoteur de tie-2 qui, dans le cas du gène endogène, est actif au cours de la prolifération vasculaire chez l'embryon ou chez l'adulte a un comportement différent lorsqu'il est associé à un gène hétérologue ; il demeure actif lors du développement de la vascularisation de l'embryon de souris, mais ne l'est plus chez l'adulte, même lors de l'angiogénèse.

Le promoteur du facteur de Von Willebrand n'a permis l'expression du gène marqueur que dans certaines cellules endothéliales de cerveau, en revanche, le gène hétérologue a été exprimé dans d'autres tissus où le gène endogène n'est pas normalement exprimé [AIRD et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p. 4567-4571, (1995)].

Des travaux précédents auxquels ont participé les Inventeurs ont permis d'isoler des clones génomiques comprennant le gène de la VE-cadhérine, et de déterminer la position des introns et des exons [HUBER et al.

Genomics, 32, p. 21-28, (1996)]. Cependant, aucune séquence contrôlant la transcription de ce gène n'avait été mise en évidence.

Les Inventeurs ont maintenant identifié et cloné les séquences du promoteur de la VE-cadhérine, et ont en outre localisé des régions de ce promoteur responsables de l'expression tissu-spécifique dans les cellules endothéliales.

La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique dont la séquence est celle du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un fragment de celuici.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit fragment comprend au moins un domaine fonctionnel intervenant dans l'activité dudit promoteur.

Au sens de la présente invention, on entend par promoteur de la VE-cadhérine une séquence d'acide nucléique essentiellement constituée par les éléments nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine par un mécanisme similaire au mécanisme naturel ; on entend par domaine fonctionnel intervenant dans l'activité du promoteur de la VE-cadhérine aussi bien une région dudit promoteur comprenant les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription, qu'une région dudit promoteur comprenant des séquences intervenant dans la régulation en cis de l'initiation de la transcription.

Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, constituant un promoteur de la VE-cadhérine, tel que défini ci-dessus, sont représentées en particulier par
- un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris ; cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ; les positions 1 à 2509 de la séquence SEQ ID NO : 1 correspondent aux positions -2486 à +22 définies par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris
- des fragments d'acide nucléique comprenant le précédent, par exemple un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -5800 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.

Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, comprenant au moins un domaine fonctionnel, tel que défini ci-dessus, du promoteur de la VEcadhérine, sont représentées en particulier par
a) des fragments d'acide nucléique comprenant les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription. Il s'agit par exemple d'un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -139 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.

b) des fragments d'acide nucléique comprenant des séquences intervenant dans la régulation de la transcription, et en particulier dans sa spécificité tissulaire ; il s'agit en particulier
- d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -140 à la position -187 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VEcadhérine de souris
- d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -188 à la position -289 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VEcadhérine de souris
- d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -516 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VEcadhérine de souris, et des sous-fragments de celui-ci dont les séquences s'étendent respectivement de la position -516 à la position -1190 et de la position 1191 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.

Ces fragments comprennent des séquences qui augmentent la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales.

La présente invention englobe les molécules d'acide nucléique constituant des segments de plus de lopb, et de préférence de plus de 20pb des fragments mentionnés ci-dessus ; de telles molécules peuvent par exemple être utilisées comme sondes pour détecter une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention dans un mélange d'acides nucléiques, ou comme amorces pour procéder à son amplification.

I1 doit être bien entendu que les fragments d'acide nucléique spécifiés ci-dessus, qui peuvent être obtenus à partir du promoteur du gène de la VE-cadhérine de souris ne constituent qu'une illustration de l'objet de l'invention. Celle-ci englobe également en particulier, des molécules d'acide nucléique reproduisant la séquence de promoteurs ou des domaines fonctionnels homologues existant chez la souris ou chez d'autres espèces animales, et qui peuvent être obtenues par l'homme du métier par des techniques classiques de biologie moléculaire, en procédant au criblage d'une banque génomique de l'animal concerné à l'aide d'un ou plusieurs oligonucléotides de plus de 20pb reproduisant tout ou partie de la séquence de l'un des fragments mentionnés ci-dessus. De même, l'homme du métier peut, à partir des fragments comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine spécifiés cidessus, identifier les séquences constituant les domaines fonctionnels, par exemple par la technique des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant ces fragments avec des extraits nucléaires de cellules endothéliales, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules dans lesquels le promoteur de la VE-cadhérine est inactif. Ceci permet de construire différentes molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, par exemple en procédant à la délétion de séquences situées en dehors de ces domaines fonctionnels, et/ou éventuellement à leur substitution par d'autres séquences.

Les molécules d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels du promoteur de la VE-cadhérine peuvent être associées entre elles, ou avec des éléments fonctionnels provenant de promoteurs autres que celui de la VE-cadhérine, selon différentes combinaisons, pour obtenir des promoteurs qui se distinguent entre eux par leur niveau d'activité, et leur degré de spécificité.

Par exemple, si l'on souhaite obtenir un niveau d'activité élevé, sans rechercher une expression spécifique dans les cellules endothéliales, on utilisera une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription situés dans la séquence s'étendant entre la position +22 et la position -139 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris. Si l'on souhaite augmenter à la fois le niveau d'expression et la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales, on associera cette première molécule (ou une autre molécule d'acide nucléique comprenant des séquences nécessaires à l'initiation de la transcription), à une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s'étendant de la position -140 à la position -187 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris, et/ou à une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s'étendant de la position -188 à la position -289 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VEcadhérine de souris.

Si l'on souhaite privilégier la spécificité d'expression par rapport au niveau d'expression, on ajoutera une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s'étendant de la position -516 à la position -1190 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VEcadhérine de souris ; pour obtenir des promoteurs actifs dans les cellules endothéliales, et inactifs (c'est-àdire n'induisant pas l'expression d'un gène au-delà du niveau basal observé en l'absence de tout promoteur) dans les autres types cellulaires, cette molécule d'acide nucléique comprendra les éléments de régulation situés dans la séquence s'étendant de la position -516 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.

Les promoteurs obtenus à partir des molécules d'acide nucléique conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules de mammifère, et avantageusement, pour obtenir une expression spécifique dans les cellules de l'endothélium vasculaire. Le choix du promoteur le plus approprié parmi les promoteurs conformes à l'invention, dépend du niveau et de la spécificité d'expression que l'on souhaite obtenir.

L'objet de la présente Invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue.

Au sens de la présente Invention on entend par "hétérologue" relativement à une séquence donnée, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence.

Des molécules d'acide nucléique recombinant conformes à l'invention comprennent en particulier
a) des cassettes d'expression comprenant
- un promoteur qui contient au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention ; il peut s'agir du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un promoteur chimérique, comprenant au moins une domaine fonctionnel de celui-ci,
- et une séquence hétérologue placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.

b) des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement, ces vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci dessus.

De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule-hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte, etc...), ainsi que de la nature de la cellule-hôte.

L'Invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. De préférence, ces cellules sont des cellules animales, en particulier des cellules de mammifère. I1 peut s'agir de cellules endothéliales, ou de cellules d'un autre type cellulaire.

Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux (adénovirus, rétrovirus, etc...) dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur viral ou plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, ou bien l'injecter directement dans la cellule-hôte.

Le transfert de gènes dans l'endothélium vasculaire peut par exemple, être réalisé à l'aide d'adénovirus recombinants ou de liposomes [NABEL E. G.

Circulation, 91, p. 541-548, (1995) ; VON DER LEYEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p. 1137-1141, (1995) ; LARKIN et al., Transplantation, 61, p. 363-370, (1996)].

Les Inventeurs ont également obtenu des animaux transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue était placé sous contrôle transcriptionnel du promoteur de la VE-cadhérine et ont ainsi constaté que les propriétés de ce promoteur, et en particulier la spécificité d'expression dans les cellules de l'endothélium vasculaire se manifestaient non seulement in vitro, mais également in vive.

La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques nonhumains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit un gène d'intérêt sous contrôle du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un promoteur chimérique construit à partir des éléments de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales ; le gène d'intérêt est alors uniquement exprimé dans les cellules de l'endothélium vasculaire.

Les cellules transformées et les animaux transgéniques conformes à l'invention sont en particulier utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules endothéliales.

L'invention a également pour objet l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments, en particulier de médicaments destinés au traitement des pathologies telles que l'artériosclérose, ou les maladies tumorales. Par exemple, des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être incorporées dans des médicaments utilisables en particulier en thérapie génique.

La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'obtention et la caractérisation du promoteur de la VE-cadhérine et de domaines fonctionnels de celui-ci, ainsi qu'à leur utilisation pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cultures de cellules et dans des animaux transgéniques.

EXEMPLE 1 : CLONAGE DU PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE
Le clonage du gène de la VE-cadhérine murine, et le clone génomique lambda 1 contenant la région en amont du premier exon de ce gène ont été précédemment décrits par HUBER et al. [Genomics, 32, p. 21-28, (1996)].

Le fragment d'ADN SacI de 3653 pb issu du clone génomique lambda 1, contenant le premier exon, 2813 pb de région 5', et 782 pb au début du premier intron a été inséré dans le site SacI de pBluescript II
SK+ (STRATAGENE). La séquence de 1'insert a été déterminée par la méthode de Sanger sur les deux brins une partie de cette séquence est représentée en annexe.

Ne disposant pas de site de restriction unique dans le premier exon pour le clonage dans le vecteur d'expression
CAT, une stratégie PCR a été développée pour créer artificiellement un site XhoI en aval de la position +22.

La matrice est le plasmide décrit précédemment, l'armorce (5' -CCCGGAAAGATCTGCTCTCT-3') contient le site BglII à la position -1190, l'amorce 3' (5' -CTCCACTCGAGTCTGTCCAGGGCCGAGC-3') contient la séquence allant de +6 à +22 puis le site
XhoI. Le fragment amplifié, digéré par les enzymes XhoI et BglII, a été inséré dans les sites XhoI et BglII de pBLCAT3. Ce plasmide dénommé "-1190", dont l'insert a été vérifié par séquençage, constitue la base de départ de l'ensemble des constructions CAT mentionnées ci-après
La construction "-515' a été obtenue par insertion du fragment PvuII/XhoI issu de "-1190" dans les sites xbaî, comblé par l'enzyme de Klenow et XhoI de pBLCAT3.

La construction "-289" a été obtenue par insertion du fragment HindIII/XhoI dans les sites HindIII et XhoI de pBLCAT3.

La construction "-187" a été obtenue par insertion du fragment ApaI (extrémité sortante éliminée par action de l'ADN polymérase du phage T4)/XhoI issu de "-1190" dans les sites SalI comblé et XhoI de pBLCAT3.

La construction "-139" a été obtenue par insertion du fragment PstI/XhoI issu de pBLCAT3 dans les site PstI/XhoI de pBLCAT3.

La construction "-5800" a été obtenue par insertion du fragment Eco RI comblé/BglII de lambda 1 dans les sites SalI comblé et BglII de "-1190"
La construction "-2486" a été obtenue par insertion du fragment SpeI/BglII de lambda 1 dans les sites XbaI (non comblé) et XhoI de "-1190"
Afin de rechercher l'existence de zones promotrices dans ces différents fragments, ceux-ci ont été liés au gène rapporteur CAT (chloramphénicol acétyl transférase), en les clonant dans le vecteur d'expression pBLCAT3 [LUCKOW et SCHUTZ, Nucl. Acids Res. 15, p. 5490, (1987)] en amont du gène CAT.

La construction dénommée ici "HSVTK", qui est similaire à la construction pBLCAT2 décrite par LUCKOW et
SCHUTZ (publication précitée), et qui contient le gène
CAT sous contrôle du promoteur du gène tymidine kinase du virus de l'herpès, la construction dénommée ici "RSV", qui est le vecteur décrit par GORMAN et al. [Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 79, p. 6777-6781, (1982)] et qui contient le gène CAT sous contrôle des LTR du virus du sarcome de
Roux , ont été utilisées à titre de témoins positifs. Des constructions dérivées des précédentes par délétion des promoteurs contrôlant l'expression du gène CAT, ont été utilisées à titre de témoins négatifs.

Un plasmide d'expression de la luciférase contenant le gène "luc+" (PROMEGA) inséré dans le vecteur pCDNA3 (IN VITROGEN) a été utilisé pour étalonner les mesures de l'activité CAT, selon le protocole décrit par
HUBER et al. [J. Biol. Chem. 265, p. 5696-5701, (1990)].

Ces constructions ont été utilisées pour transfecter d'une part des cellules endothéliales d'aorte de boeuf ("BAEC"), provenant d'aortes de boeuf traitées à la collagènase [MOORE et al., Clin. Invest., 79, p.124130, (1987)], et d'autre part des cellules des lignées 3T3 ('NIH-3T3" ; lignée fibroblastique), HeLa (lignée épithéliale), HepG2 (lignée hépatocytaire), Hel et Lin 175 (lignées hématopolétiques) obtenues à l'ATCC.

Dans une première série d'expérimentations, l'activité CAT des constructions comprenant les différents fragments de restriction obtenus à partir du clone génomique lambda a été déterminée dans les cellules des lignées BAEC et 3T3, en utilisant comme témoins la construction HSVTK et la construction sans promoteur correspondante.

Dans une seconde série d'expérimentations, l'activité CAT de la construction comprenant le fragment -2486, +22 a été déterminée dans les cellules des lignées
BAEC , 3T3, HeLa, HepG2, Hel et Lin 175, en utilisant comme témoins la construction HSVTK, la construction RSV, et les constructions sans promoteur correspondantes.

Les cellules ont été cultivées dans du milieu
DMEM (GIBCO) contenant 10% de sérum de veau foetal (15% pour les BAEC).

Les cellules BAEC, 3T3, HeLa et HepG2 ensemencées la veille (106 cellules), ont été transfectées par la méthode au phosphate de calcium [WIGLER et al.,
Cell., 11, p. 223-232, (1977)] avec 3,5 picomoles de construction CAT et 5 microgrammes de plasmide exprimant la luciférase.

Les cellules Hel et Lin 175 (10 cellules) ont été transfectées par électroporation (GENE PULSER BIO
RAD, réglé à 400V et 960 microfarad) dans 0,8 ml de PBS avec 3,5 picomoles de construction CAT, 10 microgrammes de plasmide luciférase et 50 microgrammes d'ADN de sperme de saumon comme entraîneur.

Dans tous les cas, les extraits cellulaires ont été préparés 2 jours après la transfection par 3 cycles de congélation/décongélation.

Préalablement à la détermination de l'activité
CAT, l'activité luciférase a été déterminée sur un aliquote des extraits cellulaires à l'aide d'un kit (PROMEGA) et d'un luminomètre (LKB).

Les résultats de la première série d'expérimentations sont illustrés par la Figure 1 l'équivalent de 1200 et 3000 unités lumineuses arbitraires des extraits cellulaire obtenus respectivement à partir des BAEC et des 3T3, a été utilisé pour la détermination de l'activité CAT.

Les résultats reproduits sur la Figure 1 représentent les moyennes de 5 à 10 transfections effectuées en dupliqué.

Les constructions comprenant les différents fragments obtenus à partir du clone génomique lambda sont identifiées par la position de l'extrémité 5' du fragment concerné (par rapport au site d'initiation de la transcription) "Sans prom" indique la construction contenant le gène CAT seul ; "HSVTK", indique le témoin positif.

Ces résultats permettent d'établir
1) que toutes les constructions (à l'exception du témoin négatif) s'expriment de façon significative dans les cellules endothéliales ; on observe toutefois une diminution d'environ 50% de l'activité pour les constructions de -515 à -5800 par rapport aux constructions allant de -139 à -289
2) que les constructions proximales sont actives dans les fibroblastes, mais que cette activité diminue progressivement lorsqu'on allonge le fragment pour devenir négligeable et comparable au bruit de fond (construction sans promoteur) pour les fragments -2486 et -5800. Ces deux constructions peuvent être considérées comme tissu-spécifiques.

La deuxième série d'expérimentations a été effectuée avec la construction comprenant le fragment -2486, +22. La séquence de ce fragment est représentée sur la liste de séquences en annexe sous le numéro
SEQ ID NO : 1.

L'activité promotrice de cette construction a été déterminée dans différents types cellulaires. Les résultats sont illustrés par la Figure 2 : les activités
CAT ont été déterminées avec l'équivalent de 200 unités lumineuses arbitraires pour Hel, 3000 unités pour HepG2, 150 unités pour Hela et 200 unités pour Linl75 ; 1200 unités pour BAEC et 3000 unités pour 3T3.

-2486 indique la construction comprenant le fragment -2486, +22 ; 0 indique la construction contenant le gène CAT seul ; "HSVTK", et RSV indiquent les témoins positifs.

Ces résultats confirment que la construction comprenant le fragment -2486, +22 n'est active que dans les cellules endothéliales.

EXEMPLE 2 : PRODUCTION ET ANALYSE DES SOURIS
TRANSGENIQUES EXPRIMANT UN GENE RAPPORTEUR SOUS CONTROLE
DU PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE
Un plasmide pBLCAT3 contenant le promoteur -2486, +22, obtenu comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, a été digéré par les endonucléases SacI et SalI , et le fragment de restriction obtenu, qui comprend le gène CAT et le promoteur -2486, +22 a été purifié. Ce fragment a été injecté dans des oeufs de souris qui ont été réimplantés dans des souris pseudo-gestantes, selon le protocole décrit par HOGGAN et al. [Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (1994)].

Les 2 fondateurs obtenus (lignée 28 et lignée 23) ont été génotypés par la technique de Southern et le nombre de copies de transgène dans chacun d'eux a été estimé par analyse quantitative au PHOPHORIMARGER (MOLECULAR DYNAMICS).

L'activité enzymatique CAT a été mesurée sur des homogénats de différents organes d'animaux adultes descendant (F1) de chacun de ces 2 fondateurs.

Les résultats sont illustrés par le tableau I ci dessous
TABLEAU I

<tb> <SEP> lignée <SEP> 28 <SEP> lignée <SEP> 23
<tb> nombre <SEP> de
<tb> transgènes <SEP> 16 <SEP> 8
<tb> <SEP> activité <SEP> CATa
<tb> coeur <SEP> 440 <SEP> (1) <SEP> 85,3 <SEP> (1)
<tb> foie <SEP> 162 <SEP> (0,37) <SEP> 25,7 <SEP> (0,30)
<tb> cerveau <SEP> 252 <SEP> (0,57) <SEP> 50,6 <SEP> (0,59)
<tb> poumon <SEP> 1298 <SEP> (2,95) <SEP> 275 <SEP> (3,22)
<tb> rate <SEP> 148 <SEP> (0,34) <SEP> 21,2 <SEP> (0,25)
<tb> rein <SEP> 168 <SEP> (0,38) <SEP> 22,6 <SEP> (0,26)
<tb> thymus <SEP> 145 <SEP> (0,33) <SEP> 12,9 <SEP> (0,15)
<tb> peau <SEP> 169 <SEP> (0,38) <SEP> 19,7 <SEP> (0,23)
<tb> cellules <SEP> sanguines <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> < <SEP> 0,01
<tb> plasma <SEP> 0,5 <SEP> (0,0011) <SEP> 0,63 <SEP> (0,007)
<tb> a en pMole de chloramphénicol acétylé par heure et par ug d'extrait protéique ; l'activité relative par rapport au coeur est indiquée entre parenthèses.

On observe une activité CAT forte, et corrélée positivement au degré de vascularisation des tissus concernés, et au nombre de copies du transgène dans chaque lignée. Seules les cellules sanguines ne présentent pas d'activité décelable. En outre, le profil d'expression observé pour les deux lignées de souris transgéniques est identique, ce qui permet d'exclure une influence potentielle du site d'intégration sur l'expression du transgène. Ceci démontre le caractère tissu-spécifique in vivo de l'expression contrôlée par le promoteur du gène de la VE-cadhérine.

La localisation de l'expression de la CAT chez les souris transgéniques a également été étudiée par immunohistochimie.

Des embryons âgés de 13,5 jours ont été prélevés, fixés 2 h dans du paraformaldéhyde 4% dans le
PBS, puis incubés 1h à 220C dans du tampon PBS/Saccharose 15%, une nuit dans du PBS/saccharose 30W et enfin congelés dans de l'OCT (TISSUTEK) à l'aide d'un bain carboglace/éthanol. Des coupes parasagittales de 10 micromètres, réalisées grâce à un cryostat (LEICA), séchées 5 min à 450C et de nouveau fixées 30 min en
PBS/paraformaldéhyde 4% ont été incubées avec différents anticorps anti-CAT, anti VE-cadhérine, et anti-PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-l, utilisé ici comme marqueur endothélial). Les complexes antigène/anticorps révélés par un second anticorps marqué, dans les conditions résumées dans le tableau II ci dessous.

TABLEAU II

<tb> <SEP> Protéine <SEP> Premier <SEP> Conditions <SEP> Deuxième <SEP> Conditions
<tb> <SEP> marquée <SEP> anticorps <SEP> -d'incubation <SEP> anticorps <SEP> d'incubation
<tb> <SEP> IgY <SEP> (PROMEGA) <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 40C <SEP> anti <SEP> IgY-FITC <SEP> 1 <SEP> h <SEP> à <SEP> 220C
<tb> CAT <SEP> di1.1/300 <SEP> (PROMEGA)
<tb> <SEP> dix. <SEP> 1/100 <SEP>
<tb> <SEP> sérum <SEP> de <SEP> lapin <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 40C <SEP> anti <SEP> IgG <SEP> de <SEP> 1 <SEP> h <SEP> à <SEP> 220C
<tb> VE- <SEP> du1.1/300 <SEP> lapin-TRITC
<tb> cadhérine <SEP> (JACKSON)
<tb> <SEP> dil.1/100 <SEP>
<tb> <SEP> monoclonal <SEP> de <SEP> 16h <SEP> à <SEP> 40C <SEP> anti <SEP> IgG <SEP> de <SEP> 1 <SEP> h <SEP> à <SEP> 22CC <SEP>
<tb> <SEP> rat, <SEP> rat-FITC
<tb> PECAM <SEP> 1 <SEP> surnageant <SEP> JACKSON
<tb> <SEP> d'hybridome <SEP> dil.1/100 <SEP>
<tb> <SEP> pur
<tb>
L'observation des coupes histologiques montre que l'expression de la protéine CAT est restreinte à l'endothélium, et permet d'observer une colocalisation entre la CAT et la VE-cadhérine endogène, ainsi qu'entre la CAT et le PECAM-1.

LISTE DE SEQUENCES
NOMBRE DE SEQUENCES : 1
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR : 2509 paires de bases
(B) TYPE : nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS : double
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 :
ACTAGTAGCA GAAACAAGGT CCTCTGGAAG AGCAACTGAT GCTCTTAGGT ACTGAAGCAT 60
CATCCTGCCC CAGAGACCAC TCGCATATGA AGCACACATA TTCAGTCTGC CTTACTTGTG 120
TTAATGATTG CCAGTGTCCC TCTGACCTCC TAGCCCTGAA AAGGTGTGGC CTGAAGGTCA 180
TTTCAGAGAC GGGGAGAGCT GCTCAGAGAA GCCAATCGGC GAGTCTAGGA CACACAGACA 240
GGATCTAGTC CCAGAGTTCG CTAGCCTAGG TGAGCGTCCC CTGGCCCCTT ATACCACTTC 300
CTTCTCCAGC TTGCATCTAA TTCGCTCTGG CAGACCATCG TGTTTCCTGT CTTCCTGGCA 360
GCCTCCAGCA CGCTCAGTGC TACTCCCTCG CATGCGCCCT CCTCCCAGTA CCTTCTCTGA 420
CTCCAGTGGG CTTGGAGTGC GAGGAGGAAG GGTGAGGAAG GGGTGAAATC AGGTATTGGA 480
TCCACAGGGG GTCTGAAGAG CACTAGCCTG GCCTTTTGGG ACTGAACTTC TGCTATGAAG 540
ACCTCCACTG CCATCCCTGG AGTCCGGGGC ACATCCAAGG GTTGCTGTCC ATCGTTTAAC 600
TGTTTACAGA TGACAACAAT GACTCGTGTT CGGGGCAGAA ATATCACCAG GGCTAGAGTA 660 CAAAAGGAGT TTGCATTGAT GGCCGGACAG GCCTGTCCCT GGACCAGCCT GCGACGCTGA 720
GTATGAGACC CAGCGGAAGT GCTACCCTGG CAGACGTGTC ACTGAGTACA CAGACCACCA 780
AGGCAGGCAG CTCTCGGGGA AGCTGTCTAT GCTGGGCCAG CCCACCTTGA GGGCAGGGAA 840
CAGAACAGAT TGTGGCAGAG AGGAAAATGT GGAGCTTCTG TTTGTTCACA GACACACGCA 900
CTCGCCCACG CACGCACGCA CGCACGCACG CACGCACGAA TGCACGCACG CAGTAGTTGA 960
ATGCTATGGA TTCCGCTCAG AGCTGAGAAC AGCCCCAGCG ACAGTTCCCT GGCCTCTCTC 1020
CTTACTCTGA TGTCCTCATC TGTCTTCACA TGGTCTCAGG ACGCTAATAC TCCATCCTAA 1080
TGTACACTCC TTTCCCTGGG CCTCCGTTCC AGTTCAGTTC TCAGAGGACC TGGAGGGAGT 1140
GATTGGCTAC ACCAACTTTG CTTTCGTTCA CCAAGCCCAT GTCTCTACTT GGGTGTCTAA 1200
TGGGCATCTC CAACATTACC TACCCCAAAC AGAAAACCCT TTCTTCCCCC CAACCACACC 1260
CCACCCTACC CCCACAGTAT TTTCTCCATG CCCGGAAAGA TCTGCTCTCT TATGGTCCCT 1320
CTTTGCCTCA CTGAAAAGCA GGACAAGTTG GGGAACTTCC CAAACTTTTA TGCATGAAGA 1380
AACCCAGGCA ATTTGCCAAA AGGTACACTC TGGGGGTCTG TCATTTACTC TGAGCCAGAA 1440
CCCTGAAATT TTTACTAACC CATCACATAA TGAATGAAGA GAATCTTTTT CTTTTTTTTT 1500
TTTTTTCTTT TTTTTTGGTT TTTCGAGACA GGGTTTCTCT GTATAGCCCT GGCTATCCTG 1560
GAACACACTC TGTAGACCAG GCTGGCCTCG AACTCAGAAA TCCACCTGCC TCTGCCTCCC 1620
GAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGCGCCACCA CGCCTGGCTG AATGAAGAGA ATCTTGACCT 1680
CATCTCCCCA GCCTCTTGGT CCTGAGGGAC CCTGGTCTAC CTACTGCTTT GCTGTCTTCT 1740
TAGCTCTTCT TACTTTTTTG CTGACTCAGA CCTATGGCTA TCTCCATTAT ACAGATGAGG 1800
AGACTGAGGC ATGGATCCCT GGTTGGTCCA TGGTCACGTG AAGCCCATCA CCCAGTATTT 1860
GTAAAGTGAG ATGGGCCAGG CTGGTACCTT GGAACTGAAA CTCACACTGC CCTACCTGGA 1920
AGAATCTGAC AGGCAAAATC TGCTGCTGAA AGTGATTGTC TGTCACGTTT CTCAGCTGCC 1980
CGACTCTGAG AACTCCACAG CCCCCTTTCG TTCCACCATA CTACAGAGTC GCCACGGAAA 2040
GCCGGCTCTG TGGAGAAGCT GAGGTAGCTG GGTTTCTGTC TGGGTTACTC TGTCCAGCGA 2100
GGAAACAAGT ACCTTAGACC CACTAAGCCT CTGCTTTCTG AACTGTAAAG TGGGGGATAT 2160
GACACCTGCC TCCCAGGGAT GGCTGAATGC TCTGGCAGAA GCTTAGAGCC CCCACAGCTA 2220
CCCCTAGGCT CACAGCTCCT CCGATGAGAC CTAGAATTGA GGTATGAGTT GAATACCCCA 2280
GGCAGGTCCA AGGCTTCCAC GGGCCCAGGC TGACCAAGCT GAGGCCGCCC ACCGTAGGGC 2340 TTGCCTATCT GCAGGCAGCT CACAAAGGAA CAATAACAGG AAACCATCCC GAGGGGAAGT 2400
GGGCCAGGGC AAGTTGGAAA ACCTGCCTCC CTCCCAGCCT GGGTGTGGCT CCCCTCTCCC 2460
CTCCTGAGGC AATCAACTGT GCTCTCCACA AAGCTCGGCC CTGGACAGA 2509

Claims

REVENDICATIONS

1) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce que sa séquence est celle du promoteur de la VEcadhérine, ou d'un fragment de celui-ci.

2) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment comprend au moins un domaine fonctionnel intervenant dans l'activité dudit promoteur.

3) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1, ou un fragment de celle-ci.

4) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine contenant des séquences nécessaires à l'initiation de la transcription.

5) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine contenant des séquences conférant une spécificité d'expression dans les cellules de 1'endothélium vasculaire.

6) Molécule d'acide nucléique constituant une cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur qui contient au moins une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 5, et une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.

7) Vecteurs recombinants comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6.

8) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6.

9) Cellule transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de mammifère.

10) Animal transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6.

11) Animal transgénique selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère.

12) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6 pour l'obtention de médicaments.