WO1998024892A1 - Promoteur de la ve-cadherine et ses utilisations - Google Patents

Promoteur de la ve-cadherine et ses utilisations Download PDF

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WO1998024892A1
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cadherin
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Philippe Huber
Monique Laurent
Sylvie Gory
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Commissariat A L'energie Atomique - C.E.A.
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Definitions

  • the present invention relates to a promoter active in the vascular endothelium, and to its use for expressing genes of interest in this tissue.
  • L 1 vascular endothelium is a cell monolayer formed by about one trillion endothelial cells, distributed throughout the body.
  • the endothelium controls vascular permeability to fluids and blood cells and regulates hemostasis and thrombosis.
  • the deterioration of the vascular homeostasis can induce serious pathologies, such as arteriosclerosis, major factor of cardiovascular diseases which represent the first cause of mortality in Western countries, or the uncontrolled vascular proliferation observed for example in diseases inflammatory (rheumatoid arthritis), diabetic retinopathy, tumor angiogenesis or vascular tumors (angiosarcomas, Kaposi's sarcoma).
  • vascular endothelium being in direct contact with the blood, it is easily accessible to gene vectors introduced via the venous route, and the gene products which it expresses can be secreted directly into the circulating blood. These properties can be used to obtain the secretion of proteins (coagulation factors, hormones, etc.) in the blood stream.
  • the cells of the vascular endothelium constitute a particularly interesting host for expressing, near their site of action, cellular effectors such as, for example, cytokine receptors or competitors of these receptors.
  • endothelial cells have a lifespan which, in humans, can reach from 5 to 20 years [FAN et al. ; TIPS, 16, p. 57, (1995)]. Transduced endothelial cells can therefore survive and express a transgene for a relatively long time.
  • tie-2 a tyrosine kinase receptor called tie-2 [SCHLAEGER et al., Development, 121, p. 1089-1098,
  • an expression is observed in vivo which is not limited to the endothelium, but is found in other cell types, such as the respiratory and intestinal epithelium and the cells. of the vascular media [HARATS et al., J. Clin. Invest. , 95, p. 1335, (1995)].
  • tie-2 promoter regions For example, the influence of tie-2 promoter regions, von Willebrand factor and preproendothelin on the expression of a reporter gene have been studied in vivo in transgenic mice.
  • tie-2 promoter which, in the case of the endogenous gene, is active during vascular proliferation in the embryo or in the adult has a different behavior when it is associated with a heterologous gene; it remains active during the development of the vascularization of the mouse embryo, but is no longer active in adults, even during
  • the Von Willebrand factor promoter only allowed expression of the marker gene in certain brain endothelial cells, however, the heterologous gene was expressed in other tissues where the gene endogenous is not normally expressed [AIRD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p. 4567-4571, (1995)].
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule whose sequence is that of the promoter of VE-cadherin, or a fragment thereof.
  • said fragment comprises at least one functional domain involved in the activity of said promoter.
  • VE-cadherin promoter is intended to mean a nucleic acid sequence essentially constituted by the elements necessary for controlling the initiation of transcription of the VE-cadherin gene by a similar mechanism with natural mechanism; “functional domain involved in the activity of the VE-cadherin promoter” is understood to mean both a region of said promoter comprising the sequences necessary for initiating transcription, and a region of said promoter comprising sequences involved in regulation in cis of initiation of transcription.
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention constituting a promoter of VE-cadherin, as defined above, are represented in particular by: a nucleic acid fragment whose sequence extends from position +22 to position -2486 relative to the site of initiation of transcription of the gene of the VE - mouse cadherin; this sequence is represented in the attached sequence list under the number SEQ ID NO: 1; positions 1 to 2509 of the sequence SEQ ID NO: 1 correspond to positions -2486 to +22 defined with respect to the site of initiation of transcription of the gene for mouse VE-cadherin;
  • nucleic acid fragments comprising the preceding one, for example a nucleic acid fragment whose sequence extends from position +22 to position -5800 relative to the site of initiation of transcription of the gene of the VE - mouse cadherin.
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention comprising at least one functional domain, as defined above, of the promoter of VE-cadherin, are represented in particular by: a) nucleic acid fragments comprising the sequences necessary for initiating transcription. It is for example a nucleic acid fragment whose sequence extends from position +22 to position -139 relative to the site of initiation of transcription of the gene for mouse VE-cadherin. b) nucleic acid fragments comprising sequences involved in the regulation of transcription, and in particular in its tissue specificity; in particular:
  • fragments include sequences which increase the specificity of expression in endothelial cells.
  • the present invention encompasses nucleic acid molecules constituting segments of more than 10 bpb, and preferably more than 20 bp of the fragments mentioned above; such molecules can for example be used as probes for detecting a nucleic acid molecule according to the invention in a mixture of nucleic acids, or as primers for carrying out its amplification.
  • nucleic acid fragments specified above which can be obtained from the promoter of the mouse VE-cadherin gene, constitute only an illustration of the object of the invention.
  • This also includes, in particular, nucleic acid molecules reproducing the sequence of promoters or homologous functional domains existing in mice or in other animal species, and which can be obtained by a person skilled in the art by techniques. molecular biology, by screening a genomic library of the animal concerned using one or more oligonucleotides of more than 20 bp reproducing all or part of the sequence of one of the fragments mentioned above .
  • a person skilled in the art can, at from the fragments comprising at least one functional domain of the VE-cadherin promoter specified above, identify the sequences constituting the functional domains, for example by the technique of DNA fingerprints, by incubating these fragments with nuclear extracts of endothelial cells, as well as with nuclear extracts of cells in which the VE-cadherin promoter is inactive.
  • identify the sequences constituting the functional domains for example by the technique of DNA fingerprints, by incubating these fragments with nuclear extracts of endothelial cells, as well as with nuclear extracts of cells in which the VE-cadherin promoter is inactive.
  • nucleic acid molecules comprising functional domains of the VE-cadherin promoter can be associated with one another, or with functional elements originating from promoters other than that of VE-cadherin, according to different combinations, in order to obtain promoters which are distinguish between them by their level of activity, and their degree of specificity.
  • nucleic acid molecule comprising the elements necessary for the initiation of transcription located in the sequence s extending between position +22 and position -139 relative to the site of initiation of transcription of the gene for mouse VE-cadherin.
  • this first molecule (or another nucleic acid molecule comprising sequences necessary for the initiation of transcription) will be combined ), to a nucleic acid molecule comprising the regulatory elements located in the sequence extending from position -140 to position -187 with respect to the site of initiation of the transcription of the gene for mouse VE-cadherin, and / or to a nucleic acid molecule comprising the regulatory elements located in the sequence extending from position -188 to position -289 relative to the site of initiation of transcription of the gene for mouse VE-cadherin.
  • nucleic acid molecule comprising the regulatory elements located in the sequence extending from position -516 to position -1190 by relation to the site of initiation of the transcription of the gene for mouse VE-cadherin; to obtain promoters active in endothelial cells, and inactive (that is to say, not inducing the expression of a gene beyond the basal level observed in the absence of any promoter) in the other types cellular, this nucleic acid molecule will comprise the regulatory elements located in the sequence extending from position -516 to position -2486 relative to the site of initiation of transcription of the gene for mouse VE-cadherin.
  • the promoters obtained from the nucleic acid molecules in accordance with the present invention can be used to control the expression of a heterologous gene in mammalian cells, and advantageously, to obtain specific expression in cells of the endothelium. vascular.
  • the choice of the most suitable promoter among the promoters in accordance with the invention depends on the level and the specificity of expression which it is desired to obtain.
  • the object of the present invention also encompasses recombinant nucleic acid molecules comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention linked to at least one heterologous sequence.
  • heterologous relative to a given sequence means any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said sequence.
  • the object of the present invention includes in particular: a) expression cassettes comprising: a promoter which contains at least one nucleic acid molecule according to the invention; it may be the VE-cadherin promoter, or a chimeric promoter, comprising at least one functional domain thereof, and a heterologous sequence placed under transcriptional control of said promoter.
  • these vectors are expression vectors, comprising at least one expression cassette as defined above.
  • Many vectors into which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form, or else integration into the chromosomal material of the host, etc.), as well as the nature of the host cell.
  • the invention further relates to prokaryotic or eukaryotic cells transformed with at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • these cells are animal cells, in particular mammalian cells. They can be endothelial cells, or cells of another cell type.
  • Transformed cells according to the invention can be obtained by any means, known in themselves, making it possible to introduce a nucleic acid molecule into a host cell.
  • viral vectors adenovirus, retrovirus, etc.
  • said sequence can also be associated (isolated or inserted into a viral or plasmid vector) with a substance allowing it to cross the membrane of host cells, for example a preparation of liposomes, or else inject it directly into the host cell.
  • genes into the vascular endothelium can, for example, be carried out using recombinant adenoviruses or liposomes [NABEL E.G .;
  • the inventors also obtained transgenic animals, in which a heterologous gene was placed under transcriptional control of the promoter of VE-cadherin and thus found that the properties of this promoter, and in particular the specificity of expression in the cells of 1 endothelium manifested not only in vitro, but also in vivo.
  • the subject of the present invention is animals and in particular non-human transgenic mammals, characterized in that all or part of their cells are transformed by a nucleic acid molecule according to the invention.
  • These are, for example, animals into which a gene of interest has been introduced under the control of the VE-cadherin promoter, or a chimeric promoter constructed from the elements of regulation thereof which confer specificity of expression in endothelial cells; the gene of interest is then only expressed in cells of the vascular endothelium.
  • the transformed cells and the transgenic animals in accordance with the invention can in particular be used as models for studying and / or modifying the expression of different genes in endothelial cells.
  • a subject of the invention is also the use of nucleic acid molecules in accordance with the invention for obtaining medicaments, in particular medicaments intended for the treatment of pathologies such as arteriosclerosis, or tumor diseases.
  • nucleic acid molecules according to the invention can be incorporated into medicaments which can be used in particular in gene therapy.
  • an Xhol site was created immediately downstream of the +22 position of the first exon, by carrying out a PCR amplification using as matrix the Sacl fragment of 3653 bp described above, and as primers:
  • the amplified fragment was digested with the enzymes Xhol and BglII, then inserted between the Xhol and BglI I sites of pBLCAT3.
  • the construction "-515” was obtained by inserting the PvuII / XhoI fragment from "-1190" in the Xbal, (treated with Klenow enzyme), and Xhol sites of pBLCAT3.
  • the construction "-5800” was obtained by inserting the BcoRI fragment (treated with the Klenow enzyme) / BglI I of lambda 1 into the SalI (treated with the Klenow enzyme) and BglII sites of "-1190"
  • SCHUTZ publication cited above, and which contains the CAT gene under the control of the promoter of the tymidine kinase gene of the herpes virus; the plasmid here called "RSV”, which is identical to that described by GORMAN et al. [Proc. Natl.
  • constructs derived from the previous ones by deletion of the promoters controlling the expression of the CAT gene were used as negative controls.
  • a luciferase expression plasmid containing the "luc +" gene (PROMEGA) inserted into the vector pCDNA3 (IN VITROGEN) was used to calibrate the measurements of the CAT activity, according to the protocol described by HUBER et al. [J. Biol. Chem. 265, p. 5696-5701, (1990)]. These constructs were used to transfect on the one hand endothelial cells of aorta of beef (“BAEC”), coming from aorta of beef treated with collagenase [MOORE et al., Clin. Invest.
  • NIH-3T3 fibroblastic line
  • HeLa epidermal line
  • HepG2 hepatocyte line
  • Hel and Lin 175 hematopoietic lines
  • the CAT activity of the constructs comprising the various restriction fragments obtained from the lambda genomic clone was determined in the cells of the BAEC and 3T3 lines, using as construction the HSVTK construct, and the construct without corresponding promoter.
  • the CAT activity of the construction comprising the fragment -2486, +22 was determined in the cells of the lines BAEC, 3T3, HeLa, HepG2, Hel and Lin 175, using as construction the construction HSVTK, the RSV construct, and the corresponding promoter-free constructs.
  • the cells were cultured in DMEM medium (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (15% for BAEC).
  • DMEM medium GIBCO
  • the BAEC, 3T3, HeLa and HepG2 cells seeded the day before (10 cells) were transfected by the calcium phosphate method [WIGLER et al., Cell., 11, p. 223-232, (1977)] with 3.5 picomoles of CAT construct, and 5 micrograms of plasmid expressing luciferase.
  • the Hel and Lin 175 cells (10 7 cells) were transfected by electroporation (GENE PULSER BIO-RAD, set to 400V and 960 microfarad) in 0.8 ml of PBS with 3.5 picomoles of CAT construction, 10 micrograms of plasmid luciferase and 50 micrograms of salmon sperm DNA as a trainer. In all cases, the cell extracts were prepared 2 days after the transfection by 3 freeze / thaw cycles.
  • the luciferase activity was determined on an aliquot of the cell extracts using a kit (PROMEGA) and a luminometer (LKB).
  • results reproduced in FIG. 1 represent the means of 5 to 10 transfections carried out in duplicate.
  • constructs comprising the different fragments obtained from the lambda genomic clone are identified by the position of the 5 ′ end of the fragment concerned (relative to the site of initiation of transcription); "Without prom” indicates the construct containing the CAT gene alone; "HSVTK” indicates the positive control.
  • CAT were determined with the equivalent of 200 arbitrary light units for Hel, 3000 units for HepG2,
  • the 2 founders obtained (line 28 and line 23) were genotypes by the Southern technique and the number of copies of transgene in each of them was estimated by quantitative analysis at PHOPHORIMARGER (MOLECULAR DYNAMICS).
  • the CAT enzymatic activity was measured on homogenates of different organs of descendant adult animals (FI) from each of these 2 founders.
  • a strong CAT activity is observed, and positively correlated with the degree of vascularization of the tissues concerned, and with the number of copies of the transgene in each line. Only blood cells show no detectable activity.
  • the expression profile observed for the two lines of transgenic mice is identical, which makes it possible to exclude a potential influence of the integration site on the expression of the transgene.
  • This demonstrates the in vivo tissue-specific character of the expression controlled by the promoter of the VE-cadherin gene.
  • the localization of CAT expression in transgenic mice has also been studied by immunohistochemistry. 13.5-day-old embryos were removed, fixed for 2 h in 4% paraformaldehyde in PBS, then incubated for 1 h at 22 ° C.
  • Platinum Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 used here as an endothelial marker.
  • the antigen / antibody complexes are revealed by a second labeled antibody, under the conditions summarized in Table II below.
  • CATCCTGCCC CAGAGACCAC TCGCATATGA AGCACACATA TTCAGTCTGC CTTACTTGTG 120
  • CTTCTCCAGC TTGCATCTAA TTCGCTCTGG CAGACCATCG TGTTTCCTGT CTTCCTGGCA 360
  • CTTTGCCTCA CTGAAAAGCA GGACAAGTTG GGGAACTTCC CAAACTTTTA TGCATGAAGA 1380
  • CATCTCCCCA GCCTCTTGGT CCTGAGGGAC CCTGGTCTAC CTACTGCTTT GCTGTCTTCT 1740

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Abstract

L'invention est relative au clonage du promoteur de la VE-cadhérine. L'invention concerne également des cellules transformées et des animaux transgéniques comprenant ledit promoteur. Ce promoteur est en particulier utilisable pour l'expression tissu-spécifique d'un gène d'intérêt dans l'endothélium vasculaire.

Description

PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE ET SES UTILISATIONS.
La présente Invention est relative à un promoteur actif dans 1 ' endothelium vasculaire, et à son utilisation pour exprimer des gènes d' intérêt dans ce tissu.
L1 endothelium vasculaire est une monocouche cellulaire formée d'environ mille milliards de cellules endothéliales, réparties dans l'ensemble de l'organisme.
L ' endothelium contrôle la perméabilité vasculaire aux fluides et aux cellules sanguines et régule l'hémostase et la thrombose. L'altération de 1 ' homéostasie vasculaire peut induire des pathologies graves, telles que l'artériosclérose, facteur majeur des maladies cardio-vasculaires qui représentent la première cause de mortalité dans les pays occidentaux, ou la prolifération vasculaire incontrôlée observée par exemple dans les maladies inflammatoires (arthrite rhumatoide) , la rétinopathie diabétique, 1 ' angiogénèse tumorale ou les tumeurs vasculaires (angiosarcomes, sarcome de Kaposi) . La possibilité de moduler les réponses des cellules endothéliales en dirigeant l'expression d'un gène d'intérêt dans ces cellules peut trouver de nombreuses applications, telles que par exemple :
- dans le cas des maladies cardio-vasculaires, la synthèse directe par la paroi vasculaire d'agents fibrinolytiques tels que les activateurs du plasminogène : uPA et tPA ;
- le contrôle de la prolifération vasculaire :
* soit pour la stimuler, par exemple afin de recréer une surface anti-thrombotique après denudation du vaisseau (artériosclérose) , et éviter une resténose après angioplastie, ou afin de promouvoir une revascularisation de tissus ischémies ;
* soit pour la freiner, par exemple pour inhiber la progression tumorale en détruisant la vascularisation des tissus cancéreux. Ceci peut être obtenu par exemple, par la fabrication de mutants dominant -négatifs pour des récepteurs de facteur de croissance (flk-1, flt-1, ...), ou par l'utilisation d'ARN antisens. En outre, 1 ' endothelium vasculaire étant en contact direct avec le sang, il est facilement accessible aux vecteurs de gènes introduits par voie veineuse, et les produits des gènes qu'il exprime peuvent être sécrétés directement dans le sang circulant . Ces propriétés peuvent être mises à profit pour obtenir la sécrétion de protéines (facteurs de coagulation, hormones, etc..) dans le flux sanguin.
Par ailleurs, du fait de leur présence au niveau des capillaires, dans tout l'organisme, les cellules de 1 ' endothelium vasculaire constituent un hôte particulièrement intéressant pour exprimer, près de leur site d'action, des effecteurs cellulaires tels que par exemple, des récepteurs de cytokines ou des compétiteurs de ces récepteurs. Enfin, les cellules endothéliales ont une durée de vie qui, chez l'homme, peut atteindre de 5 à 20 années [FAN et al. ; TIPS, 16, p. 57, (1995)]. Des cellules endothéliales transduites peuvent donc survivre et exprimer un transgène pendant un temps relativement long.
L'étude des fonctions in vivo de 1 ' endothelium vasculaire, ainsi que la modification de ces fonctions dans un but thérapeutique nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant d'évaluer individuellement le rôle de chacune des protéines exprimées par les cellules endothéliales, qu'il s'agisse de sur-exprimer ou de sous- exprimer une protéine produite naturellement par ces cellules, d'évaluer l'activité de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ou d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue. Pour être en mesure d'utiliser effectivement les potentialités du transfert de gènes dans 1 ' endothelium vasculaire, il faut disposer de vecteurs permettant d'obtenir une expression stable d'un gène d'intérêt dans les cellules endothéliales, in vi tro et également in vivo ; cette expression doit en outre, dans certains cas, être spécifique de ce tissu, afin d'éviter les problèmes qui pourraient résulter d'une expression ubiquitaire . On connaît actuellement un certain nombre de protéines, qui sont exprimées plus ou moins spécifiquement dans 1 ' endothelium, et dont les promoteurs constituent des candidats potentiels pour l'expression tissu-spécifique d'un gène hétérologue : le facteur Von Willebrand [FERREIRA et al., Biochem. J. 293, p. 641-648,
(1993)], PECAM-1 (CD31) [De LISSER et al., Immunol .
Today, 15, p. 490, (1994)], la préproendothéline-1
[HARATS et al., J. Clin. Invest . 95, p. 1335, (1995)],
1 ' intégrine αvβ3 [BROOKS et al., Science, 264, p. 569, (1994)], la P-sélectine [PAN et Me EVER, J. Biol . Chem.
268, p. 22600, (1993)], la VE-cadhérine [LAMPUGNANI et al., J. Cell. Biol. 118, p. 1511-1522, (1992) ; BREIER et al., Blood, 87, p. 630-641, (1996)], la E-sélectine
[ HITLEY et al., Mol. Cell. Biol., 14, p. 6464, (1994)], le récepteur du facteur de croissance endothelial vasculaire (Flk-1 ou KDR) [MILLAUER et al., Cell. 72, p.
835-846, (1992)] et un récepteur tyrosine-kinase appelé tie-2 [SCHLAEGER et al., Development, 121, p. 1089-1098,
(1995) ] . Certains des promoteurs régulant l'expression des gènes ci-dessus ont été clones et étudiés in vi tro en culture de cellules, en particulier ceux de la E- sélectine, du facteur de Von Willebrand et de la préproendothéline-1 [INOUE et al., J. of Biol. Chem. 264, p. 14954-14959, (1989)]. Même si des séquences consensus pour la liaison de facteurs de transcription connus ont été identifiées dans certains de ces promoteurs, aucune séquence responsable de la spécificité endothéliale de l'expression n'a encore été caractérisée.
Par exemple, dans le cas du promoteur de la préproendothéline, on observe in vivo une expression qui n'est pas limitée à 1 ' endothelium, mais se retrouve dans d'autres types cellulaires, tels que l'épithélium respiratoire et intestinal et les cellules de la média vasculaire [HARATS et al., J. Clin. Invest . , 95, p. 1335, (1995) ] .
En outre, dans de nombreux cas, les observations faites in vi tro ne reflètent pas l'activité réelle et la spécificité de la séquence promotrice in vivo, d'autant qu'il a été rapporté que cette activité et cette spécificité pouvaient, dans le cas d'un gène hétérologue, différer de celles observées avec le gène endogène .
Par exemple, l'influence des régions promotrices de tie-2, du facteur de Von Willebrand et de la préproendothéline sur l'expression d'un gène rapporteur ont été étudiées in vivo chez des souris transgéniques .
SCHLAEGER et al., [Development 121, p. 1089- 1098, (1995)] ont ainsi observé que le promoteur de tie-2 qui, dans le cas du gène endogène, est actif au cours de la prolifération vasculaire chez l'embryon ou chez l'adulte a un comportement différent lorsqu'il est associé à un gène hétérologue ; il demeure actif lors du développement de la vascularisation de l'embryon de souris, mais ne l'est plus chez l'adulte, même lors de
1 ' angiogénèse.
Le promoteur du facteur de Von Willebrand n'a permis l'expression du gène marqueur que dans certaines cellules endothéliales de cerveau, en revanche, le gène hétérologue a été exprimé dans d'autres tissus où le gène endogène n'est pas normalement exprimé [AIRD et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 92, p. 4567-4571, (1995)].
Des travaux précédents auxquels ont participé les Inventeurs ont permis d'isoler des clones génomiques comprennant le gène de la VE-cadhérine, et de déterminer la position des introns et des exons [HUBER et al. Genomics, 32, p. 21-28, (1996)]. Cependant, aucune séquence contrôlant la transcription de ce gène n'avait été mise en évidence. Les Inventeurs ont maintenant identifié et clone les séquences du promoteur de la VE-cadhérine, et ont en outre localisé des régions de ce promoteur responsables de l'expression tissu-spécifique dans les cellules endothéliales. La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique dont la séquence est celle du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un fragment de celui- ci .
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit fragment comprend au moins un domaine fonctionnel intervenant dans l'activité dudit promoteur .
Au sens de la présente invention, on entend par « promoteur de la VE-cadhérine » une séquence d'acide nucléique essentiellement constituée par les éléments nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine par un mécanisme similaire au mécanisme naturel ; on entend par « domaine fonctionnel intervenant dans l'activité du promoteur de la VE-cadhérine » aussi bien une région dudit promoteur comprenant les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription, qu'une région dudit promoteur comprenant des séquences intervenant dans la régulation en cis de l'initiation de la transcription. Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, constituant un promoteur de la VE-cadhérine, tel que défini ci -dessus, sont représentées en particulier par : un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris ; cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ; les positions 1 à 2509 de la séquence SEQ ID NO : 1 correspondent aux positions -2486 à +22 définies par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris ;
- des fragments d'acide nucléique comprenant le précédent, par exemple un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -5800 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.
Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, comprenant au moins un domaine fonctionnel, tel que défini ci -dessus, du promoteur de la VE- cadhérine, sont représentées en particulier par : a) des fragments d'acide nucléique comprenant les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription. Il s'agit par exemple d'un fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position +22 à la position -139 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris. b) des fragments d'acide nucléique comprenant des séquences intervenant dans la régulation de la transcription, et en particulier dans sa spécificité tissulaire ; il s'agit en particulier :
- d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -140 à la position -187 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE- cadhérine de souris ; - d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -188 à la position -289 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE- cadhérine de souris ;
- d'un fragment dont la séquence s'étend de la position -516 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE- cadhérine de souris, et des sous-fragments de celui-ci dont les séquences s'étendent respectivement de la position -516 à la position -1190 et de la position 1191 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.
Ces fragments comprennent des séquences qui augmentent la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales .
La présente invention englobe les molécules d'acide nucléique constituant des segments de plus de lOpb, et de préférence de plus de 20pb des fragments mentionnés ci-dessus ; de telles molécules peuvent par exemple être utilisées comme sondes pour détecter une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention dans un mélange d'acides nucléiques, ou comme amorces pour procéder à son amplification.
Il doit être bien entendu que les fragments d'acide nucléique spécifiés ci-dessus, qui peuvent être obtenus à partir du promoteur du gène de la VE-cadhérine de souris ne constituent qu'une illustration de l'objet de l'invention. Celle-ci englobe également en particulier, des molécules d'acide nucléique reproduisant la séquence de promoteurs ou des domaines fonctionnels homologues existant chez la souris ou chez d'autres espèces animales, et qui peuvent être obtenues par l'homme du métier par des techniques classiques de biologie moléculaire, en procédant au criblage d'une banque génomique de l'animal concerné à l'aide d'un ou plusieurs oligonucléotides de plus de 20pb reproduisant tout ou partie de la séquence de l'un des fragments mentionnés ci -dessus. De même, l'homme du métier peut, à partir des fragments comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine spécifiés ci- dessus, identifier les séquences constituant les domaines fonctionnels, par exemple par la technique des empreintes sur l'ADN (footprints) , en incubant ces fragments avec des extraits nucléaires de cellules endothéliales, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules dans lesquels le promoteur de la VE-cadhérine est inactif. Ceci permet de construire différentes molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, par exemple en procédant à la délétion de séquences situées en dehors de ces domaines fonctionnels, et/ou éventuellement à leur substitution par d'autres séquences.
Les molécules d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels du promoteur de la VE-cadhérine peuvent être associées entre elles, ou avec des éléments fonctionnels provenant de promoteurs autres que celui de la VE-cadhérine, selon différentes combinaisons, pour obtenir des promoteurs qui se distinguent entre eux par leur niveau d'activité, et leur degré de spécificité.
Par exemple, si l'on souhaite obtenir un niveau d'activité élevé, sans rechercher une expression spécifique dans les cellules endothéliales, on utilisera une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription situés dans la séquence s 'étendant entre la position +22 et la position -139 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris. Si l'on souhaite augmenter à la fois le niveau d'expression et la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales, on associera cette première molécule (ou une autre molécule d'acide nucléique comprenant des séquences nécessaires à l'initiation de la transcription), à une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s' étendant de la position -140 à la position -187 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris, et/ou à une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s 'étendant de la position -188 à la position -289 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE- cadhérine de souris .
Si l'on souhaite privilégier la spécificité d'expression par rapport au niveau d'expression, on ajoutera une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments de régulation situés dans la séquence s 'étendant de la position -516 à la position -1190 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE- cadhérine de souris ; pour obtenir des promoteurs actifs dans les cellules endothéliales, et inactifs (c'est-à- dire n'induisant pas l'expression d'un gène au-delà du niveau basai observé en l'absence de tout promoteur) dans les autres types cellulaires, cette molécule d'acide nucléique comprendra les éléments de régulation situés dans la séquence s' étendant de la position -516 à la position -2486 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène de la VE-cadhérine de souris.
Les promoteurs obtenus à partir des molécules d'acide nucléique conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules de mammifère, et avantageusement, pour obtenir une expression spécifique dans les cellules de 1 ' endothelium vasculaire. Le choix du promoteur le plus approprié parmi les promoteurs conformes à l'invention, dépend du niveau et de la spécificité d'expression que l'on souhaite obtenir.
L'objet de la présente Invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue . Au sens de la présente Invention on entend par "hétérologue" relativement à une séquence donnée, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence. L'objet de la présente invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant : un promoteur qui contient au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention ; il peut s'agir du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un promoteur chimérique, comprenant au moins une domaine fonctionnel de celui-ci, et une séquence hétérologue placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. b) des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement, ces vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci dessus. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule-hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple replication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte, etc...) , ainsi que de la nature de la cellule-hôte. L'Invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. De préférence, ces cellules sont des cellules animales, en particulier des cellules de mammifère. Il peut s'agir de cellules endothéliales, ou de cellules d'un autre type cellulaire . Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux (adénovirus, rétrovirus, etc...) dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d' intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur viral ou plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, ou bien l'injecter directement dans la cellule-hôte.
Le transfert de gènes dans 1 ' endothelium vasculaire peut par exemple, être réalisé à l'aide d' adénovirus recombinants ou de liposomes [NABEL E. G. ;
Circulation, 91, p. 541-548, (1995) ; VON DER LEYEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 92, p. 1137-1141,
(1995) ; LARKIN et al., Transplantation, 61, p. 363-370, (1996) ] .
Les Inventeurs ont également obtenu des animaux transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue était placé sous contrôle transcriptionnel du promoteur de la VE-cadhérine et ont ainsi constaté que les propriétés de ce promoteur, et en particulier la spécificité d'expression dans les cellules de 1 ' endothelium vasculaire se manifestaient non seulement in vi tro, mais également in vivo .
La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques non- humains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit un gène d'intérêt sous contrôle du promoteur de la VE-cadhérine, ou d'un promoteur chimérique construit à partir des éléments de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules endothéliales ; le gène d' intérêt est alors uniquement exprimé dans les cellules de 1 ' endothelium vasculaire. Les cellules transformées et les animaux transgéniques conformes à l'invention sont en particulier utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules endothéliales . L'invention a également pour objet l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments, en particulier de médicaments destinés au traitement des pathologies telles que l'artériosclérose, ou les maladies tumorales. Par exemple, des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être incorporées dans des médicaments utilisables en particulier en thérapie génique .
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'obtention et la caractérisation du promoteur de la VE-cadhérine et de domaines fonctionnels de celui-ci, ainsi qu'à leur utilisation pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cultures de cellules et dans des animaux transgéniques . EXEMPLE 1 : CLONAGE DU PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE
Le clonage du gène de la VE-cadhérine murine, et le clone génomique lambda 1 contenant la région en amont du premier exon de ce gène ont été précédemment décrits par HUBER et al. [Genomics, 32, p. 21-28, (1996) ] .
Un fragment d'ADN Sacl de 3653 pb issu du clone génomique lambda 1, contenant le premier exon du gène de la VE-cadhérine, 2813 pb de la région 5', et 782 pb du début du premier intron, a été inséré dans le site Sacl de pBluescript II SK+ (STRATAGENE) . La séquence de chacun des brins de 1 ' insert a été déterminée par la méthode de Sanger.
Différents fragments de la région 5' ont été clones en amont du gène rapporteur CAT (chloramphénicol acétyl transférase) , dans le vecteur d'expression pBLCAT3 [LUCKOW et SCHUTZ, Nucl . Acids Res . 15, p. 5490, (1987)].
Dans ce but, un site Xhol a été créé immédiatement en aval de la position +22 du premier exon, en procédant à une amplification PCR utilisant comme matrice le fragment Sacl de 3653 pb décrit ci-dessus, et comme amorces :
- la séquence suivante :
(5 ' -CCCGGAAAGATCTGCTCTCT-3 ' ) , qui contient un site BglII situé à la position à la position -1190 de la région 5', et
- la séquence suivante :
3 ' (5 ' -CTCCACTCGAGTCTGTCCAGGGCCGAGC-3 ' ) qui correspond à la séquence +6 à +22 du premier exon, suivie du site Xhol.
Le fragment amplifié a été digéré par les enzymes Xhol et BglII, puis inséré entre les sites Xhol et BglI I de pBLCAT3.
Le plasmide obtenu, dénommé "-1190", et dont 1 ' insert a été vérifié par sequençage, constitue la base de départ de l'ensemble des constructions CAT mentionnées ci-après :
La construction "-515" a été obtenue par insertion du fragment PvuII/XhoI issu de "-1190" dans les sites Xbal, (traité par l'enzyme de Klenow) , et Xhol de pBLCAT3.
La construction "-289" a été obtenue par insertion du fragment HindiII/Xhol de la construction "-
1190" dans les sites HindIII et Xhol de pBLCAT3. La construction "-187" a été obtenue par insertion du fragment Apal (traité par l'ADN polymérase du phage T4)/XhoI issu de la construction "-1190" dans les sites Sali (traité par l'enzyme de Klenow) , et Xhol de pBLCAT3.
La construction "-139" a été obtenue par insertion du fragment Pstl/Xhol issu de "-1190" dans les site Pstl/Xhol de pBLCAT3.
La construction "-5800" a été obtenue par insertion du fragment BcoRI (traité par l'enzyme de Klenow) /BglI I de lambda 1 dans les sites Sali (traité par l'enzyme de Klenow) et BglII de "-1190"
La construction "-2486" a été obtenue par insertion du fragment Spel/BglII de lambda 1 dans les sites XJbaJ (non comblé) et Xhol de "-1190"
D'autre part, les plasmides suivants ont été construits, pour être utilisés à titre de témoins positifs : le plasmide dénommé ici "HSVTK" , qui est similaire à la construction pBLCAT2 décrite par LUCKOW et
SCHUTZ (publication précitée) , et qui contient le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène tymidine kinase du virus de l'herpès ; la plasmide dénommé ici "RSV" , qui est identique à celui décrit par GORMAN et al. [Proc. Natl .
Acad. Sci. USA, 79, p. 6777-6781, (1982)] et qui contient le gène CAT sous contrôle des LTR du virus du sarcome de
Roux, ont été.
En outre, des constructions dérivées des précédentes par délétion des promoteurs contrôlant l'expression du gène CAT, ont été utilisées à titre de témoins négatifs.
Un plasmide d'expression de la luciférase contenant le gène "luc+" (PROMEGA) inséré dans le vecteur pCDNA3 (IN VITROGEN) a été utilisé pour étalonner les mesures de l'activité CAT, selon le protocole décrit par HUBER et al. [J. Biol. Chem. 265, p. 5696-5701, (1990)]. Ces constructions ont été utilisées pour transfecter d'une part des cellules endothéliales d'aorte de bœuf ("BAEC"), provenant d'aortes de boeuf traitées à la collagènase [MOORE et al., Clin. Invest . , 79, p.124- 130, (1987)], et d'autre part des cellules des lignées 3T3 ("NIH-3T3" ; lignée fibroblastique) , HeLa (lignée épithéliale) , HepG2 (lignée hépatocytaire) , Hel et Lin 175 (lignées hématopoïétiques) obtenues à l'ATCC.
Dans une première série d'expérimentations, l'activité CAT des constructions comprenant les différents fragments de restriction obtenus à partir du clone génomique lambda a été déterminée dans les cellules des lignées BAEC et 3T3, en utilisant comme témoins la construction HSVTK, et la construction sans promoteur correspondante.
Dans une seconde série d'expérimentations, l'activité CAT de la construction comprenant le fragment -2486, +22 a été déterminée dans les cellules des lignées BAEC , 3T3, HeLa, HepG2 , Hel et Lin 175, en utilisant comme témoins la construction HSVTK, la construction RSV, et les constructions sans promoteur correspondantes.
Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 10% de sérum de veau foetal (15% pour les BAEC) . Les cellules BAEC, 3T3, HeLa et HepG2 ensemencées la veille (10 cellules) , ont été transfectées par la méthode au phosphate de calcium [WIGLER et al., Cell., 11, p. 223-232, (1977)] avec 3,5 picomoles de construction CAT, et 5 microgrammes de plasmide exprimant la luciferase.
Les cellules Hel et Lin 175 (107 cellules) ont été transfectées par électroporation (GENE PULSER BIO- RAD, réglé à 400V et 960 microfarad) dans 0,8 ml de PBS avec 3,5 picomoles de construction CAT, 10 microgrammes de plasmide luciferase et 50 microgrammes d'ADN de sperme de saumon comme entraîneur. Dans tous les cas, les extraits cellulaires ont été préparés 2 jours après la transfection par 3 cycles de congélation/décongélation.
Préalablement à la détermination de l'activité CAT, l'activité luciferase a été déterminée sur un aliquote des extraits cellulaires à l'aide d'un kit (PROMEGA) et d'un luminomètre (LKB) .
Les résultats de la première série d'expérimentations sont illustrés par la Figure 1 : l'équivalent de 1200 et 3000 unités lumineuses arbitraires des extraits cellulaire obtenus respectivement à partir des BAEC et des 3T3 , a été utilisé pour la détermination de l'activité CAT.
Les résultats reproduits sur la Figure 1 représentent les moyennes de 5 à 10 transfections effectuées en dupliqué.
Les constructions comprenant les différents fragments obtenus à partir du clone génomique lambda sont identifiées par la position de l'extrémité 5' du fragment concerné (par rapport au site d'initiation de la transcription) ; "Sans prom" indique la construction contenant le gène CAT seul ; "HSVTK" , indique le témoin positif .
Ces résultats permettent d'établir : 1) que toutes les constructions (à l'exception du témoin négatif) s'expriment de façon significative dans les cellules endothéliales ; on observe toutefois une diminution d'environ 50% de l'activité pour les constructions de -515 à -5800 par rapport aux constructions allant de -139 à -289
2) que les constructions proximales sont actives dans les fibroblastes , mais que cette activité diminue progressivement lorsqu'on allonge le fragment pour devenir négligeable et comparable au bruit de fond (construction sans promoteur) pour les fragments -2486 et -5800. Ces deux constructions peuvent être considérées comme tissu-spécifiques.
La deuxième série d'expérimentations a été effectuée avec la construction comprenant le fragment -2486, +22. La séquence de ce fragment est représentée sur la liste de séquences en annexe sous le numéro
SEQ ID NO : 1.
L'activité promotrice de cette construction a été déterminée dans différents types cellulaires. Les résultats sont illustrés par la Figure 2 : les activités
CAT ont été déterminées avec l'équivalent de 200 unités lumineuses arbitraires pour Hel, 3000 unités pour HepG2 ,
150 unités pour Hela et 200 unités pour Linl75 ,- 1200 unités pour BAEC et 3000 unités pour 3T3. « -2486 » indique la construction comprenant le fragment -2486, +22 ; « 0 » indique la construction contenant le gène CAT seul ; "HSVTK", et « RSV » indiquent les témoins positifs.
Ces résultats confirment que la construction comprenant le fragment -2486, +22 n'est active que dans les cellules endothéliales.
EXEMPLE 2 : PRODUCTION ET ANALYSE DE SOURIS TRANSGENIQUES
EXPRIMANT UN GENE RAPPORTEUR SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR
DE LA VE-CADHERINE Un plasmide pBLCAT3 contenant le promoteur
-2486, +22, obtenu comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, a été digéré par les endonucléases Sacl et Sali , et le fragment de restriction obtenu, qui comprend le gène CAT et le promoteur -2486, +22 a été purifié. Ce fragment a été injecté dans des oeufs de souris qui ont été réimplantés dans des souris pseudo-gestantes, selon le protocole décrit par HOGGAN et al . [Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (1994)].
Les 2 fondateurs obtenus (lignée 28 et lignée 23) ont été génotypes par la technique de Southern et le nombre de copies de transgène dans chacun d'eux a été estimé par analyse quantitative au PHOPHORIMARGER (MOLECULAR DYNAMICS) .
L'activité enzymatique CAT a été mesurée sur des homogénats de différents organes d'animaux adultes descendant (FI) de chacun de ces 2 fondateurs.
Les résultats sont illustrés par le tableau I ci dessous
TABLEAU I
Figure imgf000021_0001
On observe une activité CAT forte, et corrélée positivement au degré de vascularisation des tissus concernés, et au nombre de copies du transgène dans chaque lignée. Seules les cellules sanguines ne présentent pas d'activité décelable. En outre, le profil d'expression observé pour les deux lignées de souris transgéniques est identique, ce qui permet d'exclure une influence potentielle du site d'intégration sur l'expression du transgène. Ceci démontre le caractère tissu-spécifique in vivo de l'expression contrôlée par le promoteur du gène de la VE-cadhérine. La localisation de l'expression de la CAT chez les souris transgéniques a également été étudiée par immunohistochimie . Des embryons âgés de 13,5 jours ont été prélevés, fixés 2 h dans du paraformaldehyde 4% dans le PBS, puis incubés lh à 22 °C dans du tampon PBS/Saccharose 15%, une nuit dans du PBS/saccharose 30% et enfin congelés dans de 1 ' OCT (TISSUTEK) à l'aide d'un bain carboglace/éthanol . Des coupes parasagittales de 10 micromètres, réalisées grâce à un cryostat (LEICA) , séchées 5 min à 45°C et de nouveau fixées 30 min en PBS/paraformaldéhyde 4% ont été incubées avec différents anticorps anti-CAT, anti VE-cadhérine, et anti-PECAM-1
(Platelet Endothelial Cell Adhésion Molecule-1, utilisé ici comme marqueur endothelial) . Les complexes antigène/anticorps sont révélés par un second anticorps marqué, dans les conditions résumées dans le tableau II ci dessous.
TABLEAU II
Figure imgf000022_0001
L'observation des coupes histologiques après révélation montre que l'expression de la protéine CAT est restreinte à 1 ' endothelium, et permet d'observer une colocalisation entre la CAT et la VE-cadhérine endogène, ainsi qu'entre la CAT et le PECAM-1. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT
(A NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE-CEA
(B RUE: 31-33 RUE DE LA FEDERATION
(C VILLE: PARIS
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 75752
(G TELEPHONE : -
(H TELECOPIE: -
(I TELEX : -
(A NOM: HUBER PHILIPPE
(B RUE: 1 RUE DES JONQUILLES
(C VILLE: SEYSSINS
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 38180
(A NOM: LAURENT MONIQUE
(B RUE: 5 RUE DES TROIS EPIS
(C VILLE: GRENOBLE
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 38100
(A NOM: GORY SYLVIE
(B RUE: 7 RUE DU DRAC
(C VILLE: SAINT-EGREVE
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 38120
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR DE LA VE-CADHERINE ET SES UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 ( iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk
( B ) ORDINATEUR : IBM PC compatible
( C) SYSTEME D ' EXPLOITATION : PC -DOS /MS -DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2509 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1:
ACTAGTAGCA GAAACAAGGT CCTCTGGAAG AGCAACTGAT GCTCTTAGGT ACTGAAGCAT 60
CATCCTGCCC CAGAGACCAC TCGCATATGA AGCACACATA TTCAGTCTGC CTTACTTGTG 120
TTAATGATTG CCAGTGTCCC TCTGACCTCC TAGCCCTGAA AAGGTGTGGC CTGAAGGTCA 180
TTTCAGAGAC GGGGAGAGCT GCTCAGAGAA GCCAATCGGC GAGTCTAGGA CACACAGACA 240
GGATCTAGTC CCAGAGTTCG CTAGCCTAGG TGAGCGTCCC CTGGCCCCTT ATACCACTTC 300
CTTCTCCAGC TTGCATCTAA TTCGCTCTGG CAGACCATCG TGTTTCCTGT CTTCCTGGCA 360
GCCTCCAGCA CGCTCAGTGC TACTCCCTCG CATGCGCCCT CCTCCCAGTA CCTTCTCTGA 420 CTCCAGTGGG CTTGGAGTGC GAGGAGGAAG GGTGAGGAAG GGGTGAAATC AGGTATTGGA 480
TCCACAGGGG GTCTGAAGAG CACTAGCCTG GCCTTTTGGG ACTGAACTTC TGCTATGAAG 540
ACCTCCACTG CCATCCCTGG AGTCCGGGGC ACATCCAAGG GTTGCTGTCC ATCGTTTAAC 600
TGTTTACAGA TGACAACAAT GACTCGTGTT CGGGGCAGAA ATATCACCAG GGCTAGAGTA 660
CAAAAGGAGT TTGCATTGAT GGCCGGACAG GCCTGTCCCT GGACCAGCCT GCGACGCTGA 720
GTATGAGACC CAGCGGAAGT GCTACCCTGG CAGACGTGTC ACTGAGTACA CAGACCACCA 780
AGGCAGGCAG CTCTCGGGGA AGCTGTCTAT GCTGGGCCAG CCCACCTTGA GGGCAGGGAA 840
CAGAACAGAT TGTGGCAGAG AGGAAAATGT GGAGCTTCTG TTTGTTCACA GACACACGCA 900
CTCGCCCACG CACGCACGCA CGCACGCACG CACGCACGAA TGCACGCACG CAGTAGTTGA 960
ATGCTATGGA TTCCGCTCAG AGCTGAGAAC AGCCCCAGCG ACAGTTCCCT GGCCTCTCTC 1020
CTTACTCTGA TGTCCTCATC TGTCTTCACA TGGTCTCAGG ACGCTAATAC TCCATCCTAA 1080
TGTACACTCC TTTCCCTGGG CCTCCGTTCC AGTTCAGTTC TCAGAGGACC TGGAGGGAGT 1140
GATTGGCTAC ACCAACTTTG CTTTCGTTCA CCAAGCCCAT GTCTCTACTT GGGTGTCTAA 1200
TGGGCATCTC CAACATTACC TACCCCAAAC AGAAAACCCT TTCTTCCCCC CAACCACACC 1260
CCACCCTACC CCCACAGTAT TTTCTCCATG CCCGGAAAGA TCTGCTCTCT TATGGTCCCT 1320
CTTTGCCTCA CTGAAAAGCA GGACAAGTTG GGGAACTTCC CAAACTTTTA TGCATGAAGA 1380
AACCCAGGCA ATTTGCCAAA AGGTACACTC TGGGGGTCTG TCATTTACTC TGAGCCAGAA 1440
CCCTGAAATT TTTACTAACC CATCACATAA TGAATGAAGA GAATCTTTTT CTTTTTTTTT 1500 TTTTTTCTTT TTTTTTGGTT TTTCGAGACA GGGTTTCTCT GTATAGCCCT GGCTATCCTG 1560
GAACACACTC TGTAGACCAG GCTGGCCTCG AACTCAGAAA TCCACCTGCC TCTGCCTCCC 1620
GAGTGCTGGG ATTAAAGGCG TGCGCCACCA CGCCTGGCTG AATGAAGAGA ATCTTOACCT 1680
CATCTCCCCA GCCTCTTGGT CCTGAGGGAC CCTGGTCTAC CTACTGCTTT GCTGTCTTCT 1740
TAGCTCTTCT TACTTTTTTG CTGACTCAGA CCTATGGCTA TCTCCATTAT ACAGATGAGG 1800
AGACTGAGGC ATGGATCCCT GGTTGGTCCA TGGTCACGTG AAGCCCATCA CCCAGTATTT 1860
GTAAAGTGAG ATGGGCCAGG CTGGTACCTT GGAACTGAAA CTCACACTGC CCTACCTGGA 1920
AGAATCTGAC AGGCAAAATC TGCTGCTGAA AGTGATTGTC TGTCACGTTT CTCAGCTGCC 1980
CGACTCTGAG AACTCCACAG CCCCCTTTCG TTCCACCATA CTACAGAGTC GCCACGGAAA 2040
GCCGGCTCTG TGGAGAAGCT GAGGTAGCTG GGTTTCTGTC TGGGTTACTC TGTCCAGCGA 2100
GGAAACAAGT ACCTTAGACC CACTAAGCCT CTGCTTTCTG AACTGTAAAG TGGGGGATAT 2160
GACACCTGCC TCCCAGGGAT GGCTGAATGC TCTGGCAGAA GCTTAGAGCC CCCACAGCTA 2220
CCCCTAGGCT CACAGCTCCT CCGATGAGAC CTAGAATTGA GGTATGAGTT GAATACCCCA 2280
GGCAGGTCCA AGGCTTCCAC GGGCCCAGGC TGACCAAGCT GAGGCCGCCC ACCGTAGGGC 2340
TTGCCTATCT GCAGGCAGCT CACAAAGGAA CAATAACAGG AAACCATCCC GAGGGGAAGT 2400
GGGCCAGGGC AAGTTGGAAA ACCTGCCTCC CTCCCAGCCT GGGTGTGGCT CCCCTCTCCC 2460
CTCCTGAGGC AATCAACTGT GCTCTCCACA AAGCTCGGCC CTGGACAGA 2509

Claims

REVENDICATIONS 1) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce que sa séquence est celle du promoteur de la VE- cadhérine, ou d'un fragment de celui-ci. 2) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit fragment comprend au moins un domaine fonctionnel intervenant dans l'activité dudit promoteur.
3) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1, ou un fragment de celle-ci.
4) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine contenant des séquences nécessaires à l'initiation de la transcription.
5) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un domaine fonctionnel du promoteur de la VE-cadhérine contenant des séquences conférant une spécificité d'expression dans les cellules de 1 ' endothelium vasculaire. 6) Molécule d'acide nucléique constituant une cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur qui contient au moins une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 5, et une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
7) Vecteurs recombinants comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6.
8) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6. 9) Cellule transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de mammifère.
10) Animal transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6.
11) Animal transgénique selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère. 12) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 6 pour l'obtention de médicaments.
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