JP2002532523A - 石灰化腫瘍および組織を治療するための骨シアロタンパク質に基づく毒性遺伝子治療 - Google Patents

石灰化腫瘍および組織を治療するための骨シアロタンパク質に基づく毒性遺伝子治療

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内で発現を指令するプロモーター、エンハンサー、およびその他の調節エレメントに関する。特に、本発明は、骨シアロタンパク質（「BSP」）の発現を制御する、5'調節領域由来のヌクレオチド配列、およびその転写活性のある断片を含む組成物に関する。具体的には、BSP調節領域が、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞において、異種コード配列の発現を調節し得るか、内因性BSPコード配列もしくは病理学的過程のインヒビターを過剰発現させ得るか、または石灰化関連疾患にとって重要であると考えられている特異的遺伝子の発現をノックアウトし得る、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物を提供する。また本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞に関連する障害のアゴニストおよびアンタゴニストについて候補分子をスクリーニングするための、該ベクター、細胞および動物の使用方法に関する。さらに本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での化合物の発現を調節するための組成物および方法に関する。また、スクリーニングアッセイによって同定された分子および化合物を治療に使用する方法も提供する。さらに本発明は、腫瘍ならびに石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞に関連するその他の疾患および障害を治療する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、35 U.S.C. §119 (e)に基づき、本明細書にその全文が参照により
組み入れられる1998年12月22日に出願された米国仮特許出願第60/113,200号に対
する優先権を主張する。
【０００２】１ 緒言 本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での発現を指令
するプロモーター、エンハンサーおよびその他の調節エレメントに関する。特に
、本発明は、骨シアロタンパク質（「BSP」）の発現を制御する、5'調節領域由
来のヌクレオチド配列、およびその転写活性のある断片を含む組成物に関する。
具体的には、BSP調節領域が、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞
において、異種コード配列の発現を制御し得るか、内因性BSPコード配列もしく
は病理学的過程（pathological process）のインヒビターを過剰発現させ得るか
、または石灰化関連疾患にとって重要であると考えられている特異的遺伝子の発
現をノックアウトし得る、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動
物を提供する。また本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞
に関連する障害のアゴニストおよびアンタゴニストについて候補分子をスクリー
ニングするための、該ベクター、細胞および動物の使用方法に関する。
【０００３】 さらに本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での化合
物の発現を調節するための組成物および方法に関する。さらに本発明は、石灰化
の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での発現を調節する化合物のスクリ
ーニングに関する。スクリーニングアッセイによって同定された分子および化合
物を治療に使用する方法も提供する。さらに本発明は、腫瘍ならびに石灰化の可
能性を有する腫瘍細胞および組織細胞に関連するその他の疾患および障害を治療
する方法に関する。
【０００４】２ 発明の背景 2.1 遺伝子治療 体細胞遺伝子治療は、治療目的のために、核酸、典型的にはDNAの形である核
酸を投与して標的細胞の遺伝子レパートリーを改変する方法である。実験遺伝子
治療の研究はまだ比較的新しい分野であるが、過去10年間に大きな進歩があった
（Arai, Y.ら, 1997, Orthopaedic Research Society, 22:341）。ヒトの疾患を
治療する体細胞遺伝子治療の可能性が多数の科学者の想像を捉えたのは、主に2
つの最近の技術進歩の故である。第1に、現在、実験動物にin vivoで効率的に遺
伝子を導入しかつ発現することができる、多数のウイルスおよび非ウイルス遺伝
子治療用ベクターが存在する。第2に、ヒトゲノムプロジェクトへの支援の増加
により、ごく近い将来に、ヒトゲノムを含む推定80,000遺伝子の正体と配列が明
らかになるであろう。
【０００５】 遺伝子治療は、元来、遺伝性欠陥の矯正のために機能的に活性のある治療用遺
伝子を標的細胞中に送達する特異的遺伝子置換治療と考えられていた。体細胞遺
伝子治療に向けての最初の研究成果は、ex vivo遺伝子治療と呼ばれる、遺伝子
を組織に導入する間接的手段に依存し、例えば、標的細胞を身体から取出し、組
換え遺伝子を運ぶベクターを用いてトランスフェクトまたは感染させ、そして身
体中に再移植する（「自己細胞導入」）。現在、DNAをin vitroで細胞に導入す
るために様々なトランスフェクション技術が利用可能でありかつ使用されており
；リン酸カルシウム-DNA沈殿、DEAE-デキストラン・トランスフェクション、エ
レクトロポレーション、リポソームが介在するDNA導入または組換えウイルスベ
クターを用いる形質導入が含まれる。このようなex vivo治療用プロトコルはDNA
を様々な異なる細胞型に導入するために提案されており、該細胞型には、上皮細
胞（米国特許第4,868,116号；MorganおよびMulligan W087/00201；Morganら, 19
87, Science 237:1476-1479；MorganおよびMulligan,米国特許第4,980,286号）
、内皮細胞（W089/05345）、肝細胞（W089/07136；Wolffら, 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:3344-3348; Ledleyら, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84:5
335-5339；WilsonおよびMulligan, W089/07136；Wilsonら, 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. 87:8437-8441）、繊維芽細胞（Palmerら, 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:1055-1059；Ansonら, 1987, Mol. Biol. Med. 4:11-20；Rosenber
gら, 1988, Science 242:1575-1578；NaughtonおよびNaughton, 米国特許第4,96
3,489号）、リンパ球（Andersonら,米国特許第5,399,346号；Blaese, R.M.ら, 1
995, Science 270:475-480）および造血幹細胞（Lim, B.ら, 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:8892-8896；Andersonら, 米国特許第5,399,346号）が含ま
れる。
【０００６】 最近、直接in vivo遺伝子導入が、リポソームに（Ledleyら, 1987, J. Pediat
rics 110: 1）、ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリ
ポソームに（Nicolauら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1068）に捕
捉されたDNAおよびポリリシン-糖タンパク質担体複合体とカップリングさせたDN
Aの製剤を用いて試みられている。さらに、「遺伝子銃」が細胞中への遺伝子送
達に使われている（オーストラリア特許第9068389号）。細胞へのDNA導入のため
の間質腔への注射用に、裸のDNAまたはリポソームに随伴するDNAを液担体溶液で
製剤化し得ることも考えられている（Felgner, W090/11092）。
【０００７】 遺伝子治療技術を使う多数の臨床的試みは、嚢胞性線維症および癌などの多様
な疾患に対して進行中である。医療行為を著しく改善するこのような治療法の将
来性は広く支持されているが、未だにこの技術が臨床の場で成功裏に使用し得る
までには通過する必要のある多くの障害がある。
【０００８】 恐らく、ex vivoまたはin vivoを問わず、最近工夫された遺伝子治療に関連す
る最大の問題の１つは、標的遺伝子の発現を制御できず、有利な治療効果を達成
するために必要な１以上の細胞型に標的遺伝子の発現を限定できないことにある
。
【０００９】 組織特異的プロモーターの使用による腫瘍細胞への治療用毒性遺伝子の送達と
発現の概念はよく認識されている。この手法は、ベクター（ウイルス、リポソー
ム等）遺伝子送達により正常細胞ならびに癌性細胞の感染が生じた場合に、隣接
正常細胞における治療用遺伝子の毒性作用を低下させる。例としては、ヘパトー
ム細胞を標的とするα-フェトプロテインプロモーター（Koryamaら, 1991, Cell
Struct. Punct., 16:503 -510）、胃癌に対する癌胎児性抗原（CEA）プロモー
ター（Tanakaら, 1996, Cancer Research, 46: 1341-1345）、黒色腫を殺傷する
ためのチロシナーゼプロモーター（Vileら, 1994, Cancer Research, 54:6228-6
234）、神経膠腫を標的とする脳の骨形態形成タンパク質プロモーター（Shimizu
, K., 1994, Nipson Rinsbo, 52:3053-3058）、および骨癌および前立腺癌を殺
傷するためのオステオカルシンプロモーター（Ko, S.ら, 1996, Cancer Researc
h, 56: 4614-4619; Gardener,ら, 1998,Gene Therapy and Molecular Biology,
2:41-58）が含まれる。組織および腫瘍に制限されたプロモーターの使用による
遺伝子治療のような分子治療的方法は、使用頻度が増加している。遺伝子治療の
主要構成要素には次が含まれる：i)適当な組織特異的もしくは腫瘍に制限された
プロモーターであって、複数の事例においてホルモン、ビタミン、抗生物質、薬
物または重金属により誘導し得るプロモーターの選択；ii)治療用（または毒性
）遺伝子の選択；iii)レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなどのよう
な適当なベクター。正常な宿主組織に危害を加えることなく適当な腫瘍組織にタ
ーゲティングする鍵は、治療用遺伝子を選ばれたプロモーターを使う組織だけに
ホーミングすることができるプロモーターにある。
【００１０】2.2 石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での組織特異的発現 転移した乳癌、骨肉腫および前立腺癌のような骨親和性腫瘍（osteotropic tu
mor）の治療は、大きな挑戦課題である。しかし、これらの見かけ上無関係な疾
患は、疾患の進行中にこれらの形態の癌で過剰発現される遺伝子の分子解析によ
ると一致している。
【００１１】 BSPは非コラーゲン性骨タンパク質であって、該タンパク質の組織発現は骨の
完全に分化した骨芽細胞または腫瘍を含む他の希少の鉱質化組織に限定される（
Sodek Jら, 1995, Conn. Tissue Research, 32: 209-217）。骨格に転移する性
向を有するヒト前立腺癌細胞を評価したとき、これらの細胞は、オステオポンチ
ン（OPN）（Thalman GNら, 1997, Principles of Practice of Genitourinary O
ncology, 409-416）、オステオカルシン（OC）（Curatolo C.ら, 1992, Europea
n Urology, 1: 105-107）、およびBSP（Withold W.ら, 1997, Clinical Chemist
ry, 85-91）などの大量の非コラーゲン性骨マトリックスタンパク質を合成しか
つ分泌する能力を有するという驚くべき知見を得た。BSPは、アスパラギン酸、
グルタミン酸、およびグリシンの豊富な34キロダルトンのタンパク質であり、シ
アル酸の豊富な炭水化物50%を伴う。BSPは硫酸エステル化およびリン酸エステル
化されており（セリン残基の30%）、ビトロネクチンと相同的である細胞結合モ
チーフ配列を含有する（Oldbrgら, 1988, J. Biol. Chem.,263:19433）。BSPは
、新骨形成中の鉱質化の核形成の最前線に関わり、ヒドロキシアパタイトと強く
結合する（Hunterら, 1993, PNAS,90:8562; Chenら, 1992, JBMR, 7:987; Kobay
ashiら, 1996, J. Biochem.,119:475）。ヒトBSPは第４染色体上に単一コピー遺
伝子として存在し（Fisher L.W.ら, 1990, J.B.C., 265:4:2347-235 1）かつ7個
のエキソンと6個のイントロンを有する。BSPは他のシアロタンパク質、例えば、
象牙質シアロタンパク質、オステオポンチン、IL-1、IL-6、TNFおよび他の骨関
連シアロタンパク質などとは異なる。
【００１２】 BSPは成熟した骨形成細胞中に見出されるが、未熟な前駆体中には見出されな
い（Biancoら, 1991, Conn. Tiss. Int., 49:421; Chenら, 1991, Matrix, 11:1
33）。BSPは胎盤の栄養膜細胞中、および歯のセメント質および象牙質中に見出
されるが、非鉱質化軟骨、腸、腎臓、肝臓、心臓、および骨格筋を含むほとんど
の他の組織中には不在である（Macneilら, 1994, JBMR, 9:1597）。トランスジ
ェニックマウス系においては、BSPプロモーターの活性は、骨中で高レベルで存
在するが、腎臓、肝臓、胃、腸および脾臓中で不在であり（Chenら, 1996, JBMR
, 11:5:654-64）、そして外因性グルココルチコイドの投与はレポーター遺伝子
の発現を1.6〜11倍刺激した（Chenら, 1996, Conn. Tiss. Res., 35:33-39）。B
SPプロモーターのDNA配列は2000を超える塩基対長であり、多数の調節エレメン
トを含有し、その中には、ビタミンD、AP-1、グルココルチコイド（GRE）、hox
、NFκb、TGF-β、CREなどが含まれる（Kim R.H.ら, 1994, Matrix Biology. 14
:31-40; Sodek J.ら, 1996, Connective Tissue Research, 35:23-31; Kim R.H.
ら. 1996,Biochem. J., 318:219-226; Yamauchi M.ら, 1996, Matrix Biology,
15:119-130; Kerr J.M.ら, 1997, Calcif. Tiss. Int., 60:276-282; Ogata Y.
ら, 1995, European J. Biochem., 230:183-192）。
【００１３】３． 発明の概要 本明細書に開示した発明は、骨親和性特異的遺伝子転写のモデルを提供する。
本発明は、部分的に、石灰化の可能性を有する腫瘍を処置し、治療しおよび／ま
たは改善する新規の治療剤の同定に基づくものであり、上記腫瘍は、限定される
ものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、
脳腫瘍、多発性骨髄腫を含み、および、特に、限定するものでないが、乳癌およ
び前立腺癌を含む。具体的には本発明は、上記骨親和性腫瘍の転移部位、および
、適用できる場合には、転移環境においてそれらを支持する骨性間質（osseous
stroma）を標的とする。さらに、また本発明は、石灰化が起こる良性前立腺肥大
（BPH）または動脈硬化状態などの良性状態にも適用し得る治療剤にも関する。
【００１４】 骨シアロタンパク質（「BSP」）プロモーターは、骨親和性腫瘍において高い
活性を有する新規配列であり、これらの骨親和性腫瘍に対して選ばれた治療用遺
伝子の作用を腫瘍および組織に制限された様式で指令する強力なツールとして使
うことができる。今まで最も良く研究された治療用遺伝子は単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（HSVTKまたはTK）遺伝子である。単純ヘルペスウイルス-TK
は、プロドラッグACR（または関係薬剤）を分割細胞に細胞毒性があるリン酸化
形態に変換する（Moolten, F.L., 1996, Cancer Research, 46: 5276-5281）。
結果の成功を得る上で重大なことは、「バイスタンダー」の影響であり、これは
近傍の形質導入されない細胞に細胞毒性を与える。有効な腫瘍細胞殺傷は、自殺
遺伝子の送達および発現なしにあらゆる腫瘍細胞においてin vivoで達成するこ
とができる。この手法は、最近、動物モデルにおいて多くの固形腫瘍を退行させ
るのに有効であることが実証されている（Tong, X.W.ら, 1998, Anticancer Res
earch, 18: 713-718）。最近の文献では、選ばれた腫瘍特異的プロモーターおよ
び治療用（毒性）遺伝子の送達ベクターが、選定された発現カセットを含有する
組換えアデノウイルス、またはリポソームまたはレトロウイルス剤形であること
が多い。多数のベクター送達方法を実施することができ、病巣内注射、静脈内注
射、骨内注射、または潅流による移動局部的（loco-regionally）注入が含まれ
る。有効な遺伝子治療の要は、腫瘍特異的プロモーターの選択である。
【００１５】 以前に処置した、再発性前立腺癌（または他の骨親和性腫瘍）の患者は通常の
放射線治療、手術、または化学療法に対する応答速度が乏しいので、単独で、ま
たは現在の理学療法もしくは他の新規の治療方法と組み合わせて適用できる新し
い治療方法を開発することが重要である。本発明は、腫瘍および組織特異的な様
式で治療用もしくは毒性遺伝子の発現を駆動する新規治療用遺伝子を同定するこ
とで大きな前進を与える。さらに具体的には、本発明は初めて、とりわけ、培養
骨親和性細胞中in vitroとトランスジェニック動物中in vivoの両方で、骨親和
性特異的発現を指令するBSPプロモーターを含む新規治療用遺伝子の同定を提供
する。
【００１６】 本発明は、組換えアデノウイルス（Ad）などのベクターにより原発部位または
転移部位で石灰化の可能性を示す種々のヒト腫瘍または良性組織へ送達される、
治療用または毒性遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）
の発現を駆動するBSPプロモーターを含む新規治療用組成物を提供する。このこ
とは、特に前立腺癌および骨肉腫に対して明らかであるが、例えば、肺癌、多発
性骨髄腫、乳癌、大腸癌および脳腫瘍などの骨親和性進行性転移腫瘍が含まれる
。石灰化能を有ししたがってBSPを発現する非腫瘍細胞も本発明の組換えレポー
ターまたは治療用遺伝子を高レベルで発現する能力がある。
【００１７】 また本発明は、骨肉腫または前立腺癌または他の骨親和性腫瘍の治療方法であ
って、プロドラッグ、最も一般的にはアシクロビア（ACV）と組み合わせて組換
えアデノウイルスAd-BSP-TK投与の上述のルートによりBSPプロモーターを使うこ
とができる上記治療方法を提供するが、該BSPプロモーター駆動による治療は特
定のベクターまたは治療用遺伝子に限定されるものでない。実際、認識されるよ
うに、所望の抗腫瘍効果を得るために多くの形態のベクターまたは毒性遺伝子を
作製し、この新規BSP駆動による方法と組み合わせることができる。組換え抗体
および毒性または治療用遺伝子と組み合わせたとき、BSPプロモーター発現のレ
ベルおよび組織特異性に基づいて、本発明は効果的に、in vitroおよびin vivo
両方での局在化したおよび骨転移性沈着した、前立腺癌および骨肉腫または、限
定するものでないが、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫
、および乳癌増殖を含む他の骨親和性腫瘍を消滅させるであろう。
【００１８】 本発明は、骨親和性細胞および組織内で発現を調節する化合物をスクリーニン
グする組成物および方法を提供する。特に本発明は、ヒトBSPプロモーター由来
のヌクレオチドおよびその転写活性のある断片、ならびに、骨親和性特異的遺伝
子の発現を制御するヌクレオチドと高度ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする核酸を含む組成物を提供する。具体的には、異種レポーター遺伝子、例
えばルシフェラーゼと機能しうる形で結合したBSPプロモーターおよびその転写
活性のある断片を含む発現ベクター、ならびにこのようなベクターを含有する宿
主細胞およびトランスジェニック動物を提供する。また本発明は、骨親和性関連
障害のアゴニストおよびアンタゴニストについて候補分子をスクリーニングする
ために、このようなベクター、細胞および動物を使用する方法も提供する。スク
リーニングアッセイにより同定された分子および化合物を治療処置のために使用
する方法も提供する。
【００１９】 例えば、限定するものでないが、レポーター遺伝子を含む組成物はBSPプロモ
ーターと機能しうる形で連結されている。BSP駆動レポーター遺伝子は動物中で
トランスジーンとして発現される。トランスジェニック動物およびこのようなト
ランスジェニック動物の骨親和性細胞由来の細胞は、骨親和性関連障害を調節す
るために有用な候補について化合物をスクリーニングするために使用することが
できる。いずれの特定の理論にも束縛されることなく、このような化合物は恐ら
く、骨親和性関連障害に関与する、転写因子などのトランス作用因子、プロモー
ターおよびエンハンサーなどのシス作用エレメント、ならびに転写後、翻訳また
は翻訳後のいずれかのクラスの化合物の機能を妨害すると思われる。このように
して、上記化合物は、限定するものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌
、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫を含み、特に、限定するも
のでないが、乳癌および前立腺癌、ならびに石灰化が起こるBPHまたは動脈硬化
状態などの良性症状を含む上記障害を治療するための強力な候補である。本発明
の化合物はさらに、老化および変性状態中に得た損傷を修復するのに重要な、増
殖因子、増殖因子受容体、骨形態形成タンパク質などの、成長および分化に関連
する遺伝子を発現するために使用することができる。
【００２０】 ある実施形態においては、本発明は、骨親和性細胞および組織内で遺伝子の特
異的発現を調節する化合物をハイスループットスクリーニングするための方法を
提供する。本発明のこの態様においては、骨親和性組織由来の細胞をトランスジ
ェニック動物から取出し、in vitroで培養する。レポーター遺伝子の発現を使っ
て骨親和性特異的遺伝子活性をモニターする。特定の実施形態においては、ルシ
フェラーゼがレポーター遺伝子である。この方法により同定される化合物の、正
常動物の骨親和性関連障害に対する効果をさらに試験することができる。
【００２１】 他の実施形態においては、本発明のトランスジェニック動物モデルは、候補薬
物の骨親和性関連障害に対する効果について、その作用機序を試験するためのin
vivoスクリーニングに使うことができる。具体的には、限定するものでないが
、局所性または播種性骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発
性骨髄腫を含み、特に、限定するものでないが、乳癌および前立腺癌、ならびに
石灰化が起こるBPHまたは動脈硬化状態などの良性状態を含む骨親和性障害に対
する、上記薬物の効果をアッセイすることができる。
【００２２】 他の実施形態においては、骨親和性関連障害を治療および／または予防する遺
伝子治療法を提供する。BSPプロモーターを毒性または治療用分子の骨親和性特
異的発現を駆動するために使い、骨親和性細胞に導入する。本方法は、毒性また
は治療用分子をコードする核酸と機能しうる形で結合したBSPプロモーター配列
を骨親和性細胞に導入することを含んでなる。ある実施形態においては、本発明
は、毒性または治療用分子をコードする核酸と機能しうる形で結合したBSPプロ
モーター配列を骨親和性細胞に導入して、骨親和性関連障害を遅延および／また
は予防することを含んでなる予防的遺伝子治療法を提供する。特定の実施形態に
おいては、本発明は、限定するものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌
、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫を含む、特に、限定するも
のでないが、乳癌および前立腺癌を含む癌または他の増殖性障害の治療のための
遺伝子治療法を提供する。BSPプロモーター配列は、具体的には患者の骨親和性
腫瘍細胞内で１以上のタンパク質の発現を指令するために使われる。さらに、本
発明で使われるプロモーターは組織特異性であるので、治療剤および／または毒
性物質は、注入によるなどの直接適用で投与したときのみでなく、静脈内投与、
動脈内投与、腫瘍内投与、潅流、経口投与などを経由して全身投与したときも有
効である。なぜなら、遺伝子発現が特定の骨芽細胞および組織型に限定されかつ
局在化するからである。さらに、本発明の多くの治療剤および／または毒性物質
は、多面発現性の効果を表すので、特異的に標的化された細胞のみにおける治療
剤および／または毒性物質の発現が多数の有害な副作用を予防するために不可欠
である。
【００２３】 本発明は、組織特異的プロモーターに加えて、誘導プロモーターを使うベクタ
ーを包含する。誘導プロモーターは、患者の臨床状態に依存してスイッチオンお
よびオフできるので有利である。従って、もし細胞を誘導プロモーターの制御下
で治療用トランスジーンを用いて安定的にトランスフェクトすれば、その発現を
個人の生存期間にわたって制御することができる。
【００２４】 さらに本発明は、BSPプロモーター配列を調節する新規転写因子をスクリーニ
ングする方法を提供する。本発明の方法により同定したこのような新規転写因子
は骨親和性関連障害を治療する標的として使用することができる。
【００２５】3.1 定義 TK＝チミジンキナーゼ；OC＝オステオカルシン；BSP＝骨シアロタンパク質；AcV
＝アシクロビア；FBS＝ウシ胎児血清；β-gal＝β-ガラクトシダーゼ；CMV＝サ
イトメガロウイルス；ROS 17/2.7＝ラット骨芽細胞骨肉腫；MG 63＝ヒト骨肉腫
；NIH 3T3＝胚性マウス織維芽細胞；P69＝腫瘍形成能または転移能力のないヒト
「正常」前立腺細胞型；LNCaP＝ヒトアンドロゲン依存前立腺癌；C4-2＝ヒトア
ンドロゲン非依存高度腫瘍形成性／転移性前立腺癌；PC-3M＝ヒトアンドロゲン
非依存高度転移性前立腺癌；ArCaP＝ヒトアンドロゲン非依存前立腺癌；Saos-2
＝ヒト骨肉腫；SF/PF＝無血清、無フェノール；D1＝マウス胚性多能性骨髄細胞
；Lovo＝ヒト大腸癌；MCF-7＝ヒト乳癌；U-97＝神経グリア芽細胞腫(gioblastom
a)多形型のヒト脳腫瘍；A547＝ヒト肺癌；DMEM＝ダルベッコ改変イーグル培地；
T media＝前立腺癌細胞最適増殖培地；RLU＝相対ルシフェラーゼ単位；Dex.＝1
x 10-7または1 x 10-8デキサメタゾン（グルココルチコイド）；Mineral. cond.
＝50 ug/ml最終濃度L-アスコルビン酸（ビタミンC）および10 uM最終濃度B-リン
酸グリセロール。
【００２６】４．図面の簡単な説明 以下の図面は本明細書の一部分を構成し、本発明のある特定の態様をさらに示
すために含まれる。本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合
わせて１以上のこれらの図面を参照することにより、本発明を一層よく理解する
ことができるであろう。なお、各図面の説明については下記参照のこと。
【００２７】５ 発明の詳細な説明 本発明は、BSPの発現を制御する5'調節領域由来のヌクレオチド配列およびそ
の転写活性のある断片を含む、骨親和性細胞内で発現を指令するプロモーター、
エンハンサーおよびその他の調節エレメントを提供する。具体的には、BSP調節
領域が、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞において、異種コード
配列の発現を制御し得るか、内因性BSP遺伝子もしくは病理学的過程（pathologi
cal process）のインヒビターを過剰発現させ得るか、または石灰化関連疾患に
とって重要であると考えられる特異的遺伝子の発現をノックアウトし得る、発現
ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物を提供する。
【００２８】 また本発明は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞に関連する障
害のアゴニストおよびアンタゴニストについて候補分子をスクリーニングするた
めの、該ベクター、細胞および動物の使用方法も提供する。別の実施形態におい
ては、本発明は石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での化合物の
発現を調節するための組成物および方法、および、石灰化の可能性を有する腫瘍
細胞および組織細胞内での発現を調節する化合物のスクリーニングを提供する。
スクリーニングアッセイによって同定された分子および化合物を治療に使用する
方法も提供する。
【００２９】 さらに本発明は、限定するものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌、
大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌を含む
石灰化の可能性を有する腫瘍ならびに他の疾患および障害を治療および／または
改善する方法を提供する。本発明は、具体的には、上記の骨親和性腫瘍の転移部
位、および、適用できる場合には、転移環境においてそれらを支持する骨性間質
を標的とする。さらに、また本発明は、石灰化が起こる良性前立腺肥大または動
脈硬化状態などの良性状態に適用することができる治療剤を提供する。
【００３０】 本発明は、部分的には、ベクター（すなわちウイルスベクター）内に含有され
る毒性および／または治療用コード配列をコードするヌクレオチド配列を、該ヌ
クレオチド配列の組織特異的発現を可能にするプロモーターを使用することによ
って、細胞および組織特異的な様式で投与できるという発見に基づく。さらに、
本発明のベクターはこれらのプロモーターを利用して毒性および／または治療用
コード配列の発現を制御するので、本発明のベクターは直接適用を経由して投与
されたときのみならず、身体に全身的に投与されたときでも有効な治療剤である
。なぜなら毒性および／または治療用コード配列は特異的に標的化された細胞、
すなわち石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内においてのみ発現さ
れるからである。
【００３１】 この特徴の利点を考慮して、本発明の方法は治療剤をコードする１以上のDNA
分子を治療剤が必要である部位に効率的に導入するように設計する。本方法は、
翻訳産物（すなわち治療用タンパク質）または転写産物（すなわちアンチセンス
またはリボザイム）をコードするDNAを含有するベクターを、哺乳類動物宿主内
の翻訳産物が必要とされる部位への投与を含む。ベクターが治療剤を必要とする
細胞に感染すれば、目的のコード配列、すなわちチミジンキナーゼが発現され、
それにより毒性物質および／または治療剤、タンパク質またはRNAの量が増幅す
る。
【００３２】 また本発明は、限定するものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌、大
腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、ならび
に、例えば石灰化が起こる前立腺肥大（BPH）または動脈硬化状態などの良性状
態を含む骨親和性関連障害を治療および／または改善するために使うDNAを含有
するベクターを含む医薬組成物に関する。本発明の組成物は一般的に、目的の治
療用タンパク質、すなわち、チミジンキナーゼ、増殖因子などをコードするDNA
を含有するベクターを含む生体適合物質を含んでなる。生体適合性組成物は、哺
乳類動物宿主に投与したときに、アレルギー反応、副作用またはその他の有害作
用を生じない形態にあるものである。
【００３３】 本発明は、骨親和性疾患を治療しおよび／または改善する最近の組換えタンパ
ク質治療に特に関連する欠点を克服する。第１に、直接遺伝子導入は、トランス
フェクトした細胞が、(a)組織および関連(context)特異的な方法で改変された治
療用タンパク質を生理学的量産生し、そして、(b)このタンパク質を適当な環境
下の適当な細胞表面シグナル伝達受容体に送達することを可能にする合理的な方
法である。このような分子の外因的送達は、重大な投与および送達の問題に関連
すると期待される。第２に、本発明の方法では、誘導プロモーターを含む様々な
プロモーターを使って目的の治療用タンパク質の発現レベルを制御することがで
きるので、反復投与は可能であっても必要ではない。さらに、トランスフェクト
したDNAの組込みは、長期間の組換えタンパク質発現と関連付けることができる
。
【００３４】 以下、第5.1節および第5.2節に記載したのは、BSP調節領域のヌクレオチド配
列、ならびに、BSP調節領域により異種コード配列の発現を制御する発現ベクタ
ー、宿主細胞およびトランスジェニック動物である。第5.3節では、BSP遺伝子の
調節領域と相互作用する化合物をスクリーニングするための、このようなポリヌ
クレオチド（すなわち、BSP遺伝子の調節領域）および融合タンパク質産物の使
用方法を記載する。この節は、BSP調節領域に結合するか、該領域の活性を調節
する小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリー
ニングするin vivoおよびin vitroアッセイの両方を記載する。第5.4節は、本発
明の組成物、薬物送達または遺伝子治療のための同定されたアゴニストおよびア
ンタゴニストの使用方法を記載する。最後に、第5.5節において、このような組
成物、アゴニストおよびアンタゴニストを用いて、骨親和性関連障害を調節する
方法を記載する。限定するものでないが、局所性または播種性骨肉腫、肺癌、大
腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、ならび
に石灰化が起こる前立腺肥大（BPH）または動脈硬化状態などの良性状態を含む
、様々な骨親和性関連障害を治療する方法と組成物を提供する。
【００３５】5.1 本発明のポリヌクレオチドおよび核酸 本発明は、BSP遺伝子の5'調節領域を含むポリヌクレオチド配列、および転写
活性があるその断片を包含する。特に、本発明は、BSP遺伝子内に位置する907bp
、1107bp、1418bp、1459bpおよび2253bp配列を含むポリヌクレオチドを提供する
。具体的には、該ポリヌクレオチドは、図８に示したBSP配列の-838bp〜+69bp、
-1038bp〜+69bp、-1349bp〜+69bp、-1390bp〜+69 bpおよび-2184bp〜+69 bpをそ
れぞれ含む。様々な実施形態においては、該ポリヌクレオチドは5000、4000、30
00、2000、1000および好ましくはほぼ500bp長である。
【００３６】 さらに本発明は、BSP調節領域のプローブ、プライマーおよび断片を提供する
。ある実施形態においては、BSP遺伝子配列の少なくとも8ヌクレオチド（すなわ
ち、ハイブリダイズ可能な部分）からなる精製核酸を提供し；他の実施形態にお
いては、該核酸は、BSP配列の少なくとも20（隣接）ヌクレオチド、25ヌクレオ
チド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、500、1000、2000
、3000、4000または5000ヌクレオチドからなる。当技術分野で公知の方法を使い
、単離された状態のまたは発現ベクターに含有された状態のこれらの配列を構築
することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技
術およびin vivo遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrookら, 1989,前掲,およびA
usabelら, 1989、前掲、に記載された技術を参照のこと；また本明細書に参照に
よりその全文が組み入れられる、"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait M.
J.編, IRL Press, Oxfordに記載の技術も参照のこと。
【００３７】 他の実施形態においては、核酸は20、25、35、200または500ヌクレオチド長よ
り小さい。核酸は1本鎖または２本鎖であることができる。また本発明は、上記
配列とハイブリダイズ可能なまたは相補的な核酸も包含する。特定の態様におい
ては、BSP遺伝子の少なくとも10、20、25、50、100、200、500ヌクレオチドまた
は全調節領域と相補的である配列を含む核酸を提供する。
【００３８】 本発明により提供されるBSP調節領域のプローブ、プライマーおよび断片は、
様々な目的の研究分野で使うことができる。これらは、サザンブロットゲル上の
分子量マーカーとして；染色体を同定するかまたは関係遺伝子位置をマップする
ための染色体マーカーまたはタグ（標識したときは）として；患者の内因性DNA
配列と比較して潜在的遺伝子障害を確認するために；ハイブリダイズし、そして
新規の関係DNA配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリン
トのためのPCRプライマーを誘導するための情報源として；および他の新規ポリ
ヌクレオチドを発見する過程において既知配列を「引き去る（subtract out）」
ためのプローブとして使うことができる。上に掲げた用途を実施する方法は当業
者には周知である。このような方法を開示した参考文献には、限定するものでな
いが、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第2版, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. FritschおよびT. Maniatis編, 1989
、ならびに"Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques"
, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel編, 1987が挙げられる。
【００３９】 また本発明のヌクレオチド配列は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組
織細胞内で特異的に発現を駆動する能力のある、図８に記載のヌクレオチド配列
および／またはその転写活性のある断片に対して少なくとも65%、70%、75%、80%
、85%、90%、95%、98%またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレ
オチド配列を含む。
【００４０】 2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性(％)を決定するには、配列を最適
の比較目的のためにアラインメントさせる（例えば、第1のアミノ酸または核酸
配列を第2のアミノ酸または核酸配列と最適にアラインメントさせるために配列
にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌク
レオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある
位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占
められると、該分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性(%)は、両配
列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性(%)＝同一の重複
位置数／全位置数 X 100）。ある実施形態においては、2つの配列は同じ長さで
ある。
【００４１】 2つの配列間の同一性(%)の決定はまた、数学的アルゴリズムを使って達成する
ことができる。好ましい、2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの
例は、限定するものではないが、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl Aca
d Sci. USA 87:2264-2268,およびその改定版であるKarlinおよびAltschul (1993
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877、のアルゴリズムである。このよ
うなアルゴリズムをAltschulら, (1990) J Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTお
よびXBLASTプログラムに組みこむ。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム
を用いてスコア＝100、ワード長＝12にて実施し、本発明の核酸分子と相同的な
ヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索はXBLASTプログラ
ムを用いてスコア＝50、ワード長＝3にて実施し、本発明のタンパク質分子と相
同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップ有りのアライン
メントを得るために、Altschulら (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402に記
載のギャップ有りBLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BLASTを使い、
離れた分子間の関係（Id.）を検出する反復検索を実施することができる。BLAST
、ギャップ有りBLASTおよびPSI-Blastプログラムを用いるとき、それぞれのプロ
グラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使うことが
できる（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）。他の好ましい、配列の
比較に利用する数学的アルゴリズムの例は、限定するものではないが、Myersお
よびMiller, (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴ
リズムを、GCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部分であるALIGN
プログラム（バージョン2.0）に組み込む。ALIGNプログラムをアミノ酸配列の比
較に利用するとき、PAM120ウェイト残基テーブル、ギャップ長ペナルティ12およ
びギャップ長ペナルティ4を使うことがで きる。別の実施形態においては、NA_MULTIPLE_ALIGNMENT 1.0プログラムを使い
、ギャップウェイト5およびギャップ長ウェイト1を使ってアラインメントを得る
ことができる。
【００４２】 ２つの配列間の同一性(%)は、上記と類似の技術を使い、ギャップ有りまたは
無しで決定することができる。同一性(%)の計算では、典型的には、正確なマッ
チングだけを数える。
【００４３】 また本発明は、次を包含する： (a)上記BSP調節配列および／またはその相補配列（すなわちアンチセンス）のい
ずれかを含有するDNAベクター； (b)レポーター遺伝子などの異種遺伝子と機能しうる形で結合した上記BSP調節エ
レメント配列のいずれかを含有するDNA発現ベクター；および (c)BSP調節エレメントが宿主細胞中の異種遺伝子の発現を指令するように、異種
遺伝子と機能しうる形で結合した上記BSP調節エレメント配列のいずれかを含有
する遺伝子工学的に作製された宿主細胞。
【００４４】 また、この調節領域の様々な転写活性のある断片も本発明の範囲内に包含され
る。本発明による図８に記した配列の「転写活性がある」または「転写機能があ
る」断片は、組換え細胞宿主内での組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレ
オチドの発現に対する調節領域として機能する上記ポリヌクレオチドの断片を含
むポリヌクレオチドを意味する。本発明の目的にとって、核酸またはポリヌクレ
オチドは組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現する調節領域
として「転写活性がある」というのは、上記調節ポリヌクレオチドが転写情報を
含有する核酸配列を含み、かつ、そのような配列が所望のポリペプチドまたは所
望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列と機能しうる形で結合して
いる場合である。
【００４５】 特に、本発明のBSP調節領域の転写活性のある断片は、BSP調節配列と機能しう
る形で連結されて石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞中にトランス
フェクトされたときに、レポーター遺伝子などの異種遺伝子の転写を促進するの
に十分な長さである断片を包含する。典型的には、調節領域はコード配列の5'の
直前に配置され、コード配列と機能しうる形で結合している。本明細書で使われ
る用語「機能しうる形で結合している」とは、調節配列をレポーター遺伝子の5'
の直前(上流)に配置して、転写因子、ポリメラーゼサブユニットおよびアクセサ
リータンパク質などの転写開始に必要なトランス作用因子をこの領域に集合させ
るようにし、レポーター遺伝子のRNAポリメラーゼ依存転写開始を可能にするこ
とを意味する。
【００４６】 ある実施形態においては、選ばれるポリヌクレオチド配列はさらに、BSP遺伝
子由来のまたは異種遺伝子由来の他のヌクレオチド配列を含むことができる。他
の実施形態においては、プロモーター配列またはその断片の複数コピーをお互い
に連結してもよい。例えば、プロモーター配列またはその断片をプロモーター配
列またはその他の断片の他のコピーと、頭側対尾側（head to tail）、頭側対頭
側（head to head）、または尾側対尾側（tail to tail）の方向で連結してもよ
い。他の実施形態においては、骨親和性特異的エンハンサーをBSP調節配列また
はその断片と機能しうる形で連結し、BSP調節配列を含有する構築物からの転写
を増強するために使ってもよい。
【００４７】 転写活性に実質的に影響を与えない上記ヌクレオチド配列の改変も本発明の範
囲内に包含される。そのような改変は付加、欠失および置換を含む。さらに、ス
トリンジェントな条件下で図８に記した配列の相補配列と選択的にハイブリダイ
ズしかつ石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内でコード配列の発現
を特異的に活性化する能力のある任意のヌクレオチド配列も本発明の範囲内に包
含される。中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は次の通
りである：DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、8時間〜
一夜、65℃にて、6 X SSC、50 mM Tris-HCI (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、
0.02% フィコール、0.02% BSAおよび500 μg/ml 変性サケ精子DNAから成るバッ
ファー中で実施する。フィルターは、48時間、65℃にて、100μg/ml 変性サケ精
子DNAおよび5-20 X 106 cpMの32P標識プローブを含有するプレハイブリダイゼー
ション混合液中でハイブリダイズする。フィルターの洗浄は、37℃にて、1時間
、2X SSC、0.01% PVP、0.01% フィコール、および0.01% BSAを含有する溶液中で
実施する。続いて、50℃にて、45分間、0.1 X SSC中で洗浄した後、オートラジ
オグラフィにかける。あるいは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件の例は次の通りである：例えば、0.5 M NaHP04、7% ドデシル硫酸ナト
リウム(SDS)、1 mM EDTA中で、65℃にてフィルターに結合したDNAとのハイブリ
ダイゼーション、そして、68℃にて、0.1 x SSC/0.1% SDS中での洗浄(Ausubel F
.M.ら, 編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green P
ublishing Associates, Inc.、およびJohn Wileyおよびsons, Inc., New York,
p.2.10.3)。他の使用し得る高ストリンジェンシーの条件は当技術分野で公知で
ある。一般的に、14〜70ヌクレオチド長のプローブについては、その融点（TM）
は次式で計算される： Tm(℃)=81.5+16.6(log[一価カチオン(モル濃度)])+0.41 (% G+C)-(500/N)、 （式中、Nはプローブの長さである）。もしハイブリダイゼーションをホルムア
ミドを含有する溶液中で実施すれば、その融点は次式を使って計算される： Tm(℃)=81.5+16.6(log[一価カチオン(モル濃度)])+0.41 (% G+C)-(0.61 %ホルム
アミド)-(500/N)、 （式中、Nはプローブの長さである）。一般的に、ハイブリダイゼーションはTm
より約20-25℃低い温度（DNA-DNAハイブリッド）、またはTmより10-15℃低い温
度（RNA-RNAハイブリッド）で実施する。
【００４８】 BSP調節領域、またはその転写機能がある断片は、哺乳類動物に由来すること
が好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング方法により、様
々な生物から遺伝子配列を単離することが可能である。本明細書に開示する単離
されたポリヌクレオチド配列またはその断片を標識して、対象の生物由来の適当
な細胞または組織（例えば石灰化組織）より取得したmRNAから構築したcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするために使うことができる。cDNAライブラリーが標
識した配列が由来する生物の種と異なる生物に由来するときは、使用されるハイ
ブリダイゼーション条件は低ストリンジェンシーであるべきである。低ストリン
ジェンシー条件は、当業者には周知であり、ライブラリーおよび標識した配列が
由来する生物に依存して変化するであろう。このような条件についての手引書は
、例えば、それぞれ本明細書にその全文が参照により組み入れられる、Sambrook
ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Har
bor Press, N.Y.、およびAusabelら, 1989, Current Protocols in Molecular B
iology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照の
こと。さらに、哺乳類動物のBSP調節領域相同体は、本明細書に開示したBSP調節
領域のヌクレオチド配列に基づいて設計した2つのプライマープールを使ってポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を実施することにより、例えばヒト以外のウシ
または核酸から、単離することができる。この反応のためのテンプレートは、例
えば、BSP遺伝子を発現することが公知であるウシまたは他の非ヒト細胞系もし
くは組織から調製したmRNAの逆転写により得たcDNAであってもよい。このような
条件に関する手引書は、例えば、それぞれ本明細書にその全文が参照により組み
入れられる、Innisら, (編) 1995, PCR Strategies, Academic Press Inc., San
Diego；およびErlich (編) 1992, PCR Technology, Oxford University Press,
New Yorkを参照のこと。
【００４９】 さらに、BSP遺伝子の5'非コード領域内のプロモーター配列は、エキソヌクレ
アーゼIIIまたは適当な制限エンドヌクレアーゼ消化などの通常の技術を使って
ネスト化（nested）5'および／または3'欠失体を構築することにより、規定する
ことができる。得られた欠失断片をプロモーター-レポーターベクター中に挿入
して、上記欠失がプロモーター活性を低下または消去するかを、例えば、Coles
らの記載(Hum. Mol. Genet., 7:791-800, 1998)のように決定することができる
。この方法で、プロモーターの境界を規定することができる。所望であれば、個
々にまたは組み合わせてプロモーター内の可能性のある転写因子結合部位を消去
する部位特異的突然変異またはリンカースキャニングを使い、プロモーター内の
可能性のある個々の調節部位を同定することができる。これらの突然変異の転写
レベルに対する効果は、突然変異体をプロモーター-レポーターベクターのクロ
ーニング部位に挿入することにより決定することができる。これらのアッセイ形
式は当業者には周知である（WO 97/17359、US 5,374,544、EP 582796、US 5,698
,389、US 5,643,746、US 5,502,176、およびUS 5,266,488）。
【００５０】 BSP調節領域および転写機能があるその断片、ならびにBSP調節領域およびその
断片の同定に利用できる本明細書に記載の断片およびプローブは、当技術分野で
公知の技術を使って組換えDNA技術により作製することができる。当業者に公知
の方法を使ってこれらの配列を単離した形でまたは発現ベクターに含まれた形で
構築することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えDNA技術、合
成技術およびin vivo遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrookら, 1989, 前掲、
およびAusabelら, 1989, 前掲を参照のこと；また、本明細書にその全文が参照
により組み入れられる"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait M.J. 編, IRL
Press, Oxfordに記載の技術も参照のこと。
【００５１】 調節配列の改変は、当技術分野で公知の様々な化学的および酵素的方法を使っ
て作製することができる。例えば、制限酵素切断部位により規定される配列の領
域を欠失することができる。オリゴヌクレオチド指定突然変異を用い、規定した
方法で配列を改変しおよび／または配列内の特定部位に制限酵素切断部位を導入
することができる。さらに、欠失突然変異体は、Bal31、ExoIII、またはS1ヌク
レアーゼなどのDNAヌクレアーゼを使って作製することができる。調節配列内に
より大きな欠失をもつ欠失体は、DNAをヌクレアーゼを用いて時間を増加させて
インキュベートすることにより作製することができる（Ausubelら, 1989,前掲）
。
【００５２】 改変した配列は、適当な宿主細胞内で、異種コード配列の発現を指令する能力
について評価する。コード配列の発現を指令する能力を保持する改変した調節配
列のいずれかを、さらなる使用のために組換え発現ベクターに組み込むことは本
発明の範囲内にある。
【００５３】5.2 骨親和性特異的プロモーター活性の分析 BSP調節領域は、選択的組織および細胞型特異性を示す；すなわち、骨親和性
細胞内で遺伝子発現を誘導する。従って、本発明の調節領域および転写活性のあ
るその断片を使って骨親和性細胞内で異種コード配列の発現を特異的に誘導する
ことができる。本発明は、標的コード配列の組織特異的発現を達成するためのBS
P調節領域の使用を提供する。BSP調節領域の活性および特異性はさらに、BSPプ
ロモーターを含有するように遺伝子操作した様々な型の細胞、組織および細胞系
内のBSPプロモーターに機能しうる形で結合した、検出可能なポリヌクレオチド
の発現レベルをモニタリングすることにより評価することができる。以下に考察
するように、検出可能なポリヌクレオチドは、予め規定したオリゴヌクレオチド
プローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または検出可能なタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００５４】5.2.1 BSPプロモーター駆動レポーター構築物 本発明の調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物内でコード
配列またはレポーター遺伝子を発現するために利用できる組換え発現ベクターの
一部分であるのが有利である。本発明のBSP調節領域および転写活性のあるその
断片を使って、異種コード配列の発現を指令することができる。特に本発明は、
哺乳類動物BSP調節領域を包含する。本発明によれば、BSP調節領域の転写活性の
ある断片は、該断片が機能しうる形で連結したレポーターコード配列の転写を促
進するのに十分な長さである領域の断片を包含する。
【００５５】 当業者に公知である様々なレポーター遺伝子配列を利用することができ、該レ
ポーター遺伝子は、限定するものでないが、グリーン蛍光タンパク質（GFP）な
どの蛍光タンパク質、酵素（例えば、CAT、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラー
ゼ）、または抗原マーカーをコードする遺伝子を含む。便宜のために、本発明の
スクリーニングアッセイには、比色度または蛍光度アッセイにより分析する酵素
レポーターおよび発光レポーターが好ましい。
【００５６】 ある実施形態においては、例えば、生物発光、化学発光または蛍光タンパク質
を本発明の発光レポーターとして使うことができる。基質または補因子を必要と
しない発光レポーターのタイプは、限定するものでないが、発光オワンクラゲ（
Victoria aequoria）の野生型グリーン蛍光タンパク質（GFP）(Chalfieら, 1994
, Science 263:802-805)、および改変GFP（Heimら, 1995, Nature 373:663-4；P
CT 出願WO 96/23810）等が含まれる。このタイプのレポーター遺伝子の転写およ
び翻訳は試験する細胞内の蛍光タンパク質の蓄積をもたらし、その蓄積は、蛍光
光度計またはフローサイトメーターにより、例えば当技術分野で公知の方法によ
って測定することができる（例えば、Lackowicz, 1983, Principles of Fluores
cence Spectroscopy, Plenum Press, New Yorkを参照のこと）。
【００５７】 使用し得る他のレポーター遺伝子のタイプは、発光の補助因子を必要とする酵
素であり、限定するものでないが、レニラ（Renilla）ルシフェラーゼが含まれ
る。ルシフェラーゼの他の起源も当技術分野で公知であり、限定するものでない
が、ビブリオハルベイ（Vibrio harveyi）の細菌のルシフェラーゼ（luxAB遺伝
子産物）（Karp, 1989, Biochim. Biophys. Acta 1007:84-90；Stewartら, 1992
, J. Gen. Microbiol, 138:1289-1300）、およびホタル、フォティオスピラリス
(Photinus pyralis)由来のルシフェラーゼ（De Wetら, 1987, Mol. Cell. Biol
. 7:725 737）を含み、該ルシフェラーゼは光生産によりアッセイすることがで
きる（Miyamotoら, 1987, J. Bacteriol. 169:247-253；Loessnerら, 1996, En
viron. Microbiol. 62:1133-1140；ならびに、SchultzおよびYarus, 1990, J. B
acteriol. 172:595-602）。
【００５８】 比色分析を用いて分析できるレポーター遺伝子は、限定するものでないが、β
-ガラクトシダーゼ（Nolanら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2603-07
）、β-グルクロニダーゼ（Robertsら, 1989, Curr. Genet. 15:177-180）、ル
シフェラーゼ（Miyamotoら, 1987, J. Bacteriol. 169:247-253）、またはβ-ラ
クタマーゼを含む。ある実施形態においては、レポーター遺伝子配列は、LacZ遺
伝子産物、β-ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。該酵素
は、非常に安定でありかつ広い特異性を有し、限定するものでないが、5-ブロモ
-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシダーゼ(X-gal)、ラクトース2,3,5-ト
リフェニル-2H-テトラゾリウム(ラクトース-テトラゾリウム)およびフルオレセ
インガラクトピラノシド(Nolanら, 1988, 前掲、を参照のこと)などの様々な組
織化学的、発色性、蛍光発光性基質の使用が可能である。
【００５９】 他の実施形態においては、大腸菌（E.coli）β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS
）の産物をレポーター遺伝子として使用することができる（Robertsら, 1989, C
urr.Genet. 15:177-180）。GUS活性は、X-グルクロニド（Xgluc）および4-メチ
ルウンベリフェリルグルクロニドなどの様々な組織化学および蛍光発生基質によ
り検出することができる。
【００６０】 上記のような通常の比色応答をもたらすレポーター遺伝子に加えて、例えば選
択レポーター遺伝子配列などの他のレポーター遺伝子配列を通常使用することが
できる。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の
コード配列を利用して、BSP調節領域に依存する、クロラムフェニコール耐性細
胞の増殖の発現をもたらすことができる。CATの使用および選択レポーター遺伝
子の利点は当業者には周知である（Eikmannsら, 1991, Gene 102:93-98）。限定
するものでないが、ゼオシン（zeocin）（Hegedusら, 1998, Gene 207:241-249
）またはカナマイシン耐性（FriedrichおよびSoriano, 1991, Genes. Dev. 5:15
13-1523）を与えるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、他の選択レポ
ーター遺伝子配列も利用することができる。
【００６１】 毒性遺伝子産物、潜在的毒性遺伝子産物、および抗増殖または細胞分裂停止遺
伝子産物などの他のコード配列も使うことができる。他の実施形態においては、
検出可能なレポーターポリヌクレオチドは、予め規定したオリゴヌクレオチドプ
ローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはBSPポリペプチ
ドまたその断片もしくはその変異体を含む検出可能なタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドのいずれであってもよい。このタイプのアッセイは、当業者には
周知である（US 5,502,176およびUS 5,266,488）。
【００６２】 BSPプロモーター駆動レポーター構築物は、標準的組換えDNA技術によって構築
することができる（例えば、それぞれ本明細書にその全文が参照により組み入れ
られる、Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press；Sambroo
kら, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring H
arbor Press, New York；およびAusubel et al. Current Protocols in Molecul
ar Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yor
k、を参照のこと）。
【００６３】 プロモーター活性をアッセイする方法は、当業者には周知である（Sambrookら
, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY, 1989）。使用し得る典型的な方法の一例は、レポータ
ー遺伝子および図８に記されたBSP配列由来のゲノム配列を含有する組換えベク
ターを用いる。簡単に説明すると、生物学的に活性なポリヌクレオチド断片の制
御下に配置された場合のレポーター遺伝子（例えば、グリーン蛍光タンパク質、
ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ）の発現を検出する。遺伝子の第１エキソンの上流に位置する
ゲノム配列を任意の適当なプロモーター-レポーターベクター中にクローニング
することができる。例えば、多数の市販ベクターは、遺伝子操作して、本発明の
BSP調節領域を哺乳類動物宿主細胞内で発現するように挿入することができる。
このようなベクターの非限定の例は、pSEAPBasic、pSEAP-エンハンサー、pβgal
-Basic、pβgal-エンハンサー、またはpEGFP-1プロモーター-レポーターベクタ
ー(Clontech, Palo Alto, CA)またはpGL2-basicまたはpGL3-basicプロモーター
不存在ルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクター(Promega, Madison, WI)である
。これらのプロモーター-レポーターベクターは、分泌性アルカリホスファター
ゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼなど
の容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置
するマルチクローニング部位を含有する。BSP遺伝子の調節配列をレポーター遺
伝子の上流のクローニング部位中に両方の配向で挿入し、そして適当な宿主細胞
に導入する。レポータータンパク質のレベルをアッセイし、クローニング部位に
インサートのないベクターを用いて得たレベルと比較する。対照ベクターと比較
して、インサートを含有するベクター中の発現レベルの上昇があると、インサー
ト中にプロモーターが存在することを示す。
【００６４】 さらにBSP調節領域を含む発現ベクターは、選択マーカーをコードする遺伝子
を含むことができる。限定するものでないが、それぞれtk-、hgprt-またはaprt- 細胞で利用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler
ら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:
2026）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell
22:817）遺伝子を含む多数の選択システムを使うことができる。また代謝拮抗
剤耐性を、メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 1980, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:3567；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:15
27）、ミコフェノール酸耐性を与えるgpt（MulliganおよびBerg, 1981, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78:2072）、アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Col
berre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150: 1）、およびハイグロマイシンに
対する耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147）遺伝子に対する選
択のベースとして使うことができる。さらなる遺伝子は、細胞がトリプトファン
の代わりにインドールを利用できるようにするtrpB；細胞がヒスチジンの代わり
にヒスチノールを利用できるようにするhisD（HartmanおよびMulligan, 1988, P
roc. Natl. Acad.Sci. USA 85:8047）；オルニチンデカルボキシラーゼインヒビ
ターである、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルチニン、DFMO耐性（McConlogue L.,
1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harb
or Laboratory ed.）およびグルタミンシンセターゼに対する耐性（Bebbington
ら, 1992, Biotech 10: 169）を与えるODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）が
含まれる。
【００６５】5.2.2 転写活性がある調節断片の特性決定 BSP調節領域またはその断片を含む融合構築物を転写活性についてアッセイす
ることができる。プロモーター分析の第１ステップとして、検討する骨親和性特
異的遺伝子の転写開始点（+1部位）を、標準法（Sambrookら, 1989, Molecular
Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Pres
s）に従い、プライマー伸長アッセイおよび/またはRNAseプロテクションアッセ
イを利用して決定しなければならない。＋1部位の上流のDNA配列は一般的に遺伝
子調節を担うプロモーター領域と考えられる。しかし、イントロン内の配列を含
む下流配列も遺伝子調節に関与しうる。プロモーター活性に対する試験を始める
に当たり、−3kb〜＋3kb領域（＋1は転写開始点である）をレポーター遺伝子コ
ード領域の上流にクローニングすることができる。骨親和性特異的発現を担う領
域の同定を助けるために、調節領域の5'および/または3'末端切断型を含有する
２つ以上のさらなるレポーター遺伝子構築物も作ることができる。適用に応じて
レポーター遺伝子のタイプを選択する。
【００６６】 好ましい実施形態においては、GFPレポーター遺伝子構築物を用いる。グリー
ン蛍光タンパク質（GFP）のレポーターとしての適用は、骨親和性特異的遺伝子
プロモーターの研究には特に有用である。GFPをレポーターとして使う主な利点
は、基質の必要はなく、新しく単離した石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および
組織細胞内で、GFPを検出できるということである。
【００６７】 本発明の他の実施形態においては、Lac Zレポーター構築物を用いる。Lac Z遺
伝子産物、β-ガラクトシダーゼはきわめて安定であり、かつ広範な特異性を有
し、限定するものでないが、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシ
ダーゼ(X-gal)、ラクトース2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウム(ラクトース
-テトラゾリウム)およびフルオレセインガラクトピラノシド(Nolanら, 1988, 前
掲、を参照のこと)などの様々な組織化学的、発色性、蛍光発光性基質が使用で
きる。
【００６８】 トランスジェニックマウスにおけるプロモーター分析については、哺乳類動物
細胞中の発現に対して最適化されているGFPが好ましい。プロモーター不在のク
ローニングベクターpEGFP1（Clontech, Palo Alto, CA）は、哺乳類動物細胞に
おける蛍光強度および高発現に関して最適化された野生型GFPの赤色シフト変異
体をコードする（Cormackら, 1996, Gene 173:33; Haasら, 1996, Curr. Biol.
6: 315）。さらに、この増強GFP（EGFP）の最大励起ピークは488nmにあるので、
450-500nmにて照射するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）光学系のよ
うな通常使用するフィルターセットを使ってGFP蛍光を可視化することができる
。pEGFP1はトランスジェニックマウスのプロモーター分析用レポーターベクター
として有用であることが立証されている（Okabeら, 1997, FEBS Lett. 407: 313
）。代わりの実施形態においては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にBS
P調節領域をもつトランスジーンを含有するトランスジェニックマウスを利用す
る。
【００６９】 当技術分野で公知の方法を使って、推定プロモーター断片（通常、プロモータ
ー領域を含む8-10kbゲノムDNAを含有するファージ親クローンに由来する）を、
クローニング用に調製できる。ある実施形態においては、例えば、プロモーター
断片をルシフェラーゼレポーターベクターのマルチクローニング部位にクローニ
ングする。ある実施形態においては、制限エンドヌクレアーゼを用い、レポータ
ーベクターに挿入されるべき調節領域断片を切除する。しかし、この方法の使用
可能性は、調節断片中に適当な制限酵素切断部位が利用可能であるかどうかに依
存する。好ましい実施形態においては、所要のプロモーター断片は、制限エンド
ヌクレアーゼ切断に適切な部位を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使い、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Saikiら, 1988, Science 239:487）によって増幅
する。制限酵素切断に必要な配列が、増幅すべき調節断片を挟む順方向および逆
方向のプライマーの5'末端に含まれる。PCR増幅の後、該適当な末端をPCR産物の
制限酵素消化によって作製する。次に、いずれかの方法で作製されたプロモータ
ー断片は、標準的クローニング方法（Sambrookら, 1989,前掲）に従い、レポー
ターベクターのマルチクローニング部位に連結する。構築物中のPCRで作製した
プロモーター断片のDNA配列は、トランスジェニック動物を作製する前に検証す
ることを推奨する。得られたレポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子オー
プンリーディングフレーム、例えばGFPまたはルシフェラーゼcDNAの上流に位置
する推定プロモーター断片を含有する。
【００７０】 好ましい実施形態には、以下の手順を用いる。レポーター遺伝子構築物50〜10
0pgを適当な制限エンドヌクレアーゼを使って消化し、トランスジーン断片を単
離する。制限酵素による切断産物を、臭化エチジウム 0.5 μg/ml およびTAEバ
ッファー(1X: 0.04 M Tris酢酸、0.001 M EDTA、pH 8.0)を含有する1%(w/v)アガ
ロースゲル中で5-6 V/cmにて分離する。好ましくはDNAのニック化を減少するた
めに長波長UVランプを用い、UVトランスイルミネーターを使って、トランスジー
ンのバンドの位置を決定し、所要のバンドを含有するゲル片を注意深く切除する
。該ゲル片と0.5 X TAEバッファー 1 mlを、1 mM EDTA、pH 8.0で10分間煮沸し
ておいた透析バッグ（Sambrookら, 1989, 前掲）に入れて、両端を結ぶ。ゲル片
の入った透析バッグを、0.5 X TAEバッファーの入った水平ゲル電気泳動チャン
バー内に浸漬し、5-6 V/cmで45分間電気泳動する。電気泳動チャンバー内の電流
を、運転停止前に１分間逆転させ、透析チューブ壁に付着したDNAを遊離させる
。透析バッグから、電気的に溶出したDNAを含有するTAEバッファーを新しいエッ
ペンドルフチューブに採集する。ゲル片をUVトランスイルミネーター上で観察し
てDNAの電気的溶出が完全であるかを確かめる。
【００７１】 電気的に溶出したDNAサンプルを、Elutip Dカラムを通してさらに精製する。
カラムのマトリックスを高塩濃度バッファー（1.0 M NaCl, 20mM Tris. Cl, 1.0
mM EDTA, pH 7.5）1-2mlを用いて予洗し、続いて低塩濃度バッファー（0.2 M N
aCl, 20 mM Tris. Cl, 1.0 mM EDTA, pH 7.5）5mlを用いて洗浄する。5ml用のシ
リンジを使って、溶液をElutip Dカラムに逆流を避けながらアプライする。電気
的に溶出したDNAを含有する溶液を徐々に載せる。カラムを低塩濃度バッファー2
-3mlで洗浄し、DNAを高塩濃度バッファー0.4mlで溶出する。２倍容量の95%冷メ
タノールを加えてDNAを沈殿させる。DNAを微量遠心分離機で14,000 gにて10分間
遠心分離して集め、DNAペレットを破壊しないよう注意深くアルコールを除去す
る。ペレットを70%(v/v)エタノールを用いて少なくとも2回洗浄し、乾燥させる
。塩およびエタノールの残存は発生胚にとって致命的であるので、洗浄と乾燥工
程は重要である。DNAを注入バッファー（Milli-Q品質の水を用いて調製し、TM 1
OmM, EDTA 0.1mM, pH 7.5）中に再懸濁する。精製トランスジーンDNA断片の濃度
は分光光度計を使い、A260（50 μg/ml DNAにおいて、A260＝1）で吸光度を測定
して決定する。この方法で調製したDNAは、マウス受精卵中にマイクロインジェ
クションするのに適切である。
【００７２】5.2.3 トランスジェニックマウスを使う骨親和性プロモーター分析 哺乳類動物BSP調節領域を用いて、特に、トランスジェニック動物において特
異的に石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞内での、同種遺伝子また
は異種遺伝子、レポーターコード配列の発現を指令することができる。限定する
ものでないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミクロブタ、ヤギ
、ヒツジ、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーを含む任
意の種の動物を使ってトランスジェニック動物を作製することができる。本明細
書で用いる用語「トランスジェニック」は、異種に由来するBSP遺伝子配列を発
現する非ヒト動物（例えばヒトBSP配列を発現するマウス）、ならびに内在性（
すなわち同種の）BSP配列を過剰発現するよう遺伝子工学的に作製した動物また
は特定の配列をノックアウトするように遺伝子工学的に操作した動物を意味する
。
【００７３】 ある実施形態においては、本発明は、その全細胞において、BSP調節領域また
は転写活性のあるその断片の制御下にあるレポーター遺伝子、治療用配列および
／または毒性コード配列などのトランスジーンを含有するトランスジェニック動
物、ならびにそれらの全細胞でなく一部の細胞において該トランスジーンを含有
する動物、すなわちモザイク動物を提供する。トランスジーンを単一のトランス
ジーンとしてまたはコンカテマーとして、例えば、頭側対頭側の直列（head-to-
head tandem）または頭側対尾側の直列（head-to-tail tandem）に組み込むこと
ができる。また該トランスジーンは、例えばLaskoら(1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:6232-6236)の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入し活性化
することもできる。トランスジーンを内在性の対応する遺伝子の染色体部位に組
み込むことを所望するときは、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に説明す
ると、そのような技術を利用するには、染色体の配列との相同組換えにより、内
在性遺伝子のヌクレオチド配列に組込んで、その機能を破壊することを目的とし
て、内在性遺伝子と相同的なあるヌクレオチド配列を含有するベクターを設計す
る。
【００７４】 当技術分野で公知の任意の技術を使ってBSP調節領域制御下のトランスジーン
を動物に導入し、トランスジェニック動物の始祖系列を作製することができる。
このような技術は、限定するものでないが、前核マイクロインジェクション（Ho
ppeおよびWagner, 1989, 米国特許第4,873,191号）；静止状態へと誘導した培養
胚、胎児または成熟細胞由来の核の除核卵細胞中への核導入（Campbellら, 1996
, Nature 380:64-66; Wilmutら, Nature 385:810-813）；生殖系列へのレトロウ
イルス遺伝子導入（Van der Puttenら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82 :6148-6152）；胚性幹細胞の遺伝子ターゲティング（Thompsonら, 1989, Cell 6
5:313-321）；胚のエレクトロポレーション（Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 31:1
803-1814）；および精子が媒介する遺伝子導入（Lavitranoら, 1989, Cell 57:7
17-723；Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229
を参照のこと）を含む。
【００７５】 例えば、受精卵のマイクロインジェクションについては、調節領域、レポータ
ー遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含有する直鎖状のDNA断片（トランス
ジーン）を、レポーター遺伝子構築物から切除する。トランスジーンは当技術分
野で公知の方法により、例えば電気的溶出法によりゲル精製することができる。
ゲル断片の電気的溶出に続いて、Elutip Dカラム（SchleicherおよびSchuell, D
assel, Germany）を通すことによりいかなる微量不純物でもさらに除去される。
【００７６】 好ましい実施形態においては、精製トランスジーン断片を、標準的方法（Hoga
n, 1986, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）により、メスのB6 CBAか
ら得た受精卵の雄性前核中にマイクロインジェクションする。マウスを、数個の
胚の胚形成期の段階で一過的に、または、発生過程および成熟動物中のトランス
ジーン発現のより詳細な分析を可能にする始祖系列を確立することによって分析
する。トランスジーンの存在は、Vemetら, Methods Enzymol 1993; 225:434-451
の方法に従って、胎盤（一過的）または尾部片（始祖系列）から精製したゲノム
DNAを用いてPCRにより分析する。好ましくは、PCR反応は、dNTP 0.2 mM、MgCl2
2 mM、各プライマー 600μM、およびTaqポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）
2.5ユニットを添加した1 X 反応バッファー中で、ゲノムDNA 1μgを含有する容
積100μl中で実施する。30回のPCRサイクルは、それぞれ、94℃にて1分間の変性
、54℃にて1分間のアニーリング、および72℃にて1分間の伸長から成る。次に、
始祖系列マウスをC57B1のパートナーと交配してマウスのトランスジェニックF1
系列を作製する。
【００７７】5.3 スクリーニングアッセイ 石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞の異常機能および／または増
殖を妨害する化合物は、限定するものでないが、局在化または播種性骨肉腫、肺
癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、
ならびに石灰化が起こる前立腺過形成（BPH）または動脈硬化症状などの良性症
状を含む、骨親和性関連障害の欠陥を標的とする治療法を提供することができる
。このような化合物を用いて骨親和性関連障害の発症または進行を阻止すること
ができる。またプロモーター活性を刺激または阻害する化合物を使って骨親和性
関連障害の症候群を改善することもできる。
【００７８】 レポーター遺伝子に機能しうる形で連結されたBSP調節領域またはその断片を
含有する、遺伝子工学的に作製された細胞、細胞系および／またはトランスジェ
ニック動物は、BSP調節領域活性を調節する薬剤のスクリーニング用システムと
して用いることができる。このようなトランスジェニックマウスはin vivo実験
モデルを提供し（または、in vitroで使う初代細胞または細胞系の供給源として
使用することが可能であり）、該実験モデルは治療用および／または毒性薬剤を
ターゲティングして骨親和性関連障害の進行の停止をもたらすことにより、かか
る障害を治療する新しい方法を開発するために用いることができる。
【００７９】 本発明は、BSP調節領域の活性を調節する化合物を同定するために設計された
スクリーニングアッセイを包含する。本発明は、in vitroアッセイおよび細胞に
基づくアッセイ、ならびにトランスジェニック動物におけるin vivoアッセイを
包含する。以下に記載の通り、試験する化合物は、限定するものでないが、オリ
ゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小さな有機化合物または無機化合物、
抗体などを含む。
【００８０】 化合物の例は、限定するものでないが、例えば可溶性ペプチドなどのペプチド
（限定するものでないが、免疫グロブリンの一部分との（Ig-tailed）融合ペプ
チド、およびランダムペプチドライブラリーのメンバー；（Lamら, 1991, Natur
e 354:82-84; Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86）、およびD-および／また
はL-アミノ酸から作られた組み合わせ化学(combinatorial chemistry)により誘
導された分子ライブラリーを含む）、ホスホペプチド（限定するものでないが、
ランダムまたは部分的変性した、指定されたホスホペプチドライブラリーを含む
；例えばSongyangら, 1993, Cell 72:767-778を参照のこと）、抗体（限定する
ものでないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、
キメラまたは１本鎖抗体、およびFAb、F(ab')2およびFAb発現ライブラリーフラ
グメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを含む）、ならびに小さな有
機分子または無機分子を含む。
【００８１】 このような化合物はさらに、化合物、特に骨親和性関連障害の症候群を改善す
ることが公知である薬物または薬物の分類もしくはファミリー内のメンバーを含
んでなる。
【００８２】 このような化合物は、限定するものでないが、リチウム塩、カルバマゼピン、
バルプロ酸、リゼルギン酸ジエチルアミド（LSD）、p-クロロフェニルアラニン
、p-プロピルドーパアセトアミドジチオカルバメート誘導体、例えばFLA63；抗
不安薬、例えば、ジアゼパム；モノアミンオキシダーゼ（MAO）阻害剤、例えば
、イプロニアジド、クロルジリン、フェネルジンおよびイソカルボキシアジド；
生体アミン取込みブロッカー、例えば、デシプラミン、イミプラミンおよびアミ
トリプチリンなどの三環式抗うつ剤；セロトニン再取込みインヒビター、例えば
、フルオキセチン；フェノチアジン誘導体（例えば、クロルプロマジン（トラジ
ン）およびトリフルオプロマジン）、ブチロフェノン（例えば、ハロペリドール
（Haldol））、チオキサンテン誘導体（例えば、クロルプロチキセン）およびジ
ベンゾジアゼピン（例えば、クロザピン）などの抗精神病薬；ベンゾジアゼピン
；ドーパミン作動性アゴニストおよびアンタゴニスト、例えばL-DOPA、コカイン
、アンフェタミン、α-メチル-チロシン、レセルピン、テトラベナジン、ベンゾ
トロピン、パルジリン；ノルアドレナリン作動性アゴニストおよびアンタゴニス
ト、例えば、クロニジン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トロポロン
；ニトロ血管拡張剤（例えば、ニトログリセリン、ニトロプルシドならびにNOシ
ンターゼ酵素）；および増殖因子（例えば、VEGF、FGF、アンジオポエチンおよ
びエンドスタチン）を含む。
【００８３】 ある好ましい実施形態においては、異種遺伝子と機能しうる形で連結した哺乳
動物BSP調節領域を含有する生殖細胞および／または体細胞の、遺伝子工学的に
作製された細胞、細胞系または初代培養を使い、配列特異的DNA-タンパク質相互
作用を阻害しうる化合物をスクリーニングするアッセイシステムを開発する。こ
のような方法は、ある化合物をBSP調節領域または転写活性のあるその断片の制
御下である遺伝子を発現する細胞に接触させ、遺伝子発現または遺伝子産物活性
のレベルを測定し、そしてこのレベルを該化合物が不在の細胞で産生される遺伝
子発現または遺伝子産物活性のレベルと比較して、もし化合物存在時に得られた
レベルが不在時に得られたレベルと異なれば、哺乳類動物BSP調節領域の発現を
調節する能力のある化合物が同定されるということから成る。遺伝子発現レベル
の変化は、当業者に周知であるいくつかの方法により、例えば、レポーター遺伝
子活性をアッセイすることにより、mRNA転写物の細胞溶解液を例えばノーザン分
析によりもしくは細胞により発現された遺伝子産物をアッセイする当技術分野で
公知の他の方法を使い、アッセイすることにより確認することができる。
【００８４】 他の実施形態においては、顕微解剖（microdissection）および透過照明（tra
nsillumination）を使うことができる。これらの技術は、BSP調節領域が支配す
るレポーター遺伝子を含有するトランスジェニック動物内の骨親和性細胞に対す
る推定薬物の効果をモニタリングする迅速アッセイを提供する。この実施形態に
おいては、試験する薬剤は様々な方法によりトランスジェニック動物に送達され
る。試験する薬剤を導入する方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内および殺すこと（例えば二分枝針を使い皮膚表皮を引掻いて）による方
法、または任意の他の薬物送達の標準経路を含む。骨親和性細胞に対するこのよ
うな被験化合物の効果は、骨親和性細胞の顕微解剖および透過照明により分析す
ることができる。もし該化合物の存在で観察したまたは測定したレポーター遺伝
子発現のレベルが、該化合物の不在で得たものと異なれば、哺乳類動物BSP調節
領域の発現を調節する能力のある化合物であると同定される。
【００８５】 本発明の様々な実施形態においては、骨親和性関連障害のモジュレーターのス
クリーニングに使うことができる化合物は、該化合物はBSP調節領域結合能力を
有するかもしれない、従って医薬剤の候補でありうる、ペプチド、小分子、天然
に存在するおよび／または合成（例えば、小分子またはペプチドのライブラリー
）のペプチドおよび／または小分子（例えば、小分子またはペプチドのライブラ
リー）、細胞結合したまたは可溶性分子、有機、非タンパク質分子および組換え
分子を含む。
【００８６】 あるいは、該タンパク質および化合物は、BSP調節領域配列とin vivoで相互作
用する内在性細胞組成物を含む。細胞溶解物または組織ホモジネートを、BSP調
節領域またはその断片と結合するタンパク質または他の化合物に対してスクリー
ニングすることができる。このような内因性成分は製薬および治療的処置の新し
い標的を提供し得る。
【００８７】 ある実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングすることができる。
当技術分野で公知の多くのライブラリー、例えばペプチドライブラリー、化学合
成ライブラリー、組換え（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およ
びin vitro翻訳に基づくライブラリーを使うことができる。本発明のある実施形
態においては、ペプチドライブラリーを使ってBSPに連結したレポーター発現の
アゴニストまたはアンタゴニストについてスクリーニングすることができる。ラ
ンダムまたは組み合わせ(combinatorial)ペプチドまたは非ペプチドライブラリ
ーなどの多様なライブラリーを、BSP調節領域活性を特異的にモジュレートする
分子についてスクリーニングすることができる。固相支持体に接着した、アミノ
酸の全ての可能な組合わせから成るランダムペプチドライブラリーを使って、BS
P調節領域活性を活性化するかまたは阻害することができるペプチドを同定する
ことができる（Lam, K.S.ら, 1991, Nature 354: 82-84）。ペプチドライブラリ
ーのスクリーニングは、BSP調節領域の発現を刺激するかまたは阻害する薬剤の
発見に治療的価値を有し得る。
【００８８】 化学合成したライブラリーの例は、Fodorら, 1991, Science 251:767-773；Ho
ughtenら, 1991, Nature 354:84-86；Lamら, 1991, Nature 354:82-84；Medynsk
i, 1994, BioTechnology 12:709-710；Gallopら, 1994, J. Medicinal Chemistr
y 37(9):1233-1251；Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922
-10926；Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 11426；Houghten
ら, 1992, Biotechniques 13:412；Jayawickremeら, 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:1614-1618；Salmonら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:117
08 11712；PCT出願番号WO 93/20242；ならびに、BrennerおよびLerner, 1992, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383、に記載されている。
【００８９】 ファージディスプレイの例は、ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-39
0；Devlinら, 1990, Science, 249:404-406；Christianら, 1992, J. Mol. Biol
. 227:711-718；Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157；Kayら, 1993
, Gene 128:59-65；ならびに1994年8月18日付けPCT出願番号WO 94/18318に記載
されている。
【００９０】 非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例え
ば、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照のこと）
を使用のために用いることができる。ペプトイドライブラリー（Simonら, 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371）も使うことができる。ペプチドの
アミド機能を過メチル化して化学変換したコンビナトリアルライブラリーを作製
した、他の使用し得るライブラリーの例は、Ostreshら（1994, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91:11138-11142）に記載されている。
【００９１】 このようなin vitroスクリーニングアッセイの特定の実施形態を以下に記載す
る。BSP調節領域-レポーターベクターを使ってトランスジェニックマウスを作製
し、該マウスからBSP調節領域-レポーターベクター生殖細胞の初代培養を確立す
る。１ウエル当り約10,000個の細胞を、該細胞系に適した培地を使った全容量10
0μlで96ウエルプレートにまく。BSP調節領域の候補インヒビターを細胞に加え
る。BSP調節領域のインヒビターの効果は、BSP調節領域により駆動されるレポー
ター遺伝子の応答を測定することにより決定することができる。このアッセイは
、レポーター遺伝子活性を低下（または増加）させるが細胞毒性のない化合物ラ
イブラリーの評価のための96ウエルフォーマットの高性能スクリーニング様式に
容易にセットアップすることができる。6時間のインキュベーション後に、100μ
l DMEM培地+2.5%胎児ウシ血清（FBS）を1.25%最終血清濃度に達するまで細胞に
加え、全24時間（さらに18時間）インキュベートする。24時間経過後に、プレー
トをPBSで洗浄し、ブロットを乾燥し、-80℃にて凍結する。翌日、プレートを解
凍し、レポーター活性の存在を分析する。
【００９２】 in vivoスクリーニングアッセイの好ましい例においては、トランスジェニッ
クマウス由来の石灰化の可能性を有する腫瘍細胞および組織細胞を、正常または
他の所望の表現型をもつマウスに移植することができる（Brinsterら, 1994, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11298-302；Ogawaら, 1997, Int. J. Dev. Biol.
41:111-12）。次に、上記マウスを使って、骨親和性関連障害に対する化合物お
よび他の様々な因子の効果を試験することができる。上記の化合物および薬剤に
加えて、上記マウスを使って、食餌性効果、体内pH、体温などのような他の方法
を使って試験するのが困難である因子または症状をアッセイすることができる。
【００９３】 ある化合物がBSP調節領域活性を阻害するかまたは増強することが確認されれ
ば、次に、該化合物を動物に基づくアッセイで試験して、該化合物が、限定する
ものでないが、局在化または播種性骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、
脳腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、ならびに石灰化が起こる前立腺過
形成（BPH）または動脈硬化症状などの良性症状を含む、骨親和性関連障害の症
候群を改善および／または予防する薬物として作用する能力を表すかどうかを決
定することができる。
【００９４】 本発明のアッセイは最初は小スケール（すなわち、試験管内）で最適化し、次
に高性能アッセイにスケールアップすることができる。本発明のスクリーニング
アッセイはin vitroで、すなわち試験管内で、精製した成分または細胞溶解液を
使って実施することができる。本発明のスクリーニングアッセイはまた、培養中
の天然型の細胞および動物モデルにおいて実施することができる。本発明によれ
ば、本明細書に記載のように、in vitroでBSP調節領域の活性を調節することが
示される試験化合物は、さらに、培養細胞および動物モデルにおいてin vivoで
アッセイし、そして該被験化合物がin vivoで類似の効果を有するかどうかを決
定し、かつ、骨親和性関連障害に対する該試験化合物の効果を決定する。
【００９５】5.4 BSP調節領域ヌクレオチドの組成および治療的使用方法 BSP調節領域またはその転写活性のある断片を用いて、骨親和性特異的様式でB
SPまたはBSP調節領域に連結している異種遺伝子のレベルまたは発現を改変する
ことにより改善され得る疾患、症状または障害を治療および／または予防するこ
とができる。ここで記載するものは、そのような治療的処置の方法である。
【００９６】 BSP調節領域は、遺伝子治療プロトコールにおいて組織特異的発現を達成する
のに用いることができる。そのような細胞が腫瘍細胞である場合、BSP調節領域
による細胞障害性産物の誘導は、BSP発現に必要なトランス作用性因子を含む石
灰化の可能性がある腫瘍細胞を特異的に標的とする癌遺伝子治療の形態で用い得
る。このようにして、BSP調節領域は、石灰化の可能性がある腫瘍細胞が関与す
る癌に対する遺伝子治療法の送達経路として役立つ。さらに、アンチセンス、ア
ンチジーン（antigene）またはアプタマーオリゴヌクレオチドが、ここで記載さ
れている発現構築物を用いて細胞に輸送できる。また、リボザイムまたは一本鎖
RNAを細胞内で発現させて、関心のある標的遺伝子の発現を抑制してもよい。こ
れらのアンチセンスまたはリボザイム分子の標的遺伝子は、細胞の維持に必須の
遺伝子産物をコードするものとすべきである。
【００９７】 本発明のBSP調節領域およびその転写活性のある断片は、多種多様な目的に用
いることができ、例えば、BSP遺伝子発現をダウンレギュレートするため、ある
いはまた、異種コード配列の骨親和性特異的発現を達成するため、などが挙げら
れる。
【００９８】 １つの実施形態では、例えば、内因性のBSP調節領域をターゲッティングして
、BSP遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートすることができる。例えば、
該調節領域に相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、細胞に輸送すればよい。そ
のようなオリゴヌクレオチドは、該調節配列にアニールして、転写の活性化を防
ぐことができる。あるいはまた、該調節配列またはその部分を細胞に飽和濃度で
輸送して、転写因子の結合について競合させてもよい。遺伝子治療の方法の概説
については、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu,
1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxico
l. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorganおよびAn
derson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11:155-2
15を参照されたい。組換えDNA法の分野で一般的に知られている使用可能な方法
は、Ausubelら（編）, 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, NY；およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A
Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【００９９】 別の実施形態では、骨親和性関連障害を改善するための遺伝子治療方法が提供
される。BSP調節領域配列は、骨親和性細胞に導入され、薬剤または毒素の骨親
和性特異的発現を駆動するのに用いられる。この方法は、薬剤または毒素の遺伝
子に機能し得る形で結合させたBSP調節領域配列を骨親和性細胞に導入すること
を含む。
【０１００】 さらに別の実施形態では、本発明は、癌または他の増殖性障害を治療するため
の遺伝子治療方法を提供する。BSP調節領域は、患者の骨親和性腫瘍細胞におい
て１以上のタンパク質の発現を特異的に指令するために用いられる。そのような
タンパク質は、例えば、癌抑制遺伝子、チミジンキナーゼ（アシクロビルと組合
せて用いられる）、細胞の殺傷に関与する毒素またはタンパク質（例えばアポト
ーシス経路に関与するタンパク質）であり得る。
【０１０１】 １つの実施形態では、本発明は、毒性遺伝子治療に有用なBSPプロモーターを
含む治療剤を提供する。この方法は、真核性送達ベクターと毒性遺伝子とを含む
。好ましい実施形態において、該ベクターはアデノウイルス（Ad）であり、かつ
該遺伝子はチミジンキナーゼ（TK）である。したがって、該治療剤は、式Ad-BSP
-TKで表わされるが、実際には、ここに含まれる新規なコンセプトは、異種コー
ド配列の骨親和性特異的発現の駆動力としてのBSPプロモーターである。
【０１０２】 関心のある翻訳産物または転写産物をコードするDNAは、本発明のベクターの
調製のために大規模な該DNAの複製をもたらす種々のベクター系への組換えによ
り作製できる。これらのベクターは、該骨親和性細胞により取り込まれるDNA配
列の転写および／または翻訳を指令するのに必要なエレメントを含むように設計
できる。
【０１０３】 用い得るベクターとしては、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAま
たはコスミドDNAに由来するものが挙げられるが、それらに限定されない。例え
ば、pBR322、pUC19/18、pUC118、119およびM13mpシリーズのベクターなどのプラ
スミドベクターが用い得る。バクテリオファージベクターとしては、λgt10、λ
gt11、λgt18〜23、λZAP/RおよびEMBLシリーズのバクテリオファージベクター
を挙げることができる。用い得るコスミドベクターとしては、pJB8、pCV103、pC
V107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16およ
びコスミド９シリーズのベクターが挙げられるが、それらに限定されない。SP6
ベクターのようなRNAのin vitro転写を可能にするベクターもまた、ウイルスベ
クターに取り込まれ得るRNAを大量に生産するのに用い得る。
【０１０４】 あるいはまた、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイル
スから誘導されるものなど（しかし、それらに限定されない）の組換え複製にコ
ンピーテントまたは非コンピーテントなウイルスベクターを作製してもよい。組
込み型のベクターを用いることができるが、疾患に関連しない修復および再生で
は、遺伝子産物を多世代にわたって娘細胞に伝達しない非組込み型の系が好まし
い。このようにして、該遺伝子産物は修復過程の間に発現され、該遺伝子は子孫
世代においては薄められるので、発現される遺伝子産物の量は減少する。
【０１０５】 治療用遺伝子発現を駆動するための組織特異的プロモーターの使用は、ウイル
ス媒介遺伝子送達が該正常細胞の感染を引き起こす場合、隣接する正常細胞に対
する該治療用遺伝子の毒性作用をさらに低下させる。このことは、全身投与を用
いて治療用ベクターを体中に送達すると同時に限定した特定の数の細胞型に対す
るトランスジーンの発現を維持することができる疾患においては特に重要である
。さらに、TGF-βのような多くの骨増殖因子は多面発現作用を有するので、該増
殖因子の遺伝子が全ての細胞において発現された場合には、おそらく非常に多く
の有害な副作用が現れるであろう。
【０１０６】 幾つかの例において、該プロモーターエレメントは、構成的プロモーターであ
っても誘導的プロモーターであってもよく、適切な条件下で用いて、関心のある
遺伝子の高レベルまたは制御された発現を指令することができる。構成的プロモ
ーターの調節下での遺伝子の発現は、遺伝子発現を誘導するのに特定の基質の存
在を必要とせず、あらゆる細胞増殖の条件下で起こる。これに対して、誘導的プ
ロモーターにより調節される遺伝子の発現は、誘導物質の存在の有無に応じて起
こるものである。例えば、細胞が治療用の誘導的なトランスジーンで安定にトラ
ンスフェクトされた場合、その発現は、該個体の寿命にわたって調節できると思
われる。事実、BSPプロモーターはそれ自体、糖質コルチコイドおよびアスコル
ビン酸により誘導される。
【０１０７】 特定の開始シグナルもまた、挿入されたタンパク質コード配列の十分な翻訳に
必要である。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接する配列が
含まれる。該開始コドンおよび隣接する配列を含むコード配列全体が適切な発現
ベクターに挿入される場合、追加の転写調節シグナルは必要ないと思われる。し
かし、該コード配列の一部だけが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外
因性の翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、該開始コドンは
、該インサート全体の翻訳を確実にするために、該タンパク質コード配列のリー
ディングフレームと同じ読み枠でなければならない。これらの外因性翻訳調節シ
グナルおよび開始コドンは、天然または合成の両者を含む種々の起源のものであ
ってよい。発現の効率および調節は、転写減衰配列、エンハンサーエレメントな
どを含めることにより増大させることができる。
【０１０８】 本発明の別の実施形態では、治療剤を骨親和性腫瘍に送達することを含む、骨
親和性腫瘍を治療する方法が提供される。この治療剤は、BSPプロモーターで駆
動される毒性のチミジンキナーゼ（Tk）を含む組換えアデノウイルスベクター(A
d)を含む。本発明のさらにもう１つの態様は、アシクロビル（AcV）など（しか
しそれに限定されない）の適切なプロドラッグの添加によりTkの発現を調節する
方法を提供する。
【０１０９】 このBSPプロモーター駆動毒性遺伝子治療を含む治療剤は、適切なプロドラッ
グの存在下で、骨親和性腫瘍および前立腺癌腫瘍ならびにそれらの転移巣、なら
びに結腸癌、脳腫瘍、肺癌、乳癌、多発性腫瘍、骨髄腫、甲状腺癌および黒色腫
など（しかしそれらに限定されない）の多くの他の骨親和性腫瘍に投与できる。
Ad-BSP-TKまたはBSPプロモーター駆動活性を含む他のベクターを含んでなる本治
療用の発明は、骨親和性であり、そのために骨様および骨誘導性(bone homing)
の特性を有し、かつ骨組織に結合すると骨芽細胞性または骨溶解性の表現型を示
す癌を標的とするために提供される。
【０１１０】 さらに別の実施形態では、BSP調節領域は、細胞外、細胞表面および細胞内RNA
およびタンパク質などの、骨修復を促進する種々の因子をコードすることができ
る。これらの治療用構築物は、特に、老化および特定の変性的症状に有用である
。細胞外タンパク質の例としては、増殖因子、サイトカイン、治療用タンパク質
、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒビター、ペプ
チド成長および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、
コロニー刺激因子ならびに血管新生因子が挙げられる。そのようなタンパク質の
例としては、５種のTGF-βアイソフォームを含むTGF-β分子のスーパーファミリ
ーおよび骨形態形成タンパク質（BMP）、潜在TGF-β結合タンパク質、LTBP；ケ
ラチノサイト増殖因子（KGF）；肝細胞増殖因子（HGF）；血小板由来増殖因子（
PDGF）；インスリン様増殖因子（IGF）；塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF-1、FG
F-2など）；血管内皮増殖因子（VEGF）；VIII因子およびIX因子；エリトロポエ
チン（EPO）；組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）ならびにアクチビン
およびインヒビンが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の実施におい
て用い得るホルモンとしては、例えば、成長ホルモン（GH）および副甲状腺ホル
モン（PTH）が挙げられる。細胞外タンパク質の例としてはまた、コラーゲン、
ラミニンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質が挙げら
れる。細胞表面タンパク質の例としては、細胞接着分子のファミリー（例えば、
インテグリン、セレクチン、N-CAMおよびL1などのIgファミリーメンバー、なら
びにカドヘリン）；Ｉ型およびII型TGF-βレセプターおよびFGFレセプターなど
のサイトカインシグナリングレセプター、ならびにβグリカンおよびシンデカン
などの非シグナリングコレセプターが挙げられる。細胞内RNAおよびタンパク質
の例としては、シグナル伝達キナーゼのファミリー、タリンおよびビンクリンな
どの細胞骨格タンパク質、潜在TGF-β結合タンパク質のファミリーなどのサイト
カイン結合タンパク質、ならびに転写因子および増強因子（enhancing factors
）のような核のトランス作用性タンパク質が挙げられる。
【０１１１】 該方法は、骨の合成および／または修復を促進する治療用化合物をコードする
核酸に機能し得る形で結合させたBSP調節領域配列を導入することを含む。BSPプ
ロモーターの組織特異性により、関心のある骨親和性細胞における該治療用化合
物の特異的な発現が可能になる。治療用遺伝子の発現を駆動するためにBSPプロ
モーターを用いると、ウイルス媒介性遺伝子送達が隣接する正常細胞の感染を引
き起こす場合には、該正常細胞に対する該治療用遺伝子の毒性作用がさらに低下
する。このことは、全身投与を用いて治療用ベクターを体中に送達すると同時に
限定した特定の数の細胞型に対するトランスジーンの発現を維持することができ
る疾患において特に重要である。さらに、TGF-βのような多くの治療用増殖因子
が多面発現性作用を有するので、該増殖因子の遺伝子が全ての細胞で発現されれ
ば、おそらく非常に多くの有害な副作用が現れるであろう。
【０１１２】 さらに別の実施形態では、BSP調節領域は、免疫調節機能を有する種々の遺伝
子、例えばインターロイキン１〜15（特に例えばIL2、IL12）などのサイトカイ
ン、γ-インターフェロン、腫瘍壊死因子、GMCSFの遺伝子および／または他の遺
伝子［例えば、WO88/00971（CSIRO, Australian national University; Ramshaw
ら）およびWO94/16716（Virogenetics Corp; Paolettiら）の明細書で述べられ
ているもの］をコードできる。
【０１１３】 また、以下の遺伝子が本発明のBSP調節領域によりコードされ得る：インター
フェロンα、βもしくはγ；腫瘍壊死因子；顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニ
ー刺激因子（N-CSF）、好中球活性化タンパク質NAP、マクロファージ誘引物質お
よび活性化因子MCAFなどのケモカイン、RANTES、マクロファージ炎症ペプチドMI
P-1aおよびMIP-1b、相補的成分およびそれらのレセプター、87.1、87.2、ICAM-1
.2もしくは3などのアクセサリー分子、またはサイトカインレセプターの遺伝子
。２種以上の免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列が挿入される場
合、それらは２以上のサイトカインを含んでいてもよいし、あるいはサイトカイ
ンとアクセサリー分子との組合せを含んでいてもよい。
【０１１４】5.4.1 調節的なアンチセンス、リボザイムおよび三重らせん法 別の実施形態では、BSP調節領域を周知のアンチセンス法、遺伝子「ノックア
ウト」法、リボザイム法および／または三重らせん法と組合せて用いて骨親和性
特異的遺伝子発現を調節することにより予防、遅延または救済され得る、石灰化
の可能性がある腫瘍および組織細胞が関与する症状、障害または疾患のタイプを
記載する。そのような分子は、損なわれていない（または、もし適切であれば突
然変異型の）骨親和性遺伝子活性を調節、低下または抑制するように設計できる
。そのような分子の作製および使用のための技法は当業者には周知である。
【０１１５】 アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズしてタンパク質
翻訳を妨げることにより、mRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセ
ンス法は、mRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドの設計を含む。このアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、該相補的なmRNA配列の転写産物に結合して、翻訳を
阻止する。絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。
【０１１６】 本明細書中で言及される、RNAの一部に「相補的」な配列とは、該RNAとハイブ
リダイズして、安定な二本鎖を形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味
する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、該二本鎖DNAの一本の鎖をこうして試験
するか、三本鎖の形成をアッセイすればよい。ハイブリダイズする能力は、相補
性の程度および該アンチセンス核酸の長さの両者に応じて決まる。一般に、ハイ
ブリダイズする核酸が長いほど、それが含んでおり、かつ安定な二本鎖（場合に
よって三本鎖）をさらに形成するRNAとの塩基ミスマッチは多くなる。当業者で
あれば、標準的な手法を用いてミスマッチの許容可能な程度を確かめて、ハイブ
リダイズした複合体の融解温度を求めることができる。
【０１１７】 １つの実施形態では、関心のある配列の非コード領域に相補的なオリゴヌクレ
オチドをアンチセンス法において用いて、内因性mRNAの翻訳を抑制することがで
きる。アンチセンス核酸は、長さが少なくとも６ヌクレオチドとすべきであり、
好ましくは長さが６から約50ヌクレオチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドであ
る。特定の態様において、該オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、
少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも50ヌ
クレオチドである。
【０１１８】 標的配列をどのように選択しようとも、in vitroでの研究をまず行って、アン
チセンスオリゴヌクレオチドが配列の発現を抑制する能力を定量することが好ま
しい。これらの研究では、アンチセンス遺伝子の抑制とオリゴヌクレオチドの非
特異的な生物学的作用とを区別する対照（controls）を利用することが好ましい
。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、対照のオ
リゴヌクレオチドを用いて得られたものと比較することが考えられる。対照のオ
リゴヌクレオチドが被験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、および
該オリゴヌクレオチドの核酸が該アンチセンス配列と、該標的配列への特異的な
ハイブリダイゼーションを阻止するのに必要である以上に異なっていることが好
ましい。
【０１１９】 該オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNA、またはそれらのキメラ混合物もしく
は誘導体もしくは改変物（一本鎖であっても二本鎖であってもよい）であり得る
。該オリゴヌクレオチドは、例えば該分子の安定性、ハイブリダイゼーションな
どを改善するように、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変されてい
てもよい。該オリゴヌクレオチドは、他の付加グループを含んでいてもよく、そ
のようなグループとしては、ペプチド（例えば、in vivoにおける宿主細胞レセ
プターのターゲッティング用）、または細胞膜を介しての輸送を容易にする物質
（例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556
；Lamaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652；PCT公報WO8
8/09810号、1988年12月15日公開を参照のこと）、または血液−脳関門（例えば
、PCT出願WO89/10134、1988年４月25日公開を参照のこと）、ハイブリダイゼー
ション誘発（hybridization-triggered）切断剤（例えば、Krolら, 1988, BioTe
chniques 6:958-976を参照のこと）もしくはインターカレート剤（例えば、Zon,
1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照のこと）が挙げられる。この目的のために
、該オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などの別の分子に結合させても
よい。
【０１２０】 該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシ
ル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-ア
セチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチ
ルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、
ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテ
ニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、
2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、
N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシ
アミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニ
ルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ビブトキソシン（wybutoxosine）、プ
ソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2
-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メ
チルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-ア
ミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)W、および2,6-ジアミノプリ
ンからなる群（しかし、それらに限定されない）から選ばれる、少なくとも１つ
の改変塩基成分を含み得る。
【０１２１】 該アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、2-フルオロアラビ
ノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群（しかし、それらに限定されな
い）から選ばれる、少なくとも１つの改変糖成分を含み得る。
【０１２２】 さらに別の実施形態では、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデ
ート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステ
ル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似体からなる群から選ばれる、
少なくとも１つの改変リン酸骨格を含む。
【０１２３】 さらに別の実施形態では、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α-アノマ
ー性オリゴヌクレオチドである。α-アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的
なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこにおいて、鎖は、通常のβ
ユニットとは異なって、互いに平行に伸びている（Gautierら, 1987, Nucl. Aci
ds Res. 15:6625-6641）。該オリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルリボヌクレオ
チド（Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラRNA−DNA
類似体（Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
【０１２４】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の標準的な方法により、例えば
自動DNA合成装置（例えば、Biosearch、Applied Biosystemsなどから販売されて
いるもの）を用いることにより合成できる。例として、ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは、Steinらの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）により
合成でき、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された多孔質ガラス
ポリマー支持体の使用により調製できる（Steinら, 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 85:7448-7451）、などである。
【０１２５】 骨親和性特異的コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用し
てもよいが、転写された未翻訳の領域に相補的なものが最も好ましい。
【０１２６】 アンチセンス分子は、in vivoで骨親和性配列を発現する細胞に送達されるは
ずである。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために多くの方法が開発
されている。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射してもよいし、あ
るいは、所望の細胞をターゲッティングするように設計された改変アンチセンス
分子（例えば、標的細胞の表面で発現されるレセプターまたは抗原を特異的に結
合するペプチドまたは抗体に結合させたアンチセンス）を全身的に投与してもよ
い。
【０１２７】 内因性mRNAの翻訳を抑制するのに十分な該アンチセンスの細胞内濃度を達成す
るための好ましい方法は、組換えDNA構築物を用いるものであり、そこにおいて
、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強力なpol IIIまたはpol IIプロモー
ターの調節下に置かれる。そのような構築物を用いて患者における標的細胞をト
ランスフェクトすることにより、十分な量の一本鎖RNAが転写されるようになり
、該RNAは、該内因性配列の転写産物と相補的な塩基対を形成し、それにより該m
RNAの翻訳を阻止する。例えば、ベクターを導入して、例えばそれが細胞に取り
込まれてアンチセンスRNAの転写を指令するようにしてもよい。そのようなベク
ターは、それが転写されて所望のアンチセンスRNAを産生することができる限り
、エピソーム性のままであってもよいし、あるいは染色体に組み込まれるように
なってもよい。そのようなベクターは、当業界で標準的な組換えDNA法により構
築できる。ベクターは、プラスミド、ウイルス性、または当業界で公知の他のも
のであり得り、哺乳動物細胞における複製および発現に用いることができる。該
アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物内で、好ましくはヒト細
胞内で作用することが当業界で知られている任意のプロモーターによるものであ
り得る。そのようなプロモーターは、誘導的であっても構成的であってもよい。
そのようなプロモーターとしては、SV40初期プロモーター領域（Bernoistおよび
Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３′側の長い末
端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、
ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら
, 1982, Nature 296:39-42）、などが挙げられるが、それらに限定されない。ど
のようなタイプのプラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターも、組織
部位に直接導入できる組換えDNA構築物の調製に用いることができる。あるいは
また、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いてもよく、その場
合、投与は別の経路（例えば、全身的）で達成してもよい。
【０１２８】 標的遺伝子のmRNA転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分
子もまた、標的遺伝子のmRNAの翻訳を、したがって標的遺伝子産物の発現を阻止
するのに用いることができる。（例えば、PCT国際公報WO90/11364、1990年10月
４日公開；Sarverら, 1990, Science 247, 1222-1225を参照されたい。） リボザイムは、RNAの特定の切断を触媒できる酵素性のRNA分子である。（概説
としては、Rossi, 1994, Current Biology 4:469-471を参照されたい。）リボザ
イムの作用の機構は、該リボザイム分子の相補的な標的RNAに対する配列特異的
ハイブリダイゼーション、およびそれに続くエンドヌクレアーゼ加水分解による
切断事象を含む。リボザイム分子の組成は、該標的遺伝子mRNAに相補的な１つ以
上の配列を含んでいなければならず、mRNAの切断に関与する周知の触媒配列を含
んでいなければならない。この配列については、例えば米国特許第5,093,246号
を参照されたい（これは、引用によりその全体を本明細書に組み入れる）。
【０１２９】 mRNAを部位特異的認識配列において切断するリボザイムは、標的遺伝子mRNAを
破壊するのに用いることができ、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい
。ハンマヘッド型リボザイムは、mRNAを、該標的mRNAと相補的な塩基対を形成す
る隣接領域により指図される位置で切断する。唯一の要件は、該標的mRNAが以下
の２塩基の配列を有することである：5’-UG-3’。ハンマーヘッド型リボザイム
の構築および作製は当業界では周知であり、Myers, 1995, Molecular Biology a
nd Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VHC Publishers, New Yo
rk（特に833ページの図４を参照されたい）ならびにHaseloffおよびGerlach, 19
88, Nature, 334:585-591（引用によりその全体を本明細書に組み入れる）にさ
らに詳細に記載されている。
【０１３０】 好ましくは、該リボザイムは、切断認識部位が該標的遺伝子mRNAの５′末端近
傍に位置するように、すなわち、効率を増大させ、かつ非機能的mRNA転写産物の
細胞内蓄積を最少限に抑えるように設計（engineer）される。
【０１３１】 本発明のリボザイムはまた、Tetrahymena thermophila内に天然に存在し（IVS
またはL-19 IVS RNAとして知られるもの）、かつThomas Cechおよび共同研究者
により広範に記載（Zaugら, 1984, Science, 224:574-578；ZaugおよびCech, 19
86, Science, 231:470-475；Zaugら, 1986, Nature, 324:429-433；University
Patents Inc.による公表済みの国際特許出願WO88/04300；BeenおよびCech, 1986
, Cell, 47:207-216）されているもののようなRNAエンドリボヌクレアーゼを含
む（以下、「Cech型リボザイム」という）。Cech型リボザイムは、標的RNA配列
にハイブリダイズし、その後で該標的RNAの切断が起こる８塩基対の活性部位を
有する。本発明は、該標的遺伝子内に存在する８塩基対の活性部位配列を標的と
するCech型リボザイムを包含する。
【０１３２】 アンチセンス法の場合と同様に、該リボザイムは、改変オリゴヌクレオチド（
例えば、改善された安定性、ターゲッティングなどのためのもの）からなるもの
であってもよく、該標的遺伝子をin vovoで発現する細胞に送達されるはずであ
る。好ましい送達方法は、強力な構成的pol IIIまたはpol IIプロモーターの調
節下で該リボザイムを「コード」するDNA構築物を用いて、トランスフェクトさ
れた細胞が内因性の標的遺伝子メッセージを破壊して翻訳を抑制するのに十分な
量の該リボザイムを産生するようにすることを含む。リボザイムはアンチセンス
分子とは異なって触媒性であるので、効率のためには、低めの細胞内濃度が必要
とされる。
【０１３３】 内因性標的遺伝子の発現はまた、標的相同組換え［例えば、Smithiesら, 1985
, Nature 317:230-234；ThomasおよびCapecchi, 1987, Cell 51:503-512；Thomp
sonら, 1989, Cell 5:313-321（それらの各々は引用によりその全体を本明細書
に組み入れる）を参照されたい］を用いて該標的遺伝子またはそのプロモーター
を不活性化または「ノックアウト」することによっても低減できる。例えば、該
内因性標的遺伝子（該標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相
同なDNAで挟まれている突然変異型の非機能的標的遺伝子（または完全に関連し
ないDNA配列）は、 選択マーカーおよび／もしくはネガティブ選択マーカーと共
に用いて、またはそれらを用いずに、該標的遺伝子をin vivoで発現する細胞を
トランスフェクトすることができる。標的相同組換えによる該DNA構築物の挿入
により、該標的遺伝子の不活性化が起こる。そのような方法は農業の分野におい
て特に好適であり、その場合、ES（胚幹）細胞の改変を用いて不活性な標的遺伝
子を有する動物の子孫を作製できる（例えば、ThomasおよびCapecchi, 1987およ
びThompson, 1989, 前掲を参照のこと）。しかし、この方法は、もし該組換えDN
A構築物が直接投与されるか、あるいは適切なウイルスベクターを用いてin vivo
で所望の部位へターゲッティングされるならば、ヒトにおける使用に適用するこ
とができる。
【０１３４】 あるいはまた、内因性標的遺伝子発現は、該標的遺伝子の調節領域（すなわち
、標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシ
リボヌクレオチド配列をターゲッティングして、体内の標的細胞において該標的
遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することにより、低減できる。（
概略的には、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-584；Heleneら,
1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36；およびMaher, 1992, Bioassays 14(1
2):807-815を参照されたい。） 転写抑制のための三重らせん形成において用いる核酸分子は、一本鎖でデオキ
シヌクレオチドからなるものとすべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩
基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対合ルールにより三重らせん
形成を促進するように設計しなければならず、このルールは、プリンまたはピリ
ミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二本鎖の一方の鎖に存在すること
を必要とする。核酸は、ピリミジンをベースとするものであってもよく、これは
、得られる三重らせんの３本の会合した鎖にまたがるTATおよびCGC+トリプレッ
トを生じる。ピリミジンに富む分子は、該二本鎖の一本の鎖のプリンに富む領域
に、該鎖に対して平行な向きに塩基相補性をもたらす。さらに、プリンに富む（
例えばG残基のストレッチを含む）核酸分子を選んでもよい。これらの分子は、G
C対に富むDNA二本鎖と三重らせんを形成し、そこにおいて、プリン残基の大部分
は、標的とする二本鎖の一本の鎖の上に位置して、該三本鎖の３本の鎖にまたが
るGGCトリプレットを生じる。
【０１３５】 あるいはまた、三重らせん形成の対象とされ得る可能性のある配列は、いわゆ
る「スイッチバック」核酸分子を作ることにより増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、交互の5’−3’、3’−5’の様式で合成されて、それらが二本鎖の第
1の一方の鎖と、次いで他方の鎖と塩基対合して、プリンまたはピリミジンのか
なり大きなストレッチが二本鎖の一方の鎖の上に存在しなくてもいいようにする
。
【０１３６】 ここで記載するアンチセンス、リボザイムおよび／または三重らせん分子を用
いて突然変異型遺伝子発現を抑制する場合、おそらくこの技法は正常な標的遺伝
子対立遺伝子により生じるmRNAの転写（三重らせん）および／または翻訳（アン
チセンス、リボザイム）を非常に効率的に低減または抑制でき、存在する正常な
標的遺伝子産物濃度が正常な表現型について必要なものよりも低い可能性が生じ
る。したがって、そのような場合、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性を確
実に維持するために、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコ
ードし発現する核酸分子を、後記のセクション5.4.2で記載するような遺伝子治
療方法により細胞に導入すればよく、該方法は、どんなアンチセンス、リボザイ
ムまたは三重らせん治療が用いられているかに影響を受ける配列は含まない。あ
るいはまた、該標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合には、正常な標
的遺伝子タンパク質を同時投与して、必要なレベルの標的遺伝子活性を維持する
ことが好ましい。
【０１３７】 本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、ならびに三重らせん分子は
、上記で述べたように、DNAおよびRNA分子の合成のために当業界で公知のいかな
る方法により調製してもよい。これらとしては、例えば固相ホスホロアミダイト
化学合成のような、当業界で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリ
ゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技法が挙げられる。あるいはまた
、RNA分子は、該アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin
vivo転写により作製してもよい。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラー
ゼプロモーターのような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを取り込んでいる
多種多様なベクターに取り込まれ得る。あるいはまた、アンチセンスRNAを用い
られるプロモーターに応じて構成的または誘導的に合成するアンチセンスcDNA構
築物を、細胞系に安定に導入してもよい。
【０１３８】5.4.2 遺伝子置換治療 上記の本発明の核酸配列は、上述のように、組換え核酸配列を細胞に導入させ
、該配列をレシピエント細胞内で発現させるのに用いることができる。そのよう
な技法は、例えば、石灰化の可能性がある腫瘍または組織細胞が関与する細胞の
マーキングにおいて、または石灰化の可能性がある腫瘍または組織細胞が関与す
る障害の治療に用いることができる。そのような治療は、遺伝子置換治療（gene
replacement therapy）の形態とすることができる。具体的には、DNAを細胞に
導入する他の粒子（例えばリポソーム）に加えて、１コピー以上の正常遺伝子ま
たは正常な遺伝子機能を示す遺伝子産物の産生を指令する該遺伝子の部分を、ア
デノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルスベクターなど（しかし
、それらに限定されない）のベクターを用いて患者内の適切な細胞に挿入すれば
よい。
【０１３９】 哺乳動物細胞内での発現のために遺伝子を導入する方法は当技術分野において
周知である。一般に、そのような遺伝子治療方法の場合、該核酸は、異種コード
配列に機能し得る形で連結されたBSP調節領域を発現する標的細胞またはトラン
スジェニックマウスにin vivoで直接投与する。これは、当業界で公知の任意の
方法により達成でき、例えば、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築
し、それを投与して、それが細胞内となるようにすることにより、例えば、欠損
もしくは弱毒化レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを用いる感
染により（米国特許第4,980,286号を参照）、裸のDNAの直接的な注射により、微
粒子の衝撃（microparticle bombardment）（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Du
pont）の使用により、脂質または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤
で被覆することにより、リポソーム、微粒子またはマイクロカプセル中への封入
により、それを核に侵入することが知られているペプチドと連結させて投与する
ことにより、またはそれをレセプター媒介エンドサイトーシスに供したリガンド
と連結させて投与することにより（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432を参照）（これは該レセプターを特異的に発現する細胞型をター
ゲッティングするのに用いることができる）達成できる。別の実施形態では、核
酸−リガンド複合体を形成することができ、そこにおいて、該リガンドは、エン
ドソームを破壊するために融合誘導ウイルスペプチドを含んでいて、該核酸がリ
ソソーム分解を回避できるようにしている。さらに別の実施形態では、該核酸は
、特定のレセプターをターゲティングすることにより、細胞特異的取込みおよび
発現についてin vitroでターゲッティグンすることができる（例えば、PCT公報W
O92/06180、1992年４月16日付；WO92/22635、1992年12月23日付；WO92/20316、1
992年11月26日付；WO93/14188、1993年７月22日付；WO93/20221、1993年10月14
日付を参照）。あるいはまた、該核酸は、相同組換えにより、細胞内に導入され
て、発現のために宿主細胞DNAに取り込まれ得る（KollerおよびSmithies, 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature 342:4
35-438）。
【０１４０】 １つの実施形態では、送達の技法は、例えばそのような遺伝子配列の、該遺伝
子配列を発現させようとする細胞の部位への定位送達による直接的な投与を含む
。
【０１４１】 遺伝子発現および／または遺伝子産物の活性の全体的レベルを増大させるのに
用い得るさらに別の方法は、上記で述べたような標的相同組換え法を用い、異種
DNA調節エレメントを挿入して、挿入された調節エレメントが当該の内因性遺伝
子と機能し得る形で連結されるようにすることにより、細胞または微生物におけ
る内因性遺伝子の発現特性を変えることを含む。したがって、標的相同組換えは
、「転写的にサイレント」な（すなわち、正常に発現されない、または非常に低
レベルで正常に発現される）内因性遺伝子の転写を活性化するために、または正
常に発現される内因性遺伝子の発現を増大させるために用いることができる。
【０１４２】 さらに、標的遺伝子発現および／または遺伝子産物の活性の全体的レベルは、
適切な標的遺伝子発現細胞（好ましくは自己細胞）を患者に、骨親和性関連疾患
の症状を改善するのに十分な位置および数で導入することにより増大させること
ができる。そのような細胞は、組換えまたは非組換えのいずれかであり得る。
【０１４３】 投与しようとする細胞が非自己細胞である場合、それらは、導入された細胞に
対する宿主の免疫応答が起こるのを防止する周知の技法を用いて投与できる。例
えば、該細胞は、封入形態で導入することができ、これは、成分と近隣の細胞外
環境との交換を可能にするが、導入した細胞が宿主の免疫系により認識されない
ようにする。
【０１４４】 さらに、BSP調節領域の活性を調節できる、上記のような技法により同定され
るもののような化合物は、当業者に周知の標準的な技法を用いて投与できる。
【０１４５】5.5 医薬製剤および投与方法 BSP調節領域の活性またはBSP遺伝子産物の活性を改変することが判明している
化合物は、患者に、治療上有効な用量で投与して、石灰化の可能性がある腫瘍ま
たは組織細胞を伴う障害を治療または改善することができる。治療上有効な用量
とは、そのような障害の症状の改善をもたらすのに十分な該化合物の量をいう。
【０１４６】5.5.1 有効用量 そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばLD50（集団の50％に対し
て致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療上有効な用量）を求める
ための、細胞培養物または実験動物における標準的な製薬学的手順により決定す
ることができる。毒性作用と治療効果との用量比率が治療指数であり、それはLD 50 ／ED50比として表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
毒性の副作用を示す化合物を用いてもよいが、そのような化合物を冒された組織
の部位にターゲッティングする送達系の設計には注意を払い、未感染の細胞に対
する傷害の可能性を最低限に抑え、それにより副作用を低減しなければならない
。
【０１４７】 細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用の
ための投与量範囲を製剤化する上で用いることができる。そのような化合物の投
与量は、好ましくは、毒性がほとんど、または全くない、ED50量を含む循環濃度
の範囲内である。投与量は、用いられる剤型および利用する投与経路に応じて、
この範囲内で様々なものとし得る。本発明の方法において用いられるどのような
化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定でき
る。１用量を動物モデルにおいて製剤化して、細胞培養下で求めた場合のIC50（
すなわち、症状について最大値の半分を抑制することができる被験化合物の濃度
）を含む循環血漿濃度範囲を達成してもよい。そのような情報を用いて、ヒトに
おける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば
、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１４８】5.5.2 製剤化および使用 本発明にしたがった使用のための医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容し
得る担体または賦形剤を用いて慣用の方法で製剤化できる。
【０１４９】 つまり、該化合物ならびにその生理学的に許容し得る塩および溶媒和物は、吸
入もしくはガス注入（口または鼻のいずれかを経る）による投与用、または経口
、バッカル、非経口もしくは直腸投与用に製剤化できる。
【０１５０】 経口投与の場合、該医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、プレゼラチン化
トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースもしくはリン酸水素
カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリ
カ）；崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウ
ム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような製剤学上許容
し得る賦形剤を用いて慣用の手段により調製した錠剤またはカプセル剤の形態を
とり得る。錠剤は、当業界で周知の方法によりコーディングされてもよい。経口
投与のための液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとり
得るか、あるいはそれらは使用前に水または他の適切なビヒクルにより構成する
ような乾燥製品として存在してもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例え
ば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは硬化食用脂肪）；乳化剤
（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド
油、油状エステル、エチルアルコールもしくは分留植物油）；および保存剤（例
えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）
のような製剤学上許容し得る添加物を用いて慣用の手段により調製できる。該製
剤はまた、適宜、緩衝塩、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。
【０１５１】 経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように適切に製剤
化してもよい。
【０１５２】 バッカル投与の場合、該組成物は、慣用方法により製剤化された錠剤またはロ
ゼンジの形態をとり得る。
【０１５３】 吸入による投与の場合、本発明にしたがう使用のための化合物は、適切な噴射
剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）を用いて、圧縮パ
ックからのエーロゾルスプレー噴出またはネブライザーの形態で簡便に送達され
る。圧縮エーロゾルの場合、単位用量は、計量された量を送達するためのバルブ
を設けることにより決定できる。吸入器またはガス注入器における使用のための
（例えばゼラチンの）カプセル剤およびカートリッジは、該化合物と適切な粉末
基剤（例えば乳糖またはデンプン）との粉末混合物を含有させて製剤化できる。
【０１５４】 該化合物は、注射（例えばボーラス注射または連続注入）による非経口投与用
に製剤化できる。注射用の製剤は、保存剤を添加した、例えばアンプル中または
複数用量容器中の単位剤型としてもよい。該組成物は、油性または水性ビヒクル
中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化
剤および／または分散剤のような製剤用薬剤を含み得る。あるいはまた、活性成
分は、使用前に適切なビヒクル（例えば発熱物質不含の滅菌水）により構成する
ような粉末形態であってもよい。
【０１５５】 該化合物はまた、例えばカカオ脂または他のグリセライドなどの慣用の坐剤基
剤を含有するような坐剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化すること
もできる。
【０１５６】 特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は治療の必要な領域に局所的に投与
することが望ましい場合がある。これは、例えば、外科手術の際の局所的注入、
例えば手術後の創傷包帯と組合せた局所的適用、注射、カテーテル、坐剤、また
は埋没物により（しかし、これらに限定するものではない）達成可能である。該
埋没物は、シラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔質、非多孔質または
ゼラチン様の材料のものであってよい。１つの実施形態では、投与は、悪性腫瘍
または新生物性もしくは前新生物性組織の部位（または前部位）における直接的
な注射によるものとすることができる。
【０１５７】 局所適用の場合、該化合物は、担体と組み合せて、所望の活性に基づいた有効
用量が送達されるようにしてもよい。
【０１５８】 先に記載の製剤に加えて、該化合物はまた、デポー製剤として製剤化されても
よい。そのような長期にわたって作用する製剤は、埋没（例えば皮下的または筋
肉内）により、または筋肉内注射により投与できる。したがって、例えば、該化
合物は、適切な高分子性もしくは疎水性材料（例えば、許容し得る油中の乳化物
として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは徐々に溶解する誘導体として（
例えば徐々に溶解する塩として）製剤化することができる。
【０１５９】 該組成物は、所望により、パックまたはディスペンサー装置に入れるものであ
ってもよく、これは、活性成分を含有する１以上の単位剤型を含み得る。該パッ
クは、例えば、ブリスターパックのように、金属箔またはプラスチック箔を含ん
でもよい。該パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付
されてもよい。
【０１６０】６． 実施例：チミジンキナーゼの上流にBSPプロモーターを含む組換えアデノウ イルスベクターの構築 6.1 材料および方法 6.1.1 細胞および細胞培養 ROS 17/2.8（ラットの骨芽細胞性骨肉腫細胞系）は、培養下で増殖させた腫瘍
組織片から細胞を採取することにより得られる（ROS 17/2.8はUniversity of Te
xas Dental Branch, Houston, Tex.から入手した）。MG-63（ヒトの骨芽細胞由
来の骨肉腫細胞系）；293（トランスフォームしたヒト胚性腎臓細胞系）；およ
びNltI 3T3（胚性マウス繊維芽細胞の細胞系）はAmerican Type Culture Collec
tion(Rockville, Md.)から購入した。WH（ヒトの膀胱移行上皮癌）は本発明者ら
の研究室で樹立した（Gleave, M.E., Haich, J.T., Wu, H.C., Hong, S.J. Zhau
, H.F., Guthrie, P.D.およびChung, L.W.K. Epidermal growth factor recepto
r-mediated autocrine and paracrine stimulation of human transitional cel
l carcinoma. Cancer Res., 53:5300-5307, 1993に記載されている）。ROS17/2.
8およびMG-63細胞系は、それらの形態的、生化学的および分子的特徴のために骨
芽細胞系列と考えられるので、それらは100単位/mlのペニシリン、100μl/mlの
ストレプトマイシンおよび10％のFB5（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）
を加えたDMEM（Life Technologies, Inc., Grand Island, N.Y.）および20％F12
K（trying Scientific, Sana Ana, Calif.）中でインキュベートした。WHおよび
NIH 3T3細胞系は、（Ko, S-C., Gotoh, A., Thalmann, G.N., Zhdu, H.F., John
ston, D.A., Zhang, W.W., Kao, C., およびChung, L.W.K. Molecular therapy
with recombinant p53 adenovirus in an androgen independent, metastatic h
uman prostate cancer model. Hum. Gene Ther., 7:1683-1691, 1996に記載のよ
うにして）５％FBS（ウシ胎児血清）を含有するＴ培地中で維持した。293細胞は
、10％FBSおよび１％トリプトースホスフェートブロス（Life Technologies, In
c.）を含有するMEM（Life Technologies, Inc.）中で維持した。特に指示しない
限り、これらの細胞は、１週間に３回、新しい増殖培地に交換して培養した。
【０１６１】6.1.2 結果 組換えAd-BSP-TKウイルスの構築は、図１に示すように行った。全てのプラス
ミドは標準的なプロトコールにしたがって構築した。簡単に説明すると、pΔE1S
P1（アデノウイルスゲノムの５′末端部分を含み、E1領域が欠失しているシャト
ルベクター）を、供給元のプロトコールにしたがって、Xho-1（New England Bio
labs, Beverly, Mass.）で消化し、アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannh
eim Biochemicals, Indianapolis, IN）で処理した。1418bpのBSP断片をPCRを用
いて用意した。具体的には、第1のプライマーセットを用いて、1467bpのインサ
ートを増幅した。これらのプライマーは以下のものであった。
【０１６２】 BSP1 − GTGGCACATATACACCATGG BSP2 − AATCTTACCCTCTGGCAGTC 次に、この1467bpの断片に対する内部プライマーを用いて、1418bpのBSPプロ
モーターを作製した。内部プライマーは以下のものであった。
【０１６３】 BSP3 − CCATGGAATACTATGCAGCC BSP4 − TGGAGTGAGGAAGCAGGCTC 次に、このPCRで作製したBSPプロモーター断片を、T4リガーゼ（New England
Biolabs）を用いてpΔE1SP1 Adベクターに連結した。発現クローンpAE1SP1-BSP-
TKおよびpJM17（環状アデノウイルスゲノム）（E1領域が欠失して、PBR322 DNA
で置き換えてあるもの）を293細胞に同時トランスフェクトする。次に、組換え
ベクターを、N-［1-(2,3-ジオレオイルオキシル)プロピル］-N,N,N-トリメチル
アンモニウムメチルサルフェート（Boehringer Mannheim Biochemicals）媒介ト
ランスフェクション法（Zhang, W-W., Fang, X., Branch, C.D., Mazur, W., Fr
ench, B.A.,およびRoth, J.A. Generation and identification of recombinant
adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis, Biotechn
iques, 15:868-872, 1993）により、アデノウイルス感染細胞から293細胞へと純
化する。完全な細胞変性効果を示す293細胞の培養培地を集め、1000×gで10分間
遠心分離した。プールした上清をアリコートに分け、一次ウイルスストックとし
て−80℃で保存した。ウイルスストックを293細胞内で増殖させ、GrahamおよびP
revecの方法（Graham, F.L.,およびPrevec, L. Manipulation of adenovirus ve
ctors, 第7巻, 109-128ページ. Clifton, NJ.: The Humana Press, Inc., 1991
）にしたがうプラーク精製によりAd-BSP-TKウイルスの選択されたクローンを得
た。該ウイルスクローンの１つを293細胞内で増殖させた。感染の36〜40時間後
に細胞を収集し、ペレット化し、PBSに再懸濁し、溶解させた。該細胞を遠心分
離にかけることにより、細胞の破片を取り除き、細胞溶解物中のウイルスをCsCl 2 濃度勾配により精製した。濃縮したウイルスを透析し、アリコートに分け、−8
0℃で保存した。ウイルス力価をプラークアッセイにより求めた。この研究にお
いて用いた対照のウイルスであるAd-RSV-β-GalおよびAd-CM V-β-Galは、同様
の方法で（Ko, S-C., Gotoh, A., Thalmann, G.N., Zhou, H.E., Johnston, D.A
., Zhang, W.W., Kao, C., およびChung, L.W.K. Molecular therapy with reco
mbinant p53 adenovirus in an androgen independent, metastatic human pros
tate cancer model. Hum. Gene Ther., 7:1683-1691, 1996に記載）構築した。
【０１６４】７．実施例：各種細胞系におけるBSP mRNAの測定 ノーザンブロットを標準的な手順にしたがって行った。典型的な条件について
は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Sambrook, J.E.F. FritschおよびT. Maniatis編, 1989）
を参照されたい。細胞を血清不含かつフェノール不含の増殖培地（DMEM, F12）
で、L-アスコルビン酸（ビタミンＣ）およびリン酸供与体であるβ-グリセロー
ルリン酸を添加して、または添加せずに、増殖させた（図２）。アンドロゲン依
存型（LNCaP）およびアンドロゲン非依存型（C4-2、C4-2B4、PC-3、PC-3M、DU-1
45）を含む試験した全ての前立腺細胞系において、−1.6キロダルトンで見られ
る結合パターンは、BSP mRNAの発現を示している。ここにおいて、アンドロゲン
依存性は、元のままの（アンドロゲン非依存性）宿主または去勢したオス（アン
ドロゲン非依存性）宿主において腫瘍が形成される能力として定義した。さらに
、この発現は、C4-2B4（骨に対して最も高い親和性を有する細胞型）においてよ
り高いと思われる。この「石灰化」（ビタミンＣおよびリン酸）条件下において
、このC4-2B4発現はアップレギュレートされる。図３は、前立腺癌細胞（LNCaP
、C4-2、C4-2B4およびARCaP）、ヒト骨肉腫細胞系（MG63）およびマウス骨髄細
胞系（D1）におけるBSP発現を示している（上段）。
【０１６５】 事実、発現は、肉腫または骨の細胞よりも前立腺癌系でのほうが高い。ここでも
また、骨に対して最も高い親和性（tropism）を有するC42B4細胞は、培地にデキ
サメタゾンを添加した場合には発現が増大する。デキサメタゾンは、BSPの発現
を転写時および転写後の双方において増大させることが知られている。図３の下
段に示した別の実験において、ここでもまた、BSPは全てのヒト前立腺細胞系（C
4-2、C4-2B4、ARCaP；これらは全て、非常に転移性の高いヒト前立腺癌細胞系で
あることが知られている）およびマウス骨髄細胞（D1）に存在する。
【０１６６】８．実施例：BSPプロモーター活性 8.1 材料および方法 細胞（300,00個／ウェル）を、リポソーム媒介トランスフェクションにより、
BSPプロモーター−ルシフェラーゼベクター（2.5μg）に４〜６時間暴露し、そ
の後約２日間増殖させ、この時点で細胞溶解物を得て、相対ルシフェラーゼ活性
（RLU）についてアッセイした。全ての値は、CMV-βガラクトシダーゼレポータ
ープラスミド（0.5μg）の同時トランスフェクションにより標準化した。
【０１６７】8.2 結果 図４において、バーは、プロモーター長が800〜2200塩基対で異なっている（8
38塩基対(bp)、1038bp、1390bpおよび2186bp）４種の別個のBSPプロモーター構
築物について少なくとも２回ずつ行った３〜４種の別個の実験を示す。細胞系P6
9は、腫瘍形成能も転移能もない「正常」な前立腺細胞型であると考えられ、そ
のBSPプロモーター駆動活性は非常に低い。この系列に関連した細胞サブライン
であるLNCaP、C4-2、C4-2B4では活性が徐々に増大すると共に、腫瘍形成性およ
び転移性の骨ホーミング親和性（bone homing tropism）が増大する。同様に、P
C-3〜PC-3Mの進行モデルサブラインでも活性は徐々に増大する。ここで明らかに
されたように、腫瘍細胞がより侵襲性および転移性になるにつれてBSPプロモー
ター活性が増大することは、特に「正常」なP69細胞型のBSPプロモーター駆動活
性の実質的不在が認められる場合には、このプロモーターのまさに腫瘍特異的な
活性を示している。さらに、別のアンドロゲン非依存性細胞系であるDU-145は、
かなりの活性を有している。既知のラットBSP発現骨肉腫細胞系であるROS 17/2.
7もまた非常に高い活性を有することに注目されたい。ヒト骨肉腫細胞系であるM
G-63およびSAOS-2もまた、かなりの発現を示す（＞10,000 RLU）。前立腺癌およ
び骨肉腫における治療用遺伝子の発現レベルは、ここで証明されたBSP活性に匹
敵するものであろう。
【０１６８】 図５では、ベースライン（Ｔ培地、５％PBS）条件下および外因性糖質コルチ
コイドであるデキサメタゾンを添加した場合のin vitroでのBSPプロモーター活
性をアッセイする。この図でもまた、ルシフェラーゼ活性および３種の異なる長
さのプロモーター構築物(1038、1390および2186bp)を含む細胞系が示されている
。骨芽細胞性のC4-2B4細胞サブラインは、糖質コルチコイドで刺激されることを
示している。骨溶解性のPC-3およびPC-3M細胞系は、糖質コルチコイドが増大し
た環境下で活性が低下する。
【０１６９】 図６は、標準的条件下（Ｔ培地）および石灰化条件下(L-アスコルビン酸添加)
での各種の前立腺癌細胞系におけるBSPプロモーター発現をRLUとして示す。注目
すべきことは、BSPプロモーターに関して最も長い構築物（2186bp）の発現が、L
-アスコルビン酸条件下でC4-2B4、PC-3およびDu-145細胞において応答の増大を
誘発することである。したがって、同様の腫瘍細胞表現型を有する患者において
は、L-アスコルビン酸（ビタミンＣ）を同時に外部から投与した場合、より長い
BSPプロモーターによって駆動される治療用遺伝子の発現が増強される、と予想
される。
【０１７０】 図７は、別の癌細胞型におけるBSPプロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を示
す。この実験は、図６についての場合と全く同様に行った。これらの腫瘍におい
て用いたBSPプロモーター構築物の長さは1390bpおよび2186bpであった。このデ
ータから、大腸癌（Lovo）、乳癌（MCF-7）、脳腫瘍（U-87、神経膠芽細胞腫の
多形型）および肺癌（A547）の細胞系における活性が示される。活性レベルは、
前立腺癌および骨肉腫において見られるものほど高くないが、正常なP69細胞型
において示される基底レベルよりも有意に高い（４〜８倍）。したがって、BSP
プロモーターは、これらの癌細胞型における毒性の遺伝子の発現も駆動でき、し
たがって、これらの腫瘍を有する患者において用いることができる。
【０１７１】９．実施例：Ad-BSP-TKを用いたin vitro細胞傷害性アッセイ 細胞をＴ培地で増殖させ、０日目の時点でウイルスを感染させた。このアッセ
イは６日間にわたって行った。細胞の各グループを（ａ）なし（対照）、（ｂ）
ACV、（ｃ）ウイルス（Ad-BSP-TK）または（ｄ）ウイルス＋ACVのいずれかに暴
露した。
【０１７２】 図9Aは、骨肉腫細胞系Saos-2に関するデータを示すものであり、これはBSPを
産生するので陽性対照である。この図は、ウイルス＋ACVの細胞が、他の３グル
ープの細胞ほど増殖しなかったことを示している。図9Bは、前立腺細胞系LNCaP
を用いた結果を示す。Saos-2を用いた場合の結果と同様に、ウイルス＋ACVで処
理した細胞は、対照となるグループの細胞ほど増殖しなかった。図9Cは、前立腺
癌C4-2を用いた結果を示す。先の結果と同様に、ウイルス＋ACVで処理した細胞
は、対照となるグループの細胞ほど増殖しなかった。
【０１７３】10. 実施例：in vivoでの腫瘍増殖の抑制 図10は、16匹の動物を用いて行ったin vivo実験を示す。簡単に説明すると、
先天的に無胸腺のヌード（nu/nu）マウス（Harlan Co., Houston, Tex.）（５〜
６週令）に、200万個のPC3前立腺癌細胞を皮下的に接種した。細胞注射の約10日
後、該腫瘍が触知できるようになったら（直径４〜５mm）、該動物を無作為に４
つの実験グループに振り分けた：グループ１は、未処理の対照グループ；２は、
10、17、24および30日目に腫瘍内にPBS；３は、Ad-BSP-TKのみ；および４は、Ad
-BSP-TK＋GCVを10〜40日目に投与。Ad-BSP-TK注射では、28ゲージの針が付いて
いるマイクロリットルシリンジを用いて、75μlのAd-BSP-TK（１×109プラーク
形成単位）を送達した。Ad-BSP-TKは腫瘍内に、該腫瘍の長軸および短軸方向の
両方に注射した：長軸に平行に１回注射し、該軸に垂直に１回行った。次に、針
の先端を該腫瘍内部で回して、Ad送達領域を最大化した。腫瘍の容積を次の式に
より算出した：容積（回転楕円体）−Ｍ１×Ｍ２ ２×0.5236（Ｍ１、長軸；Ｍ２ 、短軸；Ko. S-C., Gotoh, A., Thalmann, G.N., Zhou, H.E., Johnston, D.A,
Zhang, W.W., Kao, C., およびChung, L.W.K. Molecular therapy with recombi
nant p53 adenovirus in an androgen independent, metastatic human prostat
e cancer model. Hum. Gene Ther., 7:1683-1691, 1996）。ガンシクロビル（GC
V）処理のみ、またはAd-BSP-TK＋GCVの実験グループを、GCVの腹腔内注射で体重
kg当たり40mgの用量で処理した。Ad-BSP-TKおよびGCV処理は、実験動物の体重に
悪影響を及ぼさなかった。
【０１７４】 このデータから、ウイルス＋プロドラッグで処理したグループでは実験の51日
間にわたって腫瘍増殖が最も低かったが、３つの対照グループでは腫瘍増殖が極
めて大きく増大したことが実証される。したがって、このデータは、Ad-BSP-TK
ウイルスベクターがin vivoでの石灰化の可能性がある腫瘍の改善および／また
は治療に有効であることを実証している。
【０１７５】10.1 考察 本発明は、予想外にも、BSPプロモーター駆動遺伝子を、骨肉腫（ROS、MG63、
Saos-2）、前立腺癌（LNCaP、C4-2、C4-2B4、PC-3、PC3M、Du-145、ARCaP）、大
腸癌（Lovo）、肺癌（A547）、脳腫瘍（U-87）および乳癌（MCF-7）のような感
受性の骨親和性腫瘍および骨芽細胞系列細胞に感染させた場合に、それらの細胞
はレポーター遺伝子を非常に高レベルで発現し、したがって、Ad-BSP-TKなどの
（しかしそれに限定されない）既知の送達ベクターと組み合わせた場合には、高
レベルの選択した毒性または治療用の遺伝子を効率的に発現すると予想されるこ
とを実証する。さらに、本発明は、Ad-BSP-TK系と組み合わせてAcVのような適切
なプロドラッグを添加することにより、上記の骨親和性腫瘍およびそれらの結合
する骨芽細胞支持間質の中断、抑制および細胞傷害が引き起こされることを実証
する。BSPは主に、十分に分化した、骨芽細胞または石灰化の可能性がある組織
もしくは腫瘍で発現され、ここで明らかにしたように、このBSPプロモーターは
骨親和性腫瘍において選択された遺伝子（レポーター、治療用または毒性のいず
れか）の効率的な発現を駆動できるので、本発明は予想外にも、BSPプロモータ
ー構築物が、特定の骨親和性腫瘍（骨肉腫、前立腺癌など）の増殖を抑制すると
同時に、周囲の正常な組織または非骨親和性もしくは非骨溶解性系列細胞をかな
りの損傷から守ることができ、全身的に適用した場合には、不適合組織の破壊を
防止し、それと同時に腫瘍増殖に対する所望の破壊作用を得ることができる、本
質的な腫瘍特異的遺伝子治療を構成することを教示する。さらに、BSPプロモー
ター駆動治療用遺伝子治療は、該治療用遺伝子の発現がサイトメガロウイルス（
CMV）およびラウス肉腫ウイルス（RSV）の長い末端反復配列などの普遍的プロモ
ーターにより駆動される場合には、骨親和性腫瘍に関して慣用の遺伝子治療より
も優れる。この理由は、これらの普遍的プロモーターは、その特定の標的腫瘍を
認識できず、そのために正常細胞における毒性遺伝子の発現により、選択しなか
った組織に不適合な損傷を引き起こす可能性があるからである。
【０１７６】 先に述べたように、BSPプロモーター駆動遺伝子治療の１つの治療的適用は、
骨格への転移能を有する癌を標的とすることである。骨に対する悪性細胞リクル
ートメントの１つの機構は、骨芽細胞が、前立腺癌や乳癌などの骨親和性腫瘍の
増殖、接着および移動を刺激できる生成物を合成し分泌する可能性があり、その
ために、外来の腫瘍上皮（癌）と支持している骨間質との相互関係が腫瘍増殖の
促進にとって好ましい環境（土壌）を提供することである。前立腺癌および乳癌
の細胞の増殖および移動はまた、それら自体が、骨転移部位における骨芽細胞お
よび破骨細胞の増殖を刺激するパラクリン増殖因子を分泌でき、その結果、冒さ
れた患者の骨格において優性的に骨芽細胞性（例えば前立腺）または骨溶解性（
例えば乳房）の表現型が誘導される。腫瘍細胞の増殖は周囲の間質により大きく
影響を受け、これらの相互作用（reciprocal interactions）は特定の腫瘍（前
立腺癌、骨肉腫、乳癌など）と骨間質（骨芽細胞または破骨細胞）との間に存在
するので、標的腫瘍、それらの転移および支持間質に対するBSPプロモーターを
ベースとする遺伝子治療の開発は、これらの腫瘍に苦しむ患者にとっての新規で
非常に特異性の高い遺伝子治療の様式である。事実、BSPの発現は、他の真に骨
芽細胞特異的遺伝子であるオステオカルシンとも異なる。したがって、BSP駆動
毒性遺伝子治療（Ad-BSP-TKの形態が最も一般的である）は、次のような様々な
治療的意味を呈する。ａ）BSPプロモーター駆動遺伝子治療（Ad-BSP-TK）は、骨
肉腫および前立腺癌の細胞に対する毒性化合物の発現に影響を及ぼし、また特定
の骨親和性腫瘍の骨転移性沈着体の生存を維持するのに必要と思われる骨芽細胞
を撲滅する。さらに、該治療は、幾つかの正常な骨芽細胞の増殖を失わせる可能
性があるが、これは問題ない。何故ならば、BSPの発現は非常に特異性が高く、
多種多様な組織における毒性化合物の発現により該宿主を過度に損なうはずがな
いからである。ｂ）BSPプロモーター駆動遺伝子適用は、多くの石灰化腫瘍にお
いて高レベルの治療用標的遺伝子を発現でき、まずこれらの腫瘍を、そしてその
転移沈着体を支持間質と共に撲滅するのには妥当な選択である。ｃ）適切なビヒ
クルと組み合わせたBSPプロモーター駆動治療用遺伝子治療は、種々の感受性か
つ骨親和性のヒトもしくは真核生物の腫瘍に関連する局所的で転移性の沈着体に
おける腫瘍量および罹患率の低減により、慣用の化学療法、外科的手術もしくは
放射線法、または他の新規な治療法と共に用いることができる。ｄ）長期にわた
って継続する抗腫瘍免疫を、腫瘍細胞のBSP駆動殺傷から残存している骨芽細胞
および腫瘍細胞に対して生起させることができる。ｅ）BSPプロモーター駆動構
築物は、BPH、動脈硬化などのような良性疾患の治療のための治療用遺伝子の送
達および発現に用いることができ、また、老化および変性的症状の間にもたらさ
れる損傷を修復するための、非常に重要な増殖および分化に関連する遺伝子（例
えば増殖因子、増殖因子レセプター、骨形態形成タンパク質など）の発現にも用
いることができる。ｆ）BSPプロモーター駆動治療は、種々の化合物により調節
されて、意図する特定の適用についての所望の作用の増強を得ることができる；
これらの化合物としては、ビタミンＣもしくはＤ、糖質コルチコイド、TGF-β、
PTH/PTHrpなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７７】 前立腺癌は主に骨格に転移する。本発明は、BSPが多種多様な前立腺癌細胞に
おいて高度に発現されること、そのため、このプロモーターおよび遺伝子送達用
ビヒクルと組み合せた場合には毒性および／または治療用の遺伝子も駆動するこ
とを実証する。この発現は、骨芽細胞性前立腺癌細胞および骨溶解性前立腺癌細
胞の両者、さらにアンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺癌のタ
イプを含む。同様に、本発明はまた、骨肉腫、大腸癌、肺癌、乳癌および脳腫瘍
など（しかしこれらに限定されない）の他の腫瘍にも有用である。さらに、この
BSPプロモーターは、そのDNA塩基対の中に組み込まれた種々の活性化エレメント
を有しており、本発明は、糖質コルチコイドの同時投与により、特定の腫瘍タイ
プ（C4-2B4）における標的遺伝子の発現の増大がもたらされることを示している
。したがって、同様の腫瘍表現型を有する特定の患者においては、糖質コルチコ
イドをBSPプロモーター駆動治療と同時に投与した場合、in vivoでの治療効果の
増大が引き起こされる。また、本発明は、L-アスコルビン酸が、特定の骨親和性
腫瘍表現型においてBSPプロモーター駆動活性の作用を増大させることを実証す
る。一般に、骨芽細胞性で石灰化の表現型は、L-アスコルビン酸（ビタミンＣ）
の存在下で、骨膠原性タンパク質（例えばBSP）を発現する細胞において増強さ
れることがわかっており、したがって、ここでもまた、このBSPプロモーター駆
動遺伝子治療の治療上の利点は、骨親和性腫瘍がこの、または同様の作用性表現
型を有する特定の患者において、in vivoで、L-アスコルビン酸の同時投与によ
って、増大することができる。事実、BSPプロモーター配列中にすでに存在する
種々のホルモン／化合物および／またはビタミン応答性エレメント［例えば、糖
質コルチコイド、ビタミンＣもしくはＤ、トランスフォーミング増殖因子β（TG
F-β）、AP-1、副甲状腺ホルモン（PTH／PTHrp）など］を操作することにより、
あるいはそれらを天然のBSPプロモーターに遺伝子操作することにより、このユ
ニークで新規な発明がさらに容易に調節でき、種々の臨床的適用にとって最適な
治療効果をもたらすことができる、と理解される。
【０１７８】 したがって、Ad-BSP-TKなど（しかしそれに限定されない）の適切な送達ベク
ターおよび治療用（つまり毒性の）遺伝子と連結させたBSPプロモーターを含む
新規な治療剤が作製されると考えられる。この組換え型の新規な系は、治療作用
を効率的に発現し、選択的にターゲッティングし、骨芽細胞結合細胞および石灰
化する可能性を持っている広範な腫瘍もしくは他の感受性の良性組織の殺傷を引
き起こす。
【０１７９】 さらに、Ad-BSP-TKなど（しかしそれに限定されない）の新規な組換え治療剤
は、骨肉腫または前立腺癌のみならず、肺癌、乳癌、甲状腺癌、骨髄腫、黒色腫
、大腸癌、脳腫瘍および他の石灰化腫瘍に罹患している患者または感受性である
良性組織を持つ患者に適用可能である。
【０１８０】 記載のTkの代わりに、他の毒性または治療用遺伝子をBSPプロモーター駆動治
療と共に用いてもよい。これらとしては、シトシンデアミナーゼ、癌抑制遺伝子
、細胞周期調節タンパク質（種々のサイトカイン、増殖および分化因子など）な
どの遺伝子が挙げられ、これらは記載のTk遺伝子に代えてBSPプロモーターに連
結できる。さらに、他のベクター送達系を作製し、BSPプロモーターと組み合せ
て所望の治療的応答を効率的に引き起こすことができる。
【０１８１】 本明細書に記載され権利請求する本発明は、本明細書に開示されている特定の
実施形態によりその範囲が限定されるものではない。何故ならば、これらの実施
形態は本発明の幾つかの態様を説明しようとするものだからである。どのような
等価の実施形態も、本発明の範囲にあるものとする。事実、上記の記載から、本
明細書に示され記載されているもの以外に、本発明のさまざまな改変が当業者に
は明らかになろう。そのような改変もまた、添付の請求の範囲の範囲にあるもの
とする。
【０１８２】 本明細書で述べた全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の刊行物、特許
および特許出願が具体的かつ個々に引用により組み込まれると示されているのと
同じ程度に、引用により本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１：骨シアロタンパク質（BSP）プロモーター駆動毒性チミジンキナーゼ（T
K）遺伝子を含有する組換えアデノウイルスベクターAd-BSP-TKの構築。これは、
BSPプロモーターを遺伝子治療方法に用いる１つの特定の方法を表すが、多くの
他の送達ベクター（例えば、リポソーム、レトロウイルスなど）と治療用遺伝子
（例えば、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、サイトカインなど）を用い
て直接または間接に（例えば、宿主免疫反応により）腫瘍の根絶を誘発すること
ができる。
【図２】 図２：種々の前立腺癌細胞系内の骨シアロタンパク質メッセンジャーRNAの測
定。
【図３】 図３：前立腺癌細胞（LNCaP、C4-2、C4-2B4およびARCaP）、ヒト骨肉腫細胞系
（MG63）、およびマウス骨髄細胞系（D1）中のBSP発現（頂部）を表すノーザン
ブロット。
【図４】 図４：BSPプロモーター駆動組換えプラスミドを一過性感染させた標的細胞中
のレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の測定。
【図５】 図５：基線（T培地、5%Pbs）条件下および外因性グルココルチコイド、デキサ
メタゾンを用いたBSPプロモーターin vitro活性。
【図６】 図6A-6B：標準条件（T培地）下および鉱質化条件（L-アスコルビン酸による）
下の種々の前立腺癌細胞系内のRluとしてのBSPプロモーター発現。
【図７】 図７：他の癌細胞型中のBSPプロモーター駆動ルシフェラーゼ活性。
【図８】 図８：-2184〜+237のBSPプロモーター配列。
【図９】 図9A-9C：AD-BSP-TKを用いたIn Vitro細胞毒性アッセイ。図9Aは骨肉腫細胞系
Saos-2を用いたアッセイを表す。図9Bは前立腺細胞系LNCaPを用いたアッセイを
表す。図9Cは前立腺細胞系C4-2を用いたアッセイを表す。
【図１０】 図10：ヌードマウスにおけるPC-3皮下腫瘍成長。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 35/00 38/21 43/00 １２３ 38/22 Ｃ１２Ｑ 1/02 38/43 Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｐ 35/00 37/48 43/00 １２３ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 37/24 // Ａ６１Ｋ 35/76 37/66 Ｇ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA11 BA38 CA02 DA03 EA02 FA02 HA17 4B063 QA08 QA18 QQ08 QQ22 QQ27 QQ30 QR02 QR07 QR10 QR77 QX02 4C084 AA01 AA02 AA13 DA01 DA12 DA21 DA22 DA23 DA24 DA25 DA58 DB01 MA02 MA52 MA66 MA67 4C086 AA01 AA02 BA18 CB07 EA16 EA19 MA03 MA52 MA66 MA67 NA14 NA15 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 MA52 MA55 MA66 MA67 NA14 NA15 NA20 ZB26

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨シアロタンパク質（「BSP」）プロモーター、送達ベクタ
    ーならびに毒性の治療用および／または異種コード配列を含む治療剤。
  2. 【請求項２】 プロドラッグをさらに含む、請求項１記載の治療剤。
  3. 【請求項３】 プロドラッグが、アシクロビア（「ACV」）およびガンシク
    ロビア（「GCV」）からなる群より選択される、請求項２記載の治療剤。
  4. 【請求項４】 グルココルチコイドまたはL-アスコルビン酸をさらに含む、
    請求項１記載の治療剤。
  5. 【請求項５】 BSPプロモーターが、図８に示したヌクレオチド-1349〜+69
    を含む、請求項１記載の治療剤。
  6. 【請求項６】 送達ベクターがウイルスベクターを含む、請求項１記載の治
    療剤。
  7. 【請求項７】 ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項６記載の
    治療剤。
  8. 【請求項８】 送達ベクターがリポソームを含む、請求項１記載の治療剤。
  9. 【請求項９】 毒性コード配列がチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナ
    ーゼからなる群より選択される、請求項１記載の治療剤。
  10. 【請求項１０】 治療用コード配列が、増殖因子、サイトカイン、治療用タ
    ンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒビタ
    ー、ペプチド成長および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インターフ
    ェロン、コロニー刺激因子ならびに血管新生因子からなる群より選択される、請
    求項１記載の治療剤。
  11. 【請求項１１】 異種コード配列がレポーター遺伝子である、請求項１記載
    の治療剤。
  12. 【請求項１２】 レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１１記
    載の治療剤。
  13. 【請求項１３】 骨親和性特異的遺伝子の発現の調節が可能な被験化合物を
    同定する方法であって、 (a) 前記被験化合物の存在下および不在下で、BSP調節領域、またはその転写
    活性のある断片の制御下でレポーター遺伝子の発現レベルを測定すること、 を含んでなり、その結果、被験化合物の存在下で得られたレベルがその不在下で
    得られたレベルと異なる場合、骨親和性特異的遺伝子の発現を調節する化合物が
    同定されるものである、上記方法。
  14. 【請求項１４】 レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１３記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１３記載の方法により同定された被験化合物を含む
    医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 毒性および／または治療用分子の送達方法であって、該毒
    性および／または治療用分子をコードする異種核酸に機能し得る形で連結された
    、BSP調節領域配列、またはその転写活性のある断片を含むベクターを被験者の
    骨親和性細胞に導入することを含む、上記方法。
  17. 【請求項１７】 骨親和性関連疾患または障害を治療および／または改善す
    る方法であって、その遺伝子産物が該疾患または障害を治療および／または改善
    し得る異種核酸に機能し得る形で連結された、BSP調節領域配列、またはその転
    写活性のある断片を含むベクターを被験者の骨親和性細胞に導入することを含む
    、上記方法。
  18. 【請求項１８】 骨親和性関連癌またはその他の増殖性障害を治療および／
    または改善する方法であって、被験者の該癌またはその他の増殖性障害の細胞に
    、BSP調節領域配列、またはその転写活性のある断片、送達ベクター、ならびに
    その遺伝子産物が前記細胞を殺傷することが可能な毒性の治療用および／または
    異種コード領域を含むベクターを導入することを含む、上記方法。
  19. 【請求項１９】 癌またはその他の増殖性障害が、骨肉腫、前立腺癌、乳癌
    、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、甲状腺癌、黒色腫またはその他の石灰
    化の可能性を有する疾患もしくは障害からなる群より選択される、請求項１８記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 プロドラッグを導入することをさらに含む、請求項１８記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 プロドラッグがACVおよびGCVからなる群より選択される、
    請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 導入が、直接適用による投与、または静脈内投与、動脈内
    投与、腫瘍内投与、灌流および経口投与による全身適用を含む、請求項２０記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 BSP調節領域配列が、図８に示したヌクレオチド-1349〜+6
    9を含む、請求項１８記載の方法。
  24. 【請求項２４】 BSP調節領域配列が、高度ストリンジェンシー条件下で図
    ８に示したヌクレオチド-1349〜+69の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 BSP調節領域配列が、中度ストリンジェンシー条件下で図
    ８に示したヌクレオチド-1349〜+69の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 骨親和性関連障害を予防または遅延させる方法であって、
    該障害の予防または遅延が可能な治療用分子をコードする異種核酸に機能し得る
    形で連結された、BSP調節領域配列、またはその転写活性のある断片を含むベク
    ターを、被験者の骨親和性細胞に導入することを含む、上記方法。
  27. 【請求項２７】 骨修復が必要な領域にポリヌクレオチドを投与することを
    含む骨修復を促進する方法であって、該ポリヌクレオチドが、BSP調節領域配列
    、またはその転写活性のある断片、送達ベクター、ならびにその遺伝子産物が該
    骨修復を促進し得る治療用コード配列を含む、上記方法。
  28. 【請求項２８】 治療用コード配列が、増殖因子、サイトカイン、治療用タ
    ンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒビタ
    ー、ペプチド成長および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インターフ
    ェロン、コロニー刺激因子ならびに血管新生因子からなる群より選択される、請
    求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 免疫機能の調節が必要な領域にポリヌクレオチドを投与す
    ることを含む免疫機能を調節する方法であって、該ポリヌクレオチドが、BSP調
    節領域配列、またはその転写活性のある断片、送達ベクター、ならびにその遺伝
    子産物が免疫機能を調節し得る治療用コード配列を含む、上記方法。
  30. 【請求項３０】 治療用コード配列が、インターフェロンα、βまたはγ、
    ；瘍壊死因子；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)；顆粒球コロニ
    ー刺激因子(G-CSF)；マクロファージコロニー刺激因子(N-CSF)；好中球活性化タ
    ンパク質NAP、マクロファージ化学誘引物質および活性化因子MCAF、RANTES、マ
    クロファージ炎症ペプチドMIP-1aおよびMIP-1bのようなケモカイン；補体成分お
    よびその受容体、87.1、87.2、ICAM-１、２もしくは３のような補助分子または
    サイトカイン受容体からなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
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