JP2003525911A - プロドラッグに対する内皮細胞の感受性を高める方法 - Google Patents

プロドラッグに対する内皮細胞の感受性を高める方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は本発明は抗癌療法に関する。より具体的には、本発明は、プロドラッグに対する内皮細胞の感受性を高める方法、組換えウイルスベクター、および腫瘍の血管新生を阻害する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は抗癌療法に関する。より具体的には、本発明は、プロドラッグに対す
る内皮細胞の感受性を高める方法、組換えウイルスベクター、および腫瘍の血管
新生を阻害する方法に関する。
【０００２】 （背景技術） 癌を原因とする死亡は世界中で毎年６百万例に近い。癌に冒された患者のおよ
そ半分は、腫瘍が原発部位に限局しているために、外科手術または放射線療法に
よって治すことができる。残りの癌には血液腫瘍および転移した腫瘍が含まれる
。これらの癌タイプのうち、化学療法によって治すことができるものの割合は現
時点ではわずか（５〜１０％）であり、残りは化学療法に対して抵抗性であるか
、治療の過程で抵抗性を獲得する。
【０００３】 血管新生は、既存の血管から「出芽」することによって新しい血管の形成をも
たらす多段階過程である。血管新生は数多くの生理学的事象に（正常な事象にも
病的な事象にも）関与している。正常な状態では、血管新生は創傷治癒、黄体形
成および胚発生に関与する。しかし血管新生は固形腫瘍、転移、糖尿病性網膜症
、乾癬などの様々な病的状態および慢性関節リウマチなどの炎症関連疾患でも重
要な役割を果たす。特に、最小サイズを超える固形腫瘍の増殖は、酸素、栄養素
および成長因子を供給する新しい血管の形成に決定的に依存するが、血管新生は
続発部位における転移の形成にとっても重要である。
【０００４】 初期の研究で、摘出灌流器官に移植された腫瘍は直径数ミリメートルを超えて
成長することはできないことが見いだされた。しかしドナーマウスに再移植する
と、腫瘍は１ｃｍ3を越えて急速に成長し、その宿主を殺してしまった。腫瘍は
マウス体内では血管化され、灌流器官では血管化されなかった。これらの研究に
基づいて「固形腫瘍は血管新生依存的であり」、「血管新生阻害は癌と戦う際の
治療方法になりうる」という仮説が立てられた。
【０００５】 血管新生は一般に三期に分割することができる。第一に、塩基性繊維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生刺激因
子が腫瘍細胞から放出される。第二に、これらの血管新生シグナルが、内皮細胞
の増殖、タンパク質分解酵素および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の分泌、
ならびにＥＣＭおよび腫瘍の血管浸潤を引き起す接着分子の発現の変化を誘発す
る。第三に、血管芽が管腔構造を形成することによって成熟し始め、環状に融合
することにより、新しい血管での血液循環を促進する。
【０００６】 正常な生理学的状態において、血管内皮細胞は７０ｋｇのヒトで約１０００ｍ 2 に及ぶ単層を形成する。これらの細胞は数百日以上の平均代謝回転時間を持つ
。しかし、血管新生化腫瘍における血管新生中は、内皮細胞は骨髄前駆細胞並み
の速さで（すなわち数日程度の代謝回転時間で）増殖することができる。
【０００７】 腫瘍の血管系を破壊することができれば、酸素および栄養の永続的な欠乏によ
って腫瘍細胞を飢餓状態にし、最終的には死滅させることができると考えられる
。
【０００８】 この点で、内皮細胞に特異的にターゲティングされる適切な調節要素に遺伝子
が結合している発現系を利用すれば、内皮に対する治療薬の特異的送達が可能に
なることが示唆されている。内皮細胞特異的な遺伝子発現を制御するプロモータ
ー要素については既に記載がある。
【０００９】 例えばＷＯ９７／１７３５９にはＶＥＧＦ受容体の新規プロモーターが記載さ
れており、ＷＯ９８／２４８９２にはＶＥ−カドヘリン受容体の新規プロモータ
ーが記載されている。当技術分野では他のプロモーターも知られている。
【００１０】 しかし、先行技術で腫瘍細胞を攻撃するために提案されている発現系はいずれ
も毒性物質の発現を目的とするものであり、例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジ
フテリア毒素および腫瘍壊死因子αなど、細菌、植物または動物由来の毒性タン
パク質が数多く提案されている（例えばＷＯ９７／１７３５９の２４〜２５頁を
参照されたい）。
【００１１】 最後に、プロドラッグに対する細胞の感受性を高める方法は、これまでにも記
載されていることを述べておく。例えばＷＯ９９／３９７４０には、脂質による
遺伝子および化合物の送達を用いる方法が開示されている。しかし内皮細胞のみ
を標的とする細胞感作方法はこれまで一度も記載されたことがない。
【００１２】 （発明の概要） 先行技術の発現系とは対照的に、本発明は、より一層安全な発現系の提供を目
的とする。上述した技術のように、毒性物質が望まない部位で発現するという危
険を冒して毒性物質を発現させるのではなく、成長中の固形腫瘍および転移の成
長を処置するために増殖性内皮細胞を標的とする手段であって、無害な物質だけ
を前記特定部位でのみ発現させる手段を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】 本発明によれば、無害な薬物代謝酵素をコードする遺伝子を組み込むことがで
きる遺伝子改変ウイルスで内皮細胞だけを処置し、次にそれらの内皮細胞内での
み細胞毒性薬に変換される無毒性プロドラッグによる処置を行うことからなる二
段階処置で、腫瘍および転移を攻撃する。
【００１４】 この処置によって腫瘍関連内皮細胞は破壊され、腫瘍細胞は休止状態に保たれ
るか殺滅される。この方法により、微小転移巣または残存腫瘍組織の再成長が効
果的に阻害される。
【００１５】 本発明の方法には、従来の化学療法に関連して見られた重篤な全身性副作用（
毒性）がないばかりでなく、本発明の方法では内皮細胞における毒性物質の発現
も回避される。毒性物質はプロドラッグが投与されるまで生成しない。さらに毒
性物質は内皮細胞内でのみ生成する。したがって本発明の方法により、既知の腫
瘍攻撃法よりもさらに高い安全性レベルが得られる。
【００１６】 したがって本発明は、その第一の態様として、プロドラッグに対する内皮細胞
の感受性を高める方法であって、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわち前記プロドラッグの（細胞毒性）
薬物への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）前記内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択
的に促進することができるプロモーターと を含むポリヌクレオチドを、前記内皮細胞にトランスフェクトする工程、 および （ｉｉ）前記プロドラッグを前記内皮細胞に送達する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
ドラッグに対する感受性よりも高い方法を提供する。
【００１７】 もう一つの態様として、本発明は、作動可能な形で結合したプロモーターとプ
ロドラッグ代謝遺伝子とを含む組換えウイルスベクターであって、プロモーター
が内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に促進する
能力を持つことを特徴とする組換えウイルスベクターを提供する。
【００１８】 第三の態様として、本発明は、対象における腫瘍誘導血管新生を阻害する方法
であって、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわちプロドラッグの（細胞毒性）薬物
への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に
促進することができるプロモーターと を含む、内皮細胞への形質導入能を持つ組換えウイルスベクターを、前記対象
に導入する工程、 および （ｉｉ）前記対象に前記プロドラッグを導入する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
ドラッグに対する感受性よりも高い方法を提供する。
【００１９】 本発明の他の目的は、以下の詳細な説明および実施例から当業者には明らかに
なるだろう。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 細胞感作方法 本発明は、その第一の態様として、プロドラッグに対する内皮細胞の感受性を
高める方法であって、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわち前記プロドラッグの（細胞毒性）
薬物への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）前記内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択
的に促進することができるプロモーターと を含むポリヌクレオチド（ベクター）を、前記内皮細胞にトランスフェクトす
る工程、 および （ｉｉ）前記プロドラッグを前記内皮細胞に送達する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
ドラッグに対する感受性よりも高い方法を提供する。
【００２１】 「作動可能な形で結合」という用語は、プロドラッグ代謝遺伝子とプロモータ
ーとが、コードされた酵素の発現が可能になるような形で連結されていることを
意味する。ベクターの各要素の向きおよび位置は、コードポリヌクレオチドの制
御および発現に関して作動可能な形で結合しているという要件が満たされる限り
、特に限定されない。
【００２２】 本明細書において「感受性を高める（感作）」という用語は、感作前には細胞
が感受性を示さないかまたは低い感受性しか示さなかったある化合物（すなわち
プロドラッグ）に対する前記細胞の感受性を増大させ、その化合物に対してより
高い反応性を示すようにする能力を指す。「感受性を高める」という用語は、特
に、感作前には非致命的であった物質への曝露によって細胞死が起こるような形
で細胞の感受性を増大させることを包含する。
【００２３】 好ましい一実施形態では、プロドラッグはイホスファミド［Ｋｅｉｚｅｒ Ｈ
Ｊら「１０日間持続静脈内注入としてのイホスファミド処置」Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ． １９９５，１２１，２９７〜３０２参照］
であり、プロドラッグ代謝遺伝子はＣＹＰ２Ｂ１［Ｋｅｄｚｉｅ ＫＭら「機能
的にユニークなチトクロムＰ４５０ＩＩＢ１の分子基盤」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． １９９１，２６６，２２５１５〜２２５２１およびＦｕｊｉ−Ｋｕｒｉｙ
ａｍａ Ｙら「チトクロムＰ４５０の一次構造：ラット肝由来のフェノバルビタ
ール誘導性チトクロムＰ４５０ ｃＤＮＡのコードヌクレオチド配列」Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８２，７９，２７９３〜２７９
７参照］である。無毒性プロドラッグであるイホスファミドを投与すると、内皮
細胞によって発現されるＣＹＰ２Ｂ１酵素はイホスファミドを細胞毒性代謝産物
に代謝することができる。腫瘍部位では、代謝産物であるホスホルアミドマスタ
ード（ＤＮＡをアルキル化する）およびアクロレイン（タンパク質をアルキル化
する）が高濃度に達し、内皮細胞を根絶する。酸素および栄養の永続的な欠乏は
腫瘍細胞を飢餓状態にし、最終的には死滅させる。
【００２４】 もう一つの好ましい実施形態では、プロドラッグはガンシクロビル［Ｍａｒｔ
ｉｎ ＬＡら「自殺遺伝子による直接的細胞殺滅」Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ
ａｓｉｓ Ｒｅｖ． １９９６，１５，３０１〜３１６参照］であり、プロドラ
ッグ代謝遺伝子は単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子で
ある。無毒性プロドラッグであるガンシクロビルを投与すると、内皮細胞によっ
て発現されるチミジンキナーゼは、内皮細胞を死滅させる有毒な三リン酸型に、
ガンシクロビルを代謝することができる。
【００２５】 さらにもう一つの好ましい実施形態では、プロドラッグは６−チオキサンチン
であり、プロドラッグ代謝遺伝子は大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ）６ｐｔである。
【００２６】 さらにもう一つの好ましい実施形態では、プロドラッグは５−フルオロシトシ
ン［Ｍａｒｔｉｎ ＬＡら「自殺遺伝子による直接的細胞殺滅」Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １９９６，１５，３０１〜３１６参照］であ
り、プロドラッグ代謝遺伝子はシトシンデアミダーゼである。無毒性プロドラッ
グである５−フルオロシトシンを投与すると、内皮細胞によって発現されるシト
シンデアミナーゼはは、内皮細胞に対して毒性を示す５−フルオロウラシルに、
５−フルオロシトシンを代謝することができる。
【００２７】 さらに本発明は細胞特異的プロモーターの使用による内皮細胞の組織特異的タ
ーゲティングを包含する。
【００２８】 本発明のウイルスベクター系（遺伝子導入系）は、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」［Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．］に記載されてい
るような、当業者に知られた方法によって製造することができる。
【００２９】 内皮細胞における選択的な遺伝子導入および遺伝子発現は転写ターゲティング
法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）によって達成され
ている。この転写ターゲティング法では、組織特異的な転写調節要素（プロモー
ター）を使って、それらの調節要素と相互作用する転写因子を発現させる内皮細
胞に、自殺遺伝子の発現が限定される。
【００３０】 好ましい一実施形態では、プロモーターは、ビトロネクチン受容体αサブユニ
ット（αｖ）遺伝子プロモーターである［Ｄｏｎａｈｕｅ ＪＰら「インテグリ
ンαｖ遺伝子：プロモーター領域の同定および特徴づけ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９４，１２１９，２２８〜２
３２参照］。ビトロネクチン受容体αサブユニット（αｖ）は、内皮細胞によっ
て多様に発現される受容体と結合する。インテグリンαｖの発現は血管新生に付
随して起こる。血管新生中は浸潤性内皮上でのαｖ発現量が増加する。本発明に
よれば、αｖプロモーターの制御下にあるアデノウイルスベクターまたは複製欠
損レトロウイルスベクターをインビボで適用することにより、主として、血管新
生過程に関与する増殖性内皮細胞で、高レベルの遺伝子産物が誘導される。
【００３１】 もう一つの好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮増殖因子（ＶＥＧ
Ｆ）受容体遺伝子プロモーターである。ＶＥＧＦ受容体は、腫瘍によって誘導さ
れる増殖性内皮細胞中でアップレギュレートされる。本発明によれば、ＶＥＧＦ
受容体遺伝子プロモーターの制御下にあるアデノウイルスベクターまたは複製欠
損レトロウイルスベクターをインビボで適用することにより、主として、血管新
生過程に関与する増殖性内皮細胞で、高レベルの遺伝子発現が誘導される。
【００３２】 第三の好ましい実施形態では、プロモーターはβ３インテグリン遺伝子プロモ
ーターである。 β３インテグリンは増殖性浸潤性内皮細胞内でアップレギュレートされる。本発
明によれば、β３インテグリンのβ３サブユニット遺伝子のプロモーターの制御
下にあるアデノウイルスベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターをイン
ビボで適用することにより、主として、血管新生過程に関与する増殖性浸潤性内
皮細胞で、高レベルの遺伝子産物が誘導される。
【００３３】 第四の好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カ
ドヘリン）遺伝子プロモーターである。ＶＥ−カドヘリンインテグリンは増殖性
内皮細胞中でアップレギュレートされる。本発明によれば、ＶＥ−カドヘリン遺
伝子プロモーターの制御下にあるアデノウイルスベクターまたは複製欠損レトロ
ウイルスベクターをインビボで適用することにより、主として、血管新生過程に
関与する内皮細胞で、高レベルの遺伝子産物が誘導される。
【００３４】 血管新生の発生時にはアンジオポエチン２の局所的発現が内皮細胞中で起こる
。第五の好ましい実施形態では、プロモーターはアンジオポエチン２遺伝子プロ
モーターである。アンジオポエチン２は増殖性内皮細胞中でアップレギュレート
される。本発明によれば、アンジオポエチン２プロモーターの制御下にあるアデ
ノウイルスまたは複製欠損レトロウイルスをインビボで適用することにより、主
として、血管新生過程に関与する内皮細胞で、高レベルの遺伝子産物が誘導され
る。
【００３５】 組換えウイルスベクター もう一つの態様として、本発明は、作動可能な形で結合したプロモーターとプ
ロドラッグ代謝遺伝子とを含む組換えウイルスベクターであって、プロモーター
が内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に促進する
能力を持つことを特徴とする組換えウイルスベクターを提供する。
【００３６】 遺伝子導入ベクターとして有用なウイルスにはパポバウイルス、アデノウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロ
ウイルスなどがある。
【００３７】 レトロウイルスはコアタンパク質およびＲＮＡを取り囲むタンパク質エンベロ
ープからなっている。ＲＮＡは、ゲノムに隣接するプロモーターおよびエンハン
サー領域を含む２つの末端反復配列（ＬＴＲ）、ＣＡＰ部位およびポリアデニル
化シグナルを含む転写調節シグナル、ならびにｅｎｖ遺伝子（エンベロープタン
パク質をコードしている）、ｇａｇ遺伝子（ウイルスコアタンパク質をコードし
ている）およびｐｏｌ遺伝子（逆転写酵素をコードしている）を含む構造遺伝子
をコードし、さらにパッケージングシグナルｐｓｉもコードしている。
【００３８】 ヒト患者用のレトロウイルスベクターは複製欠損性でなければならない。これ
により、標的組織における感染性レトロウイルス粒子のさらなる産生が防止され
る。その代わりに、複製欠損ベクターは、標的細胞ゲノムに安定に組み込まれた
「捕獲（ｃａｐｔｉｖｅ）」導入遺伝子になる。通例、複製欠損ベクターではｇ
ａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子が（残りのウイルスゲノムの大半と共に）欠失
している。異種ＤＮＡは欠失したウイルス遺伝子の代わりに挿入される。異種遺
伝子は内因性異種プロモーター（標的細胞内で活性な別の異種プロモーター）の
制御下にあってもよいし、レトロウイルス５’ＬＴＲの制御下にあってもよい（
ウイルスＬＴＲは多様な組織で活性である）。通例、レトロウイルスベクターは
約７〜８ｋｂの導入遺伝子収容能力を持っている。
【００３９】 本発明の好ましいウイルスベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルスベクター、および複製欠損レトロウイルスベクターである。
【００４０】 好適なベクターには、単純疱疹ウイルス系ベクター、例えばｐＨＳＶ１［Ｇｅ
ｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９０
，８７，８９５０〜８９５４］；レトロウイルスベクター、例えばＭＦＧ［Ｊａ
ｆｆｅｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９３，５３，２２２１〜２２２６］
、特にＬＮ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸ、ＬＸＳＮなどのモロニーレトロウイルスベク
ター［ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８
９，７，９８０〜９８９］およびセムリキ森林ウイルス（「ＳＦＶ」）ベクター
；ワクシニアウイルスベクター、例えばＭＶＡ［ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９２，８９，１
０８４７〜１０８５１］；アデノウイルスベクター、例えばｐＪＭ１７［Ａｌｉ
ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９４，１，３６７〜３８４、Ｂｅｒｋｅｒ
，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８８，６，６１６〜６２４、Ｗａｎｄおよ
びＦｉｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９６，２，７１４〜７１
６］；アデノ随伴ウイルスベクター、例えばＡＡＶ／ｎｅｏ［Ｍｕｒａ−Ｃａｃ
ｈｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９９２，１１，２３１〜２３７］；レ
ンチウイルスベクター［Ｚｕｆｆｅｒｅｙら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ １９９７，１５，８７１〜８７５］；ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ３ａ
、ｐＥＴ１１ｄ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＥＴ２２ｄ、およびｐＥＴ１２ａ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎから入手可能）；プラスミドＡＨ５（ＳＶ４０起点とアデノウイルス主要後
期プロモーターとを含む）；ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎから入手
可能）；ｐＣＭＵ ＩＩ［Ｐａａｂｏら，ＥＭＢＯ Ｊ． １９８６，５，１９
２１〜１９２７］；ｐＺｉｐＮｅｏ ＳＶ［Ｃｅｐｋｏら，Ｃｅｌｌ １９８４
，３７，１０５３〜１０６２］；ｐＳＲ−ａｌｐｈａ（ＤＮＡＸ（カリフォルニ
ア州パロアルト）から入手可能）；ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カ
リフォルニア州ラホーヤ）から入手可能）；ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能）；およびｐＣＤＮＡ１
（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能）
などがあるが、これらに限るわけではない。
【００４１】 好ましい一実施形態では、プロモーターはビトロネクチン受容体αサブユニッ
ト（αｖ）遺伝子プロモーターである。
【００４２】 別の好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受
容体遺伝子プロモーターである。
【００４３】 第三の好ましい実施形態では、プロモーターはβ３インテグリン遺伝子プロモ
ーターである。
【００４４】 第四の好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カ
ドヘリン）遺伝子プロモーターである。
【００４５】 第五の好ましい実施形態では、プロモーターはアンジオポエチン２遺伝子プロ
モーターである。
【００４６】 好ましい一実施形態では、プロドラッグはイホスファミドであり、プロドラッ
グ代謝遺伝子はＣＹＰ２Ｂ１である。
【００４７】 別の好ましい実施形態では、プロドラッグはガンシクロビルであり、プロドラ
ッグ代謝遺伝子は単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子で
ある。
【００４８】 さらに別の好ましい実施形態では、プロドラッグは６−チオキサンチンであり
、プロドラッグ代謝遺伝子は大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ）６ｐｔである。
【００４９】 さらにもう一つの好ましい実施形態では、プロドラッグは５−フルオロシトシ
ンであり、プロドラッグ代謝遺伝子はシトシンデアミダーゼである。
【００５０】 血管新生阻害方法 第三の態様として、本発明は、対象における腫瘍の血管新生を阻害する方法で
あって、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわちプロドラッグの（細胞毒性）薬物
への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に
促進することができるプロモーターと を含む、内皮細胞への形質導入能を持つ組換えウイルスベクターを、前記対象
に導入する工程、 および （ｉｉ）前記対象に前記プロドラッグを導入する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
ドラッグに対する感受性よりも高い方法を提供する。
【００５１】 ウイルスベクターとしては特に、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイル
スベクター、または複製欠損レトロウイルスベクターを挙げることができる。
【００５２】 好ましい一実施形態では、プロモーターはビトロネクチン受容体αサブユニッ
ト（αｖ）遺伝子プロモーターである。
【００５３】 別の好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受
容体遺伝子プロモーターである。
【００５４】 第三の好ましい実施形態では、プロモーターはβ３インテグリン遺伝子プロモ
ーターである。
【００５５】 第四の好ましい実施形態では、プロモーターは血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カ
ドヘリン）遺伝子プロモーターである。
【００５６】 第五の好ましい実施形態では、プロモーターはアンジオポエチン２遺伝子プロ
モーターである。
【００５７】 好ましい一実施形態では、プロドラッグはイホスファミドであり、プロドラッ
グ代謝遺伝子はＣＹＰ２Ｂ１である。
【００５８】 別の好ましい実施形態では、プロドラッグはガンシクロビルであり、プロドラ
ッグ代謝遺伝子は単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子で
ある。
【００５９】 さらに別の好ましい実施形態では、プロドラッグは６−チオキサンチンであり
、プロドラッグ代謝遺伝子は大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ）６ｐｔである。
【００６０】 さらにもう一つの好ましい実施形態では、プロドラッグは５−フルオロシトシ
ンであり、プロドラッグ代謝遺伝子はシトシンデアミダーゼである。
【００６１】 治療方法 別の態様として、本発明は、ヒトを含む生きた動物体の疾患または障害または
状態であって血管新生阻害に反応するものを処置または軽減する方法を提供する
。
【００６２】 より好ましい一実施形態として、本発明は、ヒトを含む生きた動物体の疾患ま
たは障害または状態であって増殖性内皮細胞の阻害に反応するもの（例えば固形
腫瘍成長、転移、糖尿病性網膜症、乾癬、黄斑変性症、ならびに慢性関節リウマ
チ、潰瘍性大腸炎および変形性関節症などの炎症関連疾患などであるが、これら
に限るわけではない）を処置する遺伝子プロドラッグ活性化治療の方法を提供す
る。
【００６３】 添付の図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
【００６４】 （実施例） 以下の実施例に関して本発明をさらに詳しく説明するが、以下の実施例は決し
て本願発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】 この実施例では本発明方法の原理を証拠立てるために計画されたインビトロ研
究について説明する。この研究はヒト臍静脈上皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を使って行
う。この実施例の場合、プロドラッグはイホスファミドであり、プロドラッグ代
謝遺伝子はチトクロムＰ４５０ ２Ｂ１（ＣＹＰ２Ｂ１）遺伝子である。
【００６６】 第一段階では、アデノウイルスによる遺伝子導入を目的とする、ＣＹＰ２Ｂ１
遺伝子を発現させるアデノウイルスベクターの構築、試験および検証について説
明し、第二段階では、増殖に対する作用（生物活性）の解析方法を説明する。
【００６７】 アデノウイルスＣＹＰ２Ｂ１遺伝子の構築、試験および検証 ＣＹＰ２Ｂ１遺伝子を含有するプラスミドｐｃ３／２Ｂ１（図１Ａ参照）を制
限酵素ＳｐｅＩおよびＳｍａＩで消化し、１５８４ｂｐの２Ｂ１断片をアガロー
スゲルから精製した。ＣＭＶプロモーターを含有するベクターｐＣＭＶｍＡＢ（
図１Ｂ参照）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、６６４５ｂｐの線
状ｐＣＭＶ１０断片をアガロースゲルから精製した。このベクターと、プラスミ
ドｐｃ３／２Ｂ１由来のＣＹＰ２Ｂ１インサートとを、１：１〜１：３および１
：５のモル比で連結することにより、ＣＹＰ２Ｂ１およびＣＭＶプロモーターお
よびアデノウイルス構造遺伝子を含有するウイルスベクターｐＣＭＶｃｙｐ２Ｂ
１を得た（図１Ｃ参照）。
【００６８】 別途、精製工程数を最小限に抑えることによって成功率を増加させるために、
ｐｃ３／２Ｂ１をＰｖｕＩＩおよびＮｄｅＩで追加消化することによって、干渉
する主鎖平滑末端／ＳｐｅＩ断片を破壊し、プラスミドｐＣＭＶｍＡＢをＢｇｌ
ＩＩおよびＳａｎＤＩで追加消化することによって、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ ｍ
ＡＢインサートを破壊した。このＤＮＡ断片混合物を精製カラムを使って精製し
、上記と同じ比率で連結した。
【００６９】 １０ｃｍ2ウェルに入った細胞密度約２００，０００細胞／ｃｍ2のヒト胚網膜
芽細胞（ＨＥＲ９１１細胞）［Ｗａｔｚｌｉｋら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
２０００，７（１），７０〜７４］に、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ
６（Ｒｏｃｈｅから入手可能）を使って、０．８μｇのシャトルベクターｐＪＭ
１７［Ａｌｉら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９４，１，３６７〜３８４；
Ｂｅｒｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８８，６，６１６〜６２４；
ＷａｎｄおよびＦｉｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９６，２，
７１４〜７１６］と０．１／０．２／０．４μｇのＰＶＵＩ線状化プラスミドｐ
ＣＭＶｃｙｐ２Ｂ１とをトランスフェクトした。
【００７０】 トランスフェクションの１０日後に、上記クローンをトランスフェクトした細
胞上に、８つの組換えプラークが現れた。これらのプラークを拾い、ＣＭＶプロ
モーターを含有するアデノウイルス５型ベクター（Ａｄ5ＣＭＶ）用のユニバー
サルプライマー： Ｃｍｖ−フォワード：５’−ａａｃｔｇｃｔｃｃｔｃａｇｔｇｇａｔｇｔｔｇ
−３’、および Ｃｍｖ−リバース：５’−ｔｃｔａｇｃａｇｃａｃｇｃｃａｔａｇｔｇａｃ−
３’ によるＰＣＲで、ＣＹＰ２Ｂ１インサートについて検査した。
【００７１】 プラークの１つ（Ａｄ5ＣＭＶ−Ｃ２Ｂ１）を、まず１０ｃｍ2ウェル、次に７
５ｃｍ2組織培養フラスコ、そして最後に５００ｃｍ2組織培養フラスコ（５本）
で増幅させた。
【００７２】 これら最終増幅工程の細胞溶解物から、塩化セシウム密度勾配超遠心分離工程
とその後の透析とによって、アデノウイルスを精製した。
【００７３】 ウイルスは小分けして−８０℃で保存した。
【００７４】 ＨＥＲ９１１細胞およびアガロース重層法を用いて４×１０10ＰＦＵ／ｍｌと
いうウイルス価が決定された。
【００７５】 全ての工程で、得られた組換えウイルスゲノムを、Ａｄ5ＣＭＶ用のユニバー
サルプライマーによるＰＣＲで、ＣＹＰ２Ｂ１インサートについて検査した。
【００７６】 導入遺伝子の発現を調べるために、ウイルス産生細胞から得た細胞溶解物をウ
ェスタンブロット解析にかけた。
【００７７】 機能的バイオアッセイ ＣＹＰ２Ｂ１導入遺伝子の生物活性を調べるために、以下のプロトコールに従
って、ヒト臍静脈上皮（ＨＵＶＥＣ）細胞［Ｊａｆｆｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ． １９７３，５２，２７４５〜２７４６］を両ウイルスクローンに感
染させ、プロドラッグであるホロキサン（Ｈｏｌｏｘａｎ）（イホスファミド）
で処理した。
【００７８】 ２日目に、０〜２×１０8ＰＦＵ／ｍｌの濃度で２時間にわたって、ＨＵＶＥ
Ｃ細胞をＡｄ５Ｃ２Ｂ１に感染させた。
【００７９】 ３日目に細胞を４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した（一部のウェルは
継代培養せず、４日目の細胞抽出物および培地収集のためにとっておいた）。
【００８０】 ４日目に、イホスファミドを０〜０．５ｍＭの濃度で加えた。ＨＵＶＥＣ細胞
は、ゼラチンコート組織培養皿上、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒト血清、１０％
（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ新生仔血清（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ）、５Ｕ／ｍＬ
のヘパリン（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａ ＢＶ）、１５０ｍｇ／ｍＬの粗製ＥＣ増殖
因子（ＴＮＯ−ＰＧ（ライデン））、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００
ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ）を添加した培地
１９９（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ）で生育させた。細胞は５％（ｖ／ｖ）ＣＯ 2 を含む湿潤雰囲気下に３７℃で生育させた。
【００８１】 ８日目にクリスタルバイオレット染色および光学密度の測定によって細胞数を
決定した。
【００８２】 ウイルス感染およびプロドラッグ処置の効果を定量するために、細胞数を上述
のように決定した。
【００８３】 結果を下記表１に示す。この結果から、最大濃度０．５ｎＭのイホスファミド
で処置したＣＹＰ２Ｂ１トランスフェクト内皮細胞では、賦形剤で処置した非ト
ランスフェクト細胞と比較して約８０％阻害されたことがわかる。
【００８４】 [表１] 内皮細胞増殖 細胞数とウイルス濃度（トランスフェクション）［０、１．２５×１０7、２
．５×１０7、５×１０7、１×１０8および２×１０8ＰＦＵ／ｍｌ］およびプロ
ドラッグ（イホスファミド）濃度［０、０．０６２５、０．１２５、０．２５お
よび０．５ｍＭ］との関係 ┌─────────────────┬────────────────┐ │ 細胞数 │ イホスファミド濃度(mM) │ │ │ │ ├─────┬─────┬─────┼─────┬─────┬────┤ │ ウイルス濃度 │ 0 │ 0.0625 │ 0.125 │ 0.25 │ 0.50 │ │(PUF/ml) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │ 0 │ 140000 │ 152000 │ 151600 │ 152500 │ 116000 │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │1.25×107 │ 110000 │ 98000 │ 110000 │ 102000 │ 85000 │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │2.5×107 │ 80000 │ 88000 │ 85000 │ 79200 │ 56000 │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │ 5×107 │ 94000 │ 87000 │ 85000 │ 75000 │ 55000 │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │ 1×108 │ 78000 │ 80500 │ 63600 │ 66000 │ 38500 │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤ │ 2×108 │ 73000 │ 60000 │ 54000 │ 53000 │ 30000 │ │ │ │ │ │ │ │ └─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴────┘
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ＣＹＰ２Ｂ１遺伝子を含有するプラスミドｐｃ３／２Ｂ１の地図を示す。
【図１Ｂ】 ＣＭＶプロモーターを含有するベクターｐＣＭＶｍＡＢの地図を示す。
【図１Ｃ】ＣＹＰ２Ｂ１遺伝子とＣＭＶプロモーターとを含有するウイルス
ベクターｐＣＭＶｃｙｐ２Ｂ１の地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/09 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA03 DA20 EA02 FA02 GA11 HA20 4B065 AA26Y AA95X AA95Y AA97X AB01 AC20 BA02 CA44 4C084 AA13 BA35 CA53 CA56 MA05 NA14 NA15 ZB261 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 BC83 NA14 NA15 ZB26

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロドラッグに対する内皮細胞の感受性を高める方法であっ
    て、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわち前記プロドラッグの（細胞毒性）
    薬物への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）前記内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択
    的に促進することができるプロモーターと を含むポリヌクレオチドを、前記内皮細胞にトランスフェクトする工程、 および （ｉｉ）前記プロドラッグを前記内皮細胞に送達する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
    ドラッグに対する感受性よりも高い方法。
  2. 【請求項２】 前記プロモーターが、 ビトロネクチン受容体αサブユニット（αｖ）遺伝子プロモーター、 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体遺伝子プロモーター、 β３インテグリン遺伝子プロモーター、 血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）遺伝子プロモーター、または アンジオポエチン２遺伝子プロモーターである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 プロドラッグがイホスファミドであり、かつプロドラッグ代
    謝遺伝子がＣＹＰ２Ｂ１であるか、 プロドラッグがガンシクロビルであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が単純疱
    疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であるか、 プロドラッグが６−チオキサンチンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が大
    腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ
    ）６ｐｔであるか、または プロドラッグが５−フルオロシトシンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が
    シトシンデアミダーゼである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 作動可能な形で結合したプロモーターとプロドラッグ代謝遺
    伝子とを含む組換えウイルスベクターであって、プロモーターが内皮細胞におけ
    るプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に促進する能力を持つことを
    特徴とする組換えウイルスベクター。
  5. 【請求項５】 前記プロモーターが、 ビトロネクチン受容体αサブユニット（αｖ）遺伝子プロモーター、 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体遺伝子プロモーター、 β３インテグリン遺伝子プロモーター、 血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）遺伝子プロモーター、または アンジオポエチン２遺伝子プロモーターである、請求項４に記載の組換えウイ
    ルスベクター。
  6. 【請求項６】 プロドラッグがイホスファミドであり、かつプロドラッグ代
    謝遺伝子がＣＹＰ２Ｂ１であるか、 プロドラッグがガンシクロビルであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が単純疱
    疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であるか、 プロドラッグが６−チオキサンチンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が大
    腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ
    ）６ｐｔであるか、または プロドラッグが５−フルオロシトシンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が
    シトシンデアミダーゼである、請求項４に記載の組換えウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまた
    は複製欠損レトロウイルスベクターである、請求項４から６のいずれか一項に記
    載の組換えウイルスベクター。
  8. 【請求項８】 対象における腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、 （ｉ）作動可能な形で結合した （ａ）プロドラッグ代謝遺伝子、すなわちプロドラッグの（細胞毒性）薬物
    への変換を促進する酵素をコードするヌクレオチド配列と、 （ｂ）内皮細胞におけるプロドラッグ代謝遺伝子の転写（発現）を選択的に
    促進することができるプロモーターと を含む、内皮細胞への形質導入能を持つ組換えウイルスベクターを、前記対象
    に導入する工程、 および （ｉｉ）前記対象に前記プロドラッグを導入する工程 を含み、かつ前記内皮細胞の前記（細胞毒性）薬物に対する感受性が前記プロ
    ドラッグに対する感受性よりも高い方法。
  9. 【請求項９】 前記プロモーターが、 ビトロネクチン受容体αサブユニット（αｖ）遺伝子プロモーター、 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体遺伝子プロモーター、 β３インテグリン遺伝子プロモーター、 血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）遺伝子プロモーター、または アンジオポエチン２遺伝子プロモーターである、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 プロドラッグがイホスファミドであり、かつプロドラッグ
    代謝遺伝子がＣＹＰ２Ｂ１であるか、 プロドラッグがガンシクロビルであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が単純疱
    疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であるか、 プロドラッグが６−チオキサンチンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が大
    腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（大腸菌ｘｇｐｔ
    ）６ｐｔであるか、または プロドラッグが５−フルオロシトシンであり、かつプロドラッグ代謝遺伝子が
    シトシンデアミダーゼである、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴
    ウイルスベクター、または複製欠損レトロウイルスベクターである、請求項８か
    ら１０のいずれか一項に記載の方法。
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