JP2001521387A - アポトーシス誘発タンパク質ｖｐ２および／またはアポプチンを発現する遺伝子伝達体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアポトーシス誘発タンパク質ＶＰ２および/またはアポプチン（ＶＰ３）様活性をエンコードする核酸分子を含む遺伝子伝達体に関する。ＶＰ２およびＶＰ３はニワトリ貧血症ウイルスのタンパク質である。また、本発明は抗腫瘍治療法に関する。本発明の遺伝子伝達体により種々のヒト腫瘍細胞を感染させると腫瘍細胞にアポトーシスを誘発するが、正常な二倍体非形質転換/非悪性腫瘍細胞ではアポトーシスが起こるとしても非常に減少したものである。また、本発明は癌の診断および、過形成、形成異常もしくはジスプラジーの関連形状の診断に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アポトーシス誘発タンパク質ＶＰ２および/またはアポプチンを発現する遺伝 子伝達体 本発明はアポトーシス誘発タンパク質ＶＰ２および/またはアポプチン（ＶＰ ３）様活性をエンコードする核酸分子を含んで成る遺伝子伝達体に関する。 また、本発明は抗腫瘍治療および癌診断に関する。種々のヒト腫瘍細胞に本発 明の遺伝子伝達体を感染させると、腫瘍細胞にはアポトーシスを誘発し、正常な 二倍体の非形質転換/非悪性腫瘍細胞にはもしあったとしてもアポトーシスの誘 発は非常にわずかである。 In vitroではニワトリの形質転換細胞においてニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡ Ｖ）誘導タンパク質アポプチン（ＶＰ３）を発現するとアポトーシスを誘発する (ノートボーン（Noteborn）ら，１９９４，ノートボーン（Noteborn）およびコ ッホ(Koch)，１９９５)。アポトーシスは細胞の縮小、核分断、ＤＮＡのドメイ ンサイズフラグメントへの縮合および切断、次いで殆どの細胞でのヌクレオソー ム間での分解により特徴づけられる。最終的に、アポトーシス細胞は膜封入アポ トーシス体に分解し、近隣細胞により急速に食作用を受ける。それ故、アポトー シスは非生理型の細胞死である壊死程に組織破壊を引起こすものではない(ウイ リー（Wyllie）ら，１９８０，アレンズ（Arends）およびウイリー，１９９１， およびホワイト(White)，１９９６)。 アポプチンはわずか１２１アミノ酸鎖長の小タンパク質であり、むしろ塩基性 で、プロリン、セリンおよびスレオニンに富むものである(ノートボーン（Noteb orn）ら，１９９１)。分析した形質転換ニワトリ細胞では、そのすべてがアポプ チン誘発のアポトーシスを受けるが、アポプチンは細胞核内に厳密に収まってい る。アポプチンのＣ−末端塩基性伸長部分を切断すると核内存在が減少し、アポ トーシス活性が有意に減少する(ノートボーン（Noteborn）ら，１９９４)。 アポプチンおよび他のアポプチン様活性を有するタンパク質はまた、ヒトの悪 性形質転換細胞系でアポトーシスを誘発するが、ヒト非形質転換細胞系では誘発 しない。我々が確立したことは、アポプチン誘発アポトーシスが機能的ｐ５３の 不存在下に起こり(ツアン（Zhuang）ら，１９９５a)、Ｂｃｌ−２、ＢＣＲ−Ａ ＢＬ(ツアン（Zhuang）ら，１９９５)、Ｂｃｌ−２−関与タンパク質ＢＡＧ−１ およびウシポックスタンパク質ＣｒｍＡ（ノートボーン(Noteborn)，１９９６） では阻止し得ないことである。In vitroでは、アポプチンは正常のリンパ系、皮 膚、表皮性、内皮性および平滑筋細胞のプログラムされた細胞死を誘発し得ない 。しかし、正常細胞が形質転換されると、その細胞はアポプチンまたはアポプチ ン様活性を有する他のタンパク質によりアポトーシスを受け易くなる。正常なヒ ト線維芽細胞にアポプチンを長期間発現させて明らかになったことは、アポプチ ンはこれらの細胞において毒性あるいは形質転換活性を示さないことである。正 常細胞において、アポプチンは細胞質に優位に見出されるが、一方、形質転換ま たは悪性腫瘍細胞、すなわち、過形成、形成異常またはジスプラジーにより特徴 づけられる細胞では、それが核内に局在し、アポプチンの局在化がその活性に関 係していることを示唆している(ダネン−バン・オーショット(Danen-Van Oorscho t)ら，１９９７，ノートボーン(Noteborn)，１９９６)。 アポトーシスは不必要な、変化を受けた、あるいは悪性腫瘍細胞を除去する活 動的でプログラムされた生理的過程である(イアーンショウ(Earnshaw)，１９９ ５)。アポトーシスの過程は種々の制御刺激により開始される(ウイリー(Wyllie) ，１９９５，およびホワイト(White)，１９９６)。細胞生存率の変化はヒトの病 気の発生機序、例えば、癌の成長、これは細胞の増殖高揚のみならず細胞死の減 少によっても起こるが、この機序において重要な役割を演じる(カー（Kerr）ら ，１９９４)。様々な化学療法化合物および放射線照射が、多くの場合、野生型 ｐ５３を介して腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することが証明されている(トン プソン(Thompson)，１９９５，ベラミー(Bellamy)ら，１９９５，ステラー(Stel ler)，１９９５)。 しかし、多くの腫瘍は癌治療に応答し難いこととしばしば相関して、その成長 の間にｐ５３の突然変異を獲得とする(フーパー(Hooper)，１９９４)。数種の （白血病性）腫瘍では、プロト癌遺伝子Ｂｃｌ−２の高い発現レベルが、種々の アポトーシス誘発性化学療法剤に強く抵抗することと関係している(ホッケンベ リー(Hockenberry)，１９９４,カー(Kerr)ら，１９９４,およびザッハス(Sachs) およびローテム(Lotem)，１９９３)。 それ故、アポプチンは、機能的ｐ５３の欠如およびＢｃｌ−２あるいは他のア ポトーシス阻害剤の（過剰）発現により、アポトーシスの（化学）治療誘発に抵 抗するようになった腫瘍細胞あるいは過形成、形成異常またはジスプラジーによ り特徴づけられる他の細胞を破壊するための有力候補となり得る。アポプチンが 正常非形質転換ヒト細胞において、少なくともin vitroではアポトーシスを誘発 しないという事実は、アポプチンin vivo処理の毒性影響が非常に低いことを示 唆する。 しかし、これまで、腫瘍細胞中のアポプチンの発現は組織培養細胞の一過性ト ランスフェクションを用い実施している。この発現法の不利益は、in vitroの状 況下でアポプチンを発現する細胞の割合が非常に低いことである。In vivoでは 用いたトランスフェクション法が少しは可能であったとしてもやっかいであるば かりでなく、有効な癌治療にはなんら寄与するものではない。 アデノウイルスはヒトのアデノウイルス（Ａｄ）から誘導し得るが、これは非 包膜正二十面体のＤＮＡウイルスである。このゲノムは逆方向末端反復を有する 約３６ｋｂの直線二重鎖ＤＮＡ分子からなる(ホルビッツ(Horvitz)，１９９０) 。ベクター開発に用いられている血清型（Ａｄ２およびＡｄ５）は重症のヒト病 因とは関係していない(ホルビッツ(Horvitz)，１９９０)。該ウイルスはそのＤ ＮＡを宿主細胞に導入するのに非常に有効である。Ａｄは広範な種の多様な分裂 および非分裂細胞に感染可能であり、該ウイルスを比較的簡単に大量に産生し得 る。レトロウイルスと対照的に、Ａｄは宿主細胞のゲノムに集積しない。現在使 用されているすべてのｒＡｄＶはＥ１領域に欠失を有し、そこに新たなＤＮＡを 導入し得る。Ｅ１欠失は組換えウイルスを複製能欠損とする(ストラットフォー ド−ペリカウデット（Stratford-Perricaudet）およびペリカウデット(Perricau det)，１９９１)。一方、このものは本質的に安全な特徴を提供する;ｒＡｄＶは Ｅ１Ａ タンパク質の不存在下ヒト細胞上で複製することができない。かくして、ｒＡｄ Ｖはその遺伝子情報をヒトの細胞に伝達することができるが、このものでは溶菌 性もしくは有効な感染に至ることはない。他方、これはこれらベクターの生産に ついての問題を提起する。しかし、Ｅ１機能は必ずしもベクターそのものによっ てエンコードされている必要はない。それらはまた、トランスで、特定のヘルパ ー細胞中に提供することができ、Ｅ１遺伝子を発現する。これらのヘルパー細胞 をＥ１−欠失Ａｄベクターで感染させること、あるいはトランスフェクションす ることにより、細胞性Ｅ１タンパク質がｒＡｄＶの複製を補完し、それが後代ｒ ＡｄＶの産生に至らしめる。Ａｄヘルパー細胞はヒト起源のものでなけれはなら ず、それらはＡｄＥ１領域、すなわち、Ａｄ−形質転換ヒト細胞、例えば、細胞 系２９３(グラハム（Graham）およびプレベック(Prevec)，１９９１)、９１１細 胞系（ファロウ（Fallaux）ら，１９９６）およびＰＥＲ．Ｃ６細胞系（ファロ ウ(Fallaux)，１９９６）を含み発現する。 本発明は抗腫瘍剤アポプチンまたはアポプチン様活性を有する他のタンパク質 の特徴を使用することを可能とする遺伝子伝達体（またはベクター）をここに提 供するものであり、該伝達体は遺伝子療法を利用する癌治療、あるいは過形成、 形成異常またはジスプラジーにより特徴づけられる悪性腫瘍の治療に有用である 。かかる遺伝子伝達体は独立した感染性ベクターであり、例えばウイルス、リポ ソーム、ポリマーなどであって、それ自身で感染し得るか、あるいは他の方法で 遺伝子情報を例えば治療可能な腫瘍細胞に伝達し得るものである。遺伝子情報と はアポプチン様活性をエンコードする核酸分子を含む。また、本発明はアポプチ ン様活性を発現する能力の著しく増大した遺伝子伝達体を提供する。驚くべきこ とに、翻訳開始部位内に位置し、アポプチン様タンパク質のコード配列に先行す る上流の非コード核酸配列を変化させると、腫瘍細胞内の前記タンパク質の発現 が著しく増強されることが判明した。また、本発明はＶＰ２様活性をエンコード する核酸を含んで成る遺伝子伝達体をも提供する。ＶＰ２様活性は、驚くべきこ とに、腫瘍細胞においてアポトーシスの誘発に関わるアポプチン様活性と相乗的 に作用することが示され、ＶＰ２様タンパク質はそれ自身で、例えばアポトーシ ス の（化学）療法誘発に相乗的に、あるいは相加的に作用し得る。本発明はアポプ チン様活性をエンコードする核酸分子を含むことに加えて、ＶＰ２様活性をエン コードする核酸を含む遺伝子伝達体を提供する。本発明により提供されるのは、 例えば、ウイルスである本発明による遺伝子伝達体である。さらに、本発明はそ れ自身では複製能を欠くウイルスであるが、ヘルパーまたはパッケージング細胞 中では複製して後代の遺伝子伝達体を産生することのできる遺伝子伝達体を提供 する。このように本発明により提供される遺伝子伝達体は、例えば、アデノウイ ルスまたはレトロウイルスであるか、伝達体として用い得る他のＤＮＡもしくは ＲＮＡ組換えウイルスであるか、またはプラスモウイルスであってもよい。さら に、本発明は特異的リガンドまたは１個もしくは複数個の標的分子をさらに補足 することにより、遺伝子伝達体がその遺伝子情報を選択した標的細胞に特異的に 伝達し得るようにした遺伝子伝達体を提供する。かかる標的分子は、腫瘍細胞表 面レセプターもしくはタンパク質と反応し得る、例えば、ウイルススパイクタン パク質またはレセプター分子または抗体であってもよい。 また、本発明は診断、すなわち癌の診断に使用し得る遺伝子伝達体を提供する 。かかる遺伝子伝達体は、すなわち、in vitroの診断に使用し得るものであって 、この場合、組織もしくは細胞標本もしくは生検組織をヒトまたは動物から採取 する。かかる標本は、次いでアポプチン様活性を発現することのできる前記遺伝 子伝達体で直接もしくは培地中感染させることにより評価するかあるいは試験し 得る。形質転換細胞、または過形成、ジスプラジーもしくは形成異常の種々の段 階を表出する細胞、または腫瘍もしくは癌細胞のみがその核内にアポプチン様活 性保持タンパク質を発現する。前記タンパク質の存在は、すなわち、古典的な（ 免疫）組織化学的技術、すなわち、顕微鏡下に、あるいは自動細胞選別技術によ り証明することができる。あるいは上記の感染細胞をアポトーシスにより特性化 し、かくしてアポトーシスの既知の特性に基づき診断することができる。 さらに本発明は、アポトーシス誘発剤アポプチンを発現する組換え複製能欠損 アデノウイルスを構築するために必要とするすべての工程を提供もしくは記載す る。力価の高い組換えアポプチン・アデノウイルスは、アデノウイルスパッケー ジング細胞系、例えば、２９３、９１１およびＰＥＲ．Ｃ６により産生させるこ とができる。アポプチンは必要とするアデノウイルス複製のすべての工程に、ま た、細胞培養条件下での他のアデノウイルスライフサイクル事象に、検出し得る 否定的な影響を示さない。 さらに本発明では対照組換えアデノウイルスの構築について記載するが、この ウイルスは組換えアポプチン・アデノウイルスとしての全配列を含むが、アポプ チンのエンコード配列が制御プロモーター要素の制御下３'−５'配向にあるため 、アポプチンを発現することができない。この対照アデノウイルスベクターによ り、組換えアデノウイルスによるアポプチン発現の特異的影響を試験することが できる。 組換え複製能欠損アデノウイルスは種々の腫瘍および/または形質転換細胞に おいて大量のアポプチンを発現し、アポトーシスを誘発するに至る。それに対し て、正常の非形質転換ヒト細胞でのアポプチン発現は、組換えアデノウイルスに よってはアポプチン誘発アポトーシスの誘発には至らない。 特に、本発明は抗腫瘍治療法に関する。腫瘍（細胞）の治療は、アポプチン様 活性を有するタンパク質のコード配列を含むアデノウイルスベクターなどの遺伝 子伝達体で（腫瘍）細胞を感染させることによるアポプチンの発現により行われ る。したがって、本発明は非常に有力な抗腫瘍剤であるアポプチンを発現するア デノウイルスなどの遺伝子伝達体を提供する。アデノウイルスのアポプチン制御 は正常細胞においてアポトーシスを誘発しないか、少なくとも検出し得る程には 誘発せず、このことは組換えアポプチン・アデノウイルスでのin vivo処理にお いて毒性が低いことを物語っている。組換えアポプチン・アデノウイルス感染に より相当に大量のアポプチン発現（腫瘍）細胞を入手し得る。この知見はＤＮＡ トランスフェクションに比べてアポプチン発現の主要な改善である。 また、本発明はアポプチンおよび/またはアポプチンの一部の合成なしにＶＰ ２発現単位を構築することに関する。さらに、我々はニワトリ貧血症ウイルス（ ＣＡＶ）タンパク質ＶＰ２の発現が、ヒトの腫瘍細胞においてアポプチン誘発ア ポトーシスを増強するという証拠を提供した。より正確には、ＶＰ２とアポプチ ン が腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発に関して相乗的に作用する。この知見は ＶＰ２とアポプチンの同時発現がアポプチンベースの療法の改善につながること を示している。 本発明はＡＴＧ−開始コドンの直上流配列を変化させることにより、アポプチ ン発現が有意に改善されることを記載する。コザック（KOZAK）規則により予測 されるように、発現の改善はアポプチンタンパク質のアミノ酸変更を必要としな い。他のＣＡＶタンパク質のＡＴＧ−開始コドンの上流配列を改善すると、その 合成の改善にも至る。 また、本発明はレトロウイルスベクターの構築にも関するが、該ベクターはヒ トの腫瘍細胞でアポプチンを発現してアポトーシスを誘発する。組換えアポプチ ン・レトロウイルスでのこの結果は、組換えアポプチン・アデノウイルスのデー タと組合わせると、アポプチンの発現がＤＮＡ−およびＲＮＡ−ウイルスの複製 にとって有害ではないことを示している。 （腫瘍）細胞でのアポプチンの発現は、アデノウイルスもしくはレトロウイル スベクターの他に、アポプチンのコード配列を含む、他のＤＮＡおよび/または ＲＮＡウイルスベクターで細胞を感染させることによっても行われる。さらに、 ウイルス誘導ベクター系、例えば、プラスモウイルスなどを腫瘍細胞中でアポプ チン誘発アポトーシスの誘発に使用することができる。 本発明を以下の実験の部に基づきさらに詳細に説明する。これは説明を目的と するだけのものであって、保護の範囲を制限するものと解釈すべきものではない 。 実験の部細胞および細胞培養条件 Ａｄ５ Ｅ１−形質転換ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ；２９３）およびヒト胎児性 網膜（ＨＥＲ；９１１およびＰＥＲ．Ｃ６）の細胞系を、１０％子ウシ血清（Ｆ ＣＳ）添加ダルベッコ（Dulbecco）改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ₂ 気流下に３７℃で生育させた。細胞系２９３はアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）から入手した。細胞系９１１および ＰＥＲ．Ｃ６はファロー（Fallaux）ら（１９９６）から入手した。細胞培養培 地、 試薬類、および血清類はギブコ(GIBCO)・ラボラトリー（Grand Island，NY）か 購入した。 ヒトの表皮ケラチン細胞は包皮から単離し、１３７−Ｃｓを致死量照射したマ ウス３Ｔ３線維芽細胞の表層存在下に生育させた。ケラチン細胞の一次培養（Ｆ ＳＫ−１）は若干の改良を加えた、記載どおりの完全培地（ラインワルト（Rhei nwald）およびグリーン(Green)，１９７５）中で開始した。 偏平細胞癌から誘導した腫瘍化ケラチン細胞、ＳＣＣ−１５細胞（ラインワル ト（Rheinwald）およびベケット(Beckett)，１９８１）は、５％子ウシ血清、０ ．４μｇのハイドロコーチゾンおよび１μＭイソプロテレノールを含有するＤＭ ＥＭ/Ｆ１２(３：１)培地中培養した。ヒト肝癌誘導ＨｅｐＧ２細胞(アデン(Ade n)ら，１９７９)およびヒト骨肉腫誘導Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２細胞（ディ ラー（Diller）ら，１９９０）は１０％子ウシ血清添加ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ ＢＲＬ）中で生育させた。同時に形質転換したケラチン細胞株ＨａＣａＴ(ブー カンプ(Boukamp)ら，１９８８)はＤｒ．フューゼニッヒ教授(Prof．Dr．R．Fuse nig，DKFZ，Heidelberg，Germany)から恵与頂いた。ＨａＣＡＴ細胞は１０％子 ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で生育させた。 マウス細胞系は高濃度グルコース（４．５ｇ/Ｌ）および１０％子ウシ血清含 有ダルベッコ改良イーグル培地中、５％ＣＯ₂気流下３７℃で培養した。エコト ロピック・パッケージング細胞系Ｐｓｉ−２（マン（Mann）ら，１９８３）およ びアンホトロピック・パッケージング細胞系ＰＡ３１７は既に記載されている( ミラー(Miller)，１９９０a，b)。ウイルス技術 プラーク検定は既に記載のとおりに実施した(ファロー（Fallaux）ら，１９９ ６)。簡単には、アデノウイルス原液を２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ２ｍｌで系列 希釈し、６穴プレート中の略融合した９１１細胞に添加した。３７℃２時間のイ ンキュベーションの後、培地を０．８５％アガロース(シグマ(Sigma)，USA)、２ ０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．４)、１２．３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．００２５％Ｌ −グルタミンおよび２％ウマ血清（５６℃３０分間加熱不活性化）含有Ｆ−１５ 最少必須培地（ＭＥＭ）に置き換えた。 アデノウイルス・ロットの小規模生産をすでに記載のとおりに実施した(ファ ロー（Fallaux）ら，１９９６)。簡単には、略融合した９１１細胞またはＰＥＲ ．Ｃ６の単層に、１％ウマ血清含有リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中、細胞当たり 約５プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．＿ｓ）で感染させた。室温１時間後、接種 物を新しい培地（ＤＭＥＭ/２％ウマ血清）で置き換えた。４８時間後、略完全 に分離した細胞を採取し、ＰＢＳ/１％ウマ血清１ml中に集めた。ウイルスは３ 回のフラッシュ凍結/融解により産生細胞から単離した。溶解物を３０００ｒｐ ｍ１０分間の遠心により清澄とし、−２０℃に保存した。 ９１１およびＰＥＲ．Ｃ６産生ｒＡｄＶ原液を組換え−適格アデノウイルスに ついてスクリーニングするに際し、Ａｄ５ＩＴＲ領域（５＿−ＧＧＧＴＧＧＡＧ ＴＴＴＧＴＧＡＣＧＴＧ−３＿）およびＥ１Ａエンコード領域（５＿−ＴＣＧＴ ＧＡＡＧＧＧＴＡＧＧＴＧＧＴＴＣ−３＿）から誘導されるプライマーにより( ノートボーン（Noteborn）およびデ・ボアー（DeBoer）(１９９５)記載)、パー キン・エルマーＰＣＲ装置を使用してＰＣＲ分析を実施した。６００ｂｐの増幅 フラグメントの存在は、複製−適格（Ｅ１領域含有）アデノウイルスが、分析し たウイルス原液に存在する（ヘーベン(Hoeben)，未公表結果）か、ＨｅｐＧ２細 胞がｒＡｄＶバッチにより感染して存在することを意味する。少なくとも１０日 間、該細胞を細胞病原性の影響について、Ｅ１Ａタンパク質に対する特異モノク ローナル抗血清を用い、間接免疫蛍光法によりモニターした。プラスミドおよびＤＮＡトランスフェクション アダプタープラスミドｐＭａｄ５をｐＭＬＰ１０（レブレルノ（Levrerno）ら ，１９９１）から以下に記載のとおり構築した。プラスミドｐＭＬＰ−１０−ｌ ｉｎは、制限エンドヌクレアーゼ ＭｌｕＩ、ＳｐｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐＩ、 ＡｓｕＩＩ、およびＭｕｎＩに対するユニーク部位をもつ合成ＤＮＡフラグメン トをｐＭＬＰ１０のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによってｐＭＬＰ１０か ら誘導した。Ａｄ５ゲノムのｎｔ３３２８ないし８９１４に及ぶアデノウイルス Ｂ ｇｌＩＩフラグメントをｐＭＬＰ−ｌｉｎのＭｕｎＩ部位に挿入した。得られる プラスミドからＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを削除し、テトラサイクリン 抵抗遺伝子を不活性化した。得られるプラスミドを制限酵素分析により照査して ｐＭａｄ５と命名した。多重クローニング部位に挿入した遺伝子の発現はアデノ ウイルス主要後期プロモーターによりドライブされるが、この立体配置において 該プロモーターはアデノウイルス即時型遺伝子１(E1)エンハンサーに結合してい る。 ＣＡＶ ＤＮＡ配列はすべて、当初、プラスミドｐＩｃ−２０Ｈ／ＣＡＶ−Ｅ ｃｏＲＩから誘導される(ノートボーン（Noteborn）およびデ・ボアー(DeBoer) ，１９９０)。以前ｐＣＭＶ−ＶＰ３と呼ばれていた発現プラスミドｐＣＭＶ− ｆｓ（ノートボーン（Noteborn）ら，１９９４）はアポプチンをもっぱらエンコ ードするＣＡＶ ＤＮＡ配列を含んでいる(ｎｔ４２７〜８６８)。 プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２ｍｕ（ノートボーン(Noteborn)，未発表結果）は ３８０〜１５１２位のＣＡＶ ＤＮＡ配列を含む。このＣＡＶ ＤＮＡフラグメン トは、２５ｂｐの５'−非コードおよび４８４ｂｐの３'−非コードＣＡＶ ＤＮ Ａ配列が両面を接するＶＰ２のコード領域を含む。ＶＰ２の開始コドンの下流１ ０６ｂｐにはアポプチンの開始コドンがもう一つの読取り枠内に位置している。 ＶＰ２の合成を妨げることなしにアポプチンの合成を防止するために、アポプチ ン開始コドン（ＡＴＧをＡＣＧに変更した）に突然変異を導入し、さらに５４９ 位に点突然変異（ＴをＡに変更した）を導入すると、アポプチンをコードする遺 伝子内の特別停止コドンとなった。それ故、挿入したＣＡＶ配列はＶＰ２タンパ ク質全長を発現するのみとなる。間接免疫蛍光法が示したことは、ＶＰ２は産生 されるが、アポプチンは合成されないということであった。 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのクローニングに際して、我々はプラスミドｐ ＣＲ−３．１を用いたが、これはインビトロジェン（Carlsbad，CA）から市販品 として購入した。組換えアポプチン複製能欠損レトロウイルスの構築のために、 レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮを用いた(ミラー(Miller)，１９９０a,b)。 プラスミドＤＮＡでのすべてのクローニング工程は原則としてマニアティス （Maniatis）ら（１９９２）の方法に従って実施した。 使用した酵素はすべてベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim，Ger many）および/またはバイオラボ（BioLabs,USA）から市販品として入手した。 プラスミドＤＮＡはＣｓＣｌ勾配での遠心分離およびセファクリルＳ５００で のカラムクロマトグラフィー（Pharmacia，Uppsala，Sweden）により精製した。 ヒト細胞系ＨａＣＡＴ、ＨｅｐＧ２、ＳＣＣ−１５、２９３、９１１、およびＰ ＥＲ．Ｃ６にはグラハムおよびバン・デル・エブ（Graham and Vander Eb）(１ ９７３)記載どおりのリン酸カルシウム沈殿法によりプラスミドＤＮＡを移入し た。正常ヒト二倍体ケラチン細胞(ＦＳＫ−１；第二継代)、Ｕ２ＯＳおよびＳａ ｏｓ−２細胞にはＤＯＴＡＰ（フィッシャー（Fischer）ら，１９９６）を移入 した。間接免疫蛍光検定 細胞を８０％アセトンで固定し、ＣＡＶ−特異またはアデノウイルスＥ１Ａ− 特異モノクローナル抗体および蛍光体と結合したヤギ抗マウスおよび/またはヤ ギ抗ウサギＩｇＣ（Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.，West Grove P A）による免疫蛍光検定に用いた(ノートボーン（Noteborn）ら（１９９０）の記 載どおり)。核のＤＮＡは２，４−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ Ｉ）または沃化プロピジウム（ＰＩ）により染色した。 結果と考察アダプター・ベクターｐＭａｂの構築 アダプター・プラスミドｐＭＡｄ５にＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入するため に、制限酵素ＣｌａＩで消化し、子ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理した 。ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩリンカーをＴ４−キナーゼで処理し、Ｔ４−ＤＮＡリガ ーゼを用い、次いでＣｌａＩ消化によりそれ自体に連結した。ＣｌａＩ／Ｂａｍ ＨＩ／ＣｌａＩリンカーを単離し、直線化したｐＭａｄ５ベクターに連結した。 バクテリア株ＪＭ１０９をこの連結産物により形質転換した。 制限酵素消化により最終ベクターｐＭａｂを特性化した。このｐＭａｂベクタ ーにより、アデノウイルス主要後期プロモーターの制御下、外来遺伝子をユニー クＢａｍＨＩ部位に連結することができる。図１はｐＭａｄ５およびｐＭａｂの 図式表現を示す。組換えアポプチンおよび制御アダプター・ベクターの構築 アポプチン遺伝子をアデノウイルスに導入するためのアダプター・ベクターを 構築するために、ｐＭａｂをＢａｍＨＩで処理し、次いで子ウシ腸管ホスファタ ーゼで処理した。次いで、ｐＣＭＶ−ｆｓをＢａｍＨＩで処理し、アポプチン− エンコード配列を含む０．４５ｋｂ ＤＮＡフラグメントを単離した。アポプチ ンＤＮＡフラグメントを、直線化したｐＭａｂアダプター・ベクターのＢａｍＨ Ｉ部位に連結した。連結産物をバクテリア株ＪＭ１０９にクローン化した。ｐＭ ａｂ中のアポプチンの配向を制限酵素分析により決定した。 アデノウイルス主要後期プロモーターの制御下、５'−３'配向にアポプチン遺 伝子を含むｐＭａｂ構築物はアポプチン遺伝子を発現する。このアダプター・ベ クターをｐＭａｂ−ＶＰ３と呼称し、アポプチン発現アデノウイルスベクターの 生成に使用する。アデノウイルス主要後期プロモーターの下流、３'−５'配向に アポプチン−エンコード配列を含むｐＭａｂＤＮＡプラスミドはアポプチンを発 現し得ず、対照組換えアデノウイルスベクターの作製に用いる。図２は両方の組 換えアダプター・ベクターの図式表現を示す。アポプチン発現組換えアポプチン・アダプター・ベクターと対比したＣＭＶ−プ ラスミドによるアポトーシスの誘発 最初、我々はｐＭａｂ−ＶＰ３ ＤＮＡベクターが実際に形質転換細胞中でア ポプチンを発現することができるかどうか、また、一方でｐＭａｂ−ｃｏｎはそ うしないかを試験した。その目的のために、ヒトアデノウイルス形質転換２９３ および９１１細胞にｐＭａｂ−ＶＰ３、ｐＭａｂ−ｃｏｎ、および陽性対照とし てｐＣＭＶ−ＶＰ３を移入した。トランスフェクションの約２日後、細胞を固定 し、間接免疫蛍光検定法によりアポプチンの発現を試験した。ｐＣＭＶ−ＶＰ３ およびｐＭａｂ−ＶＰ３を移入した細胞培養物は、アポプチン特異モノクローナ ル抗体と反応する細胞を約１％含んでいた。一方、ｐＭａｂ−ｃｏｎ ＤＮＡを 移入した細胞培養物は含んでいなかった。これらの結果はｐＭａｂ−ＶＰ３がア ポプチンを発現し、ｐＭａｂ−ｃｏｎは予測どおり含んでいないことを暗示する 。 他のトランスフェクションの実験において、我々はｐＭａｂ−ＶＰ３でのトラ ンスフェクション後、９１１細胞におけるアポトーシスの誘発を分析し、ｐＣＭ Ｖ−ＶＰ３と対比した。トランスフェクションの３日後、９１１細胞を採取し、 間接免疫蛍光法によりアポプチンの発現を試験した。さらに、該細胞をＤＡＰＩ またはＰＩにて染色したが、このものは未処理ＤＮＡを強く染色するが、アポト ーシスＤＮＡは弱いか、および/または染色異常となる(テルフォード(Telford) ，１９９２)。 ｐＭａｂ−ＶＰ３を移入したアポプチン陽性９１１細胞の約６０％がアポトー シス性であり、一方、ｐＣＭＶ−ＶＰ３を移入したアポプチン陽性細胞のおよそ ４０％がアポトーシスを受けた。これらの結果はｐＭａｂ−ＶＰ３制御アポプチ ンの発現が、ｐＣＭＶ−ＶＰ３により発現されたアポプチンと比較して、アポト ーシスの誘発が同等であるか、幾分高いレベルにあることを物語っている。図３ にその結果を示す。 さらに、アポプチンはヒトのアデノウイルス形質転換細胞においてアポトーシ スを誘発することができるが、Ｅ１Ｂはアポプチンにより誘発されたアポトーシ スを阻害しない。それに対して、Ｅ１Ｂは多種多様の化学療法剤により誘発され たアポトーシスを阻止することができる。これらの結果はアポプチンが非常に活 性の高い抗腫瘍剤であることを意味している。組換えアポプチン・アデノウイルスの構築 組換えアポプチン・アデノウイルス・ベクターは、アポプチン・コード配列お よびある種のアデノウイルス配列を担持するアダプタープラスミドｐＭａｂ−Ｖ Ｐ３と、全アデノウイルスＤＮＡからＥ１およびＥ３領域を差し引いたプラスミ ドＤＮＡ ＪＭ１７とを、ヘルパー細胞系９１１に共トランスフェクションする ことにより産生させた(マックグローリー（McGrory）ら，１９８８)。共トラン スフェクション体はグラハム（Graham）およびバン・デル・エブ（Van der Eb） (１９７３)が記載のとおりに、リン酸カルシウム沈殿したＤＮＡで形質転換した 。組換えアデノウイルスＤＮＡは、プラスミドｐＭＡｂ−ＶＰ３およびＪＭ１７ ＤＮ ＡのアデノウイルスＤＮＡ中に存在する相同ウイルス配列間の相同組換えにより 形成される。 同様の方法で、９１１細胞の共トランスフェクションをｐＭａｂ−ｃｏｎおよ びｐＪＭ１７ ＤＮＡにより実施し、アポプチンを発現し得ない対照組換えアデ ノウイルスを生成させたが、このものはアポプチン誘発アポトーシスの効果に対 するアデノウイルス対照として使用する。 トランスフェクションの数時間後、９１１細胞単層をアガロース上層で被い、 組換えアデノウイルス誘発プラークが明瞭に目視し得るまで３７℃でインキュベ ートした。ウイルスをファロウ（Fallaux）ら（１９９６）の記載どおりにＰＢ Ｓウマ血清原液としてプラークから採取した。次いで、組換えウイルス原液を新 鮮な９１１細胞を容れた２４穴に加えた。数日後、これらの感染９１１細胞を溶 解し、組換えウイルスを採取した。 次に、潜在的組換えアポプチン・アデノウイルス（ｒＡｄ−ＶＰ３）によるア ポプチンの発現または対照組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−ｃｏｎ）による発現 の欠如を試験した。感染した２４穴プレートから誘導した組換えウイルス原液の 一部を新鮮な９１１細胞の感染に用い、これをガラスカバースリップ上単層とし て生育させた。１日後、感染した９１１細胞をアセトンで固定し、アポプチン特 異モノクローナル抗体８５．１を用い、免疫蛍光法により分析した。推定ｒＡＶ -ＶＰ３で感染した５種の分析対象９１１細胞培養物の内５種がアポプチンを発 現する細胞を含んでいた。Ａｄ−ｃｏｎで感染した９１１細胞および非感染９１ １細胞はいずれもアポプチン陽性ではなかった。 これらの結果は９１１細胞などのアデノウイルスパッケージング細胞系と必要 なアダプターおよびアデノウイルスＤＮＡの共トランスフェクションに基づき、 アポプチンを発現する生存可能なｒＡｄ−ＶＰ３を生成させることができること を意味する。 ｒＡｄ−ＶＰ３またはｒＡｄ−ｃｏｎプラークから誘導される２つの原液は、 引き続く３度の９１１細胞によるプラーク精製を実施することによりｒＡｄを精 製することに、あるいは並行してファロウ（Fallaux）(１９９６)記載どおりＰ ＥＲ．Ｃ６細胞上の限界希釈検定法に用いた。 アデノウイルス主要後期プロモーターの制御下にアポプチンを発現するｒＡｄ −ＶＰ３の産生に至る上記方法に基づき、我々はまた、サイトメガロウイルス( ＣＭＶ)プロモーターの制御下アポプチンを発現するアデノウイルスベクターに 成功した。これらの結果は、種々の型の組換えアデノウイルスがそれ自体または 非相同プロモーター要素の一つにより制御能を生じ得ることを示す。ＰＥＲ．Ｃ６細胞使用によるｒＡｄ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎの産生 ｒＡＤ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎロットの小規模生産をＰＥＲ．Ｃ６細胞 を使用し、記載のとおりに実施した(ファロウ(Fallaux)，１９９６)。簡単には 、その手法は実験の部に記載する。 プラーク−アッセイにより、その力価はｒＡＤ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎ とも澄明なライゼート１ｍｌ当たり約１０^11-12と定量した。得られた力価は他 のｒＡｄにつき我々の実験室で観察した値より低くなかった。 ＰＣＲ分析およびＨｅｐＧ２をｒＡｄ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎで感染さ せることにより、産生されたウイルス・バッチが複製応答能のあるアデノウイル スを含んでいるか否かを試験した(実験の部も参照)。両方の方法で証明したよう に、ｒＡｄ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎの両バッチともＲＣＡを含んでいなか った。 アポプチンの発現は、細胞培養条件下、アデノウイルス・ライフサイクルの、 必要とするいずれの段階でも否定的に阻害することはないと我々は結論する。し たがって、アポプチンを発現するアデノウイルスベクターに基づく遺伝子治療は 実行可能である。 抗アポトーシスＡｄ５Ｅ１タンパク質（ホワイト(White)，１９９６）が発現 されるために、アポプチンは組換えアポプチン・アデノウイルスが多量に産生さ れた後に最適にアポトーシスを誘発する。アポプチン発現アデノウイルスベクタ ーがアデノウイルス・タイプ５（Ａｄ５）Ｅ１タンパク質で形質転換したヒト細 胞、例えば、２９３、９１１およびＰＥＲＣ６細胞中に産生され得るという事実 は、アポトーシス誘発タンパク質アポプチンの存在下、該Ｅ１タンパク質がこの ＤＮＡウイルスを高力価に複製させ得ることを物語っている。 これらの結果は、アデノウイルス５Ｅ１タンパク質により形質転換した細胞系 中でアポプチンを発現する他の組換えＤＮＡウイルスベクターもまた産生させる ことが可能であることを示している。例えば、Ｈ−１もしくはＭＶＭパルボウイ ルスをベースとする組換えパルボウイルスは２９３Ｔ細胞中で増殖させることが 可能であり、この細胞はＡｄ５Ｅ１タンパク質で形質転換される(ディンサート （Dinsart）ら，１９９６)。 Ｈ−１およびＭＶＭパルボウイルスは、形質転換した細胞中で、すべてではな いにしても、特異的に細胞死を誘発する(ロペツ−グエレロ(Lopez-Guerrero)， １９９７)。アポプチンを発現するパルボウイルスベクターは腫瘍特異アポトー シスの誘発において、例えばアポプチンによる付加的な腫瘍特異アポトーシス誘 発により、パルボウイルスそのものよりもより強力である(ディンサート(Dinsar t)ら，１９９６；ダネンーバン・オーショット(Danen-Van Oorschot)，１９９７ )。 Ａｄ５Ｅ１タンパク質形質転換細胞をベースとする組換えアポプチンウイルス の生産プロトコールは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルス種についても当て はまる。ヒト形質転換および/または悪性腫瘍細胞系におけるアポトーシス誘発 ヒト腫瘍細胞をｒＡｄ−ＶＰ３で感染させるとアポプチン誘発アポトーシスに 至るか否かを我々は試験した。そのために、ヒト肝癌ＨｅｐＧ２，骨肉腫Ｕ２Ｏ Ｓ、偏平上皮細胞癌から誘導されたＳＣＣ−１５細胞、および自然発生的に形質 転換したケラチン細胞系ＨａＣａＴからの細胞をｒＡｄ−ＶＰ３で感染させた。 トランスフェクションの１日後、細胞を固定し、免疫蛍光法およびＤＡＰＩ染色 により、細胞のアポプチン合成について、および細胞がアポトーシスを受けてい るか否かにつき試験した。感染１日後、すでに殆どすべての分析したアポプチン 陽性ヒト腫瘍細胞がアポトーシス性であった。非感染培養物ではわずか２〜３％ のヒト腫瘍細胞がアポトーシス性であった。ＨｅｐＧ２およびＵ２ＯＳ細胞での 結果を図４に示す。 これらの結果はｒＡｄ−ＶＰ３発現アポプチンが、異なる哺乳動物の腫瘍発生 可能なおよび/または形質転換した細胞系においてアポトーシスを誘発させ得る ことを示している。ｒＡｄ−ＶＰ３で感染した正常細胞におけるアポプチンの発現 感染させた正常非形質転換細胞においてｒＡｄ−ＶＰ３により発現したアポプ チンの効果を分析するために、ＦＳＫ−１細胞をｒＡｄ−ＶＰ３で感染させた。 トランスフェクションの４日後、細胞をモノクローナル抗体８５．１による間接 的免疫蛍光法、およびＤＡＰＩ染色により分析した。多くても８％のアポプチン 陽性細胞がＤＡＰＩ異常染色を示し、それら細胞が（アポプチン）誘発アポトー シスを受けていることを示した。しかし、感染しなかった細胞の７％もまた異常 なＤＡＰＩ染色ＤＮＡパターンを示した。結果を図４に示す。 全身性伝達後のヒトＡｄ５が肝親和性であるとすれば、正常二倍体肝細胞での アポプチンの影響を究明するのも重要なことである。そのために、単離したラッ トの肝細胞を、インシュリン（２ｍＵ／ｍｌ）およびデキサメタゾン（１ｎＭ） 添加のウイリアムズ・イー培地（Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY ，USA）中で培養した。該細胞をコラーゲン被覆培養スライド（Micronic）上生 育させた。 一次ラット肝細胞をアポプチン発現アデノウイルスベクターＡｄ−ＶＰ３、Ｌ ａｃＺ発現対照アデノウイルス、または模擬感染体により感染させた。２日後、 細胞を固定し、免疫蛍光法およびＤＡＰＩ染色によりアポトーシス性細胞の割合 を試験した。アポプチン、ｌａｃＺ、または疑似感染体を発現するいずれの致死 細胞についてもその割合に差を認めなかった。これらの観察は（ラット）肝細胞 が、アポプチンがアデノウイルスベクターにより合成される場合であっても、ア ポプチン誘発アポトーシスを受けないことを示している。 これらの結果はｒＡｄ−ＶＰ３によるアポプチン発現が正常非形質転換ヒト細 胞においては、形質転換/腫瘍発生可能なヒト細胞と対照的に、アポプチン誘発 アポトーシスに至らないことを示している。アポプチン合成の増大 アポプチンＡＴＧ開始コドンの直前にある配列の影響を調べるために、我々は ２つのｐＣＲ−３，１−アポプチン構築物を作製した。ｐＣＲ−ＶＰ３ｏｒｉは ＡＴＧコドンの当初直上流配列（５＿−ＴＴＴＣＡＡ−３＿）を含み、もう一方 のｐＣＲ−Ｖｐ３ｍｕは直上流配列５＿−ＧＣＣＡＡＣ−３＿を含む。in vitro 転写/翻訳コムギ胚芽検定により、ｐＣＲ−ＶＰ３ｍｕのアポプチン発現がｐＣ Ｒ−ＶＰ３ｏｒｉで観察される少なくとも５倍以上であると定量した。これらの データはアポプチン−ＡＴＧの直上流配列の性質がアポプチンの合成に影響する ことを物語っている。アポプチンのＡＴＧコドン直前上流配列５＿−ＧＣＣＡＡ Ｃ−３＿を有する（ウイルス）ベクターの構築はアポプチン産生を高め、間接的 にアポプチン誘発アポトーシスを増大させる結果となる。 言及すべき重要なことは、アポプチンのアミノ酸配列は「コザック規則」によ り翻訳効率を増大させるために必要であると予測されるようには変更されないと いうことである(カベンター（Caventer）およびスチュアート(Stuart)，１９９ １)。この規則に従うと、我々は＋４位置のヌクレオチドをＡからＧに変更し、 アポプチンの第二アミノ酸を異なるものとし、その活性が変化したものとなるよ うにすべきである。アポトーシス活性をもつ本質的アポプチン・フラグメントの同定 アポプチンタンパク質の一部がそのアポトーシス活性にとって本質的であるか 否かを調べるために、キメラタンパク質をエンコードし、グリーン蛍光タンパク 質（ＧＦＰ；リッズト(Rizzuto)，１９９５）およびアポプチンのＮ−末端７１ アミノ酸（Ｎ−アポプチン）またはそのＣ−末端５０アミノ酸（Ｃ−アポプチン ）からなるプラスミドを構築した。ヒトの形質転換細胞、例えば、Ｓａｏｓ−２ 細胞（ツアン(Zhuang)，１９９５）をキメラＧＦＰ／Ｎ−アポプチンまたはＧＦ Ｐ／Ｃ−アポプチン発現プラスミドで一過性に形質転換した。唯一、ＧＦＰ／Ｃ −アポプチン発現Ｓａｏｓ−２細胞のみがアポプチン特異アポトーシスを受けた 。このことはＣ−アポプチン（ＧＦＰに結合）が核に入り得るという事実と一致 する。 これらの結果は（ヒト）腫瘍発生可能/形質転換細胞においてアポトーシスを 誘発させるためにはアポプチンの一部があれば充分であることを物語っている。 し たがって、アポプチンのその部分のみを発現する（ウイルス）ベクターに基づき 有効な（遺伝子）療法を開発することも可能である。さらに、これらのデータは 、アポプチンの一部が外来タンパク質に共有結合的に結合したときにそのアポト ーシス活性もつということを示している。ヒト腫瘍細胞でのＶＰ２およびアポプチンの共発現が相乗的にアポトーシス誘発 を増大させる ＶＰ２およびアポプチンの共発現がアポトーシス誘発にどのように影響するか を調べるために、アポプチン発現性ｐＣＭＶ−ｆｓおよび/またはＶＰ２発現性 ｐＣＭＶ−ＶＰ２ｍｕによりＳａｏｓ−２細胞を（共）形質転換させた。トラン スフェクション後、該細胞を種々の時間間隔でアセトンにより固定した。間接免 疫蛍光法により、ＶＰ−２陽性細胞はモノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−１１ １．１（ノートボーン（Noteborn）およびコッホ(Koch)，１９９６）を用い、ま た、アポプチン陽性細胞はモノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１を用い 定量した。トランスフェクションの３日目に、ＶＰ２発現細胞のわずか３％がア ポトーシスを受け、アポプチン発現細胞ではそれがわずか約１０％であった。そ れに対し、ＶＰ２およびアポプチンの両方を発現するＳａｏｓ−２細胞ではその 約４０％がすでにアポトーシス性であった。また、トランスフェクションの４日 後、アポトーシスを受けたＶＰ２／アポプチン陽性細胞の割合は、アポプチンま たはＶＰ２のみを発現する細胞におけるよりも有意に高かった。 これらの結果はＶＰ２がアポプチン誘発アポトーシスを増大させることを示す 。その結果を図５に示す。ｒＡＤ−ＶＰ２の構築と生産 ニワトリ貧血症ウイルスのウイルス・タンパク質２（ＶＰ２）を発現する組換 えアデノウイルスを構築するために、アダプタープラスミドｐＭＡｂ−ＶＰ２を 作製した。１.１ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを、ＶＰ２コード配列のすべて を含むプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２ｍｕから単離したが、このものはアポプチン −コード領域内に２つの点突然変異をもっていた(実験の部参照)。ＢａｍＨＩ− 直線化され、子ウシ腸管アルカリホスファターゼ処理されたアダプター・ベクタ ー ｐＭＡｂに、このフラグメントを結紮した。最終構築物ｐＭａｂ−ＶＰ２は制限 酵素および配列分析により特性化し、図６に示した。 ｒＡＤ−ＶＰ２は、９１１細胞をｐＭａｂ−ＶＰ２ＤＮＡおよびｐＪＭ１７Ｄ ＮＡで共トランスフェクションすることにより作製した。共トランスフェクショ ンおよびｒＡＤ−ＶＰ２の特性付け、精製および生産に必要な他のすべての工程 は、ｒＡｄ−ＶＰ３およびｒＡｄ−ｃｏｎにつき記載したのと同様に実施した。 モノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−１１１.１を用いる間接免疫蛍光法により 、ｒＡｄ−ＶＰ２で感染させた９１１およびＰＥＲ．Ｃ６細胞は実際にＶＰ２タ ンパク質を発現し得ることが示された。アポプチン発現レトロウイルス・ベクターの構築 プラスミドｐＬ−ＶＰ３−ＳＮ（図７参照）を産生させるために、アポプチン −コード配列を担持するＢａｍＨＩフラグメントをｐＬＸＳＮのユニークＢａｍ ＨＩ部位に挿入した。制限酵素分析により挿入物の適切な配向を確認した。挿入 物の完全性を試験するために、プラスミドｐＬ−ＶＰ３−ＳＮをＣＯＳ−７およ びＨｅｐＧ２細胞にリン酸カルシウム共沈殿技法により移入した。トランスフェ クションの４日後、細胞を固定し、アポプチンタンパク質の発現についてモノク ローナル抗体８５．１により分析した。該細胞の約１〜２％にアポプチンの発現 が検出された。ＤＡＰＩ染色により定量されるように、細胞の大半がアポトーシ スを受けていた。これらのデータは、プロウイルスＬＴＲプロモーターがアポプ チンタンパク質の発現をドライブすることができ、その遺伝子はＤＮＡ構築物中 で完全な状態にあり、移入したＨｅｐＧ２およびＣＯＳ−７細胞ではアポプチン の発現がアポトーシスを誘発することを示す。 ウイルスを産生させるために、プラスミドｐＬ−ＶＰ３−ＳＮをＰｓｉ−２細 胞中およびＰＡ３１７細胞中にリン酸カルシウム共沈殿技法により移入した。ト ランスフェクションの４８時間後、細胞上清を採取し、その希釈液をポリブレン ４μｇ/ｍｌの存在下にＨｅｐＧ２細胞（ＰＡ３１７上清）およびＮＩＨ３Ｔ３ 細胞（Ｐｓｉ−２上清）を感染させるために用いた。感染の４日後、細胞を固定 し、アポプチンタンパク質の発現についてモノクローナル抗体８５．１での染色 によ り分析した。該細胞の約１％がアポプチンを発現していることが分かった。アポ プチン陽性ＨｅｐＧ２細胞の大半がアポトーシス性であった。これらのデータは 該細胞がＬ−アポプチン−ＳＮレトロウイルスにより形質導入されていることを 証明している。更に、それはプロウイルスの単一コピーが免疫蛍光法により検出 されるのに充分な量のアポプチンタンパク質を発現するのに充分であり、この量 はヒト腫瘍細胞系、すなわち肝癌細胞系ＨｅｐＧ２でのアポトーシス誘発に充分 であることを物語っている。 これらのデータを合わせると、アポプチン遺伝子を担持するレトロウイルスベ クターはヒト腫瘍細胞中で、産生され、かつ、アポトーシス誘発に使用し得るこ とを物語っている。それはアポプチン遺伝子もその発現もレトロウイルスのライ フサイクルの本質的なステップを阻害しないことを形式的に証明している。それ はまたアポプチン含有レトロウイルスがヒト腫瘍細胞を組織培養中に形質導入す るのに充分な量で、バッチ方式で生産し得ることを物語っている。 これらの結果は（ヒト）腫瘍細胞においてアポプチンの発現およびその結果と してのアポプチン誘発アポトーシスが、プラスモウイルスなどの（レトロ）ウイ ルス誘導ベクター系により可能であることをさらに暗示している（ノグイッツー ヘリン(Noguiez-Hellin)，１９９６)。かかる組換えアポプチンプラスモウイル ス系にとっての重要なステップはレトロウイルスの複製がアポプチンの発現によ り阻害されないかどうかである。我々は、これが上記の組換えアポプチン・レト ロウイルスにとっては全く当てはまらず、組換えアポプチンプラスモウイルスの 生産を成功させるものであることを証明した。ｒＡＤ−ＶＰ３に基づく癌細胞の診断検定 アポプチンの細胞内所在は正常非形質転換細胞に比べて、腫瘍発生可能な/形 質転換ヒト細胞において異なっている。さらに、もう一つのマーカーは腫瘍発生 可能な/形質転換ヒト細胞ではアポトーシスを誘発するが正常細胞では誘発しな いアポプチンの特異な能力である。 ｒＡｄ−ＶＰ３で細胞を感染させ、これら細胞内でのアポプチン所在および/ またはアポトーシスの誘発を分析することにより、細胞が悪性であるのかそうで はないのかを証明することができる。一次細胞を（疑わしい）組織から単離し、 必要な培地で培養する。該細胞をｒＡＤ−ＶＰ３で感染させ、並行してｒＡｄ− ｃｏｎにより感染させ、次いで分析する。例えば、アポプチン特異モノクローナ ル抗体８５．１に基づく免疫蛍光検定法を用いる。細胞は細胞質（正常細胞）中 にまたは核（形質転換細胞）内にアポプチンを有するかチェックする。さらに、 あるいは代わりに、アポトーシス性細胞の割合を評価する。もしアポトーシス性 細胞の割合がｒＡｄ−Ｖｐ３感染細胞において、ｒＡｄ−ｃｏｎ感染細胞におい てよりも有意に高いならば、これらの細胞は悪性となっている。健常ラットにおける組換えアポプチン・アデノウイルスの毒性試験 組織培養条件下で、正常細胞、例えば、ヒトまたは齧歯類起源誘導の正常細胞 中で組換えアデノウイルスｒＡｄ−ＶＰ３により発現されたアポプチンはアポト ーシスを誘発しない。下記実験において、我々は健常ラット中で組換えアデノウ イルスベクターｒＡｄ−Ｖｐ３によりアポプチンの発現が急性毒性とはならない かどうか試験した。 使用したｒＡｄ−ＶＰ３ベクターおよび対照ｒＡｄベクターの両方をＰＥＲ． ｃ６細胞上生育させ、ＰＣＲ分析により複製適格のあるアデノウイルスが陰性で ある（ＲＣＡ不含）ことを証明した。ｒＡｄのものをＣｓＣｌ−勾配遠心分離に より精製した。 体重約２００ｇの雄Ｗａｇ／Ｒｉｊラット（Harlan，The Netherlands）にア ポプチン発現組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−ＶＰ３；２．５×１０⁹プラーク 形成単位、ｐｆｕ）および遺伝子産物ルシフェラーゼ発現対照組換えアデノウイ ルス（ｒＡｄ−ｌｕｃ；２．５×１０⁹）を注射した。両方のアデノウイルスベ クターを０．１％ウシ血清アルブミンおよび１０％グリセロール含有リン酸緩衝 食塩溶液（ＰＢＳ＋）に再懸濁した。アデノウイルスベクターを含まないこの溶 液もまたラットに注射し、さらに陰性対照とした。２匹のラットにｒＡｄ−ＶＰ ３、ｒＡｄ−ｌｕｃまたはＰＢＳ＋懸濁液のいずれかを静脈内、腹腔内または皮 下に注射した。Ａｄ−ＶＰ３処理ラットの目視病理分析 Ａｄ−ＶＰ３発現アポプチンの毒性効果の可能性を試験する第１の方法は、全 体の健康状態を測定することであり、特に処理ラットの体重の測定であり、これ は注射後毎日実施した。すべてのラットは実験期間健康な状態にあった。体重は 異なる群で有意に異なることはなかった。１週間後、すべての試験ラットは、ｒ Ａｄ−ＶＰ３注射のものも含め、体重増加しており、ｒＡｄ−ＶＰ３処理の１つ によって、いずれの動物も急性毒性の影響を受けていないことを示していた。急 性毒性が存在しないことをさらに確立するために、以下の定量試験を実施した。 屠殺２時間前に、すべてのラットにＢｒｄＵを注射した。屠殺後、幾つかの組織 （肝臓、腎臓、腸管、心臓、肺、脾臓、生殖腺および陰茎）を病理学的に直接試 験するか、および/またはさらに組織病理学的分析のために採取した(下記参照) 。 目視分析ではＡｄ−ＶＰ３処理のいずれのラットにも有意な病理学的影響を受 けた器官はなかった。肝臓におけるＡｄ−ＶＰ３ＤＮＡの定量 静脈注射（組換え）アデノウイルス（ベクター）の主標的は肝臓であり、ある 範囲では脾臓である。したがって、アポプチンの毒性の影響は肝臓に見られるは ずである。 肝臓中でのＡｄ−ＶＰ３ ＤＮＡの存在、Ａｄ−ＶＰ３によるアポプチン発現 および細胞病理学的影響の可能性を試験するためにパネル実験を実施した。 先ず、我々はサザーンブロット分析により、Ａｄ−ＶＰ３処理ラットの肝蔵か ら単離したＤＮＡが、注射後８日目である屠殺日にアポプチンＤＮＡを含んでい るか否かを試験した。陰性対照として、Ａｄ−ｌｕｃ処理ラット肝臓からのＤＮ Ａを並行して試験した。単離したＤＮＡをアガロースゲル上に負荷する前に、該 ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、約０．５ｋｂｐのアポプチンＤＮＡフラグメント を得た。サザーンブロットは³²Ｐ−標識アポプチンＤＮＡプローブとハイブリッ ド化した。 Ａｄ−ＶＰ３処理動物から誘導したＤＮＡの場合には、アポプチンＢａｍＨＩ −ＤＮＡフラグメントがサザーンブロット上に鮮明に目視し得たが、対照のｒＡ ｄ−ｌｕｃで処理したラット肝臓から単離したＤＮＡ含有レーンには予測どおり 存在しなかった。肝臓中でのＡｄ−ＶＰ３コピー量を試験するために、種々量の アポプチンＤＮＡをサザーンブロット上に並行して負荷し、標識アポプチンＤＮ Ａプローブでハイブリッド化した。静脈注射の丁度８日後に１細胞当たり０．２ ５のＡｄ−ＶＰ３コピーを定量したが、このことは肝臓中できわめて有意なＡｄ −ＶＰ３の形質導入が起こっていることを意味している。肝細胞中でのアポプチン発現とその毒性効果 アポプチン特異モノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１またはＣＶＩ− ＣＡＶ−１１１．３を用い、Ａｄ−Ｖｐ３処理肝臓または対照肝臓のパラフィン 切片を免疫染色することにより、Ａｄ−ＶＰ３処理動物肝細胞の約２０〜３０％ がアポプチンを発現していることを我々は示した。対照ラットの肝蔵切片はアポ プチン陰性であった。 肝細胞に対するＡｄ−ＶＰ３発現アポプチンの細胞毒性の影響可能性を試験す るために、２つの異なる方法を実施した。先ず、Ａｄ−ＶＰ３処理ラットすべて の肝臓切片および両タイプの対照動物肝臓切片をヘマトキシン−エオシン(ＨＥ) で染色した。すべての試験肝臓切片で形態的病理的変化を観察しなかったが、こ れはアポプチンの発現がラット肝細胞にとって毒性のないことを物語っている。 阻害効果は新に分割した肝細胞を検出するＢｒｄＵ標識により観察することが できる。Ａｄ−ＶＰ３含有肝臓の場合、ＢｒｄＵ標識肝臓細胞量は対照のＡｄ− ｌｕｃ処理ラット肝臓と同程度（約２％）であった。したがって、アポプチン発 現はそのままではin vivoで有意な毒性効果を示さない。アポプチンはin vivoモデルにおいて急性毒性効果を示さない 生化学データおよび免疫学データと組み合せて可視的ならびに組織学的に分析 すると、アポプチンの発現がin vivoモデルにおいて（急性）毒性効果を示さな いことが明らかとなった。 これらの結果は、遺伝子伝達体の使用による、あるいは他の方法によるアポプ チン発現ベースの療法では、マイナスとなる併発効果が限られたものであること を物語っている。ヒト肝癌モデルでの抗腫瘍研究 アポプチンのＡｄ−ＶＰ３制御発現は組織培養条件下、ヒト形質転換細胞にお いてアポトーシスを誘発する。例えば、Ａｄ−ＶＰ３ドライブのアポプチン発現 はヒト肝癌誘導細胞ＨｅｐＧ２においてアポトーシスを誘発する。これまで、in vivoでのアポプチンの抗腫瘍活性（例えば、Ａｄ−ＶＰ３による発現）は試験 されたことがない。 したがって、我々はＡｄ−ＶＰ３制御アポプチンの発現がin vivoモデルにお いて抗腫瘍活性を示すか否かを決めた。そのために、雄ヌードＢａｌｂ/Ｃ/ｎｕ /ｎｕマウスに１側当たり１×１０⁶個のヒトＨｅｐＧ２細胞を皮下注射した。１ 匹当たり少なくとも２ないし３ヶ所にヒト肝癌細胞を注射した。注射３週間後、 明瞭な肝癌腫瘍が発生し、皮下に目視可能であり、かつ、その平均サイズは少な くとも５×５ｍｍであった。 ｒＡｄ−ＶＰ３および対照ｒＡｄ−ｃｏｎ１ベクターをリン酸緩衝食塩溶液、 ５％スクロースおよび０．１％ウシ血清アルブミンに懸濁し、腫瘍内に注射した 。 使用したアポプチン発現ｒＡｄ−ＶＰ３ベクターおよびアポプチン遺伝子含有 対照ベクターｒＡｄ−ｃｏｎ１（アポプチン遺伝子はＡｄＭＬＰプロモーターに 対し反対（逆またはアンチセンス）の３'−５'配向で含む）の両方をＰＥＲ．ｃ ６細胞上で生育させた。組換えアデノウイルスの両バッチはＰＣＲ分析によりＲ ＣＡ不含であることを証明した。ｒＡｄのものをＣｓＣｌ−勾配遠心分離により 精製した。 ４０μｌ懸濁液中腫瘍当たり７×１０⁹pｆｕ ｒＡｄ粒子を注射した。ｒＡｄ ベクター１タイプ当たり６匹の、２ないし３ＨｅｐＧ２腫瘍を有するマウスを処 理した。追加の対照として、１群４匹のＨｅｐＧ２腫瘍をもつヌードマウスに５ ％スクロースおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩溶液を腫 瘍内注射した(ＰＢＳ＋−群)。アポプチンはIn vivoモデルにおいて抗腫瘍効果を示す Ａｄ−ＶＰ３発現アポプチンのヒトＨｅｐＧ２腫瘍における抗腫瘍効果の可能 性を試験するために、ｒＡｄ−ＶＰ３および対照の懸濁液を注射後７日目まで継 続した試験期間の間、皮下腫瘍のサイズを測定した。 ＰＢＳ＋群、および対照ｒＡｄｃｏｎ１で処理した群の両群が、ＨｅｐＧ２腫 瘍サイズの平均的進行性増加を示した。それに対し、ｒＡｄＶＰ３で腫瘍内処理 した群では、腫瘍サイズの減少を示した。注射後７日目、ヌードマウスを屠殺し た。腫瘍を単離し、目視試験した。対照ｒＡｄ−ｃｏｎ１ベクターまたはＰＢＳ ＋で処理した肝癌腫瘍は、重度に血管新生ＨｅｐＧ２腫瘍組織であることを示し 、処理後肥大したことは明らかである。ｒＡｄ−ＶＰ３処理ＨｅｐＧ２腫瘍では 全く異なるパターンを観察した。残余の腫瘍塊の外観は、腫瘍血管新生減少のた めに淡色であった。腫瘍はｒＡｄ−ＶＰ３での処理後、そのサイズが縮小した。 また、腫瘍は白色気泡状の構造物を含むが、これは死滅細胞を示すものである。 アポプチン誘発腫瘍退行の他には、臓器（特に、肝臓と脾臓を試験した）上、 アポプチン発現のマイナスとなる影響は観察し得なかった。アポプチンはin vivo系において抗腫瘍活性を示す 結論として、ｒＡｄ−ＶＰ３処理の腫瘍は腫瘍サイズの減少を示したが、対照 では示さなかった。これはアポプチンの発現が、in vivoモデルにおいて抗腫瘍 活性を示すことを意味している。 Ａｄ−ＶＰ３発現アポプチンが、ＨｅｐＧ２のような急速に成長する腫瘍にお いて腫瘍の退行を誘発するという事実は、アポプチンの強力な抗腫瘍能力を証明 するものである。ヌードマウスにおいてアポプチンが腫瘍の成長を減少させると いう事実は、アポプチンの発現それ自体がさらなる免疫応答なしに腫瘍細胞を「 殺す」ということを示す。記載の毒性および抗腫瘍性の研究は、アポプチン発現 に基づく抗腫瘍治療法が安全で実行可能なものであることを示している。 図面の説明 図１はアデノウイルス・アダプターベクターｐＭＡｄ５およびｐＭａｂの本質 的部分を示す。 図２は組換えアデノウイルス・アダプターベクターｐＭａｂ−ＶＰ３およびｐ Ｍａｂ−ｃｏｎの本質的部分を示す。 図３はｐＭＡｂ−ＶＰ３またはｐＣＭＶ−ＶＰ３により形質転換した９１１細 胞のアポプチン誘発アポトーシス活性を示す。２つの、それぞれにクローン化し 、 精製したｐＭａｂ−ＶＰ３ＤＮＡバッチ（ｐＭａｂ−ＶＰ３/ｍｌおよびｐＭａ ｂ−ＶＰ３−ｍ２）を、９１１細胞のトランスフェクションに使用した。トラン スフェクションの３日後に細胞を固定し、アポプチン特異モノクローナル抗体Ｃ ＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（８５．１；ノートボーン（Noteborn）ら，１９９１） を用いて間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩにより異常染色された細胞の 割合をアポトーシスの相対測定値として示す。 図４は組換えアポプチン複製能欠損アデノウイルスＡｄ−ＶＰ３により感染さ せた、ヒト腫瘍発生可能肝癌ＨｅｐＧ２細胞、骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞および正常非 形質転換二倍体ＦＳＫ−１ケラチン細胞の、アポプチン（ＶＰ３と呼称）誘発活 性を示す。細胞はモノクローナル抗体８５．１を用いる間接免疫蛍光法により分 析し、ＤＡＰＩにより染色した。ＨｅｐＧ２およびＵ２ＯＳ細胞を、トランスフ ェクションの１日後に固定し、ＦＳＫ−１細胞は収集してトランスフェクション の４日後に固定した。ＤＡＰＩにより異常染色されたアポプチン陽性細胞の割合 を、アポプチン誘発アポトーシスの測定値として示す(黒棒)。対照として、ＤＡ ＰＩ異常染色となった非感染細胞の割合を示す(白抜き棒)。 図５は２．５μｇのアポプチン発現ｐＣＭＶ−ｆｓ ＤＮＡ（以前はｐＣＭＶ −ＶＰ３と呼称；アポプチンはＶＰ３と命名）および２．５μｇのｐＣＭＶ−ｎ ｅｏＢａｍ ＤＮＡ（ダネンーバン・オーショット(Danen-VanOorschot)，１９９ ７）により；または２．５μｇのＣＡＶタンパク質２（ＶＰ２）発現ｐＣＭＶ− ＶＰ２ ＤＮＡ、および２．５μｇのｐＣＭＶ−ｎｅｏＢａｍ ＤＮＡにより；ま たは２．５μｇのｐＣＭＶ−ｆｓおよび２．５μｇのｐＣＭＶ−ＶＰ２により形 質移入し、アポプチン（ＶＰ３）およびＶＰ２の両方を発現することとなる、Ｓ ａｏｓ−２細胞におけるアポプチンおよび/またはＶＰ２誘発アポトーシス活性 を示す。細胞をトランスフェクションの３、４および５日後に固定し、アポプチ ン特異モノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（８５．１；ノートボーン （Noteborn）ら，１９９１）またはモノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−１１１ ．１（ノートボーン（Noteborn）およびコッホ(Koch)，１９９６）を用いる間接 免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩにより異常染色された細胞の割合をアポト ー シスの相対測定値として示す。 図６は組換えアデノウイルス・アダプターベクターｐＭａｂ−ＶＰ２の本質的 部分を示す。 図７は組換えレトロウイルス・トランスファーベクターｐＬＳ−ＶＰ３−Ｎの 本質的部分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アポプチン様活性をエンコードする核酸分子を含むことを特徴とする遺伝 子伝達体。 ２．該核酸分子のＡＴＧ開始コドン直上流の修飾翻訳開始部位をさらに含むこ とを特徴とする請求項１記載の遺伝子伝達体。 ３．該翻訳開始部位が核酸配列ＧＣＣＡＡＣを有することを特徴とする請求項 ２記載の遺伝子伝達体。 ４．ＶＰ２様活性をエンコードする核酸分子を含むことを特徴とする遺伝子伝 達体。 ５．該核酸分子のＡＴＧ開始コドン直上流の修飾翻訳開始部位をさらに含むこ とを特徴とする請求項４記載の遺伝子伝達体。 ６．ＶＰ２様活性をエンコードする核酸分子をさらに含むことを特徴とする請 求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子伝達体。 ７．ＶＰ２様活性をエンコードする核酸分子のＡＴＧ開始コドン直上流の修飾 翻訳開始部位をさらに含むことを特徴とする請求項６記載の遺伝子伝達体。 ８．ウイルスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子 伝達体。 ９．複製能欠損ウイルスであることを特徴とする請求項８記載の遺伝子伝達体 。 10．アデノウイルスであることを特徴とする請求項８または９記載の遺伝子伝 達体。 11．レトロウイルスであることを特徴とする請求項８または９記載の遺伝子伝 達体。 12．少なくとも１つの標的分子をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１１ のいずれかに記載の遺伝子伝達体。 13．標的分子が腫瘍細胞表面レセプターとの反応性を有するものであることを 特徴とする請求項１２記載の遺伝子伝達体。 14．請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子伝達体を含むことを特徴とする 宿主細胞。 15．ヘルパーまたはパッケイジング細胞であることを特徴とする請求項１４記 載の宿主細胞。 16．ＨＥＫ：２９３、ＨＥＲ：９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｐｓｉ−２およびＰＡ ３１７細胞の群より選択されることを特徴とする請求項１４記載の宿主細胞。 17．請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子伝達体の、癌治療における使用 。 18．請求項１７記載の遺伝子伝達体の、通常の（化学）療法と組合わせた使用 。 19．請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子伝達体の、過形成、形成異常ま たはジスプラジー治療のための使用。 20．請求項１〜１３のいずれかに記載の遺伝子伝達体の、診断における使用。 21．形質転換、癌性、または、過形成、形成異常もしくはジスプラジー細胞の 、in vitro検出における請求項２０記載の遺伝子伝達体の使用。