SK285724B6 - Použitie adenovírusového génového nosiča schopného indukovať apoptózu v bunke na prípravu liečiva na liečenie transformovaných buniek a na prípravu diagnostického prostriedku na diagnostikovanie transformovaných buniek - Google Patents

Abstract

Je opísané použitie adenovírusového génového nosiča schopného indukovať apoptózu v bunke, obsahujúceho molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu aktivitupodobnú apoptínu, na prípravu liečiva na liečenietransformovaných buniek, pričom apoptóza je vyvolaná v týchto transformovaných bunkách a nastáva redukovaná apoptóza, ak vôbec nejaká, v normálnych diploidných, netransformovaných/nemalígnych bunkách, pričom transformované bunky sú charakterizované hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka použitia adenovirusových génových nosičov, ktoré obsahujú molekuly nukleovej kyseliny, kódujúce aktivitu podobnú proteínom VP2 a/alebo apoptínu (VP3) indukujúcim apoptózu.

Vo vynáleze sa taktiež opisujú protinádorové terapie a diagnózy rakoviny. Infekcia rôznych ľudských nádorových buniek génovými nosičmi podľa tohto vynálezu bude mať za následok indukciu apoptózy v nádorových bunkách a oveľa nižšiu apoptózu, ak vôbec nejakú, v normálnych diploidných, netransformovaných/nemalignych bunkách.

Doterajší stav techniky

Expresia in vitro proteínu apoptínu (VP3), odvodeného od vírusu kuracej anémie (CAV), indukovala v kuracích transformovaných bunkách apoptózu (Notebom a kol., 1994, Notebom a Koch, 1995). Apoptóza je charakterizovaná zmrštením buniek, segmentáciou jadra, kondenzáciou a štiepením DNA na fragmenty veľkosti domén, vo väčšine buniek po nej nasleduje intemukleozomálna degradácia. Nakoniec sa apoptické bunky rozpadnú na apoptické telieska obalené membránou, ktoré sú rýchlo fagocytované susednými bunkami. Apoptóza tak spôsobí oveľa menšie poškodenie tkaniva ako nekróza, je to nefyziologický spôsob bunkovej smrti (Wyllic a kol., 1980, Arends a Wyllie, 1991 a White, 1996).

Apoptín je malý proteín, s dĺžkou iba 121 aminokyselín. Je skôr bázický a bohatý na prolín, serin a treonín (Notebom a kol., 1991). V analyzovaných transformovaných kuracích bunkách, ktoré prechádzali apoptínom indukovanou apoptózou, bol apoptín umiestnený iba v jadre. Skrátenie C-terminálneho bázického konca apoptínu má za následok zníženú lokalizáciu v jadre a významne zníženú apoptickú aktivitu (Noterbom a kol., 1994B).

Apoptín a iné proteíny s aktivitou podobnou apoptínu môžu taktiež indukovať apoptózu v ľudských malignych a transformovaných bunkových líniách, ale nie v netransformovaných ľudských bunkových líniách. Zistilo sa, že k apoptínom indukovanej apoptóze dochádza v neprítomnosti funkčného p53 (Zhuang a kol., 1995) a že nemôže byť blokovaná Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang a kol., 1995), sBcl-2 spojeným proteínom BAG-1 a proteínom kravských kiahní CrmA (Noterbom, 1996). In vitro nie je apoptín schopný indukovať programovanú bunkovú smrť v normálnych lymfoidných, kožných, pokožkových, endoteliálnych bunkách a bunkách hladkých svalov. Keď sú však normálne bunky transformované, stávajú sa citlivými k apoptóze apoptínom alebo inými proteínmi s aktivitou podobnou apoptínu. Dlhodobá expresia apoptínu v normálnych ľudských fibroblastoch ukázala, že apoptín nemá v týchto bunkách žiadnu toxickú ani transformačnú aktivitu. V normálnych bunkách bol apoptín nájdený prevažne v cytoplazme, zatiaľ čo v transformovaných alebo malignych bunkách, napr. bunkách charakterizovaných hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou, bol umiestnený v jadre, čo naznačuje, že lokalizácia apoptínu je spojená s jeho aktivitou (Danen-Van Oorschot a kol., 1997, Notebom, 1996).

Apoptóza je aktívnym a programovaným fyziologickým procesom, ktorý eliminuje nadbytočné, pozmenené alebo mah'gne bunky (Eamshaw, 1995). Apoptotický proces môže byť začatý mnohými regulačnými podnetmi (Wyllie, 1995 a White, 1996). Zmeny v prírastku buniek majú dôležitú úlohu v ľudskej patogéneze, napr. pri vývoji rakoviny, ktorá je spôsobená zvýšeným bunkovým dele ním, ale taktiež zníženým umieraním buniek (Kerr a kol., 1994). Bolo preukázané, že mnoho chemoterapeutických zlúčenín a radiácia indukujú apoptózu v nádorových bunkách, v mnohých prípadoch cez p53 divokého typu (Thompson, 1995, Bellamy akol., 1995, Steller, 1995).

V mnohých nádoroch však počas ich vývoja dochádza k mutácii v p53, čo je často spojené so slabou odozvou na liečbu rakoviny (Hooper, 1994). Pri niekoľkých (leukemických) nádoroch je vysoká úroveň expresie protoonkogénu Bcl-2 spojená so silnou rezistenciou k množstvu chemoterapeutických látok indukujúcich apoptózu (Hockenberry 1994, Kerr a kol., 1994 aSachs aLotem, 1993).

Apoptín sa takto môže stať potenciálnym kandidátom na ničenie nádorových buniek alebo iných buniek charakterizovaných hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou, ktoré sa stali rezistentnými na (chemo)terapeutickú indukciu apoptózy, vzhľadom na nedostatok funkčného p53 a (cez) expresiu Bcl-2 a iných látok inhibujúcich apoptózu. Fakt, že apoptín neindukuje apoptózu v normálnych netransformovaných ľudských bunkkách, aspoň nie in vitro, naznačuje, že toxický účinok apoptínového liečenia in vivo môže byť veľmi nízky.

Expresia apoptínu v nádorových bunkách je však doteraz uskutočňovaná s použitím prechodnej transfekcie buniek tkanivových kultúr. Nevýhodou tohto spôsobu expresie je veľmi nízke percento buniek, ktoré môžu exprimovať apoptín v podmienkach in vitro. In vivo budú tieto používané transfekčné metódy problematické a neúčinné, ak vôbec možné a vôbec neprispievajú k účinnému liečeniu rakoviny.

Adenovírus môže byť odvodený od ľudských adenovírusov (Ad), čo sú neobalené, ikosahedrálne DNA vírusy. Ich genóm pozostáva z lineárnej, dvojreťazcovej molekuly DNA s veľkosťou asi 36 kb, ktorá nesie koncové obrátené repetície (Horvitz, 1990). Sérotypy, ktoré boli použité na prípravu vektora (Ad2 a Ad5), nie sú spojené s prísnou ľudskou patológiou (Horvitz, 1990). Vírus je extrémne účinný pri zavádzaní svojej DNA do bunky hostiteľa. Adenovírusy môžu infikovať veľké množstvá deliacich sa a nedeliacich sa buniek z celého množstva druhov a vírus môže byť relatívne ľahko produkovaný vo veľkých množstvách. Na rozdiel od retrovírusov sa adenovírusy neintegrujú do génomu bunky hostiteľa. Všetky v súčasnosti používané adenovírusy majú dcléciu v úseku El, kam môže byť zavedená nová DNA. Táto El delécia urobí rekombinantný vírus defektný v schopnosti replikácie (Stratford-Perricauder a Perricaudet, 1991). Toto na jednej strane poskytuje dôležitý bezpečnostný prvok: adenovírusy sa nemôžu replikovať v ľudských bunkách v neprítomnosti E1A proteínov. Adenovírus môže teda dopraviť svoju genetickú informáciu do ľudskej bunky, ale následkom tohto nebude lytická alebo produktívna infekcia. Na druhej strane tu vzniká problém s produkciou týchto vektorov. El funkcie však nemusia byť nutne kódované samotným vektorom. Môžu byť taktiež poskytnuté v trans, vo zvláštnych pomocných bunkách, ktoré exprimujú El gény. Pri infekcii alebo transfekcii týchto pomocných buniek adenovírusovým vektorom s deletovaným El, budú bunkové proteíny El doplňovať replikáciu adenovírusu, výsledkom čoho bude produkcia potomstva adenovírusu. Pomocné adenovírusové bunky musia byť ľudského pôvodu a musia obsahovať a experimentovať AdEl úsek, t.j. ľudské bunky transformované Ad, ako je napríklad bunková línia 293 (Graham a Prevec, 1991) bunková línia 911 (Fallaux a kol., 1996) a bunková línia PER.C6 (Fallaux, 1996).

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka použitia adenovírusového génového nosiča schopného indukovať apoptózu v bunke, obsahujúceho molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu aktivitu podobnú apoptínu, na prípravu liečiva na liečenie transformovaných buniek, pričom apoptóza je vyvolaná v týchto transformovaných bunkách a nastáva redukovaná apoptóza, ak vôbec nejaká, v normálnych diploidných, netransformovaných/nemalígnych bunkách, pričom transformované bunky sú charakterizované hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou.

Takýmto génovým nosičom, ktorý je nezávisle infekčným vektorom, môže byť napríklad vírus, lipozóm, polymér a pod., ktorý sám môže infekciou alebo akýmkoľvek iným spôsobom dopraviť genetickú informáciu do napríklad nádorových buniek, ktoré môžu byť liečené. Genetická informácia obsahuje molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcej aktivitu podobnú apoptínu. V použití podľa vynálezu v adenovírusovom génovom nosiči bola vysoko zvýšená jeho schopnosť exprimovať aktivitu podobnú apoptínu. Prekvapivo bolo zistené, že zmena postupujúcich nekódujúcich sekvencií nukleovej kyseliny, umiestnených v rámci iniciačného miesta translácie, ktoré predchádzajú kódujúcu sekvenciu proteínu podobného apoptínu, zosilňuje výrazne expresiu uvedeného proteínu v nádorových bunkách. V použití podľa vynálezu adenovírusový génový nosič ďalej obsahuje nukleovú kyselinu, kódujúcu aktivitu podobnú VP2. Prekvapivo bolo zistené, že aktivita podobná VP2 pôsobí synergický s apoptínu podobnou aktivitou, týkajúcou sa indukcie apoptózy v nádorových bunkách. Samotný proteín podobný VP2 môže taktiež pôsobiť synergický alebo doplnkovo napríklad pri (chemo)terapeutickej indukcii apoptózy. V použití podľa vynálezu génový nosič obsahuje okrem nukleovej kyseliny kódujúcej aktivitu podobnú apoptínu taktiež nukleovú kyselinu kódujúcu aktivitu podobnú VP2. Napríklad v použití podľa vynálezu adenovírusový génový nosič, ktorým je vírus, defektný na schopnosť replikácie, sa ale môže replikovať v pomocných alebo obalových bunkách, s cieľom produkcie potomstva tohto adenovírusového génového nosiča. Navyše v použití podľa tohto vynálezu génový nosič môže byť ďalej doplnený špecifickým ligandom, smerovacou molekulou alebo smerovacími molekulami, pomocou ktorých môže byť tento génový nosič špecificky smerovaný tak, aby dopravil svoju genetickú informáciu ku zvolenej cieľovej bunke. Takouto smerovacou molekulou môže byť napríklad vírusový adsorbčný proteín, receptorová molekula alebo protilátka, reagujúca s povrchovými receptormi alebo proteinmi nádorovej bunky.

Vynález sa taktiež týka použitia adenovírusového génového nosiča schopného vyvolať apoptózu v bunke, obsahujúceho molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu aktivitu podobnú apoptínu, na prípravu diagnostického prostriedku na diagnostikovanie transformovaných buniek, pričom apoptóza jc vyvolaná v týchto transformovaných bunkách a nastáva redukovaná apoptóza v prípade normálnych diploidných netransformovaných/nemalígnych bunkách, pričom transformované bunky sú charakterizované hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou.

V použití podľa vynálezu adenovírusový génový nosič sa môže napríklad použiť pre in vitro diagnózu, kedy sú z človeka alebo zvieraťa odobraté tkanivové alebo bunkové vzorky alebo biopsie. Takéto vzorky môžu byť vyhodnotené alebo testované tak, že sú priamo alebo v kultúrach infikované uvedeným adenovírusovým génovým nosičom, ktorý je schopný exprimovať napr. apoptínu podobnú aktivitu.

Iba transformované bunky, bunky majúce rôzne stupne hyperplázie, dysplázie alebo metaplázie, alebo nádorové, či rakovinové bunky, exprimujú proteín s apoptínu podobnou aktivitou vo svojom jadre. Prítomnosť uvedeného proteínu môže byť napríklad preukázaná použitím klasických (imunojhistochemických techník, napr. mikroskopicky alebo pomocou automatických technik na triedenie buniek. Druhou možnosťou je využitie skutočnosti, že vyššie infikované bunky sú charakterizované apoptózou a môžu takto byť rozpoznané podľa známych charakteristík apoptózy.

Tento vynález ďalej opisuje všetky kroky, nutné na vytvorenie rekombinantného, v replikách defektného adenovírusu, exprimujúceho látku indukujúcu apoptózu, apoptín. Vysoké titry rekombinantného-apoptínového adenovírusu môžu byť produkované pomocou bunkových línií pakážujúcich adenovírusy, ako sú 293, 911 a PER.C6. V bunkových kultúrach nemá apoptín detekovateľné negatívne účinky na žiadny z nutných krokov replikácie adenovírusu ani na ďalšie časti životného cyklu adenovírusu.

Tento vynález navyše opisuje vytvorenie kontrolného rekombinantného adenovírusu, ktorý obsahuje všetky sekvencie ako rekombinantný-apoptínový adenovírus, ale ktorý vzhľadom k 3'- 5'orientácii sekvencie kódujúcej apoptín, pod kontrolou regulačných častí promótora, nie je schopný exprimovať apoptín. Pomocou tohto kontrolného adenovírusového vektora môžu byť testované špecifické účinky expresie apoptínu rekombinantným adenovírusom.

Rekombinantný, v replikách defektný adenovírus exrimuje apoptín vo vysokých množstvách v rôznych nádorových a/alebo transformovaných bunkách, výsledkom čoho je indukcia apoptózy. Naopak expresia apoptínu, pomocou rekombinantného adenovírusu, v normálnych, netransformovaných ľudských bunkách nemá za následok apoptínom indukovanú apoptózu.

Tento vynález zvlášť opisuje protinádorovú terapiu. Liečenie nádorov (nádorových buniek) sa bude uskutočňovať expresiou apoptínu, pomocou infikovania (nádorových) buniek génovým nosičom, ako je adenovírus, ktorý obsahuje kódujúcu sekvenciu pre proteín s apoptínu podobnou aktivitou. Tento vynález tak opisuje génový nosič, ako je adenovírus, exprimujúci apoptín, ktorý je veľmi účinnou protinádorovou látkou. Adenovírusová regulácia apoptínu neindikuje alebo aspoň nie detekovateľne, apoptózu v normálnych bunkách, čo naznačuje, že toxicita liečby rekombinantným-apoptínovým adenovírusom in vivo bude nízka. Infekciou rekombinantným-apoptínovým adenovírusom môže byť získané oveľa vyššie množstvo (nádorových) buniek exprimujúcich apoptín. Toto zistenie je hlavným vylepšením expresie apoptínu, v porovnaní s transfekciou DNA.

Tento vynález taktiež opisuje prípravu VP2 expresnej jednotky bez syntézy apoptínu a/alebo časti apoptínu. Ďalej je poskytnutý dôkaz, že expresia proteínu VP2, z vírusu kuracej anémie (CAV), zvyšuje apoptózu indukovanú apoptínom v ľudských nádorových bunkách. Presnejšie, VP2 a apoptín pôsobí synergický, čo sa týka indukcie apoptózy v nádorových bunkách. Toto zistenie naznačuje, že výsledkom koexpresie VP2 a apoptínu bude zlepšenie terapií, založených na apoptíne.

Ďalej sa opisuje významné zlepšenie expresie apoptínu pomocou zmeny jeho upstream sekvencie priamo od iniciačného kodónu ATG. Vylepšenie expresie nevyžaduje zámenu aminokyseliny v apoptínovom proteíne, ako bolo stanovené Kozákovým pravidlom. Zlepšenie upstream sekvencie od iniciačného kodónu ARG iných CAV proteínov bude mať taktiež za následok zlepšenie ich syntézy.

Tento vynález taktiež opisuje prípravu retrovírusových vektorov, ktoré exprimujú apoptin v ľudských nádorových bunkách, výsledkom čoho je indukcia apoptózy. Tento výsledok pri rekombinantnom-apoptínovnom retrovíruse v kombinácii s údajmi o rekombinantnom-apoptínovom adenovíruse naznačuje, že expresia apoptínu nie je toxická pre replikáciu DNA ani RNA vírusov.

Expresia apoptínu v (nádorových) bunkách môže byť, okrem adenovírusových a retrovírusových vektorov, uskutočňovaná tiež pomocou infekcie inými DNA a RNA vírusovými vektormi, ktoré obsahujú kódujúce sekvencie pre apoptin. Ďalej môžu byť pre apoptínom indukovanú apoptózu v nádorových bunkách použité vektorové systémy odvodené od vírusov, ako sú plazmovírusy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje schematické znázornenie dôležitých častí adenovírusových adaptorových vektorov pMad5 a pMab.

Obrázok 2 ukazuje schematické znázornenie dôležitých častí adenovírusových rekombinantných adaptorových vektorov pMab-VP3 a pMab-con.

Obrázok 3 ukazuje apoptínom indukovanú apoptickú aktivitu v bunkách 911, transfekovaných pMAb-VP3 alebo pCMV-VP3. Pre infekciu buniek 911 boli použité dve nezávisle klonované a purifikované DNA pMab-VP3 (pMabVP3/ml a pMab-VP3/m2). Bunky boli fixované tri dni po transfekcii a boli analyzované pomocou nepriamej ímunofluorescencie s použitím apoptín-špecifickej monoklonálnej protilátky CVI-CAV-85.1 (85.1 ; Notebom a kol., 1991). Percento buniek, ktoré boli farbené abnormálne DAPI, je uvedené ako relatívna miera apoptózy.

Obrázok 4 ukazuje apoptínom (nazývaným VP3) indukovanú apoptickú aktivitu v ľudských tumorogénnych hepatómových bunkách HepG2, osteosarkómových bunkách U20S a normálnych netransformovaných diploidných keraticonytoch FSK-1, infikovaných rekombinatným-apoptínovým, v replikách defektným adenovirusom Ad.VP3. Bunky boli analyzované pomocou nepriamej imunofluorescencie s použitím monoklonálnej protilátky a farbené DAPI. Bunky HepG2 a USO2 boli fixované 1 deň po transfekcii a bunky FSK-1 boli zberané štyri dni po transfekcii. Percento apoptin pozitívnych buniek, ktoré boli farbené abnormálne DAPI, je uvádzané ako miera apoptínom indukovanej apoptózy (čiarkované stĺpce). Ako kontrola je tu uvedené percento neinfikovaných buniek, ktoré boli DAPI farbené abnormálne (čierne stĺpce).

Obrázok 5 ukazuje apoptínom/VP2-indukovanú apoptickú aktivitu v bunkách Saos-2, transfekovaných 2,5 pg pCMV-fs DNA, exprimujúcu apoptin (skôr nazývaný pCMV-VP3 ; apoptin je nazývaný VP3) a 2,5 pg pCMV-neoBam DNA (Danen-Van Oorschot; 1997) alebo 2,5 pg pCMV-VP DNA, exprimujúcu CAV proteín 2 (VP2) a

2,5 pg pCMV-neoBam DNA ; alebo 2m5 pg pCMV-fs a

2,5 pg pCMV-VP2, výsledkom čoho je expresia apoptínu (VP3) a VP2. Bunky boli fixované 3, 4 a 5 dní a boli analyzované pomocou nepriamej imunofluorescencie s použitím apoptín-špecifickej monoklonálnej protilátky CVI-CAV-85.1 (85.1; Notebom a kol., 1991) alebo monoklonálnej protilátky CVI-CAV-111.1 (Notebom a Koch, 1996). Percento buniek, ktoré boli farbené abnormálne DAPI, je uvedené ako relatívna miera apoptózy.

Obrázok 6 ukazuje schematické znázornenie dôležitých častí rekombinantných adenovírusových adaptorových vektorov pMab-VP2.

Obrázok 7 ukazuje schematické znázornenie dôležitých častí rekombinantného retrovirusového transferového vektora pLS-VP3-N.

Tento vynález bude ďalej vysvetlený detailnejšie na základe nasledujúcich príkladov. Tieto sú iba ilustratívne a nemali by byť vykladané ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Experimentálna časť

Bunky a podmienky bunkovej kultivácie

Ad5 El transformované bunkové línie ľudskej embryonálnej ľadviny (HEK; 293) a ľudskej embryonálnej sietnice (HER; 911 a PER.C6) boli kultivované na Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEN), doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom (FCS) v prostredí 5 % CO₂ pri 37 °C. Bunková línia 293 bola získaná od Američan Type Culture Collection (ATCC CRL 1573). Bunkové línie 911 a PER.C6 boli získané od Fallaux a kol., (1996). Bunkové kultivačné média, činidlá a séra boli kúpené od GIBCO Laboratories (Grand Island, NY). Kultivačné nádoby boli kúpené od Greiner (Níirtingen, Nemecko).

Ľudské epidermálne keraticonyty boli izolované z pokožky a boli kultivované v prítomnosti vrstvy myších 3T3 fibroplastov, ktoré boli smrteľne ožiarené 137-Cs. Primáme kultúry keraticonytov (FSK-1) boli založené na kompletnom médiu, ako je opísané (Rheinwald a Green, 1975) s menšími úpravami.

Tumorogénne keraticonyty, bunky SCC-15 (Rheiwald a Beckett, 1981), odvodené od karcínómu squamóznych buniek, boli kultivované na médiu DMEM/F12 (3 : 1), obsahujúcom 5 % fetálne teľacie sérum, 0,4 pg hydrokortizónu a 1 pM izoproterenol. Bunky HepG2 (Aden a kol., 1979), odvodené od ľudského hepatómu a bunky US02 a Saos-2 (Diller a kol., 1990), odvodené od ľudského osteosarkómu, boli kultivované na DMEM (GIBCO/BLR), doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom. Spontánne transformovaný kmeň keraticonytov HaCat (Boukamp a kol., 1988) bol darom od prof. R. Fuseniga, DKFZ, Hiedelberg, Nemecko. Bunky HaCaT boli kultivované na DMEM, doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom.

Myšie bunkové línie boli kultivované na DMEM s vysokým obsahom glukózy (4,5 gramov na liter) a 10 % fetálnym teľacím scrorn 5 % CO₂ pri 37 °C. Ekotropná pakážovacia bunková línia Psi-2 (Mann a kol., 1983) a amfotrópna pakážovacia bunková línia PA317 boli opísané (Miller, 1990 a,b).

Vírusové techniky

Plakové pokusy boli robené tak, ako bolo opísané (Fallaux a kol., 1996). Stručne, adenovírusové zásobné roztoky boli v sériách rozpustené v 2 ml DMEM, obsahujúcom 2 % konského séra a boli pridané k bunkám 911 na 6-jamkových miskách. Po dvoch hodinách inkubácie pri 37 °C bolo médium nahradené F-15 minimálnym esenciálnym médiom (MEM), obsahujúcim 0,85 % agarózu (Sigma, USA), 20 mM HEPES (pH 7,4), 12,3 mM MgCL, 0,0025 % L-glutamín a 2 % konské sérum (teplom inaktivované pri 56 °C počas 30 min.). Produkcia adenovírusových sérií v malom meradle bola robená tak, ako bolo opísané skôr (Fallaux a kol., 1996). Stručne, monovrstvy buniek 911 alebo PER.C6 boli infikované približne 5 plak-vytvárajúcimi jednotkami (p.f.u.) na bunku, vo fosfátom pufrovanom roztoku NaCl (PBS), obsahujúcom 1 % konské sérum. Po jednej hodine pri izbovej teplote bolo inokulum nahradené čerstvým médiom (DMEM/2 % konské sérum). Po 48 hodinách boli takmer úplne oddelené bunky pozbierané a zhromaždené v 1 ml PBS/1 % konského séra. Vírus bol z produkujúcich buniek izolovaný 3 cyklami rýchleho zmrazenia/rozmrazenia. Lyzáty boli prečistené centrifugáciou pri 3000 rpm počas 10 minút a uložené pri -20°C.

911 a PER. C6 produkované rADV zásobné roztoky boli testované na prítomnosť replikácie schopného adenovírusu uskutočnením PCR analýzy s primermi od Ad5 ITR úseku (5-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3) a EIA kódujúceho úseku (5-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3), ako bolo opísané v Notebom a De Boer (1995), s použitím prístroja Perkin Elmer PCR. Prítomnosť amplifikovaného fragmentu veľkosti 600 bp naznačuje, že v analyzovanom zásobnom roztoku existuje replikácie schopný adenovírus (obsahujúci EI úsek) (Hoeben, nepublikované výsledky). Bunky HepG2 boli infikované sériami rAdV. Počas aspoň 10 dní boli v bunkách sledované možné cytopatogénne účinky a boli testované nepriamou imunofluorescenciou s použitím špecifického monoklonálneho antiséra proti proteínu EIA.

Plazmidy a DNA transfekcie

Adaptorový plazmid pMad5 bol vytvorený zpMLPlO (Levremo a kol., 1991) tak, ako je opísané. Plazmid pMLP-10-lin bol odvodený od pMLPlO inzerciou syntetického fragmentu DNA s jedinečnými miestami pre reštrikčné endonukleázy Mlul, Spil, SnaBI, Spi, AsuII a MunI do miesta HindlII a pMLPlO. Adenovírusový BglI fragment, obsahujúci nukleotidy 3328 až 8914 genómu Ad5 bol vložený do MunI miesta pMLP-lin. Z výsledného plazmidu bol deletovaný fragment SalI-BamHI, s cieľom inaktivácie génu pre tetracyklínovú rezistenciu. Výsledný plazmid bol skontrolovaný reštrikčnou analýzou a pomenovaný ako pMadô. Expresia génov, inzerovaných v mnohopočetnom klonovacom mieste, bude riadená adenovírusovým hlavným neskorým promótorom, ktorý je v tomto usporiadaní spojený s adenovírusovým enhancerom skorého génu 1 (El).

Všetky CAV DNA sekvencie sú pôvodne odvodené od plazmidu pIC-20H/CAV- -EcoRI (Notebom a De Boer, 1996). Expresný plazmid pCMV-fs, skôr nazývaný pCMV-VP3 (Notebom a kol., 1994A) obsahuje CAV DNA sekvencie, kódujúce výhradne apoptín (nt 427-868).

Plazmid pCMV-VP2mu (Notebom, nepublikované výsledky) obsahuje CAV DNA sekvencie od 380 do 1512. Tento CAV DNA fragment obsahuje kódujúci úsek VP2, ohraničený 25 bp 5'-nekódujúcou CAV DNA sekvenciou. 106 bp downstream od štart kodónu pre VP2 je v inom čítacom rámci umiestnený štart kodónu pre apoptín. Na zabránenie syntézy apoptínu bez bránenia syntéze VP2 bola do iniciačného kodónu apoptínu zavedená mutácia (ATG bolo zamenené na ACG) a ďalej bola vytvorená bodová mutácia v pozícii 549 (T bolo zamenené za A), výsledkom čoho bol extra stop kodón v géne kódujúcom apoptín. Vložená sekvencia bude tak exprimovať iba proteín VP2 celej dĺžky. Nepriamou imunofluorescenciou bolo ukázané, že VP2 mohol byť produkovaný, ale apoptín sytentetizovaný nebol.

Na klonovanie PCR-amplifíkovaných DNA fragmentov bol použitý plazmid pCR-3.1, ktorý bol zakúpený od InVitrogene (Carlsbad, CA). Na vytvorenie rekombinantného, v replikách defektného retrovírusu, exprimujúceho apoptín, bol použitý retrovírusový vektor pLXSN (Miller, 1990 a,b).

Všetky klonovacie kroky splazmidovou DNA boli v podstate uskutočňované podľa metód, uvedených v Manniatis a kol., (1992).

Všetky enzýmy boli zakúpené od Boehringer Mannheim, Nemecko a/alebo BioLabs, USA.

Plazmidová DNA bola purifikovaná centrifugáciou v gradiente CsCl a kolónovou chromatografiou v Sephacrylu S500 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Ľudské bunkové línie HaCAT, HepG2, SCC-15, 293, 911 a PER.C6 boli transfekované plazmidovou DNA pomocou zrážania fosforečnanom vápenatým, ako je opísané v Graham a Van der Eb (1973). Normálne ľudské diploidné keraticonyty (FSK-1, druhá pasáž), bunky U20S a Saos-2 boli transfekované pomocou DOTAP (Fischer a kol., 1996).

Nepriama imunofluorescencia

Bunky boli fixované 80 % acetónom a boli použité v imunofluoroscenčných pokusoch v CAV-špecifickými alebo pre adenovírusový EIA špecifickými monoklonálnymi protilátkami a kozími, protimyšími a/alebo kozími protikrálikovými IgC, spojenými s fluresceínom (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, P A), ako je opísané v Notebom a kol., (1990). Jadrová DNA bola farbená 2,4-diamino-2-fenylilindolom (DAPI) alebo propidiumjodidom (PI).

Výsledky a diskusie Vytvorenie adaptorového vektora pMab

S cieľom zavedenia miesta pre reštrikčný enzým do adaptorového plazmidu pMad5 bol tento plazmid štiepený reštrikčným enzýmom Clal a bol upravený teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Clal/BamHI linker bol upravený T4 kinázou, bol ligovaný sám so sebou s použitím T4-DNA ligázy a následne bol štiepený Clal. Clal/BamHI/Clal linker bol izolovaný a ligovaný do linearizovaného vektora pMad5. Ligačnými produktami bol transformovaný bakteriálny kmeň JM 109.

Konečný vektor pMab bol charakterizovaný štiepením reštrikčnými enzýmami. Pri využití vektora pMab môžu byť cudzie gény ligované do jedinečného BamHI miesta pod kontrolu adenovírusového hlavného neskorého promótora. Schematické znázornenie pMad5 a pMab je na obrázku 1.

Vytvorenie rekombinantného-apoptínového a kontrolného adaptorového vektora.

S cieľom vytvorenia adaptorového vektora na zavedenie apoptinového génu do adenovírusu bol pMab štiepený BamHI a následne upravený teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Potom bol pCMV-fs upravený BamHI a bol izolovaný 0,45 kb dlhý fragment DNA, obsahujúci sekvencie kódujúce apoptín. Fragment apoptínovej DNA bol ligovaný do BamHI miesta linerizovaného adaptorového vektora pMab.

Ligačné produkty boli klonované do bakteriálneho kmeňa JM 109. Orientácia apoptínu v pMab bola určená pomocou analýzy reštrikčnými enzýmami.

pMab konštrukt, obsahujúci apoptínový gén v 5'- 3' orientácii pod kontrolou adenovírusového hlavného neskorého promótora bude exprimovať tento apoptínový gén. Tento apoptínový vektor bol nazvaný pMab-VP3 a bude použitý na prípravu adenovírusového vektora, exprimujúceho apoptín. pMab DNA plazmid, obsahujúci sekvencie kódujúce apoptín v 3 - 5' orientácii downstream od adenovírusového hlavného neskorého promótora, tento apoptínový gén exprimovať nemôže. Tento adaptorový vektor bude použitý na prípravu kontrolného rekombinantného adenovírusového vektora.

Schematické znázornenie obidvoch rekombinantných adaptorových vektorov je na obrázku 2.

Indukcia apoptózy CMV plazmidom v porovnaní s rekombinantným-apoptínovým adaptorovým vektorom, exprimujúcim apoptín.

Najskôr sme vyskúšali, či je pMab-VP3 DNA vektor naozaj schopný exprimovať apoptín v transfekovaných bunkách, zatiaľ čo pMab-con by toho schopný nemal byť. S tým cieľom boli ľudské, adenovírusom transformované bunky 293 a 911 transfekované pMab-VP3, pMab-con a pre pozitívnu kontrolu taktiež pCMV-VP3. Približne dva dni po transfekcií boli bunky fixované a testované na expresiu apoptínu pomocou nepriamej imunofluorescencie. Bunkové kultúry, transfekované pCMV-VP3 a pMab-VP3, obsahovali asi 1 % buniek, ktoré reagovali s monoklonálnou protilátkou, špecifickou pre apoptín, zatiaľ čo bunkové kultúry, transfekované pMab-con ho neobsahovali. Tieto výsledky znamenajú, že pMab-VP3 apoptín exprimuje a ako bolo očakávané, pMab-con ho neexprimuje.

V ďalších transfekčných pokusoch bola analyzovaná indukcia apoptózy v bunkách 911 po transfekcií pMab-VP3 v porovnaní s pCMA-VP3. Tri dni po transfekcií boli bunky 911 zbierané a testované pomocou nepriamej imunofluorescencie na expresiu apoptínu.

Navyše boli tieto bunky farbené DAPI alebo Pl, ktoré farbia silne intaktnú DNA, ale apoptickú DNA farbia slabo a/alebo nepravidelne (Telford, 1992).

Približne 60 % apoptín pozitívnych buniek 911, transfekovaných pMab-VP3, bolo apoptických, na druhej strane v apoptín-pozitívnych bunkách, transfekovaných pCMV-VP3, došlo k apoptóze asi v 40 % z nich. Tieto výsledky naznačujú, žc pMab-VP3 regulovaná expresia apoptínu má za následok podobnú alebo o niečo väčšiu úroveň indukcie apoptózy ako apoptín, exprimovaný pCMV-VP3. Výsledky sú ukázané na obrázku 3. Ďalej, apoptín je schopný indukovať apoptózu v ľudských adenovírusom transformovaných bunkách, E1B neinhibuje apoptózu indukovanú apoptinom. E1B je naopak schopný blokovať apoptózu indukovanú celým radom chemoterapeutických činidiel. Tieto výsledky naznačujú, že apoptín je veľmi účinnou protinádorovou látkou.

Vytvorenie rekombinantného-apoptínového adenovírusu

Rekombinantné-apoptínové adenovírusové vektory boli vytvorené kotransfekciou adaptorových plazmidov pMab-VP3, nesúcich kódujúce sekvencie pre apoptín a niektoré adenovírusové sekvencie a plazmidové DNA JM17, obsahujúce celú adenovírusovú DNA bez úseku El a E3 (McGrory a kol., 1988), do pomocnej bunkovej línie 911. Kotransfekcie boli uskutočnené s DNA, vyzrážanou fosforečnanom vápenatým, ako je opísané v Graham a Van der Eb (1973). Rekombinantná adenovírusová DNA je vytvorená homológnou rekombináciou medzi homológnymi vírusovými sekvcnciami, ktoré sú prítomné vplazmidoch pMab-VP3 a v adenovírusovej DNA v JM17.

Podobným spôsobom boli uskutočnené kotransfekcie buniek 911 pMab-con a pJM17 DNA, s cieľom vytvorenia kontrolného adenovírusu, ktorý namôže exprimovať apoptín a ktorý bude použitý ako adenovírusová kontrola pri testovaní apoptínom indukovaných apoptických účinkov.

Niekoľko hodín po transfekcií boli monovrstvy buniek 911 prevrstvené vrstvou agarózy a boli inkubované pri 37 °C, pokiaľ neboli plaky, indukované rekombinantným adenovírusom jasne viditeľné. Vírusy boli z plakov zberané ako zásobné roztoky PBS-konského séra, ako je opísané vo Fallaux a kol., (1996). Následne bola časť zásobných roztokov rekombinantných vírusov pridaná na 24 jamkové misky, ktoré obsahovali čerstvé bunky 911.0 niekoľko dní neskôr boli tieto infikované bunky 911 lyzované a rekombinantné vírusy boli pozberané.

Potom bola testovaná expresia apoptínu v potenciálnych rekombinantných-apoptínových adenovírusoch (rAdVP3) alebo ich absencia v kontrolných rekombinantných adenovírusoch (rAd-con). Časť zásobných rekombinantných vírusov, odvodených z infikovaných 24 jamkových misiek, bola použitá na infekciu čerstvých buniek 911, ktoré vyrástli ako monovrstvy na sklom krytých pásoch. Po jednom dni boli infikované bunky fixované acetónom a analyzované imunofluorescenciou s použitím pre apoptín-špecifickej monokíonálnej protilátky 85.1. Päť z piatich analyzovaných kultúr buniek 911, infikovaných údajným rAD-VP3, obsahovalo bunky exprimujúce apoptín. Žiadna z buniek, infikovaných Ad-con a neinfikovaných buniek 911 nebola pozitívna na apoptín.

Tieto výsledky znamenajú, že pri kotransfekcii adenovírusových pakážovacích bunkových línií, ako sú bunky 911, požadovanou adaptorovou a adevírusovou DNA, môžu byť vytvorené životaschopné rAD-VP3, exprimujúce apoptín.

Dva zásobné roztoky, odvodené od plakov rAd-VP3 a rAD-con boli použité na purifikáciu rAD uskutočnením troch následných plakových purifíkácii s bunkami 911 alebo súbežne v pokuse s obmedzeným zriedením na PER.C6 bunkách, ako je opísané Fallauxom (1996).

Na základe opísaných metód, ktorých výsledkom bola produkcia rAD-VP3, exprimujúceho apoptín pod kontrolou adenovírusového hlavného neskorého promótora, sa taktiež podarila expresia apoptínu pod kontrolou promótora cytomegalovírusu (CMV). Tieto výsledky ukazujú, že môžu byť produkované rôzne typy rekombinantných adenovírusov, regulujúcich jedným zo svojich alebo heterológnych promótorových úsekov.

Produkcia rAd-VP3 a rAd-con, za použitie PER-C6 buniek

Produkcia sérií TAD-VP2 a rAd-con v malom meradle, s použitím PER.C6 buniek bola uskutočnená tak, ako je opísané vo Fellaux, 1996. Stručne, postup je opísaný v experimentálnej časti.

Pomocou piakových pokusov bolo určené, že titry rAd-VP3 a rAd-con boli približne 10'^1-12 na ml čistého lyzátu. Získané titry nie sú nižšie ako titry pozorované v našom laboratóriu pre iné rAd.

Pomocou PCR a infekcie HepG2 rAd-VP3 a rAd-con bolo testované, či vytvorené dávky vírusu obsahujú replikácie schopný adenovírus (pozri taktiež experimentálnu časť). rAd-VP3 ani rAd-con neobsahovali RCA, ako bolo dokázané obidvoma metódami.

Bol vyvodený záver, že expresia apoptínu v podmienkach tkanivovej kultúry nezasahuje negatívne do žiadneho z nutných krokov životného cyklu adenovírusa. Génová terapia, založená na adenovírusovom vektore, exprimujúcom apoptín, je možná.

Vzhľadom na expresiu anti-apoptického Ad-5 El proteínu (White, 1996), indukuje apoptín apoptózu optimálne potom, čo bol rekombinantný, apoptín exprimujúci adenovírus produkovaný vo veľkých množstvách. Skutočnosť, že môže byť adenovírusový vektor, exprimujúci apoptín, produkovaný v ľudských bunkách, transformovaných El proteínom adenovírusu typu 5(Ad 5), ako sú bunky 293, 911 a PER,C6, naznačuje, že proteín El umožňuje tomuto DNA

SK 285724 Β6 vírusu množenie do vysokých titrov v prítomnosti apoptózu-indukujúceho proteínu apoptínu.

Tieto výsledky naznačujú, že je taktiež možné vytvoriť iné rekombinantné vektory DNA vírusov, exprimujúce apoptín v bunkových líniách, transformovaných proteínom El adenovírusu 5. Napríklad rekombinantné parvovírusové vektory, založené na H-l alebo MVM parvovírusoch, môžu byť množené v bunkách 291 T, ktoré sú transformované Ad5 El proteínom (Dinsart a kol., 1996).

H-l a MVM parvovírusy špecificky indukujú bunkovú smrť v transformovaných bunkách, ale nie vo všetkých (Lopez-Guerrero, 1997). Parvovírusové vektory, exprimujúce apoptín, budú viac účinné v indukovaní nádorovo špecifickej apoptózy ako parvovírusy samy osebe, vzhľadom na ďalšiu nádorovo špecifickú indukciu apoptózy apoptínom (Dinsart a kol., 1996, Danen-Van Oorschot, 1997). Protokol na prípravu rekombinantných-apoptínových vektorov, založená na Ad5 El proteínom transformovaných bunkách, bude taktiež platiť pre RNA vírusy, ako sú retrovírusy.

Indukcia apoptózy v ľudských transformovaných a/alebo malígnych bunkových líniách.

Skúšali sme, či infekcia ľudských nádorových buniek rAd-VP3 bude mať za následok apoptínom indukovanú apoptózu. Na tento účel boli ľudské hepatómové bunky HepG2, osteosarkómové bunky U20S, bunky SCC15 odvodené od karcinómu sqaumóznych buniek a bunky z bunkovej línie spontánne transformovaných keratinocytov Ha-Cat infikované rAd-VP3. Jeden deň po transformácii boli bunky fixované a boli testované pomocou imunofluorescencie a farbenia DAPI na syntézu apoptínu a to, či pri nich došlo kapoptóze. Už jeden deň po infekcii bola väčšina analyzovaných apoptín-pozitívnych buniek apoptická. V neinfikovaných kultúrach bolo apoptických iba niekoľko percent ľudských nádorových buniek. Výsledky v bunkách HapG2 a U20S sú ukázané na obrázku 4.

Tieto výsledky naznačujú, že apoptín exprimovaný rAd-VP3 môže indukovať apoptózu v rôznych malígnych a/alebo transformovaných bunkových líniách.

Expresia apoptínu v normálnych bunkách, infikovaných rAD-VP3

S cieľom analyzovania účinku apoptínu, exprimovaného rAd-VP3, v normálnych netransformovaných bunkách, boli bunky FSK-1 infikované rAd-VP3. Štyri dni po transfekcii boli bunky analyzované pomocou nepriamej imunofluorescencie s použitím monoklonálnej protilátky 85.1 a farbenia DAPI. Najviac 8 % z apoptín-pozitívnych buniek malo abnormálne DAPI-farbenie, čo naznačuje, že pri nich možno došlo k (apoptínom)- indukovanej apoptóze. Ale abnormálne DAPI-farbenie DNA malo 7 % buniek, ktoré infikované neboli. Výsledky sú ukázané na obrázku 4.

Vzhľadom na hepatotrópnu povahu ľudského Ad5 je taktiež dôležité zistenie účinkov apoptínu v normálnych diploidných hepatocytoch.

Na tento účel boli kultivované izolované hepatocyty krýs na Williamsovom E médiu (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA) doplnenom o inzulín (2 mU/ml) a dexametazon (1 nM). Bunky sa nechali rásť na kolagénom obalených kultivačných doskách (Micronic).

Pôvodné krysie hepatocyty boli infikované adenovírusovým vektorom Ad-VP3 exprimujúcim apoptín, kontrolným adenovírusom exprimujúcim LacZ alebo boli infikované falošne. Dva dni potom boli tieto bunky fixované a pomocou imunofluorescencie a farbenia DAPI bolo zistené percento apoptických buniek. Nebol pozorovaný žiadny rozdiel v percentách mŕtvych buniek pri expresii apoptínu, LacZ či pri falošne infikovaných bunkách. Tieto pozorovania naznačujú, že pri (krysích) hepatocytoch nedochádza k apoptínom indukovanej apoptóze, aj keď je apoptín syntetizovaný pomocou adenovírusového vektora.

Tieto výsledky naznačujú, že rAd-VP3 riadená expresia apoptínu nemá za následok apoptínom indukovanú apoptózu v normálnych netransformovaných ľudských bunkách, na rozdiel od transformovaných/tumoregénnych ľudských buniek.

Zvýšenie syntézy apoptínu

S cieľom testovania vplyvu sekvencií priamo pred ATG- iniciačným kodónom apoptínu boli vytvorené dva pCR-3.1-apoptínové konštrukty. pCR-VP3ori obsahuje pôvodnú sekvenciu (5-TTCAA-3) priamo upstream od ATG-iniciačného kodónu, zatiaľ čo druhý konštrukt, pCR-VP3 obsahuje priamu upstream sekvenciu 5-GCCAAC-3. Pomocou in vitro transkripčne/translačného pokusu na pšeničnom zárodku bolo zistené, že expresia apoptínu pri pCR-VP3mu bola aspoň 5x vyššia ako pri pCR-VP3ori. Tieto údaje naznačujú, že povaha priamej upstream sekvencie pri AGT apoptínc ovplyvňuje syntézu apoptínu. Vytvorenie (vírusových) vektorov s priamou upstream sekvenciou 5-GCCAAC-3 pred ATG kodónom apoptínu bude mať za následok vyššiu produkciu apoptínu a nepriamo zvýši apoptínom indukovanú apoptózu.

Taktiež je dôležité povedať, že aminokyselinová sekvencia apoptínu nie je zmenená, čo je podľa „Kozákovho pravidla“ (Caventer a Suart, 1991) na zvýšenie translačnej účinnosti považované za nutné. Podľa tohto pravidla by sme mali zmeniť nukleotid v pozícii +4 z A na G, výsledkom čoho by bola iná aminokyselina apoptínu, čo by zmenilo jeho aktivitu.

Identifikácia esenciálnych apoptínových fragmentov obsahujúcich apoptínovú aktivitu.

S cieľom zistenia, či je nejaká časť apoptínového proteínu esenciálna na apoptotickú aktivitu, bol vytvorený plazmid kódujúci chiméme proteíny zložené z Green-fluorescencie proteínu (GFO, Rizzuto, 1995) a N-terminálnych 71 aminokyselín apoptínu (N-apoptin) alebo jeho C-terminálnych 50 aminokyselín (C-apoptín). Ľudské transformované bunky, ako sú bunky Saos-2 (Zhuang, 1995), boli prechodne transfekované plazmidmi, exprimujúcimi GPF/N-apoptín alebo GPF/C-apoptín. K apoptín-špecifickej apoptóze došlo len v Saos-2 bunkách, exprimujúcich GFP/C-apoptín. Toto zistenie súhlasí s faktom, že C-apoptín (spojený s GFP) môže vstúpiť do jadra.

Tieto výsledky naznačujú, že na indukciu apoptózy v (ľudských) tumorogénnych/transformovaných bunkách môže byť dostačujúca časť apoptínu. Je teda možné taktiež vyvinúť účinnú (génovú) terapiu, založenú na (vírusových) vektoroch, exprimujúcich iba túto časť apoptínu. Tieto údaje ďalej naznačujú, že časť apoptínu obsahuje apoptickú aktivitu, keď je kovalentne viazaná na cudzí proteín.

Koexpresia VP2 v ľudských nádorových bunkách synergicky zvyšuje indukciu apoptózy.

S cieľom testovania vplyvu koexpresie VP2 na indukciu apoptózy boli bunky Saos-2(ko)transfekované pCMV-fs, exprimujúcim apoptín a/alebo pCMV-VP2, exprimujúcim VP2. Tieto bunky boli fixované acetónom v rôznych časových intervaloch po transfekcii. Pomocou nepriamej imunofluorescencie boli monoklonálnou protilátkou CVI-CAV-111.1 (Notebom a Koch, 1996) určené VP2- pozitívne bunky a monoklonálnou protilátkou CVI-CAV-85.1.

boli určené apoptín-pozitívne bunky. Tretí deň po transfekcii došlo k apoptóze iba v 3 % VP2-exprimujúcich bunkách a iba pri asi 10 % apoptín exprimujúcich bunkách. Naopak, apoptotických bolo už asi 40 % Saos-2 buniek, exprimujúcich VP2 apoptín. Taktiež štvrtý deň po transfekcii bolo percento VP2/apoptín-pozitívnych buniek, pri ktorých došlo k apoptóze, významne vyššie ako pri bunkách, ktoré exprimovali samotný apoptín alebo VP2.

Tieto výsledky ukazujú, že VP2 zvyšuje apoptínom-indukovanú apoptózu a sú ukázané na obrázku 5.

Vytvorenie a produkcia rAd-VP2

S cieľom vytvorenia rekombinantného adenovírusu, exprimujúceho vírusový proteín 2 (VP2) vírusu kuracej anémie, bol pripravený adaptorový plazmid pMAb-VP2. Z plazmidu pCMV-VP2mu, obsahujúceho všetky VP2 sekvencie, ale s dvoma mutáciami v úseku kódujúcom apoptín (pozri experimentálnu časť), bol izolovaný BamHI fragment veľkosti 1,1 kb a bol ligovaný do adaptorového vektora pMab, linearizovaného BamHI a upraveného teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Výsledný konštrukt pMab-VP2 bol charakterizovaný reštrikčnou a sekvenčnou analýzou a je ukázaný na obrázku 6.

rAD-VP2 bol vytvorený kotransfekciou buniek 911 pMab-VP2 DNA a pJM17 DNA. Kontransfekcia a všetky ďalšie požadované kroky, nutné pre charakterizáciu, purifikáciu a produkciu rAD-VP2, boli uskutočňované tak, ako je opísané pre rAD-VP a rAd-con. Pomocou nepriamej imunofluorescencie, s použitím monoklonálnej protilátky CV1-CAV-111.1 sa ukázalo, že bunky 911 a PER.C6. infikované rAd-VP2, naozaj môžu exprimovať VP2 proteín.

Príprava retrovírusového vektora exprimujúceho apoptín

S cieľom vytvorenia plazmidu pL-VP3-SN (pozri obr. 7) bol BamHI fragment, nesúci sekvenciu kódujúcu apoptín, vložený do jedinečného miesta BamHI pLXSN. Správna orientácia inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. S cieľom overenia neporušenosti inzertu bol plazmid pL-VP3-SN transfekovaný pomocou techniky koprecipitácie fosforečnanom vápenatým, do buniek COS-7 a HepG2. Štyri dni po transfekcii boli bunky fixované a analyzované monoklonálnou protilátkou 85,1 na expresiu apoptinového proteínu. V približne 1 - 2 % buniek mohla byť expresia apoptínu detekovaná. Vo väčšine buniek došlo k apoptóze, ako bolo zistené farbením DAPI. Tieto údaje ukazujú, že provirusový LTR promótor je schopný riadiť expresiu apoptínu, že jeho gén je v DNA konštrukte intaktný a že v transfekovaných bunkách HepG2 a COS-7 expresia apoptínu indukuje apoptózu.

S cieľom vytvorenia vírusu bol plazmid pL-VP3-SN transfekovaný do buniek Psi-2 a PA 317 pomocou techniky koprecipitácie fosforečnanom vápenatým. Štyridsať osem hodín po transfekcii bol z buniek pozberaný supematant a roztoky boli použité na infekciu buniek HepG2 (supematant PA317) a buniek NIH3T3 (supematant Psi-2) v prítomnosti 4 pg/ml polybrenu. Štyri dni po transfekcii boli bunky fixované a analyzované farbením monoklonálnou protilátkou 85.1 na expresiu apoptinového proteínu. Približne v 1 % buniek bola zistená expresia apoptínu. Väčšina buniek NepG2 pozitívnych na apoptín bola apoptická. Tieto údaje ukazujú, že tieto bunky boli transdukované L-apoptín-SN retrovírusom. Tieto údaje ďalej dokazujú, že jediná kópia provírusu je dostatočná na expresiu dostatočných množstiev apoptínu na detekciu imunofluorescenciou a že je toto množstvo dostatočné na indukciu apoptózy v ľudských nádorových bunkových líniách, menovite hepatómovej bunkovej línii HepG2.

Spolu tieto výsledky dokazujú, že môžu byť vytvorené retrovirusové vektory nesúce apoptínový gén a že môžu byť použité na indukciu apoptózy v ľudských nádorových bunkách. Toto formálne dokazuje, že ani apoptínový gén ani jeho expresia nebráni nevyhnutným krokom v životnom cykle retrovírusu. Taktiež to dokazuje, že retrovírus obsahujúci apoptín môže byť produkovaný v množstvách, dostatočných na použitie pri transdukcii ľudských nádorových buniek v tkanivových kultúrach.

Tieto výsledky ďalej znamenajú, že expresia apoptínu a následne apoptínom-indukovaná apoptóza v (ľudských) nádorových bunkách bude taktiež možná za využitia vektorových systémov, odvodených od (retro)vírusov, ako plazmovírusu (Noquiez-Hellin, 1996). Kritickým miestom takéhoto rekombinantného plazmovírusu, exprimujúceho apoptín, je to, či nie je jeho replikácia blokovaná expresiou apoptínu. Poskytnutý bol dôkaz, že v prípade opísaného rekombinantného-apoptínového retrovírusu, znamenajúceho úspešnú produkciu rekombinantného-apoptínového plazmovírusu, tomu tak v skutočnosti nie je.

Diagnostické pokusy na rakovinových bunkách rAD-VP3

Bunkové umiestnenie apoptínu je iné ako v tumorogénnych/transformovaných ľudských bunkách v porovnaní s normálnymi netransformovanými bunkami. Ďalším markerom je navyše špecifická schopnosť apoptínu indukovať apoptózu v tumorogénnych/transformovaných bunkách a nie v normálnych bunkách.

Pomocou infekcie buniek rAd-VP3 a analyzovania umiestnenia apoptínu a/alebo indukcie apoptózy v týchto bunkách je možné dokázať, či je bunka malígna alebo nie. Pôvodné bunky sú izolované z (podozrivého) tkaniva a sú pestované na požadovanom médiu. Bunky sú infikované rAd-VP3, paralelne s rAd-con a sú následne analyzované. Napríklad s použitím imunofluorescenčného pokusu založeného na monoklonálnych protilátkach špecifických pre apoptín, 85.1. V bunkách bude preverované, či majú apoptín v cytoplazme (normálne bunky) alebo v jadre (transformované bunky). Navyše alebo miesto toho bude stanovené percento apoptických buniek. Ak je percento apoptických buniek významne vyššie v bunkách infikovaných rAd-VP3 ako v bunkách infikovaných rAd-con, sú tieto bunky malígne.

Pokusy zisťujúce toxicitu rekombinantného-apoptínového adenovírusu v zdravých krysách.

V tkanivových kultúrach ncindukuje apoptín, exprimovaný rekombinantným adenovírusom rAd-VP3 v normálnych bunkách, napr. ľudského alebo hlodavčieho pôvodu, apoptózu. V opísanom pokuse, bolo zisťované, či expresia apoptínu pomocou rekombinantného adenovírusového vektora rAd-VP3 v zdravých krysách nemá za následok akútnu toxicitu.

Použitý vektor rAd-VP3 a kontrolný rAd vektor sa nechali narásť na PER.C6 bunkách a pomocou PCR analýzy bolo preukázané, že sú negatívne na prítomnosť replikácie schopného adenovírusu (RCA-free). rAd boli purifikované pomocou centrifugácie v gradiente CsCl.

Samcom Wag/Rij krýs (Harlan, Holansko), s telesnou hmotnosťou okolo 200 gramov, bol infikovaný rekombinantný adenovírus exprimujúci apoptín (rAd-VP3 2,5xl0⁹ plak tvoriacich jednotiek, pfu) a kontrolný rekombinantný adenovírus, exprimujúci génový produkt luciferázu (rAdluc, 2,5x10⁹). Obidva adenovirusové vektory boli resuspendované vo fosfátom pufrovanom roztoku NaCl, obsahujúcom 0,1 % hovädzieho sérového albumínu a 10 % glycerolu (PBS+). Tento roztok bez adenovírusového vektora bol taktiež infikovaný krysám a slúži ako negatívna kontrola. Dvom krysám bol injekovaný intravenózne, intraperitoneálne alebo subkutánne buď rAd-VP3, rAd-luc alebo PBS+suspenzia.

Makroskopická patalogická analýza krýs, na ktoré bolo pôsobené Ad-VP3.

Prvým spôsobom, ako zistiť možný toxický účinok Ad-VP3-exprimovaného apoptínu, bolo posúdenie celkového zdravotného stavu a najmä telesnej hmotnosti liečených krýs, čo bolo robené každý deň po injekcii. Všetky krysy boli počas pokusu v dobrom zdravotnom stave. Telesná hmotnosť sa v rôznych skupinách významne nelíšila. Po jednom týždni pribrali všetky testované krysy, vrátane tých, ktorým bol injekovaný rAd-VP3, na váhe, čo naznačuje, že žiadne z týchto zvierat netrpelo toxicitou, spôsobenou liečbou rAd-VP3. S cieľom ďalšieho potvrdenia akútnej toxicity boli urobené nasledujúce merania. Dve hodiny pred utratením bol všetkým krysám injekovaný BrdU. Po utratení bolo niekoľko tkanív (pečeň, ľadvina, črevá, srdce, pľúca, slezina, gonády a penis) priamo testované patologicky a/alebo zhromaždené na ďalšiu histopatologickú analýzu (pozri nižšie).

Makroskopická analýza ukázala, že žiadna z krýs, liečená Ad-VP3, nemala orgány s významnými patalogickými prejavmi.

Testovanie Ad-VP3 v pečeni

Hlavným cieľom vnútrožilovo injekovaného (rekombinantného) adenovírusu (vektora) je pečeň a v istom rozsahu aj slezina. Akékoľvek toxické prejavy apoptínu budú tak pozorované v pečeni.

Bol urobený súbor pokusov na testovanie prítomnosti Ad-VP3 DNA, expresia apoptínu Ad-VP3 a možných cytopatologických prejavov v pečeni. Najskôr pomocou Southem blot analýzy bolo zisťované, či v deň utratenia, čo znamená 8 dní po injekcii, obsahovala DNA, izolovaná z pečene krýs, liečených Ad-VP3, apoptínovú DNA. Ako negatívna kontrola bola súbežne testovaná DNA z pečene krýs, ktorým bol injekovaný Ad-luc. Pred nanesením DNA na agarózový gél, bola DNA štiepená BamHI, výsledkom čoho bol fragment apoptínovej DNA veľkosti okolo 0,5 kb. Southem blot bol hybridizovaný so sondou apoptínovej DNA, značenou ³²P.

BamHI fragment apoptínovej DNA bol na Southem blotu jasne viditeľný v prípade DNA získanej z krýs, na ktorú bolo pôsobené Ad-VP3 a ako bolo očakávané, bol neprítomný v dráhach obsahujúcich DNA izolovanej z krýs, na ktoré bolo pôsobené kontrolným rAd-luc. S cieľom stanovenia množstva kópií Ad-VP3 v pečeni boli na Southem blot súbežne nanesené a hybridizované so značenou sondou apoptínovej DNA rôzne množstvá apoptínovej DNA. Ešte osem dní po vnútrožilovej infekcii mohlo byť zistené 0,25 Ad-VP3 kópií na bunku, čo naznačuje veľmi významnú transdukciu Ad-VP3 v pečeni.

Expresia apoptínu a jeho toxické prejavy v pečeňových bunkách

Pomocou imunofarbenia parafínových častí pečene, na ktoré bolo pôsobené Ad-VP3 alebo kontrolnej pečene, s použitím apoptín-špeciflckých monoklonálnych protilátok CVI-CAV-85.1 alebo CVI-CAV-111.3, bolo dokázané, že asi 20 - 30 % pečeňových buniek zo živočíchov, na ktoré bolo pôsobené Ad-VP3, eprimovalo apoptín. Časti pečene kontrolných krýs boli na apoptín negatívne.

S cieľom testovania možných cytotoxických vplyvov apoptínu, exprimovaného Ad-VP3, na pečeňové bunky, bo li uskutočnené dve rôzne metódy. Najskôr boli časti pečene krýs, na ktoré bolo pôsobené Ad-VP3 a obidvoch typov kontrolných krýs farbené hematoxylín-eozínom (HE). Vo všetkých testovaných častiach pečene neboli pozorované žiadne morfologické patalogické zmeny, čo naznačuje, že expresia apoptínu nie je pre pečeňové bunky toxická. Škodlivé účinky môžu byť sledované pomocou značenia BrdU, ktoré detekuje nové rozdelené pečeňové bunky. V prípade pečene, obsahujúcej Ad-VP3, bolo množstvo BrdU-značených pečeňových buniek podobného rozsahu (asi 2 %) ako pri kontrolných krysách, na ktoré bolo pôsobené Ad-luc. Expresia apoptínu sama osebe tak nemá in vivo žiadne významné toxické účinky.

Apoptín nemá žiadne toxické účinky v in vivo modeli.

Makroskopická, rovnako ako histologická analýza v kombinácii s biochemickými a imunologickými údajmi ukázala, že expresia apoptínu nemá žiadne (akútne) toxické účinky v in vivo modeli.

Tieto výsledky naznačujú, že liečba, založená na expresii apoptínu za využitia génového nosiča alebo iných metód, nebude mať žiadne negatívne vedľajšie účinky.

Protinádorové štúdie na modeli ľudského hepatómu

Ad-VP3 riadená expresia apoptínu má za následok indukciu apoptózy v ľudských transformovaných bunkách v podmienkach tkanivovej kultúry. Napríklad, výsledkom Ad-VP3 riadenej expresie apoptínu je apoptóza v bunkách HepG2, odvodených od ľudského hepatómu. In vivo protinádorová aktivita apoptínu (napr. exprimovaného Ad-VP3) nebola doteraz testovaná.

Preto bolo zisťované, či bude mať Ad-VP3 riadená expresia apoptínu za následok protinádorovú aktivitu v in vivo modeli. Na tento účel bolo samcom Balb/C/nu/nu myší podkožné zo strany injekovaných lxlO⁶ ľudských buniek HepG2.

Ľudské hepatómové bunky boli injekované každej myši aspoň na dvoch alebo troch miestach. Tri týždne po injekcii sa vyvinuli jasné hepatómové nádory. Boli podkožné zreteľné a mali priemernú veľkosť aspoň 5x5 mm.

Do nádorov boli injekované vektor rAd-VP3 a kontrolný vektor rAd-conl, rozpustené vo fosfátovom pufŕovom roztoku NaCl, 5 % sacharóze a 0,1% hovädzom sérovom albumíne. Použitý vektor rAd-VP3, exprimujúci apoptín a kontrolný vektor rAd-conl, obsahujúci apoptínový gén v 3 '- 5'(obrátene alebo anti-sense) orientácii proti Ad MLP promótora, sa nechali narásť na PER.C6 bunkách. Pomocou PCR analýzy bolo ukázané, že sú obidva kmene rekombinantných adenovírusov RCA-free. rAD boli purifikované s použitím centrifugácie v gradiente CsCl. Do každého nádoru bolo injekované 7x10⁹ pfu rAd partikulí v 40 mikrolitroch suspenzie. Obidvoma typmi rAd vektora bolo liečených 6 myší s 2 alebo 3 HepG2 nádormi. Ako ďalšia kontrola bol v skupine 4 nahých myší do nádorov injekovaný fosfátom pufrovanými roztok NaCl, obsahujúci 5 % sacharózu a 0,1 % hovädzí sérový albumín (PBS + skupina).

Apoptín má protinádorový účinok v in vivo modeli

S cieľom testovania možného protinádorového účinku apoptínu, exprimovaného Ad-VP3, v ľudských HepG2 nádoroch, bola počas pokusu, ktorý pokračoval 7 dní po injekcii rAd-VP3 alebo kontrolnej suspenzii, meraná veľkosť podkožných nádorov. PBS + skupina a skupina, na ktorú bolo pôsobené kontrolným rAd-conl, mala priemerné postupné zväčšovanie veľkosti nádorov, na rozdiel od skupín, na ktorú bolo pôsobené rAd-VP3, ktorá mala menšiu veľSK 285724 B6 kosť nádorov. Sedem dní po injekcii boli nahé myší utratené. Nádory boli izolované a makroskopický skúmané. Je jasné, že hepatómové nádory, na ktoré bolo pôsobené kontrolným vektorom rAd-conl alebo PBS+, boli silne vaskularizovaným HepG2-nádorovým tkanivom a že sa po injekcii zväčšili. Úplne iná situácia bola pri HepG2 nádoroch, liečených rAd-VP3. Zostatková nádorová hmota sa objavovala zriedka, vzhľadom na zníženú vaskularizáciu nádorov. Nádory sa po liečení rAd-VP3 zmenšili. Nádory taktiež obsahovali biele bublinovité štruktúry, ktoré sú náznakom mŕtvych buniek. Okrem apoptínom indukovanej regresie nádorov neboli pozorované žiadne negatívne prejavy expresie apoptínu v orgánoch (boli najmä skúmané pečeň a slezina).

Apoptín má protinádorovú aktivitu v in vivo systémoch.

Nádory, na ktoré bolo pôsobené rAd-VP3, mali menšiu veľkosť, zatiaľ čo kontrolné nádory nie. To znamená, že expresia apoptínu má protinádorovú aktivitu v in vivo modeli. Skutočnosť, že apoptín, exprimovaný Ad-VP3, môže indukovať regresiu v rýchlo rastúcich nádoroch, ako sú HepG2, dokazuje silný protinádorový potenciál apoptínu. Skutočnosť, že apoptín zmenšuje nádorový rast pri nahých myšiach, ukazuje, že nádorové bunky „zabijú“ expresiu apoptínu samé bez ďalších imunitných reakcií. Opísané toxicitné a protinádorové štúdie dokazujú, že protinádorová liečba, založená na expresii apoptínu, je bezpečná a uskutočniteľná.

Claims (8)

1. Použitie adenovírusového génového nosiča schopného indukovať apoptózu v bunke, obsahujúceho molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu aktivitu podobnú apoptínu, na prípravu liečiva na liečenie transformovaných buniek, pričom apoptóza je vyvolaná v týchto transformovaných bunkách a nastáva redukovaná apoptóza, ak vôbec nejaká, v normálnych diploidných, netransformovaných/nemalígnych bunkách, pričom transformované bunky sú charakterizované hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou.

2. Použitie adenovírusového génového nosiča schopného vyvolať apoptózu v bunke, obsahujúceho molekulu nukleovej kyseliny, kódujúcu aktivitu podobnú apoptínu, na prípravu diagnostického prostriedku na diagnostikovanie transformovaných buniek, pričom apoptóza je vyvolaná v týchto transformovaných bunkách a nastáva redukovaná apoptóza v prípade normálnych diploidných netransformovaných/nemalígnych bunkách, pričom transformované bunky sú charakterizované hyperpláziou, metapláziou alebo dyspláziou.

3. Použitie podľa nároku 2 na detekciu in vitro týchto transformovaných buniek.

4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich 1 až 3, v ktorom adenovirusový génový nosič ďalej obsahuje modifikované iniciačné miesto translácie priamo smerom k ATG iniciačnému kodónu tejto nukleovej kyseliny.

5. Použitie podľa nároku 4, v ktorom iniciačné miesto translácie obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny GCCAAC.

6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorom adenovirusový génový nosič je defektný v replikácii.

7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, v ktorom adenovirusový génový nosič ďalej obsahuje aspoň jednu smerovaciu molekulu.

8. Použitie podľa nároku 7, v ktorom smerovacia molekula je reaktívna s receptorom povrchovej bunky nádoru.