PL196607B1 - Nośnik dostarczający geny, komórka gospodarza i zastosowanie nośnika dostarczającego geny - Google Patents

Abstract

1. No snik dostarczaj acy geny zdolny do indukowania apoptozy w komórce zawieraj acy frag- ment DNA koduj acy bia lko posiadaj ace apoptyno-podobn a aktywno sc, przy czym apoptoza jest indu- kowana w komórkach nowotworu i apoptoza zredukowana, je sli w ogóle zachodzi, zachodzi w nor- malnych diploidalnych nie transformowanych/niez lo sliwych komórkach, i przy czym no snikiem jest adenowirus a wspomnianym bia lkiem jest apoptyna. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL	(11) 196607
	(21) Numer zgłoszenia: 336312	(13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 15.04.1998	(51) Int.Cl. C12N 15/34 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	C07K 14/01 (2006.01)
	15.04.1998, PCT/NL98/00213	C12N 15/86 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:	C12N 5/10 (2006.01)
Rzeczypospolitej Polskiej	22.10.1998, WO98/46760	C12Q 1/68 (2006.01)
	PCT Gazette nr 42/98	A61K 48/00 (2006.01)

(54) Nośnik dostarczający geny, komórka gospodarza (54) i zastosowanie nośnika dostarczającego geny
(30) Pierwszeństwo: 15.04.1997,EP,97201121.7	(73) Uprawniony z patentu: LEADD B.V.,Leiden,NL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 19.06.2000 BUP 13/00	(72) Twórca(y) wynalazku: Matheus Hubertus Maria Noteborn,Leiden,NL Alexandra Maria Pietersen,Leiden,NL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik: Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ 1. Nośnik dostarczający geny zdolny do indukowania apoptozy w komórce zawierający fragment DNA kodujący białko posiadające apoptyno-podobną aktywność, przy czym apoptoza jest indukowana w komórkach nowotworu i apoptoza zredukowana, jeśli w ogóle zachodzi, zachodzi w normalnych diploidalnych nie transformowanych/niezłośliwych komórkach, i przy czym nośnikiem jest adenowirus a wspomnianym białkiem jest apoptyna.

PL 196 607 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy nośnika dostarczający geny, komórki gospodarza i zastosowania nośnika dostarczającego geny. Szczegółowo, wynalazek dotyczy nośnika który obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące indukującą apoptozę aktywność podobną do aktywności białka VP2 i/lub apoptyny (VP3). Zastosowanie nośnika dostarczającego geny odnosi się do wytwarzania leku do leczenia i diagnozowania nowotworów. Zakażenia różnych ludzkich komórek nowotworowych nośnikami dostarczającymi gen według wynalazku będzie powodowało indukowanie apoptozy w tych komórkach nowotworowych i znaczną, jeśli nie całkowitą, redukcję apoptozy w prawidłowych diploidalnych, nie transformowanych/niezłośliwych komórkach.

Ekspresja in vitro wirusa anemii kurcząt (CAV) w komórkach kurczaków transformowanych pochodną białka apoptyny (VP3) indukowało apoptozę (Noteborn i wsp., 1994, Noteborn i Koch, 1995). Apoptoza jest charakteryzowana obkurczaniem się komórek, segmentacją jądra komórkowego, zagęszczaniem i rozszczepianiem DNA na fragmenty o rozmiarach domen w większości komórek, a następnie śródnukleolsomalną degradacją. Na koniec, fragmenty komórek apoptycznych w zamkniętych obłonionych pęcherzykach ciałek apoptycznych są szybko fagocytowane przez sąsiadujące komórki. Dlatego, apoptoza powoduje dużo mniejszą destrukcję tkanki niżeli nekrozy i śmierć komórki o typie niefizjologicznym (Wyllie i wsp., 1980, Arends i Wyllie, 1991 i White, 1996).

Apoptyna jest małym białkiem, o długości tylko 121 aminokwasów, raczej zasadowym, ubogim w prolinę, serynę i treoninę (Noteborn i wsp., 1991). W analizowanych transformowanych komórkach kurczaka, i które poddano indukowanej przez apoptynę apoptozie, apoptyna jest rozmieszczana dokładnie wewnątrz jądra komórkowego. Odcięcie C-końcowych zasadowych końców apoptyny daje w wyniku redukcję jądrowej lokalizacji i znaczą cą redukcję aktywności apoptycznej (Noteborn i wsp., 1994).

Apoptyna, i inne białka z podobną do apoptyny aktywnością także indukują apoptozę w ludzkich złośliwych i transformowanych liniach komórkowych, lecz nie wywołują w nie transformowanych ludzkich liniach komórkowych. Stwierdziliśmy, że apoptoza indukowana apoptyną zachodzi w nieobecności funkcjonalnego p53 (Zhuang i wsp., 1995a) i nie moż e być zablokowana przez Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang i wsp., 1995), przez białko BAG-1 wiążące Bcl-2 i przez białka cowpox (wirusa ospy krowiej) (Noteborn, 1996). W warunkach in vitro apoptyna nie wywołuje indukcji programowanej śmierci komórki w prawidłowych komórkach limfoidalnych, naskórkowych, śródłonkowych i komórkach mięśni gładkich. Jednakże, jeśli prawidłowe komórki są transformowane stają się one wrażliwe na apoptozę przez apoptynę lub inne białka z podobną do apoptyny aktywnością. Długotrwała ekspresja apoptyny w prawidłowych ludzkich fibroblastach ujawniła, że apoptyna ma nie toksyczną lub nie transformującą aktywność w tych komórkach. W komórkach prawidłowych apoptyna była głównie znajdowana w cytoplazmie, podczas gdy w transformowanych lub złośliwych komórkach to znaczy charakteryzujących się hyperplazją, metaplazją lub dysplazją, zlokalizowana była w jądrze, sugerując, że lokalizacja apoptyny jest związana z jej aktywnością (Danen-Vao Oorschot i wsp., 1997, Noteborn, 1996).

Apoptoza jest aktywnym i zaprogramowanym fizjologicznie procesem do eliminującego usuwania, zmienionych lub nowotworowych komórek (Earnshaw, 1995). Proces apoptozy może być zapoczątkowany przez różne bodźce regulujące (Wyllie, 1995 i White, 1996). Zmiany w komórkowym wskaźniku przeżywalności grają ważną rolę w patogenezie u ludzi, na przykład, w rozwoju raka, który jest spowodowany wzmożoną proliferacją komórek ale także spadkiem śmierci komórek (Kerr i wsp., 1994). Wykazano dużą ilość związków chemoterapeutycznych i naświetlań do zapoczątkowania apoptozy w komórkach raka, w wielu przypadkach w dzikim typie p53 (Thompson, 1995, Bellamy i wsp., 1995, Steller, 1995).

Jednakże wiele guzów podczas ich rozwoju wymaga mutacji w p53, często korelującego z słabą odpowiedzią na terapię rakową (Hooper, 1994). Dla niektórych nowotworów (leukemicznych), wysoki poziom ekspresji proto-onkogenu Bcl-2 jest związany z silną opornością na różne czynniki indukujące apoptozę (Hockenberry, 1994, Kerr i wsp., 1994, i Sachs i Lotem, 1993).

Dlatego apoptyna może stać się potencjalnym kandydatem w destrukcji komórek nowotworu, lub innych komórek charakteryzujących się hyperplazją, metaplazją lub dysplazją, które stały się oporne na (chemo)terapeutyczną indukcję apoptozy, wynikającą z braku funkcjonalnego p53, oraz (nad)ekspresją Bcl-2 i innych indukujących apoptozę czynników. Fakt, że apoptyna nie indukuje apoptozy w prawidłowych nietransformowanych komórkach, przynajmniej nie w warunkach in vitro, sugeruje, że efekt toksyczny traktowania apoptyną in vivo może być bardzo niski.

PL 196 607 B1

Jednakże, dlatego, ekspresję apoptyny w komórkach guza prowadzi się przez zastosowanie przejściowej transfekcji komórek hodowli tkankowej. Niedogodnością takiej metody ekspresji jest bardzo niska procentowa zawartość komórek, które mogą ekspresjonować apoptynę w warunkach in vitro. Zastosowane metody transfekcji in vivo będą niewygodne i nie skuteczne, jeśli w ogóle będą możliwe, i nie będą w ogóle zaangażowane do skutecznego leczeniu raka.

Adenowirus może pochodzić od ludzkich adenowirusów (Ads), które są nie-otoczkowymi, dwudziestościennymi wirusami DNA. Genom zawiera liniową, podwójną nić cząsteczki DNA o około 36 kb zawierającej odwrócone końcowe powtórzenia (Horovitz, 1990). Serotypy które zostały zastosowane do utworzenia wektorów (Ad2 i Ad5) nie są związane z ostrą ludzką patologią (Horovitz, 1990). Wirus jest niezwykle skuteczny we wprowadzaniu swojego DNA do komórki gospodarza. Ads może zakażać szerokie spektrum komórek dzielących się i nie dzielących się w szerokim zakresie gatunków, i wirus ten może być wytwarzany względnie łatwo w dużych ilościach. W przeciwieństwie do retrowirusów, Ads nie integruje się do genomu komórek gospodarza. Wszystkie obecnie stosowane rAdVs mają delecję w regionie E1, gdzie może być wprowadzony nowy DNA. Delecja E1 czyni ten rekombinacyjny wirus defektywnym jeżeli chodzi o replikację (Stradford-Perricaudet i Perrcaudet, 1991). Z drugiej strony, dostarcza on zasadniczo bezpieczną cechę; rAdV nie może replikować się w komórkach ludzkich w nieobecności białek E1A. Zatem, ten rAdV może dostarczać jego informacje genetyczną do ludzkich komórek, ale nie będzie to powodowało lizy lub nie będzie wywoływało infekcji. Z drugiej strony, istnieje problem z produkcją tego wektora. Jednak funkcje E1 nie wymagają koniecznie kodowania przez wektor jako taki. Mogą one także być dostarczone w trans, w specjalnych komórkach pomocniczych, które posiadają zdolność ekspresji genów E1. Po infekcji lub transfekcji tych komórek pomocniczych wektorem Ad z delecją E1, komórkowe białka E1 będą uzupełniać replikację rAdV, dającą w wyniku potomstwo rAdVs. Komórki pomocnicze Ad muszą być pochodzenia ludzkiego, i musza one zawierać i ekspresjonować region AdE1, to znaczy, transformowane Ad komórki ludzkie takie jak linia komórkowa 293 (Graham i Prevec, 1991), linia komórkowa 911 (Fallaux i wsp., 1996) i linia komórkowa PER.C6 (Fallux, 1996).

Wynalazek dotyczy nośnika dostarczającego geny, który jest zdolny do indukowania apoptozy w komórce i zawiera fragment DNA kodujący białko posiadające apoptyno-podobną aktywność, przy czym apoptoza jest indukowana w komórkach nowotworu i apoptoza zredukowana, jeśli w ogóle zachodzi, zachodzi w normalnych diploidalnych nietransformowanych/niezłośliwych komórkach, i przy czym nośnikiem jest adenowirus a wspomnianym białkiem jest apoptyna.

Nośnik, według wynalazku dodatkowo zawiera zmodyfikowane miejsce inicjacji translacji bezpośrednio przeciwprądowo do kodonu startu ATG wspomnianej cząsteczki kwasu nukleinowego.

W nośniku według wynalazku wspomniane miejsce inicjacji translacji korzystnie zawiera sekwencję kwasu nukleinowego GCCAAC.

Również korzystnie nośnik, według wynalazku dodatkowo obejmuje co najmniej jedną komórkę docelową, a jeszcze bardziej korzystnie ta docelowa cząsteczka jest reaktywna z receptorem powierzchniowym komórki nowotworu.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza obejmująca nośnik dostarczający geny, jak zdefiniowano powyżej, wraz z jego korzystnymi odmianami.

Komórka gospodarza może być komórką pomocniczą lub upakowującą a bardziej korzystnie można ją wybrać z grupy komórek HEK;293, HER;911, PER.C6, Psi-2 i PA317.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano powyżej wraz z jego korzystnymi odmianami do wytwarzania leku do leczenia raka.

Zastosowanie według wynalazku może być korzystnie realizowane w połączeniu z konwencjonalną (chemo)terapią.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano powyżej wraz z jego korzystnymi odmianami do wytwarzania leku do leczenia hyperplazji, metaplazji i dysplazji.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano powyżej wraz z jego korzystnymi odmianami do wytwarzania środka diagnostycznego do diagnozowania nowotworu.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano powyżej wraz z jego korzystnymi odmianami do detekcji in vitro transformowanych lub rakowatych lub hyperplastycznych, metaplastycznych lub dysplastycznych komórek.

PL 196 607 B1

Wynalazek dostarcza obecnie nośnika dostarczającego gen (lub wektor) który umożliwia stosowanie apoptyny cechującej się aktywnością czynnika przeciwnowotworowego do leczenia raka przez zastosowania terapii genowej lub do leczenia złośliwości nowotworowej charakteryzującej się hyperplazją, metaplazją lub dysplazją. Taki nośnik dostarczający gen, który niezależnie jest wektorem zakażającym jest wirusem, który może sam zakażać lub na innej drodze dostarczać informacji genetycznej dla, na przykład, komórek nowotworowych które mogą być leczone. Informacja genetyczna obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko posiadające aktywność podobną do apoptyny i przy czym to wspomniane białko jest apoptyną. Wynalazek dostarcza także nośnika dostarczającego gen, który był znacząco podwyższony jeśli chodzi o jego zdolność ekspresji białka posiadającego aktywność podobną do apoptyny. Niespodziewanie stwierdzono, że zmiana sekwencji nie kodującej upstream kwasu nukleinowego zlokalizowana wewnątrz miejsca inicjującego translację, który poprzedza sekwencję kodującą białko podobne do apoptyny, znacząco wzmaga ekspresję wspomnianego białka w komórkach guza. Wynalazek dostarcza także, na przykład, nośnika dostarczającego gen według wynalazku, który jest wirusem. Ponadto, wynalazek dostarcza nośnika dostarczającego gen, który sam jest wirusem z defektem replikacji ale który replikuje się w komórkach pomocniczych lub opakowujących w celu wytworzenia potomnego nośnika dostarczającego gen. Dlatego zatem, nośnik dostarczający gen według wynalazku jest adenowirusem.

Ponadto, wynalazek dostarcza nośnika dostarczającego gen, który jest dodatkowo był uzupełniony specyficznym ligandem lub cząsteczką docelową lub cząsteczkami docelowymi, przez które ten nośnik dostarczający gen może być specyficznie kierowany w celu dostarczenia jego informacji genetycznej do wybranej komórki docelowej. Taka komórka docelowa może na przykład być wirusowym białkiem kolca, lub cząsteczką receptorową, lub przeciwciałem reagującym z receptorem powierzchniowym komórki guza lub z białkiem.

Wynalazek dostarcza także nośnik dostarczający gen, który może być stosowany do przygotowania środka diagnostycznego do diagnozowania, na przykład raka. Taki nośnik dostarczający gen może być stosowany na przykład do diagnozowania in vitro, przy czym tkanka lub próbki komórek lub biopsje są pobierane z ludzi lub zwierząt. Takie próbki mogą być następnie oceniane lub testowane przez zainfekowanie ich, w hodowli lub wprost, przez nośnik dostarczający gen zdolny do ekspresji na przykład, aktywności podobnej do apoptyny. Jedynie komórki transformowane, lub komórki ujawniające różne etapy hyperplazji, dysplazji lub metaplazji lub komórki nowotworowe lub rakowe, ekspresjonują w jądrze białko z aktywnością podobną do apoptyny. Obecność tego wspomnianego białka można zademonstrować na przykład klasycznymi technikami histochemicznymi, na przykład techniką mikroskopową lub techniką automatycznego sortowania. Alternatywnie, te powyżej wspomniane zainfekowane komórki charakteryzują się apoptozą i dlatego mogą być diagnozowane znanymi cechami apoptozy.

Wynalazek dostarcza ponadto lub opisuje wszystkie etapy potrzebne do konstruowania rekombinacyjnego defektywnego w odniesieniu do replikacji adenowirusa ekspresjonującego czynnik indukujący apoptozę. Wysokie miano rekombinacyjnego apoptynowego adenowirusa może być wytwarzane za pomocą zawierających adenowirusa linii komórkowych takich jak 293, 911 i PER.C6. Apoptyna nie wykazuje dającego się oznaczyć negatywnego wpływu na wszystkie niezbędne etapy replikacji adenowirusa i inne zdarzenia cyklu życiowego adenowirusa w warunkach hodowli komórkowej.

Ponadto wynalazek opisuje konstrukcję kontrolnego rekombinacyjnego adenowirusa, który zawiera wszystkie sekwencje takie jak rekombinacyjny apoptynowy adenowirus, ale na skutek orientacji 3'-5' sekwencji kodującej apoptynę pod kontrolą elementów regulujących promotora, nie zdolnego do ekspresji apoptyny. Za pomocą tego kontrolnego adenowirusowego wektora mogą być badane, specyficzne efekty ekspresji apoptyny przez rekombinantowy adenowirus. Rekombinantowy, defektywny w odniesieniu do replikacji adenowirus ekspresjonuje apoptynę w dużych ilościach w różnych nowotworowych i/lub transformowanych komórkach dając w wyniku indukcję apoptozy. W przeciwieństwie do tego ekspresja apoptyny w normalnych nie transformowanych komórkach ludzkich za pomocą rekombinacyjnego adenowirusa nie daje w wyniku indukcji apoptozy indukowanej apoptyną.

Wynalazek dotyczy zwłaszcza terapii przeciwnowotworowej. Traktowanie komórek nowotworowych będzie zachodziło przez ekspresję apoptyny na drodze zainfekowania komórek(nowotworu) nośnikiem dostarczającym gen takim jak wektor adenowirusowy, który zawiera sekwencję kodującą białko z aktywnością podobna do apoptyny. Dlatego, wynalazek dostarcza nośniki dostarczające gen, takie jak adenowirusy ekspresjonujące apoptynę, który jest właśnie tym potencjalnym czynnikiem przeciwnowotworowym. Adenowirusowa regulacja apoptyny w ogóle lub prawie w ogóle nie indukuje

PL 196 607 B1 w sposób dający się wykryć apoptozę w prawidłowych komórkach, wskazując, że toksyczność traktowania in vivo rekombinonatowym apoptynowymi adenowirusami będzie niska. Poprzez infekcję rekombinantowymi apoptynowymi adenowirusami można znacznie większe ilości ekspresjonujących apoptynę (nowotworowych) komórek. To spostrzeżenie jest głównym usprawnieniem ekspresji apoptyny w porównaniu z transfekcją przez DNA.

Wynalazek niniejszy opisuje znaczące polepszenie apoptynowej ekspresji poprzez zmianę jej bezpośredniej sekwencji upstream w kodonie inicjującym ATG. To polepszenie ekspresji nie wymaga zmiany aminokwasu w białku apoptyny, jak było przewidywane zgodnie z zasadą KOZAK. Usprawnienie sekwencji upstream inicjującego kodonu ATG innych białek CAV będzie dawało także w wyniku polepszenie ich syntezy.

Część doświadczalna

Komórki i warunki hodowli komórkowej

Linie komórkowe embrionalnej ludzkiej nerki (HEK;293) i ludzkiej siatkówki (HER;911 i PER.C6) hodowano w modyfikowanej pożywce Eagle Dulbecco's (DMEM) uzupełnionej 10% surowicą płodową cielęcą (FCS) w atmosferze 5% CO2 37°C. Linia komórkowa 293 była otrzymana z American Type Collection (ATCC CRL 1573). Linia komórkowa 911 i PER.C6 otrzymano z Fallaux i wsp. (1996). Pożywka hodowli komórkowej, odczynniki i surowice były zakupione w GIBCO Laboratories (Grand Island, NY). Naczynka plastikowe do hodowli były zakupione w Greiner (Nurtingen, Niemcy).

Ludzkie keratynocyty naskórka były izolowane z napletka i hodowane w obecności warstwy mysich fibroblastów 3T3 śmiertelnie napromieniowanych Cs137. Hodowle pierwotne keratynocytów (FSK-1) były zapoczątkowane w pożywce kompletnej jak opisano (Rheinwald and Green, 1975) z niewielkimi modyfikacjami.

Rakotwórcze keratynocyty, komórki SCC-15 (Rheiwald and Beckett, 1981), pochodzące z raka płaskokomórkowego, były hodowane w pożywce DMEM/F12 (3:1) zawierającej 5% surowicę płodową cielęcą, 0,4 μg hydrokortyzonu i 1 μΜ izoprotrenol. Ludzkie komórki pochodzące od wątrobiaka hepG2 (Aden i wsp., 1979 i ludzkie komórki U20S i SAOS-2 pochodzące z kostniakomięsaka (Diller i wsp., 1990) hodowano w DMEM (GIBCO/BRL) uzupełnionym 10% cielęcą surowicą płodową. Spontanicznie transformowany szczep keratynocytów HaCaT (Boukap i wsp., 1988) był podarowany przez Prof. Dr. R. Fuzenig'a, DKFZ, Heidelberg, Niemcy. Komórki HaCAT hodowano w DMEM uzupełnionym 10% surowicą płodowa cielęcą.

Linie mysich komórek hodowano w modyfikowanej pożywce Eagla z Dulbecco z glukozą (4,5 gram na litr) i 10% płodową surowicą cielęcą w 5% atmosferze CO2 w 37°C. Linia komórkowa Psi-2 upakowana ekotropowo (Mann i wsp., 1983 i upakowana amfotropowo linia komórkowa PA317 była opisana poprzednio (Miller, 1990a,b).

Techniki badania wirusów

Badania łysinek prowadzono jak opisano poprzednio (Fallaux i wsp., 1996). W skrócie, roztwór podstawowy adenowirusów był seryjnie rozcieńczany w 2 ml DMEM zawierającej 2% surowicę końską i dodawany do prawie zlewających się 911 komórek w 6-studzienkowych płytkach. Po 2-godzinnej inkubacji w 37°C, pożywkę zastępowano minimalną pożywką podstawową (MEM) zwierającą 0,85% agarozy (Sigma, USA), 20mM HEPES (pH 7,4), 12,3mM MgCl2, 0,0025% L-glutaminę i 2% surowicę końską (inaktywowaną przez podgrzewanie, 56°C przez 30 minut.

Produkcja liczebnych serii adenowirusów na małą skalę była prowadzona jak opisano poprzednio (Fallaux i wsp., 1996). W skrócie, prawie zlewająca się 911 pojedynczo-komórkowa warstwa PER.C6 była infekowana za pomocą około 5 jednostek tworzących łysinki (p.fu.-s) na komórkę, w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% surowicę końską. Po 1 godzinie przetrzymywania w temperaturze pokojowej inokulum było zastępowane świeżą pożywką (DMEM/2% surowicy końskiej). Po 48 godzinach, prawie całkowicie rozpłynięte komórki były zbierane, i łączone z 1 ml PBS/1% surowicy końskiej. Wirus był izolowany z komórek wytwarzających w 3 cyklach błyskawicznego mrożenia i rozmrażania. Lizaty były oczyszczane przez wirowanie przy 3000 rpm w ciągu 10 minut i przechowywane w -20°C.

Wytworzoną masę podstawową rAdV 911 i PER.C6 badano na obecność rekombinantowo-kompetytywnych wirusów przez przeprowadzenie analizy PCR przy pomocy primerów pochodzących z regionu ITR Ad5 (5-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3) i regionu kodującego E1A (5-TCGTGAAGGGTAGGTGGTT-3) stosując aparaturę PCR Perkin Elmer, jak opisano przez Noteborna i De Boera (1995). Obecność zamplifikowanych fragmentów 600-bp wskazuje, że kompetycyjny replikacyjnie (zawierający region E1) adenowirus istnieje w analizowanej masie wirusa (Hoeben, wyniki nie

PL 196 607 B1 opublikowane) lub przez infekowanie komórek HepG2 porcją rAdV. W okresie co najmniej 10 dni, komórki były monitorowane pod kątem potencjalnego efektu cytopatogenicznego i przez pośrednią immunofluorescencję stosując specyficzną monoklonalną antysurowicę skierowana przeciwko białku E1A.

Plazmidy i transfekcja DNA

Adaptorowy plazmid pMadS skonstruowany z pMLP10 (Levrerno i wsp., 1991) jak opisano poniżej. Plazmid pMLP-1-lin był wyprowadzony z pMLP10 przez insercję syntetycznego fragmentu DNA w okreś lone jednoznacznie miejsca dla restrykcji endonukleazami Mlul, SpIl, SnaBI, Spl, AsuII, i MunI do miejsca Hindlll w pMLP10. Fragment Bglll adenowirusa spinający nt 3328 do 8914 genomu Ad5 był wbudowywany do miejsca MunI pMLP-lin. Z otrzymanego plazmidu, fragment Sall-BamHI był usuwany w celu inaktywacji genu oporności na tetracyklinę. Otrzymany plazmid był sprawdzony analizą restrykcyjną-enxyme i nazwany pMadS. Ekspresja wbudowanych genów do wielokrotnych miejsc będzie prowadzona przez główny adenowirusowy opóźniony promotor, który w tej konfiguracji powiązany jest do bezpośrednio poprzedzającego go genu wzmacniacza adenowirusowego 1 (E1).

Wszystkie sekwencje CAV DNA są pierwotnie pochodzą z plazmidu pIc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn i de Boer, 1990). Plazmid ekspresji pCMV-fs, wcześniej zwany pCMV-VP3 (Noteborn i wsp., 1994), zawiera sekwencje DNA CAV kodującą wyłącznie apoptynę (nt 427-868).

Plazmid pCMV-V2mn (Noteborn, dane nie publikowane) zawiera sekwencje DNA CAV w pozycjach 380-1512. Te fragmenty DNA CAV zawierają region kodujący dla VP2 flankowanego przez 25 bp 5' nie kodujące i 484 bp 3' nie kodujące sekwencje DNA CAV. 106 bp downstream kodonu startu dla VP2 dla apoptyny jest usytuowany w innej ramce odczytu. W celu zapobieżenia syntezie apoptyny bez interferencji syntezy VP2, wprowadzono mutację do kodonu inicjacji apoptyny (ATG zmieniono na ACG) i dodatkowo mutację punktową w pozycji 549 (T zmieniono na A), dające w wyniku dodatkowy kodon stopu w genie kodującym apoptynę. Dlatego, wprowadzone sekwencje CAV będą tylko ekspresjonować białko VP2 o pełnej długości. Przez pośrednią immunofluorescencję wykazano, że VP2 może być wytwarzany ale apoptyna nie była syntetyzowana.

Do klonowania fragmentów amplifikowanych przez PCR używano plazmidu pCR-3.1, który był zakupiony w InVitron (Carlsbad, CA). W celu skonstruowania defektywnego replikacyjnie retrowirusa z rekombinantową apoptyną stosowano wektor retrowirusowy pLXSN (Miller, 1990a, b).

Wszystkie etapy klonowania w plazmidzie DNAs były głównie przeprowadzone według metody Maniatisa i wsp, (1992).

Wszystkie stosowane enzymy pochodziły z zakupu w Boehringer Mannheim, Niemcy i/lub BioLabs, USA.

Plazmidowy DNA był oczyszczony przez wirowanie w gradiencie CsCl i w chromatografii kolumnowej w Sephacrylu S500 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Linie ludzkich komórek HaCAT, HepG2, SCC-15, 293, 911 i PER.C6 były transfekowane plazmidem DNA na drodze wapniowo-fosforanowego strącania jak opisano przez Graham'a i Van der Eb'a (1973). Prawidłowe ludzkie diploidalne keratynocyty (FSK-1; druga faza), U20S i komórki SAOS-2 były transfekowane DOTAP (Fischer i wsp., 1996).

Pośrednie próby immunofluorescencyjne

Komórki utrwalano w 80% acetonie i stosowano do badań immunofluorescencyjnych z zastosowaniem specyficznych względem CAV lub względem adenowirusa E1A monoklonalnych przeciwciał i anty mysiej i/lub koziej anty króliczej IgC skonjugowanej z fluorescencją (Jaskson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove PA), jak opisano przez Noteborn'a i wsp., (1990). Jądrowy DNA był barwiony 2,4-diamino-2-fenylinoidolem (DAPI) lub jodkiem propidyny (PI).

Wyniki i dyskusja

Konstruowanie wektora adaptorowego pMab

W celu wprowadzenia miejsca dla enzymu restrykcyjnego BamHI do adaptorowego plazmidu pMAd5, był on trawiony enzymem restrykcyjnyn ClaI i traktowany jelitową cielęcą fosfatazą alkaliczną. Łącznik Clal-BamHI traktowano kinazą T4 i ligowano do siebie przez zastosowanie ligazy T4-DNA i następnie stosując trawienie przez ClaI. Łącznik ClI/BamHI/Clal izolowano i ligowano do linearyzowanego wektora pMad5. Szczep bakteryjny JM109 transformowano produktami ligacji.

Ostatecznie otrzymany wektor scharakteryzowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Za pomocą wektora pMab obce geny mogą być ligowane do szczególnego miejsca BamHl pod kontrolą głównego opóźnionego promotora adenowirusowego. Schematyczna reprezentacja pMad5 i pMab pokazana jest na Figurze 1.

PL 196 607 B1

Konstruowanie rekombinantowej apoptyny i kontrolnego wektora adaptorowego

W celu skonstruowania wektora adaptorowego do wprowadzania genu apoptyny do adenowirusa, pMab traktowano BamHI i następnie jelitową fosfatazą cielęcą. Następnie, pCMV-fs traktowano BamHl i izolowano 0,45 kb fragment DNA zawierający sekwencję kodującą apoptynę. Fragment DNA apoptyny ligowano do miejsca BamHI linearyzowanego adaptera wektora pMab. Produkt ligacji klonowano w bakteryjnym szczepie JM109. Kierunek apoptyny w pMab określano przez zastosowanie analizy restrykcyji enzymatycznej.

Konstrukt pMab zawierający gen apoptyny w kierunku 5'-3' regulowany przez głównego opóźnionego promotora adenowirusa będzie ekspresjonował gen apoptyny. Ten adaporowy wektor nazwany został pMab-VP3 i stosowany będzie do wytwarzania wektora adenowirusowego z ekspresją apoptyny. Plazmid DNA pMab zawierający sekwencje kodujące apoptynę w kierunku downstream 3'-5' głównego późnego promotora adenowirusa nie może ekspresjonować apoptyny i będzie stosowany do wytworzenia kontrolnego rekombinantowego wektora wirusowego. Schematyczna reprezentacja obu rekombinantowych wektorów adaptorowych pokazano na Figurze 2.

Indukcja apoptozy przez plazmid CMV przeciwko rekombinantowemu apoptynowemu wektorowi adaptorowemu z ekspresją apoptyny.

Najpierw sprawdzono czy wektor DNA pMab-VP3 jest rzeczywiście zdolny do ekspresji apoptyny w komórkach transfekowanych, podczas gdy pMab-con nie powinien być zdolny do ekspresji. Na koniec, ludzki adenowirus transformowany komórkami 293 i 911 był transfekowany przy pomocy pMab-VP3, pMab-con, i jako kontrola pozytywna transfekowany przez pCMV-VP3. Około 2 dni po transfekcji, komórki były utrwalane i badane pod kątem ekspresji apoptyny za pomocą pośredniej próby immunofluorescencyjnej. Hodowle komórkowe transfekowane przez pCMV-VP3 i pMab-VP3 zawierały około 1% komórek reagujących z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym wobec apoptyny, podczas gdy hodowle komórkowe transfekowane przez DNA pMab-con nie reagowały. Wyniki te sugerują, że pMab ekspresjonuje apoptynę i jak można było się spodziewać, pMab-con nie ekspresjonuje apoptyny.

W innym doś wiadczeniu z transfekowaniem, analizowano indukowanie apoptozy w komórkach 911 po transfekcji przez pMab-VP3 przeciwko pCMV-VP3. Trzy dni po transfekcji komórki 911 były zbierane i badane na ekspresjonowanie apoptyny pośrednią immunofluorescencja. Ponadto, komórki barwiono przez DAPI lub PI, które mocno barwią nietknięty DNA, ale DNA apoptyczne barwią słabo i/lub nieregularnie. (Telford, 1992).

Około 60% apoptyno-pozytywnych komórek 911, transfekowanych przez pMab-VP3 były apoptycznymi, podczas gdy około 40% apoptyno pozytywnych komórek transfekowanych przez pCMV-VP3 uległo apoptozie. Wyniki te wskazują, że ekspresja regulowana przez pMab-VP3 daje w wyniku podobny ale w pewnym stopniu wyższy poziom indukcji apoptozy, niżeli ekspresja apoptyny przez pCMV-VP3. Wyniki te są przedstawione na Figurze 3.

Ponadto, apotyna jest w stanie indukować apoptozę w ludzkich transformowanych adenowirusem komórkach, E1B nie hamuje apoptozy indukowanej przez apoptynę. W przeciwieństwie do tego, E1B jest zdolny do blokowania apoptozy indukowanej przez wiele rodzajów czynników chemoterapeutycznych. Wynik ten wskazuje, że apoptyna jest bardzo silnym czynnikiem przeciwnowotworowym. Konstruowanie rekombinantowego apoptynowego adenowirusa

Wektory rekombinantowego apoptynowego adenowirusa były generowane przez ko-transfekcję do linii komórek pomocniczych 911 plazmidów adaptorowych pMab-VP3 zawierających sekwencję kodującą dla apoptyny plus pewne sekwencje adenowirusowe, i DNA plazmid JM17 zawierający całkowite DNA adenowirusa minus region E1 i E3 (McGrory i wsp., 1988). Ko-transfekty były transformowane precypitatem wapniowo-fosforanowym DNA jak opisano przez Grahama i Van der Eb'a (1973). Rekombinantowy adenowirus DNA jest utworzony przez rekombinację homologiczną pomiędzy homologicznymi sekwencjami wirusowymi, które są obecne w plazmidzie pMAb-VP3 i adenowirusie DNA JM17 DNA.

W podobny sposób, przeprowadzono ko-transfekcję komórek 911 przez pMAb-coc i pJM17 DNA w celu wygenerowania kontrolnego rekombinanta adenowirusowego, który nie mógł ekspresjonować apoptyny, i który będzie stosowany jako kontrolny adenowirus dla efektów apoptycznych indukowanych apoptyną.

Wiele godzin po transfekcji, komórki monowarstwy były pokryte górną warstwą agarozową i inkubowane w 37°C aż łysinki indukowane przez rekombinantowego adenowirusa zaczęły być wyraźnie widoczne. Wirus był zbierany z łysinek jako koncentrat surowicy końskiej-PBS, jak opisano przez

PL 196 607 B1

Falluxa i wsp., (1996). Następnie, część koncentratów wirusa rekombinantowego była dodawana do 24 studzienek zawierających świeże komórki 911. Kilka dni później, te zainfekowane komórki 911 były poddawane lizie i rekombinantowe wirusy były zbierane.

Następnie, badano ekspresjonowanie apoptyny przez potencjalne rekombinantowe apoptynowe adenowirusy (rAd-VP3) lub nieobecność ich ekspresji przez kontrolne rekombinantowe adenowirusy (rAd-con). Część koncentratów rekombinanowych wirusów było stosowanych do infekcji świeżych komórek 911, które rosły jako monowarstwa na szkiełkach nakrywkowych. Jeden dzień później, zainfekowane komórki 911 były utrwalane acetonem i analizowane immunofluorescencyjnie stosując specyficzne wobec apoptyny przeciwciało monoklonalne 85.1. Pięć na pięć analizowanych hodowli komórek 911 infekowanych domniemanym rAd-VP3, zawierało komórki ekspresjonujące apoptynę. Żadna z komórek 911 infekowanych przez Ad-con i nie infekowanych komórek 911 nie był a apoptyno-pozytywna.

Wyniki te sugeruje, że pod wpływem ko-transfekcji zawierających adenowirusa linii komórkowych, takich jak komórki 911, z wymaganym adapterem i DNA adenowirusa, można wykonać znaczącą ekspresję apoptyny.

Dwa koncentraty pochodzące z łysinek rAd-Vp3 lub rAd-con stosowano dla oczyszczenia rAds przez przeprowadzenie trzech następujących po sobie oczyszczeń łysinek z komórek 911 lub w równoległym badaniu ograniczonych rozcieńczeń na komórkach PER.C6 jak opisał Fallux (1996).

Bazując na powyżej opisanych metodach, w wyniku których otrzymuje się ekspresję apoptyny rAd-Vp3 regulowaną przez głównego późnego promotora adenowirusowego, udało się także ekspresjonowanie apoptyny w wektorze adenowirusowym pod kontrolą promotora cytomegalowirusowego. Wyniki te pokazują, że różne typy rekombinantowych adenowirusów regowanych przez jeden z ich własnych lub heterologicznych elementów promotora można wytwarzać.

Wytwarzanie rAd-Vp3 i rAd-con przez komórki PER.C6

Produkcja rAd-Vp3 i rAd-con na małą skalę stosująca zestawy komórek PER.C6 przeprowadzona była jak opisano (Fallaux, 1996). Procedura ta jest opisana w rozdziale Doświadczenia.

W próbach łysinek, oznaczano miano które wynosiło około 10^11-12 na ml czystego lizatu przez zarówno rAd-Vp3 i rAd-con. Otrzymane miana nie są niższe niż obserwowane w naszym laboratorium dla innych rAd.

Za pomocą analizy PCR i infekcji HepG2 przez rAd-Vp3 i rAd-con zbadano czy wytworzone porcje wirusa zawierały adenowirus kompetycyjny (patrz także rozdział Doświadczenia). Obie porcje rAd-Vp3 i rAd-con były wolne od RCA, jak sprawdzono obiema metodami.

Stwierdzono w podsumowaniu, że ekspresja apoptyny nie wpływa negatywnie na wszystkie wymagane etapy cyklu życiowego adenowirusa w warunkach hodowli komórkowej. Dlatego, terapia genowa oparta o wektor adenowirusa ekspresjonującego apoptynę jest możliwa do wykonania.

W związku z ekspresją anty-apoptycznych białek Ad5 E1 (White, 1996), apoptyna optymalnie indukuje apoptozę po wyprodukowaniu dużych ilości rekombinantowego-apoptynowego adenowirusa. Fakt, że wektor adenowirusowy ekspresjonujacy apoptynę może być wytwarzany w ludzkich komórkach transformowanych białkiem E1 adenowirusa typu 5 (Ad 5), takich jak komórki 293, 911 i PERC6 wskazuje, że białko E1 pozwala temu wirusowemu DNA na replikację do wysokiego miana w obecności indukującego apoptozę białka apoptyny.

Wyniki te wskazują, że możliwe jest także generowanie innych rekombinantowych wirusów DNA ekspresjonujących apoptynę w liniach komórkowych transformowanych przez białko E1 adenowirusa 5. Na przykład, rekombinantowe wektory parwowirusa oparte na parwowirusach MVM mogą być namnażane w komórkach 293T, które są transformowane przez białko Ad5 E1 (Dinsart i wsp., 1996).

Parwowirusy H-1 i MVM specyficznie indukują śmierć komórki w komórkach transformowanych, ale nie we wszystkich (Lopez-Guerrero, 1997). Wektory parwowirusa, ekspresjonujące apoptynę będą silniejsze w indukowaniu nowotworowo-specyficznej apoptozy niż sam parwowirus, z powodu dodatkowej nowotworowo-specyficznej indukcji apoptozy przez apoptynę (Danen-Van Oorschot, 1997).

Protokół wytwarzania wektorów rekombinantowego-apoptynowego adenowirusa w oparciu o transformowane biał kiem Ad5 E1 komórki, takż e sprawdza się dla gatunków wirusów RNA, takich jak retrowirusy.

Indukowanie apoptozy w ludzkich transfomowanych i/lub liniach komórkowych nowotworów złośliwych

Badano czy infekcja ludzkich komórek nowotworowych przez rAd-VP3 powoduje indukowaną apoptyną apoptozę. Na koniec, ludzki wątrobiak Hepg2, komórki kostnomięsaka U20S, komórki SCC-15, pochodzące od komórek raka płaskokomórkowego i komórki z spontanicznie transformowanej

PL 196 607 B1 linii komórkowej keratynocytów HaCaT były infekowane przez rAd-VP3. Jeden dzień po transfekcji, komórki te były utrwalane i za pomocą immunofluorescencji oraz barwienia DAPI komórki te były badane na obecność syntezy apoptyny, oraz tego czy uległy one apoptozie. Już po 1 dniu po infekcji prawie wszystkie analizowane apotyno-pozytywne komórki ludzkie były apoptyczne. W nie infekowanych hodowlach jedynie kilka procent komórek ludzkiego raka było apoptyczne. Wyniki te dla komórek HepG2 i U20S pokazane są na Figurze 4.

Wyniki te wskazują, że ekspresjonowana apoptyna rAd-VP3 może indukować apoptozę w różnych ssaczych rakotwórczych i/lub transformowanych liniach komórkowych.

Ekspresja apoptyny w prawidłowych komórkach infekowanych przez rAd-VP3

W celu przeanalizowania efektu apoptyny ekspresjonowanej przez rAd-VP3 w prawidł owych nie transformowanych komórkach, komórki FSK-1 były infekowane przez rAd-VP3. Cztery dni po transfekcji, komórki analizowano przy pomocy pośredniej immunofluorescencji stosując przeciwciała monoklonalne 85.1 i barwienie DAPI. Większość 8% apoptyno-pozytywnych komórek wykazywała nieprawidłowe barwienie DAPI, wskazując, że mogły one ulec indukowanej (przez apoptynę) apoptozie. Jednakże, 7% komórek które nie były infekowane także miała zakłócony wzór barwionego przez DAPI DNA. Wyniki te przedstawiono na Figurze 4.

Ludzki Ad5 o naturze hepatotropicznej po podaniu do układowym, jest także ważny do zbadania efektu apoptyny w prawidłowych diploidalnych hepatocytach. Na koniec, izolowane szczurze hepatocyty były hodowane w pożywce Willams'a E (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA) uzupełnionym insuliną (2mU/ml) i deksametazonem (1nM). Komórki te rosły na powleczonych kolagenem szkiełkach do hodowli. (Micrinic).

Pierwotne szczurze hepatocyty były infekowane przez wektor adenowirusowy Ad-VP3 ekspresjonującym apoptynę, wektorem kontrolnym ekspresjonującym LacZ, lub były infekowane pozornie. Po dwóch dniach, komórki utrwalano i badano procent komórek apoptycznych za pomocą immunofluorescencji i barwienia DAPI. Nie obserwowano różnic w procentowej ilości komórek uśmierconych zarówno ekspresjonujących apoptynę, lacZ lub pozornie infekowanych. Obserwacje te wskazują, że hepatocyty (szczurze) nie uległy indukowanej przez apoptynę apoptozie, także wtedy gdy apopytyna jest syntetyzowana za pomocą wektora adenowirusowego.

Wyniki te wskazują, że kierowana przez rAd-VP3 ekspresja w apoptyny nie daje w wyniku apoptozy indukowanej apoptyną z prawidłowych nietransformowanych ludzkich komórek, w przeciwieństwie do transformowanych/rakotwórczych komórek ludzkich.

Zwiększenie syntezy apoptyny

W celu przebadania efektu działania bezpośrednich sekwencji przed kodonem apoptyny inicjującym ATG, wykonano dwie konstrukcje pCR-3.1-apoptyna. Miejsce ori rAd-VP3 zawiera oryginalną bezpośrednią sekwencję upstream (5-TTTCAA-3) kodonu ATG, podczas gdy inny, pCR-Vp3mu zawiera bezpośrednią sekwencję upstream 5-GCCAAC-3. Za pomocą próby in vitro transkrypcja/translacja wheat-germ, oznaczono, że ekspresja apoptyny pCR-VP3mu była co najmniej 5 razy większa niż obserwowana dla pCR-VP3ori. Dane te wskazują, że natura bezpośredniej sekwencji upestream apoptyny-ATG wpływa na syntezę apoptyny. Konstrukcja wektorów (wirusowych) z bezpoś rednią sekwencję upstream 5-GCCAAC-3 przed kodonem apoptyny ATG b ę dzie powodował wyższą produkcję apoptyny i pośrednio wzrost indukowanej przez apoptynę apoptozy.

Należy także zaznaczyć, że sekwencja aminokwasowa apoptyny nie jest zmieniona jak przewidywano, że będzie to konieczne dla wzrostu wydajności translacji według zasady Kozak'a (Caventer i Stuart, 1991). Zgodnie z tą zasadą, powinniśmy otrzymać zmieniony w pozycji +4 nukleotyd z A na G, dając w wyniku różny drugi aminokwas apoptyny, który powinien posiadać zmianę swojej aktywności.

Identyfikacja zasadniczych fragmentów apoptyny zawierających aktywność apoptyczną

W celu sprawdzenia czy część biał ka apoptyny jest zasadnicza dla jej aktywno ś ci apoptycznej, skonstruowano kodujący białka chimeryczne plazmid, zawierające białka o fluorescencji zielonej (GFP; Rizzuto, 1995) i N-końcowych 71 aminokwasach apoptyny (N-apoptyna) lub 50 C-końcowych aminokwasach (C-apoptyna). Transformowane ludzkie komórki, takie jak komórki SAOS-2 (Zhuang, 1995) były przejściowo transfekowane plazmidem ekspresjonującym chimeryczne GFP/N-apoptyna lub GFP/C-apoptyna. Tylko komórki SAOS-2 ekspresjonujące GFP/C-apoptynę uległy apoptyno-specyficznej apoptozie. Zgodne jest to z faktem, że Apoptyna-C (związana z GFP) może wchodzić do jądra.

PL 196 607 B1

Wyniki te wskazują, że część apoptyny może także być wystarczająca do indukcji apoptozy w rakotwórczych/transformowanych komórkach (ludzkich). Dlatego, można by także rozwinąć skuteczną terapię genową opartą o wektory (wirusy) ekspresjonujące tylko tą część apoptyny. Ponadto, te dane wskazują, że część apoptyny zawiera jej apoptyczną aktywność, wtedy gdy jest związana kowalencyjnie z obcym białkiem.

Ko-ekspresja VP2 i apoptyny w komórkach ludzkiego guza synergicznie podwyższa indukcję apoptozy

W celu zbadania wpł ywu ko-eksprasji VP2 i apoptyny na indukcję apoptozy, komórki SAOS-2 były (ko)-transfekowane przez pCMV-fs, ekspresjonując apoptynę i/lub pCMV-VP2mu, ekspresjonujacym VP2. Komórki utrwalano acetonem w różnych przedziałach czasowych po transfekcji. Za pomocą pośredniej immunofluorescencji, komórki VP2-pozytywne były oznaczane przy pomocy monoklonalnego przeciwciała CVI-CAV-111.1 (Noteborn i Koch, 1996) i apoptyno-pozytywne komórki przy pomocy przeciwciała monoklonalnego CVI-CAV-85.1. Trzeciego dnia transfekcji, tylko 3% komórek ekspresjonujących VP-2 i tylko około 10% komórek ekspresjonujących apoptynę uległo apoptozie. W przeciwieństwie do tego, okoł o 40% komórek SAOS-2 ekspresjonują cych zarówno VP2 i apoptynę było już apoptycznych. Także w 4 dni po transfekcji, procent VP2/apoptyno-pozytywnych komórek, które uległy apoptozie było znacząco wyższy niż w komórkach ekspresjonujących tylko apoptynę lub VP2.

Wyniki te wskazują, że VP2 podwyższa indukowaną apoptyną apoptozę i są pokazane na Figurze 5.

Konstrukcja i wytwarzanie rAD-VP2

W celu skonstruowania rekombinantowego adenowirusa ekspresjonującego wirusowe białko 2 (VP2) wirusa anemii kurcząt, utworzono plazmid adaptorowy pMab-VP2. Fragment 1.1-kb BamHI izolowano z plazmidu pMab-VP2mu zawierającego całą sekwencję kodującą VP2, ale z mutacją 2 punktową wewną trz regionu kodującego apoptynę (patrz rozdział Doś wiadczenia) i ligowano z linearyzowaną BamHI i wektorem adaptorowym pMAb traktowanym jelitową alkaliczną fosfatazą. Ostateczną konstrukcję scharakteryzowano przez analizę enzymami restrykcyjnymi i analizę sekwencji jak pokazano na Figurze 6.

Na drodze ko-transfekcji komórek 911 przez pMab-VP2 DNA i pJM17 DNA, utworzono rAD-VP2. Ko-transfekcja i wszystkie inne wymagane etapy potrzebne do scharakteryzowania oczyszczenia i wytworzenia rAd-VP3, były prowadzone jak opisano dla rAd-VP3 i rAd-con. Za pomocą pośredniej immunofluorescencji stosując przeciwciało monoklonalne CVI-CAV-111.1, wykazano, że komórki 911 i PER.C6 infekowane przez rAd-VP2, rzeczywiście mogły ekspresjonować białko VP2.

Konstruowanie wektora retrowirusowego ekspresjonującego apoptynę

W celu wytworzenia plazmidu pL-VP3-SN (patrz Figura 7), fragment BamHI niosą cy sekwencję kodującą był wprowadzony do unikalnego miejsca BamHI w pLXSN. W analizie enzymami restrykcyjnymi właściwa orientacja insertu została potwierdzona, w celu przetestowania integralności insertu plazmid pL-VP3-SN transfekowano do COS-7 i komórek HepG2 techniką precyptacji fosforowapniowej. Cztery dni po transfekcji, komórki utrwalano i analizowano monoklinalnym przeciwciałem 85.1 pod kątem ekspresji białka apoptyny. Ekspresję apoptyny można było wykryć w około 1-2% komórek. Większość komórek uległa apoptozie, jak oznaczono barwieniem DAPI. Dane te wskazują, że prowirusowy promotor LTR zdolny jest do prowadzenia ekspresji białka apoptyny, że jego gen jest nieuszkodzoną konstrukcją DNA i że w transfekowanych komórkach HepG2 i COS-7 ekspresja apoptyny indukuje apoptozę.

W celu wytworzenia wirusów plazmid pL-VP3-SN był transfekowany do komórek Psi-2 i do komórek PA 317 techniką ko-precypitacji fosforanem wapnia. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, supernatant komórek był zbierany i rozcieńczany i stosowany do infekowania komórek HepG2 (supernatant PA317) i komórek NIH3T3 (supernatant Psi-2) w obecności 4 μg polibrenu. Cztery dni po infekcji komórki były utrwalane i analizowane pod względem ekspresji apoptyny na drodze barwienia przeciwciałem monoklonalnym 85.1. Jak stwierdzono, około 1% komórek ekspresjonował apoptynę. Większość apoptyno-pozytywnych komórek HepG2 było apoptycznych. Dane te pokazują, że komórki te były transdukowane retrowirusami L-apoptyna-SN. W dodatku pokazują one, że pojedyncza kopia prowirusa jest wystarczająca do ekspresji wystarczających ilości białka apoptyny aby było one wykrywalne przez immunofluorescencję i ta ilość jest wystarczająca do spowodowania apoptozy w ludzkiej linii komórkowej wątrobiaka HepG2.

Dane te wzięte razem pokazują, że wektory retrowirusowe zawierające gen apoptyny mogą być generowane i mogą być stosowane do indukowania apoptozy w komórkach ludzkich nowotworów.

PL 196 607 B1

Dowodzi to formalnie, że ani gen apoptyny ani jego ekspresja nie interferuje z zasadniczymi etapami w cyklu życiowym retrowirusa. Wykazano także, że zawierający apoptynę retrowirus może być wytwarzany okresowo w ilościach wystarczających do zastosowania do transdukcji komórek ludzkich nowotworów w hodowli tkankowej.

Wyniki te sugerują ponadto, że ekspresja apoptyny i w następstwie tego indukowana apoptyną apoptoza w komórkach nowotworowych (ludzkich) będzie możliwa także za pomocą układów wektorowych pochodzących od wirusa (retro), takich jak plazmawirusy (Neguiez-Hellin, 1996). Krytycznym etapem dla takich układów rekombinantowych apoptynowych plazmowirusów, jest to czy ta replikacja retrowirusowa nie jest blokowana przez ekspresję apoptyny. Dostarczyliśmy dowodów, że w przypadku tym rzeczywiście taka blokada nie zachodzi dla powyżej opisanych rekombinantowych apoptynowych retrowirusów sugerując powodzenie produkcji rekombinantowego apoptynowego plazmowirusa.

Badania diagnostyczne komórek nowotworowych opartych na rAD-VP3

Komórkowa lokalizacja apoptyny jest różna w ludzkich rakotwórczych/transformowanych komórkach w porównaniu do prawidłowych nie transformowanych komórek. Ponadto, innym wyznacznikiem specyficzna zdolność apoptyny do indukowania apoptozy w rakotwórczych/transformowanych komórkach i brak tej zdolności w komórkach prawidłowych.

Przez infekowanie komórek przez rAd-VP3 i analizowanie lokalizacji apoptyny i/lub indukcję apoptozy w tych komórkach można wykazać czy komórka jest złośliwa czy nie. Pierwotne komórki są izolowane z (podejrzanej) tkanki i są hodowane w wymaganej pożywce. Komórki te są infekowane rAd-VP3 i równolegle rAd-con i następnie analizowane. Na przykład, przez zastosowanie badania fluorescencji opartej na monoklonalnych przeciwciałach specyficznych dla apoptyny 85.1. Komórki te będą sprawdzone na posiadanie apoptyny w cytoplaźmie (komórki prawidłowe) lub w jądrze (komórki transformowane). Ponadto lub zamiast tego, będzie oznaczana procentowa zawartość komórek apoptycznych. Jeżeli procent komórek apoptycznych jest znacząco wyższy dla rAd-Vp3 niż dla rAd-con zainfekowanych komórek, komórki te stawały się złośliwe.

Doświadczenia dotyczące toksyczności rekombinantowego apoptynowego adenowirusa u zdrowych szczurów

W warunkach hodowli tkankowej, apoptyna ekspresjonowana przez rekombinantowego adenowirusa rAd-VP3 w prawidłowych komórkach, na przykład, pochodzących od ludzi lub gryzoni, nie indukuje apoptozy. W doświadczeniu opisanym poniżej, badaliśmy czy ekspresja apoptyny za pomocą rekombinantowego adenowirusowego wektora rAd-Vp3 u zdrowych szczurów nie będzie dawała w wyniku ostrej toksyczności.

Zastosowany wektor rAd-VP3 i wektor kontrolny rAd były hodowane w komórkach PER.C6 i przez analizę PCR udowodniono negatywny wynik dla kompetytywnego-replikacyjnego adenowirusa (wolny od RCA). rAd's był oczyszczony za pomocą wirowania w 20 gradiencie CsCl.

Samcom szczurów Wag/Rij (Harlan, The Netherlands) o masie ciała około 200 g podawano przez iniekcję rekombinantowy adenowirus ekspresjonujący apoptynę (rAd-VP3; 2,5x109 jednostek tworzących łysinki, pfu), kontrolny rekombinantowy adenowirus ekspresjonujący produkt genu lucyferazy (rAd-luc; 2,5x109). Oba wektory adenowirusowi były zawieszone w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, zawierającej 0,1% albuminy surowicy wołowej i 10% gliceryny (PBS+). Roztwór bez wektora adenowirusowego był podawany przez iniekcję szczurom i służył jako dodatkowa kontrola negatywna. Dwóm szczurom podawano dożylnie, dootrzewnowe lub podskórnie albo rAd-VP3, rAd-luc lub zawiesinę +PBS.

Analiza makroskopowa szczurów traktowanych Ad-VP3

Pierwszą metodą, badania możliwego efektu toksycznego 10 Ad-VP3 ekspresjonującego apoptynę była ocena ogólnego stan zdrowia i szczególnie ciężaru ciała traktowanych szczurów, który to pomiar wykonywano każdego dnia po wstrzyknięciu. Wszystkie szczury były w dobrym stanie zdrowia w czasie doświadczenia. Ciężar ciała nie był znacząco różny w różnych grupach. Po 1 tygodniu, wszystkie zwierzęta doświadczalne włączając te z którym wykonano wstrzyknięcie rAd-VP3, zwiększyły masę ciała wskazując, że żadne ze zwierząt nie cierpiało na ostrą toksyczność spowodowaną traktowaniem przez rAd-VP3. W celu ustalenia braku ostrej toksyczności przeprowadzono następujące oznaczenia. Dwie godziny przed uśmierceniem wszystkim szczurom podano przez wstrzyknięcie BrdU. Po uśmierceniu wiele tkanek (wątroba, nerki, jelita, serce, płuca, śledziona, gonady i penis) badano pod kątem patologii bezpośrednio i/lub zbierano do dalszych badań histopatologicznych (patrz niżej).

PL 196 607 B1

Badania mikroskopowe pokazały, że żaden z traktowanych przez Ad-VP3 szczurów nie miał patologicznie znacząco zmienionych organów.

Oznaczanie Ad-VP3 DNA w wątrobie.

Głównym celem podawanego dożylnie (rekombinantowego) adenowirusa (wektora) jest wątroba i w pewnym zakresie śledziona. Dlatego każdy efekt toksyczny apoptyny będzie obserwowany w wą trobie.

Przeprowadzono zespół doświadczeń w celu zbadania obecności Ad-VP3 DNA, ekspresji apoptyny przez Ad-VP3 i możliwego efektu cytopatologicznego w wątrobie.

Najpierw zbadano, analizą Southern blot, czy izolowany DNA z wątrób traktowanych przez Ad-VP3 szczurów zawierał DNA apoptyny w dniu uśmiercenia, który był 8 dniem po wstrzyknięciu. Kontrola negatywna DNA z wątrób traktowanych przez Ad-luc szczurów była badana równolegle. Przed załadowaniem izolowanego DNA na żel agorozowy, DNA było trawione BamHI, co spowodowało otrzymanie fragmentu DNA o około 0,5 kbp. Southern blot hybrydyzowano z sondą DNA znakowaną ³²P.

Fragment BamHI-DNA był wyraźnie widoczny na Southern blot w przypadku DNA pochodzącego z traktowanych przez Ad-VP3 zwierząt i jak spodziewano się nieobecnych w prążkach zawierających DNA izolowane z wątrób szczurów traktowanych przez kontrolny rAd-luc. W celu zbadania ilości kopii Ad-VP3 w wątrobie, różne ilości DNA apoptyny były ładowane równolegle na Southern blot i hybrydyzowane z znakowaną sondą -apoptyna-DNA. Nawet 8 dni po infekcji doż ylnej, kopie 0,25 Ad-VP3 na komórkę mogą być oznaczane, co wskazuje bardzo znacząco transdukcję Ad-VP3 w wą trobie.

Ekspresja apoptyny i jej toksyczny efekt na komórki wątroby.

Za pomocą barwienia immunologicznego skrawków parafinowych wątrób traktowanych przez Ad-VP3 lub kontrolnych wątrób stosując specyficzne wobec apoptyny przeciwciała monoklonalne CVI-CAV-85.1 lub CVI-CAV-11.3, wykazano, że około 20-30% komórek wątroby traktowanych Ad-VP3 zwierząt ekspresjonowało apoptynę. Sekcja wątroby szczurów kontrolnych była negatywna dla apoptyny.

Badania możliwego wpływu cytotoksycznego ekspresjonującego apoptynę Ad-VP3 na komórki wątroby, przeprowadzono dwiema różnymi metodami. Najpierw skrawki wątroby wszystkich szczurów traktowanych przez Ad-VP3 i obu typów zwierząt kontrolnych barwiono hemotoksylino-eozyną (HE). We wszystkich zbadanych skrawkach wątroby nie obserwowano żadnych morfologicznych zmian patologicznych, 20 wskazując, że ekspresja apoptyny nie jest toksyczna dla komórek wątroby szczura.

Efekty uszkadzające mogą być obserwowane znakowaniem BrdU, który wykrywa nowo podzielone komórki wątroby. W przypadku wątroby zawierającej Ad-VP3, ilość komórek wątroby 25 znakowanych BrdU była podobnego stopnia (około 2%) jak w wątrobach kontrolnie traktowanych szczurów. Dlatego, ekspresja apoptyny, jako taka miała nieznacznie toksyczny wpływ in vivo.

Apoptyna nie ma wpływu toksycznego w modelu in vivo.

Zarówno mikroskopowa jak i histopatologiczna w połączeniu z danymi biochemicznymi i immunologicznymi analiza ujawniła, że ekspresja apoptyny nie ma (ostrego) toksycznego wpływu w modelu in vivo.

Wyniki te wskazują, że terapia oparta o ekspresję apoptyny przez zastosowanie nośnika dostarczającego geny lub innymi metodami będzie ograniczała skutki negatywne.

Badania przeciwnowotworowe w ludzkim modelu nowotworu wątroby

Regulowana przez Ad-VP3. ekspresja apoptyny powoduje indukcje apoptozy w transformowanych ludzkich komórkach w warunkach hodowli tkankowej. Na przykład, wywodząca się z Ad-VP3 ekspresja apoptyny powoduje indukcję apoptozy w pochodzących z ludzkiego nowotworu wątroby komórek HepG2. Dotychczas nie badano przeciwnowotworowej aktywności apoptyny in vivo (na przykład ekspresjonowanej przez Ad-VP3).

Dlatego, badano czy regulowana przez Ad-VP3 ekspresja apoptyny będzie wywoływała aktywność przeciwnowotworową w modelu in vivo. Na koniec, samcom myszy nudę Balb/C/nu/nu podawano przez iniekcję podskórną ludzkie komórki raka wątroby 1x106 na miejsce. Wykonano co najmniej dwa lub trzy podania na mysz. Trzy tygodnie po wstrzyknięciu rozwijały się wyraźne raki wątroby, były widoczne i miały średnią wielkość co najmniej 5x5 mm.

Wektory rAd-con1, zawieszone w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, 5% sacharozie i 0,1% albuminy surowicy wołowej, był podawany przez iniekcję do wnętrza guza.

PL 196 607 B1

Zastosowany wektor rAd-VP3 ekspresjonujący apoptynę i wektor kontrolny rAd-con1 zawierający gen apoptyny w przeciwnej do promotora Ad MLP orientacji 3'-5' (odwrotnej lub antysensownej) oba były hodowane w komórkach PER.C6. Obie porcje rekombinantowych adenowirusów były stwierdzane jako wolne od RCA za pomocą analizy PCR. RAds był oczyszczony przez wirowanie w gradiencie CsCl.

Na guz podawano przez wstrzyknięcie 7x10⁹ pfu w 40 mikrolitrowej zawiesinie. Traktowano 6 myszy z 2 do 3 guzami HepG2Na na typ wektora rAd. Jako kontrolę dodatkową , grupie 4 myszy nagich posiadających guza HepG2 podawano przez wstrzyknięcie buforowaną fosforanem sól fizjologiczną zawierającą 5% sacharozy i 0,15' albuminy surowicy wołowej (PBS + -grupa).

Apoptyna wywiera działanie przeciwnowotworowe w modelu in vivo

W celu zbadania moż liwego dział ania ekspresjonują cego apotyne Ad-VP3 w ludzkich rakach HepG2, mierzono wielkość podskórnych guzów w czasie doświadczenia które kontynuowano do 7 dni po iniekcji rAd-VP3 i zawiesiny kontrolnej.

Obie grupy zarówno PBS+ jak i grupa traktowana kontrolnym rAd-con1 wykazywały średni progresywny wzrost rozmiaru guza HepG2. W przeciwieństwie, do grupy która była traktowana do wewnątrz guza przez rAdVP3, który wykazywał redukcję rozmiaru guza. W 7 dni po iniekcji, myszy nagie były uśmiercane. Guzy były izolowane i badane mikroskopowo. Jest jasnym, że raki wątroby traktowane kontrolnym wektorem rAd-con1 lub PBS+ wykazywały mocniejsze unaczynienie tkanki guzowej HepG2 i stawały się większe po traktowaniu. Zupełnie inny obraz był obserwowany w przypadku traktowania raków HepG2 przez rAd-VP3. Pozostała masa guzowa posiadała wygląd blady, w związku z redukcją unaczynienia guza. Guzy zaczęły zmniejszać wielkość po traktowaniu przez rAd-VP3. Guzy zawierały także białą podobną do bąbelków strukturę, która jest wskaźnikiem śmierci komórek.

Poza indukowaną przez apoptynę regresją nowotworu, nie obserwowano negatywnego efektu ekspresji apoptyny na narządy (badano szczególnie wątrobę i śledzionę).

Apoptyna posiada przeciwnowotworową aktywność w układzie in vivo.

Podsumowując, nowotwory traktowane przez rAd-VP3 wykazywały zredukowany rozmiar guza, podczas gdy kontrolne nie wykazywały. To implikuje, że ekspresja apoptyny posiada aktywność przeciwnowotworową w modelu in vivo.

Fakt, że ekspresjonujący apoptynę Ad-VP3 może indukować regresję nowotworu w szybkorosnących nowotworach jak HepG2 potwierdza silny potencjał przeciwnowotworowy apoptyny. Fakt, że apoptyna redukuje wzrost u myszy nagich wskazuje, że ekspresja apoptyny jako taka zabija komórki nowotworu bez dodatkowej odpowiedzi immunologicznej. Opisana toksyczność i badania przeciwnowotworowe ujawniają, że terapia przeciwnowotworowa oparta o apoptynę jest bezpieczna i wykonalna.

Opis figur.

Figura 1 przedstawia w postaci wykresu, reprezentację zasadniczych części adenowirusowych adaptorowych wektorów pMAdS i pMab.

Figura 2 przedstawia w postaci wykresu reprezentację zasadniczych części rekombinantowych adenowirusowych adaptorowych wektorów pMab-VP3 i pMab-con.

Figura 3 przedstawia aktywność apoptozową indukowaną apoptyną w komórkach 911 transfekowanych przez pMAb-VP3 lub przez pCMV-VP3. Dwa niezależnie klonowane i oczyszczone pMAb-VP3 porcje DNA(pMab-VP3/ml i pMab-VP3-m2) były stosowane do transfekcji komórek 911. Komórki te były utrwalane 3 dni po transfekcji i analizowane przez pośrednią immunofluprescencję stosując specyficzne wobec apoptyny monoklonalne przeciwciała CVI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn i wsp., 1991. Procent komórek które barwiły się nieprawidłowo przy pomocy DAPI jest przedstawiony jako względny pomiar apoptozy.

Figura 4 przedstawia apoptyną indukowaną aktywność ludzkich tworzących nowotwór komórek raka wątroby HepG2 (zwanych VP3), kostnomięsaka U20S - i prawidłowych nie transformowanych diploidalnych keratynocytów FSK-1 infekowanych rekobmbinantowym apoptynowym defektywnym w odniesieniu do replikacji adenowirusem Ad-VP3. Komórki analizowano na drodze pośredniej immunofluorescencji stosując monoklonalne przeciwciało 85.1 barwione przy pomocy DAPI. Komórki HepG2 i U20S były utrwalane 1 dzień po transfekcji i komórki FSK-1 były zbierane i utrwalane 4 dni po transfekcji. Procent apoptyno-pozytywnych komórek, które barwiły się nieprawidłowo DAPI jest podana jako pomiar indukowanej apoptyną apoptozy (czarne pudełka). Jako kontrola procent nie infekowanych komórek które stały się nieprawidłowo barwione DAPI (słupki otwarte).

PL 196 607 B1

Figura 5 przedstawia apoptyno i/lub VP2 indukowaną aktywność apoptozową w komórkach SAOS-2 transfekowanych 2,5 μg pCMV-fs DNA ekspresjonujących apoptynę (poprzednio nazwanych pCMV-VP3; apoptyna jest nazwana VP3) i 2,5 μg pCMV-neoBam DNA (Danen-Van Oorschot, 1997); lub 2,5 μg pCMV-VP2 DNA ekspresjonujących białko CAV 2 (VP2) i 2,5 μg pCAV-neoBam DNA; lub 2,5 μg pCMV-fs i 2,5 μg pCMV-VP2 powodując ekspresję zarówno apoptyny (VP3) i VP2. Komórki były utrwalane 3, 4 i 5 dni po transfekcji i analizowane przez pośrednią immunofluorescencję stosując specyficzne wobec apoptyny monoklonalne przeciwciała CAI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn i wsp., 1991) lub przeciwciało monoklonalne CAVI-CAV-111. 1 (Noteborn i Koch, 1996). Procent komórek, które barwiły się nieprawidłowo DAPI przedstawiono jako względny pomiar apoptozy.

Figura 6 przedstawia w postaci wykresu reprezentację zasadniczych części rekombinantowego adenowirusowego wektora adaporowego pMab-VP2.

Figura 7 przedstawia w postaci wykresu reprezentację zasadniczych części rekombinantowego retrowirusowego wektora transferowego pLS-VP3-N.

Odnośniki

1. Aden, D.P., Fogel, A., Plotkin, S., Damjanov, I., i Knowles, H.B, (1979). Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-deriyed cell line. Nature 282, 615-616.

2. Arends, M.J., i Wyllie, A.H. 1991. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. International review of experimental pathology 32, 223-254.

3. Bellamy, C.O.C., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., x Wyllie, A.H. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12.

4. Boukamp, P., Petrussevska, R.T., Breitkreutz, Hornung, J., Markham, A., i Fusenig, R. 1988. Normal keratinazatron in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology 106, 761-771.

5. Cavener, D.R. i Stuart, C.R. (1991), Eukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Research 19, 3185-3192.

6. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Fischer D., Grimbergen J.M., Klein B., Zhuang S.M., Falkenburg J.H.F., Backendorf C., Quax P.H.A., Van der Eb A.J., and Noteborn M.H.M. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignami cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: In press.

7. Diller, L. i wsp., (1990). p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas. Molecular Cellular Biology 10, 5772-5781.

8. Dinsart, C., Cornelis, J., Rommelaere, J. (1996). Recombinant autonomous parvoviruses: New tools for the gene therapy of cancer? Chimica Oggi/chemistry coday. September 1996, 32-38.

9. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current opinion in Cell Biology 7, 337-343.

10. Fallaux, F. (1996). Gene therapy for heraophilia A: Towards the use of adenaviral vectors? PhD Thesis/Leider. University, The Netherlands.

11. Fallaux F. Kranenburg/ Cramer S.J., Houweling, A., Van Ormondt, H., Hoeben, R.C., i Van der Eb, A.J. (1996) Human Gene Therapy 7, 215-222.

12. Fischer, D.F., Gibbs, S., Van De Putte, P., i Backendorf, C. (1996). Molecular Cellular Biology 16, 5365-5374.

13. Graham, F.L, and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Volume 7: Gene Transfer and Expression Protols. E.J. Murray, ed. (The Humana Press, Clifton, N.J.) pp 109-128.

14. Graham, F.L. i Van der Eb, A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

15. Hockenberry, D.M. (1994). Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55.

16. Hooper, M.L. (1994). The role of the p53 and Rb-1 gene in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 13-17.

17. Horwitz, M.S. (1990). Adenoviridae and their replication, pp 1679-1740. In B.N. Fields and D.M. Knipe (Eds): Virology, Raven Press, Ltd, New York.

18. Kerr, J.F.R., Winterford, C.M., i Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026.

PL 196 607 B1

19. Levrero, M., Barban, V., Manteca, S., Ballay, A., Balsano, C., Avantaggiati, M.L., Natoli, G., Skellekens, H., Tiollais, P., i Perricaudet, M. (1991). Defective and nondefective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.

20. Lopez-Guerro, J.A., Rayet, B., Tuynder, M., Rommelaere, J., i Dinsart, C. (1997). Constitutive activation of U937 promonocytic cell clones selected for their resistance to parvovirus H-1, infection. Blood 89, 1642-1653.

21. Maniatis, T., Fritsch, E.F., i Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, New York, USA.

22. Mann, R., Mulligan, R.C., i Baltimore, D. (1983). Cell 33, 153-159.

23. McGrory, W.J., Bautista, D.S., i Graham, F.L. (1988). A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163, 614-617.

24. Miller, A.D. (1990a). Progress towards human gene therapy. Blood 76, 271-278.

25. Miller, A.D. (1990b). Retrovirus packaging cells. Human Gene Therapy, 1, 5-14.

26. Noguiez-Hellin, P., Robert-LeMeur, M., Salzmann, J.L., i Klatzmann, D. (1996). Plasmoviruses: nonviral/viral vectors for gene therapy. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 93, 4175-4180.

27. Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191 Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of a anti-tumor therapy.

28. Noteborn, M.H.M. i De Boer, G.F. (1995). Patent USA/no. 030,335. Noteborn, M,H.M. i Koch, G. (1996). PCT application WO 96/40931 Chicken anemia virus vaccines containing neutralizing conformational epitope.

29. Noceborn, M.H.M., De Boer, G.F., Kant, A., Koch, G., Bos, J.L., Zantema, A., i Van der Eb, A.J. (1990). Expression of avian leukemia virus env-gp85 in Spodoptera frugiperda cells by use of a baculovirus expression vector. Journal of general Virology 71, 2641-2698.

30. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, O., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., i Yan der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 3131-3139.

31. Noteborn M.H.M, i Koch G. (1995). Chicken anaemia virus infection: molecular basis of pathogenicity. Avian Pathology 24: 11-31.

32. Moteborn M.H.M., Koch G., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M,, Veldkamp S., Van der Eb A.J. (1994). A single anaemia virus protein, apoptin, causes cytopathogenic effect by inducing apoptosis. In: Proceedings of the international symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia (Kaleta EF, ed) pp 376-381, Rauischholzhausen, Germany.

33. Noteborn M.H.M., Todd D., Verschueren C.A.J., De Gauw, H.W.F.M. Curran W.L., Veldkamp S., Douglas A.J., McNulty; M.S., Van der Eb A.J., Koch G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J. Virology 68:346-351.

34. Rheinwald, J. and Beckett, M.A. (1980). Defective terminal differentiation in cultures as a consistent and selectable character of malignant human keratinocytes. Cell 22; 629-632.

35. Rheinwald, J.G., and Green, H. (1975). Serial cultivation of strains of homan epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6, 331-343.

36. Rizzuto, R. (1995). Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organels in living cells. Curr. Biol. 5, 635-642.

37. Sachs, L. i Lotem, J. (1993). Control of programmed cell deach in normal and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21.

38. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449.

39. Stratford-Perricaudet, L. i Perricaudet, M. (1991). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus, pp 51-61, In: O. Cohen-Adenauer and M. Boiron (eds): Human Gene Transfer, John Libbey Eurotext.

40. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 1456-1462.

41. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apopcosis. Genes and development 10,

1-15.

42. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apopcosis. Current opinion in Genetics and Development 5, 97-104.

PL 196 607 B1

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nośnik dostarczający geny zdolny do indukowania apoptozy w komórce zawierający fragment DNA kodujący białko posiadające apoptyno-podobną aktywność, przy czym apoptoza jest indukowana w komórkach nowotworu i apoptoza zredukowana, jeśli w ogóle zachodzi, zachodzi w normalnych diploidalnych nie transformowanych/niezłośliwych komórkach, i przy czym nośnikiem jest adenowirus a wspomnianym białkiem jest apoptyna.
2. 2. Nośnik, wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e dodatkowo zawiera zmodyfikowane miejsce inicjacji translacji bezpośrednio przeciwprądowo do kodonu startu ATG wspomnianej cząsteczki kwasu nukleinowego.
3. 3. Nośnik, według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane miejsce inicjacji translacji zawiera sekwencję kwasu nukleinowego GCCAAC.
4. 4. Nośnik, według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje co najmniej jedną komórkę docelową.
5. 5. Noś nik, wedł ug zastrz. 4, znamienny tym, ż e ta docelowa czą steczka jest reaktywna z receptorem powierzchniowym komórki nowotworu.
6. 6. Komórka gospodarza obejmująca noś nik dostarczają cy geny, jak zdefiniowano w zastrz. 1.
7. 7. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że jest komórką pomocniczą lub upakowującą.
8. 8. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, ż e jest wybrana z grupy komórek HEK;293, HER;911, PER.C6, Psi-2 i PA317.
9. 9. Zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że lek ten działa w połączeniu z konwencjonalną (chemo)terapią.
11. 11. Zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia hyperplazji, metaplazji i dysplazji.
12. 12. Zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do wytwarzania środka diagnostycznego do diagnozowania nowotworu.
13. 13. Zastosowanie nośnika dostarczającego geny jak zdefiniowano w zastrz. 1 do detekcji in vitro transformowanych lub rakowatych lub hyperplastycznych, metaplastycznych lub dysplastycznych komórek.