CZ349399A3

CZ349399A3 - Genový nosič, jej obsahující hostitelská buňka a jeho použití

Info

Publication number: CZ349399A3
Application number: CZ19993493A
Authority: CZ
Inventors: Matheus Hubertus Maria Noteborn; Alexandra Maria Pietersen
Original assignee: Leadd B. V.
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2000-02-16
Also published as: AU750162B2; BR9808542A; NZ500012A; ATE275200T1; JP2001521387A; KR100528755B1; KR20010006460A; DE69825978T2; EP0878546A1; SK285724B6; NO994967D0; CA2286165C; AU6856398A; EP0975764A1; CA2286165A1; PT975764E; PL196607B1; DE69825978D1; WO1998046760A1; PL336312A1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká genových nosičů, které obsahují molekuly nukleové kyseliny, kódující apoptózu indukujícím proteinům VP2 a/nebo apoptinu (VP3) podobnou aktivitu.

Tento vynález se také týká protinádorových terapií a diagnosy rakoviny. Infekce různých lidských nádorových buněk genovými nosiči tohoto vynálezu bude mít za následek indukci apoptózy v nádorových buňkách a mnohem nižší apoptózu, jestli vůbec nějakou, v normálních diploidních, netransformovaných/nemaligních buňkách.

Dosavadní stav techniky

In vitro, indukovala exprese proteinu apoptinu (VP3), odvozeného od viru kuřecí anemie (CÁV), v kuřecích transformovaných buňkách apoptózu (Noteborn et al., 1994, Noteborn a Koch, 1995). Apoptóza je charakterizována smrštěním buněk, segmentací jádra, kondenzací a štěpením DNA na fragmenty velikosti domén, u většiny buněk následované internukleozomální degradací. Nakonec se apoptotické buňky rozpadnou na apoptotická tělísky obalená membránou, která jsou rychle fagocytována sousedními buňkami. Apoptóza tudíž působí mnohem menší poškození tkáně nežli nekróza, nefyziologický způsob buněčné smrti (Wyllie et al., 1980, Arends a Wyllie, 1991 a White, 1996).

Apoptin je malý protein, dlouhý pouze 121 aminokyselin. Je dosti bazický a bohatý na prolin, serin a threonin (Noteborn et al., 1991). V analyzovaných transformovaných kuřecích buňkách, které procházely apoptinem indukovanou apoptózou, byl apoptin umístěn pouze v jádře. Zkrácení C-terminálního bazického konce apoptinu má za následek sníženou lokalizaci v jádře a významně sníženou apoptotickou aktivitu (Noteborn et al., 1994).

Apoptin a jiné proteiny s apoptinu podobnou aktivitou mohou také indukovat apoptózu v lidských maligních a transformovaných buněčných liniích, ale ne v netransformovaných lidských buněčných liniích. My jsme zjistili, že k apoptinem

• · · · · · • · ·

9 · • · · • · · · ·* *· indukované apoptóze dochází v nepřítomnosti funkčního p53 1995a) a že nemůže být blokována Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang Bcl-2 spojeným proteinem BAG-1 a proteinem kravských (Noteborn, 1996). In vitro není apoptin schopen indukovat • · · · • * · 9

999 999 • · • · · · (Zhuang et al., et al., 1995), s neštovic CmrA programovanou buněčnou smrt u normálních lymfoidních, kožních, pokožkových, endotheliálních buněk a buněk hladkých svalů. Když jsou však normální buňky transformovány, stávají se citlivými k apoptóze apoptinem nebo jinými proteiny s aktivitou podobnou apoptinu. Dlouhodobá exprese apoptinu v lidských fibroblastech ukázala, že apoptin nemá v těchto buňkách žádnou toxickou ani transformační aktivitu. V normálních buňkách byl apoptin nalezen převážně v cytoplazmě, zatímco v transformovaných nebo maligních buňkách, např. buňkách charakterizovaných hyperplázií, metaplázií nebo dysplázií, byl umístěn v jádře, což naznačuje, že lokalizace apoptinu je spojena s jeho aktivitou (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn, 1996).

Apoptóza je aktivním a programovaným fyziologickým procesem, který eliminuje nadbytečné, pozměněné nebo maligní buňky (Earnshaw, 1995). Apoptotický proces může být započat řadou regulačních podnětů (Wyllie, 1995 a White, 1996). Změny v přírůstků buněk hrají důležitou roli v lidské patogenezi, např. při vývoji rakoviny, která je způsobena zvýšeným buněčným dělením, ale také sníženým umíráním buněk (Kerr et al., 1994). Bylo prokázána, že řada chemoterapeutických sloučenin a radiace indukují apoptózu v nádorových buňkách, v mnoha případech přes p53 divokého typu (Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995).

U mnoha nádorů však během jejich vývoje dochází k mutaci v p53, což je často spojeno se slabou odezvou na léčbu rakoviny (Hooper, 1994). U několika (leukemických) nádorů je vysoká úroveň exprese protoonkogenu Bcl-2 spojena se silnou rezistencí k řadě chemoterapeutických látek indukujících apoptózu (Hockenberry 1994, Kerr et al., 1994 a Sachs a Lotem, 1993).

Apoptin se tudíž může stát potenciálním kandidátem pro ničení nádorových buněk, nebo jiných buněk charakterizovaných hyperplázií, metaplázií či dysplázií, které se staly rezistentními k (chemo)terapeutické indukci apoptózy, vzhledem k nedostatku funkčního p53 a (nad)expresi Bcl-2 a jiných látek inhibujících apoptózu. Fakt, že apoptin neindukuje apoptózu v normálních

I

L.

netransformovaných lidských buňkách, alespoň ne in vitro, naznačuje, že toxický účinek apoptinového léčení in vivo může být velmi nízký.

Exprese apoptinu v nádorových buňkách je však dosud prováděna za použití přechodné transfekce buněk tkáňových kultur. Nevýhodou tohoto způsobu exprese je velmi nízké procento buněk, které mohou exprimovat apoptin za podmínek in vitro. In vivo budou tyto používané transfekční metody problematické a neúčinné, jestli vůbec možné, a vůbec nepřispějí k účinnému léčení rakoviny.

Adenovirus může být odvozen od lidských adenovirů (Ad), což jsou neobalené, ikosahedrální DNA viry. Jejich genom je tvořen lineární, dvouřetězcovou molekulou DNA velikosti asi 36 kb, která nese koncové obrácené repetice (Horvitz, 1990). Serotypy, které byly použity pro přípravu vektoru (Ad2 a Ad5) nejsou spojeny se silnou lidskou patologií (Horvitz, 1990). Virus je extrémně účinný při zavádění své DNA do buňky hostitele. Ad mohou infikovat velké množství dělících se a nedělících se buněk z celé řady druhů a virus může být relativně lehce produkován ve velkých množstvích. Na rozdíl od retrovirů se Ad neintegrují do genomu hostitele. Všechny v současnosti používané rAdV mají deleci v úseku El, kam může být vkládána nová DNA. Tato El delece učiní rekombinantní virus defektní ve schopnosti replikace (Stratford-Perricauder a Perricaudet, 1991). Toto na jedné straně poskytuje důležitý bezpečnostní prvek : rAdV se nemůže replikovat v lidských buňkách v nepřítomnosti E1A proteinů. rAdV může tedy dopravit svoji genetickou informaci do lidské buňky, ale následkem tohoto nebude lytická nebo produktivní infekce. Na druhé straně zde vzniká problém s produkcí těchto vektorů. El funkce však nemusí být nutně kódovány samotným vektorem. Mohou být také poskytnuty v trans, ve zvláštních pomocných buňkách, které exprimují El geny. Při infekci nebo transfekci těchto pomocných buněk Ad vektorem s deletovaným El, budou buněčné proteiny El doplňovat replikaci rAdV, výsledkem čehož bude produkce potomstva rAdV. Ad pomocné buňky musí být lidského původu a musí obsahovat a exprimovat AdEl úsek, např. lidské buňky transformované Ad, jako je buněčná linie 293 (Graham a Prevec, 1991) buněčná linie 911 (Fallaux et al., 1996) a buněčná linie PER.C6 (Fallaux, 1996).

• » · · • · · » · · • · · • · « • · · · • · · · ·· ··

Podstata vynálezu

Tento vynález nyní poskytuje genový nosič (nebo vektor), který umožňuje využití vlastností protinádorové látky apoptinu nebo jiných proteinů s apoptinu podobnou aktivitou, pro léčení rakoviny pomocí genové terapie, nebo pro léčení zhoubností, charakterizovaných hyperplázií, metaplázií nebo dysplázií. Takovýmto genovým nosičem, který je nezávisle infekčním vektorem, může být například virus, lipozóm, polymer apod, který sám může infekcí nebo jakýmkoliv jiným způsobem dopravit genetickou informaci do například nádorových buněk, které nohou být léčeny. Genetická informace obsahuje molekulu nukleové kyseliny, kódující apoptinu podobnou aktivitu. Tento vynález také poskytuje genový nosič, u něhož byla vysoce zvýšena jeho schopnost exprimovat apoptinu podobnou aktivitu. Překvapivě bylo zjištěno, že změna upstream nekódující sekvence nukleové kyseliny, umístěné v rámci iniciačního místa translace, které předchází kódující sekvenci proteinu podobného apoptinu, zesiluje expresi zmíněného proteinu v nádorových buňkách. Tento vynález také poskytuje genový nosič, obsahující nukleovou kyselinu, kódující VP2 podobnou aktivitu. Překvapivě bylo zjištěno, že VP2 podobná aktivita působí synergisticky s apoptinu podobnou aktivitou, týkající se indukce apoptózy v nádorových buňkách. Samotný VP2 podobný protein může také působit synergisticky nebo doplňkově například při (chemo)terapeutické indukci apoptózy. Tento vynález také poskytuje genový nosič, obsahující vedle nukleové kyseliny kódující aktivitu podobnou apoptinu také nukleovou kyselinu kódující VP2 podobnou aktivitu. Tento vynález poskytuje například genový nosič podle tohoto vynálezu, kterým je virus. Tento vynález dále poskytuje genový nosič, kterým je virus, defektní ve schopnosti replikace, který se ale může replikovat v pomocných nebo pakážovacích buňkách, za účelem pomnožení tohoto genového nosiče. Genovým nosičem, poskytnutým tímto vynálezem, mohou být například adenovirové, retrovirové nebo jiné DNA či RNA rekombinatní viry, které mohou být použity jako genové nosiče, nebo plasmovirus. Tento vynález dále poskytuje genový nosič, který byl dále doplněn specifickým ligandem, směrovací molekulou nebo směrovacími molekulami, pomocí kterých může být tento genový nosič specificky směrován tak, aby dopravil svoji genetickou informaci ke zvolené ······ · ♦ · · · · ·· · · · ·· · · · · ··· · · ♦ · · · • · · · · · · ······ ···· · · · · ·· ·· ··· ··· ·· ·· cílové buňce. Takovouto směrovací molekulou může být například virový adsorbční protein, receptorová molekula nebo protilátka, reagující s povrchovými receptory nebo proteiny nádorové buňky.

Tento vynález také poskytuje genový nosič, který může být použit při diagnose např. rakoviny. Takovýto genový nosič může být například použit pro in vitro diagnosu, kdy jsou z člověka nebo zvířete odebrány tkáňové či buněčné vzorky nebo biopsie. Takovéto vzorky mohou být hodnoceny nebo testovány tak, že jsou přímo nebo v kulturách infikovány zmíněným genovým nosičem, který je schopen exprimovat např. apoptinu podobnou aktivitu. Pouze transformované buňky, buňky vykazující různé stupně hyperplázie, dysplázie či metaplázie, nebo nádorové či rakovinné buňky, exprimují protein s apoptinu podobnou aktivitou ve svém jádře. Přítomnost zmíněného proteinu může být například prokázána za použití klasických (imuno)histologických technik, např. mikroskopicky nebo pomocí automatických technik na třídění buněk. Druhou možností je využití skutečnosti, že výše infikované buňky jsou charakterizovány apoptózou a mohou tedy být rozpoznány podle známých charakteristik apoptózy.

Tento vynález dále poskytuje nebo popisuje všechny kroky, nutné pro vytvoření rekombinantního, v replikaci defektního adenoviru, exprimujícího látku indukující apoptózu, apoptin. Vysoké titry rekombinantního-apoptinového adenoviru mohou být produkovány pomocí buněčných linií pakážujících adenoviry, jako jsou 293, 91 1 a PER.C6. V buněčných kulturách nevykazuje apoptin detekovatelné negativní účinky na žádný z nutných kroků replikace adenoviru ani na další části životního cyklu adenoviru. Tento vynález navíc poskytuje vytvoření kontrolního rekombinantního adenoviru, který obsahuje všechny sekvence jako rekombinantní-apoptinový adenovirus, ale který vzhledem k 3'-5' orientaci sekvence kódující apoptin, pod kontrolou regulačních částí promotoru, není schopen exprimovat apoptin. Pomocí tohoto kontrolního adenovirového vektoru mohou být testovány specifické účinky exprese apoptinu rekombinantním adenovirem.

Rekombinantní, v replikaci defektní adenovirus exprimuje apoptin ve vysokých množstvích v různých nádorových a/nebo transformovaných buňkách, výsledkem čehož je indukce apoptózy. Naopak exprese apoptinu, pomocí rekombinantního adenoviru, v normálních, v netransformovaných lidských buňkách nemá za • · • · · ·· · · ···· • * · · · « · · · • · · · · » · ······ ···· ·· · (* ·· ·· ··· ··· ·· ·· následek apoptinem indukovanou apoptózu.

Tento vynález se obzvláště týká protinádorové terapie. Léčení nádorů (nádorových buněk) se bude provádět expresí apoptinu, pomocí infikování (nádorových) buněk genovým nosičem, jako je adenovirus, který obsahuje kódující sekvence pro protein s apoptinu podobnou aktivitou. Tento vynález tudíž poskytuje genový nosič, jako je adenovirus, exprimující apoptin, který je velmi účinnou protinádorovou látkou. Adenovirová regulace apoptinu neindukuje, nebo alespoň ne detekovatelně, apoptózu v normálních buňkách, což naznačuje, že toxicita léčby rekombinantním-apoptinovým adenovirem in vivo bude nízká. Infekcí rekombinantním-apoptinovým adenovirem může být získáno mnohem vyšší množství (nádorových) buněk exprimujících apoptin. Toto zjištění je hlavním vylepšením exprese apoptinu, ve srovnání s transfekcí DNA.

Tento vynález se také týká přípravy VP2 expresní jednotky bez syntézy apoptinu a/nebo části apoptinu. Dále jsme poskytli důkaz, že exprese proteinu VP2, z viru kuřecí anemie (CAV), zvyšuje apoptózu indukovanou apoptinem v lidských nádorových buňkách. Přesněji, VP2 a apoptin působí synergisticky, co se týká indukce apoptózy v nádorových buňkách. Toto zjištění naznačuje, že výsledkem koexprese VP2 a apoptinu bude zlepšení terapií, založených na apoptinu.

Tento vynález poskytuje významné zlepšení exprese apoptinu pomocí změny jeho upstream sekvence přímo od iniciačního kodonu ATG. Vylepšení exprese nevyžaduje záměnu aminokyseliny v apoptinovém proteinu, jak bylo stanoveno Kozákovým pravidlem. Vylepšení upstream sekvence od iniciačního kodonu ATG jiných CAV proteinu bude mít také za následek zlepšení jejich syntézy.

Tento vynález se také týká přípravy retrovirových vektorů, které exprimují apoptin v lidských nádorových buňkách, výsledkem čehož je indukce apoptózy. Tento výsledek u rekombinantního-apoptinového retroviru v kombinaci s údaji o rekombinantním-apoptinovém adenoviru naznačuje, že exprese apoptinu není toxická pro replikaci DNA ani RNA virů.

Exprese apoptinu v (nádorových) buňkách může být, kromě adenovirových a retrovirových vektorů, prováděna také pomocí infekce jinými DNA a/ RNA virovými vektory, které obsahují kódující sekvence pro apoptin. Dále mohou být pro apoptinem indukovanou apoptózu v nádorových buňkách použity vektorové systémy odvozené od virů, jako jsou plasmoviry.

• · • · φ · γ ·· · · ······

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje schematické znázornění důležitých částí adaptorových vektorů pMad5 a pMab.

Obrázek 2 ukazuje schematické znázornění důležitých částí rekombinantních adaptorových vektorů pMab-VP3 a pMab-con.

Obrázek 3 ukazuje apoptinem indukovanou apoptotickou aktivitu v buňkách 911, transfekovaných pMAb-VP3 nebo pCMV-VP3. Pro infekci buněk 911 byly použity dvě nezávisle klonované a purifikované dávky DNA pMab-VP3 (pMabVP3/ml a pMab-VP3/m2). Buňky byly fixovány tři dny po transfekci a byly analyzovány pomocí nepřímé imunofluorescence za použití apoptin-specifické monoklonální protilátky CVI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn et al., 1991). Procento buněk, které byly barveny abnormálně DAPI je uvedeno jako relativní míra apoptózy.

Obrázek 4. ukazuje apoptinem (nazývaným VP3) indukovanou apoptotickou aktivitu v lidských tumorogenních hepatomových buňkách HepG2, osteosarkomových buňkách U20S a normálních netransformovaných diploidních keratinocytech FSK-1, infikovaných rekombinantním-apoptinovým, v replikaci defektním adenovirem Ad.VP3. Buňky byly analyzovány pomocí nepřímé imunofluorescence za použití monoklonální protilátky a barveny DAPI. Buňky HepG2 a USO2 byly fixovány 1 den po transfekci a buňky FSK-1 byly sklizeny čtyři dny po transfekci. Procento apoptin pozitivních buněk, které byly barveny abnormálně DAPI je uváděno jako míra apoptinem indukované apoptózy (šrafované sloupce). Jako kontrola je zde uvedeno procento neinfikovaných buněk, které byly DAPI barveny abnormálně (černé sloupce).

Obrázek 5 ukazuje apoptinem/VP2-indukovanou apoptotickou aktivitu v buňkách Saos-2, transfekovaných 2,5 ug pCMV-fs DNA, exprimující apoptin (dříve nazývaný pCMV-VP3; apoptin je nazýván VP3) a 2,5 ug pCMV-neoBam DNA (Danen-Van Oorschot; 1997), nebo 2,5 ug pCMV-VP2 DNA, exprimující CAV protein 2 (VP2) a 2,5 ug pCMV-neoBam DNA; nebo 2m5 ug pCMV-fs a 2,5 ug pCMV-VP2, výsledkem čehož je exprese apoptinu (VP3) a VP2. Buňky byly fixovány 3, 4 a 5 dní po transfekci a byly analyzovány pomocí nepřímé adenovirových adenovirových

9 9 9

I 9 9 <

► 9 9 « *···«* 9 · · · 9 · · · · · · ·

9 9 9 9 9 9 • 9 9 · 9 · ·· *· ♦·· ·♦· imunofluorescence za použití apoptin-specifické monoklonální protilátky CVICAV-85.1 (85.1; Noteborn et al., 1991) nebo monoklonální protilátky CVI-CAV111.1 (Noteborn a Koch, 1996). Procento buněk, které byly barveny abnormálně DAPI je uvedeno jako relativní míra apoptózy.

Obrázek 6 ukazuje schematické znázornění důležitých částí rekombinantních adenovirových adaptorových vektorů pMab-VP2.

Obrázek 7 ukazuje schematické znázornění důležitých částí rekombinantního retrovirového transferového vektoru pLS-VP3-N.

Tento vynález bude dále vysvětlen detailněji na základě následujících příkladů. Tyto jsou pouze ilustrativní a neměly by být vykládány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Experimentální část

Buňky a podmínky buněčné kultivace

Ad5 El transformované buněčné linie lidské embrionální ledviny (HEK; 293) a lidské embrionální sítnice (HER; 911 a PER.C6) byly kultivovány na Dulbeccově modifikovaném Eagle mediu (DMEN), doplněném 10% fetálním telecím šerem (FCS) v prostředí 5% COg při 37 °C. Buněčná linie 293 byla získána od

American Type Culture Collection (ATCC CRL 1573). Buněčné linie 911 a PER.C6 byly získány od Fallaux et al., (1996). Buněčná kultivační media, činidla a sera byla zakoupena od GIBCO Laboratories (Grand Island, NY). Kultivační nádoby byly zakoupeny od Greiner (Nurtingen, Německo).

Lidské epidermální keratinocyty byly izolovány z pokožky a byly kultivovány v přítomnosti vrstvy myších 3T3 fibroblastů. které byly smrtelně ozářeny 137-Cs. Primární kultury keratinocytů (FSK-1) byly založeny na kompletním mediu, jak jest popsáno (Rheinwald a Green, 1975) s menšími úpravami.

Tumorogenní keratinocyty, buňky SCC-15 (Rheiwald a Beckett, 1981), odvozené od karcinomu squamozních buněk, byly kultivovány na mediu DMEM/F12 (3:1), obsahujícím 5% fetální telecí sérum, 0,4 ug hydrokortisonu a 1 uM isoproterenol.

• · » ·· * • · « · « · · « · « ♦ • « · ♦ · · ♦ · · • · «4 · · · ·♦···* • · · · » · · · · · · ♦ ····♦· · · · ·

Buňky HepG2 (Aden et al., 1979), odvozené od lidského hepatomu, a buňky US02 a Saos-2 (Diller et al., 1990), odvozené od lidského osteosarkomu, byly kultivovány na DMEM (GIBCO/BRL), doplněném 10% fetálním telecím šerem. Spontáně transformovaný kmen keratinocytů HaCat (Boukamp et al., 1988) byl darem od Prof. R. Fuseniga, DKFZ, Heidelberg, Německo. Buňky HaCaT byly kultivovány na DMEM, doplněném 10% fetálním telecím šerem.

Myší buněčné linie byly kultivovány na DMEM s vysokým obsahem glukosy (4,5 gramů na litr) a 10% fetálním telecím šerem v prostředí 5% CO2 při 37 °C. Ekotropní pakážovací buněčná linie Psi-2 (Mann et al., 1983) a amfotropní pakážovací buněčná linie PA317 byly popsány dříve (Miller, 1990 a,b).

Virové techniky

Plakové pokusy byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve (Fallaux et al., 1996). Stručně, adenovirové zásobní roztoky byly v sériích rozpuštěny ve 2 ml DMEM, obsahujícím 2% koňské sérum, a byly přidány k buňkám 911 na

6-jamkových miskách. Po dvou hodinách inkubace při 37 °C bylo medium nahrazeno F-15 minimálním esenciálním mediem (MEM), obsahujícím 0,85% agarosu (Sigma, USA), 20 mM HEPES (pH 7,4), 12,3 mM MgCl2, 0,0025% L-glutamin a 2% koňské sérum (teplem inaktivované při 56 °C po dobu 30 min). Produkce adenovirových sérií v malém měřítku bylo prováděna tak, jak bylo popsáno dříve (Fallaux et al., 1996). Stručně, monovrstvy buněk 911 nebo PER.C6 byly infikovány přibližně 5 plak-vytvářejícími jednotkami (p.f.u.) na buňku, ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCl (PBS), obsahujícím 1% koňské sérum. Po jedné hodině při pokojové teplotě bylo inokulum nahrazeno čerstvým mediem (DMEM/2% koňské sérum). Po 48 hodinách byly téměř úplně oddělené buňky sklizeny a shromážděny v lml PBS/1% koňského sera. Virus byl z produkujících buněk izolován 3 cykly rychlého zmrazení/rozmrazení. Lyzáty byly pročištěny centrifugací při 3000 rpm po dobu 10 min a uloženy při -20 °C.

911 a PER.C6 produkované rADV zásobní roztoky byly testovány na přítomnost replikaceschopného adenoviru prováděním PCR analýzy s primery od Ad5 ITR úseku (5-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3) a E1A kódujícího úseku (5-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3), jak bylo popsáno v Noteborn a De Boer (1995), za použití přístroje Perkin Elmer PCR apparatus. Přítomnost •*•44* * 4 · · · · • 4 4 ·· «4 4 4 4 4 • 44 4 4 4 ♦ · 4

4 4« 4 4 4 444444

4444 4 4 · « ίο *· ·* *·· ··· ·* *· amplifikovaného fragmentu velikosti 600 bp naznačuje, že v analyzovaném zásobním roztoku existuje replikaceschopný adenovirus (obsahující El úsek) (Hoeben, nepublikované výsledky). Buňky HepG2 byly infikovány seriemi rAdV. Během alespoň 10 dnů byly u buněk sledovány možné cytopatogenní účinky a byly testovány nepřímou imunofluorescencí, za použití specifického monoklonálního antisera proti proteinu E1A.

Plazmidy a DNA transfekce

Adaptorový plazmid pMad5 byl vytvořen z pMLPIO (Levrerno et al., 1991) tak, jak je popsáno níže. Plazmid pMLP-10-lin byl odvozen od pMLPIO inzercí syntetického fragmentu DNA s jedinečnými místy pro restrikční endonukleázy Mlul, SplI, SnaBI, Spi, AsuII a MunI do místa HindlII na pMLPIO. Adenovirový BglI fragment, obsahující nukleotidy 3328 až 8914 genomu Ad5 byl vložen do MunI místa pMLP-lin. Z výsledného plazmidu byl deletován fragment SallBamHI, za účelem inaktivace genu pro tetracyklinovou rezistenci. Výsledný plazmid byl zkontrolován restrikční analýzou a pojmenován jako pMad5. Exprese genů, inzerovaných v mnohočetném klonovacím místě, bude řízena adenovirovým hlavním pozdním promotorem, který je v tomto uspořádání spojen s adenovirovým enhancerem raného genu 1 (El).

Všechny CAV DNA sekvence jsou původně odvozeny od plazmidu pIc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn a De Boer, 1990). Expresní plazmid pCMV-fs, dříve nazývaný pCMV-VP3 (Noteborn et al., 1994) obsahuje CAV DNA sekvence, kódující výhradně apoptin (nt 427-868).

Plazmid pCMV-VP2mu (Noteborn, nepublikované výsledky) obsahuje CAV DNA sekvence od 380 do 1512. Tento CAV DNA fragment obsahuje kódující úsek VP2, ohraničený 25 bp 5-nekódující a 484 bp 3-nekódující CAV DNA sekvencí. 106 bp downstream od start kodonu pro VP2 je v jiném čtecím rámci umístěn start kodon pro apoptin. Pro zamezení syntézy apoptinu bez bránění syntéze VP2 byla do iniciačního kodonu apoptinu zavedena mutace (ATG bylo zaměněno na ACG) a dále byla vytvořena bodová mutace v pozici 549 (T bylo zaměněno za

A), výsledkem čehož byl extra stop kodon v genu kódujícím apoptin. Vložená sekvence bude tudíž exprimovat pouze protein VP2 plné délky. Nepřímou imunofluorescencí bylo ukázáno, že VP2 mohl být produkován, ale apoptin • · · ·

syntetizován nebyl.

Pro klonování PCR-amplifikovaných DNA fragmentů jsme použili plazmid pCR-3.1, který byl zakoupen od InVitrogene (Carlsbad, CA). Pro vytvoření rekombinantího, v replikaci defektního retroviru, exprimujícího apoptin, byl použit retrovirový vektor pLXSN (Miller, 1900 a,b).

Všechny klonovací kroky s plazmidovou DNA byly v podstatě prováděny podle metod, uvedených v Manniatis et al., (1992),

Všechny enzymy byly zakoupeny od Boehringer Mannheim, Německo a/nebo BioLabs, USA.

Plazmidová DNA byla purifikovány centrifugací v gradientu CsCl a kolonovou chromatografií v Sephacrylu S500 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Lidské buněčné linie HaCAT, HepG2, SCC-15, 293, 911 a PER.C6 byly transfekovány plazmidovou DNA pomocí srážení fosforečnanem vápenatým, jak je popsáno v Graham a Van der Eb (1973). Normální lidské diploidní keratinocyty (FSK-1, druhá pasáž), buňky U20S a Saos-2 byly transfekovány pomocí DOTAP (Fischer et al., 1996).

Nepřímá imunofluorescence

Buňky byly fixovány 80% acetonem a byly použity v imunofluorescenčních pokusech s CAV-specifickými nebo pro adenovirový E1A specifickými monoklonálními protilátkami a kozími protimyšími a/nebo kozími protikráličími IgC, spojenými s fluoresceinem (Jackson Immunoresearch Laboratories lne., West Grove, PA), jak jest popsáno v Noteborn et al., (1990). Jaderná DNA byla barvena 2,4-diamino-2-fenylilindolem (DAPI) nebo propidiumiodidem (PI).

Výsledky a diskuse

Vytvoření adaptorového vektoru pMab

Za účelem zavedení místa pro restrikční enzym BamHI do adaptorového plazmidu pMad5, byl tento plazmid štěpen restrikčním enzymem Clal a byl upraven telecí střevní alklalickou fosfatázou. Clal/BamHI linker byl upraven T4 kinázou, byl ligován sám se sebou za použití T4-DNA ligázy a následně byl štěpen Clal. Clal/BamHI/Clal linker byl izolován a ligován do linearizovaného vektoru pMad5. Ligačními produkty byl transformován bakteriální kmen JM109.

4*4«·· · · ·♦ 44 «· 4 · 4 ·· · 4 4 · • 4« 4 4 «4·· •4 4« 4 4 4 4*4444

4444 44 44 ·· ·· ··· ’·· *· *·

Konečný vektor pMab byl charakterizován štěpením restrikčními enzymy. Při využití vektoru pMab mohou být cizí geny ligovány do jedinečného BamHI místa pod kontrolu adenovirového hlavního pozdního promotoru. Schematické znázornění pMad5 a pMab je na obrázku 1.

Vytvoření rekombinantního-apoptinového a kontrolního adaptorového vektoru.

Za účelem vytvoření adaptorového vektoru pro zavedení apoptinového genu do adenovirů byl pMab štěpen BamHI a následně upraven telecí střevní alklalickou fosfatázou. Poté byl pCMV-fs upraven BamHI a byl izolován 0,45 kb dlouhý fragment DNA, obsahující sekvence kódující apoptin. Fragment apoptinové DNA byl ligován do BamHI místa linearizovaného adaptorového vektoru pMab.

Ligační produkty byly klonovány do bakteriálního kmene JM109. Orientace apoptinu v pMab byla určena pomocí analýzy restrikčními enzymy.

pMab konstrukt, obsahující apoptinový gen v 5'-3' orientaci pod kontrolou adenovirového hlavního pozdního promotoru bude exprimovat tento apoptinový gen. Tento apoptinový vektor vyl nazván pMab-VP3 a bude použit pro přípravu adenovirového vektoru, exprimujícího apoptin. pMab DNA plazmid, obsahující sekvence kódující apoptin v 3'-5' orientaci downstream od adenovirového hlavního pozdního promotoru, tento apoptinový gen exprimovat nemůže. Tento adaptorový vektor bude použit pro přípravu kontrolního rekombinantního adenovirového vektoru.

Schematické znázornění obou rekombinantních adaptorových vektorů je na obrázku 2.

Indukce apoptózy CMV plazmidem ve srovnání s rekombinantním-apoptinovým adaptorovým vektorem, exprimujícím apoptin

Nejprve jsme vyzkoušeli, zda je pMab-VP3 DNA vektor vskutku schopen exprimovat apoptin v transfekovaných buňkách, zatímco pMab-con by toho schopen být neměl. Za tímto účelem byly lidské, adenovirem transformované buňky 293 a 911 transfekovány pMab-VP3, pMab-con a pro pozitivní kontrolu také pCMV-VP3. Přibližně dva dny po transfekci byly buňky fixovány a testovány na expresi apoptinu pomocí nepřímé imunofluorescence. Buněčné kultury, transfekované pCMV-VP3 a pMab-VP3, obsahovaly asi 1 % buněk, které

9 ··♦· • · · · 99 9 9

..............

reagovaly s monoklonální protilátkou, specifickou pro apoptin, zatímco buněčné kultury, transfekované pMab-con je neobsahovaly. Tyto výsledky znamenají, že pMab-VP3 apoptin exprimuje a jak bylo očekáváno, pMab-con jej neexprimuje.

V dalších transfekčních pokusech jsme analyzovali indukci apoptózy v buňkách 911 po transfekci pMab-VP3 ve srovnání s pCMA-VP3. Tři dny po transfekci byly buňky 911 sklizeny a testovány pomocí nepřímé imunofluorescence na expresi apoptinu.

Navíc byly tyto buňky barveny DAPI nebo PI, které barví silně intaktní DNA, ale apoptotickou DNA barví slabě a/nebo nepravidelně (Telford, 1992).

Přibližně 60 % apoptin pozitivních buněk 911, transfekovaných pMab-VP3, bylo apoptotických, kdežto u apoptin-pozitivních buněk, transfekovaných pCMV-VP3, došlo k apoptóze u asi 40 % z nich. Tyto výsledky naznačují, že pMab-VP3 regulovaná exprese apoptinu má za následek podobnou nebo o něco větší úroveň indukce apoptózy než apoptin, exprimovaný pCMV-VP3. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3. Dále, apoptin je schopen indukovat apoptózu v lidských adenovirem transformovaných buňkách, E1B neinhibuje apoptózu indukovanou apoptinem. EIB je naopak schopen blokovat apoptózu indukovanou celou řadou chemoterapeutických činidel. Tyto výsledky naznačují, že je apoptin velmi účinnou protinádorovou látkou.

Vytvoření rekombinatního-apoptinového adenoviru

Rekombinantní-apoptinové adenovirové vektory byly vytvořeny kotransfekcí adaptorových plazmidů pMab-VP3, nesoucích kódující sekvence pro apoptin a některé adenovirové sekvence, a plazmidové DNA JM17, obsahující celou adenovirovou DNA bez úseku El a E3 (McGrory et al., 1988), do pomocné buněčné linie 911. Kotransfekce byly provedeny s DNA, vysráženou fosforečnanem vápenatým, jak je popsáno v Graham a Van der Eb (1973). Rekombinatní adenovirová DNA je vytvořena homologní rekombinací mezi homologními virovými sekvencemi, které jsou přítomné v plazmidů pMab-VP3 a v adenovirové DNA v JM17.

Podobným způsobem byly provedeny kotransfekce buněk 911 pMab-con a pJM17 DNA, za účelem vytvoření kontrolního adenoviru, který nemůže exprimovat apoptin a který bude použit jako adenovirová kontrola při testování apoptinem ·» 9· » 4 4 4 » 4* <

• 4 4 4 4 4

4 • · *

• · • · · ·· indukovaných apoptotických účinků.

Několik hodin po transfekci byly monovrstvy buněk 911 převrstveny vrstvou agarózy a byly inkubovány při 37 °C, dokud nebyly plaky, indukované rekombinantním adenovirem, jasně viditelné. Viry byly z plaků sklizeny jako zásobní roztoky PBS-koňského sera, jak je popsáno v Fallaux et al. (1996). Následně byla část zásobních roztoků rekombinantních virů přidána na 24 jamkové misky, obsahujících čerstvé buňky 911. O několik dní později byly tyto infikované buňky 911 lyžovány a rekombinantnř viry byly sklizeny.

Poté byla testována exprese apoptinu u potenciálních rekombinantníchapoptinových adenovirů (rAd-VP3) nebo její absence v kontrolních rekombinantních adenovirech (rAd-con). Část zásobních roztoků rekombinatních virů, odvozených z infikovaných 24 jamkových misek, byla použita k infekci čerstvých buněk 911, které vyrostly jako monovrstvy na sklem krytých páscích. Po jednom dni byly infikované buňky fixovány acetonem a analyzovány imunofluorescencí za použití pro apoptin-specifické monoklonální protilátky 85.1. Pět z pěti analyzovaných kultur buněk 911, infikovaných údajným rADVP3, obsahovalo buňky exprimující apoptin. Žádná z buněk, infikovaných Ad-con, a neinfikovaných buněk 911 nebyla pozitivní na apoptin.

Tyto výsledky znamenají, že při kotransfekci adenovirových pakážovacích buněčných linií, jako jsou buňky 911, požadovanou adaptorovou a adenovirovou DNA, mohou být vytvořeny životaschopné rAD-VP3, exprimující apoptin.

Dva zásobní roztoky, odvozené od plaků rAd-VP3 a rAD-con byly použity pro purifikaci rAd provedením tří následných plakových purifikací s buňkami 911 nebo souběžně v pokusu s omezeným zředěním na PER.C6 buňkách, jak je popsáno Fallauxem (1996).

Na základě výše popsaných metod, jejichž výsledkem byla produkce rAd-VP3, exprimuj ícího apoptin pod kontrolou adenovirového hlavního pozdního promotoru, se nám také podařila exprese apoptinu pod kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV). Tyto výsledky ukazují, že mohou být produkovány různé typy rekombinantních adenovirů, regulujících jedním ze svých nebo heterologních promotorových úseků.

Produkce rAd-VP3 a rAd-con, za použití PER-C6 buněk ·· · ·· ·· ···· • · · · · · * · * ·· ·« · ·»······ • · · · · · ·· ·· ·· *.........

Produkce sérií rAd-VP2 a rAd-con v malém měřítku, za použití PER.C6 buněk byla provedena tak, jak je popsáno v Fellaux, 1996. Stručně, postup je popsán v experimentální části

Pomocí plakových pokusů bylo určeno, že titry rAd-VP3 a rAd-con byly 11-12 přibližně 10 na ml čistého lyzátu. Získané titry nejsou nižší než titry, pozorované v naší laboratoři pro jiné rAd.

Pomocí PCR a infekce HepG2 rAd-VP3 a rAd-con bylo testováno, zda vytvořené dávky viru obsahují replikaceschopný adenovirus (viz také experimentální část). rAd-VP3 ani rAd-con neobsahovaly RCA, jak bylo dokázáno oběma metodami. Vyvodili jsme závěr, že exprese apoptinu za podmínek tkáňové kultury nezasahuje negativně do žádného z nutných kroků životního cyklu adenoviru. Genová terapie, založená na adenovirovém vektoru, exprimujícím apoptin, je možná.

Vzhledem k expresi anti-apoptotického Ad-5 El proteinu (White, 1996), indukuje apoptin apoptózu optimálně poté, co byl rekombinantní, apoptin exprimující adenovirus produkován ve velkých množstvích. Fakt, že může být adenovirový vektor, exprimující apoptin, produkován v lidských buňkách, transformovaných El proteinem adenoviru typu 5 (Ad 5), jako jsou buňky 293, 911 a PER.C6, neznačuje, že protein El umožňuje tomuto DNA viru množení do vysokých titrů v přítomnosti apoptózu-indukujícího proteinu apoptinu.

Tyto výsledky naznačují, že je také možné vytvořit jiné rekombinantní vektory DNA virů, exprimující apoptin v buněčných liniích, transformovaných proteinem El adenoviru 5. Například rekombinantní parvovirové vektory, založené na H-l nebo MVM parvovirech, mohou být množeny v buňkách 291T, které jsou transformované Ad5 El proteinem (Dinsart et al., 1996).

H-l a MVM parvoviry specificky indukují buněčnou smrt v transformovaných buňkách, ale ne ve všech (Lopez-Guerrero, 1997). Parvovirové vektory, exprimující apoptin, budou více účinné v indukování nádorově specifické apoptózy než parvoviry jako takové, vzhledem k další nádorově specifické indukci apoptózy apoptinem (Dinsart et al, 1996, Danen-V.an Oorschot, 1997). Protokol pro přípravu rekombinantních-apoptinový vektorů, založených na Ad5 El proteinem transformovaných buňkách, bude také platit pro RNA viry, jako jsou retroviry.

• ·

Indukce apoptózy v lidských transformovaných a/nebo maligních buněčných liniích.

Zkoušeli jsme, zda infekce lidských nádorových buněk rAd-VP3 bude mít za následek apoptinem indukovanou apoptózu. Za tímto účelem byly lidské hepatomové buňky HepG2, osteosarkomové buňky U20S, buňky SCC15 odvozené od karcinomu squamozních buněk a buňky z buněčné linie spontáně transformovaných keratinocytů HaCat infikovány rAd-VP3. Jeden den po transformaci byly tyto buňky fixovány a byly testovány pomocí imunofluorescence a barvení DAPI na syntézu apoptinu a to, zda u nich došlo k apoptóze. Již jeden po infekci byla většina analyzovaných apoptin-pozitivních buněk apoptotická. V neinfikovaných kulturách bylo apoptotických pouze několik procent lidských nádorových buněk. Výsledky u buněk HepG2 a U20S jsou ukázány na obrázku 4.

Tyto výsledky naznačují, že apoptin exprimovaný rAd-VP3 může indukovat apoptózu v různých savčích maligních a/nebo transformovaných buněčných liniích.

Exprese apoptinu v normálních buňkách, infikovaných rAD-VP3

Za účelem analyzování účinku apoptinu, exprimovaného rAd-VP3, v normálních netransformovaných buňkách, byly buňky FSK-1 infikovány rAd-VP3. Čtyři dny po transfekci byly tyto buňky analyzovány pomocí nepřímé imunofluorescence, za použité monoklonální protilátky 85.1 a barvení DAPI. Nejvíce 8 % z apoptinpozitivních buněk vykázalo abnormální DAPI-barvení, což naznačuje, že u nich možná došlo k (apoptinem)-indukované apoptóze. Avšak abnormální DAPIbarvení DNA vykázalo také 7 % buněk, které infikovány nebyly. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4.

Vzhledem k hepatotropní povaze lidského Ad5 je také důležité zjištění účinků apoptinu v normálních diploidních hepatocytech.

Za tímto účelem byly kultivovány izolované krysí hepatocyty na Williamsově E mediu (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA) doplněném o inzulín (2mU/ml) a dexamethason (1 nM). Buňky se nechaly růst na kolagenem obalených kultivačních deskách (Micronic).

Původní krysí hepatocyty byly infikovány adenovirovým vektorem Ad-VP3 exprimujícím apoptin, kontrolním adenovirem exprimujícím LacZ nebo byly infikovány falešně. Dva dny po poté byly tyto buňky fixovány a pomocí imunofluorescence a barvení DAPI bylo zjišťováno procento apoptotických buněk. Nebyl pozorován žádný rozdíl v procentu mrtvých buněk při expresi apoptinu, LacZ či u falešně infikovaných buněk. Tato pozorováni naznačují, že u (krysích) hepatocytů nedochází k apoptinem indukované apoptóze, i když je apoptin syntetizován pomocí adenovirového vektoru.

Tyto výsledky naznačují, že rAd-VP3 řízená exprese apoptinu nemá za následek apoptinem indukovanou apoptózu v normálních netransformovaných lidských buňkách, na rozdíl od transformovaných/tumorogenních lidských buněk.

Zvýšení syntézy apoptinu

Za účelem testování vlivu sekvencí přímo před ATG-iniciačním kodonem apoptinu jsme vytvořili dva pCR-3.1-apoptinové konstrukty. pCR-VP3ori obsahuje původní sekvenci (5-TTCAA-3) přímo upstream od ATG-iniciačního kodonu, zatímco druhý konstrukt, pCR-VP3mu obsahuje přímou upstream sekvenci 5-GCCAAC-3. Pomocí in vitro transkripčně/translačního pokusu na pšeničném zárodku bylo zjištěno, že exprese apoptinu u pCR-VP3mu byla alespoň 5 vyšší než u pCR-VP3ori. Tyto údaje naznačují, že povaha přímé upstream sekvence u ATG apoptinu ovlivňuje syntézu apoptinu. Vytvoření (virových) vektorů s přímou upstream sekvencí 5-GCCAAC-3 před ATG kodonem apoptinu bude mít následek vyšší produkci apoptinu a nepřímo zvýší apoptinem indukovanou apoptózu.

Je také důležité zmínit, že aminokyselinová sekvence apoptinu není změněna, což je podle Kozáková pravidla (Caventer a Suart, 1991) pro zvýšení translační účinnosti považováno za nutné. Podle tohoto pravidla bychom měli změnit nukleotid v pozici +4 z A na G, výsledkem čehož by byla jiná aminokyselina apoptinu, což by změnilo jeho aktivitu.

Identifikace esenciálních apoptinových fragmentů, obsahujících apoptinovou aktivitu.

Za účelem zjištění, zde je nějaká část apoptinového proteinu esenciální pro *· «··* ♦ * ·· • · · • · · · · · · · · • · » · · · » 999 999 • · 9 9 · · * · ·· ·· *·· *·· ·· ·* apoptotickou aktivitu, byl vytvořen plazmid, kódující chimerní proteiny, složené z Green-fluorescence proteinu (GFO, Rizzuto, 1995) a N-terminálních 71 aminokyselin apoptinu (N-apoptin) nebo jeho C-terminálních 50 aminokyselin (C-apoptin). Lidské transformované buňky, jako jsou buňky Saos-2 (Zhuang, 1995), byly přechodně transfekovány plazmidy, exprimujícími GPF/N-apoptin nebo GPF/C-apoptin. K apoptin-specifické apoptóze došlo pouze u Saos-2 buněk, exprimujících GFP/C-apoptin. Toto zjištění souhlasí s faktem, že C-apoptin (spojený s GFP) může vstoupit do jádra.

Tyto výsledky naznačují, že pro indukci apoptózy v (lidských) tumorogenních/transformovaných buňkách může být dostačující část apoptinu. Je tudíž možno také vyvinout účinnou (genovou) terapii, založenou na (virových) vektorech, exprimujících pouze tuto část apoptinu. Tyto údaje dále naznačují, že část apoptinu obsahuje apoptotickou aktivitu, když je kovalentně vázána na cizí protein.

Koexprese VP2 a apoptinu v lidských nádorových buňkách synergisticky zvyšuje indukci apoptózy.

Za účelem testování vlivu koexprese VP2 a apoptinu na indukci apoptózy byly buňky Saos-2 (ko)transfekovány pCMV-fs, exprimujícím apoptin a/nebo pCMVVP2, exprimujícím VP2. Tyto buňky byly fixovány acetonem v různých časových intervalech po transfekci. Pomocí nepřímé imunofluorescence byly monoklonální protilátkou CVI-CAV-111.1 (Noteborn a Koch, 1996) určeny VP2- pozitivní buňky a monoklonální protilátkou CVI-CAV-85.1. byly určeny apoptin-pozitivní buňky. Třetí den po transfekci došlo k apoptóze pouze u 3 % VP2-exprimujících buněk a pouze u asi 10 % apoptin exprimujících buněk. Naopak, apoptotických bylo již asi 40 % Saos-2 buněk, exprimujících VP2 i apoptin. Také čtvrtý den po transfekci bylo procento VP2/apoptin-pozitivních buněk, u kterých došlo k apoptóze, významně vyšší než u buněk, které exprimovaly samotný apoptin nebo VP2.

Tyto výsledky ukazují, že VP2 zvyšuje apoptinem-indukovanou apoptózu a jsou ukázány na obrázku 5.

Vytvoření a produkce rAd-VP2

• · · · • · · ·

Za účelem vytvoření rekombinantního adenoviru, exprimujícího virový protein 2 (VP2) viru kuřecí anemie, byl připraven adaptorový plazmid pMAb-VP2. Z plazmidu pCMV-VP2mu, obsahujícího všechny VP2 kódující sekvence, ale se dvěma mutacemi v úseku kódujícím apoptin (viz experimentální část), byl izolován BamHI fragment velikosti 1,1 kb a byl ligován do adaptorového vektoru pMab, linearizovaného BamHI a upraveného telecí střevní alkalickou fosfatázou. Výsledný konstrukt pMab-VP2 byl charakterizován restrikční a sekvenční analýzou a je ukázán na obrázku 6.

rAD-VP2 byl vytvořen kotransfekcí buněk 911 pMab-VP2 DNA a pJM17 DNA. Kotransfekce a všechny další požadované kroky, nutné pro charakterizaci, purifikaci a produkci rAD-VP2, byly provedeny tak, jak je popsáno pro rAd-VP3 a rAd-con. Pomocí nepřímé imunofluorescence, za použití monoklonální protilátky CVI-CAV-111.1 se ukázalo, že buňky 911 a PER.C6, infikované rAdVP2, vskutku mohou exprimovat VP2 protein.

Příprava retrovirového vektoru, exprimujícího apoptin

Z účelem vytvoření plazmidu pL-VP3-SN (viz obr. 7) byl BamHI fragment, nesoucí sekvence kódující apoptin, vložen do jedinečného místa BamHI pLXSN. Správná orientace inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Za účelem ověření neporušenosti inzertu byl plazmid pL-VP3-SN transfekován, pomocí techniky koprecipitace fosforečnanem vápenatým, do buněk COS-7 a HepG2. Čtyři dny po transfekci byly buňky fixovány a analyzovány monoklonální protilátkou 85.1 na expresi apoptinového proteinu. V přibližně 1-2 % buněk mohla být exprese apoptinu detekována. U většiny buněk došlo k apoptóze, jak bylo zjištěno barvením DAPI. Tyto údaje ukazují, že provirový LTR promotor je schopen řídit expresi apoptinu, že jeho gen je v DNA konstruktu intaktní a že v transfekovaných buňkách HepG2 a COS-7 exprese apoptinu indukuje apoptózu.

Za účelem vytvoření virů byl plazmid pL-VP3-SN transfekován do buněk Psi-2 a PA 317 pomocí techniky koprecipitace fosforečnanem vápenatým. Čtyřicet osm hodin po transfekci byl z buněk sklizen supernatant a roztoky byly použity k infekci buněk HepG2 (supernatant PA317) a buněk NIH3T3 (supernatant Psi-2) v přítomnosti 4 ug/ml polybrenu. Čtyři dny po transfekci byly buňky fixovány a analyzovány barvením monoklonální protilátkou 85.1 na expresi apoptinového proteinu. U přibližně 1 % buněk byla zjištěna exprese apoptinu. Většina buněk HepG2 pozitivních na apoptin byla apoptotická. Tyto údaje ukazují, že tyto buňky byly transdukovány L-apoptin-SN retrovirem. Tyto údaje dále dokazují, že jediná kopie proviru je dostatečná pro expresi dostatečných množství apoptinu pro detekci imunofluorescencí a že je toto množství dostatečné pro indukci apoptózy v lidských nádorových buněčných liniích, jmenovitě hepatomové buněčné linie HepG2.

Dohromady tyto výsledky dokazují, že mohou být vytvořeny retrovirové vektory, nesoucí apoptinový gen, a že mohou být použity pro indukci apoptózy v lidských nádorových buňkách. Toto formálně dokazuje, že ani apoptinový gen ani jeho exprese nebrání nezbytným krokům v životním cyklu retroviru. Také to dokazuje, že retrovirus obsahující apoptin může být produkován v množstvích, dostatečných pro použití při transdukci lidských nádorových buněk v tkáňových kulturách.

Tyto výsledky dále znamenají, že exprese apoptinu a následně apoptinemindukovaná apoptóza v (lidských) nádorových buňkách bude také možná za využití vektorových systémů, odvozených od (retro)virů, jako je plazmovirus (Noquiez-Hellin, 1996). Kritickým místem takovéhoto rekombinantního plazmoviru, exprimujícího apoptin, je to, zda není jeho replikace blokována expresí apoptinu. Poskytly jsme důkaz, že v případě výše popsaného rekombinantního-apoptinového retroviru, znamenajícím úspěšnou produkci rekombinantního-apoptinového plazmoviru, tomu tak vskutku není.

Diagnostické pokusy na rakovinných buňkách rAD-VP3

Buněčné umístění apoptinu je jiné v tumorogenních/transformovaných lidských buňkách ve srovnání s normálními netransformovaným buňkami. Dalším markérem je navíc specifická schopnost apoptinu indukovat apoptózu v tumorogenních/transformovaných buňkách a ne v normálních buňkách.

Pomocí infekce buněk rAd-VP3 a analyzování umístění apoptinu a/nebo indukce apoptózy v těchto buňkách je možno dokázat, zda je buňka maligní či ne. Původní buňky jsou izolovány z (podezřelých) tkání a jsou pěstovány na požadovaném mediu. Buňky jsou infikovány rAd-VP3, paralelně s rAd-con, a jsou následně analyzovány. Například za použití imunofluorescenčního pokusu, ······ · · ·· ··

založeného na monoklonálních protilátkách specifických pro apoptin, 85.1. U buněk bude prověřováno, zda mají apoptin v cytoplazmě (normální buňky) nebo v jádře (transformované buňky). Navíc nebo místo toho bude stanoveno procento apoptotických buněk. Je-li procento apoptotických buněk významně vyšší u buněk infikovaných rAd-VP3 než u buněk infikovaných rAd-con, jsou tyto buňky maligní.

Pokusy, zjišťující toxicitu rekombinantního-apoptinového adenoviru ve zdravých krysách.

V tkáňových kulturách neindukuje apoptin, exprimovaný rekombinantním adenovirem rAd-VP3 v normálních buňkách, např. lidského nebo hlodavčího původu, apoptózu. V pokusu, popsaném níže, jsme zjišťovali, zda exprese apoptinu pomoci rekomabinantního adenovirového vektoru rAd-VP3 ve zdravých krysách nemá za následek akutní toxicitu.

Použitý vektor rAd-VP3 a kontrolní rAd vektor se nechaly narůst na PER.C6 buňkách a pomocí PCR analýzy bylo prokázáno, že jsou negativní na přítomnost replikaceschopného adenoviru (RCA-free). rAd byly purifikovány pomocí centrifugace v gradientu CsCl.

Samcům Wag/Rij krys (Harlan, Nizozemsko), s tělesnou hmotností okolo 200 gramů, byl injikován rekombinantní adenovirus, exprimující apoptin (rAd-VP3, 2,5xl0⁹ plak tvořících jednotek, pfu) a kontrolní rekombinantní adenovirus, exprimující genový produkt luciferázu (rAd-luc, 2,5xl0⁹). Oba adenovirové vektory byly resuspendovány ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCl, obsahujícím 0,1% hovězí sérový albumin a 10% glycerol (PBS+). Tento roztok bez adenovirového vektoru byl také injikován krysám a slouží jako negativní kontrola. Dvěma krysám byl injikován intravenózně, intraperitonálně nebo subkutánně buď rAd-VP3, rAd-luc nebo PBS+suspenze.

Makroskopická patologická analýza krys, na které bylo působeno Ad-VP3.

Prvním způsobem, jak zjistit možný toxický účinek Ad-VP3-exprimovaného apoptinu, bylo posouzení celkového zdravotního stavu a obzvláště tělesné hmotnosti léčených krys, což bylo prováděno každý den po injekci. Všechny krysy byly během pokusu v dobrém zdravotním stavu. Tělesná hmotnost se v • · · ·· · · · · · · ··« · · ···· • · · · · · · ······ • · · · ·· · ·

..............

různých skupinách významně nelišila. Po jednom týdnu přibraly všechny testované krysy, včetně těch, kterým byl injikován rAd-VP3, na váze, což naznačuje, že žádné z těchto zvířat netrpělo akutní toxicitou, způsobenou léčbou rAd-VP3. Za účelem dalšího potvrzení absence akutní toxicity byla provedena následující měření. Dvě hodiny před utracením, byl všem krysám injikován BrdU. Po utracení bylo několik tkání (játra, ledvina, střeva, srdce, plíce, slezina, gonády a penis) přímo testováno patologicky a/nebo shromážděno pro další histopatologickou analýzu (viz níže).

Makroskopická analýza ukázala, že žádná z krys, léčená Ad-VP3, neměla orgány s významnými patologickými projevy.

Testování Ad-VP3 DNA v játrech.

Hlavním cílem vnitrožilně injikovaného (rekombinantního) adenoviru (vektoru) jsou játra a jistém rozsahu i slezina. Jakékoliv toxické projevy apoptinu budou tudíž pozorovány v játrech.

Byla provedena sada pokusů na testování přítomnosti Ad-VP3 DNA, exprese apoptinu Ad-VP3 a možných cytopatologických projevů v játrech. Nejdříve jsme pomocí Southern blot analýzy zjišťovaly, zda v den utracení, což znamená 8 dní po injekci, obsahovala DNA, izolovaná z jater krys, léčených Ad-VP3, apoptinovou DNA. Jako negativní kontrola byla souběžně testována DNA z jater krys, kterým byl injikován Ad-luc. Před nanesením DNA na agarózový gel, byla

DNA štěpena BamHI, výsledkem čehož byl fragment apoptinové DNA velikosti okolo 0,5 kb. Southern blot byl hybridizován se sondou apoptinové DNA, 32 značenou P.

BamHI fragment apoptinové DNA byl na Southern blotu jasně viditelný v případě DNA, získané z krys, na které bylo působeno Ad-VP3, a jak bylo očekáváno, byl nepřítomen v dráhách obsahujících DNA, izolovanou z krys, na které bylo působeno kontrolním rAd-luc. Za účelem stanovení množství kopií Ad-VP3 v játrech byla na Southern blot souběžně nanesena a hybridizována se značenou sondou apoptinové DNA různá množství apoptinové DNA. Ještě osm dní po vnitrožilní infekci mohlo být zjištěno 0,25 Ad-VP3 kopií na buňku, což naznačuje velmi významnou transdukci Ad-VP3 v játrech.

• ·

Exprese apoptinu a jeho toxické projevy v jaterních buňkách

Pomocí imunobarvení parafinovaných části jater, na které bylo působeno Ad-VP3 nebo kontrolních jater, za použití apoptin-specifických monoklonálních protilátek CVI-CAV-85.1 nebo CVI-CAV-111.3, jsme ukázali, že asi 20-30 % jaterních buněk, z živočichů, na které bylo působeno Ad-VP3, exprimovalo apoptin. Části jater kontrolních krys byly na apoptin negativní.

Za účelem testování možných cytotoxických vlivů apoptinu, exprimovaného Ad-VP3, na jaterní buňky, byly provedeny dvě různé metody. Nejdříve byly části jater krys, na které bylo působeno Ad-VP3, a obou typů kontrolních krys barveny haematoxilin-eosinem (HE). U všech testovaných částí jater nebyly pozorovány žádné morfologické patologické změny, což naznačuje, že exprese apoptinu není pro jaterní buňky toxická. Škodlivé účinky mohou být sledovány pomocí značení BrdU, které detekuje nově rozdělené jaterní buňky. V případě jater, obsahujících Ad-VP3, bylo množství BrdU-značených jaterních buněk podobného rozsahu (asi 2 %) jako u kontrolních krysích jater, na které bylo působeno Ad-luc. Exprese apoptinu jako taková tudíž nemá in vivo žádné významné toxické účinky.

Apoptin nemá žádné akutní toxické účinky v in vivo modelu.

Makroskopická, stejně jako histologická analýza v kombinaci s biochemickými a imunologickými údaji ukázala, že exprese apoptinu nemá žádné (akutní) toxické účinky v in vivo modelu.

Tyto výsledky naznačují, že léčba, založená na expresi apoptinu, za využití genového nosiče nebo jiných metod, nebude mít žádně negativní vedlejší účinky.

Protinádorové studie na modelu lidského hepatomu

Ad-VP3 řízená exprese apoptinu má za následek indukci apoptózy v lidských transformovaných buňkách za podmínek tkáňové kultury. Například, výsledkem Ad-VP3 řízené exprese apoptinu je apoptóza v buňkách HepG2, odvozených od lidského hepatomu. In vivo protinádorová aktivita apoptinu (např. exprimovaného Ad-VP3) nebyla doposud testována.

Proto jsme zjišťovali, zda bude mít Ad-VP3 řízená exprese apoptinu za následek protinádorovou aktivitu v in vivo modelu. Za tímto účelem bylo samcům Balb/C/nu/nu myší podkožně ze strany injikováno lxlO⁶ lidských buněk HepG2.

• ·

• · · · •·· 99 9 ·

• « · ·

Lidské hepatomové buňky byly injikovány každé myši alespoň na dvou nebo třech místech. Tři týdny po injekci se vyvinuly jasné hepatomové nádory. Byly podkožně zřetelné a měly průměrnou velikost alespoň 5x5 mm.

Do nádorů byly injikovány vektor rAd-VP3 a kontrolní vektor rAd-conl, rozpuštěné ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCl, 5% sacharose a 0,1% hovězím sérovém albuminu. Použitý vektor rAd-VP3, exprimující apoptin, a kontrolní vektor rAd-conl, obsahující apoptinový gen v 3'-5' (obrácené nebo anti-sense) orientaci proti Ad MLP promotoru, se nechaly narůst na PER.C6 buňkách. Pomocí PCR analýzy bylo prokázáno, že jsou oba kmeny rekombinantních adenovirů RCA-free. rAd byly purifikovány za použití centrifugace v gradientu CsCl. Do každého nádoru bylo injikováno 7xl0⁹ pfu rAd partikul! ve 40 mikrolitrech suspenze. Oběma typy rAd vektorů bylo léčeno 6 myší se 2 nebo 3 HepG2 nádory. Jako další kontrola byl skupině 4 nahých myší do nádorů injikován fosfátem pufrovaný roztok NaCl, obsahující 5% sacharosu a 0,1% hovězí sérový albumin (PBS+ skupina).

Apoptin má protinádorový účinek v in vivo modelu.

Za účelem testování možného protinádorového účinku apoptinu, exprimovaného Ad-VP3, v lidských HepG2 nádorech, byla během pokusu, který pokračoval 7 dní po injekci rAd-VP3 nebo kontrolní suspenze, měřena velikost podkožních nádorů. PBS+ skupina a skupina, na kterou bylo působeno kontrolním rAd-conl, vykázala průměrné postupné zvětšování velikosti nádorů, narozdíl od skupiny, na kterou bylo působeno rAd-VP3, která vykázala menší velikost nádorů. Sedm dní po injekci byly nahé myši utraceny. Nádory byly izolovány a makroskopicky zkoumány. Je jasné, že hepatomové nádory, na které bylo působeno kontrolním vektorem rAd-conl nebo PBS+, byly silně vaskularizovánou HepG2-nádorovou tkání a že se po injekci se zvětšily. Úplně jiná situace byla u HepG2 nádorů, léčených rAd-VP3. Zbytková nádorová hmota se objevovala zřídka, vzhledem k snížené vaskularizaci nádorů. Nádory se po léčení rAd-VP3 zmenšily. Nádory také obsahovaly bílé bublinovité struktury, které jsou náznakem mrtvých buněk. Kromě apoptinem indukované regrese nádorů nebyly pozorovány žádné negativní projevy exprese apoptinu v orgánech (obzvláště byly zkoumány játra a slezina).

• φ φ · • · φ φ φφφ φφφ • φ φ φ · φ

Apoptin má protinádorovou aktivitu v in vivo systémech.

Závěrem, nádory, na které bylo působeno rAd-VP3, vykázaly menší velikost, zatímco kontrolní nádory ne. To znamená, že exprese apoptinu má protinádorovou aktivitu v in vivo modelu. Fakt, že apoptin, exprimovaný AdVP3, může indukovat regresi nádorů u rychle rostoucích nádorů, jako jsou HepG2, dokazuje silný protinádorový potenciál apoptinu. Fakt, že apoptin zmenšuje nádorový růst u nahých myší, ukazuje, že nádorové buňky zabijí exprese apoptinu sama bez dalších imunitních reakcí. Popsané toxicitní a protinádorové studie dokazují, že protinádorové léčba, založená na expresi apoptinu, je bezpečná a proveditelná.

ODKAZY • · · 4 · · 4 4 44 «· · «4 4« 4444

444 4 4 4444 • · 44 4 4 4 444444 • * 4 · 44 4*

44 444 44* 4 4 44

1. Aden, D.P., Fogel, A., Plotkin, S., Damjanov, I._z and Knowles, B.B. (1979). Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line.

Nátuře 282, 615-616.

2. Arends, M.J., and Wyllie, A.H. 1991..Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. International review of experimental pathology 32, 223-254.

3. Bellamy, C.O.C., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie, A.H. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12.

4. Boukamp, P., Petrussevska, R.T., Breitkreutz, Hornung, J., Markham, A., and Fusenig, R. 1988. Normál keratina2ation in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology 106, 761-771.

5. Cavener, D.R. and Stuart, C.R. (1991). Eukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Research 19, 3185-3192.

6. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Fischer D., Grimbergen J.M., Klein B., Zhuang S.-M., Falkenburg J.H.F., Backendorf C., Quax P.H.A., Van der Eb A.J., and Noteborn M.H.M. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normál cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: In press.

7. Diller, L. et al., (1990). p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas. Molecular Cellular Biology 10, 5772-5781.

8. Dinsart, C., Cornelis, J., Ronunelaere, J. (1996). Recombinant autonomous parvoviruses: New tools for the gene therapy of cancer? Chimica Oggi/chemistry today. September 1996, 32-38.

9. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current opinion in Cell Biology 7, 337-343.

10. Fallaux, F. (1996). Gene therapy for hemophilia A;

Towards the use of adenoviral vectors? PhD Thesis, Leiden University, The Netherlands.

11. Fallaux F., Kranenburg, Cramer S.J., Houweling, A., Van Ormondt, H., Hoeben, R.C., and Van der Eb, A.J. (1996) Human Gene Therapy 7, 215-222.

12. Fischer, D.F., Gibbs, S., Van De Putte, P., and

Backendorf, C. (1996). Molecular Cellular Biology 16, 5365-5374.

13. Graham, F.L. and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Volume 7: Gene Transfer and Expression Protols. E.J. Murray, ed.

(The Humana Press, Clifton, N.J.) pp 109-128.

14. Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

15. Hockenberry, D.M. (1994) . Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55.

16. Hooper, M.L. (1994). The role of the p53 and Rb-1 gene in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 13-17.

17. Horwitz, M.S. (1990). Adenoviridae and their replication. pp 1679-1740. In B.N. Fields and D.M. Knipe (Eds): Virology, Baven Press, Ltd, New York.

18. Kerr, J.F.R., Wintetford, C.M., and Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026.

19. Levrero, M., Barban, V., Manteca, S., Ballay, A., Balsano, C., Avantaggiati, M.L., Natolí, G., Skellekens, H., Tiollais, P.f and Perricaudet, M. (1991). Defective and non-defective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.

20. Lopez-Guerro, J.A., Rayet, B., Tuynder, M., Rommelaere, J., and Dinsart, C. (1997). Constitutive activation of U937 promonocytic cell dones selected for their resistance to parvovirus H-l infection. Blood 89, 1642-1653.

·· ··»· · » *· ·* ·· · ·. ·· ·*·* • · · · · · · . · • · · · · · · ··· ··· ··»· .· ·.

·· ·· ........ ··

21. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning; A Laboratory Manual. CSHL Press, New York,

USA.

22. Mann, R., Mulligan, R.C., and Baltimore, D. (1983). Cell 33, 153-159.

23. McGrory, W.J., Bautista, D.S., and Graham, F.L. (1988).

A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163,

614-617.

24. Miller, A.D. (1990a). Progress towards human gene therapy. Blood 76, 271-278.

25. Miller, A.D. (1990b). Retrovirus packaging cells. Human Gene Therapy, 1, 5-14.

26. Noguier-Hellin, P., Robert-LeMeur, M., Salzmann, J.L., and Klatzmann, D. (1996). Plasmoviruses: nonviral/viral vectors for gene therapy. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 4175-4180.

27. Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191 Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normál cells as essential characteristic for the development of a anti-tumor therapy.

28. Noteborn, M.H.M. and De Boer, G.F. (1995). Patent

USA/no. 030, 335.

Noteborn, M.H.M. and Koch, G, (1996). PCT application WO

96/40931 Chicken anemia virus vaccines containing neutralizing conformational epitope.

29. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Kant, A., Koch, G.,

Bos, J.L., Zantema, A., and Van der Eb, A.J. (1990).

Expression of avian leukemia virus env-gp85 in Spodoptera frugiperda cells by use of a baculovirus expression vector. Journal of generál Virology 71, 2641-2648.

30. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D.,

Karreman, C., Kranenburg, O., Vos, J., Jeurissen, S.,

Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991) . Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the • · ··· · ·· • · · · ··· · · · ·· ··

Virology 65,

Chicken anaemia infectious replication cycle. Journal of 3131-3139.

31. Noteborn M.H.M. and Koch G. (1995).

virus infection: molecular basis of pathogenicity. Avian Pathology 24: 11-31,

32. Noteborn M.H.M,, Koch G., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M., Veldkamp S., Van der Eb A.J. (1994). A single anaemia virus protein, apoptin, causes cytopathogenic effect by inducing apoptosis. In: Proceedings of the International symposium on infectious buršal disease and ehicken infectious anaemia (Kaleta EF, ed) pp 376-381, Rauischholzhausen,

Germany.

33. Noteborn M.H.M., Todd D., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M., Curran W.L., Veldkamp S., Douglas A.J., McNulty M.S., Van der Eb A.J., Koch G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J. Virology 68: 346-351.

34. Rheinwald, J. and Beckett, M.A. (1980). Defective terminál differentiation in cultures as a consistent and selectable character of malignant human keratinocytes. Cell 22, 629-632.

35. Rheinwald, J.G., and Green, H. (1975). Seriál cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6, 331-343.

36. Rizzuto, R. (1995). Chimeric green fluorescent protein as a tool for visuálizing subcellular organels in living cells. Curr, Biol. 5, 635-642.

37. Sachs, L. and Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normál and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21.

38. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449.

39. Stratford-Perricaudet, L, and Perricaudet, M. (1991). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus, pp 51-61, In: 0. Cohen-Adenauer and M. Boiron (eds): Human Gene Transfer, John Libbey Eurotext.

*9 9*99

•

9

9 • 9 · 9 9 • 9 · 9 9 9

9 9 9 9 • · ··· 999

9 9 «99 9 · 99

40. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesís and treatment of disease. Science' 267, 1456-1462.

41. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10, 1-15.

42. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apoptosis. Current opinion in Genetics and Development 5,

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Genový nosič, obsahující molekulu nukleové kyseliny, kódující apoptinu podobnou aktivitu.
2. Genový nosič podle nároku 1, dále obsahující modifikované místo iniciace translace přímo upstream od ATG-iniciačního kodonu zmíněné molekuly nukleové kyseliny.
3. Genový nosič podle nároku 2, kde zmíněné místo iniciace translace obsahuje sekvenci nukleové kyseliny GCCAAC.
4. Genový nosič, obsahující molekulu nukleové kyseliny, kódující VP2 podobnou aktivitu.
5. Genový nosič podle nároku 4, dále obsahující modifikované místo iniciace translace přímo upstream od ATG-iniciačního kodonu zmíněné molekuly nukleové kyseliny.
6. Genový nosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, dále obsahující molekulu nukleové kyseliny, kódující VP2 podobnou aktivitu.
7. Genový nosič podle nároku 6, dále obsahující modifikované místo iniciace translace přímo upstream od ATG-iniciačního kodonu molekuly nukleové kyseliny, kódující VP2 podobnou aktivitu.
8. Genový nosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kterým je virus.
9. Genový nosič podle nároku 8, kterým je virus, defektní ve schopnosti replikace.
10. Genový nosič podle nároku 8 nebo 9, kterým je adenovirus.

• ·
11. Genový nosič podle nároku 8 nebo 9, kterým je retrovirus.
12. Genový nosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, který dále obsahuje alespoň jednu směrovací molekulu.
13. Genový nosič podle nároku 12, kde je tato směrovací molekula reaktivní s povrchovým receptorem nádorové buňky.
14. Hostitelská buňka, obsahující genový nosič podle kteréhokoliv z nároku 1 až 13.
15. Hostitelská buňka podle nároku 14, kterou je pomocná nebo pakážovací buňka.
16. Hostitelská buňka podle nároku 14, která je vybrána ze skupiny, obsahující buňky HEK;293, HER;911; PER.C6, Psi-2 a PA317.
17. Použití genového nosiče podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 při léčení rakoviny.
18. Použití genového nosiče podle nároku 17 v kombinaci s běžnou (chemo)terapií.
19. Použití genového nosiče podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 při léčení hyperplázie, metaplázie a dysplázie.
20. Použití genového nosiče podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 při diagnóze.
21. Použití genového nosiče podle nároku 20 při in vitro detekci transformovaných, nádorových, hyperplastických, metaplastických nebo dysplastických buněk.