KR20010006460A

KR20010006460A - 세포자멸사 유도 단백질 브이피2 및/또는 아폽틴을 발현시키는 유전자 전달 운반자

Info

Publication number: KR20010006460A
Application number: KR1019997009550A
Authority: KR
Inventors: 마테우스 휴버투스 마리아 노테본; 알렉산드라 마리아 페터슨
Original assignee: 리드 비.브이.
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2001-01-26
Also published as: NZ500012A; KR100528755B1; CA2286165C; JP2001521387A; EP0975764A1; PL196607B1; PL336312A1; CZ299963B6; ES2227822T3; NO994967L; EP0878546A1; AU6856398A; ATE275200T1; CA2286165A1; BR9808542A; DK0975764T3; AU750162B2; SK285724B6; WO1998046760A1; SK142899A3

Abstract

본 발명은 세포자멸사를 유발하는 단백질 VP2 및/또는 아폽틴(VP3)와 같은 활성을 암호화하는 핵산 분자로 이루어진 유전자 전달 운반자에 관한 것이다. VP2와 VP3는 닭 빈혈 바이러스의 바이러스성 단백질 이다. 또한, 본 발명은 항종양 요법에 관한 것이다. 다양한 인간 종양 세포를 본 발명의 유전자 전달 운반자로 감염함으로써, 종양 세포에 세포자멸사가 유발되며, (만일 가능하면) 정상적인 이배성, 비형질전환 세포/비악성 세포에서 세포자멸사가 많이 줄어들 것이다. 또한, 본 발명은 암과 관련된 형태의 과형성, 화생 및 이형성의 진단에 관한 것이다.

Description

세포자멸사 유도 단백질 브이피2 및/또는 아폽틴을 발현시키는 유전자 전달 운반자{A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin}

시험관내 시험에서, 닭형질전환 세포에서 닭빈혈 바이러스(CAV)에서 유도된 단백질 아폽틴(VP3)의 발현은 세포자멸사를 유도하였다(Noteborn et al. 1994, Noteborn and Koch, 1995). 세포자멸사는 대개의 세포들 중에서 세포의 수축, 핵의 분열, DNA의 축합 및 DNA의 도메인 크기의 단편으로의 분할, 다음에 핵간 뉴클레오솜의 분해(internucleosomal degradation)에 의해서 특정지어진다. 최종적으로, 세포자멸사 세포들은 막피에 둘러싸인 세포자멸사체로 쪼개지며, 상기 세포자멸사체들은 근접해 있는 세포들에 의해서 급속히 식작용된다. 그러므로, 세포자멸사는 괴사, 즉 비생리학적 유형의 세포사 보다도 조직을 훨씬 적게 파괴시킨다(Wyllie et al., 1980, Arends and Wyllie, 1991 and White, 1996).

아폽틴은 작은 단백질이고, 다소 알카리성이며, 프롤린, 세린과 트레오닌이 풍부한 121 개의 아미노산들로 구성되어 있다(Noteborn et al. 1991). 아폽틴에 의해 유도된 세포자멸사를 격게되는 형질전환된 닭세포들을 분석해 보면, 아폽틴은 엄격하게 세포핵내에서만 위치되어 있다. 아폽틴의 C-말단 염기성 신장부분의 절단은 핵위치를 감소시키고, 세포자멸사 활성을 상당히 감소시킨다(Noteborn et al., 1994).

아폽틴과, 아폽틴과 같은 활성을 갖는 다른 단백질들도 악성 인간 세포계와 형질전환된 인간 세포계에서 세포자멸사를 유도시키지만, 형질전환되지않은 인간 세포계에서는 세포자멸사가 유도되지 않는다. 아폽틴 유도 세포자멸사는 기능 p53 (Zhuang et al., 1995a) 부재하에 일어나며, Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang et al., 1995), Bcl-2 와 관련된 단백질 BAG-1 및 우두단백질 CrmA (Noteborn, 1996)에 의해서 차단될 수 없다. 시험관내 시험에서, 아폽틴은 프로그램된 세포사를 정상적인 임파, 진피, 표피, 내피와 평활근 세포들에게 유도하지 못한다. 그러나, 정상적인 세포들이 형질전환되면, 아폽틴 또는 아폽틴과 같은 활성을 갖는 다른 단백질에 의해 세포자멸사되기 쉬워진다. 정상적인 인간 섬유아세포에서 아폽틴의 장기 발현은 아폽틴에 독성이나 형질전환 활성이 없음을 나타냈다. 정상적인 세포들에서, 아폽틴은 주로 세포질 중에서 발견되었으며, 반면 과형성(hyperplasia), 화생 (metaplaisa) 또는 이형성(dysplasia)에 의해 특징지어지는 형질전환세포 또는 악성세포에서는 아폽틴이 핵안에 위치하였음을 알 수 있다. 이러한 발견은 아폽틴의 배치가 그것의 활성과 연관되어 있다고 볼수있다 (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn, 1996).

세포자멸사는 불필요하거나 변질된 세포나 악성세포들을 제거하는 활동성있는 프로그램된 생리적인 과정이다(Earnshaw, 1995). 세포자멸과정은 다향한 조절 자극에 의해 개시된다(Wyllie, 1995 and White, 1996). 세포수명율의 변화는 인간 병원론(예를 들면, 암발생)에 있어서 중요한 역활을 한다. 암발생은 증진된 세포증식과 감소된 세포사에 의해 일어난다(Kerr et al., 1994). 여러 경우에는 야생형p53을 이용하여, 다양한 화학요법 화합물과 방사선이 세포자멸사를 종양세포에 유발시킴을 나타냈다(Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995).

그러나, 많은 종양은 발달과정에 p53에 돌여변이를 얻게 된다. 이 돌이변이는 가끔 암치료에 약한 반응을 보인다(Hooper, 1994). 몇몇의 (백혈병) 종양에 있어서, 프로토-엉코진 Bcl-2 의 고도의 발현이 다양한 세포자멸사를 유발시키는 화학요법제에 대한 강한 저항력과 관련되어 있다(Hockenberry, 1994, Kerr et al., 1994, and Sachs and Lotem, 1993).

그러므로, 아폽틴이 종양세포나 과형성, 화생 또는 이형성이 특징인 다른 세포들을 파괴시킬 수 있는 강력한 후보자가 될수 있다. 기능 p53의 결여와 Bcl-2 및 기타 세포자멸사 억제제의 (과잉) 발현 때문에, 과형성, 화생 또는 이형성이 특징인 다른 세포들은 세포자멸사의 화학요법적인 유발에 저항력을 가지게 된다. 아폽틴이 시험관내 시험에서도, 정상적인, 형질전환되지 않은 인간 세포에 있어서 세포자멸사를 조금도 유발시키지 않는다는 사실은, 생체내 시험에 있어서 아폽틴 치료의 독성효과가 매우 낮아질 수 있다는 것을 암시해 준다.

그러나, 지금까지 종양세포에서 아폽틴의 발현은 조직배양세포의 일시적인 형질감염에 의하여 이루어졌다. 이 발현방법의 단점은 시험관내 시험 상황하에서, 아폽틴을 발현할수 있는 세포들의 백분율이 매우 낮은 것이다. 생체내 시험에서, 사용한 형질감염 방법은 번거롭고, 비효율적이며, 유효한 암치료에 공헌하지 않는다.

아데노바이러스는 외피에 싸이지 않은, 정20면체 DNA 바이러스들인 인간 아데노바이러스(Ads)에서 유래되었다. 이 게놈은 반전말단반복부를 갖는, 약 36kb의 선형, 이중가닥DNA 분자로 구성되었다(Horvitz, 1990). 벡터 발육에 사용되는 혈청형(AD₂및 AD₅)은 위중한 인간 병리학과 연관이 없다(Horvitz, 1990). 이 바이러스는 그의 DNA를 숙주 세포에 삽입하는데에 매우 효율적이다. Ads는 광범위한 종의 다양한 분할 또는 비분할 세포들을 감염시킬 수 있으며, 비교적 쉽게 다량으로 생산 될 수 있다. 레트로바이러스와는 다르게, Ads는 숙주 세포 게놈에 통합하지 않는다. 현재 사용되는 rAdVs는 신규 DNA를 삽입 할 수 있는 E1 영역에 결실을 갖는다. E1 영역에 결실은 재조합 바이러스 복제를 결손하게 한다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). 한편으로, 이 결실은 필수적인 안전 특징을 제공한다. rAdV는 E1A 단백질 부재하에서 인간 세포들에 복제 할 수 없다. 그러므로, rAdV가 그의 유전 정보를 인간 세포에 전달할 수 있으나, 이것은 용균감염이나 생성감염 을 가져오지 않는다. 이와 반대로, 이것은 벡터 생산에 문제를 일으킨다. 그러나, E1 기능은 반드시 벡터 자체에 의하여 코드될 필요가 없으며, 그 기능은 E1 유전자를 발현하는 특별한 헬퍼 세포들 같은 trans 세포안에서 제공될 수 있다. 이들은 헬퍼 세포를 E1이 삭제된 Ad벡터로 감염 또는 형질감염시킨 후에, 세포 E1 단백질은 2세대 rAdVs를 생성하는 rAdV 복제를 보충한다. Ad 헬퍼 세포들은 반드시 인체에서 기원되어야 하고, AdE1 부위를 내포하고 발현하여야 한다. 이 세포들은 세포계 293(Graham and Prevec, 1991), 911세포계 (Fallaux et al., 1996) 와 PER. C6 세포계와 같은 Ad 형질전환된 인간 세포들이다.

본 발명은 세포자멸사 유도 VP2 단백질 및/또는 아폽틴(VP3)과 같은 활성을 암호화(코드)하는 핵산 분자들로 구성되어 있는 유전자 전달 운반자에 관한것이다. 또한, 본 발명은 항종양 치료법과 암 진단에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 전달 운반자를 각종 인간 종양세포들에 감염시키면, 종양세포에 있어서 세포자멸사를 유도하게 되고, 정상적인 이배체, 비형질전환/비악성 세포에 있어서 세포자멸사를 상당히 감소시킬 것이다.

도 1은 아데노바이러스 아답터 벡터 pMad5 및 pMab의 주요 부분들의 도해도이다.

도 2는 재조합 아데노바이러스 아답터 벡터 pMab-VP3 및 pMab-con의 주요 부분들의 도해도이다.

도 3은 pMab-VP3 또는 pCMV-VP3로 형질감염된 911 세포중에서 아폽틴에 의해 유발된 세포자멸사 활성을 나타낸 것이다. 2개의 독립적으로 클로닝되고, 정제된 pMab-VP3 DNA 배취 (pMab-VP3-m1 및 pMab-VP3-m2)는 911 세포의 형질감염에 사용되었다. 상기 세포를 형질감염시킨 후, 3일동안 고정시키고, 아폽틴 특이성 모노클로날 항체 CVI-CAV-85.1 (85,1; Noteborn et al., 1991)를 사용하여 간접 면역형광방법으로 분석했다. 비정상적으로 DAPI로 착색된 세포들의 백분율을 세포자멸사의 상대적인 크기로 제시했다.

도 4는 재조합-아폽틴 복제 결손 아데노바이러스 Ad-VP3로 감염된 인간 종양발생 간암 HepG2 세포, 골육종 U2OS 세포와 정상적이고, 형질전환되지 않은 이배성 FSK-1 케라틴세포의 아폽틴(VP3로 칭함)을 유발하는 활성을 나타낸 것이다. 모노클로날 항체 85.1을 사용하고, DAPI에 의해서 착색한 간접 면역형광방법으로 세포들을 분석했다.

도 5는, 아폽틴을 발현시키는 2.5㎍ pCMV-fs DNA(이전에는 pCMV-VP3로 칭했음; 아폽틴은 VP3로 명명함) 및 2.5㎍ pCMV-neoBam DNA(Danen-Van Oorschot, 1997)로, 또는 CAV 단백질 2(VP2)를 발현시키는 2.5㎍ pCMV-VP2 DNA, 및 2.5㎍의 pCMV-neoBam DNA로, 또는 아폽틴(VP3) 및 VP2 모두의 발현에서 생성되는 2.5㎍ pCMV-fs 및 2.5㎍ pCMV-VP2로 형질감염시킨 Saos-2 세포에서 아폽틴- 및/또는 VP2-유도 세포자멸사 활성을 나타낸 것이다. 세포들을 3일, 4일, 5일 동안 고정시키고, 아폽틴-특히 모로클로날 항체 CVI-CAV-85.1(85.1; Noteborn et al., 1991) 또는 모노클로날 항체 CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch, 1996)을 사용하는 간접 면역형광법으로 분석했다. DAPI로 비정상적으로 착색된 세포의 백분율을 세포자멸사의 상대적인 크기로 제시했다.

도 6은 재조합 아데노바이러스 아답터 벡터 pMab-VP2의 주요 부분들의 도해도이다.

도 7은 재조합 레트로바이러스 트랜스퍼벡터 pLS-VP3-N의 주요 부분들의 도해도이다.

본 발명은 유전자 요법으로 암치료나 과형성, 화생 또는 이형성의 특징을 지닌 악성종양 치료를 위하여 항종양제 아폽틴 또는 아폽틴과 같은 활성을 갖는 다른 단백질의 특징을 활용할 수 있는 유전자전달 운반자를 제공한다. 독립적으로 감염벡터인 이 유전자 전달 운반자는, 예를 들면 바이러스, 리포솜, 중합체 등이 될 수 있으며, 이것은 그 자체를 감염시키거나, 아니면 다른방법으로 유전정보를 치료가 가능한 종양세포들에게 전달할 수 있다. 이 유전정보는 아폽틴과 같은 활성을 코드하는 핵산 분자로 구성되었다. 또한, 본 발명은 아폽틴과 같은 활성을 발현하는 그 능력을 크게 증가 시키는 유전자 전달 운반자를 제공한다. 본 발명자들은, 놀라웁게도 아폽틴과 같은 단백질 코딩 서열을 선행하는 번역개시 부위에 위치한 상부 비코딩 핵산서열에 변화를 주면 종양세포중에서 상기 단백질 발현을 크게 향상시킴을 발견했다. 본 발명은 또한 VP2와 같은 활성을 암호화하는 핵산으로 구성되는 유전자 전달 운반자를 제공한다. VP2와 같은 활성은 놀라웁게도 종양세포의 세포자멸사 유발에 관해서 아폽틴과 같은 활성과 공동적으로 작용을 하는 것으로 나타났다. VP2와 같은 단백질 그 차체도 역시(화학) 치료법으로 세포자멸사를 유발시키는데 공동적으로, 부가적으로 작용을 할 수 있다. 본 발명은, 또한, 아폽틴과 같은 활성을 암호화하는 핵산분자로 구성된 것에 VP2와 같은 활성을 부차적으로 암호화하는 핵산으로 이루어진 유전자 전달 운반자를 공급한다. 본 발명에 의하여, 예를 들면, 본 발명에 따른 유전자 전달 운반자, 즉 바이러스가 제공된다. 부차적으로, 본 발명은 유전자 전달 운반자 (자체)가 복제 결손인 바이러스이지만, 2세대 유전자 전달 운반자를 생성하기 위하여 헬퍼 또는 포장 세포들에서 복제를 할수 있는 바이러스이다. 그러므로, 본 발명에 의하여 제공되는 유전자 전달 운반자는, 예를 들면 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 기타 DNA 또는 RNA 재조합 바이러스일 수 있고, 이들은 전달 운반자 또는 플라스모바이러스로 사용될 수 있다. 부차적으로, 본 발명은 특정한 리간드, 표적분자 또는 표적분자들과 추가로 보층된 유전자 전달 운반자를 제공하며, 이것에 의해 유전자 전달 운반자는 선택된 표적세포에 그의 유전정보를 특이적으로 전달한다. 이러한 표적 분자는, 예를 들면, 종양세포의 표면 수용체 또는 단백질과 반응성있는 바이러스성 스파이크 단백질, 수용체 분자 또는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 암 진단에 사용될 수 있는 유전자 전달 운반자도 제공한다. 이 유전자 전달 운반자는 시험관내 진단에 사용될 수 있으며, 여기서 조직, 세포 샘플 또는 생검(biopsies)은 인간 또는 동물에서 취한다. 이어서, 이와 같은 샘플을 아폽틴과 같은 활성을 발현시킬 수 있는 상기 유전자 전달 운반자로 배양 또는 직접 감염시켜서 평가하거나 시험할 수 있다. 형질전환된 세포, 다양한 단계의 과형성, 화생 또는 이형성의 특징을 나타내는 세포 또는 종양이나 종양 세포들만이 핵 내부에서 아폽틴과 같은 활성을 갖는 단백질을 발현한다.

상기 단백질의 존재는 현미경 검사나 자동화된 세포분류 기법과 같은 고전적 (면역) 조직화학 기술로 확인될 수 있다. 다른 방법으로, 상기 감염된 세포는 세포자멸사에 의해 특징지어지므로 알려진 세포자멸사의 특징을 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포자멸사를 유발하는 아폽틴을 발현하는 재조합, 복제 결손 아데노바이러스를 구성하기 위한 모든 과정들을 제공하거나 설명한다. 재조합- 아폽틴 아데노바이러스의 높은 역가는 293,911 및 PER.C6 와 같은 아데노바이러스 포장 세포계에 의해서 생성될 수 있다. 아폽틴은 아데노바이러스의 모든 복제 단계와 세포배양 상태에 있는 다른 아데노바이러스의 라이프 사이클 이밴트들에 대해서 부정적 효과를 나타내지 않았다.

그 외에, 본 발명은 재조합 아폽틴 아데노바이러스로서 모든 서열을 갖추었지만, 조정프로모터 엘리먼트의 조절하에 아폽틴 암호화 서열의 3'-5' 배향때문에 아폽틴을 발현할수 없는 대조 재조합 아데노바이러스의 구성을 설명한다. 이 대조 아데노바이러스 벡터에 의하여, 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴 발현의 특이 효과를 시험할 수 있다.

재조합 복제 결손 아데노바이러스는 세포자멸사의 유발에서 생기는 각종 종양 및/또는 형질전환된 세포에서 많은 양의 아폽틴을 발현시킨다. 이와 반대로, 정상적인 비형질전환 인간 세포들에서 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴의 발현은 아폽틴-유도 세포자멸사를 유발시키지 않는다.

특히, 본 발명은 항종양 치료법에 관한 것이다. 종양세포의 치료는 아폽틴과 같은 활성을 갖는 단백질의 코드 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터와 같은 유전자 전달 운반자로 (종양)세포를 감염시켜서 아폽틴을 발현시켜 행한다. 그러므로, 본 발명은 매우 가능성이 있는 항종양제인 아폽틴을 발현시키는 아데노바이러스와 같은 유전자 전달 운반자를 제공한다. 아데노바이러스의 아폽틴 조절은 정상적인 세포내에서 검출될만한 세포자멸사를 유발시키지 않으며, 재조합 아폽틴 아데노바이러스로 생체내 치료의 독성이 낮을 것이라는 것을 나타낸다. 재조합-아폽틴 아데노바이러스 감염에 의하여, 더 많은 양의 아폽틴을 발현하는 세포들을 얻을 수 있다. 이러한 발견은 DNA 형질감염에 비교하여 아폽틴 발현에 주요한 개선이다.

본 발명은, 또한 아폽틴 합성 및/또는 일부분의 아폽틴 없이, VP2 발현 유닛트의 구성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 닭 빈혈 바이러스 (CAV) 단백질 VP2의 발현이 인간종양세포에서 아폽틴-유도 세포자멸사를 증대시키는 증거를 제공한다.

더 구체적으로, VP2 와 아폽틴은, 종양세포들에서의 세포자멸사 유발에 관하여 공동으로 작용한다. 이러한 발견은 VP2와 아폽틴의 공발현이 아폽틴 기초 치료들을 향상시킴을 나타낸다.

본 발명은 ATG 개시 코돈의 직 상부 서열을 변경해서 아폽틴 발현의 현저한 개선을 설명한다. KOZAK의 규칙에 의해 예언된 것 같이, 발현의 개선은 아폽틴 단백질에 있어서 아미노산 변화를 필요로하지 않는다. 다른 CAV 단백질들의 ATG 개시 코돈의 상부 서열 개선이 또한 상기 단백질 합성을 개선시킬 것이다.

본 발명은, 또한 세포자멸사를 유발하는 인간 종양 세포중에서 아폽틴을 발현 시키는 레트로바이러스성 벡터의 구성에 관한 것이다. 재조합 아폽틴 아데노바이러스 데이터와 조합한 재조합 아폽틴 레트로바이러스와의 결과는 아폽틴 발현이 DNA 바이러스와 RNA 바이러스 복제에 대하여 독성이 없는 것을 나타내 준다.

(종양)세포들중에 아폽틴 발현은, 또한, 세포들을 아데노바이러스나 레트로바이러스 벡터들 외에도, 아폽틴 코딩 서열을 포함한 다른 DNA 및/또는 RNA 바이러스성 벡터들로 감염시킴으로써 일어날 수 있다. 그 외에, 프라스모바이러스와 같은 바이러스로 부터 유래된 벡터 시스템이 종양세포 중에 아폽틴에 의해 유발하는 세포자멸사를 유발시키는데에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하였으며, 이 실험예는 설명의 목적일 뿐, 보호의 범위를 제한하는 것이 아니다.

세포및 세포 배양 조건

Ad5 E1-형질절환단 인간 배아 신장(HEK; 293)-Ad5 E1과 인간 배아 망막 (HER; 911 및 PER.C6) 세포계를 37C, 5% CO₂의 분위기 중에서 10% 배아 송아지 혈청(FCS) 으로 보충된 둘베코(Dulbecco)의 개질 이글 배지(DMEM) 중에서 성장시켰다. 세포계 293은 아메리칸 타입 배양 수집 (ATCC CRL 1573)에서 얻었으며, 세포계 911과 PER.C6은 Fallaux et al., (1996) 로 부터 얻었다. 세포 배지, 시약과 혈청은 GIBCO Laboratories (Grand Island, NY)로 부터 구입했으며, 배양 플라스틱들은 Greiner (Nurtingen, Germany) 로부터 구입했다.

인간 표피 케라틴세포 (Keratinocytes)는 포피(包皮)에서 단리시킨 후, 137-Cs로 치명적으로 조사한 한층의 마우스 3T3 섬유아세포 존재하에 성장시켰다. 케라틴세포의 일차 배양은 이미 설명된 바와 같이, 완전 배지 중에서 최소 수식으로 시작했다(Rheinwald and Green, 1975).

비늘모양의 세포암에서 유래된 SCC-15 세포들과 같은 종양발생적 케라틴세포들(Rheinwald and Beckett, 1981)을 5% 태아 송아지 혈청, 0.4㎍ 하이드로코티존과 1㎛ 이소프로테레놀을 함유하는 DMEM/F12 (3:1) 배지중에서 배양하였다. 인간 간암에서 유래된 HepG2 세포들(Aden et al., 1979)과 인간 골육종에서 유래된 U2OS와 Saos-2 세포들(Diller et al., 1990)을 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 DMEM (GIBCO/BRL) 배지 중에서 성장시켰다. 자연적으로 형질전환된 케라틴세포 균주 HaCAT (Boukamp et al., 1988) 는 Dr. R. Fusenig, DFKZ, Heidelberg, Germany, 가 제공한 것이다. HaCAT 세포들을 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지중에서 성장시켰다.

쥐 (Murine) 세포계들은 37℃, 5% CO₂분위기 중에서 높은 농도의 글루코오스(4.5 g/l)와 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지 중에서 배양하였다. 자기지향성인 포장 세포계 Psi-2 (Mann et al., 1983) 와 양쪽양자성인 포장세포계 PA317은 앞에서 설명되었다(Miller, 1990 a, b).

바이러스 기법

플라크(plaque) 분석을 앞에서 기술한 바와 같이 수행하였다(Fallaux et al., 1996). 간단히 말하자면, 아데노바이러스 균주들을 2% 말 혈청을 함유하는 DMEM 2㎖에 연속적으로 희석한 후, 6-웰 플레이트에 있는 거의 융합성 911 세포계에 첨가했다. 37C에서 2시간 동안 배양시킨 후, 배지는 0.85% 아가로오스 (Sigma, U.S.A.), 20mM HEPES (pH 7.4), 12.3 mM MgCl2, 0.0025% L-글루타민과 2% 말 혈청(560℃에서 30분 동안 가열해서 불활성화 했음)을 함유하는 F-15 최소 필수배지(MEM)로 대체했다.

아데노바이러스의 소규모 생산은 앞에서 설명한 바와 같이 수행했다 (Fallaux et al., 1996). 간단히 설명하자면, 거의 융합성인 911 세포 또는 PER·C6 단층을 1% 말 혈청을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서, 세포당 약 5 플라크 형성 유니트 (p.f.u.s)로 감염시켰다. 실온에서 1시간 후, 접종물은 신선한 배지 (DMEM/2% 말 혈청)로 대체했다. 48시간 후, 거의 완전히 고립된 세포들을 회수하고, 1ml PBS/1% 말 혈청중에서 수거하였다. 바이러스는 3회의 순간 냉동/해동 순환과정 끝에 프로듀서 세포들에서 단리했다. 용해질(lysates)을 3000 rpm에서 10분 동안 윈심분리로 제거한 후, -20℃에서 저장하였다. Perkin Elmer PCR 장치를 사용해서 Noteborn 및 De Boer (1995)이 기술한 바와 같이, Ad5 ITR 영역(5_-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3_)및 E1A 암호화 영역 (5_-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3_)으로 부터 유래된 프라이머로 PCR분석을 행하여 재조합 적응 아데노바이러스의 존재를 확인하기 위하여 911 및 PER.C6 생산 rAdV 스톡을 스크리닝했다. 600-bp의 확대된 단편의 존재는 복제 적응(E1-영역 함유) 아데노바이러스가 분석된 바이러스 스톡 (Hoeben, 미공고된 결과)에 존재하거나, 또는 rAdV 배취로 HepG2 세포를 감염시킴으로써 존재하는 것을 나타냈다. 적어도 10일 동안, 상기 세포들은 E1A 단백질에 대한 특이 모노클로날 항혈청을 사용하는 간접 면역형광법에 의하여 잠재적인 세포변성효과를 모니터 하였다.

플라스미드 및 DNA 형질감염

아답터 플라스미드 pMad5는 아래에 기재한 바와 같이, pMLP10 (Levrerno et al., 1991)로부터 제조했다. MluI, SplI, SnaBI, SpI, AsuII와 MunI과 같은 제한효소들의 독특한 부위들을 갖는 합성 DNA 단편을 pMLP10의 HindIII 부위에 삽입함으로써 플라스미드 pMLP-10-lin은 pMLP10에서 유래되었다. Ad5 게놈의 뉴클레오타이드 3328 내지 8914 까지의 아데노바이러스 BglII 단편을 pMLP-lin의 MunI 부위에 삽입했다. SalI-BamHI 단편은, 생성되는 플라스미드로 부터 테트라사이클린 저항 유전자를 비활성화시키기 위하여 삭제했다. 생성되는 플라스미드는 제한효소 분석에 의하여 제어되었으며, pMad5라고 명명했다. 복수의 클로닝 부위에 삽입된 유전자의 발현은 아데노바이로스 즉시 초기 유전자 1(E1)인핸서에 연결된 아데노바이러스 주요 후기 프로모터에 의하여 조종된다.

모든 CAV DNA 서열들은 초기에 플라스미드 pIc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn and De Boer, 1990)로부터 유도되었다. 전에 pCMV-VP3 으로 불리어진 발현 플라스미드 pCMV-fs (Noteborn et al., 1994)는 독점적으로 아폽틴만 코드하는 CAV DNA (뉴클리오타이드 427-868) 를 함유한다.

플라스미드 pCMV-VP2mu (Noteborn, 미공고된 결과)는 뉴클레오타이드 380-1512 까지의 CAV DNA 서열들을 함유하고 있다. CAV DNA 단편은 25 bp 5'-비암호화 CAV DNA서열과 484 bp 3'-비암호화 CAV DNA 서열과 접해있는 VP2 코딩 영역을 함유한다. VP2의 개시코돈의 106 bp 하부에서 아폽틴 개시코돈은 다른 리딩 프레임 (reading frame)에 위치해 있다. VP2의 합성을 방해 않고, 아폽틴의 합성을 방지하기 위해, 아폽틴 개시 코돈 중의 변종(ATG가 ACG로 변함)을 도입하고, 위치 549 (T가 A로 변함)에서 포인트-뮤테이션(point-mutation)을 도입해서 유전자 암호화 아폽틴 내에 잉여 스톱코돈(extra stopcodon)을 생성했다. 그러므로, 삽입된 CAV 서열은 전체 길이의 VP2 단백질만 발현한다. 아폽틴은 합성이 않되었으나, VP2는 생성될수있다는 것을 간접 면역형광법에 의하여 알수 있었다.

PCR 확대 DNA 단편의 클로닝을 위하여, 본 발명자들은 In Vitrogen (Carlsbad, CA.)에 구입한 플라스미드 pCR-3.1을 사용하였다. 재조합-아폽틴-복제 결손 레트로바이러스를 제조하기 위하여 레트로바이러스 pLXSN을 사용하였다(Miller et al., 1992).

플라스미드 DANs로 수행하는 클로닝 단계는 모두 원칙적으로 마니아티스 (Maniatis) 등의 방법 (1992)에 따라서 행하였다.

이 실험에서 사용된 효소들은 모두 독일 뵈링거 만하임 회사(Boehringer Mannheim) 회사 및/또는 미국 바이오랩스(BioLabs) 회사에서 구입했다.

플라스미드 DNA는 CsCl 구배 원심분리와 세파크릴 S500-컬럼크로마토그라피를 사용하여 정제하였다(Pharmacia, Uppsala, Sweden). 인간 세포계 HaCAT, HepG2, SCC-15,293,911, 및 PER.C6는 Graham and Van der Eb (1973)에 의하여 설명된 인산칼슘침전법에 의하여 플라스미드 DNA로 형질전환시켰다. 정상적인 인간 이배체 케라틴세포 (FSK-1; 제2 통과), U2OS와 Saos-2 세포들을 DOTAP (Fischer et al., 1996)로 형질전환시켰다.

간접 면역형광법 분석

Noteborn et al. (1990)에 의하여 기술한 바와 같이, 세포들을 80% 아세톤으로 고정시키고, CAV 특이 또는 아데노바이러스 E1A-특이 모노클로날 항체 및 플루오레스세인(fluorescein)(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove PA)으로 결합시킨 염소 항마우스 및/또는 염소 항토끼 IgC로 면역형광 분석을 행했다. 핵 DNA는 2,4-디아미노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 요오드화 프로피디움(PI)으로 착색했다.

아답터 벡터 pMab의 구성

BamHI 제한효소 부위를 아답터 플라스미드 pMad5 에 도입하기 위하여, 이것을 제한효소로 분해하고, 송아지 장 알칼리성 포스파타제로 처리했다. ClaI-BamHI 링커를 T-4키나제로 처리하고, T4-DNA 리가제를 사용하고, 이어서 ClaI 분해에 의하여 그 자체에 결찰했다. ClaI/BamHI/ClaI 링커를 단리시킨 후, 선형화된 pMad5 벡터에 결찰했다. 세균 균주 JM109를 결찰 생성물로 형질전환시켰다.

제한효소 분해에 의하여 최종 벡터 pMab는 특징지어졌다. pMAab 벡터에 의하여, 이질적인 유전자는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에 독특한 BamHI 부위로 결찰될 수 있다. pMad 5와 pMab의 도해는 도 1에 나타냈다.

재조합 아폽틴 및 대조 아답터 벡터의 구성

아폽틴 유전자를 아데노바이러스에 도입하기 위한 아답터 벡터를 구성하기 위하여, pMab를 BamHI로 처리하고 이어서, 송아지 장 포스파타아제로 처리했다. 이어서, pCMV-fs를 BamHI로 처리하고, 아폽틴 암호화 서열을 함유한 0.45 kb DNA 단편을 단리하였다. 아폽틴 DNA 단편을 선형화된 pMab 아답터 벡터의BamHI 부위에 결찰했다. 결찰 생성물을 세균 균주 JM109에 클로닝했다. pMab 중에서 아폽틴의 배향은 제한효소 분석에 의해서 결정했다.

아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에 5'-3' 배향으로 아폽틴 유전자를 함유한 pMab 구조물은 아폽틴 유전자를 발현한다. 이 아답터 벡터를 pMab-VP3 로 칭하며, 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 생성하는데 사용된다. 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 하부의 3'-5'배향에서 아폽틴을 암호화하는 서열을 함유한 pMab DNA 플라스미드는 아폽틴을 발현시키고, 대조 재조합 아데노바이러스 벡터를 만들기 위하여 사용될 것이다. 두 개의 재조합 아답터 벡터의 도해를 도 2에 나타냈다.

압폽틴을 발현하는 재조합 아폽틴 아답터 벡터와 대비하여 CMV-플라스미드에 의한 세포자멸사의 유도

첫째로, 본 발명자들은 pMab-con은 아폽틴의 발현을 못하는 반면, pMab-VP3 DNA 벡터가 형질감염된 세포들 중에서 아폽틴을 발현할 수 있는지 여부를 시험했다. 그렇기 하기 위해서, 인간 아데노바이러스-형질전환된 293과 911 세포를 pMab-VP3과 pMab-con으로 형질감염시키고, 또한 pCMV-VP3로 양성인 제어로 상기 세포들을 형질감염시켰다. 형질감염한지 약 2일 후, 세포를 고정하고, 아폽틴의 발현 여부를 간접 면역형광분석으로 검사했다. pCMV-VP3와 pMab-VP3로 형질감염시킨 세포 배양물은 아폽틴 특이 모노클로날 항체와 반응하는 세포 약 1%를 함유하는 반면에, pMab-con DNA로 형질감염시킨 새포배양물은 상기 세포를 함유하지 않았다. 상기 결과는 pMab-VP3가 아폽틴을 발현하며, 이미 예상한 바와 같이, pMab-con은 아폽틴을 발현하지 못했음을 암시해준다.

다른 형질감염 실험에서, 본 발명자들은 pCMV-VP3와 대비하여 pMab-VP3로 형질감염시킨 후, 911 세포중에서 세포자멸사의 유도를 분석했다. 형질감염 3일 후, 911 세포를 수거하고, 아폽틴의 발현 여부를 간접 면역형광법에 의하여 검사했다. 그외에, 세포를 DAPI 또는 PI로 착색했다. 손상되지 않은 DNA는 강하게 착색되지만,세포자멸사 DNA는 약하게 또는 불규칙하게 착색된다(Telford, 1992).

pMab-VP3로 형질감염된 아폽틴 양성 911 세포 중 약 60%가 세포자멸적임에 반하여, pCMV-VP3로 형질감염된 아폽틴 양성 세포 중 약 40%가 세포자멸사를 당했다.

상기 결과들은 아폽틴의 pMab-VP3 조절 발현은 pCMV-VP3에 의해 발현된 아폽틴보다 비슷하거나 약간 높은 수준의 세포자멸사의 유도를 가져오는 것을 나타내 준다. 상기 결과를 도 3에 나타냈다.

또한, 아폽틴은 인간 아데노바이러스-형질감염된 세포들 중에서 세포자멸사를 유발시키지만, E1B는 아폽틴이 유발시킨 세포자멸사를 억제하지 않는다. 이와 반대로, E1B는 다양한 화학요법제에 의하여 유발된 세포자멸사를 차단할 수 있다. 이들 결과는 아폽틴이 매우 효능있는 항종양제라는 것을 나타내 준다.

재조합 아폽틴 아데노바이러스의 구성

재조합 아폽틴 아데노바이러스 벡터를, 아폽틴의 암호화 서열과 약간의 아데노바이러스 서열을 유발하는 아답터 플라스미드 pMab-VP3와, E1과 E3 영역(McGrory et al., 1988)를 뺀 전체 아데노바이러스 DNA를 함유하는 플라스미드 DNA JM17의 헬퍼 세포계 911로 공형질감염시켜서 생성했다. 공형질감염물은 Graham과 Van der Eb(1973)에 의해서 기술된 바와 같이, 인산칼슘으로 침전시킨 DNA로 형질감염시켰다. 재조합 아데노바이러스 DNA는 플라스미드 pMab-VP3와 JM17 DNA의 아데노바이러스 DNA중에 존재하는 상동 바이러스성 서열들 사이에서 상동 재조합에 의하여 형성되었다.

비슷한 방법으로, 911 세포의 공형질감염을 pMab-con 및 pJM17 DNA로 행하여 아폽틴을 발현할 수 없는 대조 재조합 아데노바이러스를 생성시키며, 이것은 아폽틴-유도 세포자멸 효과의 아데노바이러스 대조물로서 사용될 것이다.

형질감염 수 시간 후, 911 세포 단층을 아가로스 덮개층으로 덮고, 재조합 아데노바이러스에 의하여 유도된 플라크 (plaque)가 분명하게 보일때까지 37℃에서 배양했다. 바이러스를 Fallaux et al.(1996)가 기술한 바와 같이, PBS 말 혈청 스톡으로서 플라크에서 수거되었다. 이어서, 재조합-바이러스 스톡의 일부를 새로운 911 세포가 들어 있는 24-웰에 첨가했다. 수일 후, 상기 감염된 911 세포들은 용균되었으며, 재조합 바이러스들은 수거되었다.

다음에, 잠재성이 있는 재조합-아폽틴 아데노바이러스(rAd-VP3)에 의한 아폽틴의 발현 또는 대조 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴의 발현의 부재를 검사했다.

감염된 24-웰 플레이트에서 유도된 재조합 바이러스 스톡의 일부를 유리덮개 슬립상에서 단층으로 성장한 새로운 911 세포를 감염시키기 위하여 사용되었다. 1일 후, 감염된 911 세포를 아세톤으로 고정시키고, 아폽틴-특이 모노클로날항체 85.1를 이용하여 면역형광법으로 분석했다. 추정의 rAd-VP3로 감염된 5개의 분석한 911 세포 배양물 중 5개는 아폽틴을 발현하는 세포를 함유하였다. Ad-con으로 감염된 911 세포는 아폽틴에 대하여 양성이 아니였고, 감염이 않된 911 세포는 아폽틴-에 대하여 양성이였다. 상기 결과는 911 세포와 같은 아데노바이러스 포장 세포계를 필요한 아답터와 아데노바이러스 DNA로 공형질감염 시킨 후, 아폽틴을 발현시키는 생존 가능한 rAd-VP3가 생성될 수 있음을 암시해준다.

rAd-VP3 또는 rAd-con 플라크에서 유도된 2개의 스톡을 911 세포로 3회 연속 플라크 정제방법으로 처리하거나, 또는 Fallaux(1996)에서 기술된 바와 같이, PER.C6를 이용한 제한-희석 분석을 병행하여 rAd를 정제하는데 사용했다.

아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에, 아폽틴을 발현하는 rAd-VP3를 생성하는 상기 방법에 기초해서, 본 발명자들은 거대세포바이러스 (cytomegalovirus)(CMV) 프로모터의 조절에 의하여 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 얻는데 성공하였다. 이런 결과들은 다양한 유형의 재조합 아데노바이러스가 그 자체 중의 하나 또는 이종 프로모터 엘리먼트를 조절 하여 생성된다는 것을 나타냈다.

PER.C6 세포 사용에 의한 rAd-VP3및 rAd-con의 생산

PER.C6 세포를 사용해서 rAd-VP3와 rAd-con의 소규모로 생산하는 것은 Fallaux(1996)에 기재된 바와 같이 수행했다. 요약해서, 이 과정은 실험예에 기재되었다.

플라크 분석에 의하여, 역가는 용해질을 제거한 rAd-VP3 및 rAd-con 모두에 대해서 약 10^11-12/ml가 되는 것으로 측정되었다. 얻어진 역가는 실험실 내에서 얻은 다른 rAd's의 역가 보다 낮지 않았다.

PCR 분석과 rAd-VP3 및 rAd-con 에 의한 HepG2 감염에 의하여 생성된 바이러스 배취에 복제 가능한 아데노바이러스가 들어있는지 여부를 검사했다(실험예 참조). rAd-VP3 및 rAd-con 배취는, 모두 두 가지 방법으로 증명된 바와 같이, RCA가 없었다.

아폽틴의 발현은 세포 배양 조건하에서 아데노바이러스 생활환의 필요한 단계를 모두 부정적으로 방해하지 않는다. 그러므로, 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터에 기초한 유전자 요법이 가능하다.

항-세포자멸적인 Ad5 E1단배질 (White, 1996)의 발현 때문에, 아폽틴은, 재조합 아폽틴 아데노바이러스가 다량으로 생성된 후, 세포자멸사를 최적으로 유발한다. 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터가, 293,911 및 PER.C6 세포 등의 아데노바이러스 유형5(Ad5)E1 단백질로 형질전환시킨 인간세포에서 생산될 수 있다는 사실은, E1 단백질이 이 DNA 바이러스를 세포자멸사-유도 단백질 아폽틴 존재하에서 높은 역가로 복제할 수 있다는 것을 암시해준다.

상기 결과들은, 또한 아데노바이러스 5 E1 단백질로 형질전환시킨 세포계 중에서 아폽틴을 발현하는 다른 재조합 DNA바이러스 벡터를 생성할 수 있다는 것을 암시해준다. 예를 들면, H-1 또는 MVM 파르보바이러스에 기초한 재조합 파르보바이러스 벡터는 Ad 5 E1 단백질(Dinsant et al., 1996)로 형질전환시킨 293T 세포중에서 번식할수 있다.

H-1 및 MVM 파르보바이러스는 형질전환된 세포중에서 세포사(細胞死)를 특이적으로 유발하지만, 모두 세포사를 유발하지는 않는다.(Lopez-Guerrero, 1997.) 아폽틴을 발현하는 파르보바이러스 벡터는, 아폽틴에 의한 세포자멸사의 추가적인 종양 특이 유도(Dinsart et al., 1996, Danen-Van Oorschot, 1997) 때문에, 파르보바이러스 그 자체 보다 종양 특이 세포자멸사를 유도하는데 더욱 효능이 있을 것이다.

Ad 5 E1 단백질 형질전환된 세포에 기초한 재조합-아폽틴 바이러스 벡터의 생성 프로토콜은 또한 레트로바이러스와 같은 RNA-바이러스종 에도 유효하다.

인간 형질전환 세포계 및/또는 악성 세포계 중에서 세포자멸사의 유도

인간 종양세포에 rAd-VP3 감염이 아폽틴에 의한 세포자멸사를 유도하는지를 검토했다. 그런면에서, 인간 간암 HePG2, 골육종 세포 U2OS, 비늘모양의 세포암에서 유래된 세포 SCC-15 과 자발적으로 형질전환된 케라틴 세포계 HaCAT는 rAd-VP3에 의해 감염되었다. 형질감염 1일후, 세포들을 고정하고, DAPI 착색 처리를 함유한 면역형광방법을 통해 아폽틴 분석을 하고 세포들이 세포자멸 과정을 거쳤는지의 여부를 조사했다. 감염 1일 후, 거의 모든 분석된 아폽틴 양성인 인간 세포가 자멸적이었다. 감염이 않된 배양물에서는 불과 몇 %의 인간종양 세포가 소멸되었다. HePG2와 U2OS 세포 결과는 도 4에 도시하였다.

rAd-VP3로 감염된 정상적인 세포중에서 아폽틴의 발현

감염된 정상 비형질전환 세포중에서 rAd-VP3에 의해 발현된 아폽틴의 효능을 분석하기 위해 FSK-1 세포를 rAd-VP3로 감염하였다. 형질감염 4일후, 세포는 모노클로날항체 85.1과 DAPI 착색물을 사용한 면역형광법에 의하여 분석되었다. 기껏해서 아폽틴 양성인 세포의 8%가 DAPI에 비정상적으로 착색 되므로, 아폽틴에 의하여 유도된 세포자멸 과정을 거쳤을 것이라고 나타냈다. 그러나, 감염이 않된 세포중 7%가 미입성 착색된 DNA 패턴를 함유하고 있다. 상기 결과는 도 4에 도시하였다.

전신 전달 후 인간 Ad5의 헤파토트로픽 (향간성)선천성이 기정 사항이라면, 정상적인 이배체간세포에서 아폽틴의 효능을 조사하는 것도 중요하다고 본다. 이런면에서, 단리된 쥐 간세포들을 인슐린 (2mU/ml)와 덱아메타존(dexamethasone) (1nM)을 함유한Williams E 배지(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.)에 배양하였다. 세포들은 콜라겐으로 덮인 배양 슬라이드(Micronic)에 생육되었다.

일차 쥐 간세포들을 아폽틴을 발현하는아데노바이러스 벡터 Ad-VP3, LacZ를 발현하는 아데노바이러스 제어로 감염하거나 또는 모의 감염하였다. 2이후, 세포들을 고정하고, 면역형광법과 DAPI-착색으로 세포자멸사 백분율을 검토하였다. 모의 감염된세포 비율이나 아폽틴, LacZ 을 발현하는 소멸한 세포 비율에는 아무 차이가 없었다. 아폽틴이 아데노바이러스 벡터를 통해 합성이되어도 쥐 간세포는 아폽틴에 의해 발현된 세포자멸 과정을 거치지않았다고 상기 보고들은 지적했다.

상기 결과들은 rAd-VP3에 의해 지배된 아폽틴의 발현은 (형질전환 된/종양적인 인감 세포와 반면) 정상적이고 형질전환이 않된 인간 세포에서는 아폽틴에 의한 세포자멸사가 이루어지진 않는다. 이것이 (GFP와 연결된) C-아폽틴이 세포핵안에 들어갈수 있다는 사실과 일치하다.

아폽틴 합성의 증가

상기 결과는 rAd-VP3에 의한 아폽틴 발현은 다른 포유류 종양성 및 또는 형질전환된 세포계에서 세포자멸사를 유도 한다는 것을 나타냈다.

아폽틴 ATG- 개시 코돈 앞 부위에 있는 직 서열의 효능을 측정하기 위해 2개의 PCR-3, 1- 아폽틴 구조물(constructs)을 구성하였다. PCR-VP3 ori는 아폽틴 ATG- 코돈의 본래 즉 상부 서열 (5_-TTTCAA-3_)을 포함한 반면 PCR-VP3 mu는 즉 상부 서열 (5_-GCCAAC-3_)를 함유하고 있다. 시험관 내 전사와 번역, 밀씨눈 분석 방법으로 PCR-VP3 ori에 의한 아폽틴 발현보다 적어도 5배 이상 많았다고 확정되었다.

상기 자료는 아폽틴-ATG의 즉 상부 서열 조화가 아폽틴의 합성을 좌우한다. 아폽틴의 ATG-코돈 앞(부위)에 위치한 즉 상부 서열 5_-GCCAAC-3_을 지닌 바이러스성 벡터의 구성은 높은 아폽틴 생성과 아폽틴의 발현에 의한 세포자멸사의 간접적인 증식(증가)으로 이어진다.

아폽틴의 아미노산 서열은 번역 효율 증가를 위해서는 변경이 필요하다는 Kozak의 법칙(Caventer and Stuart, 1991)에 의한 예측을 뒤로 하였음을 중요하게 언급되었다. 즉, 이 규칙에 따르면, 포지션 +4에 위치한 누클레오티드 A는 G로 바뀌어야 그(본) 활성을 체인지할 수 있는 아폽틴의 다른 2번째 아미노산을 얻을 수 있다.

세포자멸적 활성을 내포하는 필수적인 아폽틴 단편의 동정

자멸적인 활성도를 위한 아폽틴 단백질의 일부가 필수적인지의 여부를 가리기 위해 녹색 형광 단백질(GFP; Rizzuto, 1995)과 N-터미널(말단기)기 아폽틴의 아미노산(N-apoptin)이나 그C-말단기 50 아미노산(C-apoptin)으로 이루어진 키메라(chimeric) 단백질을 암호화하는 플라스미드를 구성했다. Saos-2세포(Zhuang, 1995)와 같은 형질전환된 인간 세포는 일시적으로 키메라 GFP/N- 아폽틴이나 GFP/C- 아폽틴을 발현하는 Saos-2 세포만이 아폽틴 특이성 세포자면 과정을 거쳤다.

상기 결과들은 아폽틴의 일부가 충분히 종양적인/형질전환된 인간 세포중에 세포자멸사를 유도 할수있다고 지적했다. 그러므로, 일부분의 아폽틴만 발현하는 바이러스 벡터에 의거하는 효과적인 유전요법도 개발할수있다. 또한, 상기 자료들은 외래 단백질과 공유 연결되었을 때만 그 세포자멸적인 활성도를 포함한 아폽틴의 일부를 지적해냈다,

인간 종양 세포중에 VP2와 아폽틴의 공발현이 상승작용하여 세포자멸사의 유도를 증가 시킨다

VP2와 아폽틴의 공발현이 세포자멸사의 유도에 미치는 영향을 검토하기 위하여 Saos-2 세포를 아폽틴을 발현하는 pCMV-fs 및 또는 VP2를 발현하는 pCMV-VP2mu로 동시 형질하고, 감염 후, 수 차례 시간간격으로 세포들을아세톤에 의해 고정하고, 간접면역형광법으로 VP2 양성인 세포들은 모노클로날항체인 CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch, 1996.) 과 아폽틴 양성인 세포들은 모노클로날항체인 CVI-CAV-85.1에 의해 확인되었다.

형질감염 3일 후, VP2를 발현하는 세포의 3%와 아폽틴 을 발현하는 세포중 10%만이 세포자멸과정 을 거쳤다. 그 반면, VP2와 아폽틴을 발현하는 Saos-2세포들은 이미 세포자멸적이었다. VP2를 발현하는 세포중 오직 3%와 아폽틴을 발현하는 세포중 10%가 세포자멸 과정을 거쳤다. 그 반면, 약 40%의 VP2와 아폽틴을 발현하는 Saos-2 세포는 이미 자멸적이었다. 그리고 형질 감염 4일 후, 세포 자멸 과정을 거친 VP2/아폽틴 양성인 세포들의 비율은 아폽틴이나 VP2를 각각 발현하는 세포들보다 두드러지게 높았다. 상기 결과들은 VP2가 아폽틴에 의해 유도되는 세포자멸사를 촉진시킨다고 나타냈다. 도 5에 상기 결과를 도시하였다.

아폽틴을 발현하는 레트로바이러스 벡터의 구성

플라스미드 PL-VP3-SN(도7 참조)을 생성하기 위해 아폽틴을 암호화하는 서열을 갖는 SamHI 단편은 PLXSN의 독특한 BamHI 부위에 삽입하였다. 제한요소 분석에 의하여 삽입물의 적당한 배향이 확인되었다. 삽입의 보전성을 시험하기 위하여 플라스미드 PL-VP3-SN을 인산석회 침체 방법 처리와 함께 COS-7과 HePG2에 형질감염하였다. 형질감염 4일 후, 아폽틴 단백질의 발현에 있어 세포들을 고정하고, 모노클로날 항체 85.1에 의해 분석되었다. 세포 중 대략 1~2%가 아폽틴 발현이 확인되었다. DAPI 착색처리에 의해 대부분의 세포들은 자멸과정을 치루었다. 상기 자료는 프로바이러스성 LTR 프로모터는 아폽틴의 발현을 가동시킬 수 있으며 그 유전자는 DNA 구성물에 보전되었고 또한 형질감염된 HePG2와 COS-7 세포중에 아폽틴의 발현이 세포자멸사를 유도한다는 것을 나타냈다.

바이러스 생성을 위하여 인산칼슘 동시 침전 방법으로 플라스미드 pL-VP3-SN을 Psi-2 세포와 PA 317에 형질감염하였다. 형질 감염 48시간 후, 세포의 상징액을 수거하고, 희석액(물)을 4μg/ml 폴리브렌(polybrene)을 첨가해 HepG2 세포(PA317 상징액)와 NIH3T3(Psi-2 상징액)를 감염하였다. 감염 4일 후, 세포들을 고정하고 모노클로날 항체 85.1과 착색처리하여 아폽틴 발현에 대한 분석을 하였다. 대략 세포의 1%가 아폽틴을 발현한다는 것을 알 수 있었다. 상당수의 아폽틴 양성인 HepG2 세포는 자멸적이었다.

상기 자료들은 L-아폽틴-SN 레트로바이러스가 세포들에 형질도입되었다는 것을 보여주었다. 또한, 프라스모바이러스의 단일카피는 충분히 면역형광법에 의해 발견될 수 있을 만큼 충분한 양의 아폽틴 단백질을 발현하며, 또한 간암세포계 HepG2와 같은 인간종야세포계중에 세포자멸사를 유도하는데 충분했다.

상기 자료를 합해 검토하면 아폽틴 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터가 생성될 수 있으며 인간종양세포에 세포자멸사를 유발할 수 있다는 것을 나타냈다. 아폽틴 유전자도 또한 그의 발현도 레트로바이러스 생활환의 필수과정(단계)를 방해하지 않았다고 정식으로 증명하였다. 또한 조직 배양에서 인간(종양)세포에 형질도입할 수 있는 아폽틴을 함유하는 충분한 양의 레트로 바이러스를 배취 방식으로 생성할 수 있다는 것이 증명되었다.

더 나아가서 상기결과는 인간종양세포에서 아폽틴 발현과 그 결과로서 일어나는 세포 자멸사도 프라스모 바이러스(Noquiez Hellin, 1996)와 같은 레트로바이러스에서 유래된 벡터시스템에 의해 가능하다고 내포했다. 레트로바이러스 복제가 아폽틴의 발현에 의해 차단되었는지의 여부가 재조합 아폽틴 프라스모 바이러스 시스템에게는 중요한 단계다.

사실이 그렇지 않다고 입증하는 증거는 성공적인 재조합 아폽틴 프라스모 바이러스의 생성을 의미한다.

rAd-VP3에 기초한 암세포에 대한 진단상의 분석

종약적인/형질전환된 인간 세포에 아폽틴의 세포상의 위치는 정상적인/형질전환이 안된 세포에 아폽틴의 세포상의 위치와 다르다. 또한 다른 마커(marker)는 정상적인 세포에서가 아닌 종양적인/형질전환된 세포에서도 자멸사를 유발하는 아폽틴의 특별한 능력을 소유하고 있다.

세포를 rAd-VP3로 감염시키고 아폽틴 위치 및 또는 이들 세포안에서의 세포자멸사의 유발에 대해 분석하므로 세포가 악성인지의 여부를 확인할 수 있다.

제 1차 세포들은 의심쩍은 조직에서 단리된 후 필수적인 배지에 배양했다. 세포들은 rAd-VP3과 rAd-con으로 병행하여 감염시켰고 분석되었다.

예를 들면, 아폽틴 특이성 모노클로날 항체 85.1를 함유한 면역 형광 분석로 아폽틴이 (정상세포)일 경우에나 (아니면)또는 핵(형질전환된 세포)일 경우에 있는지 확인 할 수 있다. 또한/(그대신) 세포자멸적인 세포의 비율이 대략 측정된다. 만일 rAd-VP3에 대한 세포자멸적인 세포의 비율이 rAd-con로 감염된 세포에 대한 것보다 상당히 높으면, 이 세포들은 악성으로 변한다.

건강한 쥐에 있어서 재조합 아폽틴 바이러스의 독성실험

조직 배양 상태에서 재조합 아데노바이러스 rAd-VP3에 의해 발현된 아폽틴은 인체나 서류에서 유래된 정상적인 세포에서는 세포자멸사를 유발하지 않는다. 아래에 설명된 실험에서는 건강한 쥐에 재조합 아데노바이러스 벡터 rAd-VP3에 의해 아폽틴의 발현이 심각한 독성 효과를 거져오는지의 여부를 검토한다.

이 실험에 사용된 rAd-VP3 벡터와 대조군 rAd벡터는 PER.C6 세포에 배양된 후 PCR 분석에 의해 재조합 충분한 아데노바이러스(RCA-free)가 제거되었다는 것을 확인했다. rAd는 CsCl-구배 원심분리에 의해 정제되었다. 시험관대략 200g 몸무게의 수컷 Wag/Rij 쥐(Harlan, The Netherlands)들에 아폽틴을 발현하는 재조합 아데노바이러스(rAd-VP3, 2.5x10⁹프라크 형성성단위(p.f.u))와 대조군 유전자 생성을 루시페라아제(luciferase) (rAd-luc; 2.5x10⁹)으로 투입했다. 두 가지의 아데노바이러스 벡터는 0.1% 소혈청 알부민과 10% 글리세롤(glycerol)-(PBS+)을 함유한 인산완충식염수에 배양되었다. 아데노바이러스 벡터가 첨가되지 않은 상기 액을 또 하나의 네거티브 대조군으로 투입되었다. 2마리의 쥐의 정맥내에, 복강내에 또는 피하에 rAd-VP3, rAd-luc 또는 PBS+ 현탁액을 투입하였다.

Ad-VP3로 처리된 쥐의 거시적이고 병리학적 분석

아폽틴-VP3에 의해 발현된 아폽틴의 독성 효과의 가능성을 검토하기 위한 1번째 방법은 실험의 대상인 쥐들의 일반 건강 상태와 특히 그들의 몸무게를 측정하는 것이다. 몸무게는 투입 후 매일 측정되었다. 실험동안 모든 쥐들은 양호한 상태였다. 여러 그룹의 몸무게에 별로 큰 차이가 없었다. 1주일 후, rAd-VP3로 투입된 주를 포함한 모든 실험 대상의 쥐의 몸무게가 늘었다. 몸무게 증가는 rAd-VP3에 처리되었으므로 사용된 동물들은 심각한 독성 효과를 격지 않았다.

심각한 독성 효과가 없다는 것을 더 확립시키기 위하여 다음과 같이 이행하였다. 희생 2시간전, Brdu로 쥐들에게 투입하였다. 희생후, 여러 조직들(간, 콩팥, 장, 심장, 폐, 비장, 생식선과 음경)은 병리학적으로 즉시 검토되거나 또는 더 나아가서 조직 병리상의 분석을 위해 수거되었다. (아래 참조). 거시적 분석은 Ad-VP3로 처리된 쥐들의 어느 장기에서도 중요한 병리적 효과(반응)을 나타내지 않았다.

간에서의 Ad-VP3 DNA의 측정

정맥내로 투입된 (재조합) 아데노바이러스(벡터)의 주요 표적은 간과 (다소) 비장이다. 그러므로 아폽틴의 독성 효과가 얼마라도 있으면 간에서 관찰될 수 있다.

Ad-VP3 DNA의 현존과 Ad-VP3에 의한 아폽틴 발현과 세포 병리학적인 효과를 검토하기 위해 여러 차례의 실험을 실행했다.

먼저, Ad-VP3로 처리된 쥐에서 단리된 DNA가 아폽틴 DNA를 함유하는지의 여부를 가리기 위해 투입 8일 후 쥐들이 희생되고 네가티브 대조군으로서 써던흡입방법(Southern blot)에 의해 분석되었다. Ad-luc로 처리된 쥐들의 칸에서 단리된 DNA들을 병행하여 검토하였다.

단리된 DNA를 아가로스젤상에 적재하기 전에, DNA는 BamHI에 의해 분해되었고 0.5kbp의 아폽틴 DNA 단편이 완성되었다. 써던흡입방법은 32p-라벨된 아폽틴 DNA/ 프로브로 혼성화되었다. 아폽틴으로 처리된 쥐에서 단리된 BamHI DNA 단편은 써던흡입에 의해 선명히 보였으며, 예상하였듯이 r-Ad-luc 대조군으로 처리한 여러 쥐칸에서 단리된 DNA들을 함유한 레인에서는 관찰못했다.

간에 Ad-VP3 카피양을 측정하기 위해 다양한 양의 아폽틴 DNA를 병행(parallel)하여 써던흡입에 적재(부하)하고 라벨된 아폽틴 DNA 프로브로 혼성화되었다.

정맥내의 감염(투입) 8일 후에도 세포당 0.25 Ad-VP3 카피가 측정이 될 수 있다는 것이 간에서 매우 상당한(중요한) Ad-VP3의 형질도입을 나타냈다.

간세포에서의 아폽틴 발현과 그의 독성 효과

Ad-VP3로 처리된 간이나 대조군에 대한 파라핀 단편을 아폽틴 특이성 모노클로날 항체 CVI-CAV-85.1나 CVI-CAV-111.3로 착색한 결과, Ad-VP3로 처리한 동물의 간세포의 25~30%가 아폽틴을 발현하였다. 쥐 대조군의 간단편(섹션)은 아폽틴 네가티브였다.

Ad-VP3에 의해 발현된 아폽틴의 독성효과가 간세포에 미치는 영향을 검토하기 위해 2가지 방법을 실행했다. 모든 Ad-VP3-로 처리된 쥐와 2가지 타입의 동물 대조군의 간섹션들을 헤마탁실린-에오신(haematoxyline-eosin, HE)으로 착색처리하였다.

검토된 모든 간섹션에서는 아무런 형태적이고 병리학적인 변화를 관찰하지 못했으므로 생체내에 아폽틴 발현은 쥐 간세포에 독성 효과가 없다는 것을 알 수 있다.

새롭게 분리된 세포들을 BrdU-표지(labeling)으로 확인하여 손상적인 영향을 측정하였다.

Ad-VP3를 함유한 간일 경우에는 BrdU 로 라벨된 간세포도 Ad-luc로 처리된 쥐간과 같이 대략 2% 정도 였다. 그러므로, 상기와 같은 아폽틴 발현은 생체 내에서도 주목할 만한 독성효과를 보이지 않았다.

생체내 모형 내에서 아폽틴은 급성 독성효과를 가지고 있지 않다

거시적과 조직적 분석이 생화학과 면역적 자료와 결합되며 아폽틴의 발현이 생체내 모형에서 급성 독성효과를 지니지않다고 나타냈다. 상기 결과는 유전자 전달 운반자나 다른 방법들을 동윈한 아폽틴 발현에 근거한 요법은 제한된 (음의) 부작용 가질 것이라고 지적했다.

인간 간암 모형에서 항종양 연구

조직 세포 배양 상태에 형질전환된 인감 세포에서 Ad-VP3에 의해 발현되는 아폽틴은 세포자멸사의 유발로 이루어진다. 예를 들면, 인간 간암 세포 HepG2안에서 아폽틴에 의해 가동되는 아폽틴의 발현은 세포자멸사를 유발 시킨다. 아직까지 생체 내에서 아폽틴 (예를 들면, Ad-Vp3에 의해 발현된)의 항종양 활성도를 관찰하지 못 했다.

그러므로, Ad-Vp3에 의해 조절된 아폽틴 발현이 생체 내에서 항종양 활성도로 이어지는지의 여부를 확인했다. 그런 면에서, 수컷 무모마이스 Balb/C/nu/nu mice들은 측면 당 (per side) 1x106 의 인간 세포 HepG2/ 를 피하주사 하였다. 적어도 쥐의 2 내지 3 부분에 인간 간암 세포를 투입하였다. 접종 3주 후, 피하에 적어도 5x 5 mm의 평균 크기의 클리어 (clear)한 간암 종양들이 자랐다. 5% 수크로오스 (sucrose)와 .1% 소혈청알부민을 함유한 이산완충식염수에 현탁된 rAd-VP3와 rAd-con 대조군 벡터들을 종양 내에 투입하였다.

아폽틴을 발현하는 투입된 rAd-VP3 벡터와 Ad MLP 촉진제와 반대의 3'-5' (역전 이나 반의미) 오리엔테이션의 아폽틴 유전자를 지닌 대조군 벡터 rAd-VP con1를 PER.C6 세포에 자라게 했다. 이 2개의 재조한 아데노바이러스 배치에는 RCA가 PCR 방법에 의해 제거됨을 확인할수 있었다. rAd 는 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제되었다. 종양당 40l 의 현탁액의 7x109 pfu- rAd 입자들이 투입되었다. 타입당 rAd 벡터는 2 내지 3의 HepG2 종양을 지닌 쥐 6마리에 투입 되었다. 부가적인 대조군으로, HepG2를 지닌 4마리의 무모마이스사용하였다. (PBS+ 그룹) 쥐들의 종양 내로 5% 수크로오스 (sucrose)와 .1% 소혈청알부민을 함유한 이산완충식염수를투입 하였다.

생체내 모형내에서 아폽틴은 항종양 효과를 갖는다

rAd-VP3과 대조군현탁액을 투입한지 7일 후, 인간 HepG2 종양에 Ad-Vp3를 발현하는 아폽틴의 항종양 가능성을 관찰하기 위해 피하 종양의 크기를 측정하였다. PBS+그룹과 대조군 rAd-con1에 처리된 그룹의 HepG2 종양 크기는 중용의 연속적인 증가를 나타냈다. 그 반면, 종양 내로 rAd-VP3가 투입된 그룹의 종양 크기는 줄어든것을 나타냈다. 투입 7일 후, 무모마이스들은 희생되었다. 종양들은 단리되고 거시적으로 관찰되었다. 대조군rAd-con1벡터 또는 PBS+로 처리된 간암 종양들은 커지고심하게 혈관화 된 간암 종양 조직이 나타냄이 분명하였다. rAd-VP3로 처리된 HepG2 세포 종양에서는 완전히 다른 패턴을 관찰하였다. 종양 잔량누가는 축소된 종양 혈관화에 이해 창백한 외관을 지녔다. rAd-VP3로 처리된 종양의 크기는 감수되었다. 종양은 소멸된 세포를 의미하는흰 거포와 같은 구조를 함유하였다.

아폽틴에 의해 유발된 종양 퇴행(regression) 외에 장기(특히 간과 비장)에 아폽틴 발현의 아무런 네거티브(음의) 영향을 관찰하지 못했다.

생체내의 시스템에서 아폽틴은 항종양 활성을 갖는다

마지막으로, 대조군들과 반면 rAd-VP3로 처리된 종양은 축소된 종양을 나타냈다. 상기 결과는 아폽틴의 발현은 생체 모형내에서 항종양 활성을 언급한다. Ad-VP3에 의해 발현된 아폽틴이 종양 퇴행에 HePG2와 같은 급성장하는 종양을 촉진시킨다는 사실이 아폽틴의 강한 항종양 가증성을 확인한다. 아폽틴이 무모마이스에 종양 퇴행을 축소했다는 사실이 아폽틴의 발현 그 자체가 종양세포를 더 이상의 면역 반응 없이 소멸한다.

이미 설명된 유독성과 항종양 연구들은 아폽틴의 발현에 근거한 항종양 요법이 안전성과 가능성을 드러났다.

참조문헌

Claims

아폽틴과 같은 활성을 암호화하는 핵산으로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 1항에 있어서, 부차적으로 상기 핵산의 ATG-개시 코돈 상류에 수식된 번역 개시 부위로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 2항에 있어서, 상기 번역 개시 부위가 핵산 서열 GCCAAC로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
VP2와 같은 활성을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 4항에 있어서, 부차적으로 상기 핵산의 ATG-개시 코돈 상류에 수식된 번역 개시 부위로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 부차적으로 VP2와 같은 활성을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 6항에 있어서, 부차적으로 VP2와 같은 활성을 암호화하는 핵산분자의 ATG 개시 코돈 상류에 수식된 번역 개시 부위로 이루어지는 유전자 전달 운반자.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자 전달 운반자가 바이러스인 유전자 전달 운반자.
제 8항에 있어서, 유전자 전달 운반자가 복제 결손 바이러스인 유전자 전달 운반자.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 유전자 전달 운반자가 아데노바이러스인 유전자 전달 바이러스.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 유전자 전달 운반자가 레트로바이러스인 유전자 전달 바이러스.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 부차적으로 적어도 1개의 표적 분자로 이루어진 유전자 전달 운반자.
제 12항에 있어서, 표적 분자가 종양 세포 표면 수용체에 반응성인 유전자 전달 운반자.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 의한 유전자 전달 운반자로 이루어지는 숙주세포.
제 14항에 있어서, 숙주세포가 헬퍼 세포 또는 포장 세포인 숙주세포.
제 14항에 있어서, 숙주세포가 HEK;293, HER;911, PER.C6, Psi-2 및 PA317세포로 되는 군 중에서 선택되는 숙주세포.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 의한 유전자 전달 운반자를 함유하는 암치료제.
제 17항에 있어서, 유전자 전달 운반자를 통상의 화학 요법과 결합한 암치료제.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 의한 유전자 전달 운반자를 함유하는 과형성, 화생, 및 이형성 치료제.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 의한 유전자 전달 운반자를 함유하는 진단제.
제 20항에 의한 유전자 전달 운반자를 함유하는 형질전환 세포, 암세포, 과형성 세포, 화생 세포 또는 이형성 세포의 시험관내 시험 검출제.