CZ299963B6 - Lécivo obsahující adenovirový genový nosic - Google Patents

Abstract

Použití adenovirového genového nosice schopného indukovat apoptózu v bunce obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující apoptinu podobnou aktivitu pro prípravu léciva pro lécení transformovaných bunek, kde apoptóza je indukována v transformovanýchbunkách a redukovaná apoptóza se vyskytuje, pokudvubec, v normálních diploidních, netransformovaných/nemaligních bunkách, a kde transformované bunkyjsou charakterizované hyperplazií, metaplazií nebo dysplazií. Použití je rovnež pro diagnostické úcely.

Description

(57) Anotace.

Použití adenov irového genového nosiče schopného indukovat apoptózu v buňce obsahující molekulu nukleové kysel i nv kódující apoptinu podobnou aktivitu pro přípravu léčiva pro léčeni trans formovaných buněk, kde apopló/a je indukována v transformovaných buňkách a redukovaná apopló/a se vyskytuje, pokud vůbec, v normál nich dipíoidních. netransformovanýeh/pemalignieh buňkách, ti kde transformované buňky jsou charakterizované hy perpla/íí. melapla/ií nebo dyspla/ií. Použiti je rovněž pro diagnostické účely.

Léčivo obsahující adenovirový genový nosič

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití genových adenovirových nosičů obsahujících molekuly nukleové kyseliny, kódující apoptózu indukujícím proteinům VP2 a/nebo apoptinu (VP3) podobnou aktivitu pro přípravu léčiva pro léčení transformovaných buněk.

kj Vynález sc také týká použití léčiva pro léčení protinádorových terapií a diagnózy rakoviny, infekce různých lidských nádorových buněk genovými nosiči tohoto vynálezu bude mít za následek indukci apoptózy v nádorových buňkách a mnohem nižší apoptózu. jestli vůbec nějakou, v normálních diploidních, netransformovaných/ncmalignich buňkách.

Dosavadní stav techniky

In vitro indukovala exprese proteinu apoptinu (VP3), odvozeného od viru kuřecí anémie (CAV), v kuřecích transformovaných buňkách apoptózu (Notebom et al., 1994, Notebom a Koch, 1995).

2o Apoptóza je charakterizována smrštěním buněk, segmentaci jádra, kondenzací a štěpením DNA na fragmenty velikosti domén, u většiny buněk následované intemukleozomální degradaci. Nakonec se apoptotieké buňky rozpadnou na apoptotická tělísky obalená membránou, která jsou ry chle íagoeylována sousedními buňkami. Apoptóza tudíž působí mnohem menší poškození tkáně nežli nekróza, neťýziologieký způsob buněčné smrti (Wyllie et al„ 1980, Arcnds a Wyllie, 1991 a

White, 1996).

Apoptin je malý protein, dlouhý pouze 121 aminokyselin. Je dosti bazický a bohatý na proliti, serin a threonin (Noteborn et al., 1991). V analyzovaných transformovaných kuřecích buňkách, které procházely apoptinem indukovanou apoptózou, byl apoptin umístěn pouze v jádře. Zkrácení

C-tenninálnťho bazického konce apoptinu má za následek sníženou lokalizaci v jádře a významně sníženou apoptotickou aktivitu (Noteborn et al., 1994).

Apoptin a jinc proteiny s apoptinu podobnou aktivitou mohou také indukovat apoptózu v lidských maligních a transformovaných buněčných liniích, ale ne v netransformovaných lidských

3? buněčných liniích. Bylo zjištěno, že k apoptinem indukované apoptóze dochází v nepřítomnosti funkčního p53 (Zhuang et al., 1995a) a že nemůže být blokována Bel-2. BCR-ABL (Zhuang el al., 1995), s Bel 2 spojeným proteinem BAG-1 a proteinem kravských neštovic CmrA (Noteborn. 1996). In vitro není apoptin schopen indukovat programovanou buněčnou smrt u normálních lymfoidníeh, kožních, pokožkových, endotel iáln ich buněk a buněk hladkých svalů. Když io jsou však normální buňky transformovány, stávají se citlivými k apoptóze apoptinem nebo jinými proteiny s aktivitou podobnou apoptinu. Dlouhodobá exprese apoptinu v lidských fibroblastech ukázala, že apoptin nemá v těchto buňkách žádnou toxickou ani transformační aktivitu. V normálních buňkách byl apoptin nalezen převážně v cytoplazmě, zatímco v transformovaných nebo maligních buňkách, např. buňkách charakterizovaných hyperplazií, metaplazií nebo dysplazií, byl umístěn v jádře, což naznačuje, že lokalizace apoptinu je spojena sjeho aktivitou (Danen-Van Oorscbot ct ak. 1997, Noteborn. 1996).

Apoptóza je aktivním a programovaným fyziologickým procesem, který eliminuje nadbytečné, pozměněné nebo maligní buňky (Earnshaw, 1995). Apoptotický proces může být započat řadou regulačních podnětů (Wyllie. 1995 a White, 1996), Změny v přírůstku buněk hrají důležitou roli v lidské patogenezi. např. při vývoji rakoviny, která je způsobena zvýšeným buněčným dělením, ale také sníženým umíráním buněk (Kerr et al., 1994). Bylo prokázáno, že řada chemoterapeutických sloučenin a radiace indukují apoptózu v nádorových buňkách, v mnoha případech přes p53 divokého typu (Thompson, 1995. Bellamy et al., 1995, Stcllcr, 1995).

Q7. 299963 B6

U mnoha nádorů však během jejich vývoji dochází k mutací v p53, což je často spojeno se slabou odezvou na léčbu rakoviny (Hooper. 1994). U několika (Icukemiekých) nádorů je vysoká úroveň exprese protoonkogenu Bel—2 spojena se silnou rezistencí k řadě ehemoterapeutickýeh látek indukujících apoptózu {Hockenberry 1994. Kerr et ak. 1994 a Sachs a Lotem. 1993).

Apoptin sc tudíž může stát potenciálním kandidátem pro ničení nádorových buněk, nebo jiných buněk charakterizovaných hyperplazií, metaplazií či dysplazií, které sc staly rezistentními k (ehemo)terapeutícké indukci apoptózy', vzhledem k nedostatku funkčního p53 a (nad)expresi Bcl-2 a jiných látek inhibujících apoptózu. fakt, že apoptin neindukuje apoptózu v normálních netransformovaných lidských buňkách, alespoň ne in vitro, naznačuje, že toxický účinek apoptinovčho léčení in vivo může být velmi nízký.

Exprese apoptinu v nádorových buňkách je však dosud prováděna za použití přechodné transfekce buněk tkáňových kultur. Nevýhodou tohoto způsobu exprese jc velmi nízké procento buněk, které mohou exprimovat apoptin za podmínek in vitro. In vivo budou tyto používané transfekční metody problematické a neúčinné- jestli vůbec možné, a vůbec nepřispějí k účinnému léčení rakoviny.

Adenovirus může být odvozen od lidských adenovirů (Ad), což jsou ncobalené, ikosahedrální

DNA viry. Jejich genom je tvořen lineární, dvouřetězeovou molekulou DNA velikosti asi 36 kb, která nese koncové obrácené repetice (ilorvitz, 1990). Serotvpy, které byly použity pro přípravu vektoru (Ad2 a Ad5) nejsou spojeny se silnou lidskou patologii (Horvitz, 1990). Virus je extrémně účinný při zaváděni své DNA do buňky hostitele. Ad mohou infikovat velké množství dělících se a nedělících se bunčk z celé řady druhů a virus může být relativně lehce produkován ve velkých množstvích. Na rozdíl od retro virů sc Ad ne integrují do genomu hostitele. Všechny v současnosti používané rAdV mají deleci v úseku El, kam může být vkládána nová DNA. Tato El delece učiní rekombinantní virus defektní ve schopnosti replikace (Stratford-Perricauder a Perricaudet, 1991). Toto na jedné straně poskytuje důležitý bezpečnostní prvek: rAdV se nemůže replikovat v lidských buňkách v nepřítomnosti El A proteinů. rAdV může ledy dopravit svoji genetickou informaci do lidské buňky, ale následkem tohoto nebude lytická nebo produktivní infekce. Na druhé straně zde vzniká problém s produkcí těchto vektorů, El funkce však nemusí být nutně kódovány samotným vektorem. Mohou být také poskytnuty v trans, ve zvláštních pomocných buňkách, které exprimují El geny. Při infekci nebo transfekci těchto pomocných buněk Ad vektorem sdeletovaným El, budou buněčné proteiny El doplňovat repli35 kaci rAdV. výsledkem čehož bude produkce potomstva rAdV. Ad pomocné buňky musí být lidského původu a musí obsahovat a exprimovat Ad El úsek, např. lidské buňky transformované Ad, jako je buněčná linie 293 (Graham a Prevec, 1991) buněčná linie 911 (Eallaux ct al., 1996) a buněčná linie PER.C6 (Eallaux, 1996).

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká použití adenovirového genového nosiče schopného indukovat apoptózu v buňce obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující apoptinu podobnou aktivitu pro přípravu léčiva pro léčení transformovaných buněk, kde apoptóza je indukována v transformovaných buňkách a redukovaná apoptóza se vyskytuje, pokud vůbec, v normálních diploidnich, netransformovaných/nemaligních buňkách, a kde transformované buňky jsou charakterizované hyperplazií, metaplazií nebo dysplazií.

?o Tento vynález se tedy týká použití adenovirového genového nosiče, který umožňuje využití vlastností protinádorovc látky apoptinu nebo jiných proteinů s apoptinu podobnou aktivitou, pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny pomocí genové terapie, nebo pro léčení zhoubností, charakterizovaných hyperplazií, metaplazií nebo dysplazií.

Takovýmto genovým nosičem, který jc nezávisle infekčním vektorem, muže být například virus, lipozom. polymer apod.. který sám může infekcí nebo jakýmkoliv jiným způsobem dopravit genetickou informaci do například nádorových buněk, které mohou být léčeny. Genetická informace obsahuje molekulu nukleové kyseliny, kódující apoptinu podobnou aktivitu. Tento vynález také poskytuje výše uvedené použití genového nosiče, u něhož byla vysoce zvýšena jeho schopnost exprimovat apoptinu podobnou aktivitu. Překvapivě bylo zjištěno, že změna upstream nekódující sekvence nukleové kyseliny, umístěné v rámci iniciačního místa translace, které předchází kódující sekvenci proteinu podobného apoptinu, zesiluje expresi zmíněného proteinu v nádorových buňkách. Tento vynález také poskytuje uvedené použití genového nosiče obsahujícího nukleovou kyselinu, kódující VP2 podobnou aktivitu. Překvapivě bylo zjištěno, že VP2 podobná aktivita působí synergisticky s apoptinu podobnou aktivitou, týkající se indukce apoptózy v nádorových buňkách. Samotný VP2 podobný protein může také působit synergisticky nebo doplňkově například při (chenio)tcrapeutieké indukci apoptózy . Tento vynález také poskytuje uvedené použití genového nosiče, obsahujícího vedle nukleové kyseliny kódující aktivitu podobnou apoptinu také nukleovou kyselinu kódující VP2 podobnou aktivitu. Tento vynález popisuje uvedené použití například genového nosiče, kterým je virus. Tento vynález dále popisuje uvedené použití genového nosiče, kterým je virus, defektní ve schopnosti replikace, který se ale může replikovat v pomocných nebo pakážovacích buňkách, za účelem pomnožení tohoto genového nosiče. Genovým nosičem, poskytnutým tímto vynálezem, mohou být například adenovirové. retrovirové ?o nebo jiné DNA ěi RNA rekombinantní viry. které mohou být použity jako genové nosiče, nebo plazmovirus. lento vynález dále poskytuje genový nosič, který byl dále doplněn specifickým ligandem. směrovací molekulou nebo směrovacími molekulami, pomocí kterých může být tento genový nosič specificky směrován tak, aby dopravil svoji genetickou informaci ke zvolené cílové buňce. Takovouto směrovací molekulou může být například virový adsorpční protein, receptoro25 vá molekula nebo protilátka, reagující s povrchovými receptory' nebo proteiny nádorové buňky.

Tento vynález také popisuje použití genového nosiče pro přípravu farmaceutického prostředku, který může být použit při diagnóze např. rakoviny. Takovýto farmaceutický prostředek může být například použit pro in vitro diagnózu, kdy jsou z člověka nebo zvířete odebrány tkáňové či buněčné vzorky nebo biopsie. Takovéto vzorky mohou být hodnoceny nebo testovány tak. že jsou přímo nebo v kulturách infikovány zmíněným genovým nosičem, který je schopen exprimoval např. apoptinu podobnou aktivitu. Pouze transformované buňky, buňky vykazující různé stupně hyperplazie. dysplazie ěi mctaplazie. nebo nádorové či rakovinné buňky, exprimují protein s apoptinu podobnou aktivitou ve svém jádře. Přítomnost zmíněného proteinu může být například prokázána za použití klasických (imuno)histologiekýeh technik, např. mikroskopicky nebo pomocí automatických technik na třídění buněk. Druhou možností jc využití skutečnosti, že výše infikované buňky jsou charakterizovány apoptózou a mohou tedy být rozpoznány podle známých charakteristik apoptózy'.

•to Tento vynález dále poskytuje nebo popisuje všechny kroky, nutné pro vytvoření rekombinantního, v replikci defektního adenovirů, exprimuj ícího látku indukující apoptózu, apoptin. Vysoké titry rekombinantního-apoptinového adenovirů mohou být produkovány pomocí buněčných linií pakážujících adenoviry. jako jsou 293. 911a PER.C6. V buněčných kulturách nevykazuje apoptin detekovatelně negativní účinky na žádný z nutných kroků replikace adenovirů ani na další části životního cyklu adenovirů. Tento vynález navíc poskytuje vytvoření kontrolního rekombinantního adenovirů. který obsahuje všechny sekvence jako rekombinantní-apoptlnový adenovirus, ale který vzhledem k 3-5' orientaci sekvence kódující apoptin, pod kontrolou regulaěníeh částí promotoru, není schopen exprimovat apoptin. Pomocí tohoto kontrolního adenovirového vektoru mohou být testovány specifické účinky exprese apoptinu rekombinantním adenovirem.

Rekombinantní, v replikaci defektní adenovirus exprimuje apoptin ve vysokých množstvích v různých nádorových a/nebo transformovaných buňkách, výsledkem čehož je indukce apoptózy . Naopak exprese apoptinu. pomocí rekombinantního adenovirů, v normálních, v netransformovaných lidských buňkách nemá za následek apoptinem indukovanou apoptózu.

Tento vynález se obzvláště týká proti nádorové terapie. Léčení nádorů {nádorových buněk) se bude provádět expresí apoptinu, pomocí infikování (nádorových) buněk genovým nosičem, jako je adenovirus, které' obsahuje kódující sekvence pro protein s apoptinu podobnou aktivitou. Tento vynález tudíž poskytuje genový nosič, jako je adenovirus. exprimuj ící apoptin. který je velmi účinnou proti nádorovou látkou. Adenovirová regulace apoptinu neindikuje, nebo alespoň ne detekovatelně. apoptózu v normálních buňkách, což naznačuje, že toxicita léčby rekombinantnimapoptinovým adenovirem in vivo bude nízká. Infekcí rckombinantním-apoptinovým adenovirem může být získáno mnohem vyšší množství (nádorových) buněk exprimuj ících apoptin. Toto zjištění je hlavním vylepšením exprese apoptinu. ve srovnání s transfekci DNA.

Tento vynález se také týká přípravy VP2 expresní jednotky bez syntézy apoptinu a/nebo části apoptinu. Dále jsme poskytli důkaz, že exprese proteinu VP2, z viru kuřecí aiiémie (CAV), zvyšuje apoptózu indukovanou apoptinem v lidských nádorových buňkách. Přesněji. VP2 a apoptin působí synergist icky; co se týká indukce apoptózy v nádorových buňkách, foto zjištění naznaču15 je, že výsledkem koexprese VP2 a apoptinu bude zlepšení terapií, založených na apoptinu.

Tento vy nález poskytuje významné zlepšení exprese apoptinu pomocí změny jeho upstream sekvence přímo od iniciačního kodonu A TG. Vylepšení exprese nevyžaduje záměnu aminokyseliny v apoptinovém proteinu, jak bylo stanoveno Kozákovým pravidlem. Vylepšení upstream sek20 vence od iniciačního kodonu ATG jiných CAV proteinu bude mít také za následek zlepšení jejich syntézy;

Tento vynález se také týká přípravy retrovirových vektorů, které exprirnují apoptin v lidských nádorových buňkách, výsledkem čehož je indukce apoptózy. Tento výsledek u rekombinantního2? apoptinového retroviru v kombinaci s údaji o rckombinantním-apoptinovém adenoviru naznačuje, že exprese apoptinu není toxická pro replikaci DNA ani RNA virů.

Exprese apoptinu v (nádorových) buňkách může být, kromě adenovirovýeh a retrovirových vektorů. prováděna také pomocí infekce jinými DNA a/RNA virovými vektory, které obsahují kódující sekvence pro apoptin. Dále mohou být pro apoptinem indukovanou apoptózu v nádorových buňkách použity vektorové systémy odvozené od vírů. jako jsou plazmoviry.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje schematické znázornění důležitých částí adenovirovýeh adaptorový ch vektorů pMadS a pMab.

Obrázek 2 ukazuje schematické znázornění důležitých částí adenovirovýeh rekombinantních

-to adaptorových vektorů pMab-VP3 a pMab-con.

Obrázek 3 ukazuje apoptinem indukovanou apoptotickou aktivitu v buňkách 911, transfekovaných pMAb-VP3 nebo pCMV-VP3. Pro infekci buněk 911 byly použity dve nezávisle klonované a purifikované dávky DNA pMab-VP3 (pMab-VP3/ml a pMab-VP3/m2). Buňky byly fixovány tři dny po transfekci a byly analyzovány pomocí nepřímé i mu no fluorescence za použití apoptin specifické monoklonální protilátky CV1-CAV 85.1 (85.1; Noteborn et af, 1991). Procento buněk, které byly barveny abnormálně DAP1 je uvedeno jako relativní míra apoptózy;

Obrázek 4 ukazuje apoptinem (nazývaným VP3) indukovanou apoptotickou aktivitu v lidských tumorogenních hepatomových buňkách llepG2, ostcosarkomových buňkách IJ20S a normálních netransformovaných diploidních keralinocytech ESK-1, infikovaných rekoinbinantním-apoplinovým, v replikaci defektním adenovirem Ad.VP3. Buňky byly analyzovány pomocí nepřímé i muno fluorescence za použití monoklonální protilátky a barveny DAPi. Buňky HepG2 a USO2 byly fixovány 1 den po transfekci a buňky ESK-1 byly sklizeny čtyři dny po transfekci. Procento apoptin pozitivních buněk, které byly barveny abnormálně DAPI je uváděno jako míra apoptinem indukované apoptózv (šrafované sloupce). Jako kontrola je zde uvedeno procento nein Ukovaných buněk, které byly DAP1 barveny abnormálně {černé sloupce).

Obrázek 5 ukazuje apoptinem/VP2- indukovanou apoptotickou aktivitu v buňkách Saos-2, trans5 fekovanýeh 2,5 gg pCMV-fs DNA, exprimující apoptin (dříve nazývaný pCMV-VP3; apoptin je nazýván VP3) a 2.5 gg pCMV-ncoBam DNA (Danen-Van Oorschot; 1997). nebo 2.5 gg pCMV-VP2 DNA, exprimující CAV protein 2 (VP2) a 2.5 gg pCMV-neoBam DNA; nebo 2.5 gg pCMV-fs a 2,5 gg pCMV-VP2. výsledkem čehož je exprese apoptinu (VP3) a VP2. Buňky byly fixovány 3. 4 a 5 dní po transfekci a byly analyzovány pomocí nepřímé imunofluorescencc io za použití apoptin—specifické monoklonální protilátky CVI CAV-85.1 (85.1; Noteborn ct al., 1991) nebo monoklonální protilátky CV1-CAV-111.1 (Noteborn a Koch, 1996). Procento buněk, které bvlv barveny abnormálně DAP1 je uvedeno jako relativní míra apoptózv.

Obrázek 6 ukazuje schematické znázornění důležitých částí rekombinantních adenovirových adaptorových vektorů pMab-VP2.

Obrázek 7 ukazuje schematické znázornění důležitých částí rekombinantního retrovirové ho transferového vektoru pLS-VP3 N.

Tento vynález bude dále vysvětlen detailněji na základě následujících příkladů. Tyto jsou pouze ilustrativní a neměly by být vykládány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Experimentální část

Buňky a podmínky buněčné kultivace

Ad5 El transformované buněčné linie lidské embryonální ledviny (HEK; 293) a lidské embryonální sítnice (HER; 91 ] a PER.C6) byly kultivovány na Dulbeccově modifikovaném Eagte médiu (DMEN). doplněném 10% fetálním telecím sérem (ECS) v prostředí 5% CO, při 37 °C. Buněčná linie 293 byla získána od American Type Culture Collection (ATCC C'RL 1573). Buněčné linie 911a PER.C6 byly získány od Eallaux et al., (1996), Buněčná kultivační média, činidla a séra byla zakoupena od GIBCO Laboratories (Grand Island, NY). Kultivační nádoby byly zakoupeny od Greiner (Núrlingen. Německo).

Lidské epidermální keratinocyty byly izolovány z pokožky a byly kultivovány v přítomnosti vrstvy myších 3T3 fibroblastu, které byly smrtelně ozářeny 137-Cs. Primární kultury keratinoeylů (FSK-1) byly založeny na kompletním médiu, jak jest popsáno (Rheinwald a Green, 1975) s menšími úpravami.

Tumorogenní keratinocyty, buňky SCC-15 (Rheiwald a Bcckett. 1981). odvozené od karcinomu squamozních buněk, byly kultivovány na médiu DMEM/E12 (3:1), obsahujícím 5% fetální telecí sérum, 0,4 gg hydrokortisonu a 1 gM izoproterenol. Buňky HepG2 (Aden et af, 1979), odvozené od lidského hepalomu. a buňky US02 a Saos-2 (Diller et af, 1990), odvozené od lidského

5o ostcosarkomu, byty kultivovány na DMEM (GIBCO/BRL), doplněném 10% fetálním telecím sérem. Spontánně transformovaný kmen keratinoeylů HaCat (Boukamp et af, 1988) byl darem od Prof. R. Fuseniga, DKEZ, Heidelberg, Německo. Buňky HaCaT byly kultivovány na DMEM, doplněném 10% fetálním telecím sérem.

Myší buněčné linie byly kultivovány na DM EM s vysokým obsahem glukózy (4,5 gramů na litr) a 10% fetálním telecím scrcm v prostředí 5% CO: při 37 °C. Ekotropní pakážovací buněčná linie

Psi-2 (Mann et al.. (1983) a amfotropní pakážovací buněčná linie PAS 17 byly popsány dříve (Mi!ler. 1990 a,b).

Virové techniky

Plakové pokusy byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve (Eallaux et al., 1996). Stručně, adenovirové zásobní roztoky byly v sériích rozpuštěny ve 2 ml DM EM, obsahujícím 2% koňské lo sérum, a byly přidány k buňkám 911 na 6-jamkových miskách. Po dvou hodinách inkubace při °C bylo médium nahrazeno F-l5 minimálním esenciálním médiem (MEM), obsahujícím

0,85% agarózu (Sigma. USA). 20 mM HEPES (pFI 7,4), 12,3 mM MgCE, 0,0025 % L-glutamin a 2% koňské sérum (teplem inaktivované při 56 °C po dobu 3 min). Produkce adenovirových sérií v malém měřítku byla prováděna tak, jak bylo popsáno dříve (Fallaux el al.. 1996). Stručně, monovrstvy buněk 911 nebo PER.C6 byly infikovány přibližně 5 plak-vytvářejícúni jednotkami (p.f.u.) na buňku, ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCI (PBS), obsahujícím 1% koňské sérum.

Po jedné hodině při pokojové teplotě bylo inokulum nahrazeno čerstvým médiem (DMEM/2% koňské sérum). Po 48 hodinách byly téměř úplné oddělené buňky sklizeny a shromážděny v l ml PBS/1% koňského sera. Virus byl z produkujících buněk izolován 3 cykly rychlého zmrazení/2o rozmražení. Lyzáty byly pročištěny centrifugací při 3000 rpm po dobu 10 min a uloženy při -20 °C.

911 a PER.C6 produkované rADV zásobní roztoky byly testovány na přítomnost replikace schopného adenoviru prováděním PCR analýzy s primery od Ad5 1TR úseku (5 -GGGTGGAG25 TTTGTGACGTG-3) a EIA kódujícího úseku (5-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3), jak bylo popsáno v Notebom a De Boer (1995), za použití přístroje Perkin Elmer PCR aparalus. Přítomnost amplifikovaného fragmentu velikosti 600 bp naznačuje, že v analyzovaném zásobním roztoku existuje replikaceschopný adenovirus (obsahující El úsek) (Hoeben, nepublikované výsledky). Buňky HepG2 byly infikovány sériemi rAdV. Během alespoň 10 dnů byly u buněk sledovány možné cytopatogcnní účinky a byly testovány nepřímou imunofluorescencí, za použití specifického monoklonálního antiséra proti proteinu EIA.

Plazmidy a DNA transfekce

Adaptorový plazmid pMad5 byl vytvořen z pMLPIO (Levrerno et al., 1991) tak, jak je popsáno níže. Plazmid pMLP-10 lin byl odvozen od pMLPIO inzercí syntetického fragmentu DNA s jedinečnými místy pro restrikční endonukleázy Mlul, Spll, SnaBE Spi, Asull a Munl do místa llindlll na pMLPIO. Adenovirový BglI fragment, obsahující nukleotidy 3328 až 8914 genomu Ad5 byl vložen do Munl místa pMLP-lin. Z výsledného plazmidu byl deletován fragment io Sall-BamHI, za účelem inaktivace genu pro tetracyklínovou rezistenci. Výsledný plazmid byl zkontrolován restrikční analýzou a pojmenován jako pMad5. Exprese genů, inzerovaných v mnoh ocelném klonovacím místě, bude řízena adeno víro vým hlavním pozdním promotorem, který jc v tomto uspořádání spojen s adenovirovým enhancercm raného genu I (El).

Všechny CA V DNA sekvence jsou původně odvozeny od plazmidu plc-20H/CAV-EcoRl (Noteborn a Dc Boer, 1990). Expresní plazmid pCMV fs, dříve nazývaný pCMV-VP3 (Notcborn et al.. 1994) obsahuje CAV DNA sekvence, kódující výhradně apoptin (nt 427-868).

Plazmid pCMV-VP2mu (Notcborn. nepublikované výsledky) obsahuje CAV DNA sekvence od

380 do 1512. Tento CAV DNA fragment obsahuje kódující úsek VP2. ohraničený 25 bp 5' nekódující a 484 bp 3'-nekódujíeí CAV DNA sekvencí. 106 bp downstream od start kodonu pro VP2 je v jiném čtecím rámci umístěn start kodon pro apoptin. Pro zamezení syntézy apoptinu bez bránění syntéze VP2 byla do iniciačního kodonu apoptinu zavedena mutace (ATG bylo zaměněno na ACG) a dále byla vytvořena bodová mutace v pozici 549 (T bylo zaměněno za A), výsledkem čehož byl extra stop kodon v genu kódujícím apoptin. Vložená sekvence bude tudíž . a .

exprimovat pouze protein VP2 plné délky. Nepřímou imunofluoresccncí bylo ukázáno, že VP2 mohl být produkován, ale apoptin syntetizován nebyl.

Pro klonování PCR-amplifikovaných DNA fragmentů byl použit plazmid pCR-3.1, který byl ? zakoupen od InVitrogene (Carlsbad, CA). Pro vytvoření rekombinantního, v replikaci defektního retroviru, exprimujícího apoptin. byl použit retrovirový vektor pLXSN (Mi Her. 1900 a.b).

Všechny klonovací kroky s plazmidovou DNA byly v podstatě prováděny podle metod, uvedených v Manniatis et al., (1992).

io

Všechny enzymy byly zakoupeny od Boehringer Mannheim, Německo a/nebo BioLabs, USA.

Plazmidová DNA byla purifikovária centrifugací v gradientu CsCl a kolonovou chromatografií v Sephacrylu S500 (Pharmacia. Uppsala, Švédsko). Lidské buněčné linie HaCAf, HepG2,

SCC-I5, 293. 911 a PER.C6 byly transfekovány plazmidovou DNA pomocí srážení fosforečnanem vápenatým, jak je popsáno v Graham a Van der Eb (1973). Normální lidské diploidní keratinocyty (FSK-1, druhá pasáž), buňky U20S a Saos-2 byly transfekovány pomocí DOTAP (Fischer et al., 1996).

2o Nepřímá imunofluorescenee

Buňky byly fixovány 80% acetonem a byly použity v imunoťluorescenčních pokusech s CAVspecifickými nebo pro adenovirový El A specifickými monoklonálni mi protilátkami a kozími protimyšími a/nebo kozími protíkrálíčími IgC, spojenými s fluoreseeinem (Jackson Immuno25 rcscareh Laboratories lne., West Grove, PA), jak jest popsáno v Noteborn ct al., (1990). Jaderná DNA byla barvena 2.4-diamíno-2-feny lil indolem (DAPI) nebo propidiumiodidem (Pl).

Výsledky a diskuse

Vytvoření adaptorového vektoru pMab

Za účelem zavedení místa pro restrikční enzym BamHI do adaptorového plazmidu pMad5, byl tento plazmid štěpen restrikčním enzymem Clal a byl upraven telecí střevní alkalickou fosfatázou. Clal/BamllI linker byl upraven 14 kinázou, byl ligován sám se sebou za použití

T4-DNA ligázy a následně byl štěpen Clal. Clal/BamHl/Clal linker byl izolován a ligován do linearizovaného vektoru pMad5. Ligačními produkty byl transformován bakteriální kmen JM109. Konečný vektor pMab byl charakterizován štěpením restrikčním i enzymy. Při využití vektoru pMab mohou být cizí geny ligovány do jedinečného BamHI místa pod kontrolu adenovirového hlavního pozdního promotoru. Schematické znázornění pMad5 a pMab je na obrázku 1.

Vytvoření rekombinantního-apoptinového a kontrolního adaptorového vektoru. Za účelem vytvoření adaptorového vektoru pro zavedení apoptinového genu do adenoviru byl pMab štěpen BamHI a následně upraven telecí střevní alkalickou fosfatázou. Poté byl pCMV-fs upraven BamHI a byl izolován 0,45 kb dlouhý fragment DNA, obsahující sekvence kódující apoptin.

Fragment apoptinovc DNA byl ligován do BamHI místa linearizovaného adaptorového vektoru pMab.

Ligační produkty byly klonovány do bakteriálního kmene JMI09. Orientace apoptinu v pMab byla určena pomoeí analýzy restrikčním i enzymy.

pMab konstrukt, obsahující apoptinový gen v 5-3' orientaci pod kontrolou adenovirového hlavního pozdního promotoru bude exprimovat tento apoptinový gen. Tento apoptinový vektor byl nazván pMab-VP3 a bude použit pro přípravu adenovirového vektoru, exprimujícího apoptin. pMab DNA plazmid. obsahující sekvence kódující apoptin v 3'-5' orientaci downstream od ade nevirového hlavního pozdního promotoru, tento apoptinovy gen exprimovat nemůže. Tento adaptorový vektor bude použit pro přípravu kontrolního rckombinantního adenovirového vektoru.

Schematické znázornění obou rekombinantních adaptorových vektoru je na obrázku 2.

Indukce apoptózy CMV plazmidem ve srovnání s rekombinantnírn apoptinovým adaptorovým vektorem, cxprimujícím apoptin

Nejprve jsme vyzkoušeli, zda je pMab-VP3 DNA vektor vskutku schopen exprimovat apoptin ío v transfekovanýeh buňkách, zatímco pMab-con by toho schopen být neměl. Za tímto účelem byly lidské, adenovirem transformované buňky 293 a 911 transfekovány pMab-VP3, pMab-con a pro pozitivní kontrolu také pCMV-VP3. Přibližně dva dny po transfekci byly buňky fixovány a testovány na expresi apoptinu pomocí nepřímé imunofhiorescence. Buněčné kultury', transfekované pCMV VP3 a pMab- VPC obsahovaly asi 1 % buněk, které reagovaly s monoklonální i? protilátkou, specifickou pro apoptin, zatímco buněčné kultury, transfekované pMab-eon je neobsahovaly. Tyto výsledky znamenají, že pMab-VP3 apoptin exprimuje a jak bylo očekáváno, pMab-con jej neexprimuje.

V dalších transfekčních pokusech jsme analyzovali indukci apoptózy v buňkách 911 po trans2() fekei pMab-VP3 ve srovnání s pCMA-VP3. Tři dny po transfekci byly buňky 91 I sklizeny a testovány pomocí nepřímé imunotluorescenee na expresi apoptinu.

Navíc byly tyto buňky barveny DAPl nebo Pl, které barví silně intaktní DNA. ale apoptotiekou DNA barví slabě a/nebo nepravidelně (Telford, 1992).

Přibližně 60 % apoptin pozitivních buněk 911, transfekovanýeh pMab-VP3, bylo apoptotickýeh, kdežto u apoptin-pozitivníeh buněk, transfekovanýeh pCMV-VP3, došlo k apoptóze u asi 40 % z nich. Tyto výsledky naznačují, že pMabVPŠ regulovaná exprese apoptinu má za následek podobnou nebo o něco větší úroveň indukce apoptózy než apoptin, exprimovaný pCMV-VP3.

Výsledky jsou ukázány na obrázku 3. Dále, apoptin je schopen indukovat apoptózu v lidských adenovirem transformovaných buňkách, E1B neinhibuje apoptózu indukovanou apoptinem. EIB je naopak schopen blokovat apoptózu indukovanou celou řadou chemoterapeutickýeh činidel. Tyto výsledky naznačují, že je apoptin velmi účinnou protinádorovou látkou.

Vytvoření rekombinantního-apopti nového adenovirů

Rckombinantní-apoptinovc adenovirové vektory byly vytvořeny kotransfekcí adaptorových plazmidů pMab-VP3, nesoucích kódující sekvence pro apoptin a některé adenovirové sekvence, a plazmidové DNA JMI7, obsahující celou adenovirovou DNA bez úseku El a E3 (McGrory et al., 1988), do pomocné buněčné linie 911. Kotransfekcc byly provedeny s DNA, vysráženou fosforečnanem vápenatým, jakje popsáno v Graham a Van der Eb (1973). Rekombinantní adenovirové DNA je vytvořena homologní rekombinaci mezi homologními virovými sekvencemi, které jsou přítomné v plazmidu pMab-VP3 a v adenovirové DNA v JMI 7.

Podobným způsobem byly provedeny kotransfekce buněk 911 pMab-con a pJM17 DNA, za účelem vytvoření kontrolního adenovirů, který nemůže exprimovat apoptin a který bude použit jako adenovirové kontrola při testování apoptinem indukovaných apoptotickýeh účinků.

Několik hodin po transfekci byly monovrstvy buněk 911 převrstveny vrstvou agarózy a byly

51) inkubovány při 37 °C, dokud nebyly plaky, indukované rekombinantnírn adenovirem, jasně viditelné. Viry byly z plaků sklizeny jako zásobní roztoky PBS-koňského séra. jak je popsáno v Fallaux et al. (1996). Následně byla část zásobních roztoků rekombinantních virů přidána na 24jamkove misky, obsahující čerstvé buňky 911.0 několik dní později byly tylo infikované buňky 911 lyžovány a rekombinantní viry byly sklizeny.

o

C7. 299963 B6

Poté byla testována exprese apoptinu u potenciálních rekombinantních-apopt i nových adenoviru (rAd-VP3) nebo její absence v kontrolních rekombinantních adenovirech (rAd-con). Část zásobních roztoku rekombinantních virů. odvozených z infikovaných 24jamkových misek, byla použita k infekci čerstvých buněk 911, které vyrostly jako monovrstvy na sklem kry tých páscích.

? Po jednom dni byly infikované buňky fixovány acetonem a analyzovány imunofluorescencí za použití pro apoptin-specifické monoklonální protilátky 85.1. Pět z pěli analyzovaných kultur buněk 911, infikovaných údajným rAD-VP3, obsahovalo buňky exprimující apoptin. Žádná z buněk, infikovaných Ad-con. a neinfikovaných buněk 911 nebyla pozitivní na apoptin.

io I yto výsledky znamenají, že při kontransfekci adcnovirových pakážovacích buněčných linií, jako jsou buňky 911, požadovanou adaptorovou a adenovirovou DNA, mohou být vytvořeny životaschopné rAD-VP3. exprimující apoptin.

Dva zásobní roztoky, odvozené od plaků rAd-VP3 a rAD-con byly použity pro purifikaci rAd provedením tří následných plakových purifikaci s buňkami 911 nebo souběžně v pokusu s omezeným zředěním na PER.C6 buňkách, jak je popsáno Fallauxem (1996).

Na základě výše popsaných metod, jejichž výsledkem byla produkce rAd-VP3, exprimuj ícího apoptin pod kontrolou adenovirového hlavního pozdního promotoru, se nám také podařila expre20 se apoptinu pod kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV). I vto výsledky ukazují, že mohou být produkovány různé typy rekombinantních adenoviru, regulujících jedním ze svých nebo heterologních promotorových úseků.

Produkce rAd-VP3 a rAd-con, za použití PER C6 buněk

Produkce sérií rAd-VP2 a rAd-con v malém měřítku, za použití PER.C6 buněk byla provedena tak, jak je popsáno v Fellaux, 1996. Stručně, postup jc popsán v experimentální části.

Pomocí plakových pokusů bylo určeno, že titry' rAd- VP3 a rAd-con byly přibližně 10^{11 12} na ml čistého lyzátu. Získané titry nejsou nižší než titry; pozorované v naší laboratoři pro jiné rAd.

Pomocí PCR a infekce HepG2 rAd VP3 a rAd-con bylo testováno zda vytvořené dávky viru obsahují replikacesehopný adenovirus (viz také experimentální část). rAd-VP3 ani rAd-con neobsahovaly RCA, jak bylo dokázáno oběma metodami,

Vyvodili jsme závěr, že exprese apoptinu za podmínek tkáňové kultury' nezasahuje negativně do žádného / nutných kroků životního cyklu adenoviru. Genová terapie, založená na adenovirovém vektoru, exprimujícím apoptin, je možná.

Vzhledem k expresí anti -apoptotického Ad 5 El proteinu (White, 1996). indukuje apoptin apoptózu optimálně poté, co byl rekombinantní, apoptin exprimující adenovirus produkován ve velkých množstvích. Fakt, že může být adenovirový vektor, exprimující apoptin, produkován v lidských buňkách, transformovaných El proteinem adenoviru typu 5 (Ad 5), jako jsou buňky 293, 911 a PER.C6, naznačuje, že protein El umožňuje tomuto DNA viru množení do vysokých titrů v přítomnosti apoptózu-indukujícího proteinu apoptinu.

Tyto výsledky naznačují, že je také možné vytvořit jiné rekombinantní vektory DNA virů, exprimující apoptin v buněčných liniích, transformovaných proteinem El adenoviru 5. Například rekombinantní parvovirové vektory, založené na 111 nebo MVM parvovirech, mohou býl mno50 ženy v buňkách 291T, které jsou transformované Ad5 El proteinem (Dinsart et al„ 1996).

H-l a MVM parvoviry specificky indukují buněčnou smrt v transformovaných buňkách, ale ne ve všech {Lopez-Guerrcro, 1997). Parvovirové vektory, exprimující apoptin. budou více účinné v indukování nádorově specifické apoptózy než parvoviry jako takové, vzhledem k další nádoss rove specifické indukci apoptózy apoptinem (Dinsart et al., 1996. Danen-Van Oorschot, 1997).

_ o

Protokol pro přípravu rekombinantních-apopt i nových vektorů, založených na Ad5 El proteinem transformovaných buňkách, bude také platit pro RNA viry. jako jsou retroviry.

Indukce apoptózy v lidských transformovaných a/nebo maligních buněčných liniích.

Zkoušeli jsme, zda infekce lidských nádorových buněk rAd-VP3 bude mít za následek apoptinem indukovanou apoptózu. Za tímto účelem byly lidské hepatomové buňky llepG2, osteosarkomové buňky U20S, buňky SCCI5 odvozené od karcinomu squamozních buněk a buňky z buněční né linie spontánně transformovaných keratinocytu HaCat infikovány rAd-VP3. Jeden den po transformaci byly tyto buňky fixovány a byly testovány pomocí imunofluorescence a barvení

DAPI na syntézu apoptinu a to. zda u nich došlo k apoptóze. Již jeden den po infekci byla většina analyzovaných apoptin-pozitivních buněk apoptotická. V neinfíkovaných kulturách bylo apoptotických pouze několik procent lidských nádorových buněk. Výsledky u buněk HepG2 a U20S jsou ukázány na obrázku 4.

Iyto výsledky naznačují, že apoptin exprimovaný rAd-VP3 může indukovat apoptózu v různých savčích maligních a/ncbo transformovaných buněčných liniích.

2o Exprese apoptinu v normálních buňkách, infikovaných rAD-VP3

Za účelem analyzování účinku apoptinu. expriniováného rAd-VP3. v normálních netransformovaných buňkách, byly buňky FSK-l infikovány rAd-VP3. Čtyři dny po transfekci by ly tyto buňky analyzovány pomocí nepřímé imunofluorescence, za použité monoklonální protilátky 85.1 a barvení DAPF Nejvíce 8 % z apoptin-pozitivních buněk vykázalo abnormální DAPI-barvení, což naznačuje, že u nich možná došlo k (apoptinem)-indukované apoptóze. Avšak abnormální DAPI-barvení DNA vykázalo také 7 % buněk, které infikovány nebyly. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4.

so Vzhledem k hepatotropní povaze lidského Ad5 je také důležité zjištění účinků apoptinu v normálních diploidních hepatocyteeh.

Za tímto účelem byly kultivovány izolované krysí hcpatocyty na Williamsově F médiu (Gibeo/Life Technologies. Grand Island, NY. USA) doplněném o inzulín (2mU/ml) a dexamethason b (I nM). Buňky se nechaly růst na kolagenem obalených kultivačních deskách (Micronie).

Původní krysí hepatoeyty byly infikovány adenovirovým vektorem Ad-VP3 exprimujícím apoptin. kontrolním adenovirem exprimujícím FacZ nebo byly infikovány falešně. Dva dny poté byly tyto buňky fixovány a pomocí imunofluorescence a barvení DAPI bylo zjišťováno procento apoptoliekýeh buněk. Nebyl pozorován žádný rozdíl v procentu mrtvých buněk při expresi apoptinu, FacZ ěi u falešně infikovaných buněk, l ato pozorování naznačují, že u (krysích) hepalocytů nedochází k apoptinem indukované apoptóze, i když je apoptin syntetizován pomocí adenovirového vektoru.

Tyto výsledky naznačují, že rAd-VP3 řízená exprese apoptinu nemá za následek apoptinem indukovanou apoptózu v normálních netransformovaných lidských buňkách, na rozdíl od transformovaných/tuniorogenníeh lidských buněk.

Zvýšení syntézy apoptinu

Za účelem testování vlivu sekvencí přímo před ATG-iniciaéním kodonem apoptinu jsme vytvořili dva pCR-3.l-apoptinové konstrukty. pCR VP3-ori obsahuje původní sekvenci (5-TTCAA3) přímo upstream od ATG-ínieíačního kodonu, zatímco druhý konstrukt, pCR-VP3mu obsahuje přímou upstream sekvenci 5-GCCAAC 3. Pomocí in vitro transkripčně/translaěního pokusu na pšeničném zárodku bylo zjištěno, že exprese apoptinu u pCR-VP3mu byla alespoň 5 vyšší než u i n

CZ 299963 Bó pCR-VP3ori. Tyto údaje naznačují, že povaha přímé upstream sekvence u ATG apoptinu ovlivňuje syntézu apoptinu. Vytvoření (virových) vektorů s přímou upstream sekvencí 5

GCCAAC-3 před ATG kodonem apoptinu bude mít za následek vyšší produkci apoptinu a nepřímo zvýší apoptinem indukovanou apoptózu.

Je také důležité zmínit, že aminokyselinový sekvence apoptinu není změněna, což je podle „Kozáková pravidla (Caventer a Suart, 1991) pro zvýšení translační účinnosti považováno za nutné. Podle tohoto pravidla bychom měli změnit nukleotid v pozici +4 z A na G. výsledkem čeho/ by byla jiná aminokyselina apoptinu, což by změnilo jeho aktivitu.

io

Identifikace esenciálních apoptinových fragmentů, obsahujících apoptinovou aktivitu.

Za účelem zjištění, zde je nějaká část apopt i nového proteinu esenciální pro apoptotickou aktivitu, byl vytvořen plazmid, kódující chimérní proteiny, složené z Green-fluoreseence proteinu (GFO,

Rizzuto, 1995) a N-tcrminálních 71 aminokyselin apoptinu (N-apoptin) nebo jeho C-terminálních 50 aminokyselin (C-apoptin). Lidské transformované buňky, jako jsou buňky Saos-2 (Zhuang, 1995), byly přechodně transfekovány plazmidy. exprimu jícími GPF/N-apoptin nebo GPF/C· apoptin. K apoptin-specifické apoptóze došlo pouze u Saos-2 buněk, exprimujících GFP/C-apoptin. Toto zjištění souhlasí s faktem, že C-apoptin (spojený s GFP) může vstoupit do

2o jádra.

Tyto výsledky naznačují, žc pro indukci apoptózy v (lidských) tumorogenních/transformo váných buňkách může být dostačující část apoptinu. Je tudíž možno také vyvinout účinnou (genovou) terapii, založenou na (virových) vektorech, exprimujících pouze tuto část apoptinu. Tyto údaje dále naznačují, že část apoptinu obsahuje apoptotickou aktivitu, když je kovalentnč vázána na cizí protein,

Koexprese VP2 a apoptinu v lidských nádorových buňkách synergisticky zvyšuje indukcí apoptózy.

Za účelem testování vlivu koexprese VP2 a apoptinu na indukci apoptózy byly buňky Saos-2 (ko)transfckovány pCMV-fs, exprimujícím apoptin a/nebo pCMV-VP2, exprimujícím VP2. Tyto buňky byly fixovány acetonem v různých časových intervalech po transfekcí. Pomocí nepřímé imunofluorescence byly monoklonální protilátkou CVI-CAV-111.1 (Noteborn a Koch,

1996) určeny VP2- pozitivní buňky a monoklonální protilátkou CV1-CAV-85.1. byly určeny apoptin-pozitivní buňky. Třetí den po transfekcí došlo k apoptóze pouze u 3 % VP2-exprimuj ících buněk a pouze u asi 10 % apoptin exprimujících buněk. Naopak, apoptotických bylo již asi 40 % Saos-2 buněk, exprimujících VP2 i apoptin. Také čtvrtý den po transfekcí bylo procento V P2/apoptin-pozitivních buněk, u kterých došlo k apoptóze, významně vyšší než u buněk, které

4i) exprimovaly samotný apoptin nebo VP2.

Tyto výsledky ukazují, že VP2 zvyšuje apopt i nem-induko vanou apoptózu a jsou ukázány na obrázku 5.

Vytvoření a produkce rAd VP2

Za účelem vytvoření rekombinantního adenoviru, exprimujícího virový protein 2 (VP2) viru kuřecí anémie. byl připraven adaptorový plazmid pMAb VP2. Z plazmidu pCMV-VP2mu, obsahujícího všechny VP2 kódující sekvence, ale se dvěma mutacemi v úseku kódujícím apoptin (viz experimentální část), byl izolován BamHI fragment velikosti 1,1 kb a byl ligován do adaptorového vektoru pMab, linearizovaného Baml 11 a upraveného telecí střevní alkalickou fosfatázou. Výsledný konstrukt pMab-VP2 byl charakterizován restrikční a sekvenční analýzou a je ukázán na obrázku 6.

_ 1 1 _ rAD-VP2 byl vytvořen kotransfekcí buněk 911 pMab-VP2 DNA a pJM17 DNA. Kotransfekce a všechny další požadované kroky, nutné pro charakterizaci, purifikaci a produkci rAD-VP2.

byly provedeny tak. jak jc popsáno pro rAd-VP3 a rAd-eon. Pomocí nepřímé imunofluoreseence, za použití monoklonální protilátky C VI—CA V—111.1 se ukázalo, že buňky 911 a PLR.C6, infikované rAd-VP2, vskutku mohou exprimovat VP2 protein.

Příprava relrovirovcho vektoru, exprimujícího apoptin

Z účelem vytvoření plazmidu pl -VP3-SN (viz obr. 7) byl Bamlll fragment, nesoucí sekvence ío kódující apoptin. vložen do jedinečného místa Bamlll pLXSN. Správná orientace inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Za účelem ověření neporušenosti inzertu byl plazmid pL-VP3-SN t ran štukován, pomocí techniky koprecípitace fosforečnanem vápenatým, do buněk COS-7 a HepG2. Čtyři dny po transfekci byly buňky fixovány a analyzovány monoklonální protilátkou

85.1 na expresi apoptinového proteinu. V přibližně 1-2 % buněk mohla být exprese apoptinu detekována. U většiny buněk došlo k apoptóze. jak bylo zjištěno barvením DAPI. Tyto údaje ukazují, že proti virový LIR promotor je schopen řídit expresi apoptinu, že jeho gen je v DNA konstruktu intaktní a žc v transfekovaných buňkách HepG2 a COS-7 exprese apoptinu indukuje apoptózu. Za účelem vytvoření virů byl plazmid pL- VP3 SN transfekován do buněk Psi—2 a PA 317 pomocí techniky koprecípitace fosforečnanem vápenatým. Čtyřicet osm hodin po trans20 lekci byl z buněk sklizen supematant a roztoky byly použity k infekci buněk HcpG2 (supernatant PA317) a buněk NIH3T3 (supernatant Psi 2) v přítomnosti 4 pg/ml polybrenu. Čtyři dny po transfekci byly buňky fixovány a analyzovány barvením monoklonální protilátkou 85.1 na expresi apoptinového proteinu. U přibližně 1 % buněk byla zjištěna exprese apoptinu. Většina buněk HepG2 pozitivních na apoptin byla apoptotická. Tyto údaje ukazují, že tylo buňky byly trans25 dukovány L -apoptin-SN retrovirem. Tyto údaje dále dokazují, že jediná kopie pro viru je dostatečná pro expresi dostatečných množství apoptinu pro detekci imunofluorescencí a žc je toto množství dostatečné pro indukci apoptózy v lidských nádorových buněčných liniích, jmenovitě hepatomové buněčné linie HepG2.

3o Dohromady tyto výsledky dokazují, že mohou být vytvořeny retrovirové vektory, nesoucí apoptinový gen, a že mohou býl použity pro indukci apoptózy v lidských nádorových buňkách. Toto formálně dokazuje, že ani apoptinový gen ani jeho exprese nebrání nezbytným krokům v životním cyklu retroviru. Také to dokazuje, že retrovirus obsahující apoptin může být produkován v množstvích, dostatečných pro použití při transdukci lidských nádorových buněk v tkáňových kulturách.

Tyto výsledky dále znamenají, že exprese apoptinu a následně apoptinem indukovaná apoptóza v (lidských) nádorových buňkách bude také možná za využití vektorových systémů, odvozených od (retro)virú, jako je plazmovirus. (Noquiez-Hcllin, 1996). Kritickým místem takovéhoto rekombinantního plazmoviru, exprimujícího apoptin, je to. zda není jeho replikace blokována expresí apoptinu. Poskytli jsme důkaz, že v případě výše popsaného rekombinantního-apoptinového retroviru, znamenajícím úspěšnou produkci rekombinantního-apoptinového plazmoviru, tomu tak vskutku není.

Diagnostické pokusy na rakovinných buňkách rAD-VP3

Buněčné umístění apoptinu je jiné v tumorogenních/transformovaných lidských buňkách ve srovnání s normálními netransformovanými buňkami. Dalším markérem je navíc specifická schopnost apoptinu indukovat apoptózu v tumorogenních/transformovaných buňkách a ne v normaI50 nich buňkách.

Pomocí infekce buněk rAd VP3 a analyzování umístění apoptinu a/nebo indukce apoptózy v těchto buňkách je možno dokázat, zdaje buňka maligní či ne. Původní buňky jsou izolovány z (podezřelých) tkání a jsou pěstovány na požadovaném médiu. Buňky jsou infikovány rAd-VP3.

paralelně srAd-con. a jsou následně analyzovány. Například za použití imunofluorescenčního .17.

pokusu, založeného na monoklonálních protilátkách specifických pro apoptin. 85.1. ll buněk bude prověřováno, zda mají apoptin v cytoplazmě (normální buňky) nebo v jádře (transformované buňky). Navíc nebo místo toho bude stanoveno procento apoptotickýeh buněk. Je-li procento apoptotiekých buněk významně vyšší u buněk infikovaných rAd-VP3 než u buněk infikovaných rAd-con. jsou tyto buňky maligní.

Pokusy, zjišťující toxicitu rekombinantního-apoptinového adenoviru ve zdravých krysách.

V tkáňových kulturách neindukuje apoptin. exprimovaný rekombinantním adenovirem rAd VP3 io v normálních buňkách, např. lidského nebo hlodavěího původu, apoptózu. V pokusu, popsaném níže. jsme zjišťovali, zda exprese apoptinu pomocí rekombinantního adenoviroveho vektoru rAd-VP3 ve zdravých krysách nemá za následek akutní toxicitu.

Použitý vektor rAd-VP3 a kontrolní rAd vektor se nechaly narůst na PER.C6 buňkách a pomocí

PCR analýzy bylo prokázáno, že jsou negativní na přítomnost replíkaceschopného adenoviru (RCA free). rAd byly pur i fi kovány pomocí eentrifugacc v gradientu CsCl.

Samcům Wag/Rij krys (Marian, Nizozemsko), s tělesnou hmotností okolo 200 gramů, byl injikován rekombinantní adenovirus, exprimující apoptin (rAd-VP3, 2,5x10° plak tvořících jednotek.

2d pfu) a kontrolní rekombinantní adenovirus. exprimující genový produkt lueiferázu (rAd-lue, 2,5x10 ). Oba adenovirové vektory byly resuspendovány vc fosfátem pufrováném roztoku Nad, obsahujícím 0,1% hovězí sérový albumin a 10% glycerol (PBS+). Tento roztok bez adenovirového vektoru byl také injikován krysám a slouží jako negativní kontrola. Dvěma krysám byl injikován intra venózně. intraperitoneálně nebo subkutánně buď rAd-VP3, rAd-lue nebo

PBS+suspcnzc.

Makroskopická patologická analýza krys, na kterc bylo působeno Ad-VP3.

Prvním způsobem, jak zjistit možný toxický účinek Ad-VP3-exprimovaného apoptinu, bylo posouzení celkového zdravotního stavu a obzvláště tělesné hmotnosti léčených krys. což bylo prováděno každý den po injekci. Všechny krysy byly během pokusu v dobrém zdravotním stavu. Tělesná hmotnosl se v různých skupinách významně nelišila. Po jednom týdnu přibraly všechny testované krysy, včetně těch, kterým bvl injikován rAd-VP3, na váze, což naznačuje, že žádné z těchto zvířat netrpělo akutní toxicitou, způsobenou léčbou rAd-VP3. Za účelem dalšího potvrzení absence akutní toxicity byla provedena následující měření, Dvě hodiny před utracením byl všem krysám injikován Brdll. Po utracení bylo několik tkání (játra, ledvina, střeva, srdce, plíce, slezina, gonády a penis) přímo testováno patologicky a/ncbo shromážděno pro další histopatologickou analýzu (viz níže).

4o Makroskopická analýza ukázala, že žádná z krys, léčená Ad-VP3. neměla orgány s významnými patologickými projevy.

Testování Ad-VP3 DNA v játrech.

Hlavním cílem vnitrožilně injikovaného (rekombinantního) adenoviru (vektoru) jsou játra a jistém rozsahu i slezina. Jakékoliv toxické projevy apoptinu budou tudíž pozorovány v játrech.

Byla provedena sada pokusů na testování přítomnosti Ad VP3 DNA, exprese apoptinu Ad-VP3 a možných cyt opat o logických projevů v játrech. Nejdříve jsme pomocí Southern blot analýzy

5o zjištovali, zda v den utracení, což znamená 8 dní po injekci, obsahovala DNA. izolovaná z jater krys. léčených Ad-VP3, apoptinovou DNA. Jako negativní kontrola byla souběžně testována DNA z jater krys, kterým byl injikován Ad-luc. Před nanesením DNA na agarózový gel. byla DNA štěpena BarnHI, výsledkem čehož bvl fragment apoptínovc DNA velikosti okolo 0,5 kb. Southern blot byl hybridizován se sondou apoptinové DNA. značenou ²P.

- 13 cz 299963 B6

BamHl fragment apoptinové DNA byl na Southern blotu jasně viditelný v případě DNA, získané l krys. na které bylo působeno Ad-VP3, a jak bylo očekáváno, byl nepřítomen v dráhách obsahujíc ích DNA, izolovanou z krys. na které bylo působeno kontrolním rAd-luc. Za účelem stanovení množství kopií Ad-VP3 v játrech byla na Southern blot souběžné nanesena a hybridizována se značenou sondou apoptinové DNA různá množství apoptinové DNA. Ještě osm dní po vnitrožilní infekci mohlo být zjištěno 0,25 Ad-VP3 kopií na buňku, což naznačuje velmi významnou transdukci Ad-VP3 v játrech.

Exprese apoptinu a jeho toxické projevy v jatém ích buňkách io

Pomocí imunobarvení parafinovaných části jater, na které bylo působeno Ad VP3 nebo kontrolních jater, za použití apoptin-specifických monoklonálních protilátek CVI-CAV-85.1 nebo CVI-CAV-l 11.3. jsme ukázali, že asi 20-30 % jaterníeh buněk, / živočichů, na které bylo působeno Ad-VP3, cxprimovalo apoptin. Části jater kontrolních krys byly na apoptin negativní.

Za účelem testování možných cytotoxických vlivů apoptinu, exprimovaného Ad-VP3, na jaterní buňky, byly provedeny dvč různé metody. Nejdříve by ly části jater krys. na které bylo působeno Ad-VP3, a obou typů kontrolních krys barveny haematoxilin-eosinem (HE). U všech testovaných částí jater nebyly pozorovány žádné morťologické patologické změny, eož naznačuje, že

2o exprese apoptinu není pro jaterní buňky toxická. Škodlivé účinky mohou být sledovány pomocí značení BrdU, které detekuje nově rozdělené jaterní buňky, V případě jater, obsahujících AdVP3. bylo množství BrdU značených jaterníeh bunčk podobného rozsahu (asi 2%) jako u kontrolních krysích jater, na které bylo působeno Ad—hic. Exprese apoptinu jako taková tudíž nemá in vivo žádné významné toxické účinky.

Apoptin nemá žádné akutní toxické účinky v in vivo modelu.

Makroskopická, stejně jako histologická analýza v kombinaci s biochemickými a imunologickými údaji ukázala, že exprese apoptinu nemá žádné (akutní) toxické účinky v in vivo modelu.

3o

Tyto výsledky naznačují, že léčba, založená na expresi apoptinu, za využití genového nosiče nebo jiných metod, nebude mít žádné negativní vedlejší účinky.

Protinádorové studie na modelu lidského hepatomu

Ad-VP3 řízená exprese apoptinu má za následek indukci apoptózy v lidských transformovaných buňkách za podmínek tkáňové kultury'. Například, výsledkem Ad-VP3 řízené exprese apoptinu je apoptóza v buňkách HepG2. odvozených od lidského hepatomu. In vivo proti nádorová aktivita apoptinu (např. exprimovaného Ad-VP3) nebyla doposud testována.

Proto jsme zjišťovali, zda bude mít Ad -VP3 řízená exprese apoptinu za následek protinádorovou aktivitu v in vivo modelu. Za tímto účelem bylo samcům Balb/C/nu/nu myší podkožně ze strany injikováno 1x10° lidských buněk HcpG2. Lidské liepatomové buňky byly inj i kovány každé myši alespoň na dvou nebo třech místech. Tři týdny po injekci se vyvinuly jasné liepatomové nádory.

Byly podkožně zřetelné a měly průměrnou velikost alespoň 5x5 mm.

Do nádorů byly inj i kovány vektor rAd-VP3 a kontrolní vektor rAd eonl. rozpuštěné ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCI, 5% sacharóze a 0.1% hovězím sérovém albuminu. Použitý vektor rAd-VP3, exprimujíeí apoptin. a kontrolní vektor rAd-conl, obsahující apoptinový gen

5o v 3'-5' (obrácené nebo anti-sense) orientaci proti Ad MLP promotoru, se nechaly narůst na PER.C6 buňkách. Pomocí PCR analýzy bylo prokázáno, že jsou oba kmeny rekombinantních adenovirů RCA free. rAd byly purifikovány za použití centrifugace v gradientu CsCl. Do každého nádoru bylo injikováno 7x1 (Č pfu rAd partikul·' ve 40 mikrolitrech suspenze. Oběma typy rAd vektorů bylo léčeno 6 myší se 2 nebo 3 HepG2 nádory'. Jako další kontroly byl skupině

- 14 CZ 299963 B6 nahých myší do nádorů injikován fosfátem pufrovaný roztok NaCl, obsahující 5% sacharózu a 0.1% hovězí sérový albumin (PBS+ skupina).

Apoptin má protinádorový účinek v in vivo modelu.

Za účelem testování možného proti nádorového účinku apoptinu, exprimovaného Ad\'P3. v lidských HcpG2 nádorech, byla během pokusu, který pokračoval 7 dní po injekci rAd-VP3 nebo kontrolní suspenze, měřena velikost podkožních nádorů. PBS+ skupina a skupina, na kterou bylo působeno kontrolním rAd-conl. vykázala průměrné postupné zvětšování velikosti nádorů, na ni rozdíl od skupiny, na kterou bylo působeno rAd-VP3, která vykázala menší velikost nádorů.

Sedm dní po injekci byly nahé myši utraceny. Nádory byly izolovány a makroskopicky zkoumány. Je jasné, že hepatomové nádory, na které bylo působeno kontrolním vektorem rAd-conl nebo PBS+, byly silně vaskularizovanou HepG2-nádorovou tkání a že se po injekci se zvětšily. Úplně jiná situace byla u HcpG2 nádorů, léčených rAd-VP3. Zbytková nádorová hmota se i? objevovala zřídka, vzhledem k snížené vaskularizaci nádorů, Nádory' se po léčení rAd-VP3 zmenšily. Nádory také obsahovaly bílé bub(movité struktury, které jsou náznakem mrtvých buněk. Kromě apoptinem indukované regrese nádorů nebyly pozorovány žádné negativní projevy exprese apoptinu v orgánech (obzvláště byly zkoumány játra a slezina). Apoptin má protinádorovou aktivitu v in vivo systémech.

Závěrem, nádory, na které bylo působeno rAd VP3, vykázaly menší velikost, zatímco kontrolní nádory ne. To znamená, že exprese apoptinu má proli nádorovou aktivitu v in vivo modelu. Fakt, že apoptin. exprimovány Ad-VP3. může indukovat regresi nádorů u rychle rostoucích nádorů, jako jsou HepG2. dokazuje silný protinádorový potenciál apoptinu. Fakt, že apoptin zmenšuje

2? nádorový růst u nahých myší, ukazuje, že nádorové buňky „zabíjí“ exprese apoptinu sama bez dalších imunitních reakcí. Popsané toxicitní a protinádorovc studie dokazují, žc protinádorová léčba, založená na expresi apoptinu, je bezpečná a proveditelná.

ODKAZY

1. Aden, D. P., Fogel. A., Plotkin, S., Damjanov, F. and Knowles, Β, B. (1979). Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma- derived cell line. Nátuře 282, 615-616.

2. Arends, M, J., and Wyllie, A. H. 1991, Apoptosis: mcchanisms and roles in pathology. International review of experimental pathology 32. 223 254.

3. Bellamy, C. O. C„ Malcomson. R. D. G., Harrison, D. J., and Wyllie, A. 1 í. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Sem mars on Cancer Biology 6, 3-12.

4. Boukamp, P„ Petrussevska, R. T„ Breitkreutz, Hornung, J., Markham, A., and Fusenig, R. 1988. Normál keratinazation in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocytc cell line. Journal of Cell Biology 106. 761-771.

5. Cavner, D. R. and Stuart, C. R. (1991). Fukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Research 19, 3185-3192.

6. Danen-Van Oorsehot A. A. A. M., Fischer D., Grimbergen .1. M., Klein B.. Zhuang S.-M.,

Falkenburg J. Π. F.. Baekendorf C., Quax P. ii. A., Van der Eb A. J.. and Noteborn Μ. Η. M.

(1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normál cells. Proeeedings National Acadcmy Sciences. USA. In press.

7. Diller, U. ct ak, (1990). p53 functions as a cell eyele control protein in osteosarcomas.

Molecular Cellular Biology 10, 5772 -5781.

. is CZ 299963 B6

8. Dinsart. C\ Cortielis. J., Rommelaere. J. (1996). Recombinant autonomous parvoviruses: New tools for the gene therapy of cancer? Chimica Oggi/eheniistrv today. September 1996, 32-38,

9. Earnshaw, W. C.. 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current opinion in Cell Biology 7. 337-343.

10. Fallaux, F, (1996). Gene therapy for hemophilia A: Towards the use of adenoviral veetors? to PhD Thesis. Leiden University, The Netherlands.

11. Fallaux F.. Kranenburg. Cramer S. J.. Houweling, A. Van Ormondt. 11., Houben. R. C„ and Van der Fb. A. .1. (1996) Human Gene Therapy 7. 215-222.

lí 12. Fischer. D. F.. Gibbs, S.. Van De Putte, P„ and Backendorí. C. (1996). Molecular Cellular Biology 16, 5365-5374.

13. Graham, F. L. and Prevee, L. (1991). Manipulation of adenovirus veetors. In: Mclhods in Molecular Biology. Volume 7: Gene Transfer and Exprcssion Protols. E. J. Murray, cd.

(The HUmana Press, Clifton. N. J.) pp 109-128.

14. Graham, F. F. and Van der Eb. A. J. (1973). A new techniquc for the assay of infectivily of human adenovirus 5 DNA. Virology 52. 456-467.

15. Hockenberry, D. M. (1994). Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell

Science, Supplement 18, 51-55.

16. Hopper. Μ. I.. (1994). The role of the p53 and Rb-1 gene in cancer. development and apoptosis. Journal ofCell Science. Supplement 18, 13-17.

17. Horwitz, M. S. (1990). Adenoviridac and their rcplication. pp 1679 1740. In Β. N. Eields and D. M. Knipe (Eds): Virology, Raven Press, Ltd, New York.

18. Kerr, J. F. R,. Winteríbrd, C. M.. and Harmon. Β. V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026.

19. Levrero, M., Barban. V.. Manteca, S.. Ballay, S., Balsano, C., Avantaggiati, M. L„ Natolí. G„ Skellekens. Fl., Tiollais. P.. and Perricaudet, M. (1991). Defective and non defective adenovirus veetors for expressing foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.

20. Lopez-Guerro, J. A., Rayet. B.. Tuynder, M., Rommelaere. J., and Dinsart. C. (1997). Constilutive activation of U937 promonocytic cell clones seleeted for their resistance to parvovirus H-l infection. Blood 89. 1642-1653.

21. Maniatis. I.. Fritsch, E. F.. and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: Λ Laboratory

Manual. CSHI. Press, New York, USA.

22. Mann, R.. Mulligan, R. C., and Baltimore, D. (1983). Cell 33. 153 -159.

23. McGrory, W. J., Bautista. D. S., and Graham. F. L. (1988), A simple technique for the rescuc of earlv region I mutations ínto infectious human adenovirus type 5. Virology 163, 614-617.

24. Miller. A. D. (1990a). Progress towards human gene therapy. Blood 76, 271-278.

- 16 CZ 299963 B6

25. Míller. A. D. (1990b). Retrovirus packaging celíš. Human Gene Therapy, 1.5-14.

26. Noguiez-1 lellin. P., Robert-EeMeur, M.. Salzmann, J. L., and Klatzmann. D. (1996). Plasmoviruses: nonviral/viral vectors tór gene therapy. Proe. Nati. Acad. Sci. USA 93.

4175% 180.

27. Noteborn, Μ. Η. M. (1996). PCT application WO 96/41191 Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normál cclls as essential characleristic for the development of a anti-tumor therapy.

II.)

28. Noteborn, Μ. Η. M. and De Boer, G, F. (1995). Patent USA/no. 030, 335.

Noteborn, Μ. I I. M. and Koch, G. (1996). PCT application WO 96/40931 Chicken anemia virus vaccines containing neutrálizing conformational epilope.

29. Noteborn. M. 11. M.. De Boer. G. F., Kant, A.. Koch, G„ Bos. J. L.. Zantema, A., and Van der Eb, A. J. (1990).

Expression of avian leukemia virus env-gp85 in Spodoptera frugiperda cells by use of a bac u lov i rus expression vector. Journal of generál Víro i logy 71, 2641-2648.

30. Noteborn, Μ. Η. M.. De Boer, G. F„ Van Roozelaar, D., Karreman. C„ Kranenburg. O., Vos, J.. Jeurissen, S.. Zantema. A., Hoeben. R., Koch. G.. Van Ormondt, H.. and Van der Eb. A. J. (1991). Charactcrization of cloncd chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cyclc. Journal of Virology 65. 3131 -3139.

31. Noteborn, Μ. Η. M. and Koch G. (1995). Chicken anaemia virus infection: molecular basis of pathogenicity. Avian Pathology 24: 11-31.

so 32. Noteborn. Μ. Η. M., Koch G„ Verschueren C. A. J„ De Gauw H. W. E. M., Vcldkamp S., Van der Eb A. J. (1994). A single anaemia virus protein, apoptin, causes eytopalhogenic effect by inducing apoptosis. In: Proceedings of the International symposium on infectious bursa 1 disease and chicken infectious anaemia (Kaleta EF, ed) pp 376-38U Rauischholzhausen. Germany.

33. Noteborn Μ. Η. M., Todd D., Verschueren C, A. J„ De Gauw H. W. F. M., Curran W. L.,

Vcldkamp S., Douglas A. J., McNulty M. S., Van der Eb A. J., Koch G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J, Virology 68: 346-351.

34. Rheinwald, J. and Beckett, Μ, A. (1980). Dclective terminál differentiation in cultures as

4!) a consistent and selectable character of malignant human keratinocytes. Cell 22« 629-632.

35. Rheinwald, J. G.. and Green, H. (1975). Seriál cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies front single cells. Cell 6, 331 -343,

36. Rizzuto, R. (1995). Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcelíular organels in living cells. Curr, Biol. 5. 635-642.

37. Sachs, L, and Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normál and leukemia cells: New implicalions for therapy. Blood 82, 15-21.

38. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267. 1445 -1449.

39. Stratíórd-Pcrrieaudet, E. and Perricaudet, M. (1991). Gene transfer into aniinals: the promise of adenovirus, pp 51-61. In: O, Cohen-Adenauer and M. Boiron (eds): Human Gene

Transfer. John Eibbev Eurotexl.

- 17 CZ 299963 B6

40. Thompson, C. B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science

267, 1456-1462.

41. White. E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10. 1-15.

42. Wyllie. A. H. (1995). The genetic regulalion of apoptosis. Current opinion in Genetics and Development 5, 97-104.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití adcnovirového genového nosiče schopného indukovat apoptózu v buňce obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující apoptinu podobnou aktivitu pro přípravu léčiva pro léčení transformovaných buněk, kde apoptóza je indukována v transformovaných buňkách a redukovaná apoptóza se vyskytuje, pokud vůbec. v normálních diploidních, netransformovanýeh/nemalig2o nich buňkách, a kde transformované buňky jsou charakterizované hyperplazií, mctaplazií nebo dysplazií.
2. 2. Použití adenovirového genového nosiče schopného indukovat apoptózu v buňce obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující apoptinu podobnou aktivitu pro přípravu diagnostiky pro

   25 diagnózu transformovaných buněk, kde apoptóza je indukována v transformovaných buňkách a redukovaná apoptóza sc vyskytuje, pokud vůbec, v normálních diploidních, netransťonnovaných/nemaligních buňkách, a kde transformované buňky jsou charakterizované hyperplazií, melaplazií nebo dysplazií, so
3. 3. Použití podle nároku 2, při in vitro detekci transformovaných buněk.
4. 4. Použití podle kteréhokoliv nároku 1 až 3, kde adeno virový genový nosič navíc obsahuje modifikované místo iniciace translace přímo od A1Ό—iniciačního kodonu molekuly nukleové kyseliny.
5. 5. Použití podle nároku 4. kde zmíněné místo iniciace translace obsahuje sekvenci nukleové kyseliny GCC AAC.
6. 6. Použití podle některého z nároků l až 5, kde adenovirový genový nosič jc defektní ve schop40 nosti replikace.
7. 7. Použití podle některého z nároků I až 6. kde adenovirový genový nosič navíc obsahuje alespoň jednu směrovací molekulu.

   45 8. Použití podle nároku 7, kde směrovací molekula je reaktivní s povrchovým receptorem nádorové buňky,