KR100528755B1

KR100528755B1 - 세포자멸사 유도 단백질 브이피2 및/또는 아폽틴을 발현시키는 유전자 전달 운반체

Info

Publication number: KR100528755B1
Application number: KR10-1999-7009550A
Authority: KR
Inventors: 마테우스 휴버투스 마리아 노테본; 알렉산드라 마리아 페터슨
Original assignee: 리드 비.브이.
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2005-11-15
Also published as: AU750162B2; BR9808542A; NZ500012A; ATE275200T1; JP2001521387A; KR20010006460A; DE69825978T2; EP0878546A1; SK285724B6; NO994967D0; CA2286165C; AU6856398A; EP0975764A1; CA2286165A1; PT975764E; CZ349399A3; PL196607B1; DE69825978D1; WO1998046760A1; PL336312A1

Abstract

본 발명은 세포자멸사를 유발하는 단백질 VP2 및/또는 아폽틴(VP3)와 같은 활성을 암호화하는 핵산 분자로 이루어진 유전자 전달 운반체에 관한 것이다. VP2와 VP3는 닭 빈혈 바이러스의 바이러스성 단백질 이다. 또한, 본 발명은 항종양 요법에 관한 것이다. 다양한 인간 종양 세포를 본 발명의 유전자 전달 운반체로 감염함으로써, 종양 세포에 세포자멸사가 유발되며, (만일 가능하면) 정상적인 이배성, 비형질전환 세포/비악성 세포에서 세포자멸사가 많이 줄어들 것이다. 또한, 본 발명은 암과 관련된 형태의 과형성, 화생 및 이형성의 진단에 관한 것이다.

Description

세포자멸사 유도 단백질 브이피2 및/또는 아폽틴을 발현시키는 유전자 전달 운반체{A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin}

본 발명은 세포자멸사-유도 단백질 VP2 및/또는 아폽틴(VP3) 유사 활성을 암호화(코드화)하는 핵산 분자들로 구성되어 있는 유전자 전달 운반체에 관한것이다. 또한, 본 발명은 항종양 치료법과 암 진단에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 전달 운반체에 의한 각종 인간 종양세포의 감염은 종양세포에서 세포자멸사를 유도시키며, 적어도 정상적인 이배체, 비형질전환/비악성 세포에서는 세포자멸사를 상당히 감소시킬 것이다.

생체외 시험에서, 닭형질전환 세포에서 닭빈혈 바이러스(CAV)에서 유도된 단백질 아폽틴(VP3)의 발현은 세포자멸사를 유도하였다(Noteborn et al. 1994, Noteborn and Koch, 1995). 세포자멸사는 대개의 세포들 중에서 세포의 수축, 핵의 분열, DNA의 축합 및 DNA의 도메인 크기의 단편으로의 분할, 다음에 핵간 뉴클레오솜의 분해(internucleosomal degradation)에 의해서 특정지어진다. 최종적으로, 세포자멸사 세포들은 막피에 둘러싸인 세포자멸사체로 쪼개지며, 상기 세포자멸사체들은 근접해 있는 세포들에 의해서 급속히 식작용된다. 그러므로, 세포자멸사는 괴사, 즉 비생리학적 유형의 세포사 보다도 조직을 훨씬 적게 파괴시킨다(Wyllie et al., 1980, Arends and Wyllie, 1991 and White, 1996).

아폽틴은 121 개의 아미노산들로 구성된 작은 단백질이고, 다소 알카리성이며, 프롤린, 세린과 트레오닌이 풍부하다(Noteborn et al. 1991). 아폽틴에 의해 유도된 세포자멸사를 겪는 형질전환된 닭세포들을 분석해 보면, 아폽틴은 엄격하게 세포핵내에서만 위치되어 있다. 아폽틴의 C-말단 염기성 신장부분의 절단은 핵위치를 감소시키고, 세포자멸사 활성을 상당히 감소시킨다(Noteborn et al., 1994).

아폽틴과, 아폽틴 유사 활성을 갖는 다른 단백질들도 악성 인간 세포계와 형질전환된 인간 세포계에서 세포자멸사를 유도하지만, 형질전환되지않은 인간 세포계에서는 세포자멸사가 유도되지 않는다. 본 발명자들은 아폽틴 유도 세포자멸사는 기능적 p53 (Zhuang et al., 1995a) 부재하에 일어나며, Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang et al., 1995), Bcl-2-관련 단백질 BAG-1 및 우두단백질 CrmA (Noteborn, 1996)에 의해서 차단될 수 없다고 확증하였다. 생체외 시험에서, 아폽틴은 정상적인 임파, 진피, 표피, 내피와 평활근 세포에서 프로그램된 세포사를 유도하지 못한다. 그러나, 정상적인 세포들이 형질전환되면, 아폽틴 또는 아폽틴과 같은 활성을 갖는 다른 단백질에 의해 세포자멸사되기 쉽다. 정상적인 인간 섬유아세포에서 아폽틴의 장기 발현은 이들 세포에서 아폽틴이 독성이나 형질전환 활성을 갖지 않음을 나타냈다. 정상세포들에서, 아폽틴은 주로 세포질 중에서 발견되었으며, 반면 과형성(hyperplasia), 화생 (metaplaisa) 또는 이형성(dysplasia)에 의해 특징지어지는 형질전환세포 또는 악성세포에서는 아폽틴이 핵안에 위치하였음을 알 수 있다. 이러한 발견은 아폽틴의 배치가 그것의 활성과 연관되어 있다고 볼 수 있다 (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn, 1996).

세포자멸사는 불필요하거나 변질된 세포나 악성세포들을 제거하는 활동성있는 프로그램된 생리적인 과정이다(Earnshaw, 1995). 세포자멸과정은 다양한 조절 자극에 의해 개시된다(Wyllie, 1995 and White, 1996). 세포생존율의 변화는 인간 병원론(예를 들면, 암발생)에 있어서 중요한 역활을 한다. 암발생은 증진된 세포증식과 세포사의 감소에 의해 일어난다(Kerr et al., 1994). 다양한 화학요법 화합물과 방사선이 많은 경우 야생형 p53을 통해 종양세포에 세포자멸사를 유발시킴이 설명되고 있다(Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995).

그러나, 많은 종양은 발달과정에 p53의 돌여변이를 얻게 된다. 이 돌이변이는 가끔 암치료에 약한 반응을 보인다(Hooper, 1994). 몇몇의 (백혈병) 종양에 있어서, 프로토-온코진(proto-oncogene) Bcl-2의 고도의 발현은 다양한 세포자멸사- 유발 화학요법제에 대한 강한 저항력과 관련되어 있다(Hockenberry, 1994, Kerr et al., 1994, and Sachs and Lotem, 1993).

그러므로, 아폽틴은 종양세포, 또는 과형성, 화생 또는 이형성을 특징으로 하는 다른 세포들을 파괴시킬 수 있는 강력한 후보자가 될 수 있다. 기능성 p53의 결여와 Bcl-2 및 기타 세포자멸사 억제제의 (과잉) 발현 때문에, 과형성, 화생 또는 이형성이 특징인 다른 세포들은 세포자멸사의 화학요법적인 유발에 저항력을 가지게 된다. 아폽틴이 적어도 생체외 시험이 아닌, 정상의 비형질전환 인간 세포에 세포자멸사를 유발시키지 않는다는 사실은, 생체내 시험에 있어서 아폽틴 치료의 독성효과가 매우 낮아질 수 있다는 것을 암시해 준다.

그러나, 지금까지 종양세포에서 아폽틴의 발현은 조직배양세포의 일시적인 형질감염에 의하여 이루어졌다. 이 발현방법의 단점은 생체외 시험 상황하에서, 아폽틴을 발현할수 있는 세포들의 백분율이 매우 낮은 것이다. 생체내 시험에서, 사용한 형질감염 방법은 번거롭고, 비효율적이며, 유효한 암치료에 공헌하지 않는다.

아데노바이러스는 비피막성, 정20면체 DNA 바이러스들인 인간 아데노바이러스(Ads)에서 유래되었다. 이 게놈은 반전 말단 반복부(inverted terminal repetitions)를 갖는, 약 36kb의 선형의 이중가닥DNA 분자로 구성되었다(Horvitz, 1990). 벡터 발육에 사용되는 혈청형(AD₂및 AD₅)은 위중한 인간 병리학과 연관이 없다(Horvitz, 1990). 이 바이러스는 그의 DNA를 숙주 세포에 삽입하는데에 매우 효율적이다. Ads는 광범위한 종의 다양한 분할 또는 비분할 세포들을 감염시킬 수 있으며, 상기 바이러스는 비교적 쉽게 다량으로 생산 될 수 있다. 레트로바이러스와는 다르게, Ads는 숙주 세포 게놈에 통합되지 않는다. 현재 사용되는 rAdVs는 E1 영역에 결실을 가지며, 여기서 신규 DNA가 도입될 수 있다. E1 결실은 재조합 바이러스를 복제-결손이 되도록 한다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). 한편으로, 이 결실은 필수적인 안전 특징을 제공한다: rAdV는 E1A 단백질 부재하에 인간 세포에 복제될 수 없다. 그러므로, rAdV는 그의 유전 정보를 인간 세포에 전달할 수 있으나, 이것은 용균감염이나 생성감염을 가져오지 않는다. 다른 한편, 이것은 벡터 생산에 문제를 일으킨다. 그러나, E1 기능이 반드시 벡터 자체에 의하여 코드될 필요는 없다. 그 기능은 E1 유전자를 발현하는 특별한 헬퍼 세포들 같은 trans 세포안에서 제공될 수 있다. 헬퍼 세포를 E1이 삭제된 Ad 벡터로 감염 또는 형질감염시킨 후에, 세포 E1 단백질은 rAdV 복제를 보완하며, 이것은 자손 rAdVs를 생성한다. Ad 헬퍼 세포들은 반드시 인체에서 기원되어야 하고, AdE1 부위를 내포하고 발현하여야 한다. 이 세포들은 세포계 293(Graham and Prevec, 1991), 911세포계 (Fallaux et al., 1996)와 PER. C6 세포계와 같은 Ad-형질전환 인간 세포들이다.

도 1은 아데노바이러스 아답터 벡터 pMad5 및 pMab의 주요 부분들의 도해도이다.

도 2는 재조합 아데노바이러스 아답터 벡터 pMab-VP3 및 pMab-con의 주요 부분들의 도해도이다.

도 3은 pMab-VP3 또는 pCMV-VP3로 형질감염된 911 세포중에서 아폽틴에 의해 유발된 세포자멸사 활성을 나타낸 것이다. 2개의 독립적으로 클로닝되고, 정제된 pMab-VP3 DNA 배치 (pMab-VP3-m1 및 pMab-VP3-m2)는 911 세포의 형질감염에 사용되었다. 상기 세포를 형질감염시킨 후, 3일동안 고정시키고, 아폽틴 특이성 모노클로날 항체 CVI-CAV-85.1 (85,1; Noteborn et al., 1991)를 사용하여 간접 면역형광방법으로 분석했다. 비정상적으로 DAPI로 착색된 세포들의 백분율을 세포자멸사의 상대적인 크기로 제시했다.

도 4는 재조합-아폽틴 복제-결손 아데노바이러스 Ad-VP3로 감염된 인간 종양발생 간암 HepG2 세포, 골육종 U2OS 세포와 정상적이고, 형질전환되지 않은 이배성 FSK-1 케라틴세포의 아폽틴(VP3로 칭함)을 유발하는 활성을 나타낸 것이다. 모노클로날 항체 85.1을 사용하고, DAPI에 의해서 착색한 간접 면역형광방법으로 세포들을 분석했다.

도 5는, 아폽틴을 발현시키는 2.5㎍ pCMV-fs DNA(이전에는 pCMV-VP3로 칭했음; 아폽틴은 VP3로 명명함) 및 2.5㎍ pCMV-neoBam DNA(Danen-Van Oorschot, 1997)로, 또는 CAV 단백질 2(VP2)를 발현시키는 2.5㎍ pCMV-VP2 DNA, 및 2.5㎍의 pCMV-neoBam DNA로, 또는 아폽틴(VP3) 및 VP2 모두의 발현에서 생성되는 2.5㎍ pCMV-fs 및 2.5㎍ pCMV-VP2로 형질감염시킨 Saos-2 세포에서 아폽틴- 및/또는 VP2-유도 세포자멸사 활성을 나타낸 것이다. 세포들을 3일, 4일, 5일 동안 고정시키고, 아폽틴-특히 모로클로날 항체 CVI-CAV-85.1(85.1; Noteborn et al., 1991) 또는 모노클로날 항체 CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch, 1996)을 사용하는 간접 면역형광법으로 분석했다. DAPI로 비정상적으로 착색된 세포의 백분율을 세포자멸사의 상대적인 크기로 제시했다.

도 6은 재조합 아데노바이러스 아답터 벡터 pMab-VP2의 주요 부분들의 도해도이다.

도 7은 재조합 레트로바이러스 트랜스퍼벡터 pLS-VP3-N의 주요 부분들의 도해도이다.

본 발명은 유전자 요법에 의한 암치료나 과형성, 화생 또는 이형성의 특징을 지닌 악성종양 치료를 위하여, 항종양제 아폽틴 또는 아폽틴-유사 활성을 갖는 다른 단백질의 특징을 활용할 수 있는 유전자 전달 운반체를 제공한다. 독립적 감염벡터인 이와 같은 유전자 전달 운반체는, 예를 들면 바이러스, 리포솜, 중합체 등일 수 있으며, 이것은 그 자체가 감염되거나, 아니면 유전정보를 다른방법으로 예를 들면 치료가 가능한 종양세포에 전달할 수 있다. 유전정보는 아폽틴-유사 활성을 암호화하는 핵산 분자로 구성되었다. 또한, 본 발명은 아폽틴-유사 활성을 발현하는 그 능력을 크게 증가 시키는 유전자 전달 운반체를 제공한다. 본 발명자들은, 놀랍게도 아폽틴-유사 단백질 코딩 서열을 선행하는 번역개시 부위에 위치한 상부 비코딩 핵산서열에 변화를 주면, 종양세포중에서 상기 단백질의 발현이 크게 향상됨을 발견했다. 본 발명은 또한 VP2-유사 활성을 암호화하는 핵산으로 구성되는 유전자 전달 운반체를 제공한다. VP2-유사 활성은 놀랍게도 종양세포에서 세포자멸사 유발에 관한 아폽틴-유사 활성과 상승적으로 작용하는 것으로 나타났다. VP2-유사단백질 그 자체도 예를 들면 세포자멸사의 (화학)치료 유발에 상승적으로 또는 부가적으로 작용을 할 수 있다. 또한, 본 발명은 아폽틴-유사 활성을 암호화하는 핵산분자로 구성된 것에 더하여 VP2-유사 활성을 암호화하는 핵산으로 이루어진 유전자 전달 운반체를 공급한다. 본 발명에 의하여, 예를 들면, 본 발명에 따른 유전자 전달 운반체, 즉 바이러스가 제공된다. 부차적으로, 본 발명은 유전자 전달 운반체 (자체)가 복제-결손인 바이러스이지만, 2세대 유전자 전달 운반체를 생성하기 위하여 헬퍼 또는 패키징 세포들에서 복제될 수 있는 바이러스이다. 그러므로, 본 발명에 의하여 제공되는 유전자 전달 운반체는, 예를 들면 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 기타 DNA 또는 RNA 재조합 바이러스일 수 있고, 이들은 전달 운반체 또는 플라스모바이러스로 사용될 수 있다. 부차적으로, 본 발명은 특정한 리간드, 표적분자 또는 표적분자들이 추가로 보충된 유전자 전달 운반체를 제공하며, 이것에 의해 유전자 전달 운반체는 선택된 표적세포에서 그의 유전정보를 특이적으로 전달하기 위해 특이적으로 통제될 수 있다. 이러한 표적 분자는, 예를 들면, 종양세포의 표면 수용체 또는 단백질과 반응성있는 바이러스성 스파이크 단백질, 수용체 분자 또는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 암 진단에 사용될 수 있는 유전자 전달 운반체도 제공한다. 이와 같은 유전자 전달 운반체는 생체외 진단에 사용될 수 있으며, 여기서 조직, 세포 샘플 또는 생검(biopsies)은 인간 또는 동물에서 취한다. 이어서, 이와 같은 샘플을 아폽틴-유사 활성을 발현시킬 수 있는 상기 유전자 전달 운반체로 배양 또는 직접 감염시켜서 평가하거나 시험할 수 있다. 형질전환된 세포, 다양한 단계의 과형성, 화생 또는 이형성의 특징을 나타내는 세포 또는 종양이나 종양 세포들만이 핵 내부에서 아폽틴-유사 활성을 갖는 단백질을 발현한다.

상기 단백질의 존재는 현미경 검사나 자동화된 세포분류 기법과 같은 고전적 (면역) 조직화학 기술로 확인될 수 있다. 다른 방법으로, 상기 감염된 세포는 세포자멸사에 의해 특징되므로 알려진 세포자멸사의 특징을 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포자멸사-유발 아폽틴을 발현하는 재조합, 복제-결손 아데노바이러스를 구성하기 위한 모든 과정들을 제공하거나 설명한다. 재조합- 아폽틴 아데노바이러스의 높은 역가는 293, 911 및 PER.C6 와 같은 아데노바이러스 패키징 세포계에 의해서 생성될 수 있다. 아폽틴은 아데노바이러스의 모든 복제 단계와 세포배양 상태에 있는 다른 아데노바이러스의 라이프 사이클 사상들(events)에 대해서 검출가능한 부정적 효과를 나타내지 않았다.

그 외에, 본 발명은 재조합-아폽틴 아데노바이러스로서 모든 서열을 갖추었지만, 조정프로모터 엘리먼트의 조절하에 아폽틴 암호화 서열의 3'-5' 배향때문에 아폽틴을 발현할 수 없는, 대조 재조합 아데노바이러스의 구성을 설명한다. 이 대조 아데노바이러스 벡터에 의하여, 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴 발현의 특이 효과를 시험할 수 있다.

재조합 복제-결손 아데노바이러스는 세포자멸사를 유발시키는 각종 종양 및/또는 형질전환된 세포에서 많은 양의 아폽틴을 발현시킨다. 이와 반대로, 정상 비형질전환 인간 세포들에서 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴의 발현은 아폽틴-유도 세포자멸사를 유발시키지 않는다.

특히, 본 발명은 항종양 치료법에 관한 것이다. 종양세포의 치료는 아폽틴-유사 활성을 갖는 단백질의 코드 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터와 같은 유전자 전달 운반체로 (종양)세포를 감염시켜서 아폽틴을 발현시켜 행한다. 그러므로, 본 발명은 매우 가능성이 있는 항종양제인 아폽틴을 발현시키는 아데노바이러스와 같은 유전자 전달 운반체를 제공한다. 아폽틴의 아데노바이러스 조절은 정상적인 세포내에서 세포자멸사를 유발하지 않거나 또는 적어도 검출할만한 세포자멸사를 유발시키지 않으며, 재조합 아폽틴 아데노바이러스로 생체내 치료의 독성이 낮을 것이라는 것을 나타낸다. 재조합-아폽틴 아데노바이러스 감염에 의하여, 더 많은 양의 아폽틴-발현 세포들을 얻을 수 있다. 이러한 발견은 DNA 형질감염에 비교하여 아폽틴 발현에 주요한 개선이다.

본 발명은, 또한 아폽틴 및/또는 아폽틴 일부의 합성없이, VP2 발현 유니트를 구성하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 닭 빈혈 바이러스 (CAV) 단백질 VP2의 발현이 인간종양세포에서 아폽틴-유도 세포자멸사를 증대시키는 증거를 제공한다.

더 구체적으로, VP2 와 아폽틴은 종양세포들에서의 세포자멸사 유발에 대해 상승적으로 작용한다. 이러한 발견은 VP2와 아폽틴의 공동-발현이 아폽틴을 근거로한 치료들을 향상시킴을 나타낸다.

본 발명은 ATG-개시 코돈의 디렉트상부 서열의 변경에 의한 아폽틴 발현의 현저한 개선을 설명한다. KOZAK의 규칙에 의해 예언된 것 같이, 발현의 개선은 아폽틴 단백질에 있어서 아미노산 변화를 필요로하지 않는다. 다른 CAV 단백질들의 ATG-개시 코돈의 상부 서열 개선은 또한 상기 단백질 합성을 개선시킬 것이다.

본 발명은, 또한 레트로바이러스성 벡터의 구성에 관한 것으로, 이것은 인간 종양 세포중에서 아폽틴을 발현시켜 세포자멸사를 유발한다. 재조합 아폽틴 아데노바이러스 데이터와 조합한 재조합 아폽틴 레트로바이러스와의 결과는 아폽틴 발현이 DNA 바이러스와 RNA 바이러스 복제에 대하여 독성이 없는 것을 나타내 준다.

(종양)세포들에서 아폽틴 발현은, 또한, 세포들을 아데노바이러스나 레트로바이러스 벡터들 외에, 아폽틴 암호화 서열을 포함하는 다른 DNA 및/또는 RNA 바이러스성 벡터들로 감염시킴으로써 일어날 수 있다. 그 외에, 프라스모바이러스와 같은 바이러스로-유래 벡터 시스템이 종양세포 중에 아폽틴-유발 세포자멸사를 유발시키는데에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하였으며, 이 실험예는 설명의 목적일 뿐, 보호의 범위를 제한하는 것이 아니다.

세포 및 세포 배양 조건

Ad5 E1-형질절환된 인간 배아 신장(HEK; 293)과 인간 배아 망막 (HER; 911 및 PER.C6) 세포계를 37C, 5% CO₂ 대기 중에서 10% 배아 송아지 혈청(FCS) 으로 보충된 둘베코(Dulbecco)의 개질 이글 배지(DMEM) 중에서 성장시켰다. 세포계 293은 아메리칸 타입 미생물 균주 수집물 (ATCC CRL 1573)에서 얻었으며, 세포계 911과 PER.C6은 Fallaux et al., (1996)로 부터 얻었다. 세포 배지, 시약과 혈청은 GIBCO Laboratories (Grand Island, NY)로 부터 구입했으며, 배양 플라스틱들은 Greiner (Nurtingen, Germany) 로부터 구입했다.

인간 표피 케라틴세포 (Keratinocytes)는 포피(包皮)에서 단리시킨 후, 137-Cs로 치명적으로 조사한 마우스 3T3 섬유아세포 층의 존재하에 성장시켰다. 케라틴세포의 일차 배양은 이미 설명된 바와 같이, 최소 변형된 완전 배지 중에서 시작했다(Rheinwald and Green, 1975).

비늘모양의 세포암에서 유래된 SCC-15 세포들과 같은 종양발생적 케라틴세포들(Rheinwald and Beckett, 1981)을 5% 태아 송아지 혈청, 0.4㎍ 하이드로코티존과 1㎛ 이소프로테레놀을 함유하는 DMEM/F12 (3:1) 배지중에서 배양하였다. 인간 간암에서 유래된 HepG2 세포들(Aden et al., 1979)과 인간 골육종에서 유래된 U2OS와 Saos-2 세포들(Diller et al., 1990)을 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 DMEM (GIBCO/BRL) 배지 중에서 성장시켰다. 자발적으로 형질전환된 케라틴세포 균주 HaCAT (Boukamp et al., 1988)는 Dr. R. Fusenig, DFKZ, Heidelberg, Germany, 가 제공한 것이다. HaCAT 세포들을 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지중에서 성장시켰다.

쥐 (Murine) 세포계들은 37℃, 5% CO₂ 대기 중에서 높은 농도의 글루코오스(4.5 g/l)와 10% 태아 송아지 혈청으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지 중에서 배양하였다. 자기지향성 패키징 세포계 Psi-2 (Mann et al., 1983) 와 양쪽양자성 패키징 세포계 PA317은 앞에서 설명되었다(Miller, 1990 a, b).

바이러스 기법

플라크(plaque) 분석을 앞에서 기술한 바와 같이 수행하였다(Fallaux et al., 1996). 간단히 말하자면, 아데노바이러스 균주들을 2% 말 혈청을 함유하는 DMEM 2㎖에 연속적으로 희석한 후, 6-웰 플레이트에 있는 거의 융합된 911 세포계에 첨가했다. 37℃에서 2시간 동안 배양시킨 후, 배지를 0.85% 아가로오스 (Sigma, U.S.A.), 20mM HEPES (pH 7.4), 12.3 mM MgCl2, 0.0025% L-글루타민과 2% 말 혈청(560℃에서 30분 동안 가열해서 불활성화 했음)을 함유하는 F-15 최소 필수배지(MEM)로 대체시켰다.

아데노바이러스를 상기 설명과 같이 소규모 생산하였다(Fallaux et al., 1996). 간단히 설명하자면, 거의 융합된 911 세포 또는 PER·C6 단층을 1% 말 혈청을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서, 세포당 약 5 플라크 형성 유니트 (p.f.u.s)로 감염시켰다. 실온에서 1시간 후, 접종물을 신선한 배지 (DMEM/2% 말 혈청)로 대체했다. 48시간 후, 거의 완전히 고립된 세포들을 회수하고, 1ml PBS/1% 말 혈청중에서 수거하였다. 바이러스는 3회의 순간 냉동/해동 순환과정 끝에 프로듀서 세포들에서 단리했다. 용해질(lysates)을 3000 rpm에서 10분 동안 윈심분리로 제거한 후, -20℃에서 저장하였다. Perkin Elmer PCR 장치를 사용해서 Noteborn 및 De Boer (1995)이 기술한 바와 같이, Ad5 ITR 영역(5_-GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3_)및 E1A 암호화 영역 (5_-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3_)으로 부터 유래된 프라이머로 PCR 분석을 행하여 재조합 적응 아데노바이러스의 존재를 확인하기 위하여 911 및 PER.C6 생산 rAdV 스톡을 스크리닝했다. 600-bp 증폭된 단편의 존재는 복제- 적임(E1-영역 함유) 아데노바이러스가 분석된 바이러스 스톡 (Hoeben, 미공고된 결과)에 존재하거나, 또는 rAdV 배치로 HepG2 세포를 감염시킴으로써 존재하는 것을 나타냈다. 적어도 10일 동안, 상기 세포들은 E1A 단백질에 대한 특이 모노클로날 항혈청을 사용하는 간접 면역형광법에 의하여 잠재적인 세포변성효과를 모니터 하였다.

플라스미드 및 DNA 형질감염

아답터 플라스미드 pMad5는 아래에 기재한 바와 같이, pMLP10 (Levrerno et al., 1991)로부터 제조했다. MluI, SplI, SnaBI, SpI, AsuII와 MunI과 같은 제한효소들의 독특한 부위들을 갖는 합성 DNA 단편을 pMLP10의 HindIII 부위에 삽입함으로써 플라스미드 pMLP-10-lin이 pMLP10에서 유래되었다. Ad5 게놈의 뉴클레오타이드 3328 내지 8914 까지의 아데노바이러스 BglII 단편을 pMLP-lin의 MunI 부위에 삽입했다. 테트라사이클린 저항 유전자를 비활성화시키기 위하여 생성된 플라스미드로 부터 SalI-BamHI 단편을 삭제했다. 생성된 플라스미드를 제한효소 분석에 의해 제어하였고, pMad5라고 명명했다. 복수의 클로닝 부위에 삽입된 유전자의 발현은 아데노바이러스 즉시-초기 유전자 1(E1) 인핸서에 연결된 아데노바이러스 주요 후기 프로모터에 의하여 조종된다.

모든 CAV DNA 서열들은 초기에 플라스미드 pIc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn and De Boer, 1990)로부터 유도되었다. 전에 pCMV-VP3으로 불리어진 발현 플라스미드 pCMV-fs (Noteborn et al., 1994)는 독점적으로 아폽틴만 코드하는 CAV DNA (뉴클리오타이드 427-868) 를 함유한다.

플라스미드 pCMV-VP2mu (Noteborn, 미공고된 결과)는 뉴클레오타이드 380-1512 까지의 CAV DNA 서열들을 함유하고 있다. CAV DNA 단편은 25 bp 5'-비암호화 CAV DNA서열과 484 bp 3'-비암호화 CAV DNA 서열과 접해있는 VP2 코딩 영역을 함유한다. VP2의 개시코돈의 106 bp 하부에서 아폽틴 개시코돈은 다른 리딩 프레임 (reading frame)에 위치해 있다. VP2의 합성을 방해하지 않고 아폽틴의 합성을 방지하기 위해, 아폽틴 개시 코돈 중의 변종(ATG가 ACG로 변함)을 도입하고, 위치 549 (T가 A로 변함)에서 점돌연변이(point-mutation)를 도입해서 유전자 암호화 아폽틴 내에 잉여 정지코돈(extra stopcodon)을 생성했다. 그러므로, 삽입된 CAV 서열은 전체 길이의 VP2 단백질만 발현한다. 아폽틴은 합성이 안되었으나, VP2는 생성될 수 있다는 것을 간접 면역형광법에 의하여 알 수 있었다.

PCR-증폭 DNA 단편의 클로닝을 위하여, 본 발명자들은 In Vitrogen (Carlsbad, CA.)에 구입한 플라스미드 pCR-3.1을 사용하였다. 재조합-아폽틴-복제 결손 레트로바이러스를 제조하기 위하여 레트로바이러스 pLXSN을 사용하였다 (Miller et al., 1992).

플라스미드 DANs로 수행하는 클로닝 단계는 모두 원칙적으로 마니아티스 (Maniatis) 등의 방법 (1992)에 따라서 행하였다.

이 실험에서 사용된 효소들은 모두 독일 뵈링거 만하임 회사(Boehringer Mannheim) 회사 및/또는 미국 바이오랩스(BioLabs) 회사에서 구입했다.

플라스미드 DNA는 CsCl 구배 원심분리와 세파크릴 S500-컬럼크로마토그라피를 사용하여 정제하였다(Pharmacia, Uppsala, Sweden). 인간 세포계 HaCAT, HepG2, SCC-15,293,911, 및 PER.C6는 Graham and Van der Eb (1973)에 의하여 설명된 인산칼슘침전법에 의하여 플라스미드 DNA로 형질전환시켰다. 정상적인 인간 이배체 케라틴세포 (FSK-1; 제2 통과), U2OS와 Saos-2 세포들을 DOTAP (Fischer et al., 1996)로 형질전환시켰다.

간접 면역형광 분석법

Noteborn et al. (1990)에 의하여 기술한 바와 같이, 세포들을 80% 아세톤으로 고정시키고, CAV 특이 또는 아데노바이러스 E1A-특이 모노클로날 항체 및 플루오레스세인(fluorescein)(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove PA)으로 컨쥬게이트된 염소 항마우스 및/또는 염소 항토끼 IgC로 면역형광 분석을 행했다. 핵 DNA는 2,4-디아미노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 요오드화 프로피디움(PI)으로 착색했다.

아답터 벡터 pMab의 구성

BamHI 제한효소 부위를 아답터 플라스미드 pMad5 에 도입하기 위하여, 제한효소로 분해하고, 송아지 장 알칼리성 포스파타제로 처리했다. ClaI-BamHI 링커를 T-4키나제로 처리하고, T4-DNA 리가제를 사용하여 결찰하고, 이어서 ClaI 분해에 의하여 결찰했다. ClaI/BamHI/ClaI 링커를 단리시킨 후, 선형화된 pMad5 벡터에 결찰시켰다. 세균 균주 JM109를 결찰 생성물로 형질전환시켰다.

제한효소 분해에 의하여 최종 벡터 pMab를 특징지었다. pMAab 벡터에 의하여, 이종 유전자는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에 유일한 BamHI 부위로 결찰될 수 있다. pMad 5와 pMab의 도해는 도 1에 나타냈다.

재조합 아폽틴 및 대조 아답터 벡터 구성

아폽틴 유전자를 아데노바이러스에 도입하기 위한 아답터 벡터를 구성하기 위하여, pMab를 BamHI로 처리하고 이어서, 송아지 장 포스파타아제로 처리했다. 이어서, pCMV-fs를 BamHI로 처리하고, 아폽틴 암호화 서열을 함유한 0.45 kb DNA 단편을 단리하였다. 아폽틴 DNA 단편을 선형화된 pMab 아답터 벡터의 BamHI 부위에 결찰했다. 결찰 생성물을 세균 균주 JM109에 클로닝했다. pMab 중에서 아폽틴의 배향은 제한효소 분석에 의해서 결정했다.

아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에 5'-3' 배향으로 아폽틴 유전자를 함유한 pMab 구조물은 아폽틴 유전자를 발현한다. 이 아답터 벡터는 pMab-VP3 로 칭하며, 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 생성하는데 사용된다. 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 하부의 3'-5'배향에서 아폽틴을 암호화하는 서열을 함유한 pMab DNA 플라스미드는 아폽틴을 발현시키고, 대조 재조합 아데노바이러스 벡터를 만들기 위하여 사용될 것이다. 두 개의 재조합 아답터 벡터의 도해를 도 2에 나타냈다.

CMV-플라스미드 대 아폽틴-발현 재조합 아폽틴 아답터 벡터에 의한 세포자멸사의 유도

첫째로, 본 발명자들은 pMab-con은 아폽틴의 발현을 못하는 반면, pMab-VP3 DNA 벡터가 형질감염된 세포들 중에서 아폽틴을 발현할 수 있는지 여부를 시험했다. 그렇기 하기 위해서, 인간 아데노바이러스-형질전환된 293과 911 세포를 pMab-VP3과 pMab-con으로 형질감염시키고, 또한 양성 제어로 pCMV-VP3로 상기 세포들을 형질감염시켰다. 형질감염한지 약 2일 후, 세포를 고정하고, 아폽틴의 발현 여부를 간접 면역형광분석으로 검사했다. pCMV-VP3와 pMab-VP3로 형질감염시킨 세포 배양물은 아폽틴 특이 모노클로날 항체와 반응하는 세포 약 1%를 함유하는 반면에, pMab-con DNA로 형질감염시킨 세포 배양물은 상기 세포를 함유하지 않았다. 상기 결과는 pMab-VP3가 아폽틴을 발현하며, 이미 예상한 바와 같이, pMab-con은 아폽틴을 발현하지 못함을 암시해준다.

다른 형질감염 실험에서, 본 발명자들은 pCMV-VP3와 대비하여 pMab-VP3로 형질감염시킨 후, 911 세포중에서 세포자멸사의 유도를 분석했다. 형질감염 3일 후, 911 세포를 수거하고, 아폽틴의 발현 여부를 간접 면역형광법에 의하여 검사했다. 그외에, 세포를 DAPI 또는 PI로 착색했다. 손상되지 않은 DNA는 강하게 착색되지만, 세포자멸사 DNA는 약하게 또는 불규칙하게 착색된다(Telford, 1992).

pMab-VP3로 형질감염된 아폽틴 양성 911 세포 중 약 60%가 세포자멸사임에 반하여, pCMV-VP3로 형질감염된 아폽틴 양성 세포 중 약 40%가 세포자멸사를 당했다.

상기 결과들은 아폽틴의 pMab-VP3 조절 발현은 pCMV-VP3에 의해 발현된 아폽틴보다 비슷하거나 약간 높은 수준의 세포자멸사 유도를 가져오는 것을 나타낸다. 상기 결과를 도 3에 나타냈다.

또한, 아폽틴은 인간 아데노바이러스-형질감염된 세포들 중에서 세포자멸사를 유발시키지만, E1B는 아폽틴이 유발시킨 세포자멸사를 억제하지 않는다. 이와 반대로, E1B는 다양한 화학요법제에 의하여 유발된 세포자멸사를 차단할 수 있다. 이들 결과는 아폽틴이 매우 효능있는 항종양제라는 것을 나타내 준다.

재조합 아폽틴 아데노바이러스의 구성

재조합 아폽틴 아데노바이러스 벡터를, 아폽틴의 암호화 서열과 약간의 아데노바이러스 서열을 유발하는 아답터 플라스미드 pMab-VP3와, E1과 E3 영역(McGrory et al., 1988)을 제외한 전체 아데노바이러스 DNA를 함유하는 플라스미드 DNA JM17의 헬퍼 세포계 911로 공형질감염시켜서 생성했다. 공형질감염물은 Graham과 Van der Eb(1973)에 의해서 기술된 바와 같이, 인산칼슘으로 침전시킨 DNA로 형질감염시켰다. 재조합 아데노바이러스 DNA는 플라스미드 pMab-VP3와 JM17 DNA의 아데노바이러스 DNA중에 존재하는 상동 바이러스성 서열들 사이에서 상동 재조합에 의하여 형성되었다.

비슷한 방법으로, 911 세포의 공형질감염을 pMab-con 및 pJM17 DNA로 행하여 아폽틴을 발현할 수 없는 대조 재조합 아데노바이러스를 생성시키며, 이것은 아폽틴-유도 세포자멸사 효과의 아데노바이러스 대조물로서 사용될 것이다.

형질감염 수 시간 후, 911 세포 단층을 아가로스 덮개층으로 덮고, 재조합 아데노바이러스에 의하여 유도된 플라크 (plaque)가 분명하게 보일때까지 37℃에서 배양했다. 바이러스를 Fallaux et al.(1996)가 기술한 바와 같이, PBS 말 혈청 스톡으로서 플라크에서 수거되었다. 이어서, 재조합-바이러스 스톡의 일부를 새로운 911 세포가 들어 있는 24-웰에 첨가했다. 수일 후, 상기 감염된 911 세포들은 용균되었으며, 재조합 바이러스들은 수거되었다.

다음에, 잠재성 재조합-아폽틴 아데노바이러스(rAd-VP3)에 의한 아폽틴의 발현 또는 대조 재조합 아데노바이러스에 의한 아폽틴 발현의 부재를 검사했다.

감염된 24-웰 플레이트에서 유도된 재조합 바이러스 스톡의 일부를, 유리덮개 슬립상에서 단층으로 성장한 새로운 911 세포를 감염시키기 위하여 사용되었다. 1일 후, 감염된 911 세포를 아세톤으로 고정시키고, 아폽틴-특이 모노클로날 항체 85.1를 이용하여 면역형광법으로 분석했다. 추정의 rAd-VP3로 감염된 5회 분석된 911 세포 배양물 중 5개는 아폽틴을 발현하는 세포를 함유하였다. Ad-con으로 감염된 911 세포는 아폽틴에 대하여 양성이 아니였고, 비감염된 911 세포는 아폽틴에 대하여 양성이였다. 상기 결과는 911 세포와 같은 아데노바이러스 패키징 세포계를 필수 아답터와 아데노바이러스 DNA로 공형질감염 시킨 후, 아폽틴을 발현시키는 생존 가능한 rAd-VP3가 생성될 수 있음을 암시해준다.

rAd-VP3 또는 rAd-con 플라크에서 유도된 2개의 스톡을 911 세포로 3회 연속 플라크 정제방법으로 처리하거나, 또는 Fallaux(1996)에서 기술된 바와 같이, PER.C6를 이용한 제한-희석 분석을 병행하여 rAd를 정제하는데 사용했다.

아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 조절하에, 아폽틴을 발현하는 rAd-VP3를 생성하는 상기 방법에 기초해서, 본 발명자들은 거대세포바이러스 (cytomegalovirus)(CMV) 프로모터의 조절에 의하여 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 얻는데 성공하였다. 이런 결과들은 다양한 유형의 재조합 아데노바이러스가 그 자체 중의 하나 또는 이종 프로모터 엘리먼트에 의한 조절에 의해 생성된다는 것을 나타냈다.

PER.C6 세포 사용에 의한 rAd-VP3및 rAd-con의 생산

Fllaux(1996)에 기재된 바와 같이, PER.C6 세포를 사용해서 rAd-VP3와 rAd-con를 소규모로 생산하였다. 요약해서, 이 과정은 실험예에 기재되었다.

플라크 분석에 의하여, 역가는 용해질을 제거한 rAd-VP3 및 rAd-con 모두에 대해서 약 10^11-12/ml가 되는 것으로 측정되었다. 얻어진 역가는 실험실 내에서 얻은 다른 rAd's의 역가 보다 낮지 않았다.

PCR 분석과 rAd-VP3 및 rAd-con에 의한 HepG2 감염에 의하여 생성된 바이러스 배치에 복제 가능한 아데노바이러스가 들어있는지 여부를 검사했다(실험예 참조). rAd-VP3 및 rAd-con 배치는, 모두 두 가지 방법으로 증명된 바와 같이, RCA가 없었다.

본 발명자들은 아폽틴의 발현이 세포 배양 조건하에서 아데노바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 모두 부정적으로 방해하지 않는다고 결론지었다. 그러므로, 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터에 기초한 유전자 요법이 가능하다.

항-세포자멸사인 Ad5 E1단배질 (White, 1996)의 발현 때문에, 아폽틴은, 재조합 아폽틴 아데노바이러스가 다량으로 생성된 후, 세포자멸사를 최적으로 유발한다. 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터가, 293, 911 및 PER.C6 세포 등의 아데노바이러스 유형 5 (Ad5) E1 단백질로 형질전환시킨 인간세포에서 생산될 수 있다는 사실은, E1 단백질이 이 DNA 바이러스를 세포자멸사-유도 단백질 아폽틴 존재하에서 높은 역가로 복제할 수 있다는 것을 암시해준다.

상기 결과들은, 또한 아데노바이러스 5 E1 단백질로 형질전환시킨 세포계 중에서 아폽틴을 발현하는 다른 재조합 DNA바이러스 벡터를 생성할 수 있다는 것을 암시해준다. 예를 들면, H-1 또는 MVM 파르보바이러스에 기초한 재조합 파르보바이러스 벡터는 Ad 5 E1 단백질(Dinsant et al., 1996)로 형질전환시킨 293T 세포중에서 번식할 수 있다.

H-1 및 MVM 파르보바이러스는 형질전환된 세포중에서 세포사(細胞死)를 특이적으로 유발하지만, 모두 세포사를 유발하지는 않는다.(Lopez-Guerrero, 1997.) 아폽틴을 발현하는 파르보바이러스 벡터는, 아폽틴에 의한 세포자멸사의 추가적인 종양 특이 유도(Dinsart et al., 1996, Danen-Van Oorschot, 1997) 때문에, 파르보바이러스 그 자체 보다 종양 특이 세포자멸사를 유도하는데 더욱 효능이 있을 것이다.

Ad 5 E1 단백질 형질전환된 세포에 기초한 재조합-아폽틴 바이러스 벡터의 생성 프로토콜은 또한 레트로바이러스와 같은 RNA-바이러스종에도 유효하다.

인간 형질전환 세포계 및/또는 악성 세포계 중에서 세포자멸사의 유도

인간 종양세포에 rAd-VP3 감염이 아폽틴에 의한 세포자멸사를 유도하는지를 검사했다. 이 목적을 위해서, 인간 간암 HePG2, 골육종 세포 U2OS, 비늘모양의 세포암에서 유래된 SCC-15 세포와 자발적으로 형질전환된 케라틴 세포계 HaCAT에서 유래된 세포를 rAd-VP3로 감염시켰다. 형질감염 1일후, 세포들을 고정하고, 면역형광법 및 DAPI 착색에 의하여 세포들이 아폽틴을 합성했는지를 검사하고, 또한, 세포들이 세포자멸 과정을 거쳤는지의 여부를 검사했다. 감염 1일 후, 거의 모든 분석된 아폽틴 양성인 인간 세포가 세포자멸사였다. 비감염된 배양물에서는 불과 몇 %의 인간종양 세포가 세포자멸사였다. HePG2와 U2OS 세포의 결과를 도 4에 도시하였다.이들 결과는 rAd-VP3-발현 아폽틴이 다른 포유동물 종양발생 세포계 및/또는 형질감염된 세포계에서 세포자멸사를 유발시킬 수 있는 것을 암시해준다.

rAd-VP3로 감염된 정상적인 세포중에서 아폽틴의 발현

감염된 정상 비형질전환 세포 중에서 rAd-VP3에 의해 발현된 아폽틴의 효능을 분석하기 위해 FSK-1 세포를 rAd-VP3로 감염시켰다. 형질감염 4일후, 세포를 모노클로날항체 85.1과 DAPI 착색물을 사용한 면역형광법에 의하여 분석하였다. 기껏해서 아폽틴-양성 세포의 8%가 DAPI에 비정상 착색을 나타냈으며, 이것은 상기 아폽틴 양성 세포가 (아폽틴)-유도 세포자멸사되었음을 암시해준다. 그러나, 비감염 세포중 7%가 또한 변이 DAPI 착색 DNA 패턴을 가졌다. 이 결과를 도 4에 도시하였다.

전신 전달 후, 인간 Ad5의 간친화성 특성이 주어지면, 정상적인 이배체 간세포에서 아폽틴의 효능을 조사하는 것도 중요하다. 이 목적을 위해서, 단리시킨 래트 간세포들을 인슐린 (2mU/ml)와 덱사메타존 (1nM)을 함유한 윌리암스 E 배지(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.)중에서 배양하였다. 세포들은 콜라겐으로 덮은 배양 슬라이드(Micronic)상에서 생장시켰다.

일차 래트 간세포들을 아폽틴을 발현하는 아데노바이러스 벡터 Ad-VP3, LacZ를 발현하는 개조 아데노바이러스로 감염시키거나 또는 모의 감염시켰다. 2일 이후, 세포들을 고정하고, 면역형광법과 DAPI-착색으로 세포자멸사 백분율을 검사하였다. 아폽틴을 발현하거나, LacZ를 발현하거나 또는 모의 감염세포이든 간에 치사한 세포의 백분률에 있어서 아무런 차이가 없었다. 이러한 관찰은 아폽틴을 아데노바이러스 벡터에 의하여 합성했을 때에, (래트)간세포가 아폽틴-유도 세포자멸사를 일으키지 아니함을 나타내준다.

상기 결과들은 아폽틴의 rAd-VP3 지정 발현이, 형질전환/종양발생 인간 세포와 반대로, 정상적인 비형질전환 인간세포에서 아폽틴-유도 세포자멸사를 초래하지않는 것을 나타낸다.

아폽틴 합성의 증가

아폽틴 ATG-개시 코돈 앞에 있는 디렉트(direct) 서열의 효능을 측정하기 위해 2개의 PCR-3, 1- 아폽틴 구조물을 구성하였다. PCR-VP3ori는 ATG- 코돈의 본래 디렉트 상부 서열 (5_-TTTCAA-3_)을 포함한 반면, PCR-VP3 mu는 디렉트 상부 서열 (5_-GCCAAC-3_)를 함유하고 있다. 생체외 전사와 번역, 밀씨눈 분석 방법으로, PCR-VP3mu의 아폽틴 발현이 PCR-VP3 ori에 의한 아폽틴 발현보다 적어도 5배 이상 많은 것으로 결정되었다.

삭제

상기 자료는 아폽틴-ATG의 디렉트 상부 서열의 특성이 아폽틴의 합성에 영항을 미치는 것을 나타낸다. 아폽틴의 ATG-코돈 앞에 위치한 디렉트 상부 서열 5_-GCCAAC-3_으로 바이러스성 벡터를 구성하면 아폽틴 생성을 많게 해주고, 아폽틴 유도 세포자멸사를 간접적으로 증가시키게 된다.

아폽틴의 아미노산 서열은 "코자크 규칙(Kozak rule)"(Caventer and Stuart, 1991)에 따른 번역효율 증가에 대해서 필요한 것이 되는 것으로 예측한 바와 같이 변경되지 않은 것을 언급하는 것이 또한 중요하다. 이 규칙에 의하면, +4 위치에서 누클레오티드 A를 G로 변경하면, 그의 활성을 변화시킨 아폽틴의 다른 제2 아미노산을 얻게된다.

세포자멸사 활성을 내포하는 필수 아폽틴 단편의 동정

아폽틴 단백질의 일부가 그의 세포자멸사 활성에 필수적인지의 여부를 가리기 위해 녹색 형광 단백질(GFP; Rizzuto, 1995)과 아폽틴의 N-말단 71 아미노산 (N-아폽틴) 또는 그의 C-말단 50 아미노산(C-아폽틴)으로 이루어진 키메라 단백질을 암호화하여 플라스미드를 구성했다. Saos-2세포(Zhuang, 1995)와 같은 형질전환된 인간 세포는 일시적으로 키메라 GFP/N-아폽틴이나 GFP/C-아폽틴으로 형질감염시켰다. GFP/C-아폽틴을 발현하는 Saos-2 세포만이 아폽틴 특이 세포자멸사를 당했다. 이것은 C-아폽틴(GFP에 연결됨)이 핵에 들어갈 수 있다는 사실과 일치한다.

상기 결과들은 아폽틴의 일부가 (인간) 종양발생/형질전환 세포 중에서 세포자멸사를 충분히 유도할 수 있다는 것을 나타내준다. 그러므로, 일부분의 아폽틴만 발현하는 바이러스 벡터에 기초한, 유효한 유전자요법도 개발할 수 있다. 또한, 상기 자료들은 아폽틴의 일부가 외래 단백질과 공유결합했을 때 그의 세포자멸사 활성을 갖게 되는 것을 나타내준다.

인간 종양 세포 중에서 VP2와 아폽틴의 공동발현이 세포자멸사의 유도를 상승적으로 증가시킨다

VP2와 아폽틴의 공발현이 세포자멸사의 유도에 미치는 영향을 검토하기 위하여, Saos-2 세포를 아폽틴을 발현하는 pCMV-fs 및 또는 VP2를 발현하는 pCMV-VP2mu로 공동 형질감염하고, 형질감염 후, 여러 시간 간격으로 세포들을 아세톤으로 고정했다. 간접면역형광법으로, VP2 양성 세포들을 모노클로날 항체인 CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch, 1996.)로 측정하고, 아폽틴 양성 세포들을 모노클로날 항체인 CVI-CAV-85.1으로 측정했다.

형질감염 3일 후, VP2를 발현하는 세포의 3%와 아폽틴을 발현하는 세포의 10%만이 세포자멸사를 당했다. 그 반면, VP2와 아폽틴을 모두 발현하는 Saos-2세포들의 약 40%는 이미 세포자멸적이었다. 형질감염 4일 후, 세포자멸사를 당한 VP2/아폽틴 양성 세포들의 백분율은 아폽틴이나 VP2를 단독으로 발현하는 세포들보다 현저하게 높았다. 상기 결과들은 VP2가 아폽틴에 의해 유도되는 세포자멸사를 증진시키는 것을 나타냈으며, 이 결과들을 도 5에 나타냈다. rAD-VP2의 구성 및 생산 닭 빈혈 바이러스의 바이러스성 단백질 2(VP2)를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 구성하기 위하여, 아답터 플라스미드 PMAb-VP2를 만들었다. 1.1kb BamHI 단편을 VP2 암호화 서열을 내포하는 플라스미드 PCMV-VP2mu로부터 단리시켰으나, 아폽틴 암호화 영역 내에서 2 점돌연변이(2 point mutations)시켰으며(실험부분 참조), BamH1-직선화 및 송아지 장 알칼리성 포스파타제-처리 아답터 벡터 PMab로 결찰시켰다. 최종 구조물 PMab-VP2는 제한효소 및 서열분석에 의해 특징지어졌으며, 그 결과는 도 6에 나타냈다.911 세포들을 PMab-VP2 DNA 및 PJM17 DNA와 공동 형질감염해서 rAD-VP2를 제조했다. rAD의 공동 형질감염과, 특성화, 정제 및 생산에 필요한 기타 모든 필수 단계들을 rAd-VP3 및 rAdcon에 기술한 바와 같이 행했다. 모노클로날 항체 CVI-CAV-111.1을 사용하는 간접 면역 형광법에 의하여, rAd-VP2로 감염된 911 및 PER.C6 세포는 VP2 단백질을 발현시킬 수 있음을 나타내 주었다.

아폽틴을 발현하는 레트로바이러스 벡터의 구성

플라스미드 PL-VP3-SN(도7 참조)을 생성하기 위해, 아폽틴을 암호화하는 서열을 갖는 BamHI 단편을 pLXSN의 독특한 BamHI 부위에 삽입하였다. 제한요소 분석에 의하여 삽입물의 적당한 배향이 확인되었다. 삽입물의 통합성을 시험하기 위하여, 플라스미드 PL-VP3-SN을 인산칼륨 침전기술로 COS-7 및 HepG2 세포 중에서 형질감염하였다. 형질감염 4일 후, 아폽틴 단백질의 발현을 위해 세포들을 고정하고, 모노클로날 항체 85.1로 분석했다. 세포 중 대략 1~2%가 아폽틴 발현이 확인되었다. DAPI 착색처리에 의해 측정된 바와 같이, 대부분의 세포들은 세포자멸사를 당했다. 상기 자료는 프로바이러스성 LTR 프로모터가 아폽틴 단백질의 발현을 가동시킬 수 있으며, 그의 유전자는 DNA 구성물중에서 그대로 있으며, 또한 형질감염된 HepG2와 COS-7 세포 중에서 아폽틴의 발현이 세포자멸사를 유도한다는 것을 나타냈다.

바이러스를 생성시키기 위하여, 인산칼슘 공침전기술로 플라스미드 pL-VP3-SN을 Psi-2 세포와 PA 317에 형질감염하였다. 형질 감염 48시간 후, 세포의 상징액을 수거하고, 희석액을 폴리브렌(polybrene) 4μg/ml 존재하에 HepG2 세포(PA317 상징액)와 NIH3T3(Psi-2 상징액)를 감염하기 위하여 사용했다. 감염 4일 후, 세포들을 고정하고, 모노클로날 항체 85.1로 착색처리하여 아폽틴 발현에 대한 분석을 하였다. 대략 세포의 1%가 아폽틴을 발현한다는 것을 알 수 있었다. 대부분의 아폽틴 양성 HepG2 세포는 세포자멸적이었다. 상기 자료들은 세포들이 L-아폽틴-SN 레트로바이러스로 형질도입되었다는 것을 보여주었다. 그 외에, 프로바이러스의 단일 카피는 충분히 면역형광법에 의해 발견될 수 있을 만큼 충분한 양의 아폽틴 단백질을 발현하며, 이 양은 간암세포계 HepG2와 같은 인간 종양세포계 중에서 세포자멸사를 유도하는데 충분했다.

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상기 자료를 합해 검토하면 아폽틴 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터가 생성될 수 있으며, 인간종양세포에서 세포자멸사를 유발하기 위하여 사용될 수 있는 것을 나타냈다. 아폽틴 유전자도 또는 그의 발현도 레트로바이러스 라이프 사이클의 필수과정(단계)를 방해하지 않는 것이 정식으로 증명되었다. 또한, 아폽틴 함유 레트로바이러스가 조직 배양에서 인간(종양)세포에 형질도입하기 위하여 사용되는 충분한 양으로 배치 방식으로 생산될 수 있는 것이 증명되었다.

더 나아가서, 상기 결과는 인간 종양 세포에서 아폽틴 발현과 그 결과로서 일어나는 아폽틴 유도 세포자멸사도 플라스모바이러스(Noquiez Hellin, 1996)와 같은 레트로바이러스에서 유래된 벡터시스템에 의해 가능한 것을 의미한다. 레트로바이러스 복제가 아폽틴의 발현에 의해 차단되었는지의 여부가 재조합 아폽틴 플라스모바이러스 시스템에게는 중요한 단계다. 상기 재조합 아폽틴 바이러스는 재조합 아폽틴 플라스모바이러스를 성공적으로 생산하지 못했다.

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rAd-VP3에 기초한 암세포에 대한 진단 분석

아폽틴의 세포상의 위치는 정상 비형질전환 세포와 비교하여 종양발생/형질전환 인간세포 중에서 다르다. 또한 다른 마커(marker)는 종양발생/형질전환된 세포에서 세포자멸사를 유발하는 아폽틴의 특이한 능력을 갖지만 정상세포에서는 아니다.

세포를 rAd-VP3로 감염시키고, 아폽틴 위치 및/또는 이들 세포안에서 세포자멸사의 유발을 분석함으로써 세포가 악성인지의 여부를 시험할 수 있다.

일차 세포를 (의심쩍은) 조직에서 단리시킨 후, 필수 배지에서 배양했다. 세포들은 rAd-VP3과 rAd-con으로 병행하여 감염시키고, 이어서 분석했다.

예를 들면, 아폽틴 85.1에 대해 특이한 모노클로날 항체에 기초한 면역형광 분석에 의하여, 아폽틴이 세포질(정상세포)일 경우 또는 핵(형질전환된 세포)일 경우에 있는지 확인할 수 있다. 그외에, 세포자멸사 세포의 백분율이 평가될 것이다. 세포자멸사 세포의 백분율이 rAd-con 감염 세포보다 rAd-VP3에 대해서 상당히 높으면 이들 세포는 악성이 될 것이다.

건강한 래트에서 재조합 아폽틴 아데노바이러스의 독성실험

조직 배양 조건하에서, 정상세포, 예를 들면, 인간 또는 설치류에서 유래된 재조합 아데노바이러스 rAd-VP3에 의해 발현된 아폽틴은 세포자멸사를 유발하지 않는다. 아래에 기재된 실험에서 건강한 래트에서 재조합 아데노바이러스 벡터 rAd-VP3에 의한 아폽틴의 발현이 급성 독성 효과를 가져오는지의 여부를 시험했다.

이 실험에 사용된 rAd-VP3 벡터와 대조 rAd벡터는 PER.C6 세포에서 배양시켰으며, PCR 분석에 의해 재조합-수용 아데노바이러스(RCA-free)에 대해서 음성이 되는 것으로 증명되었다. rAd를 CsCl-구배 원심분리에 의해 정제했다. 체중 약 200g의 수컷 Wag/Rij 래트(Harlan, The Netherlands)에 아폽틴을 발현하는 재조합 아데노바이러스(rAd-VP3, 2.5x10⁹ 프라크 형성성단위(p.f.u))와 유전자 생성물 루시피라제를 발현하는 대조 재조합 아데노바이러스(rAd-luc; 2.5x10⁹)로 감염시켰다. 두 가지의 아데노바이러스 벡터를 0.1% 소혈청 알부민과 10% 글리세롤(PBS+)을 함유하는 인산염 완충 염수중에 재현탁시켰다. 아데노바이러스 벡터가 첨가되지 않은 상기 액을 또한 래트에 주입했으며, 이것은 음성 추가 대조물로서 역할한다. 2마리의 래트에 rAd-VP3, rAd-luc 또는 PBS+ 현탁액을 정맥내, 복강내 또는 피하로 주사했다.

Ad-VP3로 처리된 래트의 육안적 병리학적 분석

Ad-VP3 발현 아폽틴의 중독 효과의 가능성을 검토하기 위한 첫번째 방법은 실험의 대상인 래트들의 일반 건강 상태, 특히 그들의 체중을 측정하는 것이며, 체중 측정은 주사후 매일 행했다. 실험 동안 모든 래트들은 건강상태는 양호하였다. 체중은 여러 군에서 크게 다르지 않았다. 1주일 후, rAd-VP3로 주사한 래트를 포함한 시험한 래트들은 모두 체중이 늘었으며, 이것은 래트들이 rAd-VP3로 처리한 것 때문에 급성 독성을 나타내지 않았다는 것을 나타낸다.

급성 독성 효과가 없다는 것을 더 확립시키기 위하여, 다음과 같은 측정을 행했다. 희생 2시간 전, 모든 래트에 Brdu를 주사했다. 희생 후, 여러 조직들(간, 콩팥, 장, 심장, 폐, 비장, 생식선과 음경)을 병리학적으로 즉시 검사하거나 또는 더 나아가서 조직 병리상의 분석을 위해 수거했다(아래 참조). 육안적 분석은 Ad-VP3로 처리된 래트들의 어느 기관에서도 중요한 병리적 효과(반응)을 나타내지 않았다.

간에서의 Ad-VP3 DNA의 측정

정맥내로 주사한 (재조합) 아데노바이러스(벡터)의 주요 표적은 간과 (다소) 비장이다. 그러므로 아폽틴의 독성 효과가 얼마라도 있으면 간에서 관찰될 것이다.

Ad-VP3 DNA의 존재와 Ad-VP3에 의한 아폽틴 발현과 간에서 세포 병리학적인 효과를 시험하기 위해 패널실험을 행했다. 우선, 본발명자들은 Ad-VP3로 처리된 래트의 간에서 단리된 DNA가 희생시키는 날, 즉 주사 후 8일째에, 아폽틴 DNA를 함유하는지 여부를 가리기 위해 써던 블롯트 분석법(Southern blot analysis)로 검사했다. 음성 대조물로서 Ad-luc로 처리된 래트들의 간에서 단리된 DNA들을 병행하여 검사하였다.

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단리된 DNA를 아가로스겔상에 적재하기 전에, DNA를 BamHI로 소화했고, 이것은 아폽틴 DNA 단편 약 0.5 kbp를 생성하였다. 써던블롯트는 ³²P-표지 아폽틴 DNA 프로브로 교잡했다. 아폽틴 BamHI DNA 단편은 Ad-VP3 처리 동물에서 유래한 DNA의 경우에 써던블롯트에서 분명히 볼 수 있었으며, 예상한 바와 같이 대조 rAd-luc로 처리한 래트의 간에서 단리한 DNA를 함유하는 레인에서는 없었다.

간에 있는 Ad-VP3 전사물의 양을 검사하기 위해 다양한 양의 아폽틴 DNA를 병행하여 써던블롯트에 적재하고, 표지된 아폽틴 DNA 프로브로 교잡했다.

정맥내로 주사한 8일 후에도, 세포당 0.25 Ad-VP3 전사물이 측정 될 수 있었으며, 이것은 간에서 매우 상당한 Ad-VP3의 형질도입을 나타낸다.

간세포에서의 아폽틴 발현과 그의 독성 효과

Ad-VP3로 처리된 간이나 대조군에 대한 파라핀 단편을 아폽틴 특이성 모노클로날 항체 CVI-CAV-85.1 또는 CVI-CAV-111.3로 면역착색한 결과, Ad-VP3로 처리한 동물의 간세포의 약 25~30%가 아폽틴을 발현하였다. 래트 대조군의 간 부분은 아폽틴에 대해서 음성이었다.

Ad-VP3에 의해 발현된 아폽틴의 독성효과가 간세포에 미치는 영향을 검토하기 위해, 2가지 다른 방법을 실행했다. 처음에, 모든 Ad-VP3-로 처리된 래트의 간 부분과 2가지 유형의 대조 동물의 간 부분을 해마톡실린-에오신(haematoxyline-eosin, HE)으로 착색처리하였다.

시험한 모든 간 부분에서는 형태학적이고 병리학적인 변화를 관찰하지 못했으며, 이것은 생체내에 아폽틴 발현이 래트 간 세포에 대해서 독성 효과가 없다는 것을 나타내준다.

새롭게 분할된 간 세포들을 탐지하는 BrdU-표지에 의하여 손상효과를 알 수 있다.

Ad-VP3를 함유한 간의 경우에, BrdU로 표지된 간 세포의 양은 Ad-luc로 처리된 래트의 간의 대략 2% 정도 였다. 그러므로, 아폽틴 발현은 그 자체로 생체 내에서 주목할 만한 독성효과를 갖지 않았다.

생체내 모델 중에서 아폽틴은 급성 독성효과가 없다

생화학 및 면역 자료와 조합해서 육안 및 조직학 분석 모두는 아폽틴의 발현이 생체내 모델에서 급성 독성효과가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과는 유전자 전달 운반체나 또는 다른 방법들을 사용한 아폽틴 발현에 기초한 요법은 제한된 (음성의) 부작용 가질 것이라고 나타내준다.

인간 간암 모델에서 항종양 연구

아폽틴의 Ad-VP3-조정 발현은 조직 세포 배양 조건하에서 형질전환된 인간 세포 중에서 세포자멸사의 유발을 가져온다. 예를 들면, Ad-VP3 구동 아폽틴 발현은 간암 유래 세포 HepG2 중에서 세포자멸사를 유발시킨다. 아직까지 생체 내에서, 아폽틴(예를 들면, Ad-Vp3에 의해 발현된)의 항종양 활성을 검사하지 못했다.

그러므로, Ad-Vp3에 의해 조정된 아폽틴 발현이 생체내 모델에서 항종양 활성을 생성하는지 여부를 측정했다. 이 목적을 위해, 수컷 누드 Balb/C/nu/nu 마우스에 측면 당 (per side) 1x10⁶ 의 인간 세포 HepG2를 피하 주사하였다. 마우스의 적어도 2 내지 3 부분에, 인간 간암 세포를 주사하였다. 접종 3주 후, 피하에 적어도 5x 5 mm의 평균 크기의 분명한 간암 종양들이 자랐다. 5% 수크로오스와 .1% 소혈청알부민을 함유한 인산염완충염수에 현탁시킨 rAd-VP3와 대조 rAd-con1 벡터를 종양 내에 주입하였다.

아폽틴을 발현하는 rAd-VP3 벡터와 Ad MLP 프로모터에 대항하는 3'-5' (리버스 또는 안티센스)배향에서 아폽틴 유전자를 함유하는 대조 벡터 rAd-VP con1을 모두 PER.C6 세포에 성장시켰다. 이 2개의 재조합 아데노바이러스 배치에는 PCR 분석에 의해 RCA가 없는 것을 알았다. rAd 는 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제했다. 종양당 40 마이크로 리터 현탁액의 7x10⁹ pfu- rAd 입자들을 주입했다. 유형 rAd 벡터당 6마리의 마우스를 2 내지 3개의 HepG2 종양으로 처리했다. 부가적인 대조군으로, HepG2를 갖는 4마리의 누드마우스로 되는 군에 5% 수크로스 및 0.1 % 소혈청알부민을 함유하는 이산완충염수(PBS+-그룹)로 종양내로 투입 하였다.

생체내 모델에서 아폽틴은 항종양 효과를 갖는다

인간 HerG2 종양에서 아폽틴을 발현하는 Ad-VP3의 항종양효과를 검사하기 위해, rAd-VP3 및 대조현탁액을 투입한 후 7일까지 계속된 실험기간 동안 피하종양의 크기를 측정했다. PBS+그룹과 대조군 rAd-con1로 처리된 그룹은 모두 HepG2 종양 크기의 평균적인 누진증가를 나타냈다. 이와 반대로, 종양내로 rAd-VP3로 처리한 그룹의 종양 크기는 줄어든 것을 나타냈다. 주입 7일 후, 누드마이스는 희생되었다. 종양을 단리시켜서 육안으로 검사했다. 대조 rAd-con1벡터 또는 PBS+로 처리된 간암 종양들은 심하게 혈관화된 hepG2 종양 조직이 되는 것으로 나타났으며, 처리 후 더욱 커지게 되었다. rAd-VP3로 처리된 HepG2 세포 종양에서는 완전히 다른 패턴을 관찰되었다. 잔류하는 종양 덩어리는 감소된 종양 혈관화 때문에 창백한 외관을 지녔다. rAd-VP3로 처리된 후, 종양의 크기는 감소되었다. 종양은 또한, 죽은 세포를 가리키는 흰 거품와 같은 구조물을 가졌다.

아폽틴에 의해 유발된 종양 퇴행(regression) 외에, 장기(특히, 간과 비장)에 아폽틴 발현의 음성효과가 발견되지 않았다.

생체내의 시스템에서 아폽틴은 항종양 활성을 갖는다

마지막으로, rAd-VP3로 처리된 종양은 축소된 종양을 나타낸 반면에 대조물은 그렇지 않았다. 상기 결과는 아폽틴의 발현이 생체 모델내에서 항종양 활성을 갖는 것을 의미한다. Ad-VP3에 의해 발현된 아폽틴이 HePG2와 같은 빠르게 성장하는 종양에서 종양 퇴행을 유도할 수 있다는 사실은 아폽틴의 강력한 항종양 가능성을 증명해준다. 아폽틴이 누드마우스에서 종양 성장을 감소시킨다는 사실은 아폽틴자체의 발현이 추가적인 면역 반응없이 종양세포를 죽이는 것을 나타내준다.

상기 독성 및 항종양 연구결과 아폽틴의 발현에 기초한 항종양 요법이 안전하고, 실행할 수 있는 것으로 나타났다.

참조문헌

Claims

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아폽틴 활성을 암호화하는 핵산분자를 포함하고 세포자멸사를 유도할 수 있는 유전자 전달 운반체로, 상기 세포자멸사는 종양세포에서 유도되고 정상 이배체, 비-형질전환된/비-악성 세포에서는 만일 일어난다고 하더라도 감소된 세포 자멸사가 일어나고, 상기 핵산 분자의 ATG-개시 코돈의 직상류에 수식된 번역 개시 부위를 포함하고, 여기서 상기 번역 개시 부위는 핵산 서열 GCCAAC를 포함하는 것인 유전자 전달 운반체.
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제 2항에 있어서, 바이러스인 유전자 전달 운반체.
제 8항에 있어서, 복제-결손 바이러스인 유전자 전달 운반체.
제 8항에 있어서, 아데노바이러스인 유전자 전달 운반체.
제 8항에 있어서, 레트로바이러스인 유전자 전달 운반체.
제 2항에 있어서, 종양세포 표면 수용체 또는 단백질과 반응성인, 바이러스성 스파이크 단백질, 수용체 분자 또는 항체와 같은, 하나 이상의 표적 분자를 추가로 포함하는 유전자 전달 운반체.
제 12항에 있어서, 상기 표적 분자가 종양세포 표면 수용체에 반응성인 유전자 전달 운반체.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하는 숙주세포.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하는 헬퍼 세포 또는 패키징 세포.
제 15항에 있어서, HEK;293, HER;911, PER.C6, Psi-2 및 PA317 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하는 암치료용 약제학적 조성물.
제 17항에 있어서, 통상의 화학요법과 조합 치료요법용 조성물.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하는 과형성, 화생, 및 이형성 치료용 약제학적 조성물.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하는 진단용 조성물.
제 2항에 따른 유전자 전달 운반체를 포함하고, 형질전환된 또는 암 세포, 과형성 세포, 화생 세포 또는 이형성 세포의 생체외 검출용 조성물.