KR100241685B1 - 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 임의로 세포에 대한 내화인자로 포접된, 핵산 및 핵산에 친화성이 있는 물질의 복합체를 함유함을 특징으로하여, 고등 진핵 세포를 형질감염시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 엔도솜분해 특성을 갖는 유리 또는 결합 바이러스 또는 바이러스 성분 또는 바이러스성 또는 비-바이러스성 펩티드인 엔도솜분해 물질을 함유한다.

Description

[발명의 명칭]

핵산 복합체를 고등 진핵세포 내로 도입시키기 위한 조성물

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 핵산의 고등 진핵 세포내로의 도입에 관한 것이다.

핵산을 생존 세포에 도입하기위한 효율적인 시스템 특히 유전자 요법이 요구되고 있다. 유전자는 생체내(in vivo)에서 치료학적 효능이 유전자 생성물의 합성을 성취하기 위해서, 예를들어 유전적 결손이 있는 경우 결손 유전자를 대치하기 위한 세포내에 전이시킨다. '통상적'인 유전자 요법은 단일 처치로 지속적인 치료 효과를 성취하는 원리에 기초한 것이다. 그러나, 치료학적 효과는 DNA(또는 RNA)(“유전자 치료제”)를 약물과 같이 한번 또는 필요하다면 반복하여 투여하는 치료 방법이 또한 요구된다. 유전자 요법이 유망한 접근인 것으로 확인된 유전적 원인의 질환의 예로는 혈우병, 베타-지중해빈혈 및 유전적 원인으로 아데노신 데아미나제 효소가 결핍되어 일어나는 증상인 “중증 합병형 면역 결핍”(SCID)이 있다. 다른 가능한 적용으로는 면역 조절로서 체액성 또는 세포내 면역을 분비 단백질 향체 또는 비분비 단백질 항체를 코드화하는 기능적 핵산을 백신 접종에 의하여 투여함으로써 성취된다. 결손 유전자를 코드화하는 핵산, 예를들어 특정 요구에 따라 개별적으로 제조된 형태의 핵산을 투여할 수 잇는 유전적 결함의 다른 예로는 근이영양(디스트로핀 유전자), 낭포성 섬유중(낭포성 섬유중 막간 전도 조절 유전자), 과콜레스테롤혈증(LDL 수용체 유전자)가 있다. 유전자 요법은 또한 호르몬, 성장 인자 또는 세포독성 또는 면역조절 활성을 갖는 단백질이 체내에서 합성되어야 할 경우에도 또한 매우 유용하다.

유전자 요법은 또한 소위 “종양 백신”의 투여에 의한 종양 치료 가능성을 제시한다. 종양 백신은 종양 세포의 면역원성을 증가시키기 위해 종양 세포를 변화시킴으로써 면역 반응을 개시하도록 더 많은 항원성을 부여하거나 사이토킨과 같은 특정 면역 조절 물질을 생성하게 한다. 이것은 세포를 사이토킨, 예를들면 IL-2, IL-4, IFN-감마, TNF-알파를 코드화하는 DNA로 형질감염시킴으로써 성취된다.

현재까지 자가유래(autologous) 종양 세포내로의 유전자 전이는 대부분 레트로바이러스 백터를 통하여 성취되어 왔다.

지금까지 유전자 요법중 핵산 투여에 있어서 가장 진보된 기술은 세포내로 유전자를 전이시키기 위하여 레트로바이러스 시스템을 사용하는 것이다(Wilson et al., 1990, Kasid et al., 1990). 그러나 레트로바이러스의 사용은 적어도 어느 정도는바이러스 감염(내인성 바이러스와의 재조합 또는 헬퍼(helper) 바이러스로의 오염 및 병원성 형태로 연속하여 돌연변이 가능성에 의함) 또는 종양의 형성과 같은 부작용의 위험이 있기 때문에 문제시되고 있다. 게다가 레트로바이러스에 의해 달성된 환자의 체세포의 안정한 형질전환은, 예를 들어 부작용이 발생한다면 치료를 번복하기 어렵기 때문에 모든 경우에 바람직한 것은 아니다. 더욱이 이런 유형의 요법으로는 충분한 세포를 감염시키기에 충분한 높은 역가를 얻기가 어렵다.

치료학적으로 효능의 물질로서 핵산은, 예를들어 특정 유전자 서열을 선택적으로 저해하는 데에 효능이 있는 것으로 입증된 안티센스 RNA 및 DNA 들도, 또한 특정 세포 기능을 저해하기 위하여 사용될 수 있다. 이들의 작용 방식은 이들이 생체내에서 특정 유전자(예를들어 비조절된 종양유전자(deregulated oncogene) 또는 바이러스 유전자)의 발현을 차단하는 치료제로서 사용될 수 있게 해준다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포내로 도입되어 비록 세포내 농도는 낮지만, 특히 핵산의 강한 음전하에 의한 제한된 세포막 흡수로 인하여 세포내부에서 저해 교화를 발휘한다는 것이 이미 밝혀져있다(Zamecnik et al., 1986).

유전자의 선택적 저해에 대한 또다른 접근은 리보자임의 사용이다. 다시말해서 세포내부에서 활성 리보자임은 가능한 최고 농도로 확보되어야 할 필요가 있으며, 이때 제한 인자중의 하나가 세포내부로의 전이이다.

세포내 면역성을 달성하기 위한 유전자 요법의 적용은 바이러스에 대해 보호하는 유전자, 소위 “보호 유전자(protective gene)”, 예를들어 바이러스 단백질을 코드화하는 유전자의 트랜스도미넌트(transdominant) 돌연변이체 또는 소위 RNA 데코이(decoys)를 코드화하는 DNA 분자의 형질도입을 포함한다.

그러므로 세포내에서 DNA를 발현할 수 있는 방법이 요구된다.

핵산의 치료적 사용에 영향을 미치는 제한 인자중의 하나인 생존 세포내로의 전이를 개선하기 위하여 여러 가지 해결책들이 제시되었다.

시험관내(in vitro)에서 포유류 세포의 유전자 형질전환에 대해서는 다양한 기술이 알려져 있으나, 이들을 생체내에서 사용하는 데에는 한계가 있다(이들로는 리포좀, 전기영동, 미세주사(microinjection), 세포 융합, DEAE-덱스트란 또는 인산칼슘 침전법에 의한 DNA 도입이 포함된다).

최근에는 재조합 바이러스 벡터가 개발되어 이들의 선조 바이러스(parent virus)의 효율적인 유입 기전을 사용하여 유전자를 전이시킨다. 이러한 방법은 시험관내 및 생체내에서 고효율의 유전자 전이를 성취하기 위하여 재조합 레트로바이러스 및 아데노바이러스 벡터의 작제물을 사용한다(Becker, 1988). 이들의 효능에도 불구하고, 이들 벡터들은 크기나 전이되는 DNA의 작제면에서 제한이 따른다. 게다가, 이들 물질는 원 바이러스의 생존 바이러스성 유전자 요소가 공전이(co-transfer) 한다는 관점에서 안정성 면에서 위험성을 안고 있다.

이러한 제한을 피하기 위한 다른 유전자 전이 방법이 세포가 거대분자의 전이에 사용는 기전에 기초하여 개발되었다. 이러한 예의하나는 수용체-매개성 세포내함입(endocytosis)이라는 매우 효율적인 경로를 통하여 세포내로 유전자를 전이시키는 것이다(Wu and Wu,1987, Wagner et al., 1990 and EP-Al 0388 758). 이러한 접근에서는 DNA 결합 도메인(domain) 및 세포 표면의 수용체에 대하여 특이성이 있는 도메인을 갖는 양기능의 분자 포접체를 사용한다(Wu and Wu, 1987,Wagner et al., 1990). 만약 인식 도메인이 세포 표면 수용체에 의하여 인식되는 경우, 포접체는 수용체-매개성 세포내 함입 경로에 의하여 내화(internalization)되고 포접체에 결합된 DNA도 또한 전이된다. 이러한 방법을 사용하면 적어도 통상의 방법으로 성취되는 정도의 유전자 전이율을 성취할 수 있다(Zenke et al., 1990).

이러한 시스템을 사용하여 세포내로 전이된 DNA가 발현될 때, 저해 효과가 있는 핵산이 사용될 경우에도 저해효과는 전달 시스템에 의하여 손상을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.

PCT 출원 제 WO 91/17773호는 T-세포에 대하여 특이적 활성을 갖는 핵산을 전이하는 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 T-세포계의 세포 표면 단백질, 예를들어 HIV 바이러스에 의하여 사용되는 수용체인 CD4를 사용한다. 도입시키고자하는 핵산은 단백질-다중양이온 포접체와 복합체를 형성시키며, 이때의 단백질 성분은 CD4와 같이 T-세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 것이고, 이 표면 단백질을 발현시킨 세포는 생성된 단백질-다중양이온/핵산 복합체와 접촉한다. 이러한 시스템에 의하여 세포내로 전달된 DNA를 세포내에서 발현시키는 것은 알려져 있다.

이들 두 발명은 한가지 특징은 이들 모두가 핵산을 세포내로 전이시킬 수 있거나 촉진시키는 특이적 세포 기능을 이용한다는 것이다. 이들 모두의 경우, 유입 기전은 본 발명의 분야에서는 “내화 인자(internalizing factor)”라는 용어의 인자와 관련되어 일어난다. 이 용어는 보다 협의 또는 광의로 세포-유형-특이적 인자로서, 세포 표면에 결합하여 가능하다면, 다른 인자(예를들어 세포 표면 단백질)과 함께 내화되는 인자를 의미한다. (상기 두 발명의 경우, 내화 인자는 트랜스페린 또는 T-세포 표면 항원에 결합하는 단백질, 예를들어 안티-CD4 항체이다). 내화 인자는 핵산에 대한 친화성에 의하여 내화 인자와 핵산간의 결합을 형성하는 다중양이온성 성질의 물질과 포접한다. (이하 이런 종류의 물질을 “핵산 친화성 물질”이라 하거나 DNA와 관련해서는 “DNA 결합 도메인”이라 한다. 포접체의 일부로서 이러한 종류의 물질이 핵산과 내화 인자간에 결합을 형성시킬 경우에는 이하 이것을 “결합 인자”라 한다).

이들 두 발명의 과정에서 핵산의 세포내로의 최적의 유입은 핵산에 대한 포접체의 비율이 내화 인자-다중양이온/핵산 복합체가 대략 전기적중성이 되는 경우에 달성된다. 이러한 관점으로 부터 출발하여, 핵산을 고등 진핵 세포에 도입시키기 위하여 내화 인자-결합 인자/핵산 복합체를 사용하는 방볍이 개발되었다.

핵산의 유입이 내화 인자에 의하여 수행되는 시스템의 효율을 개선하기위한 방법은 문헌에 기재되어 있다(Wagner et al., 1991a). 이 방법에서 세포내로 유입된 핵산의 양은 트랜스페린-다중양이온 포접체가 비공유적으로 결합된 다중양이온에 의하여 치환된 경우에도 감소되지 않으며: 특정한 경우에는 DNA 유입이 상당히 증가하기 조차 한다. DNA/포접체를 최적의 비율로 생성하는 트랜스페린-다중양이노-플라스미드 DNA 복합체를 분자 단계에서 연구한 결과, 이 포접체 존재하에서 플라스미드 DNA 가 약 80 내지 100㎚ 직경의 환상 구조(도우넛과 유사함)로 축합된다는 것이 밝혀졌다.

내화 인자로서 T-세포에 결합된 단백질로 실험한 결과, 유사한 결과가 나왔다.

또한 핵산 친화성 유리 물질의 추가는 또다른 핵산 친화성 물질을 결합 인자로 사용하는 경우에도, 도입 시스템의 효율성이 증가되는 결과를 가져온다.

내화 인자에 의한 세포내 함입을 통하여 고등 진핵세포내로 유입된 복합체(Wagner et al., 1991a)는 내화 인자 및 결합인자의 포접체와 결합된 핵산을 포함한다.

또한, 이 복합체는 가능하다면 결합 인자와 동일할 수 잇는 하나 또는 2 이상의 핵산 친화성 물질을 비공유적인 결합 형태로 함유하여, 포접체에 의해 달성된 핵산의 내화 및/또는 발현이 증가되는데, 이는 일차적으로는 축합 효과에 의한 것으로 보이나 다른 기전에 의한 것일 수도 있다.

이 방법에 의하여 도입된 핵산의 발현율을 증가시킬 수 있으나, 아직도 제한된다. 주어진 상황에서 이 시스템의 실용성은 단지 시스템에 관련된 세포 표면 수용체의 존재에 의해 결정되는 것이 아니라: 이 시스템의 사용과 관련되는 한계는 엔도솜(endosome)에 내화된 포접체-DNA 복합체가 리소좀(lysosome)으로 들어가 효소적으로 분해되는 결과인 것으로 추측된다. 세포 핵에 도달하여 그곳에서 발현되는 핵산의 비율을 증가시키기 위한 시도로서, 리소좀내에서 효소 활성은 저해하는 물질, 소위 리소좀지향성 물질(lysosomatropic substance) 존재하에서 세포를 형질감염시키는 실험이 계획된 대로 본 발명에 선행하는 실험에서 수행되었다. 이 방법을 사용함으로써, 전이된 DNA의 발현 증가는 달성되었으나; 달성된 반응은 사용된 물질에 따라 변동이 심하였으며; 선택된 리소좀성 물질은 유전자 전이를 증가시키는 바면 실제로 다른 것들은 발현을 저해시켰다. 그러므로, 예를들어 DNA의 효율적인 전이는 약염기인 클로로퀸의 존재에 좌우된다는 것이 밝혀졌다(Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990). 클로로퀸에 의해 달성되는 이 효과는 클로로퀸이 리소좀에서 pH를 증가시킨다는 사실에 기인할 수도 있으나, 반드시 그런것만은 아닌데; 많은 실험에 의하여 클로로퀸처럼 pH를 조절할 수 있는 모넨신, 염화 암모늄 또는 메틸아민과 같은 다른 물질들은 클로로퀸을 대체하지 못하며, 어떤 실험에서는 이들 물질중 어떤 것은 저해 효과를 나타낸다는 사실이 밝혀졌다. 또한 다양한 표적 세포들이 리소좀성 활성을 나타내는 동일 물질에 대하여 상이한 반응을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.

핵산 복합체를 사용한 수용체-매개성 세포내 함입에 의해 제시된 바와 같이, 생리학적 경로에 의한 유전자 전이는 주요한 장점(세포막을 통한 통로의 무독성; 세포 기능을 특이적으로 저해하는 유전자, 유전자 단편 또는 핵산과 같은 생물학적 활성의 핵산을 반복적 또는 계속적 투여 가능성; 세포-특이적 표적화 가능성; 대량의 포접체 생산 가능성)이 있기 때문에 이 시스템을 보다 효율적으로 만들 필요가 있다.

본 발명의 목적은 고등 진핵 세포내로의 핵산의 전이를 증가시키는 데에 있다. (본 발명의 범위에 있어서, “전이”라는 용어는 핵산 복합체을 세포막을 통하여 세포내로의 도입시키는 것 외에도 그것을 발현기키고자하는 적절한 부위에 도달할 때까지 세포내로 이 복합체 또는 그로부터 방출된 핵산을 전달하는 것을 의미한다). 고등 진핵 세포는 공지된 것으로서 효모는 포함되지 않는다(Watson et al., (1987)).

다수의 바이러스들은 원칙상 수용체-매개성 세포내 함입의 기전에 상응하는 기전에 의하여 진핵 세포 숙주내로 유입한다. 이러한 기전에 기초한 바이러스 감염은 통상 세포막의 수용체에 바이러스 입자가 결합되는 것에서 부터 시작된다. 그리고나서, 바이러스가 세포내로 내화된다. 이 내화 과정은 생리학적 리간드 또는 거대 분자의 세포내 유입에 상응하는 통상의 경로를 따르는데 : 우선, 세포 표면의 수용체 자신의 그룹으로 배열하여 소위 “피복 소와(coated pit)”를 형성하고, 세포막을 내측으로 역위시켜 피복에 의하여 둘러싸인 소포를 형성한다_.이 소포는 그 자체가 클라트린(clathrin) 피복을 제거한 다음, 세포막에 위치한 양자 펌프에 의하여 그 내부를 산성화 시킨다. 이것이 엔도솜으로부터 바이러스의 방출을 개시시킨다.

바이러스가 지질 피복을 갖는지의 여부에 따라, 엔도좀으로부터 바이러스 방출의 두가지 유형이 고려되는데 : 소위 “노출(naked)” 바이러스(예를들어 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스)의 경우에는 저 pH가 바이러스 단백질의 형태를 변화시키는 원인이 된다고 제시되었다. 이것은 생리학적 pH 에서는 접근할 수 없는 소수성 도메인을 노출시킨다. 따라서 이들 돔인은 엔도좀 막과 상호작용하 수 있는 능력을 획득함으로써 엔도솜으로 부터 세포질내로 바이러스 게놈을 방출시킨다. 지질 피복을 갖는 바이러스(예를들어 수포성 구내염 바이러스, 셈리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스, 인플루엔자 바이러스)에 있어서는 저 pH는 바이러스의 특정 단백질의 구조 또는 형태를 변화시킴으로써 바이러스 막이 엔도솜 막과 융합되는 것을 촉진시키는 것으로 추정된다. 이러한 기전에 의해 세포내로 투과되는 바이러스는 세포질내로의 통로를 확보하기 이하여 엔도솜 막을 파괴할 수 있는 특정한 분자적 특이성을 갖고 있다.

다른 바이러스, 예를 들어 피복 바이러스로 센다이(Sendai), HIV 및 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스, 또는 비피복 바이러스로 SV40 및 폴리오마 바이러스는 세포내로의 투과를 위해 저pH 환경을 필요로 하지 않으며; 이들은 세포 표면에 있는 막과 직접 융합할 수 있거나(센다이 바이러스, 가능하게는 HIV) 세포막을 파괴하는 기전을 개시하여 이를 통하여 통과할 수 있다. pH에 비의존적인 바이러스는 또한 세포내 함이 경로를 사용할 수 있을 것으로 추측된다(MaClure et al., 1990).

본 발명에 있어서 상기 문제점을 해결하기 위한 출발 전제는 핵산 복합체의 세포내 전이를 향상시킴으로서 발현을 증가시키기 위하여 특정 바이러스가 진핵 세포내로 투과할 때에 사용하는 기전을 이용하는 것이다.

이에 단백질을 바이러스와 함께 세포내로 내화시키려는 시도가 있었다(Oter o and Carrsco, 1987). 세포에서 바이러스에 의하여 성취된 투과성이 거대분자를 운반하기 위하여 사용된다는 것이 밝혀졌다. 수행된 과정은 유체상(fluid phase)의 유입 기전인 것으로 추정된다.

톡신에 포접된 내피 성장 인자(EGF)를 사용하여, 수용체 결합후 세포내 함입에 의하여 세포내로 유입되는 이러한 천연 리간드도 역시 수용체-매개성 세포내 함입에 의하여 세포내로 유입되는 아데노바이러스와 함께 동일한 엔도솜에 들어가서, 다시 바이러스와 함께 엔도솜으로부터 사이토솔(cytosol)로 방출된다는 것이 밝혀졌다(FitzGerald et al., 1983).

놀랍게도, 진핵 세포내로 들어가는 기전에 있어서, 특정 바이러스의 특성을 나타내는 특정한 물질(예를들어 바이러스 성분 또는 다른 활성 물질)이 존재하는 경우에는 실질적으로 복합체의 일부로서 세포내에 유입되는 핵산의 발현율이 증가한다는 것이 밝혀졌다.이러한 발견은 세포내에 유입된 핵산 복합체가 매우 크다는 점에서 특히 놀라운 것이다.

그러므로 본 발명은 고등 진핵 세포를 형질감염시키기 위하여 핵산 및 임의로 내화 인자와 결합된 핵산 친화성 물질의 복합체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 조성물은 그 자체 또는 헥산 복합체의 성분으로서 형질감염된 세포내로 내화될 수 잇고, 복합체가 세포에 들어간 후에 위치하는 엔도솜 의 성분을 세포질로 방출시키는 물질을 함유함을 특징으로 한다.

이하 이러한 물질을 “엔도솜분해물질(endosomlytic agent)”라 한다.

세포내로 유입되어 세포에 들어간 다음에 이들이 위치하는 엔도솜의 성분을 방출시키는 엔도솜 분해 물질의 능력을 이하에서는 “유입 기능”이라고 한다. 이 유입 기능에는 수용체-매개성 세포내 함입 기전을 통하여 세포를 능동적으로 또는 액상을 통하여 또는 핵산 복합체의 구성원으로서 수동적으로 세포내로 내화시키는 능력 및 통상적으로 엔도솜분해 활성 또는 엔도솜분해성이라 일컫는 엔도솜을 파괴하는 능력이 포함된다.

본 발명의 한가지 구체예에서 엔도솜분해물질은 바이러스이다. 또다른 구체예에서 엔도솜분해성물질은 바이러스 성분이다. 본 발명에 따르는 이들 구체에에 사용한 바이러스 또는 바이러스 성분을 이하에서는 “유리” 바이러스(성분)이라한다.

본 발명에서는 일정량의 트랜스페린-폴리시린 포접체의 HeLa 세포내로의 유전자 전이 능력에 대한 유리 아데노바이러스의 용량(does) 증가의 작용을 레포터(reporter) 유전자로서 루시페라제(luciferase) 유전자를 사용하여 연구하였다. 아데노바이러스에 의한 유전자 전이의 증가는 최고 세포당 1×10⁴바이러스 입자에 이르렀으며, 이 수치는 대략 HeLa 세포다 아데노바이러스 수용체 수에 상응하는 수치이다.

루시페라제 발현이 트랜스페린-폴리리신 포접체 단독에 의한 발현과 비교하여 2000배 이하로 상승하는 것은 바이러스의 더 높은 용량과 일치한다. 또다른 일련의 실험에서는 포접체-DNA 복합체의 제한된 양의 효과를 일정 용량의 유리 아데노바이러스 존재하에서 실험하였다_.아데노바이러스의 새포내로의 유입은 트랜스페린-폴리리신에 의해 매개되는 유전자 전이를 넓은 범위의 DNA 용량에서 증가시킨다. 아데노바이러스를 형질감염의 효율을 증가시키기 위하여 사용할 경우는 포접체-DNA 복합체에 의해 얻어진 유전자의 최대 발현 강도는 100배 적은양의 DNA에 의해 얻어진 강도에 상응한다.

유전자 전이에 대한 아데노바이러스 감염의 효과를 비결합 DNA 및 폴리리신 또는 트랜스페린-폴리리신 포접체와 결합된 DNA 모두에 대하여 실험하였다(제3(a)도). 이 분석에서 아데노바이러스 감염은 노출된 비결합 DNA의 전이를 형질감염시에 유의적으로 상승시키지는 않았다. 이와는 현저하게 대조적으로, 폴리신 또는 트랜스페닐-폴리리신 포접체에 결합된 DNA의 전이는 아데노바이러스 감염에 의해 상승하였다. 그러나 이러한 효과는 트랜스페린-폴리시니 포접체의 경우 훨씬 컸다. 포접체 분자의 다중양이온 부위는 트랜스페린을 DNA에 부착시킬 뿐만 아니라, DNA 에 중요한 구조 변화를 주기 때문에(환상 구조로 축합: Wagner et al., 1991a) 처음에는 이들 실험으로는 관측된 효과가 다중양이온-축합 DNA의 증가된 유체-상 전달에 기초한 것인지 아니면 수용체-결합 포접체-DNA 복합체의 바이러스에 의해 상승된 전달에 기초한 것인지를 구별할 수 없었다. 이들 가능성들을 판별하기 위하여 순차적 결합 실험을 수행하였다(제3(b)도). 내화시키지 않고 저온에서 트랜스페린-폴리리신-DNA 또는 폴리리신-DNA 복합체를 결합시키면, 아데노바이러스 감염전에 유체 상에서 과량의 복합체를 제거할 수 있다(FitzGerald et al., 1983). 이러한 방식으로 투여할 경우 수용체-결합 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체의 전달은 아데노바이러스 입자의 추가에 의하여 상승되는 반면, 폴리리신-DNA 복합체는 그렇지 않다. 그러므로, 특이적으로 증가한 것은 수용체-매개성 세포내 함입 경로에 의한 DNA의 세포내 유입이다.

그 다음으로, 수용체-매개성 유전자 전이를 증가시키는 아데노바이러스의 특이적 기능을 분석하였다(제3(c)도). 바이러스 입장의 미온 처리는 표적 세포막에 결합하는 바이러스의 능력을 변화시키지는 않지만, 내화된 후 엔도솜을 파괴하는 능력에는 영향을 미친다(Defer et al., 1990). 그러므로, 바이러스 결합과 바이러스 유입의 독특한 효과는 이 발견을 기초로하여 별개로 평가될 수 있다. 본 발명에 있어서 수행된 시험에서 아데노바이러스는 열 불활성화시킴으로서 이들로부터 수용체-매개성 세포내 함입을 통한 수용체-매개성 유전자 전이 증가 능력이 완전히 제거되는 것으로 나타났다. 이것은 특히 아데노바이러스가 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의해 유전자 전달을 증가시키는 것은 이들이 유입 기전의 일부인 아데노바이러스의 엔도솜 파괴 능력이라는 것을 제시한다. 복제-결함 바이러스 균주가 유전자 발현을 증가시킨다는 사실은 이러한 현상이 복제 기능에 의한 것이 아니라 바이론의 유입기능에 기인한다는 가정을 확인해준다.

유전자 발현의 증가가 바이러스에 의해 도입된 유전자의 트랜스액티베이션(transactivation) 가능성 때문일 수 있다는 가능성을 배제하기 위하여, 본질적으로 RSV-LTR 루시페라제 유전자를 발현시키는 세포주로 실험한 결과 : 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의하여 유전자를 도입시킨 양친 세포주에서는 아데노바이러스의 유전자 발현이 유의적으로 증가된 반면, 이 세포주에서는 아무런 효과를 나타내지 못하였다. 이러한 발견은 아데노바이러스는 전사 전에 일어나는 상황에 영향을 미치며, 따라서 유전자 전이의 증가 효과는 유전자 전이 단계에서 작용하는 것이지 유전자 발현단계에서 작용하는 것은 아니라는 것을 시사해준다(제5도).

또한 본 발명에서는 아데노바이러스가 선별된 세포주에서 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 미치는 영향을 밝히기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과 표적 세포에서 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의하여 유전자 전이가 일어나기 위해서는 트랜스페린 수용체의 존재가 필요하나, 모든 경우에 그런 것은 아니라는 것이 밝혀졌다. 엔도솜-내화 포접체-DNA 복합체의 운명에 관련된 세포-특이적 인자는 이러한 경로에 의해 달성될 수 잇는 유전자 전이의 수준에 있어서 극히 중요한 결정 인자인 듯하다. 이러한 관점에서 선별된 세포주에서의 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이 및 아데노바이러스에 의한 유전자 전이의 증가 모두에 대하여 실험하였다(제4도). 낭포성 섬유증 세포주(CFT1)의 세포에서는 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체로 처리한 후에 루시페라제 유전자 발현이 적당한 수준을 보였다. 이러한 발현 수준은 아데노바이러스 d1312로 처리함으로써 현저하게 상승하였다. 현격히 대조적으로, 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체로 처리한 KB 세포에서는 트랜스페린 수용체의 존재에도 불구하고 간신히 기본 수준의 루시페라제 유전자 발현 수준을 나타내었다. 그러나 아데노바이러스 d1312로 처리한 경우에는 이들 세포에서 루시페라제의 활성을 쉽게 검출할 수 있었다. HeLa 세포를 아데노바이러스로 처리한 경우에도 유사한 효과를 보였는데, 실질적으로 이 세포에서 더 강한 효과를 나타냈다.

HeLa 세포 및 KB 세포는 아데노바이러스에 대하여 대략 동일한 수의 수용체를 갖기 때문에, 유전자 전이 증가의 차이는 각 세포 유형의 특성인 트랜스페린 수용체의 수를 반영할 수 있다. 그러나, 이 결과와는 현격하게 대조적으로, 아데노바이러스 감염이 잘되지 않는(Precious and Russell, 1985) WI-38 및 MRC-5 세포주에서는 d1312로 처리함으로써 포접체-DNA 복합체 단독에 의해 성취되는 유전자 발현 정도로 거의 상승이 나타나지 않았다. 그러므로, 아데노바이러스로 처리하면 유전자 전이가 수용체-매개성 세포내 함입으로 가능한 경우에는 CFT1 세포의 경우와 같이 포접체-DNA 복합체에 의한 유전자 전이의 증가가 나타날 것이며, 또한 유전자가 이러한 경로로 전이되는 몇몇 경우에는 HeLa 및 KB 세포에서 처럼 비효율적으로 나타날 것이다. 이러한 효과가 특정 세포 유형의 바이러스 수용체, 예를들어 아데노바이러스 수용체의 수 및 트랜스페린 수용체의 수 모두와 함수 관계라면, 얻어지는 상승 수준은 상이한 표적 세포에 따라 현저하게 달라진다.

유리 바이러스의 경우에는 핵산에 친화성을 갖는 물질, 바람직하게는 유기 다중양이온은 바람직하게는 내화 인자와 포접된다. 그러나, 본 발명에 따르면 특정한 조건하에서는 DNA는 핵산에 친화성을 갖는 물질과만, 즉 내화 인자 없이 결합하여, 유리 바이러스 존재하에서 세포내로 도입될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 또한, 어떤 세포주에서는 핵산 및 핵산 친화성 물질로 구성된 복합체의 농도가 충분히 높을 경우에는 이들이 유체상을 통해 도입될 수 있다는 것도 밝혀졌다. 본 발명에 따르는 실험 및 예비 실험에서는 핵산 복합체의 유입력에 대하여 필수적 요소는 핵산을 핵산 친화성 물질에 의해 축합시키는 원인이 될 수 있는, 그들의 충밀도인 것으로 나타났다. 핵산 친화성 물질이 복합체에 실질적으로 전기적 중성을 부여하고 핵산을 치밀한 구조로 농축시킬 수 있을 분 만 아니라 바이러스와 함께 세포내로 유입할 수 있도록 세포 표면에 대하여 충분한 결합력을 갖고 있는 경우에는 복합체를 수용체-매개성 세포내 함입에 의하여 세포내로 전이시키기 위하여 핵산 친화성 물질에 내화 인자를 공유적으로 결합시킬 필요가 없을 것이다. 많은 세포가 특정 핵산 친화성 특정 물질에 대하여 비교적 높은 친화성을 갖고 있으므로, 핵산과 결합 인자의 포접체는 내화 인자을 요구하지 않고도 세포내로 유입된다. 이것은 사실인데, 본 발명에서 예를들어 간 세포의 경우 DNA-폴리리신 복합체를 유입하는 것으로 나타났다.

본 발명에 따르는 바람직한 구체예에서는 엔도솜분해 물질은 핵산 친화성 물질에 결합하며, 포접체/핵산 복합체의 일부로서 세포에 들어가는 세포에 들어간 후에 복합체가 위치하는 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시키는 능력을 갖는 있는 바이러스이다.

또 다른 바람지간 구체예에서는 엔도솜분해 물질은 핵산 친화성 물질에 결합하며, 포접체/핵산 복합체의 일부로서 세포에 들어가서 복합체가 세포에 들어간 후에 위치하는 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시키는 능력을 갖는 바이러스 성분이다.

핵산 결합 도메인에 결합한 바이러스 또는 바이러스 성분은 결합 유형에 관계없이, 이하 “바이러스 포접체”라 한다.

또한 본 발명의 대상인 바이러스 포접체는 그들의 기능적 작제물의 필수 부분으로서 바이러스 또는 바이러스 성분을 함유하며 내화 인자 포접물에서 기초한 벡터 시스템의 장점과 바이러스가 이들 시스템에 부여하는 장점을 결합시킨 것이다.

게다가, 본 발명의 구체예에 따르는 바이러스 포접체는 수용체-매개성 세포내 함입에 의한 유전자 전이를 위한 공지의 양기능성 포접체 시스템에서 유래되는 근원적인 제한을 피하여, 바이러스를 세포의 소포 시스템에서 방출시킬 수 있는 특이적 기전을 갖는 장점이 있다. 본 발명에 따르는 바이러스 포접체는 재조합 바이러스 벡터로 부터 근본적인 개념상 변화를 구성하여, 전달된 외래 DNA를 바이론의 외부로 운반시킨다. 결과적으로, 본 발명에 따르는 바이러스 포접체는 서열에 따르는 제한 없이, 세포내로 매우 큰 유전자 작제물을 전달시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 유리 또는 결합 바이러스 또는 바이러스 성분으로서의 바이러스의 일부로서 사용될 수 있는 바이러스의 적합성은 바이러스의 유입 기능에 의해 정해진다. 한편 적합한 바이러스는 세포를 핵산 복합체로 형질 감염시키는 동안 수용체-매개성 세포내 함입에 의해 세포내로 들어가서 엔도솜으로 부터 세포질내로 방출됨으로써 핵산을 방출시킬 수 있는 것이다.

이러한 설에 구애되는 것은 바라지 않지만, 이 기전은 이들 복합체가 내화될 때 바이러스와 동일한 엔도솜에 도달한다고 가정하면, 바이러스와 함께 엔도솜으로 부터 세포질내로 운반되는 한은 핵산 복합체를 세포내로 전이시키는 데에 도움이 될 수 있다. 핵산 복합체가 결합 형태로 바이러스를 함유하는 경우에는 바이러스의 엔도솜분해 활성의 도움을 받아 엔도솜으로 부터 세포질내로 운반한다. 이것은 엔도솜과 리소좀의 융합을 억제하며 결과적으로 보통 이들 세포 기관에서 일어나는 효소적 분해를 억제한다.

바이러스 및 이들이 투과할 수 있는 고등 진핵 세포의 예는 참고에 기재하였다[참고예:Fields and Knipe, 1990]. 세포내로 핵산 복합체의 유입을 촉진시키기 위하여 유리 바이러스의 형태로 사용된 바이러스에 의한 형질 전환에 대한 주어진 세포의 감수성은 표적 세포 표면의 바이러스 수용체의 존재 및 그 수에 좌우된다. HeLa 및 KB 세포에서의 아데노바이러스 수용체의 수를 결정하기 위한 방법은 공지되어 있다(Svensson, 1990;Defer,1990).

본 발명에 따르는 조성물에 적합하며, 감염 초기에 발생하는 유입 기능이 수용체-매개성 세포내 함입에 일어나는 바이러스로는 한편은 아데노바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스와 같은 지질 피복이 없는 바이러스 미 다른 한편으로는, 낭포성 구내염 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 인플루엔자 바이러스와 같은 피막이 있는 바이러스가 포함되며; pH-의존형 몰로니 바이러스 균주도 또한 적합하다. 본 발명의 실시에 있어서 사용될 수 있는 특히 바람직한 바이러스로는 아데노바이러스 아속 C, 유형 5, 셈리키 삼림 바이러스, 낭포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스 및 몰로니 백혈병 바이러스가 포함된다.

본 발명에 있어서 역전사효소를 갖고 있지 않은 RNA 바이러스의 사용은 이런 바이러스 존재하의 형질감염은 형질감염된 세포 중에 바이러스 DNA가 생성되지 않는다는 장점이 있다. 본 발명에 있어서, 대표적인 피코나바이러스(Picornavirus) 속인 리노바이러스 HRV2는 레포터 유전자의 발현을 증가시킨다. 리노바이러스의 효능은 유리 형태 및 바이러스 포접체 형태 모두에서 나타났다.

본 발명에 있어서, 바이러스라는 용어는, 그들을 세포내에 유입시켜서 그들이 도달한 엔도솜의 성분을 방출시킬 경우에는, 야생형에 추가하여, 하나 또는 그 이상의 돌연변이의 결과로 유입 기능 이외에 야생형의 특정 기능, 특히 복제 능력을 상실한 돌연변이체가 포함된다.

돌연변이체는 복제 기능을 담당하는, 그러나 유입 기능에는 필수적이 아닌며 패캐징 라인(packaging line)에 의하여 보체 결합될 수 있는 바이러스-단백질 영역의 돌연변이 또는 삭제에 의한 통상의 돌연변이 생성 방법에 의하여 생성된다. 이들에는 예를들어 아데노바이러스의 경우, ts-돌연변이체(온도 감수성 돌연변이체), ElA- 및 ElB-돌연변이체, MLP-추진 유전자에서 돌연변이를 나타내는 돌연변이체(Berkner, 1988) 및 특정 캡시드 단백질 부위에서 돌연변이를 나타내는 돌연변이체가 포함된다. 이에 상응하는 자연 돌연변이가 발생하는 바이러스 균주도 또한 적합하다. 바이러스의 복제능력은 예를들어, 배양세포를 다양한 바이러스 농도의 현탁액으로 덮고 플라크로 가시화된 분해된 세포의 수를 측정하는 문헌상 공지된 플라크 검정법을 사용하여 측정할 수 있다(Dulbecco, 1980).

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 적합한 다른 바이러스는 소위 결손 바이러스, 즉 하나 또는 그 이상의 유전자에서 자동적 바이러스 복제에 필요한 기능이 없음으로 인하여 헬퍼(helper) 바이러스를 필요로 하는 바이러스가 포함된다. 이러한 카테고리의 예로는 표준 바이러스와 동일한 구조 단백질을 갖고, 돌연변이를 갖고 있으며 복제하기 위해서는 헬퍼 바이러스로서 표준 바이러스를 필요로 하는, 감염성 표준 바이러스로 부터 유래된 DI-입자(결손 간섭 입자)가 있다(Huang, 1987;Holland, 1990). 또한 이들 그룹의 예로는 위성 바이러스(satellite virus)가 포함된다(Holland, 1990). 또 다른 그룹의 예로는 아데노-결합 바이러스라고 부르는 파보바이러스(parvovirus) 종류가 있다(Berns. K. I., 1990). 세포에서의 많은 바이러스의 유입 회로는 완전히 특성화된 것이 아니므로, 본 발명에 있어서 이들의 적합성에 요구되는 엔도솜분해 활성을 나타내는 다른 바이러스가 있을 것으로 추측된다.

또한 본 발명에 적합한 바이러스는 생 백신을 약독화시킬수 있거나(Ginsberg, 1980) 또는 백신화된 균주를 약독화시키킬 수 있는 것이다. 본 발명에 있어서, 바이러스라는 용어는 또한 불활성화된 바이러스, 예를들어 포름알데히드로 처리하는 것과 같은 화학적 처리, UV-조사, 예를들어 소랄렌(psoralen)UV-조사 또는 브로모데옥시유리딘 처리와 같은 UV-조사와 병행된 화학적 처리, 감마-조사 또는 중성자 원격조사에 의해 불활성화된 바이러스을 포함한다. 불활성화된 바이러스, 예를들어 백신으로도 사용되는 거소가 같은 것들은 문헌(Davis and Dulbecco, 1980, Hearst and Thiry, 1977)에 공지된 표준 방법으로 제조되고 DNA 복합체의 전이를 증가시키는데 있어서의 적합성을 시험할 수 있다. 본 발명에 있어서 수행된 실험에서 아데노바이러스 표본은 통상의 UV 멸균 램프 또는 포름알데히드를 사용하여 불활성화시킨다. 놀랍게도 바이러스의 불황성화 정도는 아데노바이러스를 형질감염 매질에 가하였을 때 성취되었던 유전자 전이 효과의 감소 보다는 실질적으로 더 큰 것이었다. 실험은 스트렙타비딘-결합 폴리리신과 결합된 소랄렌/UV-불활성화된 바이오틴화 아데노바이러스로 수행하며 바이러스의 불활성화 결과는 바이러스 역가가 유전자 전이 능력 보다는 상당히 더 뚜렷하게 감소하는 것으로 나타났다. 이것은 활성 바이러스에서의 정상적인 감염 기전과 관련된 기전이 유전자 전이에 필수적인 효과를 파괴하지 않고 파괴될 수 있다는 것을 명확하게 시사해준다.

“바이러스 성분”이라는 용어는 바이러스의 일부, 예를들어 핵산으로부터 유리된 단백질 부분(재조합 방법(Ansardi et al., 1991;Urakawa et al., 1989)에 의해 제조될 수 있는 공(empty) 바이러스 캡시드), 분획법에 의한 단백질 또는 유입 기능에 있어서 필수적인 자연(intact) 바이러스의 엔도솜분해 기능을 갖는 펨티드를 지칭한다. 이들 바이러스 성분은 펩티드 합성 또는 재조합 방법 어느 것으로나 그 크기에 따라 합성하여 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서 비오틴/스트렙타비딘을 통하여 폴리리신에 포접된 아데노바이러스 단백질은 유전자 전이를 증가시키는 것으로 나타났다. 내화에 필수적인 아데노바이러스 이외에 다른 바이러스로 부터의 단백질 분획의 예로는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)이 포함된다_.인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HA2 아단위(subunit)의 N-말단 서열은 엔도솜으로부터 바이러스를 방출시키는 역할을 한다. 이들 서열의 20 아미노산으로 구성된 펩티드는 지질 막을 융합하여 이를 부분적으로 분해하거나 파괴할 수 있다(Wharton et al., 1988). 본 발명에서는 원형(authentic) 및 변형된 인플루엔자 펩티드를 다양한 구체예에서 성공적으로 사용하였다. 또다른 예는 레트로바이러스, 예를들어 HIV gp41 의 피막 단백질(Rafalski et al., 1990) 또는 이들 바이러스 단백질의 일부이다.

그자체로 세포내로 들어가서 내화 인자로서 기능을 발휘할 수 있는 능력이 있는 바이러스를 사용하는 것은 본 발명의 단지 일부 측면에 불과하다.

그 자체로서는 세포에 결합하여 세포에 들어갈 능력을 가지고 있지 않은 바이러스 또는 바이러스 성분은 상기 정의한 바이러스 포접체로서 사용하는 것이 바람직하다. DNA 결합 도메인, 예를들어 다중양이온에 결합함으로써 바이러스 또는 바이러스 성분은 DNA 분자에 대하여 고친화성을 획득하고, 이에 결합하여, 역시 내화 인자 및 DNA결합 도메인의 포접체를 함유하는 DNA 복합체의 성분으로써 세포내로 전달되는 것이 보장된다. 이렇게 함으로써 성취된 전이 효과에 추가하여, 바이러스 또는 바이러스 성분의 핵산 결합 도메인에의 결합은 그 엔도솜분해성을 개선시킬 수도 있다.

다른 내화 인자를 선택함으로써, 실제적으로 특정 고등 진핵 세포를 본 발명에 따르는 조성물로 감염시킬 수 있다.

주어진 바이러스 또는 바이러스 성분이 본 발명에서 정의된 바와 같은 유입 기능을 갖고 있는지, 그리고 그럼으로써 유전자 전이를 상승시키는 데에 적합한지 여부는 간단한 스크리닝 검정법으로 결정할 수 있다. 이 검정법, 예를들어 유리 바이러스에 의한 바이러스의 적용성 시험에서는 표적 세포를 바이러스 존재 또는 부존재하에서 DNA 복합체와 접촉시킨다. 그 다음에 세포질내로 방출되는 DNA 복합체의 양은 마커(marker) 유전자 생성물, 예를들어 루시페라제의 검출로 쉽게 측정될 수 있다. 바이러스의 존재가 DNA 복합체를 유입하여 세포질내로 바이러스가 없는 경우 보다 더 큰 수준으로 방출시킨다면 이것은 바이러스의 유입 기능에서 비롯된 거일 수 있다. 적합한 유입 기능을 갖고 있는 것으로 공지된 또다른 바이러스, 예를들어 아데노바이러스 아그룹 C, 타입 5와 비교함으로써 시험 바이러스의 유입 수준을 비교할 수도 있다. 이러한 종류의 시험은 바이러스 포접체에 적용할 수 있는 데, 이 경우에는 양을 변화시킨 다양한 내화 인자 포접체와 같은 추가의 파라미터를 시험하여야 한다. 그리고, 본 발명의 분야의 전문가라면 이런 종류의 시험 임의로는 다른 시험과 혼합하여, 예를들면 강력한 엔도솜분해 활성을 갖는 바이러스 성분 또는 다른 물질의 유전자 발현을 상승시키는 능력에 대하여 시험하기 위하여 이러한 종류의 리포좀 누출 검정법을 병용하여 용이하게 적용시킬 수 있다.

자연 바이러스를 사용할 경우에 시험은 바람직하게는 바이러스가 복제할 수 있는 여부를 보기 위하여 바이러스의 유전자 전이를 상승시키는 능력을 실험하는 예비시험에 병행하여 수행한다. 복제 능력에 대한 실험은 세포변성 바이러스의 경우 또는 숙주 세포의 성장을 현저하게 손상시키는 바이러스의 경우에는 플라크 검정법(상기 내용 참조)을 사용하여 수행한다. 다른 바이러스 대해서는, 문제의 바이러스에 대한 특이적인 검출 방법, 예를들어 헤마글루티닌화 시험 또는 전자 현미경을 사용하는 것과 같은 화학-물리적 방법을 사용한다.

본 발명에 있어서, 바람직한 바이러스는, 특히 유리 바이러스로서, 높은 역가로 제조될 수 있고, 안정하며, 원상태에서 병원성이 낮고 복제 능력을 표적화하여 삭제시킬 수 있는 것으로서, 특히 아데노바이러스가 바람직하다. 특이적 세포 집단을 형질 감염시키려 한다면, 이들 세포 집단을 특이적으로 감염시키는 바이러스가 바람직하다. 다른 세포 유형을 감염시키려는 형질 감염인 경우에는 광범위한 세포 유형에 대하여 감염성이 있는 바이러스를 사용할 수 있다.

조건은 바이러스 표본이 가능한한 가장 순수해야하며 안정화 완충액은 특정 바이러스에 맞는 것을 사용해야 한다는 것이다.

특정한 경우에 있어서, 본 발명에 따르는 조성물의 생체내에서 치료학적으로 사용하기 위해서는 바이러스 또는 바이러스 성분은 가능한한 안정성 위험, 특히 표적 세포에서 바이러스의 복제 및 숙주 DNA를 가진 바이러스 DNA의 재조합의 위험을 최소화시킨 것들을 사용할 수 있다.

유리하게도, 인체를 제외한 동물을 감염시키는 바이러스의 유입 기전은 바이러스가 고등 진핵 세포에서 엔도솜 파괴 활성을 나타내는 한 고등 진핵 세포, 특히 인체로의 DNA 유입 및 방출을 증가시키는 데에 사용할 수 있다. 아데노바이러스과의 일부가 조류종, 양서류 및 다른 다양한 동물로 부터 분리되었다[참고 : Laver et al.,1971;Bragg et al., 1991;Akopian et al., 1991; Takase et al., 1990;Khang and Nagaraji 1989; 및 Reece et al., 1987]. 인체 아데노바이러스 뿐만 아니라 양서류, 조류, 소, 개, 쥐, 양, 돼지 및 원숭이 아데노바이러스는 ATCC(American Type Cultrue Collection, Rockville, Maryland)에 기탁되어 있다 (American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydae and Rickettsiae, Sixth Edition, 1990, C. Buck and G. Paulino eds., pp.1-17).

원경 종(distant species)으로 부터의 바이러스, 예를들어 아데노바이러스를 사용함에 의한 가능한 장점은 표적 세포에서 독성이 감소되고(예를들어 닭 또는 개구리 아데노바이러스는 포유류 세포에서 복제 또는 초기 유전자 발현을 기대할 수 없을 것이다), 인체 아데노바이러스에 비하여 원격 아데노바이러스를 제조하는 실험자에게 위험을 감소되며, 인체 또는 쥐 아데노바이러스의 항체로 부터의 간섭이 감소될 수 있다는 것이다. 인체 또는 쥐 항체에 의한 간섭의 부재는 바이러스가 인체 및 마우스에서 유전자 요법에 사용될 경우에 특히 중요하다. 닭 아데노바이러스 CELO(chick embryo lethal orphan virus)는 포유류 세포를 감염시키는 아데노바이러스의 주요 그룹 에피토프를 인식하는 항체에 대하여 반응성을 보이지 않는다. 게다가, CELO 바이러스를 배상태의 난(embryonated egg)에서 바이러스가 고농도로 되도록 성장시킬 수 있다.(0.5㎎/난; Laver et al., 1971). 실시예에 나타낸 바와 같이, CELO-폴리리신 포접체는 인체 아데노바이러스 d1312에 필적하는 수준에서 HeLa 세포로의 DNA 운반을 증가시킨다. 그러므로 DNA 운반을 위한 CELO 포접체의 사용은 인제 유전자 요법 실험에서 커다란 가능성을 시사해준다.

바람직하게는 원격 종 바이러스를 상기 정의된 바와 같이 혼합 복합체인 바이러스 포접체의 성분으로서 사용한다.

바이러스를 함유하는 본 발명에 따르는 포접체에 있어서, 핵산 결합 도메인에의 바이러스의 결합은 공유결합 또는 비공유적으로 결합, 예를 들어 바이오틴-스트렙타비딘 가교 또는 바이러스가 그 표면 단백질이 산성이어서 다중양이온에 결합할 수 있는 영역을 갖고 있는 경우에는 이온 결합일 수 있다.

본 발명에 따르는 실험에서 복합체는 DNA와 결합하기전에 아데노바이러스와 폴리리신 사이에 이온 결합이 생성된 상태에서 형성된다. 대조 실험은 폴리리신을 우선 DNA로 중화시켜 아데노바이러스에 쉽게 결합하지 않도록 한 상태에서 수행한다. 이온 결합된 아데노바이러스를 갖는 복합체가 이들 실험에서 우수하였다.

본 발명에 따르는 엔도솜분해 활성을 갖는 바이러스 성분의 예로는 공 바이러스 캡시드 또는 바이러스 펩티드가 있다.핵산 결합 도메인에의 바이러스 성분의 결합은 공유결합, 예를 들어 바이러스 펩티드를 폴리리신과 화학적으로 커플링하거나 비공유적으로 결합, 예를 들어 바이러스 성분이 다중양이온에 결합될 수 있는 산잔기를 가지고 있는 경우에는 이온 결합이 될 수 있다.

핵산에 친화성을 갖는 물질에 대한 바이러스 또는 바이러스 성분의 비율은 변화시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 인플루엔자 헤마글루티닌 펩티드-폴리리신 포접체의 경우에는 유전자 전이는 포접체에서 바이러스 펩티드 함량이 높은 경우에는 더 큰 정도로 상승될 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 바이러스(성분) 또는 핵산 친화성 물질로 부터 본 발명에 따르는 포접체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바이러스 포접체는 (내화 인자-다중양이온 포접체와 같이) 성분을 커플링함으로써 또는, 바이러스 성분 및 다중양이온이 폴리펩티드인 경우에는 재조합법(참고예:EP 388 758]에 의하여 제조될 수 있다.

화학적 방법에 의한 바이러스 또는 바이러스 단백질 또는 펩티드 각각의 폴리아민 화합물과의 결합은 펩티드의 커플링으로 이미 공지된 방법으로 수행될 수 있으며 필요하다면, 각 성분에 커플링 반응전에 링커(linker) 물질을 제공할 수 있다(이 방법은 커플링에 적합하게 사용할 수 있는 관능기, 예를들어 머캅토 또는 알콜기가 없는 경우에 필요하다). 링커 물질은 우선 각 성분의 관능기와 반응한 다음, 변형된 각 성분이 커플링되는 양기능성 화합물이다.

커플링은 하기에 의하여 수행될 수 있다:

a) 환원 조건하에서 다시 분열될 수 있는 디설피드 가교(예를들어, 숙신이미딜피리 딜디티오프로피오네이트(Jung et al., 1981)).

b) 생물학적 조건하에서 실질적으로 안정한 화합물(예를들어, 티오에스테르는 말레이미도 링커와 링커의 설프히드기를 반응시킴으로써 두 번째 성분에 결합한다).

c) 생물학적 조건하에서 불안정한 가교, 예를들어 에스테르 결합, 또는 약산성 조건하에서 불안정한 아세탈 또는 케탈 결합.

본 발명에 따르는 실험에서, 엔도솜분해성 인플루엔자-헤마글루티닌 HA2-펩티드는 숙신이미딜 피리딜디티오프로피오네이트(SPDP)를 사용하는 화학적 방법에 의하여 폴리리신과 커플링시킨다. 폴리리신으로의 펩티드의 변형이 엔도솜분해 활성을 증가시킨다는 것은 공지되어 있다. 형질 감염 실험은 트랜스페린-폴리리신에 의해 매개되는 유전자 전이의 효율이 DNA 복합체 중에 인츨루엔자 펩티드-폴리리신 포접체가 함께 존재하는 경우에 실질적으로 증가된다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명에서는 아데노바이러스를 다양한 상이한 방법에 의해 폴리리신에 결합시켰다. 바이러스를 폴리리신과 포접시키는 방법은 이종양기능 시약을 사용하여 결손 아데노바이러스 d1312를 변형시킨다음, 트랜스페린-폴리리신 포접체를 제조하는 방법(Wagner et al., 1990)과 유사한 방법에 의하여 수행한다. 비결합 폴리리신은 원심분리에 의하여 제거한다. DNA 결합 능력은 방사성 표지된 DNA를 사용한 결합 실험을 통해 나타난다. 클로로린이 없는 K562 세포는 DNA, 아데노바이러스-폴리리신 및 트랜스페린-폴리리신으로 구성된 복합체가 있는 경우에는 DNA에 결합하지 않는 비변형 아데노바이러스가 있는 경위보다 실질적으로 더 높은 유전자 전이를 보였다. 또한 단지 0.0003㎍의 DNA로 폴리리신-변형 아데노바이러스를 사용하여 5×10⁵개의 HeLa 세포에서 유의적인 유전자 발현이 일어남을 확인하였다.

바이러스 또는 바이러스 성분이 적합한 탄수화물 쇄를 함유하는 경우에는 글리코프로테인의 하나 또는 2이상의 탄수화물 쇄를 통하여 핵산 친화성 물질에 결합시킬 수 있다.

글리코프로테인-다중양이온 포접체를 제조하기 위한 적합한 방법은 독일 특허출원 P 40 15 038.4에서 공지되어 있으며 : 최근 문헌에 기재되어 있다 (Wagner et al., 1991b).

본 발명의 바이러스 포접체를 제조하기 위한 또 다른 바람직한 방법은 바이러스 또는 바이러스 성분을 핵산에 친화성을 갖는 물질, 더욱 특히 폴리아민에 트랜스글루타미나제에 의하여 효소적으로 커플링시키는 것이다.

트랜스글루타미나제류는 특히 표피(표피성 트랜스글루타미나제), 혈액(인자 (XIII) 및 다양한 조직 세포(조직 트랜스글루타미나제)에서 생성되는 많은 상이한 효소를 포함한다(Folk, 1985). 트랜스글루타미나제는 Ca⁺⁺존재하 및 NH₃분열에 의하여 ε-(γ-글루타밀)리신 결합의 형성을 촉매한다. 이를 위한 전제 조건은 상응하는 글루타민 및 리신이 효소에 의해 반응할 수 있는 단백질에 존재하여야 한다는 것이다. 리신의 ε-아미노기와는 달리, 에탄올아민, 푸트레신, 스페르민 또는 스페르미딘과 같은 (폴리)아민 역시 기질로서 사용할 수 있다(Clerke et al., 1959). 현재로서는 단백질 또는 폴리아민의 글루타민 또는 리신이 효소에 의하여 반응할 수 있는지 여부를 결정하는 중요한 인자는 무엇인지는 명확하지 않다. 공지된 것은 폴리아민이 트랜스글루타미나제에 의하여 사이토케라틴(Zatloukal et al., 1989), 튜불린, 세포막 단백질 및 인플루엔자 바이러스(Iwanij, 1977)의 표면 단백질과 같은 다수의 세포 단백질에 결합할 수 있다는 것이다.

본 발명에서는 폴리리신이 트랜스글루타미나제에 의해 아데노바이러스에 커플링할 수 있다는 것을 보여준다.커플링은 글리세롤 존재하여서 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이것은 바이러스 표본, 예를들어 완충액중에 안정화제로서 글리세롤을 함유하는 아데노바이러스 표본을 커플링에 직접 사용할 수 있는 장점이 있다. 플라스미드-DNA와 결합하는 아데노바이러스-폴리리신 포접체를 트랜스페린-폴리리신 포접체와 함께 사용함으로써 비폴리리신-커플링된 아데노바이러스 존재하에서 트랜스페린-폴리리신 포접체를 함께 사용한 경우보다 수배 더 큰 유전자 발현을 성취할 수 있었다.

본 발명에 따르는 포접체를 제조하기 위한 본 발명에 따르는 바람직한 방법은 바이오틴-단백질 가교, 바람직하게는 바이오틴-스트렙타비딘 가교를 통하여 바이러스 또는 바이러스 성분을 다중양이온에 커플링시키는 것이다.

바이오틴과 스트렙타비딘 또는 아비딘의 공지의 강력한 연합(Wilchek et al., 1988)은 아데노바이러스를 바이오틴으로 변형시키고 트랜스페린-폴리리신 포접체의 제조와 유사한 방법으로 스트렙타비딘을 폴리리신에 화학적으로 포접시킴으로써 폴리리신에 아데노바이러스를 커플링시키기 위하여 사용하였다(Wagner et al., 1990). 바이오틴-변형 바이러스에 임의로 비공유결합적으로 결합된 DNA 및 스트렙타비딘-폴리리신으로 구성된 복합체는 더 낮은 DNA 농도에서도 매우 높은 형질감염 효율을 나타내는 폴리리신에 결합된다. 특히 효율적인 복합체는 바이오틴-변형 바이러스를 먼저 스트렙타비딘-폴리리신에 결합시키고 두 번째 단계에서 DNA에 결합시킬 경우에 형성된다.

필요하다면, 바이오틴에 대한 결합은 아비딘에 의해서도 수행할 수 있다.

또한, 한편으로는 바이러스를 바이오틴닐화시킴으로써, 다른 한편으로는 안티바이오틴 항체를 폴리리신과 포접시키고, 상업적으로 수득할 수 있는 폴리클론성 또는 모노클론성 안티-바이오틴 표준 항체를 사용하여 바이러스 폴리리신간에 바이오틴/항체 결합에 의한 결합을 형성시킴으로써 바이러스(성분)와 폴리리신 간에 결합을 형성시킬 수 있다.

바이러스와 폴리리신 사이의 결합은 또한, 폴리리신을 바이러스 표면 글리코프로테인에 대한 친화성을 갖는 렉틴과 커플링시킴으로써 성취할 수 있으며, 이때에 이러한 포접체에서의 결합은 렉틴과 글리코프로테인 사이의 결합에 영향을 받는다. 바이러스 그 자체가 어떠한 적합한 탄수화물 측쇄도 갖고 있지 않은 경우에는 이것을 적합하게 변형시킬 수 있다.

또한 바이러스는 먼저 표면을 바이러스에 대한 이종 항원(예를들어 베링거만하임(Boehriger Mannheim)으로 부터 수득한 디곡시게닌 DIG : 또는 바이오틴)으로 변형시키고 이 항원에 결합된 항체를 통해 변형된 바이러스와 핵산 친화성 물질 사이에 연결을 형성시킴으로써 핵산 친화성 물질에 결합될 수 있다. 본 발명에 따르는 포접체를 제조하기 위하여 사용되는 특별한 방법은 다양한 기준에 따라 결정된다. 그러므로 예를들어 바이오틴에 의하나 커플링은 바이오틴-매개성 결합이 매우 강력한 비공유적으로 결합을 이루는 반면, 최소한으로 특이적이며 따라서 가장 널리 사용될 수 있는 방법이다. 트랜스글루타미나제와의 효소적 반응은 매우 적은 규모로 수행할 수 있다는 장점이 있다. 화학적 커플링은 통상 대량의 포접체를 합성하는 경우에 사용하며, 이 방법은 또한 바이러스 단백질 또는 펩티드를 커플링시킬 때 가장 좋은 방법이다. 불활성화된 바이러스를 사용하는 경우에는 커플링이 불활성화에 영향을 받지 않는 한, 불활성화는 통상 커플링전에 수행한다.

아데노바이러스와 같은 바이러스 또는 그의 엔도솜분해 성분이 접근할 수 있는 결합 도메인, 예를들어 다중양이온에 결합하는 산성 도메인을 갖고 있는 경우에는, 바이러스(성분)의 다중양이온에 대한 결합은 이온 결합일 수도 있다. 이 경우에 내화 인자와 임의로 포접된 다중양이온의 양전하는 바이러스(성분)의 산성 도메인에 의하여 부분적으로 중성화되고, 나머지 양전하는 핵산에 의하여 필연적으로 중성화될 것이다.

핵산 친화성 물질이 삽입(intercalating) 물질인 경우에는 바이러스(성분)의 특정 커플링에 적합한 링커로 변형시키는데, 예를들어 트랜스글루타미나제와 커플링시키기 위해서는 스페르민 또는 예를들어 활성 에스테르와 같은 화학적 커플링에 적합한 양기능성 그룹으로 변형시킨다.

바이러스(성분) : 핵산 결합 물질의 비는 변화될 수 있으며:이것은 통상 실험적으로,예를들어 일정량의 바이러스(성분)을 상이한 양의 폴리리신과 포접시키고 형질감염에 적합한 포접체를 선별함으로써 정해진다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는 바이러스 성분, 예를들어 엔도솜분해성 바이러스 펩티드를 DNA에 직접 결합시키기 위하여 변형시킬 수 있다. 이러한 목적으로 펩티든 자체는 펩티드 합성에 의해 펩티드를 제조하여 양전하의 아미노산을 신장시키고, 바람직하게는 펩티드를, 가장 바람직하게는 C-말단에서 연장시킴으로써 수득될 수 있는 DNA 결합 도메인을 함유한다.

본 발명에 따르는 또 다른 구체예에서는 엔도솜분해 물질는 비-바이러스성, 임의로 합성 펩티드이다. 본 발명에 따르는 조성물은 바람직하게는 이러한 유형의 펩티드를 핵산 친화성 물질, 예를들어 DNA-내화 인자-폴리리신 복합체에 이온적으로 결합하는 방식으로 함유한다. 그러므로 엔도솜분해성 펩티드의 핵산 복합체내로의 연합(incorporation)은 펩티드가 산성 아미노산 잔기을 통하여 양 전하의 핵산 결합 도메인, 바람직하게는 폴리리신에 결합함으로써 성취된다.

펩티드의 화학적 구조에 따라, 특히 그것의 말단기와 관련하여, 폴리리신에 결합 역시 폴리리신에 대한 펩티드의 결합에 대하여 상기한 방법에 의하여 수행할 수 있다. 이러한 목적에 있어서, 천연적으로 생성된 펩티드가 사용되는 경우에는 포접시키기 위하여 적합한 말단 아미노산으로 변형시킬 수 있다.

비-바이러스성 엔도솜분해성 펩티드를 핵산 복합체 중에 연합시키는 또 다른 방법은 DNA에 결합하는 서열을 갖는 펩티드를 제공하는 것이다. 이러한 서열의 위치는 펩티드의 엔도솜분해서 활성과 상충되지 않아야한다. 그러므로, 예를들어 N-말단이 이 활성을 결정하는 펩티드는 C-말단에 있는 DNA 결합 서열이 연장된다. 이런 종류의 연장부는 동종 또는 이종 양이온 올리고펩티드, 예를 들어 올리고-리신꼬리(tail) 또는 천연 DNA 결합 도메인, 예를들어 히스톤으로부터 유도된 펩티드일 수 있다. 바람직하게는 엔도솜분해성 펩티드의 필수 부분으로서의 이들 DNA 결합 서열은 약 10 내지 40개의 아미노산으로 구성된다. 본 발명에 있어서 이러한 구체예는 고 효율의 복합체을 수득하기위하여 더 많은 비율의 다중양이온을 함유하는 펩티드 포접체에서 보다 DNA 결합 서열에 대한 엔도솜분해성 서열의 비가 더 높게되는 가능성을 부여한다.

비-바이러스 엔도솜분해성 펩티드는 다음의 조건을 만족하여야 한다: 엔도솜분해 활성에 있어서 펩티드에 의해 성취되는 지질막 누출은 pH 7에서 보다는 저 pH(5-6)에서 더 높아야한다. 게다가, 막의 파괴된 영역이 거대 DNA 복합체를 통과시키기에 충분하도록 커야한다(작은 구멍은 불충분하다). 펩티드가 이러한 조건을 만족시키는지 여부를 결정하기 위해서는, 펩티드를 유리 또는 결합 형태 및/또는 DNA 복합체에 통합시킨 형태로 적용하는 시험관내 시험을 수행할 수 있어야 한다. 이러한 검정법에는 유전자 발현의 상승을 측정할 수 있는 리포좀 누출 검정법 또는 적혈구 누출 검정법 및 세포 배양 실험이 포함될 수 있다. 이러한 유형의 시험을 실시예에 기재하였다. 예비 적정(titration)에서 수득된 유전자 전이 효율을 검정함으로써 적정량의 펩티드를 결정할 수 있다. 다양한 펩티드 및 복합체의 적정 조성물의 효율은 세포 유형에 따라 달라질 수 있다는 것에 유의하여야 한다.

통상의 막 파괴성 펩티드는 양친매성 서열, 즉 지질막과 상호 작용할 수 있는 소수성 면 및 막 파괴 부위에서 수성상을 안정화시키는 친수성 면을 함유한다.

천연 막-파괴성 펩티드는 통상 소형 펩티드 또는 거대 폴리펩티드의 펩티드 도메인의 여러 가지 예가 있다. 이러한 펩티드는 천연적으로 그 기능에 따라서, 소위 막 파괴 펩티드(예를들어 자연 바이러스의 펩티드) 및/또는 막 융합 펩티드(예를들어 피막 바이러스)로 분류할 수 있다.합성 펩티드면에서는 엔도솜 파괴의 목적에 있어서는 두 부류의 펩티드 서열 모두가 유용할 수 있다. 대부분의 천연 펩티드는 양친매성 α-나선을 형성할 수 있다.

pH-특이성은 산성 잔기를 추정되는 양친매성 α-나선의 친수성 면상에 나선인 산성 pH에서만 형성될 수 있는 방식으로 통합됨으로써 달성될 수 있으나, 중성 pH에서는 음 전하의 산성 잔기간의 전하 반발로 인하여 나선 형성이 제한된다. 이 특성은 또한 천여적으로 생성된 서열(예를들어 인플루엔자 HA-2 N-말단)에서도 발견할 수 있다.

pH-특이적 막-파괴 특성을 갖는 전합성 양친매성 펩티드는 문헌에 기재되어 있다(Subbarao et al., 1987 및 Parente et al., 1990). 이 펩티드(유리형)는 막에서 작은 화합물 만을 방출시킬 수 있는 작은 구멍만을 형성하는 것으로 밝혀졌다(Parente et al., 1990).

비-바이러스성, 임의로는 합성 펩티드를 사용하는 본 발명의 구체예에 따르면 통상 다음의 단계를 밟는다:양친매성 펩티드 서열은 천연적으로 생성된 또는 인공적 펩티드의 그룹에서 선택된 것이다. 이런 종류의 펩티드는 당업자에게는 공지된 것이며, 참조에는 표2에 기재한다. 필요하다면, 산성 잔기(Glu, Asp)를 펩티드의 막 파괴 활성을 더 pH-특이적으로 하기위하여 도입시킬 수 있다(예를들어, 본 명세서 제171면에 기재한 실시예37에 따르는 인플루엔자 헤마글루티닌 펩티드의 이중 산 돌연변이체). 필요하다면, 폴리리신에 대한 펩티드의 결합을 촉진하기 위해서 산성 잔기를 도입시킬 수도 있다. 이러한 다중양이온 결합 도메인을 제공하기 위한 하나의 방안으로 C-말단 산성 연장부, 예를들어 올리고-Glu-꼬리를 도입시킬 수 있다.

본 발명에 적합한 엔도솜분해성 펩티드는 또한 천여 생성 및 인공 펩티드의 융합에 의하여 수득될 수도 있다. 본 발명에 있어서의 실험은 문헌에 기재된 합성 펩티드로 부터 유래된 다양한 펩티드로 수행하였다(Parente et al., 1990). 본 발명의 실험에 있어서 사용된 몇가지 유도체는 펩티드 GALA를 결합시킴으로서 또는 그것을 인플루엔자 펩티드 서열 또는 그의 변형, 예를들어 실시예33에 따르는 EALA-Inf 및 EALA-P50로 표시된 펩티드로 변형시킴으로써 수득된다.

펩티드 서열의 길이는 양친매성 나선의 안정성에 있어서 중요할 수 있다: 나선의 연장부는 천연 단백질로 부터 유도된 안정화된 단백질 면에서 결여된 짧은 도메인에 안정성을 증가시킬 수 있다.

펩티드의 엔도솜분해 활성을 증가시키기 위해서는 호모다이머(homodimer), 헤테로다이머(heterodimer) 또는 올리고머(oligomer)를 형성시킨다: 본 발명의 실험에서는 P50 다이머는 모노머 보다 훨씬 더 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다.

본 발명자는 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의해 매개되는 DNA 유입에 대한 합성 펩티드의 효과를 밝혀내었다. 다양한 상이한 펩티드를 합성하고 그들의 리포솜 및 적혈구 누출 능력을 검정하여 TIB 73 세포 및 NIH 3T3 세포에서의 루시페라제 발현에 대한 이들의 효과를 시험하였다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는 엔도솜분해 물질이 비-펩티드성 양친매성 물질일 수 있다.이러한 물질이 본 발명에 적합하기 위하여 충족되어야 할 요건은 필수적으로 양친매성 펩티드에서와 동일한 것, 소위 핵산 복합체내로 통합되기 위한 능력, pH 특이성, 등이다.

본 발명의 또 다른 측면은 핵산을 고등 진핵세포내로 도입하기 위한 고등 진핵 세포내로 유입되는 핵산, 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 포접체 복합체에 관한 것이다.복합체는 포접체가 핵산 친화성 물질 및 핵산 친화성 물질에 결합하여 포접체/핵산 복합체의 일부로서 세포내고 내화하여 세포내에 들어간 후에 복합체가 위치하는 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출하는 능력을 갖고 있는 엔도솜분해 물질로 구성됨을 특징으로한다.

본 발명에서 사용되는 핵산 복합체는 핵산이 핵산 친화성 물질과 복합체가 실질적으로 전기적 중성이 되는 방식으로 결합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 엔도솜분해 물질은 다중양이온에 공유결합한 바이러스 또는 바이러스 성분이다.

본 발명에 있어서, 에도솜분해성 포접체에는 엄밀히 말하여 비록 이런 종류의 “포접체”는 포접, 즉 두 성분을 서로 결합시킴으로써 수득되는 것은 아니지만, DNA에, 예를들어 그들의 기본적 연장을 통해 직접 결합하는 엔도솜분해 물질을 DNA 결합 도메인에 이온 결합시킨 포접체가 포함된다. 본 발명에 따르는 조성물의 성분으로서의 이런 유형의 엔도솜분해 물질의 기능은 그들이 엔도솜분해 물질 및 DNA 결합 도메인의 포접에 의하여 합성되는지 여부 또는 DNA 결합 도메인이 원래 엔도솜분해 물질에 존재하는지 여부와는 별개이다.

본 발명에 따르는 복합체의 또 다른 바람직한 구체예는 엔도솜분해성 포접체 이외에도, 통상적으로 포접체에서는 동일한 다중양이온인 엔도솜분해성 다중양이온 포접체의 경우에 핵산 친화성 물질이 표적 세포에 친화성을 갖는 내화 인자에 포접된 또 다른 포접체를 함유한다. 이러한 본 발명의 구체에는 특히 표적 세포가 엔도솜분해성 포접체의 일부로서 사용된 바이러스에 대한 수용체를 전혀 또는 거의 갖고 있지 않은 경우에 사용된다. 본 발명의 이 구체에의 또 다른 적용예는 바이러스 성분, 예를들어 천연적으로 생성된, 임의로 변형시킨 펩티드, 비-바이러스성, 임의로 합성된 엔도솜분해성 펩티드 또는 원격 종으로 부터의 바이러스로서 자체로는 형질감염시킬 세포내로 투과할 수 없는 것을 사용할 경우이다. 추가의 내화 인자-결합 인자 포접체의 존재하에서 엔도솜분해 포접체는 두 번째 포접체의 내화 능력으로부터 두 번째 포접체와 함께 핵산에 결합하여 이하 “혼합(combination) 복합체” 또는 “3원성(ternary) 복합체”로 기재하는 생성된 복합체의 일부로서 세포내로 유입됨으로써 수득된다. 이설에 구애되지 않더라도, 혼합 복합체는 세포에 의하여 내화 인자에 특이적인 표면 수용체에 결합하거나, 바이러스 또는 바이러스 성분을 사용할 경우에는 바이러스 수용체에 결합하거나 두 수용체 모두에 결합함으로써 유입되어 수용체-매개성 세포내 함입에 의하여 내화된다. 엔도솜분해 물질이 엔도솜으로부터 방출되는 경우에는 복합체에 함유된 DNA도 또한 세포질내로 방출됨으로써 리소좀성 분해를 피한다.

본 발명의 HeLa 세포로의 실험에서, 거의 모든 세폴르 유리 아데노바이러스로 형질 감염시킬 수 있였다. 간세포에 대한 효능은 레포터 DNA를 폴리리신-트랜스페린 포접체에 결합시켜 아데노바이러스에 결합시킨 3원성 DNA 복합체를 사용하는 경우에 훨씬 더 개선될 수 있었다.여기에서, 엔도솜에서 엔도솜분해성 바이러스 및 리간드/수용체 복합체의 동시-국소화(co-localization)는 BNL.CL2 및 HepG2 세포와 같은 다양한 세포에 대하여 사실상 모든 세포에서 형질 감염의 수율을 보장한다. 이러한 상황은 트랜스페린을 함유하는 3원성 DNA 복합체가 주로 아데노바이러스 수용체보다는 트랜스페린 수용체를 통하여 K562 세포에 접근하는 실험에 가까울 수 있다.

뜻밖에도, 3원 복합체는 소량으로도 DNA에 전달된다. 그러므로 30pg DNA/3×10⁵세포의 투입으로 1.8×10⁴광 단위(루시페라제 코드화 플라스미드의 발현에 의해 생성됨)가 수득된다. 이 투입량은 세포당 60 DNA 분자 및 1 PFU(plaque forming unit)의 바이러스 정도의 양이다. 이것은 세포당 2×10⁵DNA 분자를 사용하는 더 효율성이 적은 칼슘 침전 프로토콜에 비유될 만 하다(Sambrook et al., 1989). 그러므로 본 발명은 매우 소량의 DNA로 고등 진핵 세포를 효율적으로 형질전환시킬 수 있으므로 본 발명의 기술 분야에서는 중요한 진보를 가져오는 것이다.

DNA 복합체에서 엔도솜분해성 포접체 구성원으로서의 바이러스, 바이러스 성분 또는 비-바이러스성 엔도솜분해 물질의 존재는 다음과 같은 장점을 갖는다:

1) 특히 바이러스 또는 바이러스 성분을 사용하는 경우에는 엔도솜분해 물질 자체가 내화 인자를 구성하거나 또 다른 내화 인자(예를들어 트랜스페린 또는 아시알로페투인 등)와 함께 DNA에 결합할 수 있으므로 핵산 복합체로 유전자 전이 기술의 적용성이 어졌다. 이러한 방식으로 문제의 바이러스에 대한 수용체를 전혀 갖고 있지 않은 세포에서도 바이러스의 양성적 효과를이용할 수 있다.

2) 엔도솜분해성 포접체를 DNA에 결합시키는 것은 이들이 공동으로 세포내로 유입되는 것을 보장하므로 유전자 전이 효율이 증가한다. 바이러스 및 DNA의 공동 유입 및 방출은 또한 효율적인 유전자 전이에 요구되는 생체내 용도에 특히 중요한 DNA 및 바이러스의 양을 감소시킬수 있다.

본 발명의 목적상 “내화 인자”라는 용어는 세포에 결합한 다음 세포내 함입, 바람직하게는 수용체-매개 세포내 함입에 의하여 내화되는 리간드 또는 그의 단편, 또는 세포막의 요소와 융합에 의하여 운반되는 결합 또는 내화 인자를 의미한다.

적합한 내와 인자로는 트랜스페린(Klausner et al., 1983), 콘알부민(Sennett et al., 1981), 아시알로글리코프로테인(아시알로트랜스페린, 아시알로로소뮤코이드 또는 아시알로페투인과 같은)(Ashewell et al., 1982), 렉틴(Goldstein et al., 1980 및 Shardon, 1987) 또는 갈락토스를 함유하며 아시알로글리코프로테인 수용체에 의하여 내화되는 물질; 만노실화 글리코프로테인(Stahl et al., 1987), 리소좀 효소(Sly et al., 1987), LDL(Goldstein et al., 1982), 변형된 LDL(Goldstein et al., 1979), 수용체를 통해 세포내로 유입되는 리포프로테인(apo B100/LDL); HIV 단백질 gp 120 과 같은 바이러스 단백질 ; 항-CD4, 항-CD7 와 같은 세포 표면 항원에 대한 항체(Mellman et la., 1984;Kuhn et al.,1982, Abrahamson et al., 1982) 또는 그의 단편; 인터루킨 1 (Mizel et al., 1987), 인터루킨 2(Smith et al., 1985), TNF(Imamure et al., 1987), 인터페론(Anderson et al., 1982)와 같은 사이토킨; CSF(콜로니-촉진 인자:colony-stimulating factor)(Walker et al.,1987); 인슐린(Marshall,1985), EGF(표피 성장 인자:epidermal growth factor)(Carpenter, 1984)과 같은 인자 및 성장 인자; PDGF(혈소판-유래 성장인자:platelet-derived growth factor)(Heldin et al., 1982), TGFβ(형질전환 성장 인자:transforming growth factor β)(Massague et al., 1986), 신경 성정 인자(Hosang et al., 1987), 인슐린-유사 성장 인자 I(S초미초 et al., 1986), LH, FSH(Ascoli et al., 1978), 성장 호르문(Hizuka et al., 1981), 프롤락틴(Posner et al., 1982), 글루카곤(Asada-Kubota et al., 1983), 갑상선 호르몬(Cheng et al., 1980); α-2-마크로글로불린 프로테아제(Kaplan et al., 1979); 및 “무력화 독소”가 포함된다. 추가의 예로는 Fc 수용체 또는 SIgs(표면 면역글루불린:surface immunoglobulins)에 결합하는 안티-면역글로불린 항체에 대한 리간드인 면역글루불린 또는 그의 단편이 포함된다. 리간드는 천연 또는 합성품일 수 있다(참고:Trends Pharmacol. Sci., 1989 및 이 문헌의 인용문헌).

본 발명에 따르는 인자의 적합성을 위한 필수 요건은 다음과 같다:

a) 이들은 핵산이 도입될 특정 세포에서 내화될 수 있고 이들이 결합 인자와 포접된 경우에도 내화 능력에 영향을 받지 거나 단지 약간만 영향을 받으며,

b) 이러한 특성면에서, 그들이 사용하는 경로를 통해 핵산을 “등에 지고” 세포내고 운반할 수 있다.

본 발명에 따르는 실험에 있어서, 내화 인자 또는 혼합 복합체 형태의 추가의 내화 인자의 본 발명에 따르는 사용 범위는 각각 인체 및 마우스 트랜스페린-폴리리신-포접체, 아시알로페투인-폴리리신-포접체, 갈락토스-폴리리신-포접체, 소맥 배아글루티닌-폴리리신-포접체, T-세포-특이적 gp120-pL 및 안티-CD7-pL 포접체, LDL-pL-포접체, Ig-pL 및 안티-Ig-pL 포접체 및 내화 인자를 전혀 함유하지 않는 DNA-폴리리신-복합체에 의해 예시된다. 그리고 본 발명에 따르는 바이러스 포접체의 구체예는 추가의 내화 인자-결합 인자 포접체를 함유하지 않는 DNA 및 폴리리신-포접체 바이러스(또는 바이러스 성분)에 의해 예시된다.

특히 엔도솜분해 물질이 유리 바이러스인 경우에는 내화 인자, 엔도솜분해 물질이 바이러스 또는 바이러스 성분 또는 엔도솜분해 포접체의 일부인 비-바이러스성 펩티드인 경우에는 “추가의” 내화 인자의 사용이 허용되는지 또는 핵산 복합체의 유입을 개선시키는지의 여부를 결정하기 위해 예비 시험을 수행할 수 있다. 이들 시험은 먼저 예를들어 핵산 및 바이러스 포접체로 구성된 복합체로 된 바이러스 포접체의 경우에는 (추가의) 내화 인자 없이 핵산 복합체로, 두번째로 핵산이 표적 세포에 수용체가 있는 추가의 내화 인자를 함유하는 또 다른 포접체와 결합시킨 복합체로 병행하여 형질 감염시키는 것으로 이루어진다.

내화인자를 사용할 경우 또는 추가의 내화 인자를 사용할 경우, 즉 혼합 복합체를 사용할 경우에는 특히 표적 세포, 예를들어 특이적 표면 항원 또는 허용된 세포 유형에 특이적인 수용체에 의하여 이들 세포 유형내로 핵산의 표적화 전이가 제한된다.

본 발명에 있어서 사용될 수 있는 핵산 친화성 물질로는 가능하다면 상이한 쇄 길이의, 예를들어 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴과 같은 동종 유기 다중양이온 또는 둘 또는 그 이상의 상이한 양 전하 아미노산을 갖는 이종 다중양이온이 및 또한 폴리에틸렌이민과 같은 비-펩티드성 합성 다중양이온이 포함된다. 적합한 핵산 친화성 물질에는 스페르민 또는 스페르미딘 뿐 아니라 히스톤 또는 프로타민 또는 동종체 또는 그의 단편과 같은 다중양이온 천연 DNA-결합 단백질이 있다.

복합체가 실질적으로 전기적 중성인 한은 다중양이온의 길이는 중요하지 않다. 바람직한 폴리리신 쇄의 길이는 약 20 내지 1000개 리신의 단량체이다. 그러나 주어진 길이의 DNA에 있어서는 다중양이온의 임계 길이는 없다 DNA가 6,000 bp 및 12,000 음전하로 구성된 경우에는 DNA 1몰당 다중양이온의 양은 예를들어 다음과 같을 수 있다.:

60몰의 폴리리신 200

30 몰의 폴리리신 400: 또는

120 몰의 폴리리신 100, 등.

본 발명의 분야의 통상의 기술자는 통상의 실험으로서 다중양이온 길이 및 몰 양의 다른 조합을 선택할 수 있다.

포접체의 일부로서 다른 바람직한 핵산 친화성 물질은 트립토판 및/또는 타이로신 및/또는 페닐알라닌을 함유하는 에디듐 이량체, 아크리딘 또는 삽입 펩티드와 같은 삽입 물질들이다.

핵산 복합체의 정량적 조성물에 있어서는 통상적으로 세포에 전이되는 핵산을 우선 결정한다. 핵산은 일차적으로 세포에서 성취되는 생물학적 효과에 의해, 예를들어 결손 유전자를 치환하기 위한 목적으로는 발현되는 유전자 또는 유전자 부위에 의해, 또는 억제되는 유전자의 표적 서열에 의해 한정된다. 세포내로 전달되는 핵산은 DNA 또는 RNA 일 수 있으며, 동시에 핵산 서열에도 제한이 없다.

본 발명의 조성물은 종양 백신을 사용하기 위하여 종양 세포에 적용할 경우에는 세포에 도입될 DNA는 면역 조절 물질, 예를들어 IL-2, IL-4, IFN-감마, TNF-α와 같으 사이토킨을 코드화하는 것이 바람직하다 사이토킨의 혼합물, 예를들어 IL-2 및 IFN-감마를 코드화하는 DNA가 특히 유용할 수 있다. 종양 세포에 도입될 수 있는 또 다른 유용한 유전자에는 다중 약물 내성 유전자(mdr)가 있다. 본 발명에 있어서는 트랜스페린-폴리리신 및 저밀도 리포프로테이 포접체를 종양 세포(흑색종 세포)의 형질 감염을 위해서 아데노바이러스와 함께 성공적으로 사용하였다. 적용의 특이성에 따라서, 리간드가 문제의 특정한 경우의 종양 세포의 유형에 적합한가 여부를 결정하기 위하여 예비 시험을 실시할 수 있다.

또한 둘 또는 그 이상의 상이한 핵산 서열, 예를들어 적합한 조절 서열의 조절하에서 두 개의 상이한 단백질을 코드화하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 또는 상이한 cDNA를 함유하는 두 개의 상이한 플라스미드 작제물을 세포내로 도입할 수도 있다.

특정한 유전자 서열을 억제하기 위한 세포내 전이에 대한 치료학적으로 효율적인 억제 핵산에는 안티센스-RNA 또는 리보자임을 전사하는 유전자 작제물이 포함된다. 또한 올리고뉴클레오티드, 예를들어 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포내로 도입할 수도 있다 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 15개의 뉴클레오티드 또는 그 이상을 함유한다. 임의로 올리고뉴클레오티드는 다량체화 될 수 있다. 리보자임을 세포내에 도입할 경우에는, 이들은 안정화시키는 유전자 요소, 예를들어 tRNA 유전자 요소로 구성된 유전자 작제물의 일부로서 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 유형의 유전자 작제물은 공지되어 있다(EP A 0 387 775). 억제성 핵산 및 그의 활성 기전은 본 발명의 분야의 기술장에게는 잘 알려진 것이며; 문헌에 기재되어 있다[참고:Helene and Toulme, 1990; T마묘믐 and Inouye, 1990].

유전자, 예를들어 상보성으로 인하여 바이러스 유전자를 억제하는 핵산 분자와는 달리 상이한 억제 작용을 하는 유전자를 사용할 수 있다. 예로는 소위 트랜스-도미넌트 돌연변이를 갖는 바이러스 단백질을 코드화하는 유전자가 있다(Herskowitz, 1987). 세포에서의 유전자 발현은 상응하는 야생형 단백질을 지배하여 “세포성 면역”을 획득하게 하여, 바이러스 복제를 억제함으로써 세포를 보호하는 단백질을 생성한다. 복제 및 발현에 필요한 바이러스 단백질이 트랜스-도미넌트 돌연변이, 예를들어 HIV 복제를 억제하는 것으로 밝혀진 GAG-, Tat 및 Rev 돌연변이가 적합하다(Trono et al., 1989; Green et al., 1989; Malim et al., 1989).

세포내 면역을 달성의 또 다른 기전은 필수적인 바이러스 단백질에 대한 결합부위를 함유하는 RNA 분자, 예를들어 소위 TAR 데코이의 발현과 관련된다(Sullenger et al., 1990).

체성 유전자 요법에서 사용될 수 있고 본 발명에 의한 유전자 작제물의 성분으로서 세포내로 전이될 수 있는 유전자의 예에는 인자 VIII(A형 혈우병) (참고:Wood et al., 1984), 인자 IX(B형 혈우병)(참고:Kurachi et al., 1982), 아데노신 데아미나제(SCID) (참고:Valerio et al., 1984), α-1 안티트립신(폐기종) (참고:Ciliberto et al., 1985) 또는 낭포성 섬유증 막간 전도성 조절 유전자(참고:Riordan, J.R. et al., 1989)가 포함된다. 이들 예에는 어떤 종류의 제한도 없다.

핵산의 크기에 있어서는 넓은 범위에서 가능한데; 본 발명에 의하여 약 0.15kb(리보자임을 함유하는 tRNA 유전자의 경우) 내지 약 50kb 또는 그 이상의 유전자 작제물을 세포내로 전이시킬 수 있으며; 더 작은 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드로서 사용할 수도 있다.

본 발명은 유전자 서열에 아무런 제한도 받지 않는다는 사실 및 아주 대형의 유전자 작제물이라도 본 발명의 방법에 의하여 전이시킬 수 있다는 사실로 인해 확실히 가장 넓은 적용시킬수 있음이 분명하다.

핵산으로부터 출발하여 핵산 친화성 물질, 바람직하게는 유기 다중양이온 물질이 핵산 복합체를 형성하였는지, 바람직하게는 수득된 복합체는 실질적으로 전기적 중성인지를 결정한다. 복합체가 엔도솜분해성 포접체에 추가하여 내화 인자 및 핵산 친화성 물질을 함유하는 경우에는, 양 포접체 모두의 양이온 성분을 전기적 중성 측면과 관련하여 고려하여야 한다.

초기 발명의 과정에서 핵산의 세포내로의 최적 전이가 내화 인자-다중양이온/핵산 복합체가 실질적으로 전기적 중성이 되는 핵산에 대한 포접체의 비율을 선택할 경우에 달성될 수 있다는 것을 확인하였다. 세포내로 유입된 핵산의 양은 몇 개의 트랜스페린-다중양이온 포접체가 비공유적으로 결합된 다중양이온에 의해 치환되는 경우에도 감소하지 않는다는 것을 확인하였으며: 어떤 경우에는 DNA 유입이 실질적으로 증가하기조차 하였다(Wagner et al., 1991a). 복합체의 DNA는 직경 80 내지 100㎚의 환상 구조로 압축된 형태로 존재하는 것으로 관측되었다. 그러므로 전기적 중성 및 압축 구조의 달성이라는 두가지 파라미터를 고려하여 다중양이온의 앙을 선택하며, 한편 전기적 중성을 달성하는 면에서는 핵산의 전하로 부터 유래되는 다중양이온의 양도 또한 통상적으로 DNA의 압축을 보장한다.

그러므로, 본 발명의 추가의 구체예에서, 복합체는 또한 결합 인자와 동일 또는 상이한 비공유적으로 결합된 형태의 핵산-결합 물질, 즉 포접체에서 핵산 친화성인 물질을 함유한다. 엔도솜분해 물질이 유리 바이러스인 경우에는 복합체는 핵산 및 내화인자 포접체를 함유한다. 엔도솜분해성, 예를들어 바이러스 포접체를 사용하는 경우에는, 핵산이 이들 포접체와, 임의로 추가의 내화 인자의 포접체와 함께 결합한다. 특성 및 양적인 면에서 비-공유결합된 “유리”핵산 친화성 물질의 선택은 포접체, 특히 포접체에 함유된 결합인자를 고려하여 결정하며: 예를들어 결합인자가 DNA 농축시킬 능력이 없거나 제한되는 경우에는 통상적으로 복합체의 효율적인 내화를 달성한다는 면에서, 고도로 이런 특성을 갖고 있는 DNA 친화성 물질을 사용하는 것이 추천할만하다. 결합 인자 자체가 핵산 축합 물질이고 이미 효율적인 내화에 충분하도록 핵산을 압축시킨 경우에는 다른 기전에 의해 발현을 증가시키는 핵산 친화성 물질을 사용하는 거시 바람직하다. 본 발명에 따르면 적합한 비공유적으로 결합된 핵산 친화성 물질은 핵산을 축합 및/또는 세포에서 기대하지 않은 분해로부터 핵산을 보호할 수 있는 화합물, 특히 상기 기재된 다중양이온성 성질을 갖는 물질을 포함한다. 적합한 또 다른 그룹의 물질은 핵산에 결합함으로써 세포의 발현 기구에 대한 핵산의 접근성을 증가시킴으로써 그의 전사/발현을 증가시키는 물질을 포함한다. 이런 종류의 물질의 예는 DNA를 압축시키는 능력이 있어서 세포내에서의 발현을 상승시키는 염색체 비-히스톤 단백질 HMG1이다.

엔도솜분해 물질 및/또는 내화 인자/핵산 친화성 물질/핵산(들)에 대한 몰비를 결정하는 경우에는 핵산 복합체가 형성되어, 형성된 복합체가 세포에 결합하여 내화될 수 있고, 그 자체 또는 엔도솜분해 물질의 도움으로 엔도솜으로 부터 방출된다는 점을 주의하여야 한다.

내화 인자/결합 인자/핵산 비율은 특히 전달되는 핵산(들)의 크기 및 구조에 적합한 기준인 다중양이온 분자의 크기 및 양전하 그룹의수 및 분포에 좌우된다. 바람직하게는 내화 인자:핵산 친화성 물질의 몰비는 약 10:1 내지 1:10의 범위일 것이다.

효율적인 형질감염을 위해 포접체를 작제 및 합성하고 포접체:DNA의 최적 비율을 결정한 다음, 필요하다면 핵산 친화성 물질에 의하여 치환될 수 있는 포접체 부분의 양을 적정에 의하여 측정할 수 있다. 다중양이온을 결합 인자 및 핵산 친화성 유리 물질로서 사용할 경우에는 다중양이온은 동일하거나 상이할 수 있다.

바이러스 포접체를 사용하는 본 발명의 구체예에 있어서, 복합체에 함유된 성분의 비율을 결정하기 위한 적합한 방법은 우선 세포내로 도입시킬 유전자 작제물을 정하고, 상기한 바와 같이 특정 형질감염에 적합한 바이러스 또는 바이러스 성분을 찾아내는 것으로 이루어진다. 그리고나서 바이러스 또는 바이러스 성분을 다중양이온에 결합시키고 유전자 작제물과 복합체를 형성시킨다. 일정한 양의 바이러스 포접체로 부터 출발하여, 표적 세포를 이 (일정한) 양의 포접체로 처리하여 DNA의 농도를 감소시키거나, 그 역으로 함으로써 적정을 수행한다. 이러한 방식으로 DNA:바이러스 포접체의 최적 비율을 결정한다. 추가의 내화 인자를 사용하는 경우에는 예를들어 일정량의 DNA로 부터 출발하여 적정에 의해 내화 인자 포접체에 대한 바이러스 포접체의 비율을 측정하기 위한 방법이 될 수 있다.

복합체는 성분으로서 모두가 묽은 용액의 형태로 존재할 수 있는 ⅰ) 핵산, ⅱ) 바이러스 포접체, 임의로 ⅲ) 내화 인자/결합 인자 포접체, 및 임의로 ⅳ) 핵산 친화성 비공유적으로 결합된 물질과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 다중양이온이 결합 인자 및 동시에 “유리” 다중양이온으로서 사용될 경우에는, 통상적으로 무엇보다도 “유리” 다중양이온과 포접한 혼합물을 제조한 다음, 이 혼합물을 DNA와 결합시키는 것이 바람직하다. 포접체(들) 또는 다중양이온에 대한 DNA의 최적 비율은 적정 실험, 즉 일정량의 DNA를 사용하고 포접체(들)/다중양이온 혼합물의 양을 증가시키는 일련의 형질감염 실험에 의해 결정한다. 혼합물에서 포접체(들):다중양이온의 최적 비율은 일상적인 실험 또는 적정 실험에서 사용된 혼합물의 최적 배율을 비교함으로써 수득된다.

DNA 복합체는 생리학적 염 농도에서 제조될 수 있다. 또 다른 가능성은 높은 염 농도(약 2M NaCl)를 사용하여 서서히 희석 또는 투석함으로써 순차적으로 생리학적 조건에 맞추는 것이다.

핵산, 포접체(들), 가능하다면 핵산 친화성 유리 비공유적으로 결합된 물질을 혼합하는 가장 적함한 순서는 전 실험에 의해 결정된다. 어떤 경우에는 먼저 핵산을 포접체(들)과 결합시킨 다음, 핵산 친화성 유리 물질, 예를들어 다중양이온을 가하는 것이, 예를들어 트랜스페린-에티듐 이량체 및 폴리리신의 포접체의 경우에 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 내화 인자 또는 추가의 내화 인자는 각각 트랜스페린이며 결합 인자는 다중양이온이다. “트랜스페린”이라는 용어는 천연 트랜스페린 및 수용체에 결합하여 세포내로 전달되는 트랜스페린 변형 모두를 의미한다.

핵산은 내화 인자-다중양이온 포접체가 핵산과 결합하는 복합체의 형태로 유입된다. 핵산 친화성 비공유적으로 결합된 물질이 함유되어 있는 경우에는 다중양이온과 동일하거나 상이한 다중양이온을 포접체 중에 함유하는 것이 바람직하다.

혼합 복합체의 경우에는 핵산은 한편으로는 내화 인자에 포접되고 다른 한편으로는 엔도솜분해성 포접체가 핵산과 결합하는 복합체의 형태로 내화된다.

혼합 복합체 중에서 유리 바이러스와 함께 또는 바이러스 포접체와 함께 사용되는 내화 인자 및 다중양이온의 포접체는 화학적 방법 또는, 다중양이온의 폴리펩티드인 경우에는 재조합에 의하여 제조될 수 있다(이 제조 방법의 참조:EP 388 758).

또한 포접체는 글리코프로테인, 예를들어 트랜스페린 및 결합인자를 글리코프로테인의 하나 또는 그 이상의 탄수화물 쇄를 통하여 서로 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 통상적인 커플링 방법에 의하여 제조된 포접체와는 달리, 이런 종류의 포접체는 사용된 링커 물질로 부터 유래되는 변형을 피할 수 있다. 커플링에 적합한 단지 하나 또는 몇개의 탄수화물 그룹을 갖는 글리코프로테인, 예를들어 트랜스페린 인 경우에는 또한 이들 포접체는 글리코프로테인/결합 인자에 대한 결합 부위면에서 정확하게 한정된다는 장점이 있다.

사용된 엔도솜분해 물질의 양 및 그의 농도는 수행되는 특정 형질 감염에 좌우된다. 바이러스 및 핵산 복합체의 내화 및 엔도솜으로부터의 방출를 보장하는데에 필요한 최소량의 바이러스 또는 바이러스 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 바이러스 (포접체)의 양은 특정 세포 유형에 맞추며 무엇보다도 이런 유형의 세포에 대한 바이러스의 가염성이 고려되어야 한다. 또 다른 기준은 특히, 내화 인자와 관련하여 표적 세포가 특정 수의 수용체에 대한 내화 인자 및 결합 인자의 특정 포접체이다. 또한, 바이러스(포접체)의 양은 도입되는 DNA의 양에 좌우될 것이다. 통상적으로, 대량의 DNA를 요구하는 일시적 형질감염에서는 더 많은 양의 바이러스를 필요로 하는 반면, 소량 만의 DNA를 요구하는 안정한 형질감염에 대해서는 소량의 바이러스로도 충분하다. 특정의 적용에 있어서는 형질 감염시키려하는 표적 세포로, 가능하다면 혼합 세포 집단 및 적정에 의하여 최적의 바이러스 농도를 결정하기 위하여 형질 감염을 보여주는 벡터 시스템으로 예비 시험을 수행하며, 이때 사용되는 DNA는 편리하게도 실제 용도와 크기면에서 크게 일치하는 유전자 작제물이며 유전자 전이 효율의 보다 용이한 측정을 위하여 레포터 유전자를 함유한다. 본 발명에 있어서, 루시페라제 및 β-갈락토시다제 유전는 이러한 시험에서 적합한 레포터 유전자임이 밝혀졌다.

본 발명의 또 다른 측면은 핵산, 핵산 결합 물질 및 임의로 내화 인자의 복합체를 고등 진균 세포에 도입하기 위한 방법이다. 이 방법은 세포를 그 자체 또는 핵산 복합체의 성분으로서 세포내에 내화되어 핵산 복합체가 세포에 들어간 다음에 위치하는 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시킬수 있는 능력을 갖는 물질과 접촉시킴을 특징으로 한다.

통상적으로 핵산 복합체 및 엔도솜분해 물질을 동시에 사용하는 것이 바람직하나, 이들은 차례로 사용할 수도 있다. 분리 사용하는 경우에는 성분이 효율적인 동시 접촉이 되도록 보장하기 위해서 단계가 서로의 바로 다음에 수행되는 한은 사용 순서가 중요한 것은 아니다. 분리 물질에 있어서 유리 바이러스를 사용하는 경우에는 복합체와 바이러스 제제의 동시 투여는 핵산 복합체을 함유하는 형질감염 배지의 일부로서 바이러스를 갖게 됨으로써 보장될 수 있다. 유리 바이러스의 동시 투여의 경우는 핵산 복합체 및 바이러스 물질을 투여 전에 함께 혼합시킨다.

바람직한 구체예에 있어서, 엔도솜분해 물질는 혼합 복합체의 성분이다.

또한 유전자 발현을 중가시키기 위하여, 본 발명에 따르는 조성물을 반복하여 투여할 수 있다.

바람직한 구체에에서 세포는 일차 종양 세포이다. 특히 바람직한 구체예에서 핵산은 면역 조절 물질, 바람직하게는 상리토킨에 대하여 코드화하는 하나 또는 2이상의 서열을 함유하는 DNA이다.

또 다른 구체예서는 세포는 근원세포, 바람직하게는 일차 근원세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 섬유아세포, 바람직하게는 일차 섬유아세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 간세포, 바람직하게는 일차 간세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 일차 상피 세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 일차 기도 상피 세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 T-세포이다.

또 다른 구체예서는 세포는 B-세포이다.

표1은 본 발명의 형질 감염의 성공을 다양한 세포 유형으로 예시하여 보여준다.

본 발명의 조성물로 또한 개 혈우병 B 섬유아세포의 형질감염에 대하여 연구하였다. 루시페라제 및 β-갈락토시다제가 이들 세포에서 성공적으로 발현될 수 있었다. 게다가, 이 시스템을 1.4kb 개 인자 IX cDNA를 이들 섬유아세포내로 운반하기 위하여 사용하였다. 샌드위치 ELISA에서 개 인자 IX는 형질감염후 24시간에 검출될 수 있었다.

특정한 경우에는 엔도솜분해 물질에 추가하여 리소솜향성(lysosomatropic) 물질을 사용하는 것이 바람직한데, 예를들어 엔도솜분해 물질이 펩티드 포접체 또는 레트로바이러스인 경우에는 이들의 엔도솜분해 활성은 반드시 pH-의존적이 것은 아니다.

리소솜향성 물질이 프로타제 및 뉴클레아제의 활성을 억제하며, 따라서 핵산의 분해를 억제시킨다는 것은 공지되어 있다(Luthmann and Mangusson, 1983). 이들 물질에는 클로로퀸, 모넨신, 니게리신 및 메틸아민이 포함된다. 본 발명에서는 모넨신이 몰로니 바이러스를 사용할 경우에는 레포터 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 클로로퀸을 존재는 사실상 100%의 K562 세포에서 트랜스페린-매개성 DNA 전이에 의하여 도입된 레포터 유전자의 발현을 유도한다는 것을 보여줄 수 있다. BNL.CL2 및 HepG2 간세포는 K562 세포에서 만큼 클로로퀸에 대해 반응하지 않지만, 가해준 복제 결손 또는 화학적으로 불활성화된 아데노바이러스의 엔도솜분해 특성을 노출시킬 경우에는 5 내지 10% 수준으로 이들을 형질감염시킬 수 있다.

본 발명의 도움으로 생물학적 벡터의 장점이 증가된다. 수용체 분배의 결과로서 내화 인자 및 바이러스 모두에 대한 굴성(tropism)이 있다. 특정 세포 집단에 대한 이들 두 성분을 맞춤으로써 본 발명의 치료학적 사용에 있어서 특히 중요한 더 큰 선택성을 달성할 수 있다. 이 측면이 폐에서의 본 발명의 치료학적 사용에 있어서 특히 중요한데, 이는 폐에 있는 상이한 세포 집단은 그 특정 세포 집단, 예를들어 기도의 섬모 세포에 대하여 더 높은 결합 친화성을 갖는 벡터의 디자인이 요구될 수 있는 상이한 수용체를 갖고 있기 때문이다. 사용될 수 있는 리간드에는 예를 들어 렉틴이 포함된다. 이러한 포접체의 디자인에는 그 자체로서 포접체 구조(conformation)에 있어서 가능한 리간드의 결합 수준에 있어서의 확실성이 요구된다. 이러한 확실성은 예를들어 조성물이 치료학적으로 사용되는 조직에서 면역조직화학적 염색법에 의해 리간드에 대한 항체를 사용하는 경우에 성취될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 활성 성분으로서 치료학적 활성의 핵산 복합체, 바람직하게는 유전자 작제물의 일부로서, 임의로 포접화된 엔도솜분해 물질 및 임의로 내화인자 포접체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 식염수, 또는 인산염-완충 식염수, 또는 DNA 복합체가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 용해성을 갖도록 하는 담체와 같은 약제학적으로 허용되는 어떤 불활성 담체라도 사용할 수 있다. 약제학적 조성물을 제제화하는 방법은 문헌에 기재된 방법이다(Remington's Pharmac eutical Science, 1980).

본 발명은 약제학적 조성물 그 자체로서 적용에 있어서 최대의 가능한 유연성을 갖는 장점을 제공한다. 본 발명의 조성물은 동결건조품으로 또는 딥(deep)-냉동 상태의 적합한 완충액으로 할 수 있다. 이것은 또한 용액으로 즉시 사용 시약으로 제공할 수 있으며, 바람직하게는 냉동하에서 운송 및 저장할 수 있다. 임의로 분리된 포접 상태, DNA 결합 물질과 포접되거나 포접될 준비가 되어 있는, 임의로 내화 인자, 임의로 유리 다중양이온과 포접된 임의로 형질 감염에 필요한 성분, 즉 DNA, 엔도솜분해 물질은 역시 본 발명의 대사인 형질감염 키트(kit)의 성분으로서 분리 또는 부분적으로 분리된 적합한 완충액으로 존재할 수 있다. 본 발명에 따르는 형질 감염 키트는 시험관, 바이알 또는 본 발명에 따르는 고등 진핵 세포를 형질감염시키는 데에 필요한 장치를 함유하는 것과 같은 하나 또는 2 이상의 용기를 함유하는 담체로 이루어진다. 이런 종류의 형질감염 키트에 있어서 첫 번째 용기에는 예를들어 다양한 항원을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 상이한 DNA를 함유될 수 있다. 두 번째 용기에는 형질 감염 키트를 모듈(module) 시스템으로 사용할 수 있도록 해주는 하나 또는 그 이상의 상이한 내화 인자 포접체가 함유될 수 있다. 구성물이 즉시 사용형 제제로서 제공되는지 또는 분리되어 사용 직전에 혼합하여 사용하는 것인지는, 적용상 특이성과는 달리 통상의 안정성 시험에서 결정될 수 있는 복합체의 안정성에 좌우된다. 바람직한 구체예에서 저장시 안정한 것으로 증명된 트랜스글루타미나제-결합 아데노바이러스-폴리리신 포접체는 키트 용기중에서 하나로서 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 바이오틴화 아데노바이러스 및 스트렙타비딘-폴리리신은 별개의 용기에 넣어서 사용전에 혼합한다.

치료적 용도로서는 조성물을 약제학적 조성물의 일부로서 전신, 바람직하게는 정맥 경로로 투여할 수 있다. 이렇게 사용되는 표적 기관으로는, 예를들어 간장, 비장, 폐, 골수 및 종양이 포함될 수 있다.

국소 적용의 예로는 폐 조직이 있다(본 발명에 따르는 조성물을 점적 주입을 위한 유체 형태 또는 흡입용 에어로솔로 사용함). 두 번째 방법으로는, 분화된 폐세포에 대한 리간드의 고특이성에 추가하여 또한 폐 조직 환경에 존재하고 유전자 전이를 방해할 수 있는 다양한 인자(예를들어 섬모 운동의 마비, 기관지 점막의 쇠약, 프로테인아제 저해제의 사용)에 영향을 주는 것이 필요할 수도 있다. 추가로, 본 발명의 약제학적 조성물은 간장, 근육 조직, 종양내에 직접 주사하거나 위장관에 국소 투여함으로써 투여할 수 있다. 약제학적 조성물의 또 다른 투여 방법은 담즙 배액(draining) 시스템을 통한 적용이다. 이 적용 방법은 조성물과 혈액 성분과의 상호작용을 피하면서 모세담관에서 간세포 막에 직접 접근하게 해준다.

최근에는 유전자를 마우스의 근섬유에 운반하는 데에 근원세포(미성숙 근육세포)의 사용가능성이 밝혀졌다. 근원세포는 유전자 생성물을 혈액내로 분비한다는 것이 밝혀졌기 때문에, 이 방법은 근육 이영양증과 관련된 결함과 같은 근육 세포의 유전적 결함의 치료 이외에도 더 넓게 적용될 수 있다. 그러므로, 조작된 근원세포를 혈액에서 작용하거나 혈액에 의하여 전달되는 유전자 생성물을 운반하는데에 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 실험에서는 근원세포 및 근관 배양물을 일차적인 것이라 하더라도 고효율로 형질감염시킬 수 있는 것으로 나타났다. 가장 성공적인 형질감염 배지는 바이오틴화 아데노바이러스, 트랜스페린-폴리리신 및 스트렙타비딘-폴리리신의 혼합 복합체를 함유한다. 레포터 유전자 생성물인 루시페라제 및 β-갈락토시다제 이외에도 인자 VIII이 근세포에서 발현된다. 그리고, 닭 아데노바이러스 CELO는 추가의 내화 인자로서 소맥 밀 아글루티닌을 함유하는 혼합 복합체로 사용된다.

또한 치료적 적용으로는 생체외(ex vivo)에서, 처치된 세포, 예를 들어 골수세포, 간세포 또는 근원세포를 체내에 복귀시키는 방볍이 있을 수 있다(Ponder et al., 1991,Dhawan et al., 1991). 본 발명에 따르면 또 다른 생체의 적용은 소위 “종양 백신”과 관련된다. 이 치료적 접근의 원리는 종양 세포를 환자로 부터 분리하여 사이토킨-코드화 DNA로 세포를 형질전환시키는 것이다. 다음 단계는 세포를, 예를들어 방사선 조사에 의해 세포가 더 이상 복제하지는 않지만 여전히 사이토킨을 발현시키도록 하는 방법이 포함될 수 있다. 그리고 나서 유전적으로 변형된 세포를 백신으로 세포를 분리한 환자에게 사용한다. 백신화된 부위의 환경에서는, 분비된 사이토킨은 그 중에서도 세포독성 T 세포를 활성하시킴으로써 면역 시스템을 활성화시킨다. 이들 활성화된 세포는 인체 다른 부위에서 효과를 나타낼 수 있으며, 비-처치된 종양 세포도 공격할 수 있다. 그러므로, 종양의 재발 및 전이로 발전할 위험이 감소된다. 종양 백신을 유전자 요법에 적용하는데 적합한 방법은 문헌에 기재되어 있다(Rosenberg et al., 1992). 로젠버그에 의해 상기 문헌에 제시된 레트로바이러스 벡터 대신에 본 발명의 유전자 전이 시스템을 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 실험에서는 1차 흑색종 세포를 폴리리신-결합 아데노바이러스 및 트랜스페린-폴리리신의 혼합 복합중에 함유된 레포터 유전자로 성공적으로 형질감염시켰다.

본 발명은 또한 주어진 항원에 대한 숙주 면역 반응을 결정하는 검정법으로 사용될 수도 있다. 감염된 세포를 사멸시키는 항원-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)는 바이러스 감염 또는 종양에 대한 숙주 방어에 있어서 중요한 역할을 한다. T-세포 및 항원-출현 세포(APC)간의 상호작용은 HLA[인체 림프구성 항원(human lymphocytic antigen) = MHC, 대조직적합성 분자(major histocompatibility molecule)]-제한적이며; 시험관내에서 CTL 사멸 검정법에 있어서 항원을 발현시키는 세포의 CTL 사멸을 연구하기 위해서는 통상 자가유래(autologous) 표적 세포를 의미하는 정확한 HLA 조건하의 CTL에 대한 항원이 출현하여야 한다. CTL-사멸 검정법은 다음과 같이 수행할 수 있다:APC를 항원 코드화 서열을 함유하는 DNA 작제물로 형질 감염시킨다. 항원 에피토프는 MHC 분류 I 분자에 결합하여 특정 CTL 반응에 대한 표적으로서 세포 표면에 출현할 것이다. 그리하여, 환자의 혈청 샘플로 항온 배양시키면 특이적 CTL의 존재에 따라 APC가 분해될 것이다. 분해는 예를들어 혈청에 가하기 전에 APC에 결합시킨 방사성 크롬의 방출을 모니터하므로써 측정한다. 확립된 프로토콜(Walker et al., 1989)은 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)로 형질감염시킴으로써 항원 유전자를 발현시키기 위하여 유도된 B-LCL(B-lymphoblastoid cell lines)를 사용한다. 그러나, 약 하룻동안에 항원을 효율적으로 발현시킨 세포는 백시니아의 분해 효과로 인하여 사멸된다. 이 문제는 DNA 작제물을 코드화하는 항원, 예를들어 HIV 또는 종항 항원을 섬유아세포에서 항원을 발현시키기 위하여 섬유아세포에 도입시키기 위한 본 발명의 유전자 전이 시스템을 사용하는 CTL 사멸 검정법에 의하여 극복될 수 있다. 1차 섬유아세포는 생검으로 수득하는 것이 용이하고 생육이 용이하며, 본 발명에 의하여 특히 고효율(약 50 내지 70%)로 형질감염시킬 수 있으이 밝혀졌다. 이러한 검정법은 백신을 설게하는 관점에서는 킬러 세포에 의해 인식된 에피토프를 측정하는 것이 유용하다. 게다가, 이들은 주어진 항원에 대한 개개의 HLA 제한된 면역 반응을 결정하기 위해 편리하게 사용될 수 있다.

전이된 사실상 모든 세포에서 유전자의 높은 발현 수준이 얻어지기 때문에, 본 발명은 재조합 단백질을 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 여기에는 전이되는 DNA 서열 및 분자량 각각에 대한 제한은 전혀 또는 거의 없다. 또한 본 발명의 조성물로 형질감염시킬 수 있는 광범위한 세포 유형이 있다. 그러므로 거의 모든 세포 유형을 재조합 단백질이 높은 생물학적 활성의 생성물을 보장하는 충실하고 충분히 변형된 번역후 프로세싱된 형태로 제조되는 재조합 단백질의 제조에 사용될 수 있다.

세포내로의 유전자 전이는 루시페라제 및 FN-α에 대한 실시예에 나타난 바와같이 수행될 수 있으며, 실제적으로 목적 단백질 생성물을 생성하는 특정 유전자 작제물을 운반할 수 있다. 목적 단백질 생성물은 형질감염된 세포 배양물(특정 단백질 생성물에 대한 프로토콜에 따르는 세포 상등액 또는 적당한 세포 균등액)로부터 형질 감염후 24 시간 내지 1 주일 또는 그 이상 후에 회수할 수 있다.

본 발명에 따르는 유전자 전이 시스템의 재조합 단백질 제조에 사용하는 것은 다음과 같은 장점이 있다:

1) 고형질감염 효율(형질 감염된 세포의 90% 이상이 높은 수준으로 유전자를 발현시킬 수 있다)로 인하여 형질감염된 세포의 예비선택이 필요없으며 안정한 세포주를 확보할 필요가 없다. 소규모의 세포 배양도 유용한 양의 단백질을 생성하는 데에 충분할 수 있다.

2) 대형 유전자 작제물을 운반할 수 있다. 지금까지는 48kb 이하의 성공적으로 운반하였다.

3) 유전자 발현은 적당한 번역후 프로세싱 및 변형(예를들어 응고 인자의 비타민 K-의존성 카르복실화(Armentano, et al., 1990), 또는 세포 유형 특이적 글리코실화)을 보장하는 세포내에서 실행될 수 있다.

4) 이 방법을 사용함으로써 유전자 발현에 사용할 수 있는 표적 세포 유형이 선택 범위가 더 넓어졌다.

[도면에 대한 간단한 설명]

제1도는 아데노바이러스감염이 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

제2도는 포접체-DNA-복합체 용량 효과를 나타낸 그래프이다.

제3도는 수용체-매개 세포내 함입에 의해 발생되는 아데노바이러스에 의한 트랜스페린-폴리리신 매개성 유전자 전이의 증가가

제3(a)도는 결합된 DNA

제3(b)도는 수용체-결합된 DNA

제3(c)도는 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 미치는 효과을 나타낸 그래프이다.

제4도는 아데노바이러스 감염이 선택된 세포주에서 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

제5도는 유전자 발현의 증가가 유전자 전이에 기초하는지 또한 상호활성화(transactivation)에 기초하는지에 관하여 실험한 그래프이다.

제6도는 테트라-갈락토스 펩티드-폴리리신 포접체에 관한 구조식이다.

제7도는 아데노바이러스 존재하에서 HepG2 세포의 pRSVL-DNA 복합체로의 형질감염에 대한 그래프이다.

제8도는 아데노바이러스 존재하에서 HepG2 세포의 pCMVL-DNA 복합체로의 형질감염에 대한 그래프이다.

제9도는 TIB733 세포를 pCMVL-DNA 복합체로의 형질감염을 나타내는 그래프이다(A:클로로퀸과의 비교 수치, B:아데노바이러스 존재하).

제10도는 아데노바이러스 존재하에서 pCMVL-DNA 의 T-세포내로의 전이를 나타내는 그래프이다(A:H9 세포, B:간세포).

제11도는 아데노바이러스의 UV-불활성화를 나타낸 그래프이다(A:UV-불활성화 바이러스에 의한 HeLa 세포에서의 유전자 전이의 효과 증가, B:UV-불활성화와 유전자 전이 효과의 비교).

제12도는 포름알데히드에 의한 아데노바이러스의 불활성화를 나타낸 그래프이다.

제13도는 몰로니 바이러스 존재하에서 NIH3T3 세포의 트래스페린-폴리리신-DNA 복합체로의 형질 감염을 나타내는 그래프이다.

제14도는 NIH3T3 세포의 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체로의 형질 감염에서의 유전자 전이의 효과는 몰로니 바이러스에 의한 것인지를 나타내는 그래프이다.

제15도는 몰로니 바이러스의 유전자 전이 효과에 영향을 미치는 트랜스페린과 그의 수용체 사이의 상호작용을 나타낸 그래프이다.

제16도는 레트로바이러스의 유전자 전이 효과에 대한 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.

제17도는 인플루엔자-헤마글루티닌 펩티드; 리포좀 누출 검정법의 결과를 나타낸 그래프이다.

제18도는 인플루엔자 펩티드-폴리리신 포접체의 존재하에서 K562-세포의 트랜스페린-폴리리신 포접체의 형질 감염을 나타내는 그래프이다.

제19도는 인플루엔자 펩티드-폴리리신 포접체의 존재하에서 HeLa-세포의 트랜스페린-폴리리신 포접체로의 형질 감염을 나타내는 그래프이다.

제20도는 아데노바이러스 존재하에서 HeLa 세포를 트랜스페린-폴리리신-pCMV-β-gal-DNA로 형질전환시킨후에 그 위치에서(in situ) β-갈락토시다제 발현 증거를 나타낸 그래프이다.

제21도는 아데노바이러스 존재하에서 HeLa 세포에서 그 위치에서(in situ) β-갈락토시다제 발현을 나타낸 그래프이다.

제22도는 아데노바이러스 존재하에서 48 kb 코스미드로의세포의 형질감염을 나타낸 그래프이다(A:HeLa 세포, B:신경아세포종 세포).

제23도는 화학적 커플링에 의한 아데노바이러스-폴리리신의 제조를 나타낸 그래프이다.

제24도는 화학적으로 커플링된 아데노바이러스 포접체에 의한 K562 세포의 형질 가에 대한 그래프이다.

제25도는 화학적으로 커플링된 아데노바이러스 포접체에 의한 HeLa 세포의 형질 감염에 대한 그래프이다.

제26도는 트랜스글루타마나제에 의한 폴리리신의 아데노바이러스에의 결합을 나타낸다.

제27도는 트랜스글루타미나제-커플링된 아데노바이러스-폴리리신 포접체에 의한 쥐 간세포의 형질 감염을 나타낸 그래프이다.

제28도는 비커플링된 바이러스와 비교하여 트랜스글루타미나제-커플링된 아데노바이러스-폴리리신 포접체에 형질 감염 효율의 증가를 나타낸 그래프이다.

제29도는 바이오틴-스트렙타비딘-커플링된 아데노바이러스 포접체로의 HeLa 세포의 형질 감염을 나타낸 그래프이다.

제30도는 바이오틴-스트렙타비딘-커플링된 아데노바이러스 포접체로의 K562 세포의 형질 감염을 나타낸 그래프이다.

제31도는 섬유아세포종 세포의 바이오틴-스트렙타비딘-커플링된 아데노바이러스 포접체에 의한 48 kb 코스미드로의 형질 감염을 나타낸 그래프이다.

제32도는 클로로퀸 존재하 또는 아데노바이러스 존재하에서 간세포의 형질 감염을 나타낸 그래프이다.

제33도는 다양한 엔도솜분해 물질 존재하에서 K562 세포의 형질감염을 나타낸 그래프이다.

제34도는 다양한 엔도솜분해 물질 존재하에서 세포 수준으로 형질감염 프로토콜을 레포터 유전자로서 β-갈락토사다제와 비교한 그래프이다.

제35도는 전면 생장(confluent), 비-분화성 간세포에서 루시페라제 발현의 장기 지속성을 나타낸 그래프이다.

제36도는 유리 형태의 CELO 바이러스 존재하 및 바이오틴-스트렙다비딘을 통해 폴리리신에 결합된 CELO 바이러스 형질감염된 HeLa 세포에서의 발현을 나타내는 그래프이다.

제37도는 유리 아데노바이러스 존재하 및 바이오틴/스트렙다비딘-커플링 된 아데노바이러스 존재하에서 근원세포 및 근관의 형질감염을 나타내는 그래프이다.

제38도는 1차 근원세포 및 근관 배양물의 형질감염을 나타내는 그래프이다.

제39도는 HeLa 세포 및 C2C12 근원세포의 형질감염에 있어서 아데노바이러스 d1312 및 CELO 바이러스의 비교 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

제40도는 렉틴 리간드를 사용한 CELO 바이러스로의 형질 감염 증가를 나타내는 그래프이다.

제41도는 C1C12 근원세포 및 근관 배양물에서 인자 VIII cDNA의 발현을 나타내는 그래프이다.

제42도는 아데노바이러스 단백질에 의한 DNA 운반의 증가를 나타내는 그래프이다(A:HeLa 세포, B:섬유아세포).

제43도는 간세포내로의 DNA 전이에 대한 갈락토스-인플루엔자 펩티드 포접체의 효과를 나타낸 그래프이다.

제44도는 간세포내로의 DNA 전이에 대한 갈락토스-아데노바이러스 포접체의 효과를 나타내는 그래프이다.

제45도는 B-림프아구종 B-세포내로의 유전자 전이를 나타내는 그래프이다.

제46도는 리노바이러스 존재하에서 트랜스페린-폴리리신으로의 DNA 전이를 나타내는 그래프이다(A:유리 리노바이러스, B:포접 리노바이러스).

제47도는 1차 인체 흑색종 세포의 트랜스페린 및 아데노바이러스 포접체를 함유하는 혼합 복합체로의 형질 감염을 나타내는 그래프이다.

제48도는 1차 인체 흑색종 세포의 LDL- 및 아데노바이러스 포접체를 함유하는 혼합 복합체로의 형질 감염을 나타내는 그래프이다.

제49도는 생체내에서 랫트의 기도 상피 세포내로의 유전자 전이를 나타내는 그래프이다.

제50도는 양친매성 펩티드를 리포좀 누출 검정법으로 실험한 결과에 대한 그래프이다.

제51도는 양친매성 펩티드를 적혈수 누출 검정법으로 실험한 결과에 대한 그래프이다.

제52도는 양친매성 펩티드 존재하에서 BNL CL.2 세포의 형질감염을 나타내는 그래프이다.

제53도는 양친매성 펩티드 존재하에서 NUH3T 세포의 형질감염을 나타내는 그래프이다.

제54도는 다양한 엔도솜분해 물질 존재하에서 형질 감염된 HeLa 세포에서 IFN-α의 발현을 나타내는 그래프이다.

하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 달리 특정하지 않는한 하기의 물질 및 방법을 사용하였다.

[트랜스페린-폴리리신/DNA 복합체의 제조방법]

a) 인체 트랜스페린-폴리리신 포접체

문헌(Wagner et al., 1991b)에 기재된 방법을 사용하여 폴리리신을 트랜스페린의 탄수화물 측쇄에 커플링시킨다.

6ml의 30mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5 중의 280㎎(3.5μ㏖)의 인체 트랜스페린(iron-free, Sigma) 용액을 0℃로 냉각시키고 1㎎(51μ㏖)의 과요오드산 나트륨을 함유하는 750㎕의 30mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5를 가한다. 이 혼합물을 빙욕중에서 90분간 암실에 세워 방치시킨다. 저분자 생성물을 제거하기 위해, 겔 여과 하여(Sephadex G-25, Pharmacia) dir 250㎎의 산화된 트랜스페린(닌히드린 검정법으로 측정함)을 함유하는 요액을 수득한다. (알데히드를 함유하고 아니스알데히드로 염색할 경우 유색 반응이 일어나는 산화 형태를 확인하기 위해, 샘플을 실리카겔 박막 플레이트에 적가하고 건조시켜 플레이트를 p-아니스알데히드/황산/에탄올(1/1/18)에 침지시켜 건조 및 가열시킨다.) 변형된 트랜스페린 용액을 4.5㎕의 100mM 나트륨 아세테이트중의 1.5μ㏖의 혀광-표지된 평균 190 개리신 단량체의 쇄 길이를 갖는 폴리(L)리신을 함유하는 용액에 신속하게(10 내지 15분)가한다. 이 용액의 pH는 1M 탄산나트륨 완충액을 가하여 pH 7.5 로 조절한다. 1시간 간격으로 4 뱃치의 28.5㎎(450μ㏖)의 나트륨 시아노보로하이드리드를 혼합물에 가한다. 17시간 후에 2ml의 5M 염화나트륨을 가하여 용액을 총 0.75m의 농도로 조절한다. 반응 혼합물을 양이온 교환 칼럼(Pharmacia Mono S HR 10/10)에 로딩(loading)하고 일정 함량의 25mM HEPES, pH 7.3에서 0.75M 내지 2.5M의 염화나트륨의염 구배로하여 유출시킨다. 칼럼을 로딩하는 경우 및 초기의 구배에서 높은 염 농도가 다중양이온 포접체를 수득하는 데에 필수적이다. 약한 형광 활성을 갖는 몇몇 트랜스페린(약 30%)을 유출시켜 흘려보내고; 대두수가 형광표지된 포접체를 1.35M 내지 1.9M의 염 농도에서 유출시켜 3개 분획으로 수집한다. 이들 분획(유출된 순서로)을 수득하여 2 1 25mM HEPES pH 7.3에 대하여 2 롯트(lot)의 투석을 한 후, 45㎎(0.56 μ㏖)의 트랜스페린을 함유하는 A분획(TfpL190A)은 366n㏖ 의 폴리리신으로 변형시키고, 72㎎(0.90 μ㏖)의 트랜스페린을 함유하는 B 분획(TfpL190B)은 557n㏖의 폴리리신으로 변형시키며 7㎎(85n㏖)의 트랜스페린을 함유하는 C 분획(TfpL190C)은 225n㏖의 폴리리신으로 변형시킨다. 이것을 즉시 사용하지 않을 경우에는, 트랜스페린 포접체를 액체 질소로 급속-냉동(flash-frozen)시켜서 무-철(iron-free) 샹태로 -20℃에서 보관한다. 철을 혼합시키기 전에, 샘플(0.5 내지 1㎎)을 염화나트륨으로 생리학적 염 농도(150mM)로 조절한다. 철은 ㎎ 트랜스페린 함량 당 4㎕의 10mM 철(III) 시트레이트 완충액(200mM의 시트레이트를 함유하며, 중탄산나트륨을 가하여 pH 7.8로 조절함)으로써 혼합시킨다. 철을 함유하는 포접물을 DNA 결합시키기 위하여 사용하기 전에 소량씩 분할한 다음, 액체 질소또는 드라이 아이스/에탄올에서 급속 냉동시켜 -20℃에서 저장한다. (이 방법은 해동 및 동결의 반복은 포접체의 활성을 상실시킨다는 것이 밝혀졌기 때문에 바람직한 것으로 확증되었다.)

b) 쥐 트랜스페린 폴리리신 포접체

인체 트랜스페린에서와 유사한 방법을 사용하였고, 여기에서 커플링은 탄수화물 측쇄로 수행한다. 15.5n㏖ 쥐 트랜스페린 및 13n㏖ pL290의 포접체를 4.1㎎(51n㏖)의 쥐 트랜스페린 및 2.1㎎(34n㏖)의 pL290으로부터 수득한다.

[플라스미드-DNA]

a) pRSVL-DNA

350㎕ HBS(150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7.3) 중의 6㎍의 DNA 플라스미드 pRSVL(루이스 육종 바이러스 LTR 인헨서/프로모터(Uchida et al., 1977, De Wet et al., 1987)의 조절하에서 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라제 유전자를 함유하며, 트리톤-x 분해 표준법(Maniatis)을 사용하여 제조한 다음, CsCl/EtBr 평형 밀도 구배 원심분리하여, 부탄올-1로 탈색시키고 10mM 트리스/HCl pH 7.5, 1mM EDTA에 대해 투석한다)를 150㎕ HBS 중의 12㎍의 트랜스페린-폴리리신 포접체와 세포에 가하기 30분 전에 혼합한다.

b) pCMV-DNA

플라스미드 pCMV는 플라스미드 pSTCX556(Severne et al., 1988)의 BamHI-삽입체를 제거함으로써 제조하고, 이 플라스미드를 클레노(Klenow) 단편으로 처리하여 루세페라제를 코드화하는 서열을 함유하는 플라스미드 pRSVL로부터 HindIII/Sspl 및 클레노-처리 단편을 삽입하거나, β-갈락토시다제(Macgregor and Caskey, 1989)를 코드화하는 서열을 사용한다. 복합체 결합은 pRSVL과 유사하게 수행한다.

[바이러스 시료의제조]

a) 아데노바이러스 시료

Ela 부위에 결손이 있는 아데노바이러스 균주 d1312(Jones and Shenk, 1979)를 사용한다. 바이러스의 복제는 Ela-트랜스-보족 세포주 293에서 수행하며, 정제는 문헌(Davidson and Hassell, 1987)에 기재된 대규모로 실시한다. 정제된 바이러스는 저장 완추액(100mM 트리스, pH 8.0, 100mM NaCl, 0.1% BSA, 50% 글리세롤) 또는 HBS/40% 글리세롤에 넣어 소량씩 -70℃에서 저장한다. 비리온 농도는 추출된 게놈성 바이러스 DNA(일반식:10¹²개의 바이러스 입자/ml에 상응하는 하나의 광 밀도(OD, A₂₆₀); (Chardonnet and Dales, 1970))를 UV-분광광도 분석함으로써 결정한다.

b) 레트로바이러스-시료

몰로니 쥐 백혈병 레트로바이러스 N2를 에코트로픽 패키징 라인(ecotropic packaging line)(Keller et al., 1985, Armentano et al., 1987)에서 패키징시킨다. 세포를 발현하는 바이러스로 부터 상등액을 수지하고 액체 질소중에 급속 냉각시켜 -20℃에서 저장한다. 실시예에서 사용된 상등액은 NIH3T3 세포로 네오마이신-내성 콜로니 형성에 의하여 측정한 경우 약 10⁶cfu/ml의 역가를 갖고 있었다. 바이러스 농도 실허에서는 상등액이 질소 압력하에서 아미콘(AMICON) 교반 세포 농축기로 300kD 배제(exclusion) 막(FILTRON)을 통과하였다. 보통 이 방법에 의하여 10 내지 30ml의 상등액이 10배 농축되었다.

[세포 및 배지]

HeLa 세포를 5%의 열-불활성화 소 태아 혈청(FCS), 100 I.U./ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민을 첨가한 DMEM-배지중에서 항온 배양하였다. WI-38, MRC-5, 및 KB 세포는 10% 열-불활성화 FCS, DMEM 배지중의 항생물질, 10mM의 불필수 아미노산 및 2mM의 글루타민을 첨가하 EMEM-배지(이글(Eagle's)의 변형 필수 배지)중에서 항온배양하였다. 호흡 낭포성 섬유증 샹피 세포주(Yankaskas et al., 1991에 기재된 방법으로 제조됨; CFT1 세포주는 △F508 결실(deletion)을 포함하는 CF-돌연변이에 동형접합성(homozygous)인 특징을 갖는다)는 F12-7X-배지(Wilumsen et al., 1989) 중에서 항온배양한다. 이러한 유전자 전이 실험에 있어서 세포는 이들이 약 50%가 전면 성장(5×10⁵세포)할 때까지 6㎝세포 배양 플레이트에 항온배양한다. 베지를 제거하고 1ml의 DMEM 또는 EMEM/2% FCS 배지를 가한다. 그리고나서 포접-DNA 복합체를 가하고 즉시 아데노바이러스 d1312(세포당 0.05 내지 3.2×10⁴입자)또는 동일 용적의 바이러스 저장 완충액(1 내지 80㎕)를 가한다. 플레이트는 1시간동안 인큐베이터(5% CO2, 37℃)에 다시 넣어 배양시키고 나서, 3ml의 완전 배지를 가한다. 24시간 더 항온배양한 후, 세포를 루시페라제 유전자 발현을 측정하기 위해 회수한다. CFT1의 경우에는 유전자 전이 실험전에 세포를 4시간동안 F12-7X 배지중에서 인체 트랜스페린 없이 항온배양하였다.

하기 세포주는 ATCD로 부터 수득하였으며 주어진 카탈로그 번호로 수득 가능하다: HeLa 세포: CCL2, K562 PVH: CCL 243, HepG2 세포: HB 8065, TIB-73-세포: TIB 73(BNL CL.2), NIH3T3 세포: CRL 1658, 293 세포: CRL 1573, KB 세포: CCL 17, WI-38 세포: CCL 75, MRC 5 세포: CCL 171. H9 세포는 기탁기관(AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Human Service, Catalogue Number 87)으로 부터 입수하였다.

1차 림프구는 EDTA를 함유하는 시험관에 25ml의 제대혈 샘플을 가함으로써 수득되었다. 소량씩 4.5ml의 피콜-하이파크(Ficoll-hypaque;Pharmacia)를 가하고 2,500 rpm에서 15분간 원심분리한다. 상부 혈청층과 투명한 피콜층 사이의 갈색층을 제거한다(약 10ml). 40ml의 IMDM 및 10% FCS를 가하고, 샘플을 1200 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 50ml의 IMDM 및 10% FCS(세포 밀도는 약 2×10⁶세포/ml 이다)에 현탁시킨다. 250㎕의 피토헤마글루티닌(PHA P,DIFCO)을 가하여 배양액을 37℃ 및 5% CO₂에서 48시간동안 항온배양한다. 그리고나서 재조합 IL-2(BMB)를 ml 당 20단위의 농도로 가한다. 그리고나서 세포를 IMDM/20% FCS, 2 유니트/ml IL-2로 1:3으로 나눈다. 세포 분획을 FCS 및 5% DMSO 중에서 액체 질소로 딥 냉동시켰다. 사용전에 세포를 IMDM 및 20%FCS 및 2 단위 ml/IL-2 중에서 생육시킨다.

순차적 결합 연구에서는 HeLa 세포를 4℃에서 2%FCS를 첨가한 1ml의 DMEM 중에서 평형화시킨다. 포접체-DNA 복합체를 다른 시험에서와 같이 가하고 플레이트를 4℃에서 2시간동안 항온배양한다. 그리고나서 플레이트를 얼음처럼 찬 DMEM/2%FCS로 완전히 세척한 다음, 2ml의 이 배지를 가한다. 아데노바이러스 d1312 또는 바이러스 완충액을 가한 다음, 세포를 24 더 인큐베이터에 놓기전에 세포가 천천히 온도 상승되도록 방치한다. 항온배양후 세포를 회수하여 루시페라제 유전자 발현을 측정한다.

[루시페라제 검정법]

세포 추출물 시료, 단백질 함량의 표준화 및 루세페라제 활성의 측정은 문헌(Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990 및 EP 388 758)에 기재된 방법으로 수행한다.

[실시예1 : 아데노바이러스 처리가 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 미치는 영향 측정]

우선 정해진 양의 포접체-DNA 복합체가 유전자를 전이시키는 능력에 대해 바이러스 용량의 증가가 미치는 효과를 측정하였다. 복합체 형성을 위해 6㎍의 플라스미드 pRSVL을 12㎍의 인체 트랜스페린-폴리리신 포접체(hTfpL190B)와 혼합한다. 포접체 DNA 복합체 및 다양한 양의 아데노바이러스 d1312(세포당 0.05-3.2×10⁴바이러스 입자)를 HeLa 세포에 가한다. 이 분석 결과를 제1도에 나타내었다. 루시페라제 활성을 50㎍의 총 세포 단백질의 광 단위로 나타내었다. 이 분석에 따라 첨가된 아데노바이러스 양의 증가는 상응하여 유전자 전이를 증가시킨다. 도면은 2 내지 4회 별도로 실험한 평균을 나타낸 것이며; 바(bar)는 표준편차를 표시한다.

[실시예2 : 포접체-DNA 복합체 용량]

[실시예2 : 포접체-DNA 복합체 용량]

실시예1에서와 같이 포접체-DNA 복합체의 대수적 희석물을 제조하여 일정량의 아데노바이러스 d1312(세포당 1×10⁴바이러스 입자)를 추가하거나 추가하지 않고 HeLa 세포에 가한다. 루시페라제 활성을 실시예1에서와 같이 측정한다. 결과를 제2도로 나타내었다.

[실시예3 : 아데노바이러스에 의한 트랜스페린 폴리리신에 의해 성취되는 수용체-매개성 세포내 함입을 통한 유전자 전이의 증가]

a) 복합체 형성된 DNA의 전이에 대한 아데노바이러스의 효과

형질감염시키기 위하여 다음의 성분을 사용하였다:

트랜스페린-폴리리신 포접체(DNA)를 함유하지 않는 6㎍의 pRSVL-DNA; 6㎍의 pRSVL-DNA 및 6㎍의 비-포접된 폴리리신 270(DNA+pL) ; 6㎍ pRSVL-DNA 및 상기 실시예에서 사용된 12㎍의 트랜스페린-폴리리신 포접체(DNA+hTfpL190B). 이들 형질 감염 물질을 아데노바이러스 d1312에 의해 또는 아데노바이러스 d1312 없이 (세포당 1×10⁴바이러스 입자) HeLa 세포에 첨가한다. 세포 추출물 시료, 총 단백질 함량의 표준화 및 루세페라제 활성의 측정은 상기 실시예에서와 같이 수행한다. 그 시험 결과를 제3(a)도에 기재하였다.

b) 수용체-결합 DNA의 전이에 대한 아데노바이러스의 효과

포접체-DNA 복합체(DNA+hTfpL190B) 또는 폴리리신-DNA 복합체(DNA+pL)를 내화시키지 않고 4℃에서 항온배양함으로써 HeLa 세포에 결합시킨다. 비결합 복하베를 아데노바이러스 d1312(세포당 1×10⁴바이러스 입자) 또는 동량의 완충액을 가하기전에 제거한다. 결합 DNA 복합체 및 아데노바이러스를 내화시키기 위해연속하여 37℃에서 항온배양을 수행하였다. 루세페라제 활성의 측정은 상기한 바와 같이 측정하였다(제3(b)도).

c) 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 대한 아데노바이러스의 효과

6㎍의 pRSVL-DNA 및 12㎍의 트랜스페린-폴리리신(DNA+hTfpL190B)을 함유하는 포접체-DNA 복합체를 세포당 1×10⁴아데노바이러스 입자(d1312) 또는 동량의 열-불활성화된 아데노바이러스 d1312(d1312 h.i.)와 같이 HeLa 세포에 첨가한다. 열-불활성화는 45℃에서 30분간 항온배양하여 수행한다(Defer et al., 1990).

[실시예4 : 선별된 세포주에서 트랜스페린-폴리리신 포접체에 의한 유전자 전이에 대한 아데노바이러스의 효과]

포접체-DNA 복합체(6㎍의 pRSVL+12㎍의 hTfpL190B)를 세포주 CFT1, KB, HeLa, WI38 및 MRC5 균주에 세포에 아데노바이러스 d1312(세포당 1×10⁴바이러스 입자)와같이 또는 아데노바이러스 d1312(세포당 1×10⁴바이러스 입자)없이 세포에 가한다. 다양한 세푸주에 대한 유전자 전이의 효율은 상기 실시예에서와 같이 루시페라제 측정에 의해 결정한다(제4도).

[실시예5 : 상호활성화 수준이 아닌 유전자 전이 수준에서의 루세페라제 유전자 발현 기능의 상승]

K562 10/6 이라 하는 연속적으로 루시페라제를 발현시키는 세포주를 pUCμ로쿠스(Locus)(Collis et al., 1990)의 Clal 부위에 클로닝된 RSV-루시페라제 유전자 분획(pRSVL 의 Apal/Pvul 단편(De Wet et al., 1987))을 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시킴으로써 제조한다. 이 플라스미드를 트랜스페린-폴리리신 포접체와 복합체를 형성시키고 K562 세포를 공지의 방법(Cotten et al., 1990)을 사용하여 이들 복합체로 형질감염시킨다. pUCμ 로쿠스 플라스미드는 네오마이신 내성 유전자를 함유하기 때문에 네오바이신 내성을 바탕으로하여 루세페라제-발현 클론을 선별할 수 있다. 추가의 실험에서 클론 K562 10/6을 선별한다.

양친 세포주 K562 의 분획(200㎕ RPMI 1640 및 2%FCS 중; 샘플당 500,000 세포)을 각각의 경우 500㎕ HBS중의 12㎍의 TfpL+6㎍의 pRSVL 또는 4㎍의 pL 90+6㎍의 pRSVL으로 처리한다. 특정된 양(제5도)의 아데노바이러스 d1312를 37℃에서 1.5시간동안 작용하게 한 다음, 2ml의 RPMI 및 10%FCS를 가한다. 그리고나서 항온배양을 37℃에서 24시간 더 계속하면 세포가 루시페라제 활성을 측정하기 위해 제조된다. 아데노바이러스로 항온배양한 롸 루시페라제 활성이 현저히 증가하는 사실을 알아내었다(제5(a)도). 이것은 TfpL 복합체(25,000 광 단위에 대한 것으로서 2000 광 단위) 및 pL 90복합체(1.9×10⁶광 단위에 대한 것으로서 0) 모두에 적용된다. 이것은 K562 세포주가 pRSVL 폴리리신 복합체를 내화시킬 능력이 있고 이 루시페라제 발현에 의해 측정되는 내화는 아데노바이러스의 존재에 의하여 현저히 증가한다는 것을 보여준다.

유사한 실험을 계속적으로 RSVL 루시페라제 유전자를 발현시키는 K562 10/6 세포로 수행하였으며, 유사한 양의 아데노바이러스 d1312를 사용하였다. 500,000 세포 분획(200㎕ ROMI 및 2%FCS)을 제5(b)도에 특정된 양의 아데노바이러스와 37℃에서 1.5시간동안 항온배양하였다. 그리고나서 양친 세포주에 RPMI 및 10%FCS을 가하였으므로 항온배양을 24시간 더 계속하고 루시페라제 활성을 측정한다. 제5(b)도에 나타난 바와 같이 아데노바이러스로의 이들 세포의 처리는 루시페라제 활성에 뚜렷한 영향을 미치며; 조절 수치는 바이러스 처리 샘플에서의 수치와 동일한 범위이다.

[실시예6 : 아데노바이러스 존재하에서 아시알로페투인-폴리리신 포접체(AFpl) 또는 테트라-갈락토스 펩티드-pL 포접체((gal) 4pL)로의 간세포의 형질감염]

a) 락토실화 펩티드의 제조

프목(Fmoc)법에 의해 제조된(Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer) Cys 에 대한 디티오피리딘기를 함유하는 3.5㎎(1.92μ㏖)의 측쇄 펩티드 Lys-(Nε-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys 를 37℃에서 40㎕의 10mM 수성 나트륨 아세테이트 pH 5 중의 7.85㎎(10μ㏖)의 나트륨 시아노보로하이드리드를 4분획으로가한다. 37℃에서 총 64시간후에 0.5ml의 HEPES pH 7.3 및 15㎎의 디티오트레이톨(DTT)를 가한다. 아르곤하에서 겔 여과(Sephadex G-10, 12x130㎜ 유출액: 20mM NaCl)에 의한 분획화로 유리 머캅토 형태의 3.6ml의 락토실화 펩티드(Ellmann 시험에 상응하는 1.73 μ㏖; 수율 84%)를 수득한다. 변형된 샘플은 아니스알데히드와는 유색반응을 보이나 닌히드린과는 유색 반응을 보이지 않았다: 이는 모든 4N-말단 아미노 그륩이 락토실화되었다는 가정에 일치한다. 테트라-갈락토스 펩티드-폴리리신 포접체에 대한 것을 제6도로 나타내었다.

b) 3-디티오피리딘프로피오네이트-변형 폴리리신의 제조

SPSP(6.0μ㏖)의 400㎕ 15mM 에탄올 용액을 1.2ml의 100mM HEPES pH 7.9 중의 평균 290 리신 쇄 길이를 갖는 0.60μ㏖의 폴리-L-리신 단량체(pL290, 브롬화수소, Sigma)의 겔-여과 용액에 강력하게 혼합하면서 가한다. 1시간후에, 500㎕의 1M의 나트륨 아세테이트 pH 5를 100mM의 나트륨 아세테이트로 겔 여과(Sephadex G-25)한 후에 가하면, 이 용액은 5.77μ㏖의 디티오피리딘 링커를 갖는 0.56μ㏖ pL290를 함유한다.

c) 펩티드의 폴리리신의 포접

포접체를 a)에서 제조된 3ml의 20mM NaCl 중의 1.5 μ㏖의 락토실화 펩티드를 3ml의 20mM NaCl 중에서 아르곤 조건하에서 620㎕의 100mM 나트륨 아세테이트 완충액중의 b)로부터 수득된 0.146㎕의 변형된 pL290과 혼합하여 제조한다. 100㎕의 2M HEPES pH 7.9를 가한 다음, 반응 혼합물을 주변온도에서 18시간 동안 세워둔다. NaCl을 첨가하여 염 농도를 0.66M로 조절하고 포접체를 양이온 교환 크로마토그래피(Pharmacia Mono S column HR 5/5; 구배 유출, 완충액 A: 50mM HEPES pH 7.3; 완충액 B: 완충액 A + 3M NaCl)에 의하여 분리한다. 생성물 분획을 약 1.2M 내지 1.8M의 연 농도에서 유출시켜 두 포접체 분획으로 수집한다: 포접체 분획은 (gal)4pL1 및 (gal)4pL2로 명명한다. 25mM HEPES pH7.3에 대한 투석을 한 결과 24n㏖의 변형된 pL290을 함유하는 (gal)4pL1 및 24.5n㏖의 변형된 pL290을 함유하는 (gal)4pL2의 포접체 분획을 수득한다.

d) 아시알로페투인 포접체의 제조

포접체는 트랜스페린 포접체의 동일한 원리로 제조하며; 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 포접체의 유사한 제조방법은 공지되어 있다(Wu and Wu, 1988).

아시알로페투인의 폴리리신에 대한 커플링은 양기능성 시약 SPDP(pharmacia)로 변형시킨다음 디설피드 가교를 통해 결합시킴으로써 수행된다. 2ml의 100mM HEPES pH 7.9 중의 100㎎(2.2μ㏖)의 아시알로페투인(Sigma) 용액을 세파덱스 G-25 칼럼상에서 겔 여과시킨다. SPDP(5.0μ㏖)의 330㎕의 15mM 에탄올성 용액을 생성된 4ml의 용액에 격렬히 교반하면서 가한다. 주변 온도에서 1시간 후에, 또 다른 겔 여과(Sephadex G-25)에 의해 정제하면; 그 결과 2.5μ㏖의 디티오피리딘 링커로 변형된 5ml의 1.4μ㏖ 아시알로페투인 용액을 수득한다.

포접체는 5ml의 100mM HEPES 중의 1.4μ㏖ 변형된 아시알로페투인을 6.5ml의 200mM HEPES pH 7.6 중의 0.33㎕의 변형된 pL190(1.07μ㏖의 머캅토프로피오네이트 그룹을 함유함: 트램스페린 포접체의 제조와 동일한 방법을 사용함)과 아르곤 조건하에서 혼합하여 제조한다. 반응 혼합물을 주변온도에서 24시간 동안 세워둔다. 포접체를 양이온 교환 크로마토그래피(Pharmacia Mono S column HR 10/10: 구배 유출, 완충액 A: 50mM HEPES pH 7.9: 완충액 B: 완충액 A+3M NaCl)에 의하여 분리하고 칼럼을 로딩하기전에 염화나트륨을 가하여 최종 농도가 0.6M가 될 때까지 가한다. 생성물 분획을 약 1.5M의 염 농도에서 유출시킨다. HBS에 대한 투석한 결과 0.24μ㏖의 pL290로 변형된, 0.52μ㏖의 아시알러페투인을 함유하는 포접체를 수득한다.

e) HepG2 세포의 pRSVL-DNA 복하로의 형질감염

HepG2 세포를 T25 플라스크 중의 DMEM 배지+10%의 FCS 100 I.U./ml 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민에서 생육시킨다. 형질감염은 플라스크당 400,000 세포 밀도로 수행한다. 형질감염시키기 전에, 세포를 10%의 FCS를 함유하는 4ml의 신선한 배지로 세척한다. 형질감염 직전에 세포현탁액(DNA 용액)중의 최종 농도가 100μM가 되도록 클로로퀸(Sigma)을 가한다.

300㎕ HBS 중의 10㎍의 pRSVL-DNA를 제7도에 특정된 양의 TfpL190B 포접체(TfpL), 아시알로페투인 pL90 포접체(AFpL), 폴리리신 290(pL) 또는 테트라-갈락토스펩티드 폴리리신 포접체(gal)4pL 과 170㎕의 HBS 중에서 혼합시킨다. 경쟁 실험으로, 240㎍의 아시알로페투인((gal)4pL+Af) 또는 30㎍의 락토실화 펩티드((gal)4pL+(gal)4)를 30분 후에 가한다. 이 혼합물을 세포에 가하고: 세포를 37℃에서 4시간동안 항온배양한 다음, 형질감염 배지를 4ml의 신선한 DEME 배지+10%FCS로 치환한다. 24시간후에 세포를 루시페라제 측정을 위해 회수한다. 제7도에 주어진 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이 pL 및 TfpL에서 약간의 루시페라제 활성이 나타내고; (gal)4pL은 AfpL 만큼 높은 수치를 나타내며; (gal)4 또는 Af 는 아시알로글리코프로테인와 경쟁하며 예상과 같이 수치를 낮추었다.

f) HepG2 세포의 pCMVL-DNA 복합체로의 형질감염

HepG2 세포를 e)에 기재한 바와 같이 플레이트당 300,000 세포 밀도로 하는 6㎝플레이트에서 생육시킨다. 형질감염시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 1ml의 신선한 배지로 세척한다.

HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 제8도에 특정된 양의 TfpL10B 포접체(TfpL), 아시알로페투인-pL 포접체(AFpL), 폴리리신 290(pLys290), (gal)4pL1 또는 (gal)4pL2과 170㎕의 HBS 중에서 혼합시킨다. 30분후에 2%FCS 및 50㎕의 아데노바이러스 스톡 용액 d1312를 함유하는 1ml의 DMEM을 각 DNA-포접체 복합체에 가한다. 경쟁 실험으로, 특정된 바와 같이 30㎍의 락토실화 펩티드(gal)4pL((gal)4pL+(gal)4 또는 (gal)4pL2+(gal)4)를 가한다. 이 혼합물을 세포에 가하고: 세포를 37℃에서 2시간동안 항온배양한 다음, 10%FCS를 함유하는 1.5ml의 배지를 가한다. 2시간 후에, 형질감염 배지를 4ml의 신선한 DEME 배지+10%FCS로 치환한다. 24시간후에 세포를 루시페라제 측정을 위해 회수하면: 제8도에 주어진 수치는 형질 감염된 세포의 총 루세페라제 활성을 나타낸다. pLys290은 효과를 (gal)4pL은 강력한 효과를 나타내고; 아시알로글리코프로테인 수용체에 대해서 경쟁하는 (힘)4의 추가는 폴리리신에서 수득된 수치로 감소한 수치를 나타낸다.

g) TIB73 세포의 pCMVL-DNA 복합체로의 형질감염

태자 쥐 간 세포주 ATCC TIB73(BNL CL.2: Pat다 et al., 1978(를 100 I.U./ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민을 함유하는 10% 열-불활성화 FCS를 첨가한 “고 글루코스” DMEM(0.4% 글루코스)에서 6㎝ 플레이트에서 37℃로하여 5%CO₂주에서 생육시킨다.

형질 감염은 플레이트당 300,000 세포 밀도로 하여 수행한다. 형질감염 시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 1ml의 신선한 배지로 세척한다.

300㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 특정된 양의 쥐 트랜스페린-폴리리신 290포접체(mTfpL), 아시알로페투인-pL 포접체(AFpL), 폴리리신290(pLys290), (gal)4pL1 또는 (gal)4pL2과 170㎕의 HBS 중에서 혼합시킨다. 30분후에 2%FCS 및 50㎕의 아데노바이러스 스톡 용액 d1312를 함유하는 1ml의 DMEM을 각 DNA-포접체 복합체에 가한다. 이 혼합물을 세포에 가하여 세포를 37℃에서 2시간동안 항온배양한 다음, 10%FCS를 함유하는 1.5ml 배지를 가한다. 2시간 후에, 형질감염 배지를 4ml의 신선한 배지로 치환시킨다. 24시간 후에 루피페라제 측정을 위하여 세포를 회수하고: 제9(a)도에 나타낸 바와 같이 형질 감염된 총 루시페라제 활성을 나타낸다. 경쟁 실험으로, 형질 감염을 클로로퀸 존재하에서 아데노바이러스 없이 수행한다 : 형질감염은 플이트당 300,000 세포수의 세포 밀도에서 수행한다. 형질감염시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 1ml의 신선한 배지로 세척한다. 형질감염 직전에 클로로퀸(Sigma)을 세포 현탁액(+DNA-용액)의 최종 농도가 100μM이 되도록 가한다. 330㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 특정된 양의 mTfpL, AFpL, pLys290, (gal)4pL1 또는 (gal)4pL2 과 170㎕의 HBS 중에서 혼합시킨다. 30분후에 DNA 복합체를 세포에 가한다. 세포를 37℃에서 2시간동안 항온배양한 다음, 10%FCS를 함유하는 1.5ml 배지를 가하고 100μM의 클로로퀸을 가한다. 2시간 후에, 형질감염 배지를 4ml의 신선한 배지로 치환시킨다. 24시간 후에 루시페라제 측정을 위하여 세포를 회수한다. 루시페라제 활성에 대하여 수득된 수치를 제(9(b)도)에 나타내었다.

[실시예 7 : T 세포에 DNA 세포의 도입]

a) 안티CD7 폴리리신190 포접체의 제도

50mM HEPES pH 7.9중에 1.3㎎의 항체의 안티CD7 용액을 SPDP(Pharmacia)의 1mM 에탄올성 용액과 혼합한다. 주변온도에서 1시간후에, 이 혼합물을 세파덱스 G-25 칼럼(50mM HEPES 완충액 pH 7.9)상에서 여과함으로써 33n㏖의 피리딜리티 오프로피오네이트 그룹으로 변형된 1.19㎎(7.5n㏖)의 안티CD7을 수득한다. FITC를 사용하여 형광 표지된 폴리(L)리신190을 SPDP로 유사하게 변형시키고, 그것을 디티오트레이톨로 처리한 다음 dustr하여 겔 여과함으로써 유리 머캅토 그룹으로 변형된 형태를 만든다. 0.2ml의 30mM 나트륨 아세테이트 완충액중에서 35n㏖ 머캅토 그룹으로 변형된 11n㏖의 폴리리신190 용액을 산소 배제시켜 변형된 안티CD7(0.5ml 300mM HEPES pH 7.9중에)와 혼합하여 주변온도에서 하룻밤동안 세워 둔다. 반응 혼합물에 5M NaCl을 가하여 약 0.6M함량으로 조절한다. 포접체의 분리는 이온 교환 크로마토그래피(Mono S, Pharmacia, 50mM HEPES pH 7.3, 염 구배 0.6M 내지 3M NaCl)에 의해 수행하며; 10mM HEPES pH 7.3 에 대한 투석후, 6.2n㏖ 폴리리신190으로 변형된, 0.51㎎(3.2n㏖)의 안티CD7-항체로 구성된 상응하는 포접물을 수득한다.

b) gp120-폴리리신190 포접체의 제조

커플링은 6-말레이미도카프로산의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(EMCS, Sigma)로 변형시킨 다음 티오에테르-링킹(linking)에 의하여 문헌에 공지된 방법에 따라 수행한다(Fujiwara et al., 1981).

티오에테르-링킹된 gp120-폴리리신 190-포접체:

0.45ml의 100mM HEPES pH 7.9 주에 2㎎의 재조합 gp120 용액을 디메틸포름아미드중의 17㎕의 10mM의 EMCS 용액과 혼합한다. 주변온도에서 1시간후에, 이 혼합물을 세파덱스 G-25 칼럼9100mM HEPES 완충액 pH 7.9)상에서 여과한다. 생성된 용액(1.2ml)을 형광-표지되고 30n㏖머캅토 그룹(90㎕ 30mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0중에)으로 변형된 9.3n㏖ 폴리리신 190과 산소 배제시켜 즉시 반응시키고 주변 온도에서 하룻밤동안 세워 둔다. 반응 혼합물과 5M NaCl을 가하여 약 0.6M 함량으로 조절한다. 포접체는 이온 교환 크로마토그래피(Mono S, Pharmacia, 50mM HEPES pH 7.3, 염 구배 0.6M 내지 3M NaCl)에 으해 분리하며: 분획화 및 25mM HEPES pH 7.3에 대한 투석후, 1.9n㏖의 폴리리신 190으로 변형된 0.40㎎의 rgp120(A 분획의 경우), 2.5n㏖의 폴리리신 190으로 변형된 0.25㎎의 rgp120(B 분획), 또는 1.6n㏖의 폴리리신 190으로 변형된 0.1㎎의 rgp120(C 분획)으로 구성된 3 포접체 분획 A. B 및 C를 수득한다.

pCMVL-DNA(6㎍/샘플)을 500㎕ HBS 중의 특정량의 폴리리신90 또는 특정량의 폴리리신 포접체와 복합체를 만든다. 그동안에 H9 세포(2%의 FCS를 함유하는 5ml의 RPMI 중의 10⁶세포) 또는 1차 인체 림프구(Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM) + 2%FCS 중의 3×10⁶세포)분획을 제조한다. 폴리리신-DNA 복합체를 각세포 샘플에 가한다. 5분 후에 특정량의 아데노바이러스 d1312를 가한다. 그리고나서 세포를 37℃에서 1.5시간동안 항온배양한 다음, 15ml의 RPMI(H9 세포의 경우) 또는 IMDM(1차 림프구의 경우) +20%FCS를 각 샘플에 가한다. 세포를 37℃에서 24시간동안 항온배양한 다음, 회수하여 다른 실시예에서와 같이 루시페라제 활성을 측정하기 위한 처리를 한다. 수행된 시험 결과는 제10(a)도(H9 세포) 및 제10(b)도(1차 림프구)에 기재하였으며: H9 세포에서는, gp120 포접체는 아데노바이러스가 없어도 루시페라제 유전자가 뚜렷하게 발현된 반면, 안티CD7 포접체(제10(a)도, 7 내지 9 래인(lane)) 및 gp120 포접체(10 내지 12 래인)에서는 유전자 전이면에서 아데노바이러스에 의해 최고 결과가 얻어졌음을 보여준다. 실험을 수행하는데 있어서, gp120 포접체만이, 따라서 결손된 아데노바이러스 존재하에서만 DNA를 1차 림프구에 도입할 수 있다는 것은 중요한 사실이다(제10(b)도, 7 및 8 래인).

[실시예8 : 아데노바이러스의 불활성화]

a) UV 불활성화

실시예에 대한 도입부에 기재된 바와 같이 제조되어 저장된 아데노바이러스 d1312 시료를 2개의 UV 램프(Philips TUV15(G15 T8) lamp)로 부터 8㎝간격의 얼음상의 2㎝ 직경의 세포 배양 플레이트의 웰에 넣는다(웰당 300㎕). 바이러스를 제11(a)도에 특정된 시간동안 UV 조사에 노출시키고 각 시료 분획의 바이러스 역가를 측정하여 폴리리신-트랜스페린 포접체로 HeLa 세포에 유전자 전이를 증가시키는지 여부 및 그 정도를 측정한다.

세포의 배양 및 형질감염은 반드시 상기 “세포 및 배지”에 기재된 대로 수행하며: 형질감염에 사용되는 성분은 제11(a)도에 기재한다. pCMVL-DNA 및 12㎍의 TfpL의 복합체를 500㎕ HBS 중에서 제조하여 3×10⁵HeLa 세포(1ml DMEM+2%FCS)에 가한다. 약 5분 후에 54㎕의 각 바이러스 시료를 각 배양액에 가하고 이 배양물을 37℃에서 1.5 내지 2시간동안 항온배양시킨다. 그 다음 DMEM+10%FCS의 5ml 분획을 각 배양액에 가하고 37℃에서 24시간동안 계속한 다음, 배양액을 회수하여 루시페라제 활성을 측정한다. 54㎕의 비-조사 바이러스의 양은 포화 범위는 아니며, 즉, 시험은 적어도 3배 더 큰 량의 바이러스에 민감한 것이다. 루시페라제 발현에 대하여 얻어진 결과는 제11(b)도(진한 직사각형)로 나타내었다.

각 시료의 바이러스 역가는 Ela 보족 세포주 293을 사용하여 측정하였다. DMEM+2%FCS에서 비-조사 및 조사 바이러스 샘플의 일련의 희석물을 제조하였다. 이와 병행하여, 5×10⁴293 세포의 샘플을 200㎕의 DMEM+2%FCS 중에서 (2㎝ 웰에서)제조하였다. 5㎕의 각 희석액 분획을 각 웰에 넣는다. 바이러스가 세포에 결합하게 하기 위하여 항온배양을 37℃에서 1.5 내지 2시간동안 수행한 다음, 200㎕의 DMEM+2%FCS를 각 웰에 넣는다. 48시간후에 세포병원성 효과를 측정하기 위하여 배양액을 시험하였다. 배양액에서 50% 이하 세포가 48시간 이후에 유의적인 세포병원성 효과를 나타내는 상기 바이러스 희석도는 각 바이러스 시료에서 감염성 바이러스의 상대적인 양을 나타내 준다. 수득된 결과는 제11(b)도(빈 직사각형)에 나타내었다. 이 실시예에서 수행된 시험 결과는 UV 조사로부터 바이러스 역가에 있어서 4로그(log)의 감소는 단지 루시페라제 유전자 전이에 있어서 20배 감소와만 연관된 것임을 보여준다. 이것은 바이러스의 감염성에 결정적인 기전은 바이러스가 유전자 전이를 증가시키는 능력에 영향 받지 않고 파괴시킬 수 있음을 시사한다.

저 용량의 바이러스에서 바이러스에 의한 유전자 전이의 증가는 약간 떨어졌으며(제11(a)도, 3 내지 6 래인)이 효과는 고 용량에서 더 현저하였다(7 내지 10 래인).

b) 포름알데히드로 아데노바이러스의 불활성화

2ml의 아데노바이러스 시료를 10ml G25 칼럼(Pharmacia PD 10G, 25M)을 통과시키고 150mM Nacl, 25mM HEPES pH 7.9, 10% 글리세롤로 전-평형화(per-equilibratetion) 시킨 다음, 2.5ml 용량씩 취한다. 겔-여과 바이러스 시료 분획을 0, 0.01, 0.1% 또는 1% 포름알데히도로 빙상에서 20시간동안 항온배양시킨다. 그리고나서 트리스 pH 7.4를 가하여 100mM의 농도로 만들고, 샘플을 먼저 1 1의 150mM NaCl, 50mM 트리스 pH 7.4 al 50% 8글리세롤에 대해 투석한 다음, 2×1 리터 150mM NaCl, 50mM HEPES pH 7.4 al 50% 글리세롤에 대하여 하룻밤동안 투석한다.

그 다음 바이러스 분획을 293 세포에 대하여 그 역가를 검사한다(CEP 종말점검정법 또는 플라크 검정법: Precious and Russel, 1985). 그리고나서 포름알데히드-처리 바이러스의 HeLa 세포(300,000)내 유전자 전이에 대한 효과를 상기 실시예에서와 같이 루시페라제 활성을 측정함으로써 결정한다. 90㎕의 바이러스 시료에서는 10⁸광 단위 이상에 상응하는 DNA 전이를 수득한다. 바이러스를 0.01% 또는 0.1% 포름알데히드로 처리한 결과 유전자 전이 활성이 약간 감소하였다(0.1%에서 약 10배 감소). 1% 포름알데히드 처리가 유전자 전이 활성에 현저한 손실을 가져오지만, 90㎕의 바이러스는 여전히 10⁴광 단위에 상응하는 유전자 발현을 시킨다.

0.1% 포름알데히드로 처리하는 경우, 바이러스 역가가 10⁵PFU(플라크 형성 단위)로 감소하는 것은 루시페라제 활성이 단지 10% 감소한 것과 연관된다. 이 시험 결과를 제12(a)도로 나타내었다.

c) 아데노바이러스의 장-파장 UV+8-메톡시 로랄렌 처리에 의한 불활성화

정제된 바이러스 분획을 0.33㎍/㎕ 8-메톡시 소랄렌(스톡 농도 33㎍/㎕ 8-메톡시 소랄렌을 DMSO에 용해시킨다)으로 조절하고, 빙상에서 램프 필터로 부터 4㎝의거리에서 365㎚의 UV 광원(UVP model TL-33)에 노출시킨다. UV-광에의 노출은 제129b)도에 기재한 바와 같이 15 내지 30분간이다. 그리고나서 바이러스 샘플을 HBS+40% 글리세롤로 평형화시킨 세파덱스 G-25 칼럼(Pharmacia, PD-10)을 통과시켜 -70℃에서 저장한다.

바이러스 시료는 이들이 HeLa 세포내로 pCMVL/hTfpL 포접체 전달을 증가시키는 활성(제12(b)도 우축의 루시페라제의 얻어진 광 단위로 확인되는 바와 같이) 및 293 세포에서 복재력에 대하여 시험하였다(제12(b)도 좌측의 바이러스 역가).

[실시예9 : NIH3T3 세포의 몰로니 바이러스로의 형질감염]

레트로바이러스에 의한 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체의 내화의 증가를 보여주는 하기 이 실시예에서는 달리 특정하지 않는한 다음의 물질 및 방법을 사용한다:

트랜스페린-폴리리신190 포접체 및 포접체-DNA 보합체는 복합체 생성 반응이 500㎕ mM NaCl, 20mM HEPES pH 7.4에서 수행하는 것이 상이하고 상기 실시예에서와 유사한 방법으로 제조한다.

NIH3T3 세포를 10%FCS, 100 I.Y./ml 페니시린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM 글루타민을 추가한 DMEM 배지에서 생육시킨다. 형질 감염을 위해, T25 플라스크당 5 내지 7×10⁵세포를 형질감염전 18 내지 24시간에 분주한다. 형질감염시키기 직전에, 세포를 신선한 배지에 넣고 형질감염에 사용되는 다양한 성분을 다음의 순서로 가한다: 클로로퀸(상술한 100μM), 폴리리신-트랜스페린-DNA 복합체 및 레트로바이러스 시료. 세포를 37℃에서 4시간도안 항온배양한 다음, 배지를 교환하고 세포를 24시간 후에 회수한다. 추출물을 3회의 동결/해빙 사이클을 사용하여 제조하고: 단백질 함량에 있어서 표준화된 추출물 분획을 상기 실시예에서와 같이 루시페라제 활성을 측정한다.

제13도에서 알수 있는 바와 같이 특정된 조거나에서 10⁶의 NIH3T3 세포의 형질감염을 100μM 클로로퀸 존재하 또는 클로로퀸 없이 TfpL-DNA 복합체로 수행한다. 클로로퀸이 없는 경우에는 루시페라제 활성에 대한 수치가 단지 기본 수준(1 래인)에 있는 반면, 클로로퀸 존재하에서는 pRSVL 레포터 유전자의 높은 발현이 측정되었다(2 래인). DNA 복합체와 동시에 세포에 첨가된 몰로니 백혈병 바이러스의 증가된 양은 루시페라제 유전자 발현을 훨씬 더 증가시킬 수 있다. (제13도에 주어진 양은 ml이다.)

[실시예10 : 유전자 전이 효과가 레트로바이러스 때문일 수 있는지 여부 확인 실험]

실시예9에서 사용한 바이러스 시료는 레트로바이러스 발현 세포의 조, 비분획화된 상등액이었다. 이 바이러스에 의해 달성된 DNA 전이의 증가는 사실상 바이러스에 기인한다는 것을 확인하기 위하여, 상등액을 상기의 투석/농축 정제시키고, 레트로바이러스 상등액(도면에서 RVS로 기재됨)을 10배로 농축시킨다. 레트로바이러스가 증가의 원인이 된다면, 막에 의해 유지되는 활성은 농축 단게에서 극히 불안정한 레트로바이러스의 특정 불활성화와는 달리 원 상등액의 활성의 약 10배가 되어야 한다. 상기 실시예에서와 같이, 10⁶NIH3T3 세포를 제14도에서 주어진 조건하에서 형질감염시킨다. 제1`4도는 유전자 전이 증가 효과가 막 저류물(retentate)에 있다는 것을 보여준다(20 내지 600㎕를 사용함, 3 내지 6 래인). 또한 200 내지 600㎕의 10배 농축된 시료는 2 내지 6ml의 원래 비농축된 레트로바이러스 시료(7 및 8 래인)의 약 1/2의 활성이 있다는 것을 밝혀내었다. 병행 시험을 에코트로픽(ecotropic) 쥐 레트로바이러스에 대한 수용체가 없는 K562 세포로 수행하였다. 예상한 바와 같이, 유전자 발현이 증가하지 않았다.

[실시예 11 : 몰로니 바이러스의 유전자 전이 효과에 역할을 하는 트랜스페린과 그의 수용체 사이의 상호작용]

TfpL/pRSVL 복합체의 세포내로의 전이는 폴리리신의 레트로바이러스에의 비-특이적 결합에 의한 것일 가능성을 배제시키고 유입 기전을 더 명확하게 하기 위하여, 레트로바이러스에서 폴리리신과만 복합체 형성한 플라스미드 DNA를 세포내로 전달시키는 능력에 대하여 실험하였다. 폴리리신의 양은 초기에 정해진, 플라스미드 DNA를 완전 농축시키는 최적의 양에 상응하도록 사용하며 폴리리신-트랜스페린-포접체와 함께 사옹되는 폴리리신의 양과 유사하다(Wagner et al., 1991a). 제15도에 나타낸 시험 결과는 클로로퀸이 없는 상태에서 레포터 유전자는 TfpL-pRSVL 복합체의 형태 또는 pL-pRSVL의 형태로 어는 것으로도 발현되지 않는다(1 및 2 래인)는 것을 시사해준다. 다른 한편, 레트로바이러스의 조재하에서는 TfpL 복합체로서 사용된 레포터 DNA는 발현되지만, pL-DNA 형태는 아니다(5 및 6 래인과 함께 3 및 4 래인 참조). 또한, 수행된 시험은 과량의 유리 트랜스페린의 존재는 레트로바이러스에 의해 촉진되는 DNA 전이를 감소시킨다는 것을 보여주었다(7 및 8 래인). 이들 결과는 트랜스페린과 그의 레포너 사이의 상호작용이 레트로바이러스에 의한 DNA 유입을 중가시키는 데에 중요한 역할을 한다는 제안을 뒷받침해준다.

[실시예12 : 레트로바이러스의 유전자 전이 효과에 대한 pH의 영향]

이 실시예의 실험은 레트로바이러스의 유전자 전이 증가력에 대한 pH의 영향을 실험하기 위한 것이다. 형질 감염 실험은 상기 실시예에서와 같이 수행한다. 저 pH 수치가 유전자 전이 효과에 대하여 필수적인지 여부를 확인하기 위하여, 두개의 잘-특성화된 엔도솜 pH 감소 억제제인 모넨신 및 염화암모늄을 사용하였다. 이들 두 물질은 레트로바이러스가 유전자 전이 효과에 대한 엔도솜의 저 pH 수치를 필요로하는 경우에는 유전자 전이에 영향을 줄 것이다. 다른 한편, 이 효과에 대한 다른 기전이 작용하는 경우, 즉 HIV의 유입 기전과 같이 세포질 표면에서 직접 융합하는 경우에는 이들 물질은 음성적 효과도 나타내지 않아야하며 이들이 TfpL-DNA 복합체 경로를 변형시키는 경우에는 상승 효과 조차도 나타내지 않을 수 있다. 제16도의 실험결과는 후자의 가설을 지지하는 경향이 있다. TfpL-DNA 전이에 대한 두 물질 모두의 효과를 실험하여 이들 두 물질중 어느 것도 클로로퀸을 기능적으로 치환시킬 수 없음을 확인하였다. 그러나, 더 높은 염화 암모늄 농도에서는 루시페라제 유전자 발현의 약간의 증가가 확인되었다(1 내지 5 래인). 레트로바이러스 단독은 상기 실시예에서 나타난 바와 같이 DNA 전이에 있어서 약간의 상승을 나타낸다(6 래인). 레트로바이러스를 1μM 모넨신 존재하에서 사용할 경우에 뚜렷한 증가가 관찰되었다(7 래인). 더 높은 모넨신 농도(8 래인) 및 염화암모늄 존재하에서는(9 및 10 래인) 덜 강력한 효과가 관측되었다.

[실시예 13 : 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2의 N-엔도솜분해 펩티드에 의한 트랜스페린 포접체의 의해 달성되는 유전자 전이의 증가]

a) 펩티드의 합성

Cly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Gys의 서열(SEQ ID NO:1)의 펩티드를 프목(Fmoc:플루오레닐메톡시카르보닐)법(Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer 사용;Atherton et al., 1979)을 사용하여 제조한다. 측쇄 보호기는 Cys, Glu 및 Asp에 대해서는 t-부틸이고 Asn에 대해서는 트리틸이다. 커플링 반응후 닌히드린 시험을 실시하여 각 단계에 대해서 커플링 수준이〉90%임을 알았다. 19 개의 아미노산으로 시작하여 이중 커플링을 수행하였다. N-말단 프목 그룹을 NMP(N-메틸피롤리돈)에서 20%피페리딘을 갖고 있는 펩티드 레진 부분으로 부터 제거하였다. 그리고나서 프목-보호 및 비보호 분획을 DCM(디클로로메탄)으로 세척하고 고 진공하에서 건조시켰다. 수율은 프목-유리 펩티드 레진이 293.6㎎이고 프목-보호 펩티드 레진이 366.5㎎이다. 111.1㎎의 프목-유리 펩티드 레진을 10ml TFA, 0.75g의 페놀, 300㎕의 EDT(에탄디티올), 250㎕의 Et-S-Me(에틸메틸설피드) 및 500㎕의 물이 혼합물을 사용하여 1.5 시간동안 트리플루오로아세트산 분열 처리를 한다. 펩티드를 소결된(sintered) 유리 필터늘 통해 레진으로 부터 여과시킨다. 레진을 DCM으로 세척하여 여액에 가한다. 여액을 약 2ml로 농추기킨 다음 교반하면서 40ml의 에테르에 저가한다. 펩티드 침전물은 원심분리에 의하여 제거하고 에테르 상등액을 버린다. 침전물을 40ml의 에테르로 3회 세척하고 고 진공에서 건조시킨다. 수득된 58㎎의 조생성물을 300㎕의 25% NH₃/1를 함유하는 3.5ml의 20mM NH₄HCO₃에 용해시킨다. 이 용액을 전-패캐징된 세파덱스 G-25 칼럼(Pharmacia PD-10)상에서 동일한 완충액을 사용하여 겔-여과시킨다. 모든 물질은 모노 Q 칼럼(Pharmacia 100×14mm)(구배: 0-10분 100% A, 10-100분 0-100% B. A:20mM NH₄HCO₃+300㎕ NH₃/1. B:A+3M NaCl. 280㎚에서 척정. 354㎚에서 Trp-형광 검출. 유속 1ml/분). 생성물을 1M NaCl로 유출시킨다. 모노 Q 칼럼의 주요 분획을 BIORAD-Hi-Pore RP 304 칼럼(250×10ml)(구배: 12.5분 동안 50 내지 100% 완충액 B, 12.5 내지 25분 100% B. A:20mM NH₄HCO₃+300㎕ NH₃/1. B:98%메탄올 중의 A. 유속:1 ml/분. 237㎚에서 측정)를 사용하여 액상 HPLC에 의해 더 정제한다. 생성물은 100% B에서 유출시킨다. 생성물 분획은 스피드백(Speedvac)에서 증발시켜, 완충액 A에 재용해시키고 최종으로 동결건조시킨다. 수율은 시스테인-보호 형태로 HPLC 정제생성물 8.4㎎이다. 이 펩티드를 P16이라 부른다. 유리 머캅토 형태의 펩티드를 수득하기 위해서 t-부틸-보호된 물질을 주변 온도에서 티오아니솔/에탄디티올/트리플루오르아세트산/트리플루오로메탄설폰사(2/1/40/3; 트리플루오로메탄설폰산을 다른 성분에 따라 특정된 비율로 가한다)으로 30분간 처리한다. 펩티드를 에테르 침전 및 연속하여 상기의 완충액 A를 사용하여 아르곤 조건하에서 겔 여과(Sephadex G-25)시켜 분리한다.

b) 인플루엔자 펩티드의 폴리리신에의 커플링

b1) SPDP(숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트)를 통한 직접 결합

19.8㎎의 폴리리신(pL) 300 브롬화수소(Sigma)를 저분자 분획을 제거하기 위해 세파덱스 G-25 칼럼(Pharmacia PD-10)에서 초산나트륨 pH 5에서 겔-여과시킨다. 닌히드린 시험에 따르면 겔 여과후 pL의 농도는 3.16㎎/ml이다. 이 용액의 pH를 1M NaOH를 사용하여 7-8로 조절한다. 0.64μmol의 SPDP(Pharmacia; 무수 에탄올중의 40mM 용액)를 2.5ml의 pL 용액(7.9㎎ pL=0.13μmol)에 가한다. 이것은 5:1의 SPDP:pL 의 몰비에 상응한다. 혼합물을 하룻밤동안 반응하도록 방치하고 G25 칼럼에서 20mM NH4HCO3 pH 8.2로 겔-여과시킨다. 여액의 한 분획을 DTT(디티오트레이톨)로 환원시킨 다음 티오피리돈을 측정하여 반응이 종결되었음을 확인한다. 2.212ml 중의 0.3μmol의 pL-SPDP(μmol PDP를 기본으로함)을 티올 형태의 0.35μmol의 펩티드와 반응하도록 방치한다. 펩티드 및 pL을 혼합하였을 때 나타난 흰 침전을, 용액을 2M 구아니디늄 염산으로 조절하여 용해시켜 하룻밤동안 반응시킨다. 반응 혼합물중의 티오피리돈의 측광법 측정은 반응이 완결되었음을 확인시켜준다. 그리고나서 혼합물을 2리터의 20mM HEPES/0.5M 구아니디늄 염산에 대하여 2회 투석시킨다. 생성된 용액을 모노 S 칼럼(0.7×6㎝, Pharmacia)(구배: 0-20분 100% A, 20-140분 0-100% B. A:20mM HEPES pH 7.3/0.5M 구아니디늄 염산, B:20mM HEPES pH7.3/3M 구아니디늄 염산, 0.3ml./분. 280㎚에서 측정하고 354㎚에서 형광 측정. 280㎚에서 여기(excitation)시킴). 1.5M 구아니디늄 염산으로 유출시킨 생성물 분획을 2×2 리터의 HBS에 대하여 투석시킨다. 연속하여 닌히드린 시험으로 pL 농도를 측정한 결과 약 1.14㎎/ml의 농도를 나타냈다. 포접체 용액의 펩티드양을 280㎚ 흡광도로 부터 계산하고; 그 결과 펩티드:pL 은 4:1의 몰비인 것으로 나타났다.

b2) 폴리에틸렌글리콜 링커를 통한 결합

14.6㎎의 pL 300 브롬화수소(Sigma)를 b1)에서와 같이 겔 여과시킨다. 닌히드린 시험에 따르면 겔 여과후 pL의 농도는 4.93㎎/ml이다. 이 용액의 pH를 1M NaOH를 사용하여 7-8로 조절한다. 4.33μmol 의 SPDP(Pharmacia; 무수에탄올중의 30mM 용액)를 2.7ml의 pL 용액(13.3㎎ pL=0.22μmol)에 가한다. 이것은 20:1의 SPDP:pL의 몰비에 상응한다. 1.5 시간후에 반응 혼합물을 G-25 칼럼에서 0.1M 초산나트륨 3M 구아니디늄 염산에서 겔-여과시킨다. DTT으로 여액의 한 분획을 환원시킨다음 티오피리돈을 측정하면 생성물 분획은 3.62μmol의 SPDP를 함유하는 것으로 나타난다. SPDP-변형 pL을 79㎎의 DTT를 용액에 가함으로써 환원시킨다. 2시간 환원시킨 다음, 용액을 특정된 조건하에서 G-25에서 다시 한번 더 여과시킨다. 엘만(Ellman) 시험법을 사용하여 티올을 측정한 결과 2,224ml 중에 티올 농도가 3.15μmol인 것으로 나타났다.

17.6㎎=5μmol POE(폴리옥시에틸렌-비스(6-아미노헥실), Sigma)를 500μ㏖ 의 20mM NaHCO₃/3 M 구아니디늄 염산, pH7-8에 용해시키고 300㎕ DMF에 용해시킨 13.8㎎의 EMCS(ε-말레이미도카프로산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(Sigma)(=44.7μ㏖)과 반응시킨다. 30분 후에 용액을 G-25 상에서 겔 여과시킨다(20mM NaHCO₃/3 M 구아니디늄 염산). 300㎚에서 말레이미도 그룹의 측광법 측정은 2ml 용액중의 반응된 EMCS의 농도가 6.36μ㏖임을 보여준다.

1.39μ㏖의 티올 형태의 펩티드(2.5ml의 20mM NaHCO₃/3 M 구아니디늄 염산)을 혼합물을 아르곤 하에서 볼텍스(vortex)로 강하게 혼합하면서 1.049ml의 이 용액(3.34μ㏖의 ENCS에 상응)에 적가한다. 15분 후에는 엘만 시험에서 더 이상의 유리 티올기가 검출되지 않는다.

환원된 SPDP-변형 pL 용액은 1M NaOH를 가함으로써 pH7-8이 되도록 조절한다. 1.373ml의 이 용액을 볼텍스로 강하게 혼합하면서 상기 반응 혼합물에 가한다. 이것에 의해 1:2, 4:1.4의 펩티드-SH:POE-EMCS:pL-SH을 수득한다(EMCS 및 SH에 기초함). 2.5시간 반응후에는, 에만 시험에서 더 이상의 유리 티올기가 검출되지 않는다. 이것을 2리터의 20mM HEPES pH 7.3/0.6 M NaCl에 대하여 하룻밤동안 투석시킨 다음, 모노 S 칼럼(구배: 0-20분 22% A, 20-150 분 22-100% B, A:20mM HEPES pH 7.3, B: A+3 M NaCl. 유속 0.3ml/분. UV-측정은 280㎚에서 수행하고 형광 측정은 354㎚에서 수행한다). 1.5 내지 1.6M NaCl으로 유출된 생성물은 2리터의 HBS에 대하여 투석시킨다. 닌히드린을 사용한 pL 농도의 측정 및 280nM에서 펩티드 농도를 측광법으로 측정하여 총 4.5ml의 총 용적중 0.49㎎/ml의 pL 농도에서 12:1의 pL 계산 비를 얻었다.

c) 리포좀 제조

REV 법(역상 증발법)을 사용하여 리포좀을 제조하고(Szoka and Papahadjopoulos, 1978: Straubinger and Papahadjopoulos, 1983): 260㎕의 클로로포름중의 수성상 10mM HEPES pH 7.3:100mM 칼세인;150 mM NaCl; 유기상: 300μ㏖ L-α-레시틴(난황, 주로 팔미토일올레오일포스파티딜콜린:Avanti Polar Lipids)을 회전 증발기를 사용하여 증발시킨다. 물질을 고 진공에서 건조시킨 다음 2ml의 디에틸에테르에 다시 용해시킨다. 1ml의 수성상을 볼텍스를 사용하여 에테르 상으로 완전히 세척하고 소니케이터(sonicator)(욕조형)에서 0℃에서 5분 동안 초음파로 처리한다. 빙상에서 30분후에 물질을 10분간 더 초음파 처리한다. 생성된 안정한 에멀젼을 회전 증발기에서 천처히 증발시킨다. 디에틸에테르를 100mbar에서 제거시킨 다음, 0.75ml의 수성상을 가한다. 잔류하는 미량의 에테르를 50mbar에서 30분동안 더 증발시킨다. 생성된 에멀젼(1.7ml)을 500rpm에서 원심분리시킨 다음 핵공 폴리카르보네이트 막(nucleopore polycarbonate membrtane:0.1μm)을 통해 사출시켜, 최종 0.7ml의 리포좀 용액을 수득한다. 리포좀을 겔 여과에 의해 비-결합 물질로부터 분리시킨다(Sephadex G-50 배지, Pharmacia: 23ml 겔 용적, 10mM HEPES pH 7.3/150mM NaCl). 500㎕의 6개 분획으로 수집한다. 공지의 방법(Bartlett et al., 1959)을 사용하여 인지질을 측정한다.

d) 리포좀 누출 검정법

리포좀 성분의 방출(누출)은 봉입된 칼세인의 유출 및 형광의 팍칭을 중단시키는 희석에 의하여 측정한다(Bondeson et al., 1984). 칼세인 형광은 분광형광기(Konon SMF 25: 490㎚에서 여기(excitation), 515㎚에서 방사(emission)). 이를 위하여 상기 리포좀 용액의 100㎕ 분획을 0.1 M 초산나트륨 또는 10mM HEPES/150 mM NaCl 완충액으로 희석하여 1ml 용적에 상응하는 pH 수치(4.3, 4.5, 5.0, 6.0, 7.3)을 수득하도록한다. 이들 용액을 완류의 아르곤(최종 농도 400nM 펩티드)으로 혼합하면서 이 용액의 쿠베트(cuvettes)에 2.5㎍의 펩티드(t-부틸-보호 형태 ; HBS의 용액 1㎍/㎕)를 가한다. 칼세인 형광은 펩티드를 가한 다음 상이한 시간에서 측정한다. 100% 누출 수치는 2㎕ 트리톤 X-100을 추가함으로써 측정된 것으로 한다(Fluka).

리포좀 용액에 펩티드-pL 포접체를 가한 후 칼세인 형광을 측정하기 위해 동일한 방법을 사용한다. 2.5㎍의 포접체(pL 단독의 양에 기초한 1㎍/㎕ 농도)를 1ml의 리포좀 용액에 가한다(최종 농도 20nM 변형 펩티드). 마찬가지로 2.5㎍의 펩티드-폴리리신 포접체를 5㎍의 DNA와 항온배양한 다음(15분) 누출 검정법을 수행한다.

펩티드는 산성 범위에서만 리포좀 성분을 방출시킨다는 것을 알았다. 펩티드 포접체는 실질적으로 저 pH에서 활성을 나타내며, 중성 pH에서 조차도 pH가 낮아짐에 따라 훨씬 증가된 강한 활성을 나타낸다. 포접체의 DNA와의 복합체 형성은 산성 pH에서는 현저한 활성을 나타낸 반면, 중성 pH에서는 그 활성이 사라진다.

e) K562-세포의 형질감염

K562-세포를 RPMI 1640 배지(Gibco BRL+2g의 탄산나트륨/1)+10%의 FCS, 100 I.U./ml 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민에서 500,000 세포/ml의 밀도 이하로 생육시킨다. 형질감염시키기 12 내지 20시간전에, 세포를 50μM의 데스페리옥사민을 함유하는 신선한 배지에 넣는다(이 방법은 트랜스페린 수용체의 수를 증가시키기 위한 것이다). 하루 동안 형질감염 시킨 다음 세포를 수집하여, 10%FCS+50μM의 데스페이옥사민을 함유하는 신선한 배지에 현탁시키고(ml 당 250,000 세포) 2ml씩 24웰의 디쉬(dish)에 넣는다.

160㎕ HBS 중의 6㎍dmlpCMVL-DNA를 제18도에 특정된 양의 TfpL 포접체 또는 pL300과 160㎕의 HBS 중에서 혼합시킨 다음, 15분 후에 특정된 양의 인플루엔자 펩티드-pL-포접체(P16pL)을 가하여 15분후에 혼합물을 dK562 세포에 가한다. 세포를 37℃에서 24시간동안 항온배양한 다음, 루시페라제 측정을 위해 회수한다. 제7도에 주어진 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다. 루시페라제 활성은 상기 실시예에서 특정된 방법으로 측정한다. 제18도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다.

f) HeLa 세포의 형질감염

HeLa 세포를 상기 “세포 및 배지”의 6㎝배양 디쉬에 배양시킨다. 형질감염은 플레이트당 300,000 세포 밀도로 하여 수행한다. 형질감염시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 1ml의 신선한 배지에서 항온 배양한다.

160㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 제19도에서 특정된 양의 TfpL 포접체 또는 pL300 또는 이들 혼합물과 160㎕의 HBS 중에서 혼합시킨다. 15분후에 특정량의 인플루엔자 펩티드-pL-포접체(P16pL)를 가하고 추가로 15분 후에 혼합물을 세포에 가한다. 세포를 37℃에서 2시간동안 항온배양한 다음, 추가로 10%FCS를 함유하는 2.5ml 신선한 배지를 가한다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 항온 배양한 후에, 루시페라제 측정을 위하여 세포를 회수한다. 루시페라제 활성은 상기 실시예에서 특정된 방법으로 측정한다. 제19도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다.

[실시예 14 : 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2의 이차 N-말단 엔도솜분해 펩티드에 의한 트랜스페린 포접체의 의해 달성되는 유전자 전이의 증가]

a) 펩티드-폴리리신 복합체의 제조

서열(SEQ ID NO:2) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Gys의 펩티드(P41로 표기함)를 실시예13 a)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성한다. 펩티드의 폴리리신(pL300)에 대한 커플링은 실시예13 b1)에서 SPDP를 통한 결합에서와 같이 수행한다. 그럼으로써 펩티드:pL의 비율이 4:1인 포접체를 수득하였다.

b) HeLa 세포의 인플루엔자 펩티드 포접체로의 형질감염

HeLa 세포를 특정된 바와 같이 6㎝ 배양 디쉬에 생육시키고 형질감염은 플레이트당 300,000 세포 밀도로 하여 수행한다. 형질감염시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 1.5ml의 신선한 배지에서 항온 배양한다. 160㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA(150mM NaCl, 20mM HEPES 7.3)를 6㎍의 TfpL190B 포접체와 160㎕의 HBS 중에서 혼합시키고, 15분후에 10㎍의 인플루엔자 펩티드-폴리리신-포접체 P16pL(실시예13 참조)를 가하고(제20도): 특정량의 두 펩티드 포접체의 유전자 전이를 증가시키는 최적의 양을 측정한다. 추가로 15분 후에 혼합물을 세포에 가한다. 24시간 후에 루시페라제 측정을 위하여 세포를 회수한다. 제20도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다.

두 펩티드 포접체로의 비교 실험에서는 이차 펩티드 포접체인 P41pL로 수득되는 유전자 전이의 3.5배 이상의 증가를 나타냈다.

c) BNL CL.2 세포의 인플루엔자 펩티드 포접체로의 형질감염

BNL CL.2 세포를 실시예6에 기재한 바와 같이 생육시킨다. 인플루엔자 펩티드 P41을 폴리리신 300과 폴리리신에 대한 펩티드의 비율이 1:1, 3:1 및 8:1로 포접시킨다. 6㎍의 pCMVL DNA 및 20㎍의 포접체의 복합체를 세포에 가한다. 대조군으로서 실시예13에서 제조된 20㎍의 pL300 또는 20㎍의 P16 폴리리신 포접체를 사용한다. 세포를 37℃에서 4시간동안 항온배양한 다음, 18%FCS를 함유하는 2ml의 배지를 가한다. 24시간후에 세포를 루시페라제 측정을 위해 회수하고: 그 결과를 제20(b)도에 나타내었다. 실시예13에 기재한 바와 같이 수행한 리포좀 누출 검정법(제20(c)도)에서는 포접체의 활성(pH 5, 2.5㎍ 폴리리신과 동량)은 펩티드의 함량과 함께 증가한다(도면에서 P41은 “influ2”로 표시함).

[실시예15 : HeLa 세포의 β-갈락토시다제 레포터 유전자 작제물로의 형질감염 및 그 위치에서 β-갈락토시다제의 발현]

a) 세포 배양 및 형질감염

형질감염시키기 위해서 HeLa 세포를 커버 슬립(cover slip) 상의 3㎝ 배양 디쉬 중의 5%의 FCS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유하는 DMEM 배지에서 생육시킨다(디쉬당 3×10⁴세포).

형질감염을 위해 160㎕ HBS 중의 6㎍의 β-갈락토시다제 레포터 유전자 작제물(pCMV-β-gal)을 160 ㎕ HBS 중의 12㎍의 TfpL190B과 복합체 형성시키고 주변온도에서 30분동안 항온배양시킨다.

또 다른 실험으로, 160㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMV-β-gal을 80㎕ HBS 중의 6㎍의 TfpL190B과 주변온도에서 15분도안 항온배양시킨다. 그리고나서 실시예13에서 제조된 80㎕ HBS 중의 12㎍의 인플루엔자 펩티드 포접체(P16pL)을 가하고 혼합물을 추가로 15분 동안 항온배양시킨다. 그다음 이들 DNA-다중양이온 복합체를 상기에서와 같이 1ml의 DMEM+2%의 FCS, 항생물질 및 글루타민과 혼합한다. 형질감염의 성공에 대한 클로로퀸 및 아데노바이러스의 효과를 확인하기 위하여, 또한 추가의 실험에서 DNA 다중양이온 복합체를 함유하는 배지에 최종 농도가 100μM 또는 50㎕의 아데노바이러스 균주 용액 d1312이 되도록 클로로퀸을 가한다.

형질 감염을 위해, 원 배양 배지를 세포로부터 제거시키고 클로로퀸 또는 바이러스가 있거나 없는 DNA 복합체를 함유하는 1ml의 배지를 가한다 37℃에서 2시간동안 항온배양한 후에, 10%FCS, 항생물질 및 글루타민을 함유하는 1ml의 DMEM을 세포에 가하여 추가로 2시간동안 항온 배양한다. 그리고나서 모든 배지를 제거하고 세포를 10%FCS, 항생물질 및 글루타민을 함유하는 3ml의 신선한 DMEM에 회수한다.

b) β-갈락토시다제의 검정

형질감염 48시간후에 배지를 제거하고, 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 1회 세척한 다음 PBS 중의 0.5% 글루타르디알데히도로 주변온도에서 5분간 고정시킨다. 그리고나서 고정액을 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척한다. 그리고나서 염색 용액(10mM 인산 완충액 pH 7.0, 150 mM NaCl, 1mM MgCl₂, 3.3 mM K₄Fe(CN)₆3H₂O, 3.3 mM K₃Fe(CN)₆및 0.2% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토피라노시드)과 37℃에서 20분 내지 3시간 동안 항온배양시킨다(Lim and Chae, 1989). 그리고나서 커버 슬립을 PBS, 물 및 96% 에탄올중에서 헹구고, 건조시켜 슬라이드상에 모위올(Mowiol)을 봉입(mounting)시킨다. 현미경(Zeiss Axiophot Microscope)을 사용하여 분석한다.

제21도는 현미경 확대(112배)상을 나타낸 것이다. A: 12㎍의 TfpL190B으로 복합체를 형성시킨 6㎍의 pCMV-β-gal로 형질감염된 HeLa 세포. β-갈락토시다제에대한 염색 반응을 3시간 동안 수행한다. 도면은 β-갈락토시다제 유전자를 발현한 세포가 거의 없음(55 세포; 염색된 그룹은 화살표로 표시함)을 보여준다. B: 6㎍의 TfpL190B al 12 P16pL로 복합체를형성시킨 6㎍의 pCMV-β-gal로 형질감염된 HeLa 세포. 염색 반응: 3 시간. β-갈락토시다제 유전자를 발현한 세포가 거의 없다(250 세포). 그러나 세포의 반응이 A보다는 강하다. C: 100μM의 클로로퀸 존재하에서 6㎍의 TfpL190B 및 12 P16pL로 복합첼르 형성시킨 6㎍의 pCMV-β-gal로 형질감염된 HeLa 세포. 염색 반응: 3시간. 많은 세포(1,000 이상의 세포)에서 강한 양성 반응을 보였다. D: 아데노바이러스 존재하에서 12㎍의 TfpL190B로 복합체를 형성시킨 6㎍의 pCMV-β-gal로 형질감염된 HeLa 세포. 염색 반응: 20분. 거의 모든 세포(90%이상)에서 양성 반응을 보였다. E: 비감염 HeLa 세포(β-갈락토시다제 반응의 특이성에 대한 대조군). 염색 반응: 3시간.

[실시예16 : 아데노바이러스 존재하에서 48kb 코스미드로의 HeLa 세포의 형질감염

a) 루시페라제 코드화 서열을 함유하는 코스미드의 제조

RSV 프로모터 조건하에서 단일 P. 피라리스(P. pyralis) 루시페라제 코드화 서열을 함유하는 3.0 kb SalI 단편을 플라스미드 p220RSVLuca로부터 분리하여 코스미드 클론 Cl-7미의 특정 SalI 부의에 콘케타머(concatamer)를 형성하도록 리게이션(ligation)시킨다. (Cl-7미는 현성(apparent) 유전자를 코드화하지 않고 코스미드 벡터 pw15의 BamHI 부위에 클로닝된 37kb 인체 게놈 DNA Sau3A 단편(일부 분해물(digest))으로 이루어진다(Stratagene)). 그리고 나서 리게이션 반응 생성물을 시험관내에 패키징시키고 생성된 파지 입자 분획을 이 콜라이(E. coli) MN544 에 형질감염시킨 다음 LB amp 플레이트에 분주한다. 재조합체를 하디브리드화(hybridization) 프로브로서 3.0 kb SalI 단편(무작위 주입을³²P 표지됨)을 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의하여 스크리닝하고 다수의 양성체를 제한 지도법으로 분석한다. SalI 삽입체의 단일 복제물을 함유하는 코스미드 작제물(CosLuc)을 생장시켜 세슘(caesuim) 구배에서 정제한다(총 크기=48 kb).

소형 조절 코스키드 pWELue(12 kb)은 CosLuc를 NotI으로 분해하여, 재리게이션시키고, 세균으로 형질전화시킨 다음 적당한 플라스미드를 분리함으로서 제조한다. 그 결과 인체 DNA 삽입체 및 CosLuc의 폴리링커의 일부가 결여된 12 kb DNA 분자가 생성된다. 플라스미드 pSPNeoLuc(8 kb)는 RSB-루시페라제 유전자 단편을 함유하는 실시예5에 기재된 플라스미드이다(pUCμ 로쿠스의 Clal 부위에 클로닝된 pRSVL의 Apal/Pvul 단편).

b) 코스미드의 HeLa 세포내로의 전달

1ml DMEM+2%FCS로 도포된 HeLa 세포(6㎝ 디쉬당 3×10⁴세포)를 실시예에 기재된 방법으로 제조된 지정된 양의 hTfpL, 유리 폴리리신 및 DNA를 함유하는 TfpL/DNA과 항온배양시킨다. 항온배양 혼합물에는 추가로 100μM의 클로로퀸(1 및 2 래인) 또는 ml 당 5×10¹¹입자를 함유하는 10㎕의 아데노바이러스 d1312(3 내지 12 래인)이 함유되어 있다. 37℃에서 2시간동안 항온배양한 후 4ml DNEN+10%FCS를 각 디쉬에 가하고; 24시간 후에 세포를 회수하여 루시페라제 활성을 측정한다. 그 결과를 제22(a)도로 나타내었다.

c) 코스미드의 신경아세포종 세포내로의 전달

1ml DMEM+2%FCS로 도포된 CI-ME-N로 불리는 신경아세포종 세포주(Donti et al., 1988)(6㎝ 디쉬당 1×106 세포)를 지정된 양의 hTfpL, 유리 폴리리신 및 DNA를 함유하는 상기의 방법으로 제조된 TfpL/DNA과 항온배양시킨다. 세포 하온배양 혼합물에는 추가로 100μM의 클로로퀸(3 및 4 래인) 또는 ml 당 5×10¹¹입자를 함유하는 10㎕의 아데노바이러스 d1312(5 및 6 래인)이 함유되어 있다. 37℃에서 2시간동안 항온배양한 후, 4ml EMEM+10%FCS를 각 디쉬에 가하고; 24시간 후에 세포를 회수하여 루시페라제 활성을 측정한다. 그 결과를 제22(b)도로 나타내었다.

[실시예17 : 화학적으로 커플링된 아데노바이러스-폴리리신 포접체에 의한 유전자전이]

a) 화학적 커플링에 의한 아데노바이러스-폴리리신 포접체의 제조

150mM NaCl/25mM HEPES, pH 7.9/10% 글리세롤 중의 2.35ml의 겔 여과시킨(Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) 아데노바이러스 d1312 용액을 10㎕(10n㏖)의 1mM의 SPDP(Pharmacia)과 혼합한다.주변온도에서 3.5시간 후에 변형된 바이러스를 과량의 시약으로부터 겔 여과(상기 참조)에 의해 분리한다. 이 용액(2.5ml)d을 아르곤으로 세척하고 산소가 배제된 아르곤 하에서 2.3n㏖의 머캅토프로피오네이트 그룹(EP 388 758의 방법에 따라 제조됨)으로 변형된 42㎕의 FITC-표지 폴리리신(1n㏖)과 반응시킨다. 주변온도에서 18시간후에 용액의바을 원심분리 시험관에 옮겨 조심스럽게 1ml의 염화세슘 용액(밀도 31.33g/ml)을 덮고 주변온동서 2시간동안 35000rpm(SW60 rotor)로 원심분리한다. 바이러스 밴드(band)를 200㎕의 염화세슘 분획으로 수집하여 1ml에 HBS/50% 글리세롤로 희석한다. DNA 결합 측정은 300㎕의 변형 바이러스로 수행한다: 바이러스 용액은 1ml HBS로 희석하고 100㎕의³⁵S-표지 DNA용액(닉(Nick)번역으로 제조된 15ng pRSVL)과 혼합한다. 대조실험을 동량의 비변형 바이러스 d1312로 병행하여 수행한다. 30분 후에 샘플을 원심분리 시험관에 옮기고 조심스럽게 1ml의 염화세슘 용액(밀도 1.33g/ml)으로 덮고 주변온도에서 2시간동안 35000rpm(SW60 rotor)로 원심분리한다. 구배는 5개 분획으로 나누어진다; 각각 분획 1, 1ml; 분획 2, 0.6ml; 분획 3-5, 각각 200㎕. 200㎕ 부분 분획의 방사능을 측정하여 제23도에 나타내었다. 바이러스를 함유하는 분획(3-5), 특히 분획 3에서 대조군보다 방사능이 현저히 높게 나타났다. 이것은 폴리리신-변형 아데노바이러스와 표지된 DNA의 특이적 연합에 의한 것일 수 있다.

b) K562 세포의 형질감염

K562-세포(ATCC CCL 243)를 RPMI 1640 배지(Gibco BRL+2g의 탄산나트륨/1)+10의 FCS, 100 I.U./ml 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민에서 500,000 세포/mldm 밀도 이하로 생육시킨다. 형질감염시키기 12 내지 20시간전에, 세포를 50μM의 데스페리옥사민을 함유하는 신선한 배지에 넣는다(이 방법은 트랜스페린 수용체의 수를 증가시키기 위한 것이다). 하루 동안 형질감염시킨 다음 세포를 수집하여, 10%FCS+50μM의 데스페리옥사민을 함유하는 신선한 배지에 현탁시키고(ml 당 250,000 세포)2ml씩 24웰의 디쉬(dish)에 분주한다.

100㎕ HBS 중의 특정양의 pCMVL-DNA(6, 0.6, 0.06㎍)를 50㎕의 폴리리신 아데노바이러스(pLadeno) 또는 상응되는 양(35㎕)의 아데노바이러스 d1312와 혼합시킨다. 20분 후에 상응하는 양(12, 1.2, 0.12㎍)의 150㎕ HBS 중의 TfpL190B 포접체(P16pL)을 가한다. 추가로 20분후에 혼합물을 K562 세포에 가한다. 세포를 37℃에서 24시간동안 항온배양한 다음, 루시페라제 측정을 위해 회수한다. 루시페라제 활성은 상기 실시예에서 특정된 방법으로 측정한다. 제24도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 충 루시페라제 활성을 나타낸다.

c) HeLa 세포의 형질감염

폴리리신-바이러스 포접체의 활성을 시험하는 한가지 방법은 포접체가 극소량(0.1㎍ 이하)의 DNA 전달 능력을 시험하는 것이다. 내화 인자(트랜스페린 및 아데노바이러스 섬유 단백질)는 전달시킬 DNA와 직접 연합하기 때문에, DNA 전이력의 증가는 아데노바이러스가 폴리리신-축합 DNA에 직접 결합하는 경우에 기대할 수 있다. 이러한 가정을 시험하기 위하여 일정량의 폴리리신-아데노바이러스 포접체(2.5㎕, 약 5×10⁷바이러스 입자)를 475㎕ HBS 중의 상이한 양(3㎕ 내지 0.0003㎍)의 레포터 플라스미드와 복합체를 형성시켰다. 주변 온도로 15분동안 항온 배양한 후에 DNA 양에 상응하는 양의 트랜스페린-폴리리신의 각 샘플에 가한다(이 TfpL 양은 50% 의 플라스미드 DNA의 “패캐징”(전기적 중성)을 보장하고 동시에 바이러스-폴리리신 포접체를 위한 결합 공간을 확보하기 때문에 선택된 것이다). TfpL를 가한 후에 이 혼합물을 15분 동안 항온 배양시킨 다음, 각 혼합물을 1ml의 DMEM/2%FCS 중의 300,000 HeLa 세포를 함유하는 6㎝ 배양 디쉬에 넣는다. 그리고나서 세포를 37℃에서 1.5시간동안 항온배양시킨 다음, 4ml의 DMEM/10%FCS를 가한다. 병행하여 동일량의 DNA를 두배 과량의 TfpL(총 DNA 축합에 대한 양)으로 복합체를 형성시키고 HeLa 세포내로의 유전자 전이에 사용한다(한번은 그 자체 및 한번은 25㎕의 비-폴리리신-커플링된 아데노바이러스 d1312 시료). 24시간 후에 세포를 회수하고, 추출물을 제조하여 분획들에 대해서 루시페라제 활성을 측정한다. 이들 시험 결과를 제25도에 나타냈으며: 아데노바이러스가 없는 경우에는 0.3㎍ 이하의 DNA 양에서는 루시페라제 활성을 검출하 수 없었다. 폴리리신-커플링 및 비-커플링 된 아데노바이러스 모두가 대량의 DNA(3㎍ 및 0.3㎍)와 잘 작용한다. 그러나 비-커플링된 아데노바이러스를 사용할 경우에는 0.03㎍에서 활성이 약 100배 떨어졌고 이보다 낮은 DNA양에서는 활성이 거의 무시할 만큼 작았다. 대조적으로 폴리리신-커플링된 바이러스는 0.003 및 0.0003㎍의 DNA 양에서 모두 유전자 전이력이 유지되었다 이러한 DNA양은 세포당 약 100 DNA 분자 및 DNA 분자당 약 1 바이러스 입자에 해당한다.

[실시예18 : 폴리리신에 효소적으로 커플링된 아데노바이러스에 의한 유전자 전이]

a) 효소 반응

2ml의 아데노바이러스 시료(균주 d1312; 5×10¹⁰PFU/ml)를 25ml의 반응 완충액(0.1 M Tris-HCI;pH 8.0, 2mM DTT, 30% 글리세롤)으로 평형화시킨 세파덱스 G-25 겔 여과 칼럼(Pharmacia)에 적용시킨다. 유출을 3.5ml의 반응 완충액으로 수행한다. 효소적 커플링응 위한 반응 혼합물은 최종 1500㎕ 용적 중에 1150㎕의 바이러스 유출 분획, 0.5n㏖의 기니아-피그 간 트랜스그루타미나제(TG)(Sigma), 2n㏖ 또는 20n㏖의 폴리리신290, 10mM의 CaCl₂및 반응 완충액으로 이루어진다. 반응을 37℃에서 1시간동안 수행시킨 다음 30㎕의 0.5 M EDTA를 가하여 중지시킨다. 커플링의 특이성을 모니터링하기 위하여 반응 혼합물을 트랜스글루타미나제 없이도 제조한다. 비-결합 폴리리신을 CsCl-구배(밀도 1.33g/ml: 170,000×g, 2시간)에서 원심분리에 의하여 바이러스로 부터 분리한다. 바이러스가 함유된 분획을 수집하여 동일 용량의 글리세롤과 혼합한 다음, 액체 질소에서 동결시켜 -70℃에서 저장한다.

b) 폴리리신의 아데노바이러스에의 결합 확인

반응은 상기 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약(Amersham)으로¹²⁵I로 표지된 폴리리신으로 수행한다. CsCl-구배 원심분리 후에 바이러스 분획을 골라서 또 다른 CsCl-구배에 의해 분리한다. 그리고나서 구배를 분획화하고 모든 분획의 방사능을 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 측정한다. 제26도에 나타난 바와 같이 TG(d1312/TG-pL)와의 반응 혼합물에서 방사능 폴리리신이 바이러스 분획(바이러스)에 축적되는 것이 명백하다. TG가 없는 대조 혼합물(d1312/pL)에서는 바이러스 분획에서 방사능 폴리리신이 축적되지 않았다.

c) 폴리리신-변형 아데노바이러스 분획의 형질감염 효율에 대한 효과 시험

ⅰ) 세포 및 배지

형질 감염시키기 위하여, 10% 열-불활성화된 소 태자 혈청(FCS), 2mM의 글루타민, 100 I.U./ml 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중의 5×10⁵세포(쥐 간세포; ATCC No.:TIB 73)를 6㎝ 배양 디쉬에 접종한다.

ⅱ) 바이러스-DNA-트랜스페린 복합체의 형성

50㎕의 폴리리신-변형 바이러스 분획을 10㎕ HBS 중의 6㎍의 DNA 플라스미드 pCMVL 와 혼합시키고 주변 온도에서 20분간 항온 배양시킨다. 그리고나서 8㎕의 쥐 트랜스페린-폴리리신290B(mTfpL)을 혼합물을 가하여 10분간 더 항온배양을 계속한다.

ⅲ) 쥐 간세포의 형질감염

바이러스-DNA-트랜스페린 복합체를 1.5ml의 배지(2%FCS, 2mM의 글루타민 및 항생물질을 함유한 DMEM)와 혼합하여 기존 배지를 제거한 후 세포에 가한다. 37℃에서 2시간 동안 항온배양한 다음, 10%FCS, 글루타민 및 항생물질을 함유한 2ml DMEM를 세포에 가한다. 2시간 동안 추가로 항온배양한 후에 전체 배지를 제거하고, 10%FCS, 글루타민 및 항생물질을 함유한 4ml 신선한 DMEM를 세포에 가한다.

ⅳ) 루시페라제 발현의 측정

형질 감염 24시간후에 세포를 회수하고 상기와 같이 루시페라제 측정을 한다.

제27도에서 알 수 있는 바와 같아. TG 및 20n㏖의 폴리리신(d1312/TG-20n㏖ pL)으로 처리한 바이러스 시료에서 가장 강력한 발현(153540000 광 단위)를 보였다. TG 및 2n㏖의 폴리리신(d1312/TG-2 n㏖ pL)으로 처리한 바이러스 시료에서는 다소 약한 활성(57880000 광 단위)를 보였다. 아데노바이러스를 TG 없이 20 n㏖의 폴리리신으로 처리한 대조군 분획에서는 약 1/500이 덜 효과적이었다. 비교로서 추가로 복합체를 TG나 폴리리신(d1312) 어느 것으로도 처리하지 않은 아데노바이러스이 초기 시료를 형질감염에 사용하였다. 이 시료에서는 4403000 광 단위를 수득하였다.

d) 폴리리신-변형 아데노바이러스와 비변형 아데노바이러스, 특히 소량의

DNA를 비교한 형질감염 효율의 증가

형질감염은 50㎍의 아데노바이러스 분획 d1312/TG-20n㏖ pL 및 6㎍의 pCMV-Luc/8 ㎍ mTfpL, 0.6㎍의 pCMVL(=pCMV-Luc)/0.8㎍ mTfpL 또는 0.06㎍의 pCMV-Luc)/0.08㎍ mTfpL을 복합첼르 형성시키기 위해 사용하여 실시예3c)에 기재한 바와 같이 수행한다. 비교로서 6㎍, 0.6㎍, 0.06㎍ pCMV-Luc/mTfpL 복합체 및 비변형 아데노바이러스(d1312)로 형질감염을 수행한다. 비변형 아데노바이러스의 발현이 뚜렷하게감소하는 반면, 폴리리신-변형 아데노바이러스를 갖는 복합체에서는 소량의 DNA로도 높은 발현 수준을 얻을 수 있었다(제28도).

[실시예19 : 아데노바이러스와 폴리리신 사이의 결합이 바이오틴-스트렙타비딘 가교에 의해 수득되는 포접체의 유전자 전이]

a) 아데노바이러스 d1312의 바이오티닐화

150mM NaCl/5mM HEPES, pH 7.9/10% 글리세롤 중의 2.4ml의 겔 여과시킨(Sephadex G-25 PD10, Pharmacia) 아데노바이러스 d1312 용액을 10㎕(10n㏖)의 1mM의 NHS-LC 바이오틴(Pierce 21335)과 혼합한다. 주변온도에서 3시간 후에 바이오틴-변형 바이러스를 과량의 시약으로부터 겔 여과(상기 참조)에 의해 분리한다. 이 용액(2.5ml)을 글리세롤을 가함으로써 40%의 글리세롤 농도로 조절하여(총 용적 3.2ml) -25℃에서 저장한다. 바이러스의 바이오티닐화는 진공건조후, BSA로 차단하고, 스트렙타비딘-포접 알칼라인 포스파타제(BRL)로 항온배양하고, 세척하 다음 양성 유색 반응을 확인할 수 있는 전개 용액 NBT/X-포스페이트(니트로 블루-테트라졸륨염/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포르페이트, 톨루이딘 염 ; Boehringer Mannheim)로 1시간 동안 항온 배양하여 정성적 검출을 함으로써 확인하였다.

b) 스트렙타비딘-폴리리신 포접체의 제조

스트렙타비딘의 폴리리신에 대한 커플링은 공지의 방법(Wagner et al., 1990, EP-Al 388 758)을 사용하여 수행한다.

200mM의 HEPES pH 7.9 및 300mM NaCl 1ml 중의 79n㏖의 렙타비딘을 15mM의 에탄올성 SPDP 용액(236n㏖)으로 처리한다. 주변온도에서 1.5시간 후에 변형된 단백질을 세파덱스 G-25 칼럼상에서 겔 여과시킴으로써 196n㏖의 디티오피리딘 링커로 변형된 75n㏖의 스트렙타비딘을 수득한다. 변형된 단백질을 아르곤 조건하에서 2.6ml의 100mM의 HEPES pH 7.9 및 150mM NaCl 중의 3-머캅토프로피오네이트-변형 폴리리신(75n㏖, 평균 쇄 길이 290 리신 단량체, 190n㏖ 의 머캅토프로피오네이트 링커로 변형됨)과 반응시킨다. 포접체를 모노 S HR5 칼럼(Pharmacia)상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리한다. (구배:20-100% 완충액 B, 완충액 A: 50mM의 HEPES pH 7.9; 완충액 B: 완충액 A+3M 염화나트륨). 생성물 분획은 1.2M 내지 1.7M의 염 농도에서 용출시킨다. HBS(20mM의 HEPES pH 7.3, 150mM NaCl)에 대한 투석하여 45n㏖의 스트렙타비딘 및 53n㏖의 폴리리신으로 이루어진 포접체를 수득한다.

c) HeLa 세포의 형질감염

HeLa 세포를 상기 실시예1과 같은 6㎝배양 디쉬에 생육시킨다. 형질감염을 플레이트당 300,000 세포 밀도에서 수행한다. 형질감염시키기 전에, 세포를 2%의 FCS를 함유하는 의 신선한 배지에서 항온 배양한다.

100㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 170㎕의 HBS 중의 0.8㎍의 스트렙타비딘-폴리리신과 혼합시킨다. 20분후에 170㎕의 HBS 중의 3㎍의 폴리리신 pL300을 가한다. 추가로 20분후에 65㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스 또는 대조군에서는 상응량의 아데노바이러스 d1312(30㎕, 변형에 있어서 출발 바이러스)를 가한다. 복합체 혼합물(“biotinAdV/복합체 A” 또는 “대조군 AdV”, 제29도 참조)를 20분동안 세워둔다.

우선 65㎕의 비오티닐화 아데노바이러스를 50㎕의 HBS 중의 0.8㎍의 스트렙타비딘-폴리리신과 혼합한 다음 20분후에 170㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 가하고, 추가로 20분 후에 200㎕의 HBS 중의 3㎍의 폴리리신 pL300을 가하여 또 다른 복합체 생성을 수행한다. (복합체 혼합물“biotinAdV/복합체 B”).

67㎕의 HBS 중의 0.6㎍의 pCMVL-DNA를 33㎕의 HBS 중의 0.3㎍의 스트렙타비딘-폴리리신과 혼합한다. 20분후에 65㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스 또는 대조군에서는 상응량의 아데노바이러스 d1312(30㎕, 변형에 있어서 출발 바이러스)를 가한다. 복합체 혼합물(“biotinAdV/복합체 A” 또는 “대조군 AdV”, 제29도 참조)를 20분동안 세워둔 다음 HBS로 500㎕로 희석시킨다. 65㎕의 비오티닐화 아데노바이러스를 50㎕의 HBS 중의 0.3㎍의 스트렙타비딘-폴리리신과 혼합한 다음 20분후에 50㎕의 HBS 중의 0.6㎍의 pCMVL-DNA를 가하여 또 다른 복합체 생성을 수행한다. 복합체 혼합물(“biotinAdV/복합체 B”)을 추가로 20분동안 세워 방치한 다음 HBS로 500㎕로 희석한다.

혼합물을 세포에 가하여 세포를 37℃에서 2시간동안 항온배양한 다음, 추가로 10%FCS를 함유하는 2.5ml 신선한 배지를 가한다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 항온배양한 후에, 루시페라제 측정을 위하여 세포를 회수한다. 루시페라제 활성은 상기 실시예에서 특정된 방법으로 측정한다. 제29도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다.

병행하여 HeLa 세포의 형질감염음 포접체의 바이러스 성분으로서 소랄렌/UV-처리에 의해 불활성화시킨 바이오티닐화 바이러스를 사용하여 수행한다. 불활성화는 다음과 같이 수행한다: 200㎕ 뱃치의 바이오티닐화 바이러스 시룔르 1.6㎝ 조직배양 플레이트의 두 웰에 분주한다. 2㎕(33㎎/ml)의 8-메톡시 소랄렌(DMSO중)을 각 샘플에 가하고, 디쉬를 이상에 놓고 필터로 부터 4㎝의 거리에서 10분동안 램프(365 nm;UVP TL-33 lamp)를 조사한다. 조사후 두 샘플을 혼합하여 미리 HBS 중의 40% 글리세롤로 평형화시킨 칼럼으로 겔 여과(G50, Nick column, Pharmacia)시킨다. 75㎕ 분획을 0.8㎍의 스트렙타비딘-폴리리신과 복합체를 형성시켜 상기에서와 같이 HeLa 세포를 형질감염시키는 데에 사용한다.

세포병원성 종말점 검정법에 의하여 전이 능력은 고 농도에서 50% 이하 및 저농도에서 1/5 이하로 감소된 반면, 바이러스 역가는 불활성화에 의해 1/10⁴배 이상이 감소함을 확인하였다.

d) K562 세포의 형질감염

K562-세포를 RPMI 1640 배지(Gibco BRL+2g의 탄산나트륨/1)+10%의 FCS, 100 I.U./ml 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민에서 500,000 세포/ml의 밀도되도록 생육시킨다. 형질감염시키기 16 시간전에, 세포를 50μM의 데스페리옥사민(Sigma)을 함유하는 신선한 배지에 넣는다. 형질감염초기에 세포를 수집하여, 10%FCS+50μM의 데스페리옥사민을 함유하는 신선한 배지에 ml 당 250,000 세포로 재현탁시키고, 웰당 2ml 씩 24웰의 디쉬(dish)에 분주한다.

3개의 상이한 유형의 DNA 복합체가 제조된다: a) 160㎕ HBS(150mM NaCl, 20mM HEPES 7.3)중의 6㎍의 jpCMVL-DNA 용액을 160㎕ HBS 중의 12㎍의 TfpL190B 포접체와 혼합하고, 30분후 20㎍의 아데노바이러스 d1312를 가한 다음, 혼합물을 세포에가한다. b) 160㎕ HBS 중의 800ng의 스트렙타비딘- 폴리리신 용액을 a)에서와 같이 제조된 20㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스와 혼합시키고 30분 후에 160㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA 용액을 가한다음, 추가로 30분후에 이 용액을 160㎕ HBS 중의 10㎍의 TfpL190B 포접체와 혼합한다. 추가로 30분후에 이 혼합물을 세포에 가한다. c) DNA 복합체는 b)와 TfpL190B 포접체 대신에 3.5㎍ 폴리(L)리신 p(Lys)290 용액을 가하는 것을 다르게 하여 유사한 방법으로 제조한다. 세포를 37℃에서 24시간동안 항온배양한 다음, 루시페라제 측정을 위해 회수한다. 제30도에 나타낸 수치는 형질 감염된 세포의 총 루시페라제 활성을 나타낸다.

[실시예20 : 1차 골수 세포내로의 유전자 전이]

a) 골수 세포의 분리

1차 골수 세포를 1ml 시린지에 달린 주사 바늘(직경 0.4㎜ 또는 0.5㎜)로 배양 배지(10% FCS, 5×10^-5M β-머캅토에탄올, 1% IL-3 조건화된 배지 및 항생물질을 함유하는 IMDM)를 분리된 대퇴골 및 경골을 통하여 관류(flushing)시킴으로써 마우스로 부터 수집한다. 그리고나서 세포를 배양 배지에서 100×g로 8분간 원심분리함으로써 1회 세척한다. 그 후에 새포를 10⁷세포/ml의 농도로 재현탁시키고 T25배양 플라스크에 접종한다. 4시간 후에 비-부착 세포를 새로운 T25배양 플라스크에 옮기고 50μm 데스페리옥사민 존재하에서 하룻밤동안 배양시킨다.

b) 아데노바이러스-트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체의 형성

복합체를 형성시키기 위해서 50㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스를 20㎕ HBS 중의 400ng의 스트렙타비딘-변형 폴리리신와 항온배양시킨다. 그리고나서 6㎍의 pCMVL을 함유하는 20㎕의 HBS를 가한다. 20분의 항온 배양기간후에 160㎕ HBS 중의 7㎍의 마우스 트랜스페린-폴리리신 포접체(mTfpL)를 가하고 전체 혼합물을 추가로 20분동안 항온배양시킨다.

c) 형질감염

형질감염을 위하여 골수 세포를 100×g로 8분간 원심분리함으로써 배양 배지로부터 회수한다. 세포 펠릿을 2% FCS 및 250㎕의 아데노바이러스-DNA-트랜스페린 복합체를 함유하는 3ml의 배양 배지에 재현탁시키고 새로운 T25 배양 플라스크에 37℃에서 3시간동안 항온 배양시킨다. 그리고나서 3ml 및 2시간 후에는 추가로 6ml의 배양 배지(10% FCS 함유)를 가한다.

d) 루시페라제 발현의 측정

세포를 형질감염 48시간 후에 회수하고 다른 실시예에 기재된 바와 같이 루시페라제의 발현을 분석한다. 형질 발현에 의해 310×10³광 단위/100㎍ 총세포단백질에 상응하는 루시페라제 발현 활성을 갖는다.

[실시예21 : 신경아세포종 세포의 유리 아데노바이러스 및 아데노바이러스-폴리리신 포접체 존재하에서 48 kb 코스미드로의 형질감염]

GI-ME-N 이라 명명된 세포주의 세포를 실시예16에 기재된 바와 같이 48kb 코스미드로 특정량의 hTfpL, 유리 pL 및 DNA로 형질 감염시킨다. 항온배양 혼합물은 추가로 100μM의 클로로퀸(3 및 4 래인) 또는 ml 땅 5×10¹¹(5 및 6 래인)입자를 함유하는 10㎕의 아데노바이러스 d1312를 함유한다. 15㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스 d1312를 함유하는 마지막 두 샘플(7 및 8 래인, StpL/Biotin)을 150㎕의 HBS 중에서 스트렙타비딘-폴리리신(실시예19에서 제조된 0.8㎍)과 30분 샘플에 가한다음, 6㎍의 hTfpL+1㎍의 유리 pL을 함유하는 150㎕의 HBS를 가한다. 실온에서 추가로 30분동안 항온 배양한 후에 혼합물을 세포에 가한다. 37℃에서 2시간 동안 항온배양한 후에 4ml의 DMEM+10% FCS를 각 디쉬에 가한다. 24시간 후에 세포를 회수하여 루시페라제 활성을 측정한다. 결과를 제31도에 나타내었다.

[실시예22 : 1차 기도 상피세포로의 유전자 전이]

낭포성 섬유중의 유전적 교정에 대한 초기 연구에서 인체 기도 상피로 부터 유래된 불멸화(immortalization)된 세포주가 이 유전자 전이법에 감수성이 있는 것으로 나타났다. 이 현상이 기도 상피의 불멸화-유도 변형의 결과일 가능성을 배제시키기위해, 트랜스페린-폴리리신 분자 포접체를 인체 1차 호흡기 상피 세포(1ÅE)에서도 실험하였다.

1ÅE 세포는 문헌(Yankaskas, J. R., 1987)에 기재된 바와 같이 비폴립(nasal polyp) 표본으로부터 수득된다. 이 조직을 멸균 식염수로 헹군 다음, 항생물질(페니실린 50 U/ml, 스트렙토마이신 50㎍/ml, 겐타마이신 40㎍/ml)을 함유하는 조크리크 최소 필수 배지(Joklik's Minimum Essenmtial Medium:MEM)로 헹구어 4℃에서 실험실로 옮긴다. 카트리지 및 과량의점막하 조직을 분리해내고 상피 시트(sheet)를 MEM 중의 프로테아제 용액에서 4℃ 16 내지 48시간동안 항온배양시킨다(Sigma, 유형 14, 0.1㎎/dl)(Wu, R, 1985). 10%FBS(소 태자 혈청)을 프로테아제를 중화시키기위해 가하고, 세포를 약하게 교반함으로써 탈착시킨다. 생성된 현혭액을 10μm 나일론 메쉬(mesh)를 통하여 여과시켜 잔류물을 제거하고 펠릿(150×g, 5분)을 만들어 F12+10%FBS로 세척한다.

그리고나서 세포를 레포터 유전자로서 루시페라제 코드화 플라스미드(pRSVL)를 함유하는 트랜스페린-폴리리신 포접체(hTfpL)로 처리한다. 이 분석에서 1차 세포는 상대적으로 소량의 1ÅE 세포에 대한 트랜스페린 수용체를 나타내는 것으로 보이는 상응하는 불멸화된 세포주(기본=429 광 단위; 포접체 추가; 543 광 단위)에 의해 나타난 이들 복합체에 감수성을 나타내지 않았다.

세포에 대한 다른 표적 수용체를 연구하기 위해서 바이오티닐화 아데노바이러스를 사용하였다(참조:실시예19). 이 포접체로 처리한 세포는 기본치(2585753±453585)보다 현저하게 높은 발현 수준을 나타내었다. 추가로, 다른 종으로부터 유도된 1차 기도 상피 세포도 또한 이 경로에 의해 유전자 전이에 대한 높은 감수성을 나타내었다(마우스=3230244±343153; 원숭이=53498880±869481).

[실시예23 : 간세포 및 혈액 세포로의 유전자 전이]

이 실시예의 실험에서는 하기의 물질 및 방법을 사용한다:

조직 배양 세포의 형질감염:

세포주 BNL CL.2의 세포를 실시예6에 기재된 바와 같이 생육시킨다. HeLa 세포 및 간 세포를 6㎝ 배양 디쉬 중에서 생육시킨다. 형질감염은 디쉬당 약 3×10⁵세포의 세포 밀도에서 수행한다. 형질 감염전에 2%의 FCS를 함유하는 1ml의 신선한 배지를 표준 배양 배지로 치환시킨다.

이원성 복합체의 형성:

바이오티닐화 아데노바이러스(약 10⁹PFUs; 실시예19 a) 및 19 b) 참조)를 50㎕ HBS 중의 800ng의 스트렙타비디닐화 폴리리신과 반응시킨다. 실온에서 30분 후에 170㎕ HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 가하여 30분 동안 배양시킨 다음, 200㎕ HBS 중의 3㎍의 pL300을 가하고, 추가로 30분후에 용액을 형질감염 실험에 사용한다.

3원성 복합체의 형성

바이오티닐화 아데노바이러스(약 10⁹PFUs)를 50㎕ HBS 중의 800ng의 스트렙타비디닐화 폴리리신과 반응시킨다. 실온에서 30분 후에 170㎕ HBS 중의 6㎍의 플라스미드 DNA와 혼합시키고 30분동안 항온배양시킨 다음, 200㎕ HBS 중의 10㎍의 TfpL 190B을 가하고, 추가로 30분후에 용액을 형질감염 실험에 사용한다.

d) β-갈락토시다제의 검정

BNL CL.2 세포를 커버 슬립에 접종시키고 24시간 후에 세포를 pCMV-β gal(Lim and Chae, 1989) 레포터 프랄스미드로 형질감염시킨다. 48시가후에 β-갈락토시다제 검정을 실시예15에서와 같이 수행한다.

a) DNA 축합체 및 아데노바이러스 사이의 누출은 루시페라제 유전자 발현을 크게 증가시킨다:

DNA의 이원 및 3원성 DNA 복합체에 의한 간 세포로의 전이 효과를 제32도에 나타내었다: 유전자 전이 효율은 유리 아데노바이러스 존재하에서 상승한다. pLAdenoV/TpfL의 기울기는 트랜스글루타미나제에 의해 폴리리신으로 포접시킨 다음 DNA의 음전하를 중화시키는 DNA와 반응시킨 아데노바이러스로의 형질감염 결과를 나타낸 것이다. 그리고나서 트랜스페린-폴리리신을 나머지 저하를 중화시키기 위해 가한다. 이러한 방법으로 아데노바이러스-폴리리신/트랜스페린-폴리리신/DNA의 3원성 복합체를 합성한다. 보는 바와 같이 1.5×10⁹의 비상하게 높은 광 단위 수치를 수득한다(또는 세포당 약 5000 광 단위). adenoV+pL+TpfL의 기울기에서 아데노바이러스 및 폴리리신을 트랜스글루타민아제 처리를 위해 혼합한다. 그러나, 바이러스에 대한 폴리리신의 트랜슬글루타민아제 매개성 결합의 특이성을 확인하기 위해서는 효소를 생략한다. 그리고나서 바이러스 시료를 pLAdenoV/TpfL 에서와 같이 동량의 DNA 및 TpfL에 복합체를 형성시킨다. 양 실험 모두에서 바이러스 및 트랜스페린 DNA의 동시-국소화는 확률적 과정이기 때문에, pLAdenoV/TpfL 기울기를 나타낸 실험과는 대조적으로 3원성 복합체에서 바이러스 및 DNA의 누출에 의한 동시-국소화가 높은 수준의 트랜스페린감염(트랜스페린으로의 형질감염)을 시킨 반면, 이 경우의 형질감염은 AdenoV+TpfL에서와 같이 적당하였다.

b) K562 세포의 형질감염은 아데노바이러스의 엔도솜분해성을 나타낸다.

인체 적백형병 세포주 K562는 약 150,000 트랜스페린 수용체를 함유한다(Klausner et al., 1983b). 클로로퀸 존재하에서 이들 세포는 아데노바이러스가 존재하지 않더라도 문헌(Cotten et al., 1990)에 기재된 바와 같이 TpfL/레포터로 매우 높은 수준으로 형질감염시킬 수 있다(TpfL, 제33도). 그러나 유리 아데노바이러스와의 동일한 복합체는 클로로퀸이 없는 경우에는 아마도 다른 혈액 세포(Silver et al., 1988; Horvath, et al., 1988)에서 철머 K562 세포는 아데노바이러스 수용체 수준이 낮기 때문에, 레포너 유전자를 상대적으로 낮은 수준으로 발현시킨다(AdenoV/TpfL). 아데노바이러스가 바이오틴/스트렙타비딘 다리를 통하여 폴리리신에 링킹 된 경우 및 레포터 DNA가 이원성 복합체(pLAdenoV/TpfL)를 완성하기 위하여 더 많은 폴리리신의 추가에 의해 충분히 축합된 경우에는, 아마도 K562 세포의 몇 개의 아데노바이러스 수용체를 효율적으로 사용하기 때문에 아데노바이러스 지원성 형질감염은 중간 수준에 이른다. 그러나 복합체를 형성한 아데노바이러스-폴리리신-DNA이 충분히 축합되고 폴리리신-트랜스페린의 추가에 의해 중화되어 3원성 복합체(pLAdenoV/TpfL)를 형성하며, 수많은 세포성 트랜스페린 수용체를 작동시키는 경우에는, 두개 모두의 효율적인 트랜스페린 결합 및 바이러스의 엔도솜분해성에 기인하는 형질감염 효율은 적어도 10²배까지 증가한다(제33도).

c) 3원성 DNA 복합체는 거의 100%의 간세포에서 레포터 유전자를 발현시킨다.

마우스 간세포(BNL CL.2)에서 전달 시스템을 효능을 시험하기 위하여 세포를 β-갈락토시다제 레포터 유저자로 형질감염시킨다. 제34도는 a) 클로로퀸 존재하에서 전달감염(transferinfection), b) 유리 아데노바이러스 d1312의 존재하에서 전달감염 및 c) 3원성, (d1312) 아데노바이러스-폴리리신-트랜스페린-DNA 복합체로의 형질감염후에 β-갈락토시다제 검정 결과를 나타낸다. 아데노바이러스가 없는 경우, 레포터 DNA를 표준 전달감염시킨 다음에는 레포터 유전자를 발현하는 세포는 거의 없다. 형질감염의 퍼센트는 0.1%이하이다. 클로로퀸이 함유된 경우에는 퍼센트가 약 0.2%로 증가한다(제34(a)도). 유리 아데노바이러스가 있는 경우에는, 트랜스글루타민아제 변형된 바이러스를 갖는 3원 복합체가 전부는 아니지만 거의 모든 세포에서 레포터 유전자를 발현시키는 반면(제34(c)도), 약 5-10%의 세포가 레포터 유전자(제34(b)도)를 발현시킨다. 3원성 복합체는 고희석 상태에서 사용되기 때문에 고용량의 유리(불활성화된) 아데노바이러스에서 통상 나타나는 독성 효과가 발생하지 않는다. 그러나 100%의 조직 배양 세포에 도달하기 위해서는 3원성 복합체는 고농도로 전개시켜야 하는 반면, 유사한 독성 효과는 뚜렷해진다는 것을 알아야한다. 독성 효과는 잔류 바이러스 유전자 활성 또는 첨가된 바이러스의 엔도솜분해성에 의하여 유발될 수 있으며 또는 단순히 형질감염된 유전자의 매우 고농도의 발현의 결과이다.

d) 형질감염된 레포터 유전자의 발현을 일시적이지만 비-분해 간세포에서는 수주간 지속된다.

3원성 전달 복합체(pLAdenoV/TpfL)는 폴리리신-아데노바이러스로 제조하며 변형된 아데노바이러스를 바이러스를 소랄렌과 반응시킴으로써 추가로 불활성화시킨다. 2/3의 전면생장(confluent) 간세포 배양액을 제34(b)도에서와 같이 루시페라제 레포터 유전자 플라스미드 CMVL과 형질감염시키고, 루시페라제 활성을 상이한 시점에서 측정한다. 제35도에서 보는 바와 같이, 루시페라제 활성은 간세포 배양액이 전면생장되어 세포가 분열을 정지하는 3일후에 최대가 된다. 레포터 유전자의 발현은 유전자의 유지를 위해 선별하지 않고 비-분열 세포 배양에서 지속되며 특히 소랄렌 불활성화 아데노바이러스를 3원성 복합체 형성에 사용할 경우에는 적어도 6주동안 지속된다.

[실시예24 : 인체 세포로 DNA 전달을 증가시키기 위한 닭 아데노바이러스 CELO의 사용]

이 실시예에서는 닭 아데노바이러스 CELO에서 인체 아데노바이러스 유형 5를 사용하는 상기 실험과 동일한 방식으로 DNA를 인체 HeLa 세포로의 전달을 상승시키는 능력에 대해 시험한다.

닭 아데노바이러스 CELO(Phelps 염색, 혈청형 FAV-1, 7, 닭 신장 세포 경로)를 이들 실험에 사용한다. 바이러스(2ml)를 20mM HEPES pH 7.3, 150mM NaCl, (HBS)+10% 글리세롤 및 2ml의 용출액을 20㎕ iml의 NHS-LC-바이오틴(Pierce)과 실온에서 3시간동안 반응시킨다. 바이오티닐화 바이러스를 순차적으로 3×300ml의 HBS+40% 글리세롤에 대하여 4℃에서 투석시키고 연소가여 분획씩 -70℃에서 저장한다.

HeLa 세포(6㎝ 디쉬당 5×10⁵세포)를 500㎕의 HBS 중의 폴리리신(pLys) 또는 트랜스페린-폴리리신(TpfL) 혼합물과 복합체를 형성한 6㎍의 플라스미드 pCMVL을 함유하는 2ml의 DMEM+2% FCS 중에서 항온 배양 시킨다(복합체는 실온에서 30분동안 미리 항온배양시킨다). 그리고나서 샘플을 제36도에 정해진 양의 바이러스 존재하에서 세포에 가한다. 바이오티닐화 CELO 바이러스를 함유하는 샘플에서는 정해진 양의 바이러스를 100㎕의 HBS 중의 플라스미드 pCMVL을 가하기전에, 정해진 양의 200㎕의 HBS 중의 스트렙타비딘-폴리리신(StrpL)과 실온에서 30분동안 미리 항온배양시킨다. 실온에서 3시간동안 항온 배양시킨후에, 정해진 양의 TpfL 물질을 37℃에서 세포에 가혹 24시간 푸에 세포를 회수하여 루시페라제 검정을 위해 처리한다.

제36도에 나타난 바와 같이, 유리형태의 CELO 바이러스는 HeLa 세포 내로의 DNA의 전달을 증가시킨다(1 내지 6 래인). 그러나 CELO 바이러스를 바이오틴으로 변형시키고 추가의 트랜스페린-폴리리신이 있거나 없는 상태에서 스트렙타비딘과 복합체로 포함된 경우에는, 바이러스는 인체 아데노바이러스 d1312로 성취되는 것과 비교될 만한 수준을로 DNA 전달을 상승시키는 것을 확인하였다. 특정 HeLa 세포주는 트랜스페린이 없는 상태에서 폴리리신/DNA 복합체에 대하여 높은 결합력을 나타낸다(재36도의 샘플 1 및 4의 루시페라제 활성을 비교). 그러므로 폴리리신 DNA 복합체중에서 CELO 바이러스의 봉입은 바이러스의 유입을 개시시키기에 충분하다.

[실시예 25 : 근원세포의 형질감염]

a) 근원세포 및 근관의 유기 아데노바이러스 존재하 및 바이오틴/스트렙타비딘-커플링된 아데노바이러스 존재하에서 DNA/트랜스페린-폴리리신 복합체로의 형질감염

C2C12 근원세포(Blau et al., 1985; ATCC No.: CRL 1772) 및 G8 근원세포(ATCC N0.: CRL 1456)을 고 글루코스 DMEM+10% FCS에서 생육시킨다. 근원세포 배양액은 6㎝ 디쉬에서 디수당 약 5×10⁵세포로 아전면생장(subconfluence)시켜 형질감염시킨다. 근관 배양액은 6㎝ 디쉬(디쉬당 약 5×10⁵세포)에 근원세포를 도말시키고 세포가 전면생장되면 배지를 고 글루코스 DMEM+2% 말 혈청으로 바꿈으로써(Barr and Leiden, 1991; Dhawan et al., 1991) 제조한다. 근관 형질감염을 5-7일후에 수행한다. 형질감염 복합체를 정해진 양의 TpfL, StrpL 및 바이오티닐화 아데노바이러스 d1312를 사용하여 실시예19에 기재된 바와 같이 제조한다. 세포를 20시간동안 형질감염후에 회수하여 루시페라제 활성을 측정하기 위해 처리한다.

제37도는 전체 세포 샘플에 대한 생성된 루시페라제의 활성을 나타낸 것이다.

근원세포 및 근관 배양액 모두는 고 효율로 형질감염될 수 있다. 근관으로 분화되는 경우에는 형질감염 효율에 있어서 감소(one log 이하)(C1C12)가 있거나 유의적인 감소(G8)는 없었다. 근관 형성에 있어서 참여는 분화된 배양액에서 효율에 있어서 검출될 수 있는 감소를 일부 설명할 수 있는 G8 세포주로 더 낮은 빈도에서 발생되었다. 이런 유형의 세포에로의 DNA 전달에 있어서 트랜스페린/트랜스페린 수용체의 상호작용의 역할은 주요한 것은 아니다. 4개의 TVH 시료에서는 유리 아데노바이러스 d1312(1, 4, 7,10 래인)의 존재하에서 TpfL/DNA 복합체를 사용하는 DNA의 미약한 전달이 있었다. 형질감염 효율은 커플링된 바이러스 시스템(2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12 래인)을 사용을 증가시킨다. 바이러스 및 폴리리신/StrpL 만을 함유하는 복합체의 혼합 복합체로 수득되는 유전자 전이를 트램스페린-폴리리신을 함유하는 복합체로 수득된 생성물과 비교한 결과 효능에 있어서 1로드(log) 이하의 증가가 있었다(비교예: 2 래인, 트랜스페린 없음, 3 래인, 트랜스페린). 유리 바이러스로의 낮은 형질감염 및 트랜스페린-폴리리신 존재 또는 부재하에 커플링된 바이러스 복합체로의 높은 형질감염은 아데노바이러스가 이들 세포에서 리간드로서 제공되며, 커플링 없는 경우에는 유리 바이러스는 세포로 유입되나 TpfL/DNA 복합체는 대량으로 유입될 수 없다는 것을 제시한다.(이 실시예에서 사용된 DNA는 도면에 pCluc로 표시된 pCMVL이다.)

b) 근관에서 형질감염 빈도의 조직화학적 분석

C2C12 근관 배양액(근원세포로서 5×10⁵세포를 6㎝ 디쉬에 접종시키고 근관으로 분화시킴)을 a)에 기재된 바와 같이 제조한다. 유리 바이러스 샘플로, pCMVβ-gal DNA(6㎍)을 500㎕ HBS 중의 8㎍의 TpfL과 복합체를 형셩시켜 2ml의 DMEM/2%FCS 중의 18㎕의 아데노바이러스 d1312(ml 당 1×10¹²바이러스) 존재하에서 세포에 제공한다. 커플링된 바이러스 샘플은 pCMVLacZ DNA(6㎍)를 500㎕ HBS 중의 7㎍의 TpfL 및 800ng의 StrpL+바이오티닐화 아데노바이러스 d1312(ml 당 1×10¹²바이러스)와 복합체를 만들고 2ml의 DMEM/2%FCS 중의 세포에 제공함으로써 제조한다. 24시간 항온배양한 후에는 세포를 실시예15에 기재된 바와 같이 β-갈락토시다제 활성을 측정하기 위해 염색한다.

β-갈락토시다제 염색 패턴을 레포터 유전자(a 참조)로서 루시페라제를 하용한 형질감염의 결과와 일치하였다. 바이러스 및 DNA 커플링은 유전자 발현을 매우 높게 하는 반면, 유리 바이러스를 사용한 근관 배양물에서는 매우 낮은 유전자 발현이 수득된다. 청-염색, 다중-핵 튜불의 존재는 유리 아데노바이러스 존재하에서 이들 분화된 세포로의 유전자의 성공적인 전이를 나타낸다.

c) 마우스 1차 근원세포 및 관관 배양액으로 DNA의 전달

4주령의 수컷 C57B1/6 마우스의 양 뒷다리의 주요 골격근을 멸균적으로 PBS에 분리하여 약 5㎜ 조각으로 잘게 썬다. 조직을 20ml의 PBS에 현탁시키고 약 2분동안 정치시킨다음 상등액을 흡입제거시킨다. 이렇게 세척을 3회 반복한다. 그리고나서 조직을 3.5ml의 PBS+0.5ml 의 트랩신/EDTA, 0.5ml의 1%(w/v) 콜라게나제(유형 2, Sigma) 및 0.5ml의 1% BSA(분획 V, 4mM CaCl₂)와 혼합하여 약하게 자주 교반하며 37℃에서 30분간 항온배양시킨다. 30분 항온배양의 말기에 남은 조직을 정치시켜 상등액을 제거하고 5ml의 DMEM+20%의 FCS와 혼합한다. 조직이 완전히 분산될 때까지 프로테아제와 항온배양을 3-4회 반복한다. 그리고나서 세포 현탁액을 세포 시브(seive)(Falcon)를 통과시켜 응집물 및 조직 단편을 제거하고, 500g에서 15분동안 원심분리한다. 세포 펠릿을 10ml의 DMEM+20%FCS 중에 재현탁시켜 15㎝ 직경, 비피복 조직 배양 디쉬상에 60분동안 도말시킴으로써 섬유아세포를 제거한다. 그리고나서 부착되지 않은 세포를 조심스럽게 제거하고 5개의 라미닌-도포된, 10㎝의 조직 배양 디쉬에 디쉬당 15ml의 DMEM+20%FCSDNA와 함께 도말한다. 전면생장(confluence)에 도달하면 세포를 트립신 처리하여 라미닌-도포된, 6㎝의조직 배양 디쉬에 디쉬당 약 1×10⁶세포로 재도말한다. 근관 배양물을 생성시키기 위해서, 약 5일 후에(세포가 전면생장상태에 도달하면) 배지를 DMEM+2%FCS 말 혈청으로 교환하고 1주일후에 형질감염을 수행한다.

형질 감염을 위한 근관 배양물은 6㎝의 디쉬에서 약 80% 전면생장상태에서 형질감염시킨다. 라미닌-피복된 세포 배양 플레이트는 하기와 같은 방법으로 제조한다. 세포 배양 디쉬는 멸균수중의 0.025㎎/ml의 폴리리신(MW 30,000-70,000, Sigma)으로 실온에서 30분간 피복시킨다. 프렐이트를 멸균수로 3회 헹구고 공기중에서 건조시킨다. 그리고나서 플레이트를 물 중의 8㎍/gm의 라미닌(EHS, Sigma)으로 실온에서 하룻밤동안 피복시킨다. 플레이트를 접종전에 멸균수를 3회 세척한다.

형질감염에 사용되는 DNA는 150㎕의 HBS 중의 정해진 양의 소랄린/UV-불활성화 바이오티닐화 아데노바이러스 d1312(실시예19에서와 같이 제조됨)를 희식시키고 150㎕의 HBS 중의 1㎍의 StrpL를 가한다음, 2ml의 DMEM+2%FCS를 함유하는 6㎝의 디쉬에 근원세포 또는 근관 배양액에 가한다. 1시간 항온배양후에, 배지를 5㎕의 DMEM+2%FCS 또는 DMEM+2% 말 혈청(근관)로 치환시키고 48시간 후에, 세포를 루시페라제 분석을 위해 회수한다. 전체 세포 샘플로 부터의 루시페라제 활성을 제38도에 나타냈다.

[실시예 26 : 렉틴을 사용한 근원세포로의 CELO 바이러스 전달의 증가]

a) HeLa 세포 및 C2Cl2 근원세포에서 아데노바이러스 d1312 및 CELO 바이러스의 비교 분석

HeLa 세포 또는 C2Cl2 근원세포의 샘플(6㎝ 디쉬당 5×10⁵세포)를 1㎍의 StrpL/7㎍ 의 TpfL+5㎍의 바이오티닐화 아데노바이러스 d1312(실시예19 참조, ml 당 1×10¹²바이러스) 또는 18㎕의 바이오니틸화 CELO 바이러스(실시예24 참조, ml 당 0.3×10¹²입자)와 복합체가 형성된 pCMVL(도면에는 pCluc 로 표시함)로 형질감염시킨다. 20시간 하온배양후에 세포를 수집하여 루시페라제 활성을 측정하기 위한 처리를 한다. 제39도는 각 전체 세포 샘플로부터 수득된 루시페라제 활성을 나타낸다.

HeLa 세포로의 형질감염은 아데노바이러스 수용체 또는 트랜스페린 수용체에 의해 세포로 유입될 수 있는 인체 아데노바이러스 d1312/StrpL/TpfL/DNA 복합체 또는 트랜스페린 수용체를 통하여 유입될 수 있는 CELO 바이러스/StrpL/TpfL/DNA 복합체를 사용하여 비교적 효율적으로 수행하였다. 그러나 C2Cl2 근원세포로의 DNA 전달은 아데노바이러스 1312 복합체에 의해 효율적으로 수행될 수 있는 반면, CELO 바이러스를 함유하는 복합체는 이들 세포에서 약하게 작용한다. 상기 실시예는 트랜스페린 수용체가 이들 세포로의 혼합 복합체 전달에 있어서 단지 적은 역할을 담당할 뿐이며; 아마도 아데노바이러스 수용체가 주요한 유입 부위이라는 것을 시사한다. 그러므로 근원세포에서 CELO 바이러스의 약한 활성은 CELO 바이러스 및 트랜스페린 모두를 C2Cl2 근원세포에의 약한 결합에 기인한 것일 수 있다.

b) 리간드로서 소맥 배 아글루티닌을 사용한 CELO 바이러스 C2Cl2 근원세포 형질감염의 증가

a) 에서는 약한 전달 효과를 얻었으므로, 신규한 리간드, 즉 소맥 배 아글루티닌(단백질 몰당 2-4 몰 바이오틴: Boehringer Mannheim)을 트랜스페린을 치환시키기 위해 선택한. 바이오티닐화 CELO 바이러스를 상기와 같이 제조한다. 6㎍의 pCMVL+ 정해진 양의 StrpL, TpfL, 바이오티닐화 소맥 배 아글루티닌(WGA-B) 및 CELO 바이러스를 함유하는 복합체를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 바이러스 및 WGA를 150㎕ HBS 중에서 함께 희석한다. StrpL 도 또한 150㎕ HBS 중에서 희석하고 두 용액을 혼합하여 실온에서 30분간 항온배양시킨다. 100㎕ HBS 로 희석된 DNA를 StropL/바이러스/WGA 용액에 가한 다음, 추가로 30분간 실온에서 항온배양시킨다. 최종적으로, 100㎕ HBS 중의 TpfL을 혼합물에 가하여 다시한번 더 샘플을 실온에서 30분간 항온배양시킨다. 이 복합체를 2ml DMEM+2%FCS 중의 C2Cl2 근원세포(6㎝ 디쉬당 5×10⁵세포)제공한다. 1시간후에 5ml EMEM+10%FCS를 세포에 가하고 20시간후에 세포의 루시페라제 활성을 측정한다. 각 전체 세포 샘플에서의 활성(광 단위)을 제40도에 나타내었다. (이 실시예에서 사용된 DNA는 도면에서 pCluc으로 기재된 pCMVL 이다.)

WGA가 존제 또는 존제하지 않는 상태에서 바이러스 없이는 매우 약한 DNA 전달 결과를 수득하였다(1,6 래인). 커플링된 CELO 바이러스의 경우에는 적당한 전달 결과를 얻었고(2 래인); 그러나 WGA-B가 복합체에 함유된 경우에는 전달이 16-배 증가하였다. 복합체의 StrpL 함량이 증가(1㎍ 내지 2㎍) 된 경우에는 전달 효과를 약간 상승시킨(3 내지 5 래인 비교) 반면 복합체에서 WGA 양의 증가는(1㎍ 내지 5㎍) 전달이 약간 감소하는 결과를 얻었다(3 및 4 래인 비교). 이들 결과는 리간드로서 WGA-B가 C2Cl2 세포로의 CELO 바이러스-매개성 DNA 전달을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

d) C2Cl2 근원세포 및 근관 배양물에서 전체 길이의 인자 VIII 유전자의 발현

근원세포 및 근관 배양물을 상기에서와 같이 제조한다. 형질감염은 5 또는 15㎕의 바이오티닐화 아데노바이러스(기재된 바와 같음)+0.5 또는 1㎍의 StrpL, 및 7 또는 6㎍의 TpfL과 복합체가 형성된 전체-길이 인자 VIII cDNA(Wood et al., 1984; Eaton et al., 1986)를 함유하는 6㎍의 플라스미드를 사용하여 표준 복합체 형성 프로토콜로 수행한다.

DNA/바이러스 복합체를 2% FCS/DMEM 중의 세포에 제공한다. 37℃에서 4시간동안 항온배양시킨다음, 3ml의 신선한 DMEM+10%FCS를 각 디쉬에 가한다. 18시간후 배지를 회수하여 참고 문헌에 따르는 국제 표준의 코아테스트(COATEST)(KABI, Pharmacia) 시험 시스템을 사용하여 VIII의 존재를 측정한다. 인자 VIII 수준은 24시간당, 1×10⁶세포당 밀리단위 (mUnit)로 플로팅한다(제41도).

[실시예27 : 아데노바이러스 단백질의 DNA 전달을 위한 사용]

아데노바이러스(야생형 300)을 HeLa 세포내에서 생육시켜 졍제하고 아데노바이러스 d1312에서기재된 바와같이 바이오티닐화시킨다. 1.2ml의 바이러스를 3×300ml의 5mM MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 1mM EDTA pH 6.25에 대하여 4℃에서 18시간동안 투석시킨다. 그리고나서 이 물질을 27K로 SW60 로터에서 30분간 원심분리시킨다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 HBS/40% 글리세롤에 재현탁시킨다. HEPES, pH 7.4 및 NaCl을 20mM 및 150mM이 되도록 상등액에 가하고 펠렛(바이러스 코어(core) 단백질 및 다량의 헥손(hexon) 캡시드를 함유함, 제42도에서 “코어”) 및 상등액 분획(최고점을 포함함, 제42도에서 “최고점”) 모두에 대해서 Mov13 마우스 섬유아세포(Strauss and jaenisch, 1992) 또는 HeLa 세포 모두에로의 DNA 전달 활성을 시험한다.

DNA와의 복합체 형성은 다음과 같은 방볍으로 수행한다. 정해진 양의 원심분리전에 파괴시킨 바이러스 또는 지연 바이러스(Brandford 검정법에 의해 측정된 만큼의 ㎍ 단백질을 발현함)의 각 분획을 300㎕의 HBS에 희석시킨다. 그리고나서 스트렙타비딘-폴리리신(300㎕의 HBS 중의 3㎍)을 가한 다음, 실온에서 30분간 항온배양시킨다. 도면에 pCluc로 기재한 6㎍의 pCMVL을 100㎕의 HBS 중에서 희석시킨다음 첫 번재 용액에 가하여 30분간 항온배양시킨다. 최종적으로, 100㎕ HBS 중의 2㎕의 TpfL을 혼합물에 가하여 다시한번 더 30분간 항온배양시킨다. TpfL로만 제조된 샘플에서는 170㎕의 HBS 중의 8㎕의 TpfL을 330㎕의 HBS 중의 6㎕의 pCMVL 과 실온서 30분간 혼합시킨다. 정해진 양의 바이러스 단백질을 300㎕의 HBS에 희석시킨 다음 TpfL/DNA 복합체에 가한다. 모든 샘플을 2ml DMEM/10%FCS(또는 Mov13 섬유아세포의 HeLa)를 함유하는 6㎝ 디쉬중에 5×10⁵세포에 1시간동안 가한다. 10%FCS를 함유하는 5ml의 신선한 배지을 가한다음 20시간후에 세포의 루시페라제 활성을 측정한다. HeLa 세포(판넬 A) 또는 Mov13 섬유아세포(판넬 B) 모두에 대하여 수득된 루시페라제 활성(광 범위)을 제42도에 나타내었다. 두 세포 모두에서 최고점 분획(두 판넬에서 샘플 1-4)과 연관된 DNA 전달 활성이 용량-의존적으로 증가하였다. 동일량의 바이오티닐화 바이러스 단백질이 스트렙타비딘-폴리리신이 없는 TpfL/DNA 복합체를 함유하는 경우에는 DNA 전달이 기본수준에 근접한다는 것을 관측하였다(각 판넬에서 샘플 3).

[실시예28 : 갈락토스-리간드 포접체를 함유하는 DNA 3원성 복합체를 사용한 유전자 전이]

a) 인플루엔자 펩티드 포접체를 함유하는 3원성 복합체

DNA/트랜스페린-폴리리신 복합체에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HA-2 아단위의 N-말단으로 부터 유래된 서열을 함유하는 폴리리신-포접체 펩티드의 존재는 트랜스페린-폴리리신 매개성 유전자 전이를 실질적으로 상승시키는 것으로 밝혀졌다(실시예13 및 14).

테트라-안테나의 갈락토스 리간드-폴리리신 포접체 및 폴리리신-변형된 인플루엔자 펩티드(각각 실시예 6 또는 13에 기재된 바오 k같이 제조함)를 함유하는 유사한 DNA 혼합 복합체는 플라스미드 DNA pCMVL에 리간드-폴리리신 포접체를 가하여 DNA 전하의 반을 중화시킴으로써 제조하고, 나머지 전하는 인플루엔자 펩티드-폴리리신 포접체와 복합체를 로딩하는데에 사용한다. 합성 리간드(gal)4를 함유하는 이들 DNA 복합체의 BNL CL.2 간세포로의 전달(형질감염은 실시예 6g에 기재된 바와 같이 수행함) 결과 리간드로서 트랜스페린에 의해 수득되는 형질발현보다 현저히 높은 루시페라제 유전자 발현(제43도)이 있었다. 발현은 대조 실험에서 인플루엔자 펩티드가 결여되었으나 동량의 폴리리신을 함유하는 DNA 복합체로 수득되는 것보다 500배 이상으로 높았다(제43도). DNA 혼합 복합체로 수득되는 활성은 클로로퀸 존재하에서 세포와 항온배양시킨 DNA/(gal)4pL 복합체의 경우보다 약 30배 이상 높게 나타났다.

b) 아데노바이러스 포접체를 함유하는 3성 복합체

복합체는 다음과 같이 제조한다; 50㎕ HBS 중의 바이오티닐화된 아데노바이러스 d1312(실시예19에서와 같이 제조됨; 2㎕, 6㎕ 도는 18㎕; 10¹²입자/ml)를 100㎕ HBS 중의 스트렙타비딘-폴리리신(100 ng, 160 ng, 또는 480 ng)과 혼합시킨다. 30분동안 항온배양한 후 200㎕ HBS 중의 6㎍ pCMVL을 첨가하고, 추가로 30분후에 150㎕ HBS 중의 3.8㎍의 (gal) 4pL(실시예6에서 제조됨) 또는 7㎍ TpfL을 반응액에 첨가한다.DNA 복합체 용액을 고 글루코스 DMEM+2%FCS의 6㎝ 플레이트에서 생육시킨 각 300,000 세포(ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76)에 첨가한다. 추가로 세포 배양 방법과 루시페라제 측정은 앞의 실시예에서 설명된 방법에 의하여 수행한다. 유전자 발현(24 시간후)은 제44도에 나타내었다.

[실시예29 : B-림프아세포 B-세표로의 유전자 전이]

인체 Ig- 와 항-인체-Ig-폴리리신 포접체를 숙신이미딜피리닐디티오프로피오네이트로 변형시킨 다음, 문헌(SPKP, Jung et al., 1981)에 알려진 방법을 사용하여 디설파이드 다리를 삽입함으로써 커플링을 수행한다.

a) 항-인체-Ig-폴리리신 300 포접체의 제조

HBS 용액(150M NaCl, 20mM HEPES, pH7.8) 중의 염소-항-인체-Ig(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA)을 SPDP(Pharmacia) 5mM 에탄올 용액 14㎕와 혼합한다. 주변온도에서 10시간 방치한 후 용액은 세파덱스 G25 겔 칼럼(유출액 100mM HEPES 완충액, pH 7.3)으로 여과하여 항-인체-Ig 1.3㎎을 얻고 30nMol의 피리딜디티오프로피오네이트로 변형시킨다. 폴리(L)리신 300(평균 중합양 300 리신 그룹(Sigma))은 SPDP로 유사하게 변형시키고 디티오트레이톨과 겔 여과로 처리함으로써 유리 머캅토 그룹을 가진 변형된 형태를 생성시킨다. 0.3ml의 HBS중의 29nMol의 머캅토그룹으로 변형된 12nM의 폴리리신 300용액을 위에서 언급한 변형된 항-인체-Ig와 산소를 제가한 상태에서 혼합하고 주변온도에서 밤새도록 방치한다. 이 반응 혼합물에 5 M NaCl을 첨가함으로써 0.6 M NaCl 함량으로 조정한다. 이 포접체는 이온교환 크로마토그래피로 분리시킨다(Pharmacia, Mono S HR 5/5); 25mM HEPES pH 7.3에 대해 투석한후 4 nMol 폴리리신 300(몰비 1:2)으로 변형된 항-인체-Ig 0.33㎎으로 구성된 포접체를 수득한다.

b) 인체-Ig-폴리리신 300 포접체의 제조

2ml의 HBS 중의 19.5㎎의 항체(Sigma I-4506)용액을 10mM 에탄올성 숙신이미딜릴-피리딜디티오프로피오네이트(SPDPO, Pharmacia) 용액 39㎕와 혼합시킨다. 실온에서 2.5시간 후에 혼합물을 세파덱스 G25 겔 칼럼(유출액 100mM HEPES 완충액 pH 7.9)상에서 여과하여 252 nMol의 피리딜디티오프로피오네이트 그룹으로 변형된 인체-IgG 19㎎(119nMol)을 수득한다. 폴리-L-리신 300(평균 300리신 그룹 중합수준: Sigma)을 SPDP로 유사하게 변형시키고 유리 머캅토 그룹을 가진 변형된 형태를 만들기 위해 디티오트레이톨로 처리하고 이어서 겔 여과를 한다. 282nMol 머캅토 그룹에 의해 변형된 1ml HBS 중의 119nMol의 폴리리신 300용액을 산소가 배제된 상태에서 위에서 언급된 변형된 인체-Ig와 혼합하고 주변온도에서 밤새도록 방치한다. 그 반응 혼합물은 5 M NaCl를 첨가하여 약 0.6 M NaCl의 함량으로 조정한다. 이 포접체는 이온교환 크로마토그래피(Mono S, Pharmacia, 50mM HEPES pH 7.3, 0.6 M 내지 3 M NaCl)로 분리하고; HBS pH7.3에 대해서 투석한 후, 90nMol의 폴리리신 300(몰비 1:1.6)으로 변형된 항체 9㎎(57nMol)로 구성된 상응하는 포접체를 수득한다.

c) 복합체 형성 및 형질감염

복합체는 다음과 같이 제조한다. HBS 50㎕ 중의 바이오티닐화 아데노바이러스 d1312(30㎕, 10¹²입자/ml)를 HBS 100㎕ 중의 스트렙타비딘-폴리리신(800ng)와 혼합시키고; 30분 반응후 HBS 200㎕ 중의 9㎍ pCMVL의 용액을 첨가한다. 추가로 30분후 HBS 150㎕ 중의 폴리리신(PLYS 450) 5.1㎍, TpfL 10.2㎍, 인체-IgCT-폴리리신 포접체 12㎍ 또는 항-인체-Ig-폴리리신 포접체 10㎍를 첨가한다. 이 DNA 복합체를 10⁶B-림프아세포에 가한다. 이 세포는 문헌에 기재된(Walls 및 Crawford, 1989)것처럼 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스로 불멸화(immortalising)시킴으로써 인체 말초 단핵 혈액 세포(Peripheral mononucler blood cell)로 부터 수득되며 24-웰 디쉬에서 1ml의 RPMI 1640+2%FCS에서 배양시킨다.) 추가의 세포배양 및 루시페라제 측정은 상기 실시예에서 설명된 것과같이 실시한다. 유전자 발현치(광 단위의 루시페라제 활성)는 제45도에 나타내었다.

[실시예30 : 유리 및 포접된 리노바이러스 존재하에서 트랜스페린-폴리리신으로의 DNA 전이]

a) 리노바이러스 HRV-2 제조

리노바이러스 HRV-2는 문헌(Skern et al., 1984)기재된 바와 같이 제조하여 정제시킨다. HBS(150 mM 15mM HEPES, pH 7.9)/10% 글리세롤중의 리노바이러스 400㎕ 용액을 NHS-LC-바이오틴(Pierce 21335) 10n㏖로 처리한다. 실온에서 3시간동안 항온배양시킨 후, 바이러스를 HBS/40% 글리세롤에 대하여 4℃에서 강력하게 투석시킴으로써 비결합 바이오틴으로 부터 분리시킨다.

아크리딘 오렌지 존해하에 생육한 광-민감성 리소바이러스는 문헌(Madshus et al., 1984)에 기재된 바와같이 불활성화시킨다.

b) DNA 복합체의 제조 및 형질감염

ⅰ) 트랜스페린-폴리리신/DNA 복합체는 170㎕ HBS 중의 8㎍ TpfL290 용액과 330㎕ HBS(150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.3) 중의 플라스미드 DNA pCMVL 6㎍ 용액을 혼합하여 제조한다. DNA 복합체는 1.5ml의 배지(DMEM+2%FCS)와 0.14㎍ 내지 3.5㎍리노마이러스 HRV-2(또는 불화성화 HRV-2)와 혼합시킨다. 이 혼합물을 NIH 3T3 세포(300,000 pvh/6㎝ 플레이트)에 가한다. 4시간후 형질감염 배지를 신선한 배지(DMEM+10%FCS)로 치환한다. 24시간후 세포를 회수하고 상기에서와 같이 루시페라제 활성을 측정한다(그림 46A).

ⅱ) 트랜스페린-폴리리신과 리노바이러스-폴리리신 포접체를 함유하는 유전자 결합 복합체는 다음과 같이 3p조한다 : HBS 중의 바이노티닐화 리노바이러스 HRV-2(3.5㎍)의 100㎕ 용액을 100㎕ HBS 중의 1㎕ Strpl 폴리리신과 혼합시킨다. (다른 바이러스 농도는 적당한 비율로 한합한다.) 실온에서 30분후, 이 용액을 150㎕ HBS 중에 있는 6㎍의 플라스미드 DNA와 혼합시키고, 실온에서 추가로 30분간 항온 배양시켜 150㎕ HBS 중의 6㎍ TpfL290과 혼합한다. DNA 복합체는 1.5㎕의 배지(DMEM+2%FCS)와 혼합시키고 NIH 3T3 세포(300,000 세포/6㎝ 플레이트)에 가한다. 추가의 배양액의 처치 및 루시페라제 활성은 ⅰ)에서 설명된 것처럼 수행한다.(제46(b)도).

[실시예31 : 이온결합 아데노바이러스를 함유하는 혼합 복합체로 HeLa 세포의 형질 감염]

복합체 형성 A) : DNA 복합체는 30㎕ 아테노바이러스 d1312(대략 10⁹PFUs)을 170㎕ HBS 중의 1㎍ 폴리리신 pLyS 450(450 단량체의 평균 쇄 길이를 가짐)와 혼합하고 실온에서 30분후 170㎕ HBS 중에 pCMVL-DNH 6㎍과 혼합하여 제조한다. 추가로 30분동안 항온배양시킨후, 복합체를 170㎕ HS 중의 9㎍ TpfL190과 혼합한다. 복합체 혼합물(10%=50㎕ 용액, 600ng DNA; 또는 1%=5㎕ 용액, 60ng DNA)의 분획을 1.5ml+DMEM+2%FCS로 희석하여 300,000 HeLa 세포에 가한다. 4시간후 DMEM 2ml+2%FCS을 가한다. 형질감연 24시간후 세포를 회수하여 상기에서와 같이 루시페라제 측정을 수행한다. 총 추출물에 해당하는 루시페라제 활성은 29,115,000 광단위(600ng DNA 경우) 및 1,090,000 광단위(60ng DNA 경우)이다.

복합체 형성 B)(대조실험) : DNA 복합체는 먼저 170㎕ HBS 중의 pCMVL-DNA의 6㎍와 170㎕ HBS 중의 1㎍ 폴리리신 pLys450을 혼합하고, 실온에서 30분 후에 170㎕ HBS 중의 9㎍ TpfL190과 혼합함으로써 제조한다. 추가로 30분동안 항온 배양시킨후, 복합체를 아테노바이러스 d1312(dir 10⁹PFUs) 30㎕와 혼합한다.복합체 혼합물의 분획(10%=50㎕ 용액, 600ng DNA; 또는 1%=5㎕ 용액, 60ng DNA)은 1.5ml DMEM+2%FCS로 희석하여 300,000 HeLa 세포에 가한다. 4시간후 2ml의 DMEM+2%FCS를 가한다. 형질감염 24시간후 세포를 회집하고 루시페라제 활성은 통상적인 방법으로 측정한다. 총 추출물에 상응하는 루시페라제 활성은 405000 광단위(600ng DNA 경우) 및 200 광단위(60ng DNA 경우)이었다.

[실시예32 : DNA/아데노바이러스/트랜스페린-폴리리신 포접체의 랫트 간으로의 국소 적용]

a) 직접 주사

DNA 복합체를 실시예19에 기재된 방법으로 제조한다. 복합체는 총부피 2000㎕ HBS 중의 200㎕ 아테노바이러스 d1312, 6.4㎍ 스트렙타비딘-폴리리신, 48㎍ pCMVL 및 48㎍ TpfL290으로 이루어진다. 숫컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트(체중 240g)을 아베르틴(Avertin)으로 마취시키고 4㎝ 정도의 개복술이 수행한다. 이 복합체 용액을 간의 좌엽으로 2분간격으로 주사한다. 랫트를 에테르 마취하에서 치사시키고 다양한 간 샘플에서 루시페라제 발현을 측정한다. 주사부위에서 5.615 광단위/㎎ 간 균질액 단백질이 측정되었다. 총활성은 370,600 광단위이다. 루시페라제 활성은 주사부위에서 멀어진 간부위에서는 나타나지 않는다.

b) 담즙 배액 시스템을 통한 간에의 포저체 적용

복합체는 다음과같이 조제한다: 200㎕ HBS로 희석된 200㎕ 바이오틸화 아데노바이러스 d1312를 400㎕ HBS 중의 6.4㎍의 스트렙타비딘-변형 폴리리신과 실온에서 30분동안 항온배양시킨다. 그리고나서 800㎕ HBS 중의 48㎍ pCMVL을 가한다. 30분 항온배양후 900㎕ HBS 중의 48㎍ TpfL을 추가로 가한다. 복합체 적용에서 숫컷 SD 랫트(체중 250g)은 아베르틴으로 마취시키고 정중선을 절개하여 복부를 개복한다. 장은 몸의 왼편으로 밀어놓고 튜브가 연결된 27G 주사침의 1ml 시린지를 담즙관으로 삽입한다. 복합체의 주사는 4분 이상 수행한다. 그리고나서 주사침을 담즙관에서 빼고 주사부위를 피브린 실러(Immuno)로 봉입한다. 복부의 상처는 봉합사와 금속 클립으로 봉합한다. 30분후 랫트를 치사시키고 간의 다른 엽에서 루시페라제 유전자 발현을 측정하였다. 루시페라제의 최고 활성은 19000 광단위/㎎ 단백질이고 총 간에서 계산된 전체 발현은 2.7×10⁶광단위이다.

[실시예 33 : 겸자됨 아무스 꼬리 정맥으로의 DNA/아데노바이러스/TpfL 복합체의 적용]

복합체는 실시예19에서와 같이 제조한다. 복합체는 150㎕ HBS 중에 45㎕ 아데노바이러스 d1312, 0.8㎍ 스트렙타비딘-폴리리신, 6㎍ pCMVL 및 24㎍ mTfpL290으로 이루어진다. 복합체는 숫컷 C3H/He 마우스(2월령)의 꼬리 정맥내로 주사하고, 아베르틴으로 마취시킨다. 주사 직후 꼬리 정맥의 근위 및 원위에 겸자를 설치하여 복합체 용액이 압축 기간(25분) 동안 주사한 꼬리 정맥 분절에 제한되어 혈액에 의해 관류될 수 없게 한다. 주사 48시간후 마우스는 경추탈골로 치사시키고 꼬리정맥이 준비된다. 루시페라제 발현은 꼬리정맥 분절의 균질물에서 측정한다. 발현 결과는 2,600 광단위/3㎝ 꼬리정맥으로 수득된다.

[실시예34 : 1차 인체 멜라노마 세포의 형질감염

a) 아테노 바이러스-폴리리신/트랜스페린-폴리리신 혼합 복합체의 형질감염

1차 멜라노마 세포를 환자로 부터 외과적으로 제거한 멜라노마로 부터 분리한다. 이 종양을 5%FCS, 2mM 글루타민 및 항생물질이 함유된 RPMI 1640 배양액에서 기계적으로 파열시키고, 강철망을 통해 조직 조각을 통과시켰다. 종양 세포는 원심분리에 의해 여러번 세척하고 재분산시켜 T25 세포배양 플라스크에 분주하였다. 분리 24시간후 종양 세포를 500㎕ HBS 중의 3㎕, 9㎕, 또는 27㎕ 바이오틸화 아데노바이러스, 0.5㎎ 스트렙타비딘-폴리리신, 6㎍ pCMVL과 7㎍ TpfL290(27㎕ 아데노바이러스 : 1㎍ 스트렙타비딘-폴리리신과 6㎍ TpfL 290의 혼합물)로 구성된 3원성 복합체로 형질감염시킨다. 감염 36시간후 세포를 회수하고, 루시페라제 활성을 측정한다(광단위). (제47도; 맨위 바는 현탁액중의 세포에서의 결과를 나타내고 아래 바는 접착된 세포에서의 결과를 나타낸다.)

b) 아데노바이러스-폴리리신/저밀도 리포프로데인-폴리리신 혼합 복합체의 형질 감염

ⅰ) LDL-폴리리신 포합체의 제조

HBS 2ml 중의 LDL(저밀도 리포프로데인, Sigma, L-I139, 분자량3,500,000 입자 직경 약 26㎚) 포접체 10㎎을 10mM의 에탄올성 용액 SPDP(1.43μ㏖; Pharmacia) 143 ㎕와 혼합시키고 주온도에서 2시간동안 방치한다. HBS로 세파덱스 G 25 칼럼(14×140㎜)에 겔 여과하여 0.70㎛이 피리딜디티오프로피오네이트 그룹으로 변형된 LDL 10㎎의 용액 3.2ml를 수득하였다. 이 용액에 폴리리신이 첨가될 때 발생하는 침전을 방지하기 위해 5 M NaCl 1.2 ml을 혼합한다. 300 단량체의 평균 쇄 길이를 가진 폴리-L-리신을 설명된 것처럼 SPDP로 변형시키고 디티오트레이톨를 처리하여 겔 여과함으로써 머캅토 그룹으로 변혀오딘 형태를 만든다. 상기에서와 같이 변형된 LDL-용액을 아르곤하에서 폴리리신 300 0.3μ㏖ 용액과 혼합시키고 2 M NaCl, 0.5 M HEPES, pH 7.9에서 0.76μ㏖ 머캅토 그룹으로 변형시켜 생성된 혼합물을 실온에서 48시간동안 방치한다. 이 반응용액은 멸균수(NaCl 농도 약 0.5M) 32ml로 희석하고 이온교환 크로마토그래피(Biorad Macroprep S, 10×100㎚, 20MM HEPES pH 7.3, 0.2~3 M NaCl 구배). 생성물 분획은 1.8M~2.2M의 염농도로 유출시켜 수집한다. HBS에 대하여 투석시킨 다음 190n㏖ 폴리리신(7.5㎎ 유리 폴리리신 염기형에 해당)으로 변형시킨 LDL의 2.35㎎(3.4n㏖)로 구성된 포접체를 수득한다. 이것은 약 55 폴리리신 사슬을 가진 LDL-입자의 평균형에 해당한다.

ⅱ) 복합체 형성 및 형질 감염

바이오틸화된 아데노바이러스 d1312 lfy 18㎕를 100㎕ 부피로 HBS로 희석한다. 1.2㎍ 스트렙타비딘-폴리리신은 HBS를 사용하여 100㎕로 조정하고 아데노바이러스 100㎕와 혼합한다. 30분후 6㎕ pCMVL을 함유하는 150㎕ HBS를 가한다. 추가로 30분후 이와같이 조제된 용액을 1.5ml DMEM(10% FCS)와 혼합하고 6㎜ 직경의 세포배양 디쉬의 3×105 1차 골수종(myeloma) 세포(a)에서 제조되고 HMM1과 HMM4로 명명))에가함으로써 제조한다. 다른 세포배양 작업과 루시페라제 측정은 a)에서 설명된 것처럼 수행한다. 유전자 발현은 제48도에 나타냈다; 제48(a)도는 골수종 세포 HMM1와의 결과를 나타낸다; 모든 실험은 도면에는 별도로 언급하지 않은 AdpL-포접체로 수행한다. 제48(b)도는 골수종 세포 HMM4와의 결과를 나타낸다; 모든 실험은 마지막 칼럼에서만 별도로 나타낸 AdpL-포접체로 수행한다(d1312라는 명칭은 특정 바이러스 시료를 지칭한다). 칼럼 2에서 나타낸 실험에서 LDL을 25-배 과량으로 가함으로써 LDL-수용체에 대한 경합 결과로 유전자 전이 효율이 감소된 결과를 나타냈다.

[실시예35 : 1차 인체 섬유아세포의 형질감염]

인체 피부 생검물을 2mM 글루타민, 20% FCS, 항생물질, DMEM을 함유한 6㎝페트리 디쉬에 넣는다. 그리고나서 생검물을 외과용 수술칼로 완전히 잘게 썰은 다음 5일 동안 3ml 배지에서 배양한다. 그후 세포를 신선한 배지로 세척하고 7일 더 배양한다. 이 기간후 세포를 트립신으로 처리하고 새로운 페트리 디쉬에 분주하여 배양한다. 세포가 거의 전면생장(confluent)되었을 때 다시 세포를 트립신으로 처리하고 형질감염 때까지 냉동시켜 보나다. 형질감염을 시키기 위해서 세포를 녹이고 6㎝ 페트리 디쉬에 분주하고 2mM 글루타민, 10%FCS 및 항생물질을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한다. 형질감염 포접체는 다음과 같이 제조한다 : 바이오틸화 아데노바이러스 d1312 3㎕, 10㎕, 20㎕, 30㎕를 150㎕ HBS 중에 0.1㎍, 0.3㎍, 0.5㎍, 0.8㎍의 폴리리신-변형 스트렙타비딘과 실온에서 30분동안 배양한다. 그리고나서 170㎕ HBS 중의 6㎍ pCMV-βgal 플라스미드를 가하고 이 혼합물을 30분동안 더 항온 배양하였다. 최종단계에서 170㎍ HBS 중의 3㎕ d1312와의 포접체에 대해 7.8㎍ TpfL, 10㎕ d1312 와의 포접체에 대해 7㎍ TpfL 및 20㎕ 및 30㎕ d1312와의 포접체에 대해 6㎍ TpfL을 가한다. 30분 항온 배양후 그 포접체는 2mM 글루타민, 2%FCS, 항생 물질은 함유하는 DMEM 2ml 중의 세포에 적용하고 이 세포를 37℃ 4시간동안 항온 배양한다. 그리고나서 배지를 제거하고 2mM 글루타민, 10%FCS, 항생물질을 함유하는 DMEM에서 37℃로 항온배양을 계속한다. 48시간후 β-갈락토시다제의 발현을 상기 실시예에서와 같이 확인 하였다.

3㎕ d1312로의 형질감염에서 세포의 14%가 β-갈락토시다제의 생성을 나타내었고 10㎕ d1312에서는 32%, 20㎕ d1312에서는 39%, 30㎕ d1312에서는 64%의 세포가 양성으로 나타났다.

[실시예36 : 생체내에서 혼합 복합체에 의한 랫트의 기도 상피세포로의 유전자 전이]

a) TpfL/AdpL-혼합 복합체의 제조

인체 트랜스페린-폴리리신-DNA 복합체(hifpL)는 150㎕ HBS(150 mM NaCl/20 mM HEPES pH 7.3)중의 8㎍ 트랜스페린-폴리리신(Serva Bioxhemical)과 350㎕ HBS 중의 6㎍ pCMVL-DNA를 혼합함으로써 제조하고 그 혼합물은 주변온도에서 30분동안 항온배양 하였다. 아데노바이러스-폴리리신 포접체는 실시예19 c)에서 설명된 바와 같이 제조한다: 소랄렌/UV-불활성화 아데노 바이러스가 사용한다. 이 혼합 복합체 hifpL/AdpL은 실시예23 c)에서설명된 바와 같이 제조한다.

b) 기관내 경로에 의한 복합체의 생체내 투여

이 실험 목적으로 아데노바이러스 폐병에 대한 적합한 동물 모델(Pacini et al., 1984)인 시그모돈 히스피두스(Sigmodon hispidus)(“Cotton Rat”)를 사용한다. 이 동물은 메톡시플루란(methoxyfluran)으로 마취시킨다. 목의 복측으로 수직 절개한후 기관을 사각형으로 절개한다. 복합체(250 내지 300 ㎕; 3㎍의 플라스미드 DNA)를 환히 보이는 상태에서 45°의 각도로 위치시키고 직접 기관에 주사한다. 주사후 제49도에 특정된 시간에 실험동물을 CO₂를 사용하여 치사시키고 기관 및 폐를 원 위치에서 찬 포스페이트-완충 식염수 용액(PBS)로 관류시킨 후에 전부 회수한다. 루시페라제 측정을 위해 폐조직을 추출 완충액에서 균질화시키고, 분해물은 총 단백질 함량을 표준화시켜 루시페라제 유전자의 발현을 기재된 바와 같이 측정한다. 특정된 광단위는 폐 분해물로 부터 얻어진 1,250㎍의 총 단백질에 해당된다. 실험은 3-4회 수행하여 그 결과는 평균±표준편차로 표시하였다.

[실시예37 : 비-바이러스성 엔도솜분해 제제를 사용한 유전자 전이]

a) 막-파괴 펩티드의 합성

ⅰ) 펩티드 합성:

펩티드는 자동 합성기(ABI 431A)로 고체 지지체로서 p-알콕시벤질알콜 레진(0.97m㏖/g) 및 Fmoc-보호 아미노산을 사용하는 고상법(solid phase method)에 의해 합성한다. 카르복시-말단 아미노산을 대칭성 무수물을 통해 레진에 커플링시킨다. 그 다음의 아미노산은 1-히드록시벤조트리아졸 디사이클로헥실카르보이미드 법에 의해 커플링시킨다. 다음의 측쇄 보호기를 사용한다: (Trt)Asn, (Trt)Cys [EALA 및 GLF의 경우에는 (t-Bu)Cys], (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bu)Ser.

펩티드는 하기의 서열을 갖는다:

펩티드를 레진으로부터 절단시키고 페놀/에탄디티올/티오아니솔/물/트리플루오로아세트산 0.75:0.25:0.5:0.5:10 의 혼합물 3ml를 함유하는 펩티드-로딩된 지지물(support)을 실온에서 1.5시간동안 처리함으로써 (t-Bu)Cys 이외의 측쇄 보호기를 제거시킨다. 조 펩티드는 에탄올 중에서 침전시키고 두 번 세척한다. S-t-Bu 보호 펩티드 EALA 및 GLF를 소량으 1M 트리에틸암모늄 바이카로보네이트(TEAB) pH8에 용해시키고, 100mM TEAB에 희석시켜 추가로 뉴클레오실(Nucleosil) 500-5C4 칼럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정제한다(0.1% TFA-아세토니트릴 구배). 두 펩티드 모두 약 50% 아세토니트릴로 유출시킨다. 상기와 동일한 방법에 의해 Trt-Cys 펩티드를 탈보호함으로써 유리 Cys-SH 형태의 펩티드를 수득한다. 조 펩티드(5㎎)는 1㎕ β-머캅토에탄올을 함유하는 100㎕ 100mM TEAB, pH8에 용해시키고 겔 여과(Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0.5mM EDTA) 및 동결 건조 또는 이온-교환 크로마토그래피(Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH7.3, 0 내지 3 M Nacl 구배, 펩티드는 1.5 M NaCl로 유출시킨다)로 정제한다.

ⅱ) N-(하이드록시에틸)말레이미드로의 변형

펩티드 GLF-델타, GLF-II, EALA-Inf, EALA-P50, P50의 C-말단 SH 그룹은 유리 SH 형태를 겔 여과(Sephadex G-25, 20 mM HEPES, pH 7.3, 0.5 mM EDTA)시킨 후에 1.3 내지 10 배 몰수의 과량의 N-(하이드록시에틸)말레이미드와 반응(1시간, 실온)시킴으로써 차단시킨다. 과량의 말레이미드를 겔 여과(Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH8)에 의해 제거하여 펩티드(GLF-델타-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALA-P50-mal, P50-mal)를 동결건조된 트리에틸암모늄 염으로 수득한다.

ⅲ) 2,2'-디티오비스피리딘으로의 변형

유리 SH 펩티드를 10당량의 2,2'-디티오비스피리딘(20 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 mM EDTA)으로 실온에서 하룻밤동안 반응시킨다. 과량의 시약은 겔 여과(Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH8) 또는 이온-교환 크로마토그래피(Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7.3, 0 내지 3 M NaCl 구배, 펩티드는 1.5 M NaCl로 유출시킨다)에 의해 제거하여 (2-피리딜티오)-Cys 펩티드(GLF-델타-SSPy, GLF-II-SSpy, EALA-P50-SSPy, P50-SSPy)를 수득한다.

ⅳ) 펩티드의 이량체화(dimerization)

P50(P50 dim)의 동종이량체를 20mM HEPES 중의 동몰수의 P50-Cys-(2-피리딜티오) 및 P50-Cys-SH 과 실온에서 3일 동안 반응시킴으로써 제조한다. 반응 혼합물을 모노 Q 칼럼(HR-5/5 Pharmacia: 20mM Hepes, pH 7.3, 0.09M 내지 3M NaCl: P50-이량체는 1.1M NaCl에서 유출시킨다). 이종이량체 GLF-SS-P50은 유사하게 펩티드 P50(유리 머캅토 형태)를 피리딜티오-변형 펩티드 GLF와 반응시킴으로써 제조한다.

b) 리포좀 누출 검정법:

합성 펩티드가 리포좀을 파괴하는 능력은 자기-퀀칭 농도의 칼세인으로 로딩시킨 리포좀으로부터 형광 염료를 방출시킴으로써 검정한다. 리포좀은 100mM 칼세인, Na+, 50mM NaCl, pH 7.3의 수상으로 역상 증발시키고(Szoka and Papahadjopoulos, 1978) 단일형 크기로 분산시키기 위해 100㎚ 폴리카르보네이트 필터(MacDonald et al., 1991)를 통해 분출시킨다. 리포좀은 등삼투압 완충액(200mM NaCl, 25mM Hepes, pH 7.3)으로 세파덱스 G-25 상에서 겔 여과시킴으로써 비결합된 물질로 분리시킨다. 다양한 pH 수치에서의 누출 검정을 위해서는, 리포좀 스톡용액을 2x 검정 완충액(400mM NaCl, 40mM 시트르산 나트륨)으로 희석한다. 100㎕ 분획을 96-웰 마이크로티터 플레이트상의 80㎕의 일련의 펩티드 물 희석 용액에 가하고(최종 농도:25 μM) 실온에서 30분간 항온배양 후 600㎚(여기 490㎚)에서 마이크로티터-플레이트 형광 광도계로 칼세인 형광을 측정한다. 100% 누출에 대한 누출치는 1㎕의 10% 트리톤 X-100 용액을 가하여 수득한다. 누출 단위는 50% 누출이 관측되는 펩티트 농도(즉, 펩티트 ㎍당 50%로 분해되는 리포좀 용액 ㎕ 부피)의 역 수치로서 계산한다. 리포좀 누출 검정 결과를 제50도로 나타내였다. GLF 및 EALA는 최고 pH 특이적 활성을 나타낸다.

c) 적혈구 분해(lysis) 검정법:

신선한 인체 적혈구를 HBS로 수회 세척하고 적당한 pH(300mM NaCl, 30mM 시트르산 나트륨)에서 2x 검정 완충액으로 6.6×10⁷/㎕의 농도로 재현탁시킨다. 75㎕ 분획을 96-웰 마이크로티터 플레이트상의 75㎕의 일련의 펩티드 물 희석 용액에 가하고(원추형) 37℃에서 일정하게 진탕시키면서 1시간동안 항옴배양시킨다. 원심분라(1000 rcf, 5분)에 의해 비분해된 적혈구를 제거한 후 100㎕의 상등액을 새로운 마이크로티터-플레이트로 옮기고 450㎚에서 헤모글로빈 흡광도를 측정한다(750㎚에서 기본 교정치). 원심분리에 앞서 1㎕의 10% 트리톤 X-100 용액을 가함으로써 100% 분해를 측정한다. 용혈 단위는 50% 누출이 관측되는 펩티드 농도(즉, 펩티드 ㎍당 50%로 분해되는 적혈구 용액㎕ 부피)의 역 수치로서 계산한다. 3 용형 단위 미만의수치는 외삽시켰다. 수치를 제51도에 기재하였다. 알 수 있는 바와 같이 P50 dim 및 EALA-P50 은 세포 분해 및/또는 헤포글로빈과 같은 더 큰 분자의 방출에 있어서 가장 높은 pH 특이적 활성을 나타낸다. p50 단량체 P50mal 및 P50 SS-Py는 더 낮은 활성을 나타냈다. 멜리틴은 가장 높은 활성을 나타냈으나, 산성 pH 특이적이지는 않았다.

d) DNA 혼합 복합체의 제조

DNA 복합체는 먼저 150㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 150㎕의 HBS 중의 4㎍의 TfpL290과 혼합시킨 다음 실온에서 30분후에 100㎕의 HBS 중의 4 내지 20㎍의 폴리(L)리신290과 혼합시킨다. 실온에서 30분간 추가로 항온배양한 후에 0.3 내지 100㎕의 HBS 중의 0.3 내지 30㎍의 펩티드를 가하여 추가로 30분동안 항온배양시킨다. 최적양의 엔도솜분해 물질은 예비 적정에서 수득된 유전자 전이 효율을 검정함으로써 측정한다(BNL CL. 2 세로포의 유전자 전이에 대해서는 표 3 참고). 복합체 시료(최종 용적 1.5㎕)의 더 많은 사용 뿐만 아니라 동시에 pLys 및 엔도솜분해 물질을 추가함으로써 필적할 만한(또는 더 좋은) 형질감염 효율을 나타낸다. 이들 실험에서 비-펩티드성 양친매성 물질인 데스옥시콜산 및 올레산에서도 또한 DNA 전달이 상승되는 것으로 나타났다.

e) 세포의 형질감염:

부착 세포주(각각 BNL CL. 2 간세포 또는 NIH 3T3 세포)는 형질감염전에 6㎝ 디쉬에서 1 내지 2 일간 생육시킨다(10% FCS를 함유하는 DMEM 배지: 디쉬당 300,000 세포). 배지를 제거하고 1.5㎕의 DMEM+2% FCS 및 500㎕의 DNA 복합체를 가한다. 또 다르게는 0.5㎕ DMEM+6% FCS 및 1.5㎕의 DNA 복합체를 가한다. 4시간 항온배양시킨 다음 2㎕의 DMEM(18% FCS)를 가한다. (또는 형질감염 배지를 10%FCS를 함유한 4㎕ DMEM으로 치환시킨다). 세포의 회수 및 루시페라제 검정법은 상기에서와 같이 형질감염 24시간 후에 수행한다. 나타난 광 단위는 형질감염된 총 루피세라제 활성을 나타낸다. BNL CL. 2 간세포의 형질감염은 제52도로 나타내었다:

제52(a)도: DNA 복합체를 먼저 250㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 250㎕의 HBS 중의 4㎍의 TfpL290과 반응시킨 다음 실온에서 30분후에 750㎕의 HBS 중의 20㎍의 폴리(L)리신290과 혼합한다. 실온에서 30분간 추가로 항온 배양한 후에 250㎕k의 HBS 중의 정해진 양의 펩티드를 가한다. 추가로 30분 동안 항온배양시킨 다음 복합체를 0.5㎕ DMEM+6% FCS와 혼합하여 450,000 세포에 가한다.

제52(b)도: DNA 복합체를 다음과 같이 제조한다. 500㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 250㎕의 HBS 중의 4㎍의 TfpL290과 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한다. HBS 중의 20㎍의 폴리(L)리신290 500-㎕ 용액을 250㎕의 HBS중의 정해진 양의 펩티드와 혼합하여 즉시 정해진 양의 TfpL/DNA 복합체와 혼합한다. 실온에서 30분간 추가로 항온배양한 후에 복합체를 0.5㎕ DMEM+6% FCS와 혼합하여 450,000 세포에 가한다. 형질감염 24식나후에 세포의 회수 및 루시페라제 검정을 상기에서와 같이 수행한다.

NIH3T3 세포로 수행된 실험은 제53도에 나타내었다. A) 및 B)에 따르면 복합체의 제조는 BNL CL. 2 세포의 형질감염에서와 동일하다.

세포 배양실험에서 P50 단량체 및 멜리틴에서는 낮은 활성을 나타낸 반면, 펩티드 P50 dim 및 EALA-P50에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, EALA 및 GLF는 중간 활성을 나타냈다.

[실시예 38 : 올리고리신 C-말단 신장부(extension)]

을 갖는 펩티드를 상기 실시예에 기재된 방법에 따라 합성하여 정제한다. 이 펩티드는 펩티드를 추가의 10 리신 잔기로 신장시킴으로써 산성 pH에서 막 파괴 특이성을 갖는 것으로 알려져 있는 스타필로코쿠스 아우레우스(SEQ ID NO:3)

의 δ-톡신로 부터 유도한다.

DNA 복합체는 우선 170㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 170㎕의 HBS 중의 4㎍의 TfpL290과 혼합한 다음 실온에서 30분간후에 170㎕의 HBS 중의 약 3㎍의 펩티드와 혼합함으로써 제조한다. 실온에서 30분간 추가로 항온배양한 후에, 복합체를 1.5㎕ DMEM+2%FCS와 혼합하여 450,000 BNL CL. 2간 세포에 가한다. 2시간후에 2㎕ DMEM+2%FCS를 가한다. 형질감염 24시간후에 세포의 회수 및 루시페라제 측정을 상기 실시예에서와 같이 수행한다. 총 추출물에 상응하는 루시페라제 활성은 481,000 광단위이었다.

[실시예 39: 멜리틴 펩티드 존재하에서 C-말단 올리고-리신-꼬리에 의한 간 세포의 형질감염]

(산성 돌연변이체, mel 2로 표시함) 서열(N 내지 C 말단)의 펩티드를 실시예 38에 기재된 방법에 따라 합성한다.

DNA 복합체는 우선 170㎕의 HBS 중의 6㎍의 pCMVL-DNA를 170㎕의 HBS 중의 4㎍의 TfpL290과 혼합한 다음 실온에서 30분간후에 170㎕의 HBS 중의 약 3㎍의 펩티드 mel1 또는 170㎕의 HBS 중의 약 5㎍의 펩티드 mel2와 혼합함으로써 제조한다. 실온에서 30분간 추가로 항온배양한 후에, 복합체를 1.5㎕ DMEM+2%FCS와 혼합하여 450,000 BNL CL. 2 세포에 가하고 실시예 38에 기재된 바와 같이 배양한다. 형질감염 24시간후에 세포의회수 및 루시페라제 측정을 상기에서와 같이 수행한다. 총 추출물에 상응하는 루시페라제 활성은 9200 광단위(mel1의 경우) 및 9400 광단위(mel2의 경우).

[실시예 40: HeLa 세포에서 알파 인터페론의 발현]

HeLa 세포(6㎝ 디쉬당 5×10⁵세포)를 CMV 인헨서/포로모터 서열 조절하에 있는 인체 인터페론 알파2c를 코딩하는 플라스미드 pAD-CMV1-IFN(이 플라스미드는 DE40 21 917 A에 기재되어 있다. pADCMV1-IFN은 HindIII-XbaI IFN-α2c 삽입체를 pADCMV1에 재클로닝시킴으로써 수득된다.) 4㎍의 TpfL 만을 함유하는 샘플 6-10 및 첫 번째 30분간 항온배양후의 160㎕의 HBS 중의 P16pL(20㎍) 분획을 6 및 7 샘플 모두에 가하고 pLys 290(20㎍) 분획을 샘플 8, 9 및 10에 가한다. 추가의 30분 항온배양후, 유리 P16의 10㎕(샘플 8) 또는 50㎕(샘플 9 및 10)를 함유하는 160㎕의 HBS 분획을 가한다(P16 및 P16pL의 합성은 실시예 13 참조). 추가로 30분 항온배양후, 샘플을 다음의 추가의 화합물 존재하에서 2㎕의 DMEM/2%FCS 중의 HeLa 세포에 가한다. 샘플 2, 7 및 10은 100μM의 클로로퀸을 함유하며, 샘플 3 및 4는 5 내지 15㎕의 아데노바이러스 d1312(1×10¹²입자/㎕)를 함유하며, 샘플 5는 15㎕의 소랄렌-불활성화된, 동일한 바이러스를 함유한. (아데노바이러스의 내인성 인터페론 생성의 자극에 대한 대조군으로서, 샘플 11, 12 및 13을 샘플 3, 4 및 5에 동일한 바이러스 분획으로 처리한다). 형질감염 48시간 후에 배지를 재거하고 신선한 DMEM+10%FCS 2㎕로 치환시킨다. 이 배지는 형질감염후 72시간후에 회수하고 인터페론 알파에 대한 ELISA 분석을 공지의 방법(DE 40 21 917)으로 수행한다. 인터페론 알파의 수준(ng/㎕)은 제54도에 기재하였다.

TpfL은 루시페라제 또는 β-갈락토시다제 레포터 유전자를 사용한 상기의 연구와 일치하게 이들 세포로의 IFN 유전자 전달이 낮게 나타났다. 클로로퀸 존재는 검출가능한 표시(약 7ng/㎕, 샘플 2)를 나타내나, 아데노바이러스 d1312를 용량 의존적인 양상으로 DNA 전달을 촉진시킨다(샘플 3 및 4). 이들 세포를 IFN DNA 존재하에서 상당량의 바이러스로 처리하는 경우에는 인터페론 표시가 검출되지 않는다(샘플 11 및 12). 포접체로서(샘플 6, 7) 또는 TpfL/DNA 복합체의 표면에 이온적으로 결합된 펩티드(샘플 8, 9 도는 10, 펩티드 결합에 대해서는 실시예 37 참조)로서 합성 인플루엔자-유도 엔도솜분해 펩티드 P16(실시예 13 참조)로의 형질감염은 검출 가능한 인터페론 생성 수준을 나타내며, 이것은 클로로퀸 존재하에서 펩티드 포접체와 함께 증가한다(샘플 7).

[표 1a]

형질감영 방법

[표 1b]

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

[표 3]

[서열 리스트]

(ⅱ) 발명의 명칭 : 고등 진핵 세포내로 복합체를 도입하기위한 조성물

(ⅲ) 서열의 수 : 13

(ⅳ) 컴퓨터 가독 형태 :

(A) 배지 유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 겸용

(C) 오퍼레이팅 시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 패턴트인 릴리스(PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)

(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보 :

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 23 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디드니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 : 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:1:

(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 23 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:2:

(2) SEQ ID NO:3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 26 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:3:

(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 36 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:4:

(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 34 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:5:

(2) SEQ ID NO:6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 35 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:6:

(2) SEQ ID NO:7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 35 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:7:

(2) SEQ ID NO:8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 34 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:8:

(2) SEQ ID NO:9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 34 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:9:

(2) SEQ ID NO:10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 34 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:10:

(2) SEQ ID NO:11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 23 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:11:

(2) SEQ ID NO:12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 36 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:12:

(2) SEQ ID NO:13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성 :

(A) 길이 : 36 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 스트랜디스니스(Strandedness) : 단일

(D) 토폴로지 ; 양쪽

(ⅱ) 분자 유형 : 펩티드

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:13:

Claims (86)

1. 그 자체로 또는 헥산 복합체의 성분으로서 형질감염시키고자 하는 세포내로 내화될 수 있고, 복합체가 세포내로 유입된 후에 위치하게 되는 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시킬 수 있는 엔도솜분해 물질을 함유함을 특징으로 하여, 고등진핵 세포를 헥산 및 임의로 상기 세포에 대한 내화 인자와 커플링된 핵산 친화성 물질의 복합체로 형질감염시키기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 그 자체가 상기 세포에 대한 내화 인자인 바이러스 또는 바이러스 성분임을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 헥산 결합 도메인을 갖거나, 핵산 친화성 물질에 결합되어 있고 임의로 세포에 대한 내화 인자를 추가로 함유하는 포접체/핵산 복합체의 성분으로서 상기 세포내로 내화될 수 있는 능력을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 핵산 친화성 물질에 공유적으로 결합되어 있음을 특징으로 하는 조성물.
5. 제3항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 핵산 친화성 물질에 비공유적으로 결합되어 있음을 특징으로 하는 조성물.
6. 제5항에 있어서, 결합이 바이오틴-스트렙타비딘 가교를 통하여 이루어짐을 특징으로 하는 조성물.
7. 제5항에 있어서, 결합이 이온적으로 이루어짐을 특징으로 하는 조성물.
8. 제3항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 핵산 결합 도메인을 통해 헥산 친화성 물질에 직접 결합함을 특징으로 하는 조성물.
9. 제3항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 바이러스 또는 바이러스 성분임을 특징으로 하는 조성물.
10. 제2 또는 제9항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 아데노바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
11. 제10항에 있어서, 아데노바이러스가 돌연변이체임을 특징으로 하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 아데노바이러스가 복제-무능력 돌연변이체임을 특징으로 하는 조성물.
13. 제12항에 있어서, 아데노바이러스가 E1A 부위에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
14. 제10항에 있어서, 아데노바이러스가 불활성화된 것임을 특징으로 하는 조성물.
15. 제9항에 있어서, 바이러스 성분이 하나 또는 그 이상의 아데노바이러스 단백질임을 특징으로 하는 조성물.
16. 제2 또는 제9항에 있어서, 바이러스가 피코나(picorna) 바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
17. 제16항에 있어서, 피코나 바이러스가 임의로 불활성화된 리노바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
18. 제3항에 있어서, 엔도솜분해 물질은 그 자체가 세포에 대한 내화 인자가 아니며, 핵산 복합체가 추가로 헥산 친화성 물질에 결합하는 상기 세포에 대한 내화 인자를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
19. 제18항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 인체 세포에 대한 내화 인자가 아닌 바이러스 또는 바이러스 성분임을 특징으로 하는 조성물.
20. 제19항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 인가 이외의 다른 종에 대하여 감염성인 바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
21. 제20항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
22. 제21항에 있어서, 아데노바이러스가 조류 아데노바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
23. 제22항에 있어서, 아데노바이러스가 닭 태자 치사성 오르판(Chick Embryo Lethal Orphan) 바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
24. 제18항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 임의로 변형된 엔도솜분해 바이러스 팹티드 임을 특징으로 하는 조성물.
25. 제24항에 있어서, 엔도솜분해 펩티드가 인플루엔자-헤마글루티닌 HA2 펩티드임을 특징으로 하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 펩티드가 Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
27. 제25항에 있어서, 펩티드가 Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
28. 제18항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 비-바이러스성이며, 임의로 변형된 천연 또는 합성 펩티드임을 특징으로 하는 조성물.
29. 제28항에 있어서, 펩티드가 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
30. 제28항에 있어서, 펩티드가 제29항에서 정의된 펩티드의 동종- 또는 이종이량체 임을 특징으로 하는 조성물.
31. 제30항에 있어서, 펩티드가 동종이량체임을 특징으로 하는 조성물.
32. 제30항에 있어서, 펩티드가 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys서열을 함유하는 이종이량체임을 특징으로 하는 조성물.
33. 제28항에 있어서, 펩티드가 Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys 서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
34. 제28항에 있어서, 펩티드가 Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys -서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
35. 제24 또는 28항에 있어서, 펩티드가 핵산 결합 도메인을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
36. 제35항에 있어서, 펩티드가 올리고리신 연장부(extension)를 가짐을 특징으로 하는 조성물.
37. 제3 또는 18항에 있어서, 내화 인자가 트랜스페린임을 특징으로 하는 조성물.
38. 제3 또는 18항에 있어서, 내화 인자가 T-세포에 대한 리간드임을 특징으로 하는 조성물.
39. 제3 또는 18항에 있어서, 내화 인자가 B-세포에 대한 리간드임을 특징으로 하는 조성물.
40. 제3 또는 18항에 있어서, 내화 인자가 간세포에 대한 리간드임을 특징으로 하는 조성물.
41. 세포내에서 발현시키고자 하는 하나 또는 그 이상의 핵산 및 원래 핵산 결합 도메인을 갖거나 핵산 친화성 물질에 결합되어 있는 엔도솜분해 물질을 함유하며, 이 복합체가 임의로 핵산 친화성 물질에 결합하는 추가의 내화 인자를 함유함을 특징으로 하는, 제3항에 따르는 조성물의 구성원으로서의 복합체.
42. 제41항에 있어서, 치료학적 활성 핵산을 함유함을 특징으로 하는 조성물.
43. 제42항에 있어서, 핵산이 유전자 요법에서 활성인 하나 또는 그 이상의 DNA 분자를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
44. 제43항에 있어서, DNA 분자가 사이토킨을 코드화함을 특징으로 하는 조성물.
45. 제42항에 있어서, 핵산이 세포 기능을 특이적으로 억제하는 RNA 분자로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 함유함을 특징으로 하는 복합체.
46. 제41항에 있어서, 핵산 친화성 물질이 유기 다중양이온임을특징으로 하는 복합체.
47. 제46항에 있어서, 다중양이온이 폴리리신임을 특징으로 하는 복합체.
48. 제41항에 있어서, 엔도솜분해 물질 및 내화 인자가 모두 동일한 핵산 친화성 물질에 결합함을 특징으로 하는 복합체.
49. 제48항에 있어서, 엔도솜분해 물질 및 내화 인자가 폴리리신에 결합함을 특징으로 하는 복합체.
50. 제49항에 있어서, 추가로 비공유적으로 결합된 폴리리신을 함유함을 특징으로 하는 복합체.
51. 엔도솜분해 물질 및 헥산 친화성 물질을 함유함을 특징으로 하는 포접체.
52. 제51항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 핵산 친화성 물질에 비공유적으로 결합되어 있음을 특징으로 하는 포접체.
53. 제52항에 있어서, 결합이 바이오틴-스트렙타비딘 가교를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 포접체.
54. 제51항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 바이러스 또한 바이러스 성분임을 특징으로 하는 포접체.
55. 제54항에 있어서, 바이러스가 불활성화된 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 포접체.
56. 제54항에 있어서, 바이러스가 조류 아데노바이러스임을 특징으로 하는 포접체.
57. 제56항에 있어서, 아데노바이러스가 닭 태자 치사성 오르판 바이러스임을 특징으로 하는 포접체.
58. 제51항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 임의로 변형된 엔도솜분해 바이러스 펩티드임을 특징으로 하는 포접체.
59. 제58항에 있어서, 엔도솜분해 펩티드가 인플루엔자-헤마글루티닌 HA2 펩티드임을 특징으로 하는 포접체.
60. 제59항에 있어서, 펩티드가 Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys 서열을 가짐을 특징으로 하는 포접체.
61. 제59항에 있어서, 펩티드가 Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys서열을 가짐을 특징으로 하는 포접체.
62. 제51항에 있어서, 엔도솜분해 물질이 비-바이러스성이며, 임의로 변형된 천연 또는 합성 펩티드임을 특징으로 하는 포접체.
63. 제62항에 있어서, 펩티드가 핵산 결합 도메인을 가짐을 특징으로 하는 포접체.
64. 엔도솜분해성 도메인 및 핵산 결합 도메인을 가지는 인공 펩티드임을 특징으로 하는, 제35항에 따르는 조성물의 성분으로서 적합한 엔도솜분해성 펩티드.
65. 제64항에 있어서, 핵산 결합 도메인이 올리고리신 연장부임을 특징으로 하는 펩티드.
66. 바이러스 또는 (폴리)펩티드성 엔도솜분해 물질 및 폴리아민을 트랜스글루타미나제 존재하에서 효소적으로 커플링시킴을 특징으로 하여 제51항에 따르는 포접체를 제조하는 방법.
67. 바이러스 또는 (폴리)펩티드성 엔도솜분해 물질 및 폴리아민을 화학적으로 커플링시킴을 특징으로 하여 제51항에 따르는 포접체를 제조하는 방법.
68. 바이러스 또는 바이러스 성분을 바이오틴으로 변형시키고 스트렙타비딘-커플링 폴리아민에 결합시킴을 특징으로 하여 제52항에 따르는 포접체를 제조하는 방법.
69. 세포를 제1항에 따르는 조성물로 처리함을 특징으로 하여 인 비트로(in vitro) 또는 엑스 비보(ex vivo)에서 핵산을 고등 진핵 세포에 도입하는 방법.
70. 제69항에 있어서, 세포가 인체 세포임을 특징으로 하는 방법.
71. 제70항에 있어서, 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는 방법.
72. 제70항에 있어서, 세포가 근원 세포임을 특징으로 하는 방법.
73. 제70항에 있어서, 세포가 섬유아세포임을 특징으로 하는 방법.
74. 제70항에 있어서, 세포가 간 세포임을 특징으로 하는 방법.
75. 제70항에 있어서, 세포가 상피 세포임을 특징으로 하는 방법.
76. 제75항에 있어서, 세포가 기도 세포임을 특징으로 하는 방법.
77. 제69항 내지 76항중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 핵산이 유전자 요법에서 활성이 있음을 특징으로 하는 방법.
78. 제71항에 있어서, 종양 세포를 엑스 비보에서 조성물로 처리하고 상기 DNA 가 하나 또는 그 이상의 면역 조절 물질, 바람직하게는 사이토킨을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
79. 핵산이 목적 단백질을 코드화하는 DNA 서열을 함유하는 제1항에 따르는 조성물로 세포를 처리하고, 세포를 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양하여 단백질을 회수함을 특징으로 하여, 고등 진핵 세포에서 이종 단백질을 생성시키는 방법.
80. 치료학적으로 활성인 핵산을 함유하는 제1항에 따르는 조성물 및 약제학으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제.
81. 2개 또는 그 이상의 용기를 포함하는 캐리어 단위를 함유하며, 첫번째 용기는 임의로 고등 진핵 세포에 대한 내화 인자에 커플링된 핵산 친화성 물질을 함유하고, 두번째 용기는 그 자체가 고등 진핵 세포내로 침투되어 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시킬 수 있는 물질을 함유하는 형질감염 키트(kit).
82. 2개 또는 그 이상이 용기를 포함하는 캐리어 단위를 함유하며, 첫번째 용기는 임의로 고등 진핵 세포에 대한 내화 인자에 커플링된 핵산 친화성 물질을 함유하고, 두번째 용기는 핵산 복합체의 성분으로서 고등 진핵 세포내로 침투되어 엔도솜의 성분을 세포질내로 방출시킬 수 있는 물질에 커플링된 핵산 친화성 물질을 함유하는 형질감염 키트.
83. 제82항에 있어서, 첫번째 용기에 트랜스클루타미나제-커플링된 아데노바이러스-폴리리신 포접체를 함유함을 특징으로 하는 형질감염 키트.
84. 2개 또는 그 이상의 용기를 포함하는 캐리어 단위를 함유하며, 여기에서 첫번째 용기는 바이오틴-변형 엔도솜분해 물질을 함유하고, 두번째 용기는 스트렙타비딘-변형된 핵산 친화성 물질을 함유하는 형질감염 키트.
85. 제84항에 있어서, 첫번째 용기가 바이오티닐화 아데노바이러스를 함유하고 두번째 용기가 스트렙타비딘-폴리리신을 함유함을 특징으로 하는 형질감염 키트.
86. 인간 세포를 제외한 고등 진행 세포를 제1항에 따르는 조성물로 처리함을 특징으로 하여 핵산을 인간 세포를 제외한 고등 진핵 세포에 도입시키는 방법.