PL180304B1 - Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontówkompleksem kwasu nukleinowego PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontówkompleksem kwasu nukleinowego PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL180304B1
PL180304B1 PL92303106A PL30310692A PL180304B1 PL 180304 B1 PL180304 B1 PL 180304B1 PL 92303106 A PL92303106 A PL 92303106A PL 30310692 A PL30310692 A PL 30310692A PL 180304 B1 PL180304 B1 PL 180304B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
virus
ala
nucleic acid
dna
Prior art date
Application number
PL92303106A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Boehringer Ingelheim International Gmbh
The University Of North Carolina
Univ North Carolina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int, Boehringer Ingelheim International Gmbh, The University Of North Carolina, Univ North Carolina filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of PL180304B1 publication Critical patent/PL180304B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontów komple- ksem kwasu nukleinowego i substancji majacej powinowactwo do kwasu nukleinowego, w y- branej sposród homologicznych lub heterologicznych peptydowych lub niepeptydowych polikationów i ewentualnie skoniugowanej z czynnikiem internalizujacym w omawianych komórkach, znamienna tym, ze zawiera czynnik endosomolityczny, który sam ma zdolnosc internalizacji w danych komórkach i jest wybrany sposród wirusów ewentualnie inaktywowa- nych lub mutantów niezdolnych do replikacji lub skladników wirusa, lub który jako taki nie jest czynnikiem internalizujacym w danych komórkach i jest zwiazany z substancja m ajaca powinowactwo do kwasu nukleinowego i moze byc internalizowany do danych komórek jako skladnik kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i który jest wybrany sposród wirusów ew en- tualnie inaktywowanych lub mutantów niezdolnych do replikacji i skladników wirusa, przy czym wymieniony kompleks zawiera ewentualnie czynnik internalizujacy w komórkach, któ- ry jest zwiazany z substancja w ykazujaca powinowactwo do kwasu nukleinowego w komple- ksie i jest wybrany z grupy obejmujacej transferyne, ligand receptora asialoglikoproteiny, ligand limfocytów T, ligand hepatocytów; wirusy sa wybrane sposród adenowirusa, wirusa Moloney'a, pikornawirusa, wirusa pryszczycy, wirusa goraczki Semliki Forest, wirusa grypy i wirusów defektywnych, natomiast skladnik wirusa jest wybrany sposród jednego lub wiecej peptydów grypy -hemaglutyniny HA2; oraz zawiera takze fizjologicznie dopuszczalny nos- nik wybrany sposród soli i/lub bufor. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyższych eukariontów kompleksem kwasu nukleinowego.
Istnieje zapotrzebowanie na wydajny system wprowadzania kwasu nukleinowego do żyjących komórek. Geny przenosi się do komórek w celu uzyskania syntezy żądanych białek.
Kwasów nukleinowych używa się także do specyficznego hamowania funkcji komórki, na przykład, wykazano, że antysensowne RNA lub DNA może powodować selektywne hamowanie specyficznych sekwencji genowych. Sposób ich działania umożliwia użycie ich do blokowania ekspresji pewnych genów. Wcześniej wykazano, że krótkie antysensowne oligonukleotydy mogą być wprowadzone do komórki i tam wykazywać działanie hamujące (Zamecnik i wsp., 1986), nawet, jeśli ich stężenie wewnątrzkomórkowe jest małe, co jest spowodowane, inter alia, przez ich ograniczony wychwyt przez błonę komórkową z powodu silnego ujemnego ładunku kwasów nukleinowych.
Innym podejściem do selektywnego hamowania genów jest użycie rybozymów. Także tu istnieje potrzeba uzyskania największego możliwego stężenia aktywnych rybozymów w komórce i przenoszenie do komórki jest jednym z czynników ograniczających.
Stale istnieje zapotrzebowanie na sposób umożliwiający ekspresję DNA w komórkach. Proponowano liczne rozwiązania poprawienia przenoszenia kwasów nukleinowych do żywych komórek.
Znane sąróżne sposoby transformacji genetycznej komórek ssaków in vitro. Obejmująone wprowadzenie DNA za pomocą liposomów, metodą elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórkowej, wytrącania DNA DEAE-dekstranem lub fosforanem wapnia.
Ostatnio opracowuje się zrekombinowane wektory wirusowe w celu przenoszenia genów przez wykorzystanie wydajnych mechanizmów wnikania do komórki wirusów wyjściowych. Strategii tej użyto do wytworzenia zrekombinowanych wektorów retro wirusowych i adenowirusowych w celu uzyskania wysoce wydajnego systemu przenoszenia genów (Berkner, 1988). Pomimo skuteczności, stosowanie tych wektorów jest ograniczone wielkością i konstrukcją DNA, który ma być przenoszony.
W celu obejścia tych niedogodności, opracowano alternatywną strategię przenoszenia genów, opartą na mechanizmie, którego komórka używa do przenoszenie makrocząsteczek Jednym z przykładów jest przenoszenie genów do komórek wyjątkowo wydajną drogą endocytozy zależnej od receptorów (Wu i Wu, 1987, Wagner i wsp , 1990 i EP-A1 0388758).
W tym podejściu wykorzystuje się dwufunkcjonalne koniugaty cząsteczkowe, które mają domenę wiążącąDNA i domenę specyficzną dla receptora powierzchniowego komórki
180 304 (Wui Wu, 1987, Wagner i wsp., 1990). Jeżeli domena rozpoznawana jest rozpoznawana przez receptor powierzchniowy komórki koniugat jest intemalizowany drogąendocytozy zależnej od receptorów, dzięki temu przenoszone jest także DNA związane z koniugatem. Używając tego sposobu można osiągnąć wydajność przenoszenia genu przynajmniej tak dobrąjak osiągana tradycyjnymi sposobami (Zenke i wsp., 1990). Wykazano, że DNA przenoszone do komórki za pomocą tych systemów ulega ekspresji i że w przypadku zastosowania kwasu nukleinowego działającego hamująco, system przenoszący nie zmniejsza działania hamującego.
Zgłoszenie PCT WO 91/17773 odnosi się do układu do przenoszenia kwasów nukleinowych ze specyficzną aktywnością wobec limfocytów T. Układ ten wykorzystuje białka powierzchniowe linii limfocytów T, na przykład, CD4, receptor wykorzystywany przez wirus HIV. Wytwarza się kompleks kwasu nukleinowego, który ma być wprowadzony, z koniugatem białko-polikation, którego komponent białkowy, to znaczy domena rozpoznawana, jest białkiem zdolnym do wiązania się z białkiem powierzchniowym limfocytów T, np. CD4, i doprowadza się do kontaktu komórek, które wytwarzają to białko powierzchniowe i wytworzonego kompleksu białko-polikation/kwas nukleinowy. Wykazano, że DNA przenoszone za pomocą tego sposobu do komórki ulega w niej ekspresji.
Jedna wspólną cechą obu wynalazków jest wykorzystanie specyficznych funkcji komórki w celu umożliwienia lub ułatwienia przenoszenia kwasu nukleinowego do komórki. W obu przypadkach, wychwyt zachodzi przy udziale domen rozpoznawanych, które w obecnym wynalazku są nazwane „czynnikiem intemalizującym”. Termin ten oznacza ligand, który jest swoisty komórkowe w szerszym lub węższym znaczeniu, wiąże się z powierzchnią komórki i intemalizuje, prawdopodobnie przy współpracy innych czynników (na przykład, powierzchniowych białek komórkowych). (W przypadku dwóch wymienionych powyżej wynalazków czynnik intemalizujący jest transferyną lub białkiem, które wiąże się do antygenu powierzchniowego limfocytów T, na przykład, przeciwciałem przeciw-CD4). Czynnik intemalizujący sprzężony jest z substancją o naturze polikationowej, która dzięki swojemu powinowactwu do kwasu nukleinowego tworzy silne wiązanie pomiędzy czynnikiem intemalizującym i kwasem nukleinowym. (Substancje tego typu będą tu później nazywane „substancjami mającymi powinowactwo do kwasu nukleinowego” lub w odniesieniu do DNA „domeną wiążącą DNA”. Jeżeli tego typu substancja tworzy wiązanie pomiędzy czynnikiem intemalizującym i kwasem nukleinowym będzie tu później nazywana „czynnikiem wiążącym”).
W tych dwóch wynalazkach osiągnięto optimum wychwytu kwasu nukleinowego do komórki, kiedy stosunek koniugatu do kwasu nukleinowego był taki, że kompleksy czynnik intemalizujący-polikation/kwas nukleinowy były prawie pozbawione ładunku elektrycznego. Wychodząc z tej obserwacji ulepszono sposób, który do wprowadzania kwasu nukleinowego do komórek wyższych eukariontów wykorzystuje kompleksy czynnik internalizujący-czynnik wiążący/kwas nukleinowy.
Sposób zwiększenia wydajności systemów, w których wychwyt kwasów nukleinowych prowadzi się za pomocą czynnika intemalizującego został opisany przez Wagnera i wsp., 1991 a. Sposobem tym, ilość kwasu nukleinowego pobranego przez komórkę nie zmniejsza się, jeżeli część koniugatu transferyna-polikation zastąpi się niekowalencyjnie związanym („wolnym”) polikationem, a w pewnych przypadkach może to nawet zwiększyć znacznie wychwyt DNA. Badania stanu cząsteczkowego kompleksów transferyna-polikation-DNA plazmidowy wytworzonych przy optymalnym stosunku DNA/koniugat wykazały, że plazmidowy DNA w obecności koniugatów kondensuje w toroidalne struktury (przypominające pączki) o średnicy około 80 do 100 nm).
Doświadczenia przeprowadzone z białkami wiążącymi się z limfocytami T, jako czynnikiem intemalizującym dały podobne wyniki
Dodanie „wolnej” substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego także powoduje zwiększenie wydajności systemu wprowadzającego, nawet jeżeli używa się innych czynników wiążących.
180 304
Kompleksy opisane przez Wagnera i wsp., 1991a, które zostały wprowadzone do komórek wyższych eukariontów drogą endocytozy przy wykorzystaniu czynnika intemalizującego, zawierały kompleksy kwasu nukleinowego z koniugatem czynnika intemalizującego i czynnika wiążącego. Ponadto, kompleksy te zawierały jedną lub więcej substancji mających powinowactwo do kwasu nukleinowego, prawdopodobnie identycznych z czynnikiem wiążącym, w formie związanej niekonwalencyjnie, tak że osiągnięta za pomocą koniugatu internalizacja i/lub ekspresja kwasu nukleinowego była zwiększona, co następuje dzięki pierwotnej kondensacji, ale także może wynikać z innych mechanizmów.
Nawet, jeżeli stopień ekspresji włączonego kwasu nukleinowego można w ten sposób zwiększyć, ciągle jest to ograniczone. Praktyczne wykorzystanie tego sposobu w podanym kontekście nie jest jedynie określone, przez obecność odpowiednich dla systemu komórkowych receptorów powierzchniowych, ograniczenia związane z użyciem tego systemu wynikają prawdopodobnie z faktu, że kompleksy koniugat-DNA intemalizujące w endosomach wnikają do lizosomów, gdzie są rozkładane enzymatycznie. W celu zwiększenia proporcji kwasu nukleinowego osiągającego jądro komórkowe i ulegającego tam ekspresji przedsięwzięto pewne próby; w doświadczeniach poprzedzających ten wynalazek, prowadzono transfekcję komórek w obecności związków hamujących aktywność enzymatyczną w lizosomach tak zwanych substancji lizosomatropowych. Dzięki użyciu tej strategii, osiągnięto zwiększoną ekspresję przeniesionego DNA, jednakże osiągnięte wyniki były bardzo zmienne i zależały od użytej substancji; wybrane substancje lizosomatropowe powodowały zwiększenie przenoszenia genów, a inne w rzeczywistości je hamowały. Tak więc, na przykład, stwierdzono, że wydajne przeniesienie DNA zależy od obecności słabej zasady chlorochmy (Zenke i wsp., 1990, Cotten i wsp., 1990). Takie działanie osiągnięte za pomocąchlorochiny może nie wynikać, lub nie wynika wyłącznie z faktu, że chlorochina zwiększa pH w lizosomach. W wielu różnych doświadczeniach stwierdzono, że inne substancje, które podobnie jak chlorochina majązdolność zmieniania pH, takie jak, monensyna, chlorek amonowy lub metyloamina, nie zastępują chlorochiny i w niektórych eksperymentach substancje te wykazujądziałanie hamujące. Stwierdzono także, że różne komórki docelowe wykazują różną odpowiedź na te same substancje, mające działanie lizosomatropowe.
Ponieważ przenoszenie genów drogą fizjologiczną przy użyciu kompleksów kwasu nukleinowego, reprezentowaną przez endocytozę zależną od receptorów ma wiele zalet (nietoksyczny mechanizm przechodzenia przez błonę komórkową, możliwość podawania w sposób powtarzalny lub ciągły aktywnych biologicznie kwasów nukleinowych, takich jak, kwas nukleinowy hamujący swoiście geny lub funkcje komórki, możliwość dostarczenie swoistego komórkowe, możliwość wytworzenia koniugatu w dużej ilości) ciągle istnieje potrzeba uczynienia systemu bardziej wydajnym.
Celem wynalazku jest poprawienie przenoszenia kwasu nukleinowego do komórek wyższych eukariontów. (Słowo „przenoszenie” oznacza w tym wynalazku, oprócz wprowadzenia kompleksów kwasu nukleinowego do komórki przez błonę komórkową transport kompleksu lub kwasu nukleinowego z niego uwolnionego wewnątrz komórki, aż dotrze on do miejsca odpowiedniego dla ekspresji). Komórki wyższych eukariontów są dobrze znane i nie obejmują drożdży. Patrz Mołecular Biology of the Gene, James D. Watson i wsp., Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., str. 676-677 (1987).
Wiele wirusów wnika do komórek eukariotycznego gospodarza dzięki mechanizmom, które ogólnie odpowiadają mechanizmowi endocytozy zależnej od receptorów. Infekcje wirusowe oparte na tym mechanizmie ogólnie zaczynająsię od związania się cząsteczki wirusa z receptorem błony komórki. Następnie wirus ulega internalizacji do wnętrza komórki Proces internalizacji zachodzi normalną drogą odpowiadającą wnikaniu do komórek ligandów fizjologicznych lub makrocząsteczek: najpierw, receptory na powierzchni komórki łączą się w grupy, a błona odwraca się i tworzy pęcherzyk otoczony przez powłoczkę klatrynową. Następnie pęcherzyk uwalnia się z powłoczki i dzięki pompie protonowej zlokalizowanej w błonie, wewnątrz niego zachodzi zakwaszenie.
180 304
Powoduje to uwolnienie wirusa z endosomu. W zależności od tego, czy wirus ma otoczkę lipidową czy nie, należy rozpatrywać dwa typy uwalniania wirusów z endosomu: w przypadku tak zwanych „nagich” wirusów (na przykład, adenowirusy, wirusy polio, rhinowirusy) uważa się, że niskie pH powoduje zmiany konfiguracji białek wirusa. Powoduje to wyeksponowanie domen hydrofobowych, które przy fizjologicznym pH nie są dostępne. Domeny te wykazują zdolność oddziaływania z błonąendosomów i powodująuwalnianie genomu wirusa z endosomu do cytoplazmy. Natomiast uważa się, że w przypadku wirusów z otoczką lipidową (na przykład, wirus pryszczycy, gorączki Semliki Forest, grypy) niskie pH powoduje zmiany struktury lub konfiguracji niektórych białek wirusa, ułatwiając fuzję błony wirusa z błoną endosomu. Wirusy, które wnikają w ten sposób do komórki mająpewne cząsteczkowe własności, które umożliwiają im przerwanie błony endosomu w celu wniknięcia do cytoplazmy.
Inne wirusy, na przykład, opłaszczone wirusy Sendai, HIV i niektóre szczepy wirusa białaczki Molone/a lub nieopłaszczone wirusy SV40 i polyoma nie potrzebują niskiego pH do wniknięcia do komórki; łączą się one z błoną komórkową bezpośrednio na powierzchni komórki (wirus Sendai, prawdopodobnie HIV) lub są zdolne do uruchomienia mechanizmów przerwania błony komórkowej lub przenikania przez nią. Uważa się, że wirusy niezależne od pH są także zdolne do wykorzystania drogi endocytozy (McClure i wsp., 1990).
Punktem wyjścia w rozwiązywaniu problemu ulepszenia sposobu wprowadzania kompleksów kwasu nukleinowego do komórek i zwiększenia w ten sposób ich ekspresji, postanowionego w niniejszym wynalazku, było wykorzystanie mechanizmu używanego przez pewne wirusy do wnikania do komórki eukariotycznej.
Podjęto próby wprowadzenia do komórki białek razem z wirusami (Otero and Carrasco, 1987). Stwierdzono, że wywołana przez wirusy przepuszczalność błony komórkowej wykorzystywana jest także do przenoszenia makrocząsteczek. Sposób wjaki to zachodzi wydaje się być mechanizmem wychwytu fazy ciekłej.
Przy użyciu czynnika wzrostu komórek nabłonkowych, EGF, sprzężonego z toksyną stwierdzono, że ten naturalny ligand, który jest pobierany do komórki na drodze endocytozy po związaniu z receptorem, umieszcza się w jednym endosomie razem z adenowirusem, który także jest pobierany do komórki na drodze endocytozy zależnej od receptorów i jest uwalniany z tego endosomu do cytozolu także razem z wirusem (FitzGerald i wsp., 1983).
Stwierdzono nieoczekiwanie, że pewne czynniki (na przykład, wirusy, składniki wirusa lub inne związki), wykazujące cechy charakterystyczne pewnych wirusów w odniesieniu do mechanizmów wnikania ich do komórki eukariotycznej, znacznie zwiększają wielkość ekspresji kwasu nukleinowego włączonego do komórki jako część kompleksu. Jest to szczególnie zdumiewające, ponieważ kompleksy kwasu nukleinowego pobrane przez komórkę sąbardzo duże.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyższych eukariontów kompleksem kwasu nukleinowego i substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego; wybranej spośród homologicznych lub heterologicznych peptydowych lub niepeptydowych polikationów lub naturalnych białek wiążących DNA lub ich analogów lub fragmentów i ewentualnie skoniugowanej z czynnikiem intemalizującym w omawianych komórkach. Kompozycja według wynalazku zawiera czynnik endosomohtyczny, który sam ma zdolność internalizacji we wskazanych komórkach i jest wybrany spośród wirusów ewentualnie inaktywowanych lub mutantów niezdolnych do replikacji lub składników wirusa lub który jako taki nie jest czynnikiem intemalizującym w danych komórkach i ma domenę wiążącą kwas nukleinowy lub jest związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i może być intemalizowany do danych komórek jako składnik kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i który jest wybrany spośród wirusów ewentualnie inaktywowanych lub mutantów niezdolnych do replikacji, składników wirusa lub niewirusowych, ewentualnie zmodyfikowanych naturalnych lub syntetycznych peptydów, przy czym wymieniony kompleks zawiera ewentualnie czynnik intemahzujący w komórkach, który jest związany z substancją wykazującą powinowactwo do kwasu nukleinowego w kompleksie i jest wybrany z grupy obejmującej transferynę, ligand receptora asialoglikoproteiny, lektynę, ligand limfocytów T, ligand limfocytów B,
180 304 ligand hepatocytów, Ig i anty-Ig; wirusy są wybrane spośród adenowirusa, wirusa Molone/a, pikomawirusa, wirusa pryszczycy, wirusa gorączki Semliki Forest, wirusa grypy i wirusów defekty wnych, natomiast składnik wirusa jest wybrany spośród jednego lub więcej białek adenowirusa, peptydów wirusowych, pustych kapsydów wirusowych i peptydów grypy - hemaglutyniny HA2, oraz zawiera także nośnik, wybrany spośród soli i/lub bufor.
„Czynnikiem endosomolitycznym” jest tu nazwany czynnik, który ma zdolność internalizacji w transfekowanych komórkach perse lub jako składnik kompleksu kwasu nukleinowego i po wniknięciu do cytoplazmy komórki ma zdolność do uwolnienia zawartości endosomu, w którym kompleks jest zlokalizowany.
Zdolność czynnika endosomolitycznego do wniknięcia do wnętrza komórki i uwolnienia do cytoplazmy zawartości endosomu, w którym jest on zlokalizowany po wniknięciu do komórki będzie tu nazywana „działaniem wychwytującym”. Takie działanie wychwytujące obejmuje zdolność czynnika do aktywnej internalizacji w danych komórkach, drogą endocytozy zależnej od receptorów, lub pasywnej, przez fazę ciekłą lub jako składnik kompleksu kwasu nukleinowego i zdolność do rozerwania endosomu, którą ogólnie nazywa się „aktywnością endosomolityczną” lub „endosomolizą”.
W jednym wykonaniu wynalazku czynnikiem endosomolitycznym jest wirus,- w innym składnik wirusa. Stosowany wirus lub składnik wirusa będą nazywane dalej „wolnym” wirusem (składnikiem).
Zbadano na komórkach HeLa, używając genu lucyferazy jako genu reporterowego, wpływ zwiększenia dawki wolnego adenowirusa na zdolność przenoszenia genów przez stałą ilość koniugatu transferyna-polihzyna. Przez dodanie wolnego adenowirusa uzyskano zwiększenie przenoszenia genów maksymalnie do 1 χ 104 cząsteczek wirusa na komórkę. Liczba ta odpowiada przybliżonej liczbie receptorów adenowirusa na komórkę HeLa. Oznacza to 2000-krotne zwiększenie ekspresji lucyferazy, odpowiadające wyższej dawce wirusa, w porównaniu do ekspresji osiągniętej wyłącznie z koniugatem transferyna-polilizyna. W innej serii eksperymentów zbadano efektywność ograniczonych ilości kompleksów koniugat-DNA w obecności stałej dawki wolnego adenowirusa. Stwierdzono, że w szerokim zakresie dawek DNA, wychwyt adenowirusa do komórki zwiększa przenoszenie genów zależne od transferyny-pohlizyny. Maksymalne natężenie ekspresji genu osiągnięte dzięki kompleksom koniugat-DNA odpowiadało natężeniu osiągniętemu ze 100-krotnie mniejszą ilością DNA, przy użyciu adenowirusa do zwiększenia wydajności transfekcji.
Wpływ infekcji adenowirusowej na przenoszenie genów zbadano zarówno dląnieskompleksowanego DNA, jak i dla DNA, które było skompleksowane z polilizyną lub koniugatem transferyna-polilizyna (Rys. 3A). Dzięki tej analizie, stwierdzono, że infekcja adenowirusowa nie zwiększa istotnie przenoszenia nagiego, nieskompleksowanego DNA podczas transfekcji. Natomiast, przenoszenie DNA skompleksowanego z polilizyną lub koniugatem transferynapolilizyna było zwiększone przez infekcję adenowirusową. Jednakże, działanie to było dużo większe w przypadku koniugatów transferyna-polilizyna. Część polikationowa cząsteczki koniugatu służy nie tylko do przyłączenia transferyny do DNA, ale powoduje także znaczne zmiany strukturalne w DNA (upakowanie w struktury toroidalne, Wagner i wsp., 199la) Doświadczenia te nie pozwoliły początkowo na rozróżnienie, czy obserwowane działanie wynika ze zwiększonego transportu w fazie ciekłej DNA skondensowanego z polikationem lub zwiększenia przez wirusa dostarczania związanego z receptorem kompleksu koniugat-DNA. W celu odróżnienia obu tych możliwości przeprowadzono doświadczenia sekwencyjnego wiązania (Rys. 3B). Wiązanie kompleksów transferyna-polilizyna-DNA lub polilizyna-DNA w niskiej temperaturze bez możliwości internalizacji pozwala na usunięcie nadmiaru kompleksu w fazie ciekłej przed infekcją adenowirusową (FitzGerald i wsp , 1983). Po podaniu w ten sposób, dostarczanie związanego z receptorem kompleksu transferyna-polilizyna-DNA było znacząco zwiększone po dodaniu cząsteczek wirusa, podczas gdy kompleks pohhzyna-DNA me był obecny. Tak więc, specyficznie zwiększono wnikanie DNA drogą endocytozy zależnej od receptorów.
180 304
Następnie przeprowadzono analizę specyficznego działania adenowirusa, powodującego zwiększenie przenoszenia genów zależnego od receptorów (Rys. 3C). Łagodna cieplna obróbka wirionów nie zmieniła ich zdolności do wiązania się z błonami komórek docelowych, ale wpływała na ich zdolność do rozrywania endosomów po internalizacji (Defer i wsp., 1990). Tak więc, można oddzielnie badać wiązanie wirusa i jego wnikanie. W czasie tej analizy, inaktywacja ciepłem całkowicie znosi zdolność wirusa do zwiększania przenoszenia genów drogą endocytozy zależnej od receptorów. Sugeruje to, że zdolność adenowirusów do rozrywania endosomów jest częścią mechanizmu wnikania wirusa do komórki, która specyficznie wpływa na zwiększenie dostarczania genów przez koniugaty transferyna-polilizyna. Stwierdzenie, że defektywny ze względu na zdolność do replikacji szczep wirusa zwiększa ekspresję genów, potwierdza przypuszczenie, że zjawisko to nie wynika z replikacji, ale z działania wychwytującego wirionów.
W celu wyjaśnienia możliwości, że zwiększenie ekspresji genów można przypisać transaktywacji włączonego przez wirusa genu, przeprowadzono doświadczenia z liniami komórkowymi które mają konstruktywną ekspresję genu lucyferazy RSV-LTR: adenowirus nie przejawiał żadnego działania w tej linii komórkowej podczas gdy w macierzystej linii, do której gen wprowadzono dzięki koniugatom transferyna-polilizyna, stwierdzono znaczący wzrost ekspresji genu. Pozwala to stwierdzić, że adenowirus wpływa na zdarzenia, które zachodzą przed transkrypcją i że jego działanie zwiększające przenoszenie genów zachodzi na poziomie przenoszenia genów, a nie na poziomie ekspresji genów (Rys. 5).
Przeprowadzono także badania poza zakresem tego wynalazku w celu stwierdzenia jakie działanie ma wolny adenowirus na przenoszenie genów dzięki koniugatom transferynapolilizyna w wybranych liniach komórkowych. Stwierdzono, że do umożliwienia przenoszenia genów dzięki koniugatom transferyna-polilizyna konieczna jest obecność w komórkach docelowych receptorów transferyny, ale w niektórych przypadkach niewystarczająca. Wydaje się, że niezmiernie ważnym czynnikiem ograniczającym osiągalny w ten sposób poziom przenoszenia genów są specyficzne-komórkowo czynniki odnoszące się do niszczenia kompleksów DNAkoniugat intemalizowanych w endosomach. W tym względzie, wybrane linie komórkowe przebadano pod kątem przenoszenia genów dzięki koniugatom transferyna-polilizyna i zwiększenia przenoszenia genów przez adenowirusy (Rys. 4). Linia komórek mukowiscydozy (CFT1) wykazywała umiarkowany poziom ekspresji genu lucyferazy po działaniu kompleksów transferynapolilizyna-DNA. Ten poziom ekspresji został znacząco zwiększony przez traktowanie adenowirusem dl312. W przeciwieństwie, komórki KB traktowane kompleksami transferynapolilizyna-DNA wykazywały poziom ekspresji genu lucyferazy niewiele ponad poziom wyjściowy, pomimo obecności receptorów transferyny. Jednakże, traktowanie adenowirusem d 1312 pozwoliło na łatwe wykrycie w tych komórkach aktywności lucyferazy. Traktowanie adenowirusem dl 312 komórek HeLa miało podobny efekt, chociaż w przypadku tych komórek dużo większy. Ponieważ komórki KB i HeLa mają podobną liczbę receptorów adenowirusa różnica zwiększenia przenoszenia genów może wynikać z liczby receptorów transferyny, charakterystycznej dla każdego typu komórek. Jednakże, w odróżnieniu od tych wyników, linie komórkowe WI-38 i MRC-5, które jak wiadomo bardzo słabo wspomagają infekcję wirusową (Precious i Russell, 1985), wykazały po traktowaniu dl312 bardzo nieznaczne zwiększenie przenoszenia genów osiągnięte wyłącznie dzięki kompleksom komugat-DNA. Traktowanie wolnym wirusem, na przykład, adenowirusem, wydaje się zwiększać przenoszenie genów osiągnięte dzięki kompleksom koniugat-DNA w tych przypadkach, w których przenoszenie genów możliwe jest drogą endocytozy zależnej od receptorów, tak jak w przypadku komórek CFT1, a także w niektórych przypadkach, w których przenoszenie genów tą drogą wydaje się być nieefektywne, tak jak w przypadku komórek HeLa i KB. Osiągnięty poziom zwiększenia znacznie różni się w zależności od użytej linii komórek docelowych, co sugeruje, że działanie to wynika zarówno z liczby receptorów wirusa, na przykład, leceptorów adenowirusa, w określonym typie komórek, a także z liczby receptorów transferyny.
180 304
W przypadku użycia wolnego wirusa, substancja mająca powinowactwo do kwasu nukleinowego, korzystnie polikation organiczny, jest korzystnie sprzężona z czynnikiem intemalizującym. Jednakże, stwierdzono, że w pewnych warunkach można, w obecności wolnego wirusa wprowadzić do komórek także DNA skompleksowany tylko z substancjąmająca powinowactwo do kwasu nukleinowego, to znaczy bez czynnika intemalizującego. Stwierdzono także, że kompleksy zawierające kwas nukleinowy i substancję mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego mogąbyć wprowadzone dzięki fazie ciekłej, jeżeli stężenie kompleksu jest odpowiednio wysokie.
Badania przeprowadzone w związku z niniejszym wynalazkiem i badania wcześniejsze wykazały, że ważnym elementem zdolności do wychwytu kompleksów kwasu nukleinowego jest ich zwartość, którą można przypisać skondesowaniu kwasu nukleinowego przez substancję mająca powinowactwo do kwasu nukleinowego. Jeżeli, substancja mająca powinowactwo do kwasu nukleinowego ma odpowiednią zdolność do wiązania się z powierzchnią komórkową w celu wniknięcia do komórki razem z wirusem, a także jest zdolna do wytworzenia prawie pozbawionego ładunku elektrycznego kompleksu i skondensowania kwasu nukleinowego w strukturę zwartą może nie być potrzeby zwiększania zdolności wniknięcia przez kowalencyjne wiązanie czynnika intemalizującego z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego w celu przeniesienia kompleksu do komórki droga endocytozy zależnej od receptorów. Wiele komórek ma stosunkowo wysokie powinowactwo do pewnych substancji mających powinowactwo do kwasu nukleinowego, tak więc koniugaty kwasu nukleinowego i czynnika wiążącego pobierane są do komórki bez pomocy czynnika intemalizującego. Jest to prawda, na przykład, dla hepatocytów, które jak stwierdzono pobierają kompleksy polilizyna-DNA.
Czynnik endosomolityczny w kompozycji według wynalazku może być wirusem, który jest związany z substancja mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i ma zdolność wnikania do danych komórek jako część kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i po wniknięciu do cytoplazmy komórki ma zdolność do uwolnienia zawartości endosomu, w którym kompleks jest zlokalizowany.
Czynnik endosomolityczny może też być składnikiem wirusa, który jest związany z substancja mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i ma zdolność wnikania do danych komórek jako część kompleksu koniugat/kwas nukleinowy, i po wniknięciu do cytoplazmy komórki ma zdolność do uwolnienia zawartości endosomu, w którym kompleks jest zlokalizowany.
Wirusy lub składniki wirusa związane z domeną wiążącą kwas nukleinowy bez względu na sposób wiązania, są tu i dalej określone jako „koniugat wirusowy”.
Koniugaty wirusowe zawierają wirus lub składniki wirusa, jako integralną część ich funkcjonalnego konstruktu i łączą zalety systemów wektorowych opartych na koniugatach czynników intemalizujących z zaletami wnoszonymi do systemu przez wirus.
Ponadto, koniugaty wirusowe mają taką zaletę, że pozwalają obejść podstawowe ograniczenie znanych bifunkcjonalnych systemów koniugatów i w ten sposób, w odróżnieniu od znanych koniugatów wykorzystywanych do przenoszenia genów drogą endocytozy zależnej od receptorów, mają specyficzny mechanizm umożliwiający im uwolnienie się z komórkowego systemu pęcherzykowego.
System wektorowy wykorzystujący koniugaty wirusowe stanowi fundamentalne koncepcyjne odejście od zrekombinowanych wektorów wirusowych, które polega na tym, że obcy DNA, który ma być przenoszony, jest niesiony na zewnątrz wirionu. Co za tym idzie, koniugaty wirusowe mogą przenosić do komórek bardzo duże konstrukty genetyczne bez ograniczeń co do sekwencji.
Przydatność wirusa do wykorzystania jako wolnego lub związanego wirusa lub części wirusa jako składnika wirusowego w kompozycji według wynalazku określona jest przez jego działanie wychwytujące, jak to zdefiniowano. Odpowiednie wirusy, z jednej strony, to wirusy mające zdolność do wnikania do komórki droga endocytozy zależnej od receptorów w czasie transfekowania komórek kompleksem kwasu nukleinowego i odprowadzania do ich uwolnienia
180 304
- a więc i do uwolnienia kwasu nukleinowego - do cytoplazmy z endosomu. Bez względu na teorię można ustalić, że mechanizm importujący kompleksy kwasu nukleinowego może być korzystny, o ile w czasie internalizacji umiejscawiają się one w tych samych endosomach co wirusy i razem z wirusami przedostają się z endosomów do cytoplazmy. Jeżeli, kompleksy kwasu nukleinowego zawierają wirus w postaci związanej, wykorzystują wtedy endosomohtyczna aktywność wirusa i przedostają się z endosomów do cytoplazmy. Może przy tym nastąpić fuzja między endosomami i lizosomami i dzięki temu unika się degradacji enzymatycznej, normalnie występującej w organellach.
Przykłady wirusów i komórek wyższych eukariontów do których mogą one penetrować zawarto w Fields, B. N. i Knipe, D. M. (1990). Podatność wymienionych linii komórkowych na transformację, za pomocą wirusa jako czynnika ułatwiającego wniknięcie koniugatu jako „wolnego wirusa” zależna jest od obecności i liczby receptorów wirusa na powierzchni komórek docelowych. Metody określenia liczby receptorów na powierzchni komórek docelowych, w odniesieniu do receptorów adenowirusa opisał Svensson, 1990 i Defer, 1990.
Szczególnie, wirusami odpowiednimi dla kompozycji według wynalazku i których działanie wychwytujące mające miejsce na początku infekcji zachodzi drogą zależnej od receptorów endocytozy sąz jednej strony wirusy bez otoczki lipidowej, takie jak, adenowirusy, wirusy polio, rhinowirusy a z drugiej strony przydatne są także wirusy otoczkowe, takie jak, wirus pryszczycy, gorączki Semliki Forest, grypy czy pH-zależne szczepy wirusów Moloneya. Szczególnie korzystne wirusy, które można stosować w kompozycji według wynalazku obejmują adenowirusy poddgrupy C, typ 5, wirus gorączki Semliki Forest, wirus pryszczycy, wirus polio, rhinowirusy i wirus białaczki Moloneya. Użycie wirusów RNA, które nie mają odwrotnej transkryptazy ma tę zaletę, że transfekcja w obecności takiego wirusa nie prowadzi do namnażania się wirusowego DNA w transfekowanych komórkach. Wykazano, ze rinowirus HRV2, przedstawiciel grupy pikomawirusów, zwiększa ekspresję genu reporterowego. Przydatność rhinowirusa wykazano zarówno dla formy wolnej jak i dla wirusa w formie koniugatu.
W zakresie obecnego wynalazku, termin wirusy - pod warunkiem, że są one pobierane do komórki i uwalniajązawartość endosomów, do których przybyły - obejmuje poza dzikimi typami wirusów, mutanty, które utraciły w wyniku jednej lub więcej mutacji, pewne funkcje szczepu dzikiego, inne niż ich działanie wychwytujące, szczególnie zdolność do replikacji.
Mutanty wytwarza się tradycyjnymi sposobami mutagenezy wykorzystując delecje w regionie białek wirusowych, odpowiedzialnych za funkcje replikacji i które mogą być komplementowane przez linię opakowaniową. Obejmują one, na przykład, w przypadku adenowirusa mutanty-ts (mutanty wrażliwe na temperaturę), mutanty E1A i E1B, mutanty, które wykazują mutacje w genach zależnych od MLP (Berkner, 1988) i mutanty, które wykazują mutacje w genach pewnych białek kapsydu. Odpowiednie są także naturalne szczepy wirusowe, które mają odpowiednie mutacje. Zdolność wirusa do replikacji można zbadać, na przykład, przy użyciu znanego w literaturze testu łysinkowego, w którym hodowle komórkowe pokrywa się zawiesiną różnych stężeń wirusa i liczy się liczbę zlizowanych komórek, widocznych w postaci łysinek. (Dulbecco, 1980).
Inne wirusy, które mogą być odpowiednie do użycia sposobem według wynalazku obejmują tak zwane wirusy defektywne, to znaczy pozbawione funkcji niezbędnych do autonomicznej replikacji jednego lub więcej genów i potrzebujące wirusów wspomagających. Przykładami tej kategorii, są cząsteczki DI (defektywne cząsteczki interferujące), które pochodzą od standardowych wirusów infekcyjnych, mają takie same białka strukturalne jak wirusy standardowe, ale posiadają mutacje i wymagają standardowego wirusa, jako wirusa wspomagającego replikację (Huang, 1987; Holland, 1990). Przykłady tej grupy obejmują także wirusy satelitarne (Holland 1990) Inną grupą jest klasa parvowirusów nazywanych wirusami towarzyszącymi adenowirusom (Bems, K.I., 1990).
Ponieważ wnikanie do komórek wielu wirusów nie zostało całkowicie scharakteryzowane, prawdopodobnie także inne wirusy wykazują działanie endosomolityczne, konieczne ze względu na ich przydatność w obecnym wynalazku.
Przydatne do wykorzystania sposobem według wynalazku są także attenuowane żywe szczepionki (Ginsberg, 1980) lub szczepy szczepionkowe.
180 304
W zakresie obecnego wynalazku termin wirus obejmuje także wirusy inaktywowane, na przykład, wirusy inaktywowane metodami chemicznymi, takimi jak, działanie formaldehydem, promieniowaniem UV, połączeniem działania chemicznego i promieniowania UV, na przykład, psolaren/promieniowanie UV, promieniowaniem gamma lub napromienieniem neutronami. Inaktywowane wirusy, na przykład, takie jakich używa się także w szczepionkach, można przygotować według standardowych sposobów znanych w literaturze (Davies i Dulbecco, 1980, Hearst i Thiry, 1977) i zbadać ich zdolność do zwiększenia kompleksów DNA. W badaniach przeprowadzonych w zakresie tego wynalazku preparaty adenowirusa inaktywowano przy użyciu tradycyjnej lampy do sterylizacji UV z lub bez formaldehydu. Niespodziewanie stwierdzono, że stopień inaktywacji wirusa jest znacznie większy niż zmniejszenie efektu przenoszenia genów, osiągniętego gdy adenowirusa dodano do podłoża do transfekcji. Przeprowadzone przez wynalazców badania biotynylowanego adenowirusa inaktywowanego psolarenem/promieniowaniem UV, sprzężonego z polilizyną sprzężoną ze streptawidyną, wykazały także, że w wyniku inaktywacji, miano wirusa spada znacznie szybciej niż zdolność przenoszenia genów. Jest to jasna wskazówka, ze można zniszczyć mechanizm związany z normalną replikacją wirusa baz zniszczenia działania, które jest odpowiedzialne za przenoszenie genów.
Termin „składnik wirusa” oznacza część wirusa, na przykład, część białkową uwolnioną od kwasu nukleinowego (pusty kapsyd wirusowy, który można wytworzyć metodami rekombinacji, na przykład, Ansardi i wsp., 1991; Urakawa i wsp., 1989), białka otrzymane przez frakcjonowanie lub peptydy, które mają działanie endosomolityczne nienaruszonego wirusa. Takie składniki wirusa można wytworzyć syntetycznie, w zależności od ich wielkości, metodą syntezy peptydów lub metodami rekombinacji. Sposobem według wynalazku wykazano, że białka adenowirusa sprzężone przez biotynę/streptavidynę z polilizyną zwiększają przenoszenie genów. Przykłady fragmentów lub białek innych niz adenowirusa, a które są ważne dla internalizacji, obejmują hemaglutyninę wirusa grypy (HA). N-końcowa sekwencja podjednostki HA2 hemaglutyniny wirusa grypy odpowiedzialna jest za uwolnienie wirusa z endosomu. Wykazano, ze peptydy zawierające 20 aminokwasów tej sekwencji są zdolne do łączenia się z lipidami błony i częściowego ich przełamania i otwarcia lub zniszczenia (Wharton i wsp., 1988). W różnych przykładach wykonania sposobu według wynalazku użyto z sukcesem autentycznych i zmienionych peptydów grypy. Innym przykładem są białka otoczki retrowirusów, na przykład, HIV gp41 (Rafalski i wsp., 1990) lub części tych białek wirusowych.
Użycie wirusów, które mają per se zdolność wnikania do komórki i działają jak czynnik intemalizujący jest jednym z aspektów sposobu według wynalazku.
Wirusów lub składników wirusa, które same w sobie nie mają zdolności wiązania się z komórką i wnikania do niej, korzystnie używa się jako koniugatów wirusowych, opisanych powyżej. Sprzężenie z domeną wiązącą DNA, na przykład, polikationem, zapewnia osiągnięcie wysokiego powinowactwa wirusa, korzystnie składnika wirusa, do cząsteczki DNA i w ten sposób skompleksowanie z nią i przeniesienie do komórki jako składnika kompleksu kwasu nukleinowego, który zawiera koniugat czynnika endosomolitycznego i domeny wiążącej DNA. Oprócz tak otrzymanego działania przenoszącego, wiązanie wirusa, korzystnie składnika wirusa, do domeny wiążącej kwas nukleinowy powoduje także poprawę jego właściwości endosomolitycznych.
Jeśli wybierze się inne opisane tu czynniki endosomolityczne, praktycznie kompozycjami wytworzonymi sposobem według wynalazku można transfekować każde komórki wyższych eukariontów.
Prostym testem przesiewowym można określić, czy dany wirus, korzystnie składnik wirusa, ma działanie wychwytujące i może być zastosowany sposobem według wynalazku. W teście tym, na przykład, do testowania wirusów pod kątem ich przydatności jako wolnych wirusów, doprowadza się do kontaktu komórek docelowych z kompleksami DNA w obecności lub bez obecności wirusa. Ilość DNA uwolnioną do cytoplazmy można łatwo określić przez wykrycie produktu genu markerowego, na przykład, lucyferazy. Jeśli obecność wirusa powoduje, że kompleks DNA jest pobierany do komórki i uwalniany do cytoplazmy w większej ilości niz bez obecności wirusa, można przypisać to działaniu wychwytującemu wirusa. Możliwe jest także porównanie poziomu wychwytu kompleksu DNA z wirusem testowanego z innym wirusem o znanym działaniu wychwytującym, na przykład, adenowirusem podgrupy C, typu 5. Testy tego typu można stosować także do
180 304 koniugatów wirusowych, w takich testach można badać dodatkowe parametry, takie jak, różne koniugaty czynnika endosomolitycznego. Ponadto biegli w sztuce, łatwo przystosują testy tego rodzaju, ewentualnie w połączeniu z innymi testami, na przykład, z testem upływności liposomów, do testowania składników wirusa lub innych czynników o potencjalnym działaniu endosomolitycznym pod kątem ich zdolności do zwiększania ekspresji genów.
Jeżeli używa się nienaruszonych wirusów, prowadzi się testy, korzystnie równolegle do wstępnych testów badających wirusa pod kątem zwiększania przenoszenia genów, w celu stwierdzenia czy wirus jest zdolny do replikacji. Badanie zdolności do replikacji prowadzi się stosując testy łysinkowe (patrz powyżej) lub testy CPE lub, w przypadku wirusów cytopatycznych lub wirusów, które znacznie zaburzają wzrost komórek gospodarza, określa się późną ekspresję genów. W przypadku innych wirusów stosuje się metody wykrywania replikacji specyficzne dla danego wirusa, na przykład, test hemaglutyninowy lub metody fizyko-chemiczne, na przykład, mikroskopię elektronową.
Korzystne wirusy użyte sposobem według wynalazku, szczególnie te, które są stosowane jako wolne wirusy, są wirusami, które można wytworzyć z wysokim mianem, które są stałe, mają małą patogenność w formie naturalnej i u których możliwa jest celowa eliminacja zdolności do replikacji, szczególnie adenowirusy. Jeżeli zamierza się transfekować specyficzną populację komórek, można stosować wirusy, które specyficznie infekują tę populację komórek. Jeżeli zamierza się transfekować różne komórki docelowe, można stosować wirusy, które infekują wiele typów komórek.
Wymagania dla kompozycji wolnego wirusa, są przede wszystkim takie, zęby preparat wirusowy był jak najwyższej możliwej czystości i zęby używać buforu stabilizującego odpowiadającego określonemu wirusowi.
W wielu przypadkach, przy terapeutycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku można użyć tylko tych wirusów lub składników wirusa, u których ryzyko szkodliwości zostało zminimalizowane tak dalece, jak to tylko możliwe, szczególnie ryzyko replikacji wirusa w komórkach docelowych i rekombinacji DNA wirusa z DNA komórek gospodarza.
Korzystnie, do zwiększania wychwytu i uwalniania DNA do komórek wyższych eukanontów, szczególnie człowieka, można wykorzystać mechanizm wnikania wirusów, które infekują zwierzęta a nie ludzi, tak długo dopóki wykazuje zdolność rozrywania endosomów w komórkach wyższych eukariontów. Przedstawicieli adenowirusów, wyizolowano z różnych gatunków ptaków, płazów i różnych innych zwierząt. (Patrz, na przykład, Laver, W.G. i wsp., 1971; Bragg, R.R. i wsp., 1991; Akopian, T.A. i wsp., 1991, Takase, K. I wsp., 1990, Khang, C. i Nagaraji, K.V, 1989; Reece, R.L. i wsp., 1987). Płazie, ptasie, bydlęce, psie, mysie, owcze, świńskie i małpie adenowirusy, a także ludzkie adenowirusy, są dostępne z American Type Culture Colletion, Rockville, Maryland (Patrz, American Type Culture Colletion Catalouge of Animal Viruses and Antisera, Chamydae and Rickettsiae, Wydanie szóste, 1990, Ed. C. Buck i G Paulino, strony 1-17).
Jedną z możliwych zalet użycia wirusów, na przykład, adenowirusów, odległych gatunków może być zmniejszenie ich toksyczności dla komórek docelowych (na przykład, trudno spodziewać się, żeby adenowirusy kurcząt lub żaby replikowały lub rozpoczynały wczesną ekspresję genów w komórkach ssaków), zmniejszenie ryzyka na jakie narażony jest badacz izolujący odległe adenowirusy, w porównaniu do adenowirusów człowieka i zmniejszenie oddziaływania z ludzkimi lub mysimi przeciwciałami w organizmie docelowym.
Adenowirus kurcząt CELO (letalny wirus sierocy zarodków kurcząt) nie wykazuje reakcji z przeciwciałami rozpoznającymi główne epitopy grupowe adenowirusów infekujących komórki ssaków. Ponadto, w celu otrzymania wysokiego poziomu wirusa, wirusy CELO można namnazać na zapłodnionych jajach (0,5 mg/jajko; Laver i wsp., 1971). Jak wykazano w przykładach, koniugaty CELO-pohlizyna zwiększają dostarczanie DNA do komórek HeLa do poziomu porównywalnego z ludzkim adenowirusem dl312.
Korzystnie, jako składników koniugatów wirusowych w połączeniu z kompleksami, używa się wirusów różnych gatunków.
W koniugatach wiązanie wirusa z domeną wiązącą kwas nukleinowy może być kowalencyjne lub niekowalencyjne, na przykład, mostek biotyna-streptawidyna lub wiązanie jonowe, jeżeli wirus ma na swojej powierzchni białka o charakterze kwasowym, a więc wiążące się z polikationem
180 304
Kompleksy wytwarza się w takich warunkach, które pozwalają na oddziaływanie jonowe pomiędzy adenowirusem a polilizynąprzez skompleksowanie z DNA. Doświadczenia kontrolne prowadzono w warunkach, w których polilizynę najpierw neutralizuje się DNA i dlatego me jest ona zdolna do wiązania się z adenowirusem. Kompleksy w których adenowirus jest związany jonowo były w tych doświadczeniach lepsze.
Przykładem składnika wirusowego w komugacie endosomolitycznym są puste kapsydy wirusowe lub peptydy wirusowe. Wiązanie składnika wirusa z domeną wiążącą kwas nukleinowy może być kowalencyjne, na przykład, przez sprzężenie chemiczne peptydu wirusowego z polilizyną lub niekowalencyjne, na przykład, przez wiązanie jonowe, jeżeli składnik wirusa ma reszty kwasowe wiążące się z polikationem.
Stosunek wirusa lub składnika wirusa, do substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego może być różny. W przypadku koniugatu peptyd grypy hemaglutynina-polihzyna stwierdzono sposobem według wynalazku, że przenoszenie genów można zwiększyć jeżeli zawartość peptydu wirusowego w koniugacie jest większa.
Koniugaty wirusowe można wytworzyć (jak koniugaty czynnik internalizującypolikation) przez wiązanie związków lub, jeśli składnik wirusa i domena wiążąca kwas nukleinowy są polipeptydami, metodą rekombinacji, w odniesieniu do metod wytwarzania czym się odnośnik do EP 388 758.
Wiązanie, odpowiednio, wirusa, białek lub peptydów wirusowych ze związkiem poliaminowym za pomocą metody chemicznej, może być osiągnięte w sposób znany wcześniej dla sprzęgania polipeptydów i jeśli to konieczne, przed reakcją sprzęgania, można użyć pojedynczych składników ze związkami łączącymi (to może być konieczne, jeżeli brak jest grup funkcyjnych, odpowiednich do sprzęgania, na przykład, merkaptanowych lub alkoholowych). Związki łączące są związkami bifunkcjonalnymi, które reagująnajpierw z grupami funkcyjnymi pojedynczych składników, a potem zmodyfikowane pojedyncze składniki sprzęga się.
Sprzęganie można prowadzić za pomocą:
a) Mostków dwusiarczkowych, które są ponownie rozłączane w warunkach redukujących (na przykład, gdy używa się sukcynimidylo-pirydyłoditiopropionianu (Jung i wsp., 1981).
b) Związków, które są wyjątkowo stabilne w warunkach biologicznych (na przykład, tioeterów, w reakcji maleimidowych związków łączących z grupami wodorosiarczkowymi związków łączących związanych z drugim składnikiem).
c) Mostków, które są niestabilne w warunkach biologicznych, na przykład, wiązań estrowych, acetalowych, ketalowych, które są niestabilne w lekkokwaśnych warunkach. Endosomolityczne peptydy grypy-hemaglutynin HA2 sprzężono z polilizyną metodą chemiczną używając sukcynimidylopirydyloditiopropionianu. Stwierdzono, że modyfikacja peptydu pohlizyną zwiększa aktywność endosomolityczną. Doświadczenia z transfekcją wykazały, że wydajność przenoszenia genów zależne od polilizyny-transferyny można znacznie zwiększyć jeżeli w kompleksie z DNA razem z polilizyną-transferyną obecne są koniugaty peptyd grypypohlizyna.
Adenowirusy wiąże się z polilizyną za pomocą różnych sposobów. Sprzęganie wirusa i polilizyny można osiągnąć w sposób podobny do wytwarzania koniugatów transferyna-polihzyna (Wagner i wsp., 1990), po zmodyfikowaniu defektywnego adenowirusa dl312 za pomocą związku heterobifunkcjonalnego. Niezwiązanąpolilizynę usuwa się przez wirowanie. Zdolność wiązania DNA wykazano w testach wiązania przy użyciu DNA znaczonego radioaktywnie W komórkach K562, przy braku chlorchiny, stwierdzono, że użycie kompleksów zawierających DNA, adenowirus-polilizynę i transferynę-polilizynę znacznie zwiększa przenoszenie genów, w porównaniu do niezmodyfikowanego adenowirusa, który nie jest związany z DNA. Stwierdzono także, że znaczący wzrost ekspresji genów, przy użyciu adenowirusa zmodyfikowanego polilizyną następuje już przy 0,0003 pg DNA na 5x105 komórek HeLa.
Jeżeli wirus lub składnik wirusa zawiera odpowiednie łańcuchy węglowodanowe, można połączyć je z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego przez jeden lub więcej łańcuchów węglowodanowych glikoproteiny.
180 304
Właściwa metoda wytwarzania koniugatów glikoprotein-pohkationów jest ujawniona w niemieckim zgłoszeniu patentowym P4115038.4 i została ona krótko opisana przez Wagnera i wsp., 1991b.
Inną korzystną metodą wytwarzania koniugatów wirusowych jest sprzęganie enzymatyczne wirusa lub składnika wirusa z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, bardziej szczegółowo z poliaminą przy użyciu transglutaminazy.
Kategoria transglutaminazy zawiera pewną liczbę różnych enzymów występujących mter alia w naskórku (transglutaminaza naskórkowa), we krwi (Czynnik XIII) i w komórkach różnych tkanek (transglutaminaza tkankowa) (Folk, 1985). Transglutaminazy katalizują tworzenie wiązania s-(y-glutamylo)lizyny, w obecności jonów Ca*4-1 z jednoczesnym odcięciem NH3. Wstępnym warunkiem zajścia reakcji jest obecność w białku odpowiednich glutamin i lizyn, zdolnych do reagowania z enzymem. Oprócz ε-aminowej grupy lizyny, substratem mogą być także (poh)aminy, takie jak, etanoloamina, putrescyna, spermina i spermidyna (Clark i wsp , 1959). Na razie nie jest zupełnie jasne co jest krytycznym czynnikiem określającym czy białkowa glutamina lub lizyna czy poliamina ulegnie reakcji katalizowanej przez enzym. Wiadomo, że za pomocą transglutaminazy można związać poliaminy z wieloma białkami komórkowymi, takimi jak, cytokeratyna (Zatloukal i wsp., 1989), tubulina, białka błony komórkowej, a także białka powierzchniowe wirusa grypy (Iwanij, 1977).
Wykazano, że za pomocą transglutaminazy można sprzęgnąć połilizynąz adenowirusami. Stwierdzono, że sprzęganie należy prowadzić w obecności glicerolu. Ma to tę przewagę, że preparat wirusa, na przykład, preparat adenowirusa, który zawiera w buforze glicerol, jako środek stabilizujący, może być bezpośrednio używany do sprzęgania. Dzięki użyciu koniugatów adenowirus-polilizyna, które są skompleksowane z plazmidem-DNA razem z koniugatami transferyna-polilizyna, można osiągnąć wiele razy wyższy poziom ekspresji genów niż z koniugatami transferyna-polilizyna w obecności wirusa sprzężonego nie z polilizyną.
Inną korzystną metodą wytwarzania koniugatów jest sprzęganie wirusa lub składnika wirusa z polikationem za pomocą mostku biotyna-białko, korzystnie mostku biotyna-streptawidyna.
Znane silne wiązanie się biotyny ze streptawidyną lub awidyną (Wilchek i wsp., 1988) wykorzystuje się do sprzęgania adenowirusa z polilizyną przez zmodyfikowanie adenowirusa biotyną i chemiczne sprzężenie streptawidyny z polilizyną w sposób podobny do wytwarzania koniugatów transfeiyna-polilizyna (Wagner i wsp., 1990). Kompleksy zawierające DNA i streptawidynę-pohlizynę, z którymi wiąże się zmodyfikowany biotyną wirus i ewentualnie niekowalencyjnie wiąże się polilizyną, mają bardzo wysoką wydajność transfekcji, nawet przy niższych stężeniach DNA. Szczególnie wydajne kompleksy tworzą się, jeżeli zmodyfikowany biotyną wirus najpierw wiąże się ze streptawidyną-pohlizyną a wiązanie z DNA następuje w drugim etapie.
Jeśli to jest pożądane, wiązanie z biotyną można uzyskać także za pomocą awidyny.
Możliwe jest także uzyskanie wiązania pomiędzy wirusem (składnikiem) i polilizyną z jednej strony przez biotynylację wirusa, a z drugiej przez sprzężenie polilizyny z przeciwciałem przeciw biotynie i uzyskanie wiązania pomiędzy wirusem i polilizyną za pomocą wiązania biotyna/przeciwciało, przy użyciu standardowych dostępnych w handlu poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwciał przeciw biotynie.
Wiązanie pomiędzy wirusem i polilizynąmożna także uzyskać przez sprzężenie polilizyny z lektyną która ma powinowactwo do glikoprotein powierzchni wirusa, wiązanie w takich koniugatach uzyskuje się za pomocą wiązania pomiędzy lektyną a ghkoproteiną powierzchni wirusa. Jeżeli wirus nie posiada odpowiednich łańcuchów węglowodanowych, można je odpowiednio zmodyfikować.
Wirusa można także związać z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, najpierw modyfikując powierzchnię antygenem obcym dla wirusa (na przykład, digoksygemną DIG, którą można uzyskać z Boehnnger Mannheim; lub biotyną) a następnie ustala się połączenie pomiędzy zmodyfikowanym wirusem i substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego za pomocą przeciwciała, które wiąże się z tym antygenem. Konkretna metoda
180 304 użyta do wytwarzania koniugatu zależy od wielu czynników. Na przykład, sprzęganie za pomocą biotyny jest najmniej specyficzne i dlatego może być szeroko używane, podczas gdy wiązanie zależne od biotyny stanowi bardzo silne wiązanie niekowalencyjne. Reakcja enzymatyczna za pomocą transglutaminazy ma taką zaletę, że może być prowadzona na bardzo małą skalę Sprzęganie chemiczne jest przeważnie używane, kiedy syntetyzuje się większe ilości koniugatu i metoda jest przeważnie najlepsza do sprzęgania wirusowych białek lub peptydów. Jeśli używa się wirusów inaktywowanych, inaktywację prowadzi się przeważnie przed sprzęganiem, dzięki czemu sprzęganie nie jest zaburzane przez inaktywację.
Jeżeli wirus, na przykład, adenowirus lub jego składnik endosomolityczny ma dostępną domenę wiążącą na przykład, domenę kwasową do wiązania polikationu, wirus (składnik) można także związać z polikationem jonowo. W tym przypadku, dodatnie ładunki polikationu, który ewentualnie jest sprzężony z czynnikiem intemalizującym, są częściowo zobojętniane przez domenę kwasową wirusa (składnika), pozostające ładunki są całkowicie zobojętniane przez kwas nukleinowy.
Jeżeli substancja mająca powinowactwo do kwasu nukleinowego jest substancją interkalującą jest ona zmodyfikowana substancją łączącą która jest odpowiednia dla sprzęgania określonego wirusa (składnika), na przykład, do sprzęgania za pomocą transglutaminazy jest ona zmodyfikowana spermidyną lub związkami bifunkcjonalnymi odpowiednimi do chemicznego sprzęgania, na przykład, aktywny ester.
Stosunek wirus (składnik) substancja wiążąca kwas nukleinowy może być różny i jest przeważnie ustanawiany doświadczalnie, na przykład, sprzęgając stałąilość wirusa (składnika) z różnymi ilościami polilizyny i wybierając optymalny koniugat do transfekcji.
W innym wykonaniu wynalazku, składnik wirusa, na przykład, wirusowy peptyd endosomohtyczny można zmodyfikować w celu umożliwienia bezpośredniego wiązania się z DNA. W tym celu sam peptyd może zawierać domenę wiążącą DNA, która może być wytworzona za pomocą syntezy peptydów przez dostarczenie naładowanych dodatnio aminokwasów, korzystnie w wyniku wydłużenia peptydu, najbardziej korzystnie na C-końcu. Czynnik endosomolityczny może też być niewirusowym, ewentualnie syntetycznym peptydem. Tego typu peptyd, korzystnie zawarty jest w kompozycji według wynalazku w taki sposób, że jest on jonowo związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, na przykład, z polilizyną w przypadku kompleksów DNA-czynnik intemalizujący-polilizyna. Tak więc włączanie peptydu endosomolitycznego do kompleksów kwasu nukleinowego jest osiągnięte za pomocą wiązania reszt aminokwasowych peptydu z dodatnio naładowanymi aminokwasami domeny wiążącej, korzystnie polilizyny.
W zależności od chemicznej struktury peptydu, szczególnie jego grup końcowych, wiązanie z polilizyną może być osiągnięte za pomocą metod opisanych tu do łączenia peptydów i polihzyny. W tym celu, jeżeli używa się naturalnego peptydu można go zmodyfikować odpowiednimi aminokwasami końcowymi dla ułatwienia sprzęgania.
Inną drogą włączania niewirusowych peptydów endosomohtycznych do kompleksów kwasu nukleinowego jest dostarczenie im sekwencji wiążących DNA. Umiejscowienie takich sekwencji musi być takie, żeby nie zakłócało aktywności endosomolitycznej peptydu. Dlatego, na przykład, peptydy, których N-koniec jest odpowiedzialny za ich aktywność, rozszerza się o sekwencje wiążące DNA na C-końcu. Tego typu rozszerzenie może zawierać homologiczne lub heterologiczne oligopeptydy kationowe, na przykład, ogon ohgolizynowy lub naturalne domeny wiążące DNA, na przykład, peptydy pochodzące od histonów. Korzystnie, takie sekwencje wiążące DNA są integralną częścią peptydu endosomolitycznego i zawierają około 10 do 40 aminokwasów. Ten przykład wykonania sposobu według wynalazku umożliwia osiągnięcie wyższego stosunku sekwencji endosomolitycznej do sekwencji wiążącej DNA niż koniugaty peptydów, które w celu osiągnięcia wyższej wydajności kompleksów, zawierają większą część pohkationów.
180 304
Niewirusowe peptydy endosomolityczne powinny spełniać następujące wymagania:
W odniesieniu do aktywności endosomolitycznej upływność błony lipidowej osiągana dzięki peptydowi, korzystnie, powinna być wyższa w niższym PH (5-6) niż w pH 7. Ponadto, zniszczone obszary błony powinny być wystarczająco duże, żeby pozwolić na przejście kompleksów DNA (małe pory nie są wystarczające). W celu określenia czy dany peptyd spełnia te wymagania, prowadzi się testy in vitro stosując peptydy w formie wolnej lub związanej i/lub włączone w kompleksy DNA. Testy takie mogą zawierać test upływności liposomów, test upływności erytrocytów i doświadczenia z hodowlami komórkowymi, w których określa się zdolność do zwiększania ekspresji genów. Tego typu testy opisane sąw przykładach. Optymalną ilość peptydu można określić przez wstępne miareczkowanie, badając otrzymaną wydajność pizenoszenia genów. Należy mieć w pamięci, że wydajność różnych peptydów i optymalna kompozycja kompleksu zależy od typu komórek.
Peptydy rozrywające błony przeważnie zawierają sekwencje amfipatyczne, konkretnie stronę hydrofobową, która może oddziaływać z błoną lipidową i stronę hydrofitową, która stabilizuje fazę wodną w miejscu rozerwania błony.
W naturze występuje kilka przykładów peptydów rozrywających błony przeważnie małych peptydów lub domen peptydowych większych pohpeptydów. Peptydy takie można sklasyfikować według ich działania w naturze, konkretnie na peptydy rozrywające błony (na przykład, peptydy nagich wirusów) i/lub peptydy łączące się z błoną (na przykład, wirusów opłaszczonych). W odniesieniu do peptydów syntetycznych, do rozrywania endosomów są przydatne obie klasy sekwencji peptydowych. Większość peptydów naturalnych jest zdolna do tworzenia amfipatycznych a-helis.
Specyficzność do pH można osiągnąć włączając, do hydrofobowej strony wyjściowej α-helisy, reszty kwasowe w taki sposób, że helisa tworzy się tylko w kwaśnym pH, a me tworzy się w pH obojętnym, w którym odpychanie się ujemnie naładowanych reszt kwasowych zapobiega tworzeniu się helisy. Właściwość tę znaleziono także w naturalnie występujących sekwencjach (na przykład, N-koniec HA-2 grypy).
Całkowicie syntetyczne, racjonalnie zaprojektowane amfipatyczne peptydy z zależnymi od pH właściwościami rozrywającymi błonę opisał (Subbarao i wsp., 1987; Parente i wsp., 1990). Wykazano, że ten peptyd (w formie wolnej) tworzy w błonie tylko małe pory, pozwalające jedynie na uwalnianie małych związków (Parente i wsp., 1990).
Gdy wykorzystuje się niewirusowe, ewentualnie syntetyczne peptydy, przeważnie wykonuje się następujące etapy: z grupy naturalnie występujących lub sztucznych peptydów wybiera się amfipatyczną sekwencję peptydową. Peptydy tego rodzaju są znane w technice przegląd pokazano w tabeli 2. Jeśli to konieczne, wprowadza się reszty kwasowe (Glu, Asp) w celu uczynienia aktywności rozrywającej błony komórkowe bardziej pH-specyficzną(a przykład, podwójny kwasowy mutant peptydu hemaglutyniny grypy opisany na przykładzie 37 i oznaczony p50).
Jeśli to konieczne, reszty kwasowe można wprowadzić w celu ułatwienia wiązania peptydów z polilizyną. Jednym ze sposobów dostarczenia takiej polikationowej domeny wiążącej jest wprowadzenie C-końcowych rozszerzeń kwasowych, na przykład, ogona ohgo-Glu.
Peptydy endosomolityczne odpowiednie do wykorzystania w kompozycji według wynalazku można otrzymać także przez połączenie sekwencji występujących naturalnie i sztucznych. W tym wynalazku przeprowadzono doświadczenia z różnymi peptydymi pochodzącymi od syntetycznego peptydu GALA, opisanego przez Parente i wsp., 1990. Niektóre peptydy wykorzystane w doświadczeniach wykonanych sposobem według wynalazku uzyskano łącząc peptyd GALA lub jego modyfikacje z sekwencjami peptydu grupy lub jego modyfikacjami, na przykład, peptydy oznaczone EALA-Inf i EALA-P50, według przykładu 37
Długość sekwencji peptydowej może być krytyczna dla stabilności helisy amfipatycznej, przez wydłużenie helisy można osiągnąć wzrost stabilności krótkich domen pochodzących z białek naturalnych, które są pozbawione stabilizującego działania reszty białka.
180 304
W celu zwiększenia aktywności endosomolitycznej peptydu, można wytworzyć homodimery, heterodimery lub oligodimery; w doświadczeniach przeprowadzonych w tym wynalazku wykazano, że dimer P50 ma dużo większą aktywność niż monomer.
Wynalazcy wykazali, ze działanie syntetycznych peptydów na wychwyt DNA zależy od koniugatów transferyna-polilizyna. Zsyntetyzowano wiele różnych peptydów, zbadano ich zdolność do powodowania upłynnienia liposomów i erytrocytów i ich wpływ na ekspresję lucyferazy w komórkach TIB 73 i NIH 3T3.
W innym przykładzie wykonania kompozycji według wynalazku czynnik endosomohtyczny jest niepeptydową substancją amfipatyczną. Żeby substancja taka była przydatna do wykorzystania w kompozycji według wynalazku musi ona spełniać wymagania dokładnie takie same jakie stawia się amfipatycznym peptydom, konkretnie, musi mieć zdolność włączenia się do kompleksów kwasu nukleinowego, być pH-sspecyficzna i tym podobne.
W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, czynnik endosomolityczny jest wirusem, lub składnikiem wirusa, kowalencyjnie związanym z polikationem.
Koniugat endosomolityczny obejmuje także - oprócz koniugatu, w którym czynnik endosomolityczny jest jonowo związany z domenąwiążącąDNA - czynniki endosomolityczne, które są bezpośrednio związane z DNA, na przykład, przez ich rozszerzenia zasadowe, chociaż „koniugatów” tego rodzaju, mówiąc dokładnie, nie otrzymuje się przez sprzęganie, to znaczy przez wiązanie dwóch składników jednego z drugim. Działanie czynników endosomolitycznych tego typu jako związków w kompozycji według wynalazku nie zależy od tego, czy zostały one zsyntetyzowane przez sprzężenie czynnika endosomolitycznego z domeną wiążącą DNA, czy domena wiążąca DNA była oryginalnie obecna w czynniku endosomolitycznym.
W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, kompleks zawiera, w dodatku do koniugatu endosomolitycznego, inny koniugat, w którym substancja mająca powinowactwo do kwasu nukleinowego, w przypadku polikationowych koniugatów endosomolitycznych przeważnie ten sam polikation jak w koniugacie, jest sprzężona z czynnikiem internalizującym, który ma powinowactwo do komórek docelowych. Takie wykonanie jest szczególnie wtedy przydatne, gdy komórki docelowe nie mająlub mająmało receptorów wirusa wykorzystywanego jako część koniugatu endosomolitycznego.
W innym wykonaniu wynalazku wykorzystuje się składnik wirusa, na przykład, występujący naturalnie, ewentualnie zmodyfikowany peptyd, niewirusowy, ewentualnie syntetyczny peptyd endosomolityczny lub formę wirusa dalekiego gatunku, który sam w sobie nie ma zdolności do wnikania do komórki, która ma być transfekowana. W obecności dodatkowego koniugatu czynnika intemalizującego i czynnika wiążącego, koniugaty endosomolityczne korzystają z zdolności intemalizującej drugiego koniugatu, dzięki skompleksowamu z kwasem nukleinowym razem z drugim koniugatem i są pobierane do komórki jako część powstającego kompleksu, który dalej jest nazwany „kompleksem połączonym” lub „kompleksem potrójnym”. Niekoniecznie według tej teorii, kompleksy połączone sąpobierane przez komórkę dzięki wiązaniu ich z komórkowym receptorem powierzchniowym, który jest specyficzny dla danego czynnika intemalizującego lub, na przykład, w przypadku użycia wirusa łub składnika wirusa, dzięki wiązaniu do obu receptorów i internalizacji drogą zależnej od receptorów endocytozy. Kiedy z endosomów uwalniane są czynniki endosomolityczne do cytoplazmy uwalniany jest także DNA zawarty w endosomach i w ten sposób unika degradacji w lizosomach.
W doświadczeniach wykonanych w zakresie wynalazku prawie wszystkie komórki HeLa można było transfekować wolnym adenowirusem. Dla hepatocytów można było jeszcze ulepszyć wydajność, kiedy używa się potrójnych kompleksów DNA, w których reportem wy DNA jest skompleksowany z koniugatami transferyna-polilizyna i połączony z adenowirusem. Umieszczenie razem w endosomie wirusa endosomolitycznego i kompleksu ligandu receptora gwarantuje uzyskanie transfekcji prawie we wszystkich komórkach, tak różnych linii, jak BNL.CL2 i HepG2. W tym przypadku, zarówno receptory wirusa jak i transferyny na powierzchni komórki wychwytują potrójne kompleksy DNA Jednakże, można sobie także wyobrazić, że potrójne kompleksy DNA mogą być mtemalizowane dzięki działaniu komór
180 304 kowych związków ligand/receptor. Sytuację taką można przybliżyć w doświadczeniach, w których potrójne kompleksy DNA zawierajątransferynę dajądostęp do komórek K562, głównie dzięki receptorom transferyny a nie receptorom adenowirusa.
Niespodziewanie, potrójne kompleksy przenoszą DNA, nawet jeśli jest on obecny w bardzo małych stężeniach. Tak więc przy 30 pg DNA/3 χ 105 komórek na wejściu, otrzymano 1,8x104 jednostek światła (powstających w wyniku ekspresji plazmidu kodującego lucyferazę) W tym punkcie było tylko 60 cząsteczek DNA i 1 PFU wirusa na komórkę. Porównano to z mniej wydajna metodą wytrącania solami wapnia, w którym używa się 2 χ 105 cząsteczek DNA na komórkę (Sambrook, J. i wsp., 1989). Tak więc, wynalazek obecny stanowi znaczny postęp w technice i pozwala na wydajną transformację komórek wyższych eukariontów bardzo małymi ilościami DNA.
Obecność wirusów, składników wirusa lub niewirusowych czynników endosomolitycznych w kompleksach DNA, jako składników koniugatów endosomohtycznych ma następujące zalety:
1) Szersze zastosowanie technologii przenoszenia genów za pomocą kompleksów kwasu nukleinowego; ponieważ sam czynnik endosomohtyczny, szczególnie w przypadku wykorzystania wirusów (składników), może stanowić czynnik intemalizujący lub może być także skompleksowany z DNA razem z innym czynnikiem intemalizującym (na przykład, transferyną lub asialofetuiną i tym podobnymi). W ten sposób możliwe jest wykorzystanie pozytywnego działania wirusów, nawet dla komórek, które me mają żadnych receptorów wirusa
2) Poprawienie wydajności przenoszenia genów, ponieważ wiązanie koniugatów endosomolitycznych z DNA powoduje, że są one razem pobierane do komórek. Wspólne pobieranie i uwalnianie wirusów i DNA daje także możliwość zmniejszenia ilości DNA i wirusa koniecznych do wydajnego przenoszenia genów.
Dla celów obecnego wynalazku termin „czynnik intemalizujący” oznacza ligand lub fragment ligandu, który po związaniu z komórką jest intemalizowany drogą endocytozy, korzystnie drogą endozytozy zależnej od receptorów lub czynnik, którego wiązanie lub internalizacja zachodzi dzięki fiizji z elementami błony komórkowej.
Odpowiednie czynniki intemalizujące obejmują ligandy transferynę (Klausner, R. D. i wsp., 1983), conalbuminę (Sennett, C. i wsp., 1981), asialoglikoproteiny (takie jak, asialotransferyna, asialorosomukoid lub asialofetuina) (Ashwell, G. i wsp., 1982), lektyny (Goldstein i wsp., 1980, Shardon, 1987) lub substancje, które zawierają galaktozę i sąintemalizowane przez receptor asialoglikoproteiny; mannozylowane glikoprotemy (Stahl, P. D. i wsp., 1987), enzymy lizosomowe (Sly, W. i wsp., 1982), LDL (Goldstein i wsp., 1982), zmodyfikowane LDL (Goldstein i wsp., 1979), lipoproteiny, które są pobierane przez komórkę przez receptory (apo B100/LDL); białka wirusowe, takie jak, białko HIV gp 120; przeciwciała (Mellman, I. S. i wsp , 1984; Kuhn, L. C. i wsp., 1982, Abrahamson, D. R. i wsp., 1982); lub ich fragmenty przeciw antygenom powierzchniowym komórki, na przykład, przeciw-CD4, przeciw-CD7; cytokiny, takie jak, interleukiną-1 (Mizel, S. B. i wsp., 1987), interleukina-2 (Smith, K.A. i wsp., 1985), TNF (Immamure, komórek, i wsp., 1987), interferon (Anderson, P. i wsp., 1982), CSF (czynnik stymulujący kolonie) (Walker, F. i wsp., 1987); czynniki i czynniki wzrostu, takie jak, insulina (Marshall, S. i wsp., 1985), EGF (naskórkowy czynnik wzrostu) (Carpenter, G. i wsp., 1984), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF) (Heldin, C.-H. i wsp., 1982), TGBT (transformujący czynnik wzrostu β) (Massague, J. i wsp., 1986), czynnik wzrostu nerwów (Hosang, M., i wsp , 1987), I czynnik wzrostu podobny do insuliny (Schalch, D. S. i wsp., 1986), LH, FSH (Ascoh, M. i wsp., 1978), hormon wzrostu (Hizuka, N. i wsp , 1981), prolaktyna (Posner, Β I. i wsp , 1982), glukagon (Asada-Kubota, M. i wsp., 1983), hormony tarczycy (Cheng, S.-Y. i wsp., 1980), proteaza α-2-makroglobuliny (Kapłan, J. i wsp., 1979) i „rozbrojone” toksyny. Następne przykłady to immunoglobuhny lub ich fragmenty jako ligandy receptorów Fc lub przeciwciała przeciw immunoglobuhnom, które wiążąsię z SIg „(przeciwciałami powierzchniowymi)” Ligandy mogą być pochodzenia naturalnego lub syntetycznego (Patrz, Trends Pharmacol Sci. 10 458-462 (1989)).
180 304
Czynniki takie muszą spełniać następujące niezbędne warunki, zęby były przydatne sposobem według wynalazku:
a) muszą ulegać internalizacji w specyficznych typach komórek, do których ma być wprowadzony kwas nukleinowy, a na ich zdolność do internalizacji nie wpływa lub wpływa w niewielkim stopniu sprzężenie z czynnikiem wiążącym,
b) własność ta musi iść w parze ze zdolnością do przenoszenia ”przy okazji” kwasu nukleinowego do komórek, drogą którą same wnikają.
W przeprowadzonych doświadczeniach pokazano wiele zastosowań czynnika mternalizującego w wynalazku, lub dodatkowego innego czynnika intemalizującego w kompleksie, odpowiednio na przykładzie ludzkich i mysich koniugatów transferyna-polilizyna, koniugatów asialofetuina-polilizyna, koniugatów galaktoza-polilizyna, koniugatów aglutynina zarodków żyta-pohlizyna, swoistych dla limfocytów T koniugatów gpl20-pohhzyna i CD7-polihzyna, koniugatów LDL-polilizyna, koniugatów Ig-polilizyna i anty-Ig-polihzyna lub dzięki kompleksom DNA polilizyna, które nie zawierają żadnego czynnika intemalizującego. Ponadto, powstawanie koniugatów wirusowych sposobem według wynalazku wykazano, dzięki kompleksom DNA i wirusa sprzężonego z polilizyną(lub składnika wirusa), który nie zawiera żadnego dodatkowego koniugatu czynnik internalizujący-czynnik wiążący.
Można przeprowadzić wstępne teksty w celu określenia, czy, w przypadku gdy czynnikiem endosomolitycznym jest wolny wirus, użycie czynnika intemalizującego, lub w przypadku gdy czynnikiem endosomolitycznym jest wirus, składnik wirusa lub peptyd niewirusowy, który jest częścią koniugatu endosomolitycznego, „dodatkowy” czynnik intemalizujący pozwala lub poprawia wychwyt kompleksów kwasu nukleinowego. Testy te obejmują równoległą transfekcję kompleksami kwasu nukleinowego, najpierw bez (dodatkowego) czynnika intemalizującego, na przykład, w przypadku koniugatów wirusa kompleksami zawierającymi kwas nukleinowy i koniugat wirusa, a potem kompleksami, w których kwas nukleinowy jest skompleksowany z innym koniugatem zawierającym dodatkowy czynnik intemalizujący, dla którego receptor posiada komórka docelowa, i substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego.
Użycie czynnika intemalizującego, lub dodatkowego czynnika intemalizującego, to znaczy zastosowanie kompleksu połączonego, jest określone głównie przez komórki docelowe, na przykład, przez specyficzne antygeny powierzchniowe lub specyficzne receptory dla typu komórek, które umożliwiają w ten sposób celowe przenoszenie kwasu nukleinowego do tego typu komórek.
Substancje mające powinowactwo do kwasu nukleinowego, które mogą być użyte według wynalazku obejmują, na przykład, homologiczne polikationy organiczne, takie jak, polilizyna, poliarginina, poliomityna lub heterologiczne polikationy organiczne, mające dwa lub więcej różnych naładowanych dodatnio aminokwasów, takie polikationy mają, o ile to możliwe, łańcuchy różnej długości i także niepeptydowe syntetyczne polikationy, takie jak, polietylenoimina. Inne substancje mające powinowactwo do kwasu nukleinowego, które są przydatne, obejmują naturalne białka wiążące się z DNA o naturze pohkationowej, takie jak, histony lub protaminy lub ich analogi lub fragmenty, a także, spemina lub spermidyna.
Długość polikationu nie jest krytyczna, dopóki kompleksy są zupełnie obojętne elektrycznie. Korzystny zakres długości łańcucha polilizyny wynosi około 20 do około 100 monomerów lizyny. Jednakże, dla danej długości DNA, nie ma krytycznej długości polikationu. Jeżeli DNA zawiera 600 bp i 12000 ładunków ujemnych, można zastosować następujące ilości polikationu na mol DNA, na przykład:
moli polilizyny 200 moli polilizyny 400; lub
120 moli polilizyny 100 i tym podobne.
Specjalista może dobrać mną kombinację długości i molowej ilości polikationu dzięki rutynowym doświadczeniom.
Inne odpowiednie substancje mające powinowactwo do kwasu nukleinowego, które są przydatne, jako części koniugatów to substancje interkalujące, takie jak, dimery etydyny,
180 304 akrydyna lub peptydy interkalujące, zawierające tryptofan i/lub tyrozynę i/lub fenyloalaninę.
Przy określeniu jakościowego składu kompleksów kwasu nukleinowego jako pierwszy dobiera się kwas nukleinowy, który ma być przeniesiony do komórki. Kwas nukleinowy określa się biorąc pod uwagę przede wszystkim działanie biologiczne jakie się chce osiągnąć w komórce, a w przypadku zastosowania w terapii genowej, gen lub wycinek genu, który ma ulec ekspresji, na przykład, w celu zastąpienia genu defektywnego, lub docelową sekwencje genu, którego ekspresja ma być zahamowana. Kwas nukleinowy, który ma być przeniesiony do komórki może być DNA lub RNA, i nie ma żadnych ograniczeń co do sekwencji nukleotydowej.
Dopuszczalny jest szeroki zakres wielkości kwasu nukleinowego. Stosując kompozycję według wynalazku można przenosić do komórek konstrukty genetyczne o wielkości około 0,15 kz (w przypadku tRNA genu kodującego rybozym) do około 50 kz lub więcej, mniejsze cząsteczki kwasu nukleinowego można przenosić jako oligonukleotydy.
Szerokie zastosowanie kompozycji według wynalazku możliwe jest dzięki temu, że nie istnieją żadne ograniczenia co do sekwencji genu i że wykorzystując kompozycję według wynalazku można przenosić bardzo duże konstrukty genowe.
Wychodząc od kwasu nukleinowego dobiera się substancję mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, korzystnie organiczna substancję polikationową która zapewni skompleksowanie kwasu nukleinowego i z którą uzyskane kompleksy będą korzystnie zupełnie obojętne elektrycznie. Jeśli kompleksy zawierają obok koniugatów endosomolitycznych, koniugat dodatkowego czynnika internalizującego i substancję mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, rozważając składnik polikationowy obu koniugatów bierze się pod uwagę aspekt obojętności elektrycznej.
We wcześniejszych wynalazkach stwierdzono, że optymalne przenoszenie kwasu nukleinowego do komórki następuje, gdy stosunek koniugatu do kwasu nukleinowego dobiera się tak, że kompleksy czynnik intemalizujący-polikation/kwas nukleinowy są zupełnie obojętne elektrycznie. Stwierdzono, że ilość kwasu nukleinowego przeniesionego do komórki nie zmniejsza się jeżeli trochę koniugatu transferyna-pohlizyna zastąpi się polikationem związanym niekowalencyjnie; w pewnych przypadkach może to nawet zwiększyć znacznie wychwyt DNA (Wagnera i wsp., 199 la). Stwierdzono, że DNA w kompleksach jest upakowany w toroidalne struktury o średnicy około 80 do 100 nm). Jakość polikationu dobiera się biorąc pod uwagę dwa parametry, obojętność elektryczną i osiągnięcie struktury kompaktowej, podczas gdy ilość polikationu, która wynika z ładunku kwasu nukleinowego, z uwzględnieniem osiągnięcia obojętności elektrycznej, przeważnie gwarantuje także upakowanie DNA.
Kompleks zawiera także substancję mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego w formie związanej niekowalencyjnie, która może być identyczna lub różna od czynnika wiążącego. W przypadku, jeżeli czynnikiem endosomolitycznym jest wolny wirus, kompleks zawiera kwas nukleinowy i koniugat czynnika internalizującego. W przypadku, jeżeli używa się koniugatu endosomolitycznego, na przykład, koniugatu wirusowego, kwas nukleinowy jest skompleksowany z koniugatem, ewentualnie w zgodzie z drugim czynnikiem intemalizującym. Wybór niekowalencyjnie związanej „wolnej” substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego pod kątem jej natury i ilości, jest określony także przez koniugat (koniugaty), szczególnie biorąc pod uwagę czynnik wiążący zawarty w koniugacie: na przykład, jeżeli czynnik wiążący jest substancją która nie ma lub ma ograniczoną zdolność do kondensacji DNA, korzystne jest, jeżeli się chce uzyskać wydajną internalizację kompleksów, użycie substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, która ma tę właściwość w dużym stopniu. Jeżeli sam czynnik wiążący jest substancją kondensującą kwas nukleinowy i jeżeli od razu doprowadza do upakowania kwasu nukleinowego odpowiedniego do wydajnej internalizacji, korzystne jest użycie substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, która podnosi ekspresję w wyniku działania innego mechanizmu.
Odpowiednie „wolne” substancje mające powinowactwo do kwasu nukleinowego kompozycji według wynalazku zawierają substancje, które są zdolne kondensować i/lub chronić go
180 304 przed niepożądaną degradacją w komórce, szczególnie wspomniane powyżej substancje o naturze polikationowej. Inna grupa odpowiednich substancji zawiera substancje, które dzięki wiązaniu się z kwasem nukleinowym, prowadzą do polepszenia jego transkrypcji/ekspresji, poprawiając dostępność kwasu nukleinowego dla komórkowych mechanizmów ekspresji. Przykładem tego typu substancji są chromosomowe niehistonowe białka HGM1, które, jak stwierdzono mają zdolność upakowywania DNA i ułatwiania jego ekspresji w komórkach.
W odniesieniu do tych kompleksów, jeżeli określa się stosunek molowy czynnika endosomolitycznego i/lub czynnika intemalizującego/substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego/kwasu (kwasów) nukleinowego należy zwrócić uwagę, że zachodzi kompleksowanie kwasu (kwasów) nukleinowego, że utworzony kompleks może wiązać się z komórką i ulegać internalizacji, i że kompleksy same lub przy udziale czynnika endosomolitycznego uwalniają się z endosomu. Stosunek czynnika intemalizującego/czynmka wiążącego i kwasu nukleinowego zależy szczególnie od wielkości cząsteczki polikationu i liczby oraz rozkładu grup o dodatnim ładunku elektrycznym, można przenieść tu kryteria opisane dla wielkości i struktury kwasu (kwasów) nukleinowego. Korzystnie stosunek molowy czynnika intemalizującego/substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego wynosi od około 10/1 do około 1/10.
Po skonstruowaniu i zsyntetyzowaniu koniugatów i określeniu optymalnego, dla wydajnej transfekcji, stosunku koniugat:DNA, wielkość części koniugatu, którą można zastąpić, jeśli to konieczne, wolną substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego można określić przez miareczkowanie. Jeżeli używa się polikationów, zarówno jako czynnika wiążącego i także jako wolnej substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, polikationy mogąbyć identyczne lub różne. Gdy wykorzystuje się koniugaty wirusowe, metoda odpowiednia do określenia stosunku zawartych w kompleksach może obejmować, po pierwsze, określenie konstruktu genowego, który ma być wprowadzony do komórek i jak opisano powyżej, znalezienie wirusa lub składnika wirusa, który jest odpowiedni dla określonej transfekcji. Następnie, wirus lub składnik wirusa wiąże się z polikationem i kompleksuje z konstruktem genetycznym. Wychodząc z określonej ilości koniugatu wirusowego, można wykorzystać miareczkowanie działając na komórki docelowe tą (stałą) ilościąkoniugatu i obniżając stężenie DNA, lub na odwrót. W ten sposób można określić optymalny stosunek DNA: koniugat wirusa. Jeżeli używa się dodatkowego czynnika intemalizującego, procedury można użyć, na przykład, do określenia przez miareczkowanie optymalnego stosunku koniugatu wirusa do koniugatu czynnika intemalizującego, wychodząc ze stałej ilości DNA.
Kompleksy można otrzymać przez zmieszanie razem następujących składników i) kwasu nukleinowego, ii) koniugatu wirusa, ewentualnie iii) koniugatu czynnika intemalizującego/czynnika wiążącego i ewentualnie iv) niekowalencyjnie związanej substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, wszystkie mogąbyć obecne w formie roztworów. Jeżeli używa się polikationów, zarówno jako czynnika wiążącego i jednocześnie jako „wolnych” polikationów, ogólnie korzystnie jest najpierw przygotować mieszaninę koniugatów z „wolnymi” polikationami, a następnie łączyć tę mieszaninę z DNA. Optymalny stosunek DNA do koniugatu (koniugatów) i polikationów określa się przez miareczkowanie, to znaczy w serii transfekcji stosując stałą ilość DNA i wzrastająca ilość mieszaniny koniugatu (koniugatów)/polikationów. Optymalny stosunek koniugatu (koniugatów):polikationów w mieszaninie określa się w rutynowych eksperymentach lub przez porównanie optymalnych proporcji mieszanin używanych w doświadczeniach z miareczkowaniem.
Kompleksy DNA można przygotować przy fizjologicznych stężeniach soli. Innąmożliwościąjest użycie wysokich stężeń soli (około 2 M NaCl) i następnie doprowadzenie do stężeń fizjologicznych, przez rozcieńczenie lub dializę.
Najbardziej odpowiednią kolejność mieszania składników kwas nukleinowy, koniugat (koniugaty), ewentualnie niekowalencyjnie związana substancja mając powinowactwo do kwasu nukleinowego, określa się doświadczalnie wcześniej. W niektórych przypadkach może być korzystnie najpierw skompleksować kwas nukleinowy z koniugatem (koniugatami) i
180 304 następnie dodać „wolnej” substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, na przykład, polikationu, na przykład, w przypadku koniugatów transferyna-dimer etydyny i polilizyna. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, czynnik intemalizujący lub dodatkowy czynnik intemalizujący, odpowiednio, jest transferyną i czynnik wiążący jest polikationem. Termin „transferyna” określa zarówno naturalne transferyny jak i takie zmienione transferyny, które wiążą się z receptorem i są przenoszone do komórki.
Kwas nukleinowy pobierany jest do komórki w postaci kompleksu, w którym koniugaty czynnik intemalizujący/polikation sąskompleksowane z kwasem nukleinowym. Jeżeli zawierają one niekowalencyjnie związaną substancję mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego, jest to korzystnie polikation. Ten drugi polikationjest identyczny lub różny od polikationu zawartego w koniugacie lub obu koniugatach.
W przypadku „kompleksów połączonych”, kwas nukleinowy ulega internalizacji w postaci kompleksu, w którym koniugaty czynnika intemalizującego z jednej strony i komugaty endosomolityczne z drugiej, są skompleksowane z kwasem nukleinowym.
Koniugaty czynnika intemalizującego i polikationu, które sąużywane razem z wolnym wirusem lub razem z koniugatem wirusowym w kompleksach połączonych, można otrzymać metodami chemicznymi lub, jeśli polikation jest peptydem, metodą rekombinacji, opis metod otrzymywania jest zawarty w EP 388 758.
Korzystnie, używa się koniugatów, w których glikoproteina, na przykład, transferyna i czynnik wiążący są związane ze sobą przez jeden lub więcej łańcuchów węglowodanowych glikoproteiny.
W odróżnieniu od koniugatów otrzymanych tradycyjną metodą sprzęgania, koniugaty tego typu są wolne od zmian wynikających zużycia substancji łączących. W przypadku glikoprotein, które maja tylko jedną lub kilka grup węglowodanowych odpowiednich do sprzęgania, na przykład, transferyna, koniugaty takie mają także taką zaletę, że są ściśle określone pod względem miejsc wiązania glikoproteina/czynnik wiążący.
Ilość używanego czynnika endosomolitycznego i jego stężenie zależy od określonej transfekcji. Korzystnie jest używać minimalnej ilości wirusa lub koniugatu wirusa, która jest konieczna do zapewnienia internalizacji wirusa (koniugatu) i kompleksu kwasu nukleinowego i uwolnienia ich z endosomu. Ilość wirusa (koniugatu) dobiera się dla poszczególnego typu komórek, a przede wszystkim pod uwagę należy brać infekcyjność danego typu wirusa w tym typie komórek. Innym kryterium jest określony koniugat czynnika intemalizującego i czynnika wiążącego, szczególnie w odniesieniu do czynnika intemalizującego, dla którego komórka docelowa ma specyficzną liczbę receptorów. Ponadto, ilość wirusa (koniugatu) zalezy od ilości DNA, która ma być przeniesiona. Ogólnie, mała ilość wirusa jest odpowiednia dla osiągnięcia stałej transfekcji, która wymaga tylko małej ilości DNA, podczas gdy czasowa transfekcja, która wymaga większych ilości DNA, wymaga większych ilości wirusa. W szczególnych zastosowaniach, w celu określenia optymalnego stężenia wirusa przez miareczkowanie, prowadzi się testy wstępne na komórkach, które zamierza się transfekować, korzystnie na mieszanej populacji komórkowej i z systemem wektorowym przewidzianym do transfekcji, a używany DNA wygodnie jest konstruktorem genowym, który w dużym stopniu przypomina konstrukt przewidziany do konkretnego użycia, pod względem wielkości i zawiera gen reporterowy dla łatwiejszego zmierzenia wydajności przenoszenia genów.
Wykazano, że odpowiednimi genami reporterowymi w takich testach są geny lucyferazy i β-galaktozydazy.
Tabela 1 przedstawia wyniki pomyślnej transfekcji przy użyciu kompozycji według wynalazku, uzyskane dla różnych typów komórek.
Kompozycja według wynalazku była także badana pod kątem transfekcji psich fibroblastów hemofilii B. W tych komórkach można było z powodzeniem uzyskać ekspresję lucyferazy i β-galaktozydazy. Ponadto, kompozycji użyto do dostarczenia 1,4 kb cDNA psiego czynnika IX do fibroblastów psów chorych na hemofilię. Psi czynnik IX można było wykryć 24 godziny po transfekcji testem ELISA.
180 304
W pewnych przypadkach, korzystne jest użycie substancji lizosomatotroficznych w dodatku do czynnika endosomolitycznego, na przykład, jeśli czynnik jest koniugatem peptydu endosomolitycznego lub retrowirusem, którego aktywność endosomolityczna nie zależy ścisłe od kwaśnego pH.
Wiadomo, że substancje lizosomatotropowe hamują aktywności proteaz i nukleaz i dlatego mogą hamować degradację kwasów nukleinowych (Luthman i Mangusson, 1983). Substancje te obejmują monensynę, nigerycynę i metyloaminę. Wykazano, że monensyna podnosi ekspresję genu reporterowego, jeżeli używa się retrowirusa Moloneya.
Wykazano, że obecność chlorochiny prowadzi do ekspresji genu reporterowego, wprowadzonego metodą przeniesienia DNA za pomocą transferyny w 100% komórek K562. BNL. CL2 lub hepatocyty Hep62 nie odpowiadają na chlorochinę, tak jak komórki K562, ale i one mogą być transfekowane w 5 - 10%, kiedy wykorzysta się własności endosomohtyczne dodanych, defektywnych replikacyjnie lub inaktywowanych chemicznie wolnych adenowirusów.
Wynalazek zwiększa zalety wektorów biologicznych. Z rozkładu receptorów wynika tropizm zarówno do czynnika intemalizującego jak i do wirusa. Po dobraniu tych dwóch składników dla określonej populacji komórek, możliwe jest osiągnięcie znacznej selektywności.
Kompozycja według wynalazku może mieć postać liofilizatu, lub może być głęboko zamrożona w odpowiednim buforze. Można ja także dostarczać jako gotowy do użycia odczynnik w roztworze, korzystnie przesyłany i przechowywany w stanie oziębionym. Ewentualnie, komponenty konieczne do transfekcji, to znaczy DNA, czynnik endosomolityczny, ewentualnie sprzężony lub gotowy do koniugacji z oddzielnym związkiem - partnerem do koniugacji, substancja wiążąca DNA, ewentualnie sprzężona z czynnikiem intemalizującym, ewentualnie wolny polikation, mogą być obecne w odpowiednim buforze osobno lub częściowo oddzielone, jako składniki zestawu do transfekcji. Zestaw do transfekcji obejmuje opakowanie, w którym znajduje się jeden lub więcej pojemników, takich jak probówki do testów, fiolki itp., które zawierają materiały niezbędne do przeprowadzenia transfekcji komórek wyższych eukariontów. W takim zestawie do transfekcji, pierwszy pojemnik może zawierać jeden lub więcej różnych DNA, na przykład, kodujących różne antygeny. Drugi pojemnik może zawierać jeden lub więcej różnych koniugatów czynników intemalizujących, co umożliwia użycie zestawu do transfekcji jako systemu modułowego. Składniki mogą być dostarczane w postaci preparatów gotowych do użycia, bądź oddzielnie do zmieszania bezpośrednio przed użyciem, co zależy od stabilności kompleksów, którą można określić za pomocą standardowych testów stabilności. Korzystnie trwały podczas przechowywania jest zestaw, który w jednym pojemniku zawiera transglutaminazę sprzężoną z koniugatem adenowirus-polilizyna. Inny korzystny zestaw zawiera w oddzielnych pojemnikach biotynylowany adenowirus i streptawidynę-polilizynę, które miesza przed użyciem. W przeprowadzonych doświadczeniach wykazano, ze zarówno hodowle mioblastów jak i miotubul, nawet pierwotne, można transfekować z dużą wydajnością. Z największym powodzeniem stosowano kombinację kompleksów biotynylowanego adenowirusa, transferyny-polihzyny i streptawidyny-polilizyny. Oprócz genów reporterowych lucyferazy i β-galaktozydazy, w komórkach mięśniowych uzyskano ekspresję czynnika VIII Ponadto, użyto adenowirusa kurcząt CELO w kompleksach zawierających aglutyninę zarodków żyta, jako dodatkowego czynnika intemalizującego.
Kompozycja według wynalazku może być także stosowana w testach do określania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na dany antygen. Swoiste wobec antygenu cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zabijające komórki zainfekowane, grają ważna rolę w obronie gospodarza przed infekcjami wirusowymi i nowotworami. Interakcja pomiędzy komórką-T i komórką prezentującą antygen (APC) jest ograniczona dla HLA (antygeny krwinek białych ludzkich = MHC, główny układ zgodności tkankowej); w celu zbadania zabijania przez CTL komórek wytwarzających antygen, za pomocą testów zabijania przez CTL in vitro, konieczna jest obecność, odpowiedniego z punktu widzenia HLA, antygenu do CTL, co przeważnie oznacza autologiczne komórki docelowe
180 304
Test zabijania przez CTL można przeprowadzić jak następuje: transfekuje się APC konstruktem DNA zawierającym sekwencję kodującą antygen. Epitopy antygenowe wiążą się z cząsteczkami MHC klasy I i są prezentowane na powierzchni komórki, jako cel dla specyficznej odpowiedzi CTL. Tak więc, po inkubacji z próbką surowicy pacjenta, w zależności od obecności specyficznych CTL, APC sąhzowane. Lizę mierzy się określając uwalnianie, na przykład, radioaktywnego chromu, który włączono do APC przed dodaniem surowicy. W znanych protokołach doświadczalnych używa się (Walker i wsp., 1989) B-LCL (linia limfoblastoidalnych komórek B), w których wywołano ekspresję genów antygenu za pomocą transfekcji zrekombinowanymi wirusami szczepionkowymi. Jednakże, w tych komórkach antygen ulega wydajnej ekspresji przez około jeden dzień, ze względu na lityczne działanie szczepionki.
Te trudności można obejść używając testu zabijania przez CTL, w którym do wprowadzania konstruktów genowych kodujących antygeny, np. konstruktów kodujących antygeny HIV lub antygeny nowotworowe, do fibroblastów w celu nadania im zdolności wytwarzania antygenów, wykorzystuje się kompozycję według wynalazku.
Fibroblasty pierwotne można łatwo otrzymać przez biopsję, są łatwe do hodowania i, jak wykazano, przy użyciu kompozycji według wynalazku ulegają łatwo transfekcji ze szczególnie dużą wydajnością (od około 50% do około 70%). Takie próby są użyteczne do identyfikowania epitopów rozpoznawanych przez komórki zabijające przy projektowaniu szczepionek. Ponadto można je korzystnie stosować do określania ograniczonej HLA odpowiedzi immunologicznej osobnika na dany antygen.
Ponieważ prawie we wszystkich komórkach można osiągnąć wysoki poziom ekspresji przeniesionego genu, kompozycji według wynalazku używać można do wytwarzania zrekombinowanych białek. Brak tu lub istniejąniewielkie ograniczenia co do, odpowiednio, sekwencji lub masy cząsteczkowej przenoszonego DNA. Istnieje także wiele typów komórek, które można transfekować kompozycją według wynalazku. Tak więc, prawie każdy typ komórek może być użyty do wytwarzania zrekombinowanych białek, co powoduje, że zrekombinowane białko jest wytwarzane wiernie i wytwarzana jest forma całkowicie modyfikowana posttranslacyjnie, co gwarantuje wysoką aktywność biologiczną produktu.
Jak wykazano dla lucyferazy i interferonu alfa, można wykonać przenoszenie genów do komórek i praktycznie każdy konstrukt genowy, powodujący powstawanie pożądanego produktu białkowego może być dostarczony. Pożądany produkt białkowy można odzyskać z hodowli transfekowanych komórek (z nadsączu lub z odpowiedniego homogenatu komórkowego, według metod odpowiednich dla poszczególnych produktów białkowych), od 24 godzin do jednego lub więcej tygodni po transfekcji.
Zastosowanie kompozycji według wynalazku, do wytwarzania zrekombinowanych białek ma następujące zalety:
1) Z powodu wysokiej wydajności transfekcji ( w więcej niż 90% komórek dostarczony gen może ulegać ekspresji na wysokim poziomie), nie trzeba stosować żadnej selekcji wstępnej transfekowanych komórek i nie ma potrzeby zakładania stałych linii komórkowych. Hodowle na małą skalę są wystarczające do wytworzenia użytecznych ilości białka.
2) Można dostarczać duże konstrukty genowe. Jak dotąd dostarczono z sukcesem 48 kb.
3) Ekspresja genu uzyskana w komórkach gwarantuje odpowiednią posttranslacyjną obróbkę i modyfikację (na przykład, zależną od witaminy K. karboksylację czynników skrzepotwórczych, patrz Armentano i wsp., 1990, lub specyficzną dla typu komórek ghkozylację).
Opis rysunków
Rysunek 1: Działanie infekcji adenowimsowej na przenoszenie genów za pomocą koniugatów transferyna-polilizyna.
Rysunek 2: Wpływ dawki koniugat-DNA-kompleks.
Rysunek 3: Zwiększenie przez adenowirusy przenoszenia genów zależnego od transferynypohhzyny zachodzi drogą zależnej od receptorów endocytozy
A) Działanie na skompleksowane DNA.
B) Działanie na DNA związany z receptorem.
C) Działanie na przenoszenie genów za pomocą komugatów transferyna-polilizyna.
180 304
Rysunek 4: Działanie infekcji adenowirusowej na przenoszenie genów za pomocą koniugatów transferyna-polilizyna w wybranych liniach komórkowych.
Rysunek 5: Badanie, czy efekt zwiększenia ekspresji genów jest oparty na przenoszeniu genów, czy na transaktywacji.
Rysunek 6: Koniugat peptyd tetra-galaktoza-polilizyna.
Rysunek 7: Transfekcja komórek HepG2 w obecności adenowirusa.
Rysunek 8: Transfekcja komórek HepG2 kompleksem pCMVL-DN A w obecności adenowirusa.
Rysunek 9: Transfekcja komórek TIB73 kompleksem pCMVL-DNA.
A) Porównanie wyników dla chlorchiny.
B) W obecności adenowirusa.
Rysunek 10: Transfekcja komórek T kompleksem pCMVL-DNA w obecności adenowirusa.
A) Komórki H9.
B) limfocyty pierwotne.
Rysunek 11: Inaktywacja adenowirusów UV
A) Zwiększenie przez UV-inaktywowane wirusy przenoszenia genów w komórkach HeLa.
B) Porównanie inaktywacji UV z efektem przenoszenia genów.
Rysunek 12: Inaktywacja adenowirusów formaldehydem.
Rysunek 13: Transfekcja komórek NIH3T3 kompleksem transferyna-polilizyna-DNA w obecności wirusa Moloneya.
Rysunek 14: Badanie, czy efekt przenoszenia genów w czasie transfekcji komórek NIH3T3 kompleksem transferyna-polilizyna-DNA można przypisać obecności wirusa Moloneya.
Rysunek 15: Wzajemne oddziaływanie pomiędzy transferyną i jej receptorem gra rolę w efekcie przenoszeniu genów przez wirusa Moloneya.
Rysunek 16: Wpływ pH na efekt przenoszenia genów przez retrowirusy.
Rysunek 17: Peptyd hemaglutyniny grypy; test upłynniania lizosomów.
Rysunek 18: Transfekcja komórek K562 koniugatem transferyna-polilizyna w obecności koniugatów peptyd grypy-polilizyna.
Rysunek 19: Transfekcja komórek HeLa koniugatem transferyna-polilizyna w obecności koniugatów peptyd grypy-polilizyna.
Rysunek 20: Wykazanie in situ ekspresji β-galaktozydazy po transfekcji komórek HeLa transferyno-polilizyno-pCMV-β-gal-DNA w obecności adenowirusa.
Rysunek 21: Wykazanie in situ ekspresji β-galaktozydazy po transfekcji komórek HeLa w obecności adenowirusa.
Rysunek 22: Transfekcja komórek 48 kb kosmidem w obecności adenowirusa.
A) Komórki HeLa.
B) Komórki neuroblastoma.
Rysunek 23: Wytworzenie koniugatów adenowirus-polilizyna za pomocą sprzęgania chemicznego.
Rysunek 24: Transfekcja komórek K562 za pomocąkoniugatów sprzężonego chemicznie adenowirusa.
Rysunek 25: Transfekcja komórek HeLa za pomocą koniugatów sprzężonego chemicznie adenowirusa.
Rysunek 26: Wiązanie polilizyny z adenowirusem za pomocą transglutaminazy.
Rysunek 27: Transfekcja mysich hepatocytów za pomocąkoniugatów adenowirusa sprzężonego przy użyciu transglutaminazy.
Rysunek 28: Zwiększenie wydajności transfekcji za pomocą koniugatów adenowirusa sprzężonego przy użyciu transglutaminazy w porównaniu z wirusem niesprzężonym.
180 304
Rysunek 29: Transfekcja komórek K562 za pomocąkoniugatów adenowirusa sprzężonego z biotyną-streptawidyną.
Rysunek 30: Transfekcja komórek HeLa za pomocą koniugatów adenowirusa sprzężonego z biotyną-streptawidyną.
Rysunek 31: Transfekcja komórekneuroblastomy 48 kb kosmidem za pomocąkoniugatów adenowirusa sprzężonego z biotyną-streptawidyną.
Rysunek 32: Transfekcja komórek hepatocytów w obecności chlorchiny lub w obecności adenowirusa.
Rysunek 33: Transfekcja komórek K562 w obecności różnych czynników endosomolitycznych.
Rysunek 34: Porównanie na poziomie komórkowym protokołów transfekcji w obecności różnych czynników endosomolitycznych, przy użyciu β-galaktozydazy, jako genu reporterowego.
Rysunek 35: Długotrwała ekspresja lucyferazy w zlewających się i nie dzielących się hepatocytach.
Rysunek 36: Porównanie ekspresji w komórkach HeLa transfekowanych w obecności wirusa CELO w formie wolnej i połączonej z polilizyną za pomocą biotyny-streptawidyny.
Rysunek 37: Transfekcja mioblastów i miotubul w obecności wolnego adenowirusa i sprzężonego z biotyną-streptawidyną.
Rysunek 38: Transfekcja pierwotnych hodowli mioblastów i miotubul.
Rysunek 39: Analiza porównawcza transfekcji komórek HeLa i mioblastów C2C12 adenowirusem dl312 i CELO.
Rysunek 40: Poprawa transfekcji wirusem CELO dzięki użyciu lektyny jako ligandu.
Rysunek 41: Ekspresja cDNA czynnika VIII w pierwotnych hodowlach mioblastów C2C12 i miotubul.
Rysunek 42: Zwiększenie dostarczania DNA przez białka adenowirusa.
A) Komórki HeLa.
B) Fibroblasty.
Rysunek 43: Koniugaty galaktoza-peptyd grypy do przenoszenia DNA do hepatocytów.
Rysunek 44: Koniugaty galaktoza-adenowirus do przenoszenia DNA do hepatocytów.
Rysunek 45: Transfekcja limfoblastoidalnych komórek B.
Rysunek 46: Przenoszenie DNA zapomocątransferyny-polihzyny w obecności rhinowirusa.
A) Wolny rhinowirus.
B) Rhinowirus sprzężony.
Rysunek 47: Transfekcja pierwotnych ludzkich komórek czerniaka kompleksami zawierającymi koniugaty transferyny i adenowirusa.
Rysunek 48: Transfekcja pierwotnych ludzkich komórek czerniaka kompleksami zawierającymi koniugaty LDL i adenowirusa.
Rysunek 49: Przenoszenie genów do komórek nabłonka płuc szczurów in vivo.
Rysunek 50: Test upłynniania liposomów dla peptydów amfipatycznych.
Rysunek 51: Test upłynniania erytrocytów dla peptydów amfipatycznych.
Rysunek 52: Transfekcja komórek BNL CL. 2 w obecności peptydów amfipatycznych.
Rysunek 53: Transfekcja komórek N1H 3T3 w obecności peptydów amfipatycznych.
Rysunek 54: Ekspresja IFN-α w komórkach HeLa transfekowanych w obecności różnych czynników endosomolitycznych.
Wynalazek, opisany ogólnie powyżej, jest zilustrowany następującymi przykładami, które nie ograniczają jego zakresu.
W następujących przykładach, ilustrujących obecny wynalazek, używa się, jeżeli nie napisano inaczej, następujących materiałów i metod:
Przygotowanie kompleksów transferyna-polilizyna/DNA
a) Ludzkie koniugaty transferyna-polihzyna
180 304
Użyto metody opisanej przez Wagnera i wsp., 1991 a, w której polilizynę sprzęga się z bocznymi łańcuchami węglowodanowymi transferyny.
Roztwór 280 mg (3,5 pmoli) ludzkiej transferyny (wolnej od żelaza, Sigma) w 6 ml 30 mM buforu octanowo sodowego, pH 5, oziębia się do temperatury 0°C i dodaje 750 μΐ 30 mM buforu octanowo sodowego, pH 5, zawierającego 11 mg (51 pmoli) nadjodanu sodowego. Mieszaninę pozostawia się w ciemności w łaźni lodowej przez 90 minut.
W celu usunięcia produktów niskocząsteczkowych, prowadzono filtrację na żelu (Sephadex G-25), Pharmacia) i otrzymano roztwór, który zawiera około 250 mg utlenionej transferyny (zmierzonej testem ninhydrynowym). (W celu wykrycia formy utlenionej, która zawiera aldehyd i daje reakcję barwną po barwieniu aldehydem anyżowym, próbki dodano kroplami na cienkowarstwową płytkę żelu silikonowego i suszono, po czym płytki zanurzono w aldehydzie anyżowym/kwasie siarkowym/etanohi (1/1/18), osuszono i ogrzano). Roztwór zmodyfikowanej transferyny szybko dodano (w ciągu 10 do 15 minut) do roztworu zawierającego 1,5 pmola znakowanej fluoresceinąpoli(L)lizyny, o średniej długości łańcucha 190 monomerów lizyny, w 4,5 ml 100 mM octanu sodowego, pH 5. pH roztworu doprowadzono do pH 7,5 dodając IM bufor węglanowy. Co 1 godzinę do mieszaniny dodano 4 porcje po 28,5 mg (450 pmoli)cyjanoborowodorku sodowego. Po 17 godzinach dodano 2 ml 5M chlorku sodowego, w celu doprowadzenia roztworu do całkowitego stężenia 0,75 M. Mieszaninę reakcyjnąnaniesiono na kolumnę kationowymienną(Pharmacia Mono S 10/10) i wymywano gradientem chlorku sodowego od 0,75 M do 2,5 M ze stałą zawartością 25 mM HEPES, pH 7,3. Wysokie stężenie soli podczas ładowania kolumny i na początku gradientu jest niezbędne do otrzymania koniugatów polikationowych. W czasie przemywania wymywa się trochę transferyny (około 30%) razem z niewielką aktywnością fluorescencyjną; większość znaczonego fluorescencyjnie koniugatu wymywa się przy stężeniu soli pomiędzy 1,35 Mi 1,9 M i zbierano go w trzy frakcje. Frakcje te (w kolejności wymywania) zawierały, po dwukrotnej dializie wobec 21 25 mM HEPES pH 7,3, frakcję A (TfpL190A) zawierającą45 mg (0,56 pmoli) transferyny, zmodyfikowanej 366 nmolami polilizyny, frakcję B (TfpL190B) zawierającą 72 mg (0,90 pmoli) transferyny, zmodyfikowanej 557 nmolami polilizyny, frakcję C (TfpL190C) zawierającą? mg (85 nmoh) transferyny, zmodyfikowanej 25 nmolami polilizyny. Jeżeli frakcji nie używano natychmiast, koniugaty transferyny gwałtownie zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -20°C w postaci wolnej od żelaza. Przed włączeniem żelaza, próbki (0,5 do 1 mg) doprowadzono chlorkiem sodowym do fizjologicznego stężenia soli (150 mM). Żelazo wprowadzano dodając 4 pl 10 mM cytrynianu żelaza (Ill)-buforu (zawierającego 200 mM cytrynianu, doprowadzonego do pH 7,8 przez dodanie wodorowęglanu sodowego) na mg zawartości transferyny. Przed użyciem do kompleksowania DNA, koniugaty zawierające żelazo dzielono na małe porcje, gwałtownie zamrażano w ciekłym azocie lub w suchym lodzie/etanolu i przechowywano w temperaturze -20°C (procedurę tę powinno się wykonać raz, ponieważ stwierdzono, że powtarzalne rozmnażanie i zamrażanie powoduje stratę aktywności koniugatów).
b) Mysie koniugaty transferyna-polihzyna
Użyto podobnej metody jak do otrzymywania ludzkiej transferyny a sprzęganie uzyskano za pomocą bocznych łańcuchów węglowodorowych, z 4,1 mg (51 nmoh) mysiej transferyny 12,1 mg (34 nmoli) pL290 otrzymano koniugaty 15,5 nmoh mysiej transferyny i 13 nmoli pL 290
Plazmidowy DNA
a) pRSVL-DNA
DNA plazmidu pRSVL (zawierający gen lucyferazy Photinus pyralis pod kontrolą sekwencji wzmacniającej/promotora LTR wirusa mięsaka Rousa (Uchida i wsp , De Wet i wsp , 1987), otrzymano za pomocą standardowej metody hzy Tritonem-X (Maniatis), następnie wirując w gradiencie gęstości CsCl/ETBr, odbarwiając butanolem-1 i dializując wobec 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 1 mM EDTA). W celu wytworzenia kompleksów 6 pg DNA plazmidowego w
180 304
350 μΐ HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) mieszano z 12 pg koniugatu transferyna-polihzyna w 150 μΐ HBS, 30 minut przed dodaniem do komórek.
b) pCMVL-DNA
Plazmid pCMVL (konstrukt genu reporterowego zawierający gen lucyferazy Photinuspyralis pod kontrolą promotora cytomegalowirusa) otrzymano przez usunięcie wstawki BamHI z plazmidu pSTCX556 (Seveme i wsp., 1988); plazmid traktowano fragmentem Klenowa i Hindlll/Ssp i wstawiono traktowany polimeraząKlenowa fragment plazmidu pRSVL, zawierający sekwencję kodującą lucyferazę, względnie β-galaktozydazę. pCMVp gal opisali Macgregor i Caskey (1989). Kompleks otrzymano analogicznie jak pRSVL.
Otrzymywanie preparatów wirusowych
a) Preparaty adenowirusa
Użyto szczepu adenowirusa dl 312 opisanego przez Jones i Shenk, 1979, mającego delecję w regionie Ela. Replikację wirusa prowadzono w Ela-trans-komplementacyjnej linii 293 i prowadzono oczyszczanie na dużą skalę tak, jak opisali Davidson i Hassell, 1987. Oczyszczony wirus umieszczono w buforze do przechowywania (100 mM Tns, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 50% gliceryna) lub w HBS/40% gliceryna i porcje przechowywano w temperaturze -70°C. Stężenie wirionów określono za pomocą analizy UV-spektrofotometrycznej wyekstrahowanego wirusowego DNA genomowego (Wzór: jednajednostka gęstości optycznej (OD, A260) odpowiada I O12 cząstek wirusa/ml; (Chardonnet i Dales, 1970)).
b) Preparaty retrowirusa
Retrowirusa N2 mysiej białaczki limfatycznej Moloneya upakowano w ekotropowej linii do upakowania (Keller i wsp., 1985, Armentano i wsp., 1987). Zebrano nadsącz z komórek wytwarzających wirusy, gwałtownie zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -20°C. Nadsącze używane w przykładach miały miano około 106 cfu/ml, zmierzone za pomocą określenia tworzenia kolonii przez oporne na neomycynę komórki NIH3T3. Do badania stężenia wirusa, nadsącz filtrowano przez filtr membranowy odcinający 360 kD (FILTRON) w urządzeniu do zagęszczania komórek (AMICON) w atmosferze azotu pod zwiększonym ciśnieniem. Normalnie, 10 do 30 ml supematantu zatężano tą metodą dziesięciokrotnie.
Komórki i podłoża
Komórki HeLa hodowano w podłożu DMEM, z dodatkiem 5% inaktywowanej ciepłem cielęcej surowicy płodowej (FSC), penicyliny w ilości 1001. U./ml, streptomycyny (100 pg/ml) i 2 mM glutaminy. Komórki WI-38, MRC-5 i KB hodowano w podłożu EMEM (podłoże MEM w modyfikacji Eagla), z dodatkiem 10% inaktywowanej ciepłem FCS, antybiotyków jak podłoże DMEM, 10 Mm nie niezbędnych aminokwasów i 2 mM glutaminy. Komórki CFT1, nabłonkowa lima komórkowa mukowiscydozy oddechowej (otrzymana metodą opisaną przez Yankaskasa i wsp., 1991,; linia CFT 1 jesthomozygotyczna wdelecji5F508 mutacji CF) hodowano w podłożu F12-7Χ (Willumsen i wsp., 1989). Dla doświadczeń z przenoszeniem genów komórki hodowano na 6 cm płytkach Petriego, az osiągną50% zlewania się (5 χ 105 komórek). Podłoże usunięto i dodano 1 ml podłoża DMEM lub EMEM/2% FCS. Następnie dodano kompleksów komugat-DNA i natychmiast adenowirusa d 1312 (0,05-3,2 χ 104 cząstek wirusa na komórkę) lub porównywalną objętość buforu do przechowywania wirusów (1 -80 μΐ). Płytki wstawiono do inkubatora na jedną godzinę (5% CO2,37°C) i następnie dodano 3 ml kompletnego podłoża. Po następnych 24 godzinach inkubacji komórki zebrano w celu zmierzenia ekspresji genu lucyferazy W przypadku CFT1, przed doświadczeniami z przenoszeniem genów, komórki hodowano 4 godziny w podłożu F12-7X bez ludzkiej transferyny.
Następujące linie komórkowe otrzymano z ATCC, pod podanymi numerami katalogowymi: komórki HeLa: CCL2, komórki K562: CCL 243, komórki HepG2: HB 8065, komórki TIB-73: TIB 73 (BNL CL. 2), komórki NIH3T3: CRL 1658, komórki 293: CRL 1573, komórki KB: CCL 17, komórki WI-38: CCL 75, komórki MRC-5- CCL 171 Komórki H9 otrzymano z AIDS Research and Reference Reagent Program, U. S Departament of Health and Humań Services, numer katalogowy 87.
180 304
Pierwotne limfocyty otrzymano pobierając 25 ml krwi z pępowiny do probówek zawierających EDTA. Krew pokrywano 4,5 ml Ficol-hypaque (Pharmacia) i wirowano przez 15 minut przy prędkości 2500 obrotów na minutę. Usuwano brązowawą warstwę pomiędzy górną warstwą surowicy i klarowną warstwą Ficollu (około 10 ml). Dodawano 40 ml IMDM plus 10% FCS, wirowano próbkę przez 15 minut przy prędkości 1200 obrotów na minutę i osad komórek zawieszano w 50 ml świeżego IMDM plus 10% FCS (gęstość komórek wynosiła około 2 χ 106 komórek/ml). Dodawano 250 μΐ fitohemaglutyniny (PHA P, Difco) i hodowlę inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% azotu i dodawano zrekombinowanej IL-2 (BMB) (stężenie: 20 jednostek/ml). Komórki rozcieńczono 1:3 IMDM/20% FCS, 2 jednostki/ml IL-2. Komórki zamrażano głęboko w ciekłym azocie w FCS plus 5% DMSO. Przed użyciem komórki hodowano w IMDM plus 20% FCS plus 2 jednostki/ml IL-2.
Do badań kolejności wiązania komórki HeLa równoważono w temperaturze 4°C w 1 ml DMEM, z dodatkiem 2% FCS. Dodawano kompleksów koniugat-DNA, jak w innych testach, i płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Następnie płytki przemyto DMEM/2% FCS schłodzonym lodem i dodano 2 ml podłoża. Następnie dodano adenowirusa d 1312 lub buforu do przechowywania wirusów i pozostawiano komórki, żeby się powoli podgrzały, przed umieszczeniem w inkubatorze na następne 24 godziny. Po inkubacji komórki zebrano i badano na ekspresję genu lucyferazy.
Test aktywności lucyferazy
Przygotowanie ekstraktów komórkowych, standaryzację zawartości białka i określenie aktywności lucyferazy prowadzono tak, jak opisano w publikacji Zenke i wsp., 1990, Cotten i wsp., 1990 i EP 388 758.
Przykład 1- Określenie wpływu traktowania adenowirusem na przenoszenie genów przez koniugaty transferyna-polilizyna.
Zbadano przede wszystkim wpływ zwiększenia dawki wirusa na zdolność określonej ilości kompleksu koniugat-DNA do przenoszenia genów. W celu wytworzenia kompleksów, 6 pg plazmidu pRSVL zmieszanoz 12 pg koniugatu ludzka transferyna-polilizyna (hTfpL190B). Do komórek HeLa dodawano kompleks koniugat-DNA plus różne ilości adenowirusa d 1312 (0,05-3,2 χ 104 cząstek wirusa na komórkę). Wyniki tej analizy przedstawiono na fig. 1. Aktywność lucyferazy przedstawiono w jednostkach światła 50 pg całkowitego białka komórkowego. Według tej analizy wzrostowi ilości dodanego wirusa odpowiada wzrost przenoszenia genów. Rysunek przedstawia średnie z 2 do 4 niezależnych doświadczeń; kreskami zaznaczono odchylenie standardowe.
Przykład 2 - Wpływ dawki kompleksu koniugat-DNA
Tak jak w przykładzie 1, przygotowano logarytmiczne rozcieńczenia kompleksu koniugat-DNA i dodano do komórek HeLa z lub bez stałej dawki adenowirusa dl312 (1 χ 104 cząstek wirusa na komórkę). Aktywność lucyferazy określono tak, jak w przykładzie 1. Wyniki tej analizy przedstawiono na fig. 2.
Przykład 3 - Zwiększenie przenoszenia genów za pomocą transferyny-polilizyny przez adenowirusa zachodzi drogą zależnej od receptorów endocytozy
a) Wpływ traktowania adenowirusem na przenoszenie skompleksowanego DNA
Do transfekcji użyto następujących składników:
pg pRSVL-DNA bez koniugatu transferyna-polilizyna (DNA); 6 pg pRSVL-DNA plus 6 pg niesprzężonej polilizyny 270 (DNA + pL); 6 pg pRSVL-DNA plus 12 pg koniugatu transferyna-polilizyna użytego w poprzednim przykładzie (DNA + hTfpLl 90B) Te materiały transfekcyjne dodawano do komórek HeLa z lub bez adenowirusa d 1312 (1 χ 104 cząstek wirusa na komórkę). Przygotowanie ekstraktów komórkowych, standaryzację zawartości białka całkowitego i określenie aktywności lucyferazy prowadzono tak, jak w poprzednich przykładach. Wyniki tej analizy przedstawiono na fig. 3A.
b) Wpływ traktowania adenowirusem na przenoszenie DNA związanego z receptorem
180 304
Kompleksy koniugat-DNA (DNA + hTfpL190B) lub kompleksy polilizyna-DNA (DNA + pL) związano z komórkami HeLa bez internalizacji, przez inkubację w temperaturze 4°C. Niezwiązane kompleksy usunięto przed dodaniem adenowirusa d 1312 (1 x 104 cząsteczek wirusa na komórkę) lub porównywalnej objętości buforu. Następnie prowadzono inkubację w temperaturze 37°C w celu umożliwienia internalizacji związanych kompleksów DNA i adenowirusa. Aktywność lucyferazy określono tak, jak już opisano (fig. 3B).
c) Wpływ traktowania adenowirusem na przenoszenie genów za pomocą koniugatów transferyna-po 1 il izyna
Do komórek HeLa z 1 χ 104 cząstek adenowirusa (dl312) na komórkę lub porównywalnymi ilościami adenowirusa inaktywowanego ciepłem (dl312 h. i.) dodano kompleksów koniugat-DNA zawierających 6 pg pRSVL-DNA plus 12 pg koniugatu transferyna-pohlizyna (DNA+hTfpL190B). Inaktywację ciepłem prowadzono inkubując przez 30 minut w temperaturze 45°C (Defer i wsp., 1990). Fig. 3C przedstawia aktywność lucyferazy
Przykład4 - Wpływ traktowania adenowirusem na przenoszenie genów za pomocą koniugatów transferyna-polilizyna w wybranych liniach komórkowych
Do komórek linii CFT1, KB, HeLa, WI38 i MRC5 z lub bez adenowirusa d 1312 (1 χ 104 cząstek wirusa na komórkę) dodano kompleksów koniugat-DNA (6 pg pRSVL + 12 pg hTfpL190B). Wydajność przenoszenia genów w różnych liniaach komórkowych określono tak, jak w poprzednich przykładach za pomocą testu lucyferazy (fig. 4).
Przykład 5 - Zwiększenie ekspresji genu lucyferazy działa na poziomie przenoszenia genów, a nie na poziomie transaktywacji
Wytworzono linię komórkową oznaczoną K562 10/6, w której zachodzi konstytutywna ekspresja lucyferazy, przez transfekcję komórek plazmidem zawierającym fragment genu lucyferazy RSV (fragment Apal/Pvul pRSVL (De Wet i wsp., 1987) wklonowany w miejsce Clal pUCpLocus (Collis i wsp., 1990). Plazmid ten skompleksowano z koniugatem transferyna-pohhzyna i tym kompleksem transfekowano komórki K562, przy użyciu metody opisanej przez Cotten i wsp., 1990. Ponieważ plazmid pUCp Locus zawiera gen oporności na neomycynę, możliwa jest selekcja klonów wytwarzających lucyferazę w oparciu o oporność na neomycynę. Do następnych doświadczeń użyto klonu K562 10/6.
Komórki linii macierzystej K562 w 200 μΐ RPMI 1640 plus 2% FCS; 500000 komórek na próbkę) traktowano 12 pg TfpL plus 6 pg pRSVL lub 4 pg pL 90 plus 6 pg pRSVL w 500 pl HBS w obu przypadkach. Przez 1,5 godziny w temperaturze 3 7°C komórki traktowano adenowirusem dl312 w wymienionej ilości (fig. 5), a następnie dodano 2 ml RPMI i 10% FCS. Inkubację kontynuowano przez następne 24 godziny w temperaturze 37°C, a następnie komórki przygotowano do pomiarów aktywności lucyferazy. Stwierdzono, że inkubacja z adenowirusem powoduje znaczący wzrost aktywności lucyferazy (fig. 5A). Dotyczy to zarówno kompleksów TfpL (2000 jednostek światła w stosunku do 25000jednostek światła), jak i kompleksów pL 90 (0 w stosunku do 1,9 x 10ć jednostek światła). Wskazuje to, że komórki K562 maja zdolność internalizacji kompleksów pRSVL/pohhzyna i, że ta internalizacja, mierzona za pomocą wytwarzania lucyferazy, zwiększa się znacząco w obecności adenowirusa.
Analogiczne testy przeprowadzono z komórkami K562 10/6, w których zachodzi konstytutywna ekspresja lucyferazy i użyto podobnych ilości adenowirusa dl312. 500000 komórek (200 pi RPMI plus 2% FCS) inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C w obecności adenowirusa dl 312 w ilości podanej na fig. 5B. Następnie tak jak do linii macierzystej dodano RPMI i 10% FCS i kontynuowano inkubację przez następne 24 godziny, a następnie określono aktywność lucyferazy. Jak pokazano na fig. 5B, traktowanie komórek adenowirusem nie ma wykrywalnego wpływu na aktywność lucyferazy, wartości kontrolne są w tym samym zakresie, co wartości próbek traktowanych wirusem.
Przykład 6 - Transfekcja komórek wątroby koniugatem asialofetuina-pohhzyna (AFpL) lub koniugatem peptyd/tetragalaktoza-pohlizyna (gal 4pL) w obecności adenowirusa
a) Otrzymanie laktozylowanego peptydu
180 304
3,5 mg (1,92 pmola) rozgałęzionego peptydu Lys-(NE-Lys)Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-SerGly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys, wytworzonego metodą Fmoc przy użyciu Applied Biosystem 431A Peptide Synthesizer, zawierającego ditiopirydynowągrupę Cys, traktowano roztworem 7,85 mg laktozy w 40 μΐ 40 mM wodnego roztworu octanu sodu, pH 5 w temperaaturze 37°C. Do roztworu dodano cztery próbki po 0,6 mg (10 pmoli) cyjanoborowodorku sodowego co 10 godzin. Po całkowitym czasie 64 godzin w temperaturze 37°C dodano 0,5 ml HEPES pH 7,3 i 15 mg ditiotreitolu (DTT). Rozdzielenie na frakcje za pomocą filtracji na żelu (Sephadex G-10, 12 x 130 mm, eluent 20 mM NaCl) w atmosferze argonu dało 3,6 ml roztworu laktozylowanego peptydu z wolnymi grupami merkapto (1,74 pmola według testu Ellmanna, wydajność 84%). Próbki zmodyfikowanego peptydu wykazywały reakcję barwną z aldehydem anyżowym ale nie wykazywały reakcji barwnej z ninhydryną co zgadza się z przypuszczeniem, że zostały laktozylowane wszystkie cztery grupy N-końcowe. Koniugat peptyd tetragalaktoza-polilizyna pokazano na fig. 6.
b) Wytwarzanie polilizyny zmodyfikowanej 3-ditiopirydynopropionianem
400 μΐ 15 mM roztworu SPDP w etanolu (6,0 pmoli) dodano, intensywnie mieszając, do przefiltrowanego przez żel roztworu 0,60 pmoh polilizyny o średniej długości łańcucha 290 monomerów lizyny (pL290, bromowodorek, Sigma) w 1,2 ml 100 mM HEPES pH 7,9. 1 godzinę później dodano 500 μΐ i 1 M roztworu octanu sodu pH 5 przefiltrowanego przez żel (Sephadex G-25) z 100 mM octanu sodu. Roztwór zawierał 0,56 pmolapL290 i 5,77 pmola linkera ditiopirydynowego.
c) Sprzęganie peptydu i polilizyny
Koniugaty otrzymano przez zmieszanie 1,5 pmola laktozylowanego peptydu wytworzonego w a) w 3 ml 20 mM NaCl z 0,146 μΐ zmodyfikowanej pL 290 otrzymanej w b) w 620 μΐ 100 mM buforu octanowego w atmosferze argonu. Po dodaniu 100 μΐ 2M HEPES pH 7,9, mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 18 godzin w temperaturze otoczenia. Stężenie soli doprowadzono do 0,66 M dodając NaCl i koniugaty wyizolowano za pomocą chromatografii kationowymiennej (Pharmacia kolumna Mono S HR 5/5, wymywanie gradientem, bufor A· 50 mM HEPES pH 7,3, bufor B: bufor A plus 3 MNaCl). Frakcje zawierające produkt wymywały się przy stężeniu soli około 1,2 M - 1,8 M i zebrano je w dwóch frakcjach koniugatu, nazwanych gal4pLl i gal4pL2. Dializa wobec 25 mM HEPES pH 7,3 dała frakcje koniugatu: gal4pLl zawierającą 24 nmole zmodyfikowanej pL290 i ga!4pL2 zawierającą 24 nmole zmodyfikowanej pL290.
d) Wytwarzanie asialofetuiny
Koniugaty wytwarzano według tych samych zasad jak koniugaty transferyny; podobną metodę otrzymywania koniugatów asialoorosomukoid-polilizyna opisali Wu i Wu w 1988 roku. Sprzęganie asialofetuiny z polilizyną prowadzono przez wiązanie za pomocą mostków dwusiarczkowych po zmodyfikowaniu związkiem bifunkcyjnym SPDP (Phamacia). Roztwór 100 mg (2,2 pmoli) asialofetuiny (Sigma) w 2 ml 100 mM HEPES pH 7,9 poddano filtracji na żelu na kolumnie Sephadex G-25. Do uzyskanych 4 ml roztworu dodano, mieszając intensywnie, 330 μΐ 15 mM roztworu SPDP w etanolu (5,0 μτηοΐι). 1 godzinę później w temperaturze otoczenia, przeprowadzono oczyszczanie za pomocą następnej filtracji na żelu na kolumnie Sephadex G-25; dało to 5 ml roztworu 1,4 pmolowego asialofetuiny, zmodyfikowanej 2,5 pmolami linkera ditiopirydynowego
Koniugaty otrzymano przez zmieszanie 1,4 pmola asialofetuiny w 5 ml 100 mM HEPES pH 7,9 z 0,33 pmolami zmodyfikowanej pL290 (zawierającej 1,07 pmola grup merkaptopropionianowych; ten sam proces używany był do otrzymania koniugatów transferyny) w 6,5 ml 200 mM HEPES pH 7,6, w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 24 godziny w temperaturze otoczenia. Koniugaty wyizolowano z mieszaniny reakcyjnej metodą chromatografii kationowymiennej (Pharmacia kolumna Mono S HR 10/10, wymywanie gradientem, bufor A: 50 mM HEPES pH 7,9, bufor B. bufor A plus 3 M NaCl, a przed naniesieniem na kolumnę dodano chlorku sodu do otrzymania końcowego stężenia soli 0,6 M Frakcje zawierające produkt wymywały się przy stężeniu soli około 1,5. Dializa wobec HBS dała koniugat zawierający 0,52 pmola asialofetuiny zmodyfikowanej 0,24 pmola pL290.
180 304
e) Transfekcja komórek HepG2 kompleksami pRSVL-DNA
Komórki HepG2 hodowano w podłożu DMEM, z dodatkiem 10% FCS, penicyliny w ilości 1001.U./ml, streptomycyny w ilości 100 pg/ml 12mM glutaminy w butelkach T25. Transfekcję prowadzono przy gęstości 400000 komórek na butelkę. Przed transfekcją komórki przemywano 4 ml świeżego podłoża zawierającego 10% FCS. Bezpośrednio przed transfekcją dodano chlorchiny (Sigma) tak, że stężenie końcowe w zawiesinie komórek (plus roztwór DNA) wynosiło 100 μΜ.
pg pRSVL-DNA w 330 μΐ HBS zmieszano z określonymi na fig 7 ilościami koniugatu TfpLl 90B (TfpL), koniugatu asialofetuiny pL90 (AFpL), polilizyny 290 (pL) lub koniugatu peptyd tetragalaktoza-polilizyna (gal4pL) w 170 pl HBS. W doświadczeniach współzawodnictwa, po 30 minutach dodano 240 pg asialofetiuny ((gal)4pL + AF) lub 30 pg laktozylowanego peptydu (gal)4pL + (gal)4). Mieszaninę dodano do komórek, komórki inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C i podłoże do transfekcji zastąpiono 4 ml świeżego podłoża DMEM zawierającego 10% FCS. Po 24 godzinach zebrano komórki i badano w teście na aktywność lucyferazy. Wartości podane na fig. 7 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach. Jak wynika z rysunku, pL i TfpL wykazują niewielką aktywność lucyferazy; (gal)4pL wykazuje aktywność tak wysokąjak AfpL; (gal)4 lub Af współzawodniczą o receptor asialoglikoproteiny i zgodnie z przewidywaniami zaniżają wartości.
f) Transfekcja komórek HepG2 kompleksami pcMVL-DNA
Komórki HepG2 hodowano na płytkach Petriego o średnicy 6 cm do gęstości 300000 komórek na płytkę, tak jak opisano w e). Przed transfekcją komórki przemywano 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS.
pgpCMVL-DNA w HBS zmieszano z podanymi na fig. 8 ilościami koniugatu TfpLl OB (TfpL), koniugatu asialofetuiny-pL (AfpL), polilizyny 290 (pLys290) lub koniugatu (gal)4pLl lub (gal)4pL2 w 170 μΐ HBS. Po 30 minutach do każdego kompleksu DNA-koniugat dodano 1 ml DMAEM zawierającego 2% FCS i 50 μΐ roztworu wyjściowego adenowirusa d 1312. W doświadczeniach współzawodnictwa, dodano 30 pg laktozylowanego peptydu (gal)4pL ((gal)4pLl + (gal)4) lub (gal)4pL2 + (gal)4), jak wyszczególniono. Mieszaninę dodano do komórek, komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, po czym dodano 1,5 ml podłoża, zawierającego 10% FCS. Po 2 godzinach podłoże do transfekcji zastąpiono 4 ml świeżego podłoża DMEM zawierającego 10% FCS. Po 24 godzinach komórki zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości podane na fig. 8 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach. pLys290 wykazuje działanie, (gal)4pL wykazuje silniejsze działanie, a dodatek (gal)4, który współzawodniczy o receptor asialoglikoproteiny, zmniejsza wartość otrzymaną dla polilizyny.
g) Transfekcja komórek TIB73 kompleksami pCMVL-DNA
Komórki z linii komórkowej mysich hembrionalnych komórek wątroby ATCC TIB73 (BNL CL.2; Patek i wsp., 1978) hodowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 w „wysokoglukozowym” podłożu DMEM (0,4% glukozy), z dodatkiem 10% inaktywowanej ciepłem FCS, penicyliny w ilości 100 I.U./ml, streptomycyny w ilości 100 pg/ml i 2 mM glutaminy na płytkach Petriego o średnicy 6 cm.
Transfekcję prowadzono przy gęstości 300000 komórek na płytkę. Przed transfekcja, komórki przemywano 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS.
6' pg pCMVL-DNA w 300 μΐ HBS mieszano z określonymi ilościami koniugatu mysia transferyna-polilizyna290 (mTfpL), koniugatu asialofetuina-pL (AFpL), pohhzyny290 (pLys290) lub (gal)4pLl lub (gal)4pL2 w 170 μΐ HBS. Po 30 minutach do każdego kompleksu DNA-koniugat dodawano 1 ml DMAEM zawierającego 2% FCS i 50 μΐ roztworu wyjściowego adenowirusa d!312. Mieszaninę dodano do komórek, komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C i dodano ł ,5 ml podłoża, zawierającego 10% FCS. Po 2 godzinach podłoże do transfekcji zastąpiono 4 ml świeżego podłoża DMEM. Po 24 godzinach komórki zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości podane na rysunku 9B przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
180 304
Jako porównanie przeprowadzono transfekcję bez adenowirusa w obecności chlorchiny; transfekcję prowadzono przy gęstości 300000 komórek na płytkę. Przed transfekcją, komórki przemywano 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS. Bezpośrednio przed transfekcjądodano chlorchiny (Sigma) tak, że stężenie końcowe w zawiesinie komórek (plus roztwór DNA) wynosiło 100 μΜ. 6 pg pCMVL-DNA w 300 μΐ HBS mieszano z określonymi ilościami mTfpL, AFpL, pLys290, (gal)4pLl lub (gal)4pL2 w 170 μΐ HBS. Po 30 minutach do komórek dodano kompleksów DNA. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C i dodano l ,5 ml podłoża, zawierającego 10% FCS i 100 μΜ chlorchiny. Po 2 godzinach podłoże do transfekcji zastąpiono 4 ml świeżego podłoża DMEM. Po 24 godzinach komórki zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości uzyskane w testach aktywności lucyferazy przedstawiono na fig. 9 A.
Przykład 7 - Wprowadzenie DNA do limfocytów T.
a) Wytwarzanie koniugatów anty CD7-polilizynal90
Roztwór 1,3 mg przeciwciał anty CD7 (Immunotech) w 50 mM HEPES pH 7,9 mieszano z 49 μΐ 1 mM etanolowego roztworu SPDP (Pharmacia). Po 1 godzinie utrzymywania w temperaturze pokojowej mieszaninę filtrowano na kolumnie żelowej Sephadex G-25 (eluent 50 mM bufor HEPES pH 7,9) i otrzymano 1,19 mg (7,5 nmoli) antyCD7, zmodyfikowanego 33 nmolami grup pirydyloditiopropionianowych. Poli(L)lizynęl90, znaczoną fluorescencyjnie za pomocą FITC, analogicznie zmodyfikowano za pomocą SPDP i doprowadzono do postaci zmodyfikowanej z wolnymi grupami merkaptanowymi działając na nie ditiotreitolem i filtrując na żelu. Roztwór 11 nmoli pohlizynyl90, zmodyfikowanej 35 nmolami grup merkaptanowych, w 0,2 ml 30 mM buforu octanowego mieszano ze zmodyfikowanymi antyCD7 (w 0,5 ml 300 mM HEPES pH 7,9) w warunkach beztlenowych i pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Stężenie soli doprowadzono do 0,6 M dodając 5 M NaCl. Koniugaty wyizolowano za pomocą chromatografii jonowymiennej (Pharmacia kolumna Mono S, 50 mM HEPES pH 7,3, wymywanie gradientem soli, 0,6 M do 3M NaCl); po dializie wobec 10 mM HEPES pH 7,3, zebrano odpowiednie frakcje koniugatów zawierające 0,51 mg (3,2 nmoli) przeciwciał antyCD7, zmodyfikowanych 6,2 nmolami polilizyny 190.
b) Otrzymanie koniugatów gpl20-polilizynal90
Sprzęganie prowadzono metodą znaną w literaturze za pomocą wiązań tioeterowych po zmodyfikowaniu estrem N-hydroksysukcynimidowym kwasu maleimidokapronowego (EMCS, Sigma) (Fujiwara i wsp., 1981)
Połączone tioeterem koniugaty gpl20-polilizynal90:
Roztwór 2 mg zrekombmowanego gp!20 w 0,5 ml 100 mM HEPES pH 7,9 mieszano z 17 μΐ 10 mM roztworu ECMS w dimetyloformamidzie. Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej, przeprowadzono filtrację na żelu w kolumnie Sephadex G-25 (eluent 100 mM buforu HEPES pH 7,9). Otrzymany roztwór (1,2 ml) natychmiast poddano reakcji w warunkach beztlenowych z roztworem 9,3 nmola polilizyny 190, znaczonej fluorescencyjnie i zmodyfikowanej 30 nmolami grup merkaptanowych (w 90 μΐ 30 mM octanu sodu pH 5,0) i pozostawiano na noc w temperaturze pokojowej. Stężenie soli doprowadzono do 0,6 M dodając 5 M NaCl. Koniugaty wyizolowano za pomocą chromatografii i jonowymiennej (Pharmacia, kolumna Mono S, 50 mM HEPES pH 7,3, wymywanie gradientem soli, 0,6 M do 3M NaCl); po rozdzieleniu na frakcje i dializie wobec 25 mM HEPES pH 7,3, otrzymano 3 frakcje koniugatu A, B, C, zawierające 0,40 mg rgp!20 zmodyfikowanego 1,9 nmolami polilizynyl 90 (w przypadku frakcji A), 0,25 mg rgpl20 zmodyfikowanego 2,5 nmolami polilizyny 190 (w przypadku frakcji B), 0,1 mg rgpl20 zmodyfikowanego 1,6 nmolami pohlizynyl90 (w przypadku frakcji C).
pCMVL-DNA (6 pg/próbkę) skompleksowano z określonymi ilościami polihzyny90 lub określonymi ilościami koniugatów polilizyny w 500 μΐ HBS. W międzyczasie, przygotowano próbki komórek H9 (106 komórek w 5 ml RPMI z 2% FCS) lub pierwotnych ludzkich limfocytów (3 χ 106 komórek w podłożu Dulbecco w modyfikacji Iscove (IMDM) plus 2% FCS). Do każdej próbki komórek dodano kompleksów pohlizyna-DNA. 5 minut później dodano określonych ilości adenowirusa d!312. Komórki inkubowano 1,5 godziny w temperaturze 37°C i do każdej próbki komórek dodano 15 ml RPMI (w przypadku komórek H9) lub IMDM (w przypadku pierwotnych limfocytów) plus 20% FCS. Komórki inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C,
180 304 zabrano i potraktowano tak jak w innych przykładach w celu określenia aktywności lucyferazy Wyniki przeprowadzonych testów przedstawiono na fig. 10A (komórki H9) i 10B (limfocyty pierwotne): w komórkach H9 koniugat antyCD7 (fig. 10A, ścieżki 7 do 9) i koniugat gp!20 (ścieżki 10 do 12) wykazują najlepsze wyniki biorąc pod uwagę przenoszenie genów za pomocą adenowirusa, natomiast za pomocą koniugatu gp!20 uzyskano ekspresję genu lucyferazy nawet bez adenowirusa. Warto także zauważyć, że w przeprowadzonych testach tylko koniugat gpl20 ma zdolność wprowadzania DNA do pierwotnych limfocytów i tylko w obecności defektywnego adenowirusa (fig. 10B, ścieżki 7 i 8).
Przykład 8 - Inaktywacja adenowirusa
a) Inaktywacja UV
Preparaty adenowirusa dl312, otrzymane i przechowywane tak, jak opisano we wprowadzeniu do przykładów, umieszczono w studzienkach o średnicy 2 cm na płytce do hodowli komórkowych (300 μΐ na studzienkę) na lodzie w odległości 8 cm od 2 lamp UV (lampy Philips TUV15 (G15 T8)). Wirusa eksponowano na promieniowanie UV przez czas określony na fig. 11A i próbki każdego preparatu badano pod kątem miana wirusa i określenia czy i w jakim stopniu wirusy są zdolne zwiększać przenoszenie genów z koniugatami polilizyna-transferyna do komórek HeLa.
Hodowlę komórek i transfekcję prowadzono dokładnie tak, jak opisano powyżej w części „Komórki i podłoża”; składniki użyte do transfekcji przedstawione sąna fig. 11 A. Przygotowano kompleksy pCMVL-DNA i12pgTfpLw500plHBSidodanodo3x 105 komórek HeLa (w 1 ml DMEM plus 2% FCS). Po około 5 minutach, do każdej hodowli dodano 54 μΐ każdego preparatu wirusa i hodowle inkubowano w temperaturze 37°C przez 1,5 do 2 godzin. Następnie do każdej hodowli dodano 5 ml DMEM plus 10% FCS i kontynuowano inkubację przez 24 godziny w temperaturze 37°C, następnie komórki zebrano i określono aktywność lucyferazy. 54 μΐ nienapromienionego wirusa nie jest ilością wysycającą to znaczy test jest czuły na co najmniej trzy większe ilości wirusa. Wyniki ekspresji lucyferazy przedstawiono na fig. 11B (prostokąty zacienione). Miano wirusa w każdym preparacie określono używając linii komórkowej 293 komplementującej Ela. Seryjne rozcieńczenia nienapromieniowanych i napromieniowanych próbek wirusa przygotowano w DMEM plus 2% FCS. Równolegle, przygotowano próbki 5 χ 104 komórek 293 (w 2 cm studzienkach) w 200 μΐ DMEM plus 2% FCS. W każdej studzience umieszczono 5 pl każdego rozcieńczenia. W celu umożliwienia wirusom związania się z komórkami, komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1,5 godziny. Następnie do każdej studzienki dodano 2 ml DMEM plus 10% FCS. 48 godzin później hodowle zbadano w celu określenia efektów cytopatologicznych. Rozcieńczenie wirusa, powyżej którego mniej niż 50% komórek w hodowli wykazywało znaczący efekt cytopatologiczny po 48 godzinach wskazuje względną ilość zakaźnego wirusa w preparatach wirusowych. Uzyskane rezultaty przedstawione sąna fig. 11B (puste prostokąty). Wyniki testów przeprowadzonych w tym przykładzie wykazują że wynikający z napromienienia UV spadek miana wirusa o 4 rzędy wielkości powoduje jedynie 20-krotne zmniejszenie przenoszenia genu lucyferazy. Wynika z tego, że można zniszczyć kluczowe mechanizmy niezbędne dla zakaźności wirusa bez wpływu na zdolność wirusa do zwiększania przenoszenia genów.
Stwierdzono, że przy niższych dawkach wirusa zwiększanie przenoszenia genów lekko spada (fig. HA, ścieżki 3 do 6), a efekttenjest wyraźniejszy przy wyższych dawkach (ścieżki 7 do 10).
b) Inaktywacja adenowirusa formaldehydem ml preparatu adenowirusa przepuszczano przez 10 ml kolumnę G25 (Pharmacia Sephadex G-25, PD 10), zrównoważoną wcześniej 150 mM NaCl, 25 mM HEPES pH 7,9. 10% gliceryny i pobrano próbkę 2,5 ml. Próbki przefiltrowanego na żelu preparatu wirusa inkubowano bez formaldehydu (0) i z 0,01 %, 0,1%, 1 % formaldehydu przez 20 minut na lodzie Następnie dodano Tns pH 7,4 do otrzymania stężenia 100 mM i poddano próbki dializie najpierw przez 2 godziny wobec 1 litra 150 mM NaCl, 50 mM Tns pH 7,4 i 50% gliceryny, a następnie przez noc wobec 2 χ 1 litr mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,9 i 50% gliceryny.
180 304
Próbki wirusa badano na miano w komórkach 293 (test oznaczania CPE lub test łysinkowy, Precious i Russel, 1985). Następnie określano wpływ wirusów traktowanych formaldehydem na przenoszenie genów do komórek HeLa (300000) tak jak w poprzednich przykładach, mierząc aktywność lucyferazy. 90 μΐ preparatu wirusa dało przeniesienie DNA odpowiadające więcej niż 108jednostek światła. Traktowanie wirusa 0,01%, 0,1% formaldehydem spowodowało niewielkie zmniejszenie przenoszenia genu (około dziesięciokrotne zmniejszenie przy 0,1%). Chociaż traktowanie 1% formaldehydem powodowało uderzającą utratę zdolności przenoszenia genu, 90μ1 wirusa ciągle było zdolne do ekspresji genu odpowiadającej 104 jednostek światła.
Traktowanie 0,1% formaldehydem i zmniejszenie miana wirusa do 105 PFU (jednostek łysinkotwórczych) związane jest ze zmniejszeniem aktywności lucyferazy tylko o 10%. Wyniki testu przedstawiono na fig. 12A.
c) Inaktywacja adenowirusa UV o dużej długości fali + działaniem 8-metoksypsolarenu
Próbki oczyszczonego adenowirusa doprowadzono do stężenia 0,33 pg/μΐ 8 - m e t o ksypsolarenu (wyj ściowe stężenie 3 3 pg/μΐ 8-metoksypsolarenu w DMSO) i eksponowano na promieniowanie UV o długości fali 365 nm (lampa UVP model TL 33) na lodzie, w odległości 4 cm filtra lampy. Ekspozycja na UV trwała 15-30 minut, jak wskazano na rysunku. Próbki wirusa przepuszczano przez kolumnę Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10), zrównoważoną HBS plus 40% gliceryny i przechowywano w temperaturze -70°C.
Następnie badano preparaty wirusa na aktywność w zwiększaniu dostarczania koniugatów pCMVL/hTfpL do komórek HeLa (wyrażoną w jednostkach światła aktywności lucyferazy, prawa oś, fig. 12B) lub zdolność replikacji w komórkach 293 (miano wirusa, lewa oś, fig. 12B).
W przykładach, które teraz nastąpią ilustrujących wzrost internalizacji kompleksów transferyna-polilizyna-DNA dzięki retrowirusom, użyto następujących materiałów i metod.
Koniugaty transferyna-polilizyna 190 i kompleksy koniugat-DNA otrzymano analogicznie jak w poprzednich przykładach.
Komórki NIH3T3 hodowano w podłożu DMEM, z dodatkiem 10% FCS, 1001.U./ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy. 18 do 24 godzin przed transfekcją5 do 7 x 105 komórek wysiewano na płytki T25. Bezpośrednio przed transfekcją, komórki umieszczano w świeżym podłożu i dodawano różnych składników używanych do transfekcji w następującej kolejności: Chiorchiny (100 μΜ, gdzie zaznaczono), kompleksu transferynapolilizyna-DNA i preparatu retrowirusa. Następnie komórki inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C i zmieniono podłoże, a komórki zbierano 24 godziny później. Ekstrakty przygotowywano metodą cyklicznego zamrażania i rozmrażania i w próbce ekstraktu standaryzowanej na zawartość białka, określano aktywność lucyferazy, tak jak to opisano w poprzednich przykładach.
Przykład 9 - Transfekcja komórek NIH3T3 wirusem Moloneya.
W opisanych warunkach, prowadzono transfekcję 106 komórek NIH3T3 kompleksem TfpL-DNA w obecności 100 μΜ chiorchiny lub bez chiorchiny, tak jak pokazano na fig. 13. Stwierdzono, że bez chiorchiny poziom aktywności lucyferazy utrzymuje się na poziomie tła (ścieżka 1), podczas gdy w obecności chiorchiny uzyskano wysoki poziom ekspresji genu reporterowego pRSVL (ścieżka 2). Wzrastające ilości wirusa leukemii Moloneya (oznaczone na rysunku RVS), które dodawano do komórek w tym samym czasie jako kompleksy DNA, zwiększały ekspresję genu lucyferazy.
Przykład 10 - Badanie, czy efekt przenoszenia genów w czasie transfekcji komórek NIH3T3 kompleksem transferyna-pohlizyna-DNA można przypisać obecności wirusa Moloneya
Preparat wirusa użyty w przykładzie 9 był surowym niefrakcjonowanym nadsączem z komórek wytwarzających retrowirusa. W celu stwierdzenia, czy zwiększenie przenoszenia DNA uzyskane za pomocą preparatów wirusa można rzeczywiście przypisać obecności wirusa, nadsącz poddano procesowi oczyszczania przez dializę/zatęzanie, opisanemu powyżej. Nadsącz retrowirusa (oznaczony jako RVS na rysunku) zatężono 10 razy. Jeżeli retro wirus jest odpowiedzialny na zwiększenie przenoszenia genów, aktywność zatrzymana przez błonę, niezależnie od inaktywacji wyjątkowo niestabilnego retrowirusa w czasie zatęzania, powinna być około 10 razy większa niż wyjściowego nadsączu. Podobnie jak w poprzednim przykładzie
180 304
106 komórek NIH3T3 transfekowano w warunkach przedstawionych na fig. 14. Fig. 14 pokazuje, że efekt zwiększenia przenoszenia genów jest obecny także w retentacie na błonie (użyto 20 do 600 μΐ, ścieżki 3 do 6). Stwierdzono także, że 2001600 μΐ 10-krotme zatężonego preparatu jest tylko dwa razy mniej aktywne niż 2 lub 6 ml oryginalnego mezatężonego preparatu retrowirusa (ścieżki 7 i 8). Równoległe testy przeprowadzono dla ludzkich komórek K562, nie mających receptorów dla ekotropowych mysich retrowirusów. Zgodnie z przewidywaniami, nie stwierdzono wzrostu ekspresji genu.
Przykład 11 - Wzajemne oddziaływanie pomiędzy transferyną i jej receptorem gra rolę w efekcie przenoszenia genów przez wirus Moloneya
W celu stwierdzenia, czy istnieje możliwość, że przenoszenie kompleksów TfpL/pRSVL do komórek można przypisać niespecyficznemu wiązaniu polilizyny z retrowirusem i w celu wyjaśnienia mechanizmu wnikania, sprawdzono czy retrowirus ma zdolność przenoszenia do komórek plazmidowego DNA, skompleksowanego tylko z polilizyną. Ilość użytej polilizyny odpowiada określonej wcześniej ilości optymalnej, która powoduje całkowitą kondensację plazmidowego DNA i jest podobna do ilości polilizyny używanej do przenoszenia koniugatów transferyna-polilizyna (Wagner i wsp., 1991). Badania, których wyniki przedstawiono na fig. 15, wykazują, że gen reporterowy, w nieobecności chlorochiny, nie ulega ekspresji ani w postaci kompleksów TfpL-RSVL, ani w postaci kompleksów pL-RSVL (ścieżki 1 i 2). W obecności retrowirusa reporterowy DNA ulega ekspresji, gdy jest podawany w formie kompleksu TfpL, natomiast w formie pL-DNA nie ulega ekspresji (ścieżki 3 i 4 razem ze ścieżkami 5 16). Ponadto przeprowadzone testy wykazały, że obecność nadmiaru wolnej transferyny powoduje zmniejszenie przenoszenia DNA ułatwionego przez retrowirusy (ścieżki 7 i 8). Wyniki te potwierdzają przepuszczenie, ze wzajemne oddziaływanie pomiędzy transferyną i jej receptorem gra istotną rolę w zwiększaniu wychwytu DNA z udziałem retrowirusa.
Przykład 12 - Wpływ pH na efekt przenoszenia genów przez retrowirusy
Przeprowadzone w tym przykładzie doświadczenia wykonano w celu sprawdzenia, czy pH ma wpływ na zdolność retrowirusów do zwiększania przenoszenia genów. Transfekcję prowadzono tak, jak w poprzednich przykładach. Użyto dwóch dobrze znanych inhibitorów zmniejszenia pH endosomów, monesnyny i chlorku amonowego. Wyniki doświadczeń pokazano na fig. 16. Zbadano wpływ dwóch substancji na przenoszenie TfpL-DNA i stwierdzono, że żadna z nich nie może zastąpić działania chlorchiny. Jednakże, stwierdzono niewielki wzrost ekspresji lucyferazy przy wyższych stężeniach chlorku amonowego (ścieżki 1 do 5). Sam retrowirus wykazuje niewielki zwiększenie przenoszenia DNA, jak obserwowano w poprzednich przykładach (ścieżka 6). Gwałtowny wzrost zaobserwowano, gdy użyto retrowirusa w obecności 1 μΜ monensyny (ścieżka 7). Słabsze działanie zaobserwowano przy wyższych stężeniach monensyny (ścieżka 8) i w obecności chlorku amonowego (ścieżka 9 i 10).
Przykład 13 - Zwiększenie przenoszenia genów przez koniugaty transferyny uzyskane za pomocą N-końcowego peptydu ednosomolitycznego hemaglutyniny HA2 grypy
a) Synteza peptydu
Peptyd o sekwencji ID SEK. Nr : 1 G1 y - L e u - Phe-G 1 u-AI a-11 eA1 a - Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys, otrzymano metodą Fmoc z fluorenylometoksykarbonyloem) (Atherton i wsp., 1979), przy użyciu syntezatora peptydów Applied Biosystem 431 A. Grupami ochronnymi łańcuchów bocznych były' grupa t-butylowa dla Cys, Glu i Asp i grupa tnfenylometylowa dla Asn. Test ninhydrynowy przeprowadzony po reakcji sprzęgania, wykazał sprzęganie w każdym etapie na poziomie >98% Podwójne sprzęganie prowadzono od 19 aminokwasu. N-końcowe grupy Fmoc usunięto z części żywicy peptydowej 20% piperydyną w NMP (N-metyłopirolidynie). Następnie frakcje chronione Fmoc i frakcje niechronione przemywano DCM (dichlorometanem) i suszono pod obniżonym ciśnieniem. Otrzymano 294 mg żywicy peptydowej bez Fmoc i 367 mg żywicy peptydowej chronionej Fmoc. 111 mg żywicy z peptydem bez Fmoc poddano cięciu kwasem tnfluorooctowym przez 1,5 godziny używając mieszaniny 10 ml TFA, 0,75 g fenolu, 300 μΐ EDT (etanoditiol), 250 μΐ Et-S-Me (etylometylosulfid) i 500 μ] wody. Peptyd odfiltrowano od żywicy
180 304 przez filtr ze szkła spiekanego. Żywicę przemyto DCM i dodano do przesączu. Przesącz zatężono do około 2 ml i wkroplono stale mieszając do 40 ml eteru. Wytrącony peptyd odwirowano, a eterowy nadsącz odrzucano. Precypitat przemyto trzy razy 40 ml eteru i wysuszono pod obniżonym ciśnieniem. Otrzymano 58 mg surowego produktu, który rozpuszczono w 3,5 ml 20 mM NH4HCO3, zawierającego 300 μΐ 25% NH3/1. Roztwór filtrowano na żelu używając tego samego buforu na kolumnie Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10). Cały materiał naniesiono na kolumnę Mono Q (Pharmacia 100 x 14 mm) gradient: 0-10 minut 100% A, 10-100 minut 0-100% B. A:20mM NH4HCO3 + 300 μΐ NH3/1. B: A + 3 M Nad. Pomiary przy 280 nm, wykrywanie fluorescencji Trp przy 354 nm. Szybkość przepływu 1 ml/minutę. Produkt wymywano przy 1 MNaCl. Główną frakcję kolumny Mono Q, oczyszczano dalej metodąHPLC z odwróconymi fazami na kolumnie BIORAD-Hi-Pore RP 304 (250 x 10 mm) (gradient 50 do 100% bufor B w 12,5 minuty, 12,5 do 25 minut 100% B. A: 20 mM NH4HCO3 + 300 μΐ NH3/1. B: A w 98% metanolu. Szybkość przepływu 3 ml/minutę. Pomiary przy 273 nm). Produkt wymywano pizy 100% B. Frakcje zawierające produkt odparowano w Speedvac, rozpuszczono w buforze A i wreszcie liofilizowano. Otrzymano 8,4 mg oczyszczonego za pomocą HPLC produktu w postaci z chronionymi cysternami. Peptyd ten oznaczono P16. W celu otrzymania P16 w postaci z wolnymi grupami merkaptanowymi chronionąt-butylem substancję traktowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej mieszaniną tioanizolu/etanoditiolu/kwasu tnfluorooctowego/kwasu trifluorometanosulfonowego (2/1/40/3; kwas trifluorometanosulfonowy dodano w określonej ilości po innych składnikach). Peptyd wyizolowano przez precypitację z eteru i filtrację na żelu (Sephadex G-25) używając wspomnianego wcześniej buforu A w atmosferze argonu.
b) Sprzęganie peptydu grypy z polilizyną bl) Wiązanie bezpośrednie za pomocą SPDP (sukcynimidylopirydylo-ditiopropionian)
19,8 mg bromowodorku polilizyny 300 (Sigma) filtrowano na żelu na kolumnie Sephadex G-25 (Pharmacia, PD-10) w octanie sodu pH 5 w celu wyeliminowania frakcji niskocząsteczkowych. Stężenie pL po filtracji na żelu, określone testem ninhydrynowym, wynosiło 3,16 mg/ml. pH roztworu doprowadzono do 7-8 za pomocą 1 M NaOH. 0,64 pmola SPDP (Pharmacia: 40 mM roztwór w absolutnym EtOH) dodano do 2,5 ml roztworu pL (7,9 mg pL = 0,13 pmoli). Odpowiada to stosunkowi molowemu SPDP:pL 5:1. Mieszaninę pozostawiono w celu przereagowania na noc i przefiltrowano na żelu na kolumnie G-25 w 20 mM NH4HCO3 pH 8,2. Po redukcji 1 próbki przesączu DTT (ditiotreitol) oznaczenie triopirydonu wykazało, ze reakcja zaszła całkowicie. 0,3 pmola pL zmodyfikowanego PDP (w oparciu o pmole PDP) w 2,2 ml pozostawiono w celu przereagowania z 0,35 pmola peptydu w formie tiolowej. Biały osad, który powstał po zmieszaniu peptydu i pL, rozpuścił się po doprowadzeniu roztworu do zawartości 2 M chlorowodorku guanidyniowego i reakcję prowadzono przez noc. Fotometryczny pomiar tiopirydonu w mieszaninie reakcyjnej znów potwierdził, że reakcja zaszła całkowicie. Następnie mieszaninę dializowano dwukrotnie wobec 2 litrów 20 mM HEPES/0,5 M chlorowodorku guanidyniowego. Powstający roztwór wprowadzono do kolumny Mono S (Pharmacia, 0,7 x 6 cm) (gradient: 0-20 minut 100% A, 20-140 minut 0-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3/0,5 M chlorowodorku guanidyniowego B: 20 mM HEPES pH 7,3/3 M chlorowodorku guanidyniowego, 0,3 ml/minutę. Pomiary przy 280 nm, wykrywanie fluorescencji przy 354 nm, wzbudzenie 280 nm). Frakcję zawierającą produkt, którą wymywa się przy 1,5 M chlorowodorku guamcyny, dializowano wobec 2 litrów HBS. Określenie stężenia pL testem ninhydrynowym wykazało stężenie około 1,14 mg/ml. Ilość peptydu w roztworze koniugatu obliczono z absorpcji przy 280 nm; i otrzymano stosunek molowy peptyd: pL 4:1.
b2) Wiązanie za pomocą glikolu polietylenowego
14,6 mg bromowodorku pL 300 (Sigma) filtrowano na żelu tak, jak opisano w b 1) Stężenie pL po filtracji na żelu, określone testem ninhydrynowym, wynosiło 4,93 mg/ml. pH roztworu doprowadzono do 7-8 za pomocą 1M NaOH. 4,33 pmola PDP (Pharmacia: 30 mM roztwór w absolutnym EtOH) dodano do 2,7 ml roztworu pL (13,3 mg pL = 0,22 pmoli). Odpowiada to stosunkowi molowemu PDP: pL 20:1. Po 1,5 godzinie mieszaninę reakcyjną przefiltrowano na żelu na kolumnie Sephadex G-25 w 0,1 M octanie sodowym/3M chlorowodorku guanidyniowego. Po redukcji 1 próbki przesączu DTT, oznaczenie tiopirydonu wykazało, ze
180 304 frakcja zawierająca produkt zawiera 3,62 pmola PDP. pL zmodyfikowaną PDP zredukowano dodając do roztworu 79 mg DTT. Po 2 godzinach redukcji roztwór ponownie filtrowano na kolumnie G-25, w opisanych warunkach. Pomiar tiolu za pomocą testu Ellmana wykazał stężenie 3,15 pmola w 2,224 ml.
17,6 mg = 5 pmola POE (polioksyetyleno-bis (6-aminoheksyl), Sigma) rozpuszczono w 500 pl 20 mM NaHCO3/3M chlorowodorku guamdyniowego pH 7-8 i poddano reakcji z 13,8 mg EMCS (ester N-hydroksysukcyimidowy kwasu 6-maleimidokapronowego) (Sigma) (= 44,7 pmola), rozpuszczonego w 300 pl DMF (dimetyloformamid). Po 30 minutach mieszaninę reakcyjnąprzefiltrowano na żelu na kolumnie G-25 (20 mM NaHCO3/3M chlorowodorku guanidyniowego). Fotometryczny pomiar grup maleidowych przy 300 nm wykazał stężenie 6,36 pmola przereagowanego EMCS w 2 ml roztworu.
1,39 pmola peptydu w formie tiolowej w 2,5 ml 20 mM NaHCO3/3M chlorowodorku guanidyniowego wkroplono do 1,05 ml tego roztworu (odpowiadającego 3,34 pmola EMCS) stale intensywnie mieszając w atmosferze argonu. Po 15 minutach, za pomocą testu Ellmana, nie można było wykryć wolnych grup dołowych.
pH roztworu zredukowanej, zmodyfikowanej grupami merkaptanowymi pL doprowadzono do 7-8 za pomocą 1M NaOH. 1,37 ml tego roztworu dodano do powyższej mieszaniny reakcyjnej stale intensywnie mieszając za pomocą Vortexu. Odpowiada to stosunkowi molowemu peptydSH:POE-EMCS:pL.SH 1:2,4:1,4 (w oparciu o EMCS i SH). Po 2,5 godzinie, za pomocą testu Ellmana, nie można było wykryć wolnych trup tiolowych. Następnie mieszaninę dializowano przez noc wobec 2 litrów 20 mM HEPES pH 7,3/0,6 M NaCl i wprowadzono do kolumny Mono S (gradient: 0-20 minut 22% A, 20-150 minut 22-100% B. A: 20 mM HEPES pH 7,3, B: A + 3M NaCl. Szybkość przepływu 0,3 ml/minutę. Pomiary UV prowadzono przy 280 nm, a wykrywanie fluorescencji przy 354 nm). Produkt, który wymywano przy 1,5 M do 1,6 M NaCl, dializowano wobec 2 litrów HBS. Określenie stężenia pL testem ninhydrynowym i fotometryczne określenie ilości peptydu przy 280 nm, pozwoliło obliczyć stosunekpL 12:1, przy stężeniu pL wynoszącym 0,49 mg/ml w całkowitej objętości płynu 4,5 ml.
c) Otrzymywanie liposomów
Liposomy otrzymano metodąREV („odparowanie z odwróconej fazy”) (Szoka i Papahadjopoulos, 1978; Straubmger i Papahadjopoulos, 1983); fazę wodną 10 mM HEPES pH 7,3, 100 mM kałceina, 150 mM NaCl; fazę organiczną: roztwór 300 pmol L-a-łecytyny (z żółtka jaja, głównie palmitoilooleilofosfatydylocholina; Avanti Polar Lipids) w 260 μΐ chloroformu odparowano przy użyciu wyparki rotacyjnej. Następnie materiał wysuszono pod obniżonym ciśnieniem i ponownie rozpuszczono w 3 ml eteru etylowego. 1 ml fazy wodnej dokładnie przemywano fazą eterową przy użyciu wytrząsarki i działano ultradźwiękami przez 5 minut w temperaturze 0°C w sonifikatorze (typu łaźniowego). Po 30 minutach w lodzie materiał ponownie poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut. Powstającąstabilnąemulsję powoli odparowano w wyparce rotacyjnej. Następnie usunięto eter etylowy pod ciśnieniem 10 kPa i dodano 0,75 ml fazy wodnej. Śladowe ilości eteru etylowego usunięto przez dalsze odparowanie pod ciśnieniem 5 kPa przez 30 minut. Wytworzoną emulsję (1,7 ml) odwirowano przy 500 obrotach na minutę 1 ml emulsji przeciśnięto przez połiwęglanową błonę (0,1 pm) i otrzymano 0,7 ml roztworu liposomów. Liposomy oddzielono od me wprowadzonego materiału przez chromatografię żelową (Sephadex G-50; Pharmacia; objętość żelu 23 ml, 10 mM HEPES pH 7,3/150 mM NaCl) Zebrano 6 frakcji po 500 pl. Oznaczono fosfor lipidowy metodą Bartletta, 1959, przy 2 mM.
d) Test na wypływ z liposomów
Uwalnianie zawartości liposomów (wypływ) zmierzono, gdy pojawiła się włączona do liposomów kałceina i roztwór, który hamuje gaszenie fluorescencji (Bondeson i wsp., 1984). Fluorescencję kalceiny mierzono w spektrofluorymetrze Kontron SMF 25 (wzbudzenie przy 490 nm, emisja przy 515 nm). W tym celu, 100 μΐ powyższego roztworu liposomów rozcieńczono 100 razy 0,1 M octanem sodowym/50 mM NaCl lub buforem 10 mM HEPES/150 mM NaCl z odpowiednim pH (4,3,4,5, 5,0, 6,0, 7,3) do otrzymania objętości 1 ml. Do tych roztworów dodano 2,5 μΐ peptydu (w postaci chronionej t-butylem; roztwór 1 pg/pl w HBS) w kuwetach, mieszając
180 304 delikatnym strumieniem argonu (stężenie końcowe 400 nM peptydu) Fluorescencję kalceiny mierzono w różnych czasach po dodaniu peptydu. 100% wpływ oznaczono po dodaniu 2 μΐ Tntonu Χ-100 (Fluka).
Tej same procedury użyto do pomiaru fluorescencji kalceiny po dodaniu do roztworu hposomów koniugatów peptyd-pL. 2,5 pg koniugatu (stężenie 1 pg/pl oparte na ilości samej pL) dodano do 1 ml roztworu liposomów (stężenie końcowe 20 nM zmodyfikowanego peptydu). Podobnie, 2,5 pg koniugatu peptyd-polilizyna poddano badaniu na wypływ po inkubacji z 5 pg DNA (15 minut).
Stwierdzono, że sam peptyd powoduje uwolnienie zawartości liposomów w pH kwasowym (fig. 17). Koniugat peptydu był aktywny w zasadniczo niższych pH, a nawet w obojętnym pH obserwowano silną aktywność, którą dalej zwiększono obniżając pH. Skompleksowanie koniugatu z DNA znosi aktywność pH obojętnym, ale w kwasowym pH obserwuje się znaczącą aktywność.
e) Transfekcja komórek K562
Komórki K562 hodowano w zawiesinie w podłożu RPMI 1640 (Gibco BRL plus 2 g wodorowęglanu sodu/1), z dodatkiem 10% FCS, penicyliny w ilości 100 l.U./ml, streptomycyny (100 pg/ml) i 2 mM glutaminy do gęstości 500 000 komórek/ml. 12 do 20 godzin przed transfekcją komórki umieszczono w świeżym podłożu zawierającym 50 pM desferioksyaminy (powoduje to zwiększenie liczby receptorów transferyny). W dniu transfekcji, komórki zebrano, zawieszono w świeżym podłożu zawierającym 10% FCS plus 50 pM desferioksyaminy (250 000 komórek/ml) i 2 ml porcje umieszczono na płytce z 24 studzienkami.
pg pCMVL-DNA w 160 pl HBS zmieszano z określonymi na fig. 18 ilościami koniugatu TfpL lub pL300, w 160 pl HBS. Następnie, po 15 minutach dodano określonych ilości koniugatu peptyd grypy-pL (P16pL) i po następnych 15 minutach mieszaninę dodano do komórek K562. Komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, po czym zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Aktywność lucyferazy określono takjak opisano w poprzednich przykładach. Wartości podane na fig. 18 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
f) Transfekcja komórek HeLa
Komórki HeLa hodowano na płytkach Petriego o średnicy 6 cm takjak opisano w części pt. „Komórki i podłoża”. Transfekcję prowadzono przy gęstości 300 000 komórek na płytkę. Przed transfekcją komórki inkubowano w 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS. 6 pg pCMVL-DNA w 160 μΐ HBS mieszano z określonymi na fig. 19 ilościami koniugatu TfpL lub pL300 lub z mieszaniną obu, w 160 μΐ HBS. Następnie, po 15 minutach dodano określonych ilości koniugatu peptyd grypy-pL (P16pL) i po następnych 15 minutach mieszaninę dodano do komórek K562. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C i dodano 2,5 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS. Komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, po czym zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Aktywność lucyferazy określono takjak opisano w poprzednich przykładach. Wartości podane na fig. 19 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
Przykład 14 - Zwiększenie przenoszenia genów przez koniugaty transferyny uzyskane za pomocą drugiego N-końcowego peptydu ednosomolitycznego hemaglutymny HA2 grypy
Peptyd o sekwencji (ID SEK. Nr : 2) Gly-Leu- Phe-Gly- Ala-Ile- Ala- Gly-Phe-IleGlu-Asn- Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys (oznaczony P41) zsyntetyzowano w ten sam sposób jak peptyd opisany w przykładzie 13, a). Sprzęganie peptydu grypy z pohhzyną (pL300) prowadzono takjak w przykładzie 13, b 1) przez wiązanie za pomocą SPDP. Otrzymano koniugaty (P41pL) ze stosunkiem molowym peptyd:pL 4:1.
b) Transfekcja komórek HeLa komugatami peptydu grypy
Komórki HeLa hodowano w podłużu DMEM, z dodatkiem 5% FCS, 100 I U./ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny 12 mM glutaminy na płytkach Petriego o średnicy 6 cm Transfekcję prowadzono przy gęstości 300 000 komórek na płytkę. Przed transfekcją komórki inkubowano w 1,5 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS
180 304 pg pCMVL-DNA w 160 μΐ HBS (150 mM NaCl), 20 mM HEPES pH 7,3) zmieszano z 6 pg koniugatu TfpL190B w 160plHBS,po 15 minutach dodano 10 pg koniugatu peptyd grypypLP41pL, lub dla porównania, 18 pg koniugatu peptyd grypy-pLP16pL (patrz przykład 13) (fig. 20), określone ilości koniugatów dwóch peptydów zbadano pod kątem optymalnych ilości zwiększających przenoszenia genów. Po następnych 15 minutach mieszaninę dodano do komórek. Komórki inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C i dodano 2 ml podłoża zawierającego 18% FCS. Po 24 godzinach komórki zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości podane na fig. 20 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
Porównawcze testy koniugatów dwóch peptydów wykazały więcej niż 3,5-krotne zwiększenie przenoszenia genów uzyskane z koniugatem peptydu p41pL.
c) Transfekcja komórek BNL CL.2 koniugatami peptyd grypy-polilizyna
Komórki BNL CL.2 hodowano tak, jak opisano w przykładzie 6. Peptyd grypy P41 sprzęgano z polilizyną 300 w stosunku molowym peptydu do polilizyny 1:1, 3:1, 8:1. Do komórek dodano 6 pg kompleksu pCMVL-DNA i 20 pg koniugatów. Do porównania, użyto 20 pg pL300 lub 20 pg koniugatu P16pL, przygotowanego tak, jak pisano w przykładzie 13. Komórki inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C, po czym dodano 2 ml podłoża zawierającego 18% FCS. Po 24 godzinach komórki zebrano do testu na aktywność lucyferazy, którego wyniki przedstawiono na fig. 20B. Zawartość peptydu w koniugatach skorelowano ze zwiększeniem ekspresji genów. Test wypływu z liposomów (fig. 20C), który przeprowadzono tak, jak opisano w przykładzie 13, wykazał, że aktywność koniugatów (przy pH 5, równoważnik 2,5 pg polilizyny) wzrastała wraz z zawartościąw nich peptydu. (Na rysunku P41 oznaczono jako „influ2”).
Przykład 15 - Transfekcja komórek HeLa genem reporterowym β-galaktozydazy i wykazanie m situ ekspresji β-galaktozydazy
a) Hodowla i transfekcja komórek
Do transfekcji, komórki HeLa hodowano w podłożu DMEM, z dodatkiem 5% FCS, penicyliny, streptomycyny i glutaminy, jak opisano w poprzednich przykładach, na szkiełkach nakrywkowych w płytkach Petriego o średnicy 3 cm (3 χ 104 komórek na płytkę).
Do transfekcji, 6 pg konstruktu genu reporterowego β-galaktozydazy (pCMV-β-gal) w 160 pl HBS skompleksowano z 12 pg TfpL90B w 160 pl HBS i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
W innym eksperymencie 6 pg pCMV-β-gał w 160 pl HBS inkubowano z 6 pg TfpL90B w 80 pl HBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, do mieszaniny dodano 12 pg koniugatu peptydu grypy (P16pL), przygotowanego tak, jak w przykładzie 13, w 80 pl HBS i inkubowano mieszaninę przez następne 15 minut. Te kompleksy pohkation-DNA zmieszano z 1 ml DMEM plus 2% FCS, antybiotykami i glutaminą, jak opisano powyżej. W celu wykazania wpływu chlorchiny i adenowirusa na powodzenie transfekcji, w dodatkowych doświadczeniach do podłoża zawierającego kompleksy DNA-polikation dodano chlorchiny do stężenia końcowego 100 pM lub 50 pl roztworu szczepu dl312 adenowirusa.
Do transfekcji, usunięto oryginalne podłoże i zastąpiono je 1 ml podłoża zawierającego kompleksy DNA z lub bez chlorchiny lub adenowirusa Po inkubacji trwającej 2 godziny w temperaturze 37°C do komórek dodano 1 ml DMEM zawierającego 10% FCS, antybiotyki i glutaminę i inkubację kontynuowano przez dalsze 2 godziny. Następnie, usunięto całe podłoże i komórki hodowano w 3 ml świeżego DMEM zawierającego 10% FCS, antybiotyki i glutaminę.
b) test na β-galaktozydazę godzin po transfekcji podłoże usunięto, a komórki przemywano jeden raz roztworem soli buforowanym fosforanami (PBS) i utrwalano przez 5 minut w temperaturze pokojowej 0,5% dialdehydem glutarowym w PBS. Następnie roztwór utrwalający usunięto, a komórki przemywano jeden raz PBS. Następnie, komórki inkubowano od 20 minut do 3 godzin z roztworem barwiącym (10 mM bufor fosforanowy pH 7,0,150mMNaCl, 1 mMMgCl2, 3,3 mM K4Fe(CN) 3H2O, mM K3Fe(CN)6 i 0,2% 5-bromo-4-chloro-3-mdolllo-β-galaktoplranozyd) (Lim i Chae
180 304
1989). Następnie, szkiełka nakrywkowe przemywano PBS, wodą i 96% etanolem, wysuszono i zamocowano w Mowiol na skosach. Do analizy komórek używano mikroskopu Zeiss Axiophot.
Figura 21 przedstawia powiększony (112 razy ) obraz mikroskopowy. A: komórki HeLa transfekowane 6 pg pCMV-p-gal skompleksowanego z 12 pg TfpLl 90B. Reakcję barwną dla β-galaktozydazy prowadzono 3 godziny. Rysunek pokazuje, że tylko w niewielu komórkach (55 komórek, grupę wybarwionych komórek zaznaczono strzałką) gen β-galaktozydazy ulega ekspresji. B: komórki HeLa transfekowane 6 pg pCMV-β-gal skompleksowanego z 6 pg TfpLl 90B i 12 pgPlópL. Barwienie: 3 godziny. W niewielu komórkach (250 komórek) gen β-galaktozydazy ulega ekspresji. Jednakże, reakcja komórek jest silniejsza niż w A. C: komórki HeLa transfekowane 6 pg pCMV-β-gal skompleksowanego z 6 pg TfpLl90B i 12 pg P16pL w obecności 100 pM chlorchiny. Barwienie: 3 godziny. Wiele grup komórek wykazuje sillme dodatnią reakcję (więcej niż 1000 komórek). D: komórki HeLa transfekowane 6 pg pCMV-β-gal skompleksowanego z 12 pg TfpL 190B w obecności adenowirusa d 1312. Barwienie: 20 minut. Prawie wszystkie komórki (więcej niż 90%) wykazują dodatnią reakcję. E: komórki HeLa nietransfekowane (kontrola specyficzności reakcji β-galaktozydazy. Barwienie: 3 godziny.
Przykład 16 - Transfekcja komórek HeLa 48 kb kosmidem w obecności adenowirusa a) Wytwarzanie kosmidu zawierającego sekwencję kodującą lucyferazę
3,0 kb fragment Sali zawierający pojedynczą sekwencję kodującą lucyferazę P. pyralis pod kontrolą promotora RSV, wyizolowano z plazmidu p220RSVLuca i połączono z unikalnym miejscem Sali kosmidu C1 -7aA 1 do utworzenia konkatameru. (C1 -7aA 1 zawiera 37 kb fragment genomowy Sau3A (częściowo strawiony), nie kodujący szczególnej sekwencji, wklonowany w miejsce BamHI wektora kosmidowego pWE15 (Stratagene)). Produkt ligacji upakowano in vitro, a powstałymi cząsteczkami faga zakażono E.coli NM5441 wysiano na płytki LB amp. Rekombinanty badano metodą hybrydyzacji kolonu, używając jako sondy hybrydyzacyjnej 3,0 kb fragmentu Sali (zaznaczonego 32P za pomocą losowego użycia starterów), kolonie pozytywne analizowano za pomocą mapowania restrykcyjnego. Konstrukt kosmidowy (CosLuc) zawierający pojedynczą kopię insertu Sali namnożono i oczyszczono w gradiencie CsCl (wielkość całkowita = 48 kb).
Przez trawienie CosLuc enzymem Notl, powtórne połączenie, transformację bakterii i wyizolowanie klonu zawierającego odpowiedni plazmid otrzymano mały kontrolny kosmid pWELuc (12 kb). Pozwoliło to otrzymać cząsteczkę DNA wielkości 12 kb nie zawierającą insertu z ludzkiego DNA i części polilinkera CosLuc. Plazmid pSPNeoLuc (8 kb) to plazmid opisany w przykładzie 5, zawierający fragment RS V-gen lucyferazy (fragment Apal (Pvul pRSVL wklonowany w miejsce Clal pUCpLocus).
b) Dostarczenie kosmidu do komórek HeLa
Komórki HeLa (3 χ 104 komórek na płytkę 6 cm) pokryte 1 ml DMEM + 2% FCS mkubowano z kompleksami TfpL/DNA, otrzymanymi takjak opisano w części „Materiały i metody”, zawierającymi określone ilości hTfpL, wolnej pL i DNA. Mieszanina do inkubacji komórek zawierała ponadto, 100 μΜchlorchiny(ścieżki 1 i2)lub 10μΐroztworuadenowirusadł312zawierającego 5 χ 1011 cząstek wirusa na ml (ścieżki 3-12). Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C do każdej płytki dodano 4 ml DMEM + 10% FCS; 24 godziny później komórki zbierano i mierzono aktywność lucyferazy. Wyniki przedstawiono na fig. 22A.
c) Dostarczenie kosmidu do komórek neuroblastomy
Komórki neuroblastomy linii oznaczonej GLME-N (Donti i wsp., 1988) (1 χ 106 komórek na płytkę 6 cm) pokryte 1 ml DMEM + 2% FCS inkubowano z kompleksami TfpL/DNA, otrzymanymi takjak opisano w części „Materiały i metody”, zawierającymi określone ilości hTfpL, wolnej pL i DNA. Mieszanina do inkubacji komórek zawierała ponadto, 100 μΜ chlorchiny (ścieżki 3 i 4) lub 10 μΐ roztworu adenowirusa dl 312 zawierającego 5 χ 1011 cząstek wirusa na ml (ścieżki 5 i 6). Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C do każdej płytki dodano 4 ml DMEM + 10% FCS; 24 godziny później komórki zbierano i mierzono aktywność lucyferazy
180 304
Wyniki przedstawiono na fig. 22B.
Przykład 17 - Przenoszenie genów za pomocą sprzężonych chemicznie koniugatów adenowirus-polilizyna.
a) Wytwarzanie koniugatów adenowirus-polilhzyna przez sprzęganie chemiczne
2,35 ml roztworu adenowirusa przefiltrowanego na żelu (Sephadex G-25, PD 10 Pharmacia) (około 10 cząstek) w 150mMNaCl/25 mMHEPES pH 7,9/10% gliceryny zmieszano z 10 μΐ (10 nM) 1 mM roztworu SPDP (Pharmacia). Po 3,5 godzinach w temperaturze pokojowej zmodyfikowanego wirusa oddzielono od nadmiaru reagentów przez filtrację na żelu (jak wyżej). Roztwór (2,5 ml) przedmuchano argonem i pozostawiono do przereagowania w warunkach beztlenowych, w atmosferze argonu z 42 μΐ roztworu polilizyny znaczonej FITC (1 nmol), zmodyfikowanej 2,3 nmolami grupmerkaptopropionianowych (otrzymanymi jak opisano w EP 388 758). Po 18 godzinach w temperaturze pokojowej połowę roztworu przeniesiono do probówek wirówkowych, ostrożnie pokryto 1 ml roztworu chlorku cezu (gęstość 1,33 g/ml) i wirowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 35 000 obrotów na minutę (wirnik SW60). Prążek wirusa zbierano jako 200 μΐ frakcję chlorku cezu i rozcieńczono do 1 ml za pomocą HBS/50% gliceryny. Test wiązania DNA prowadzono z 300 ml zmodyfikowanego wirusa: roztwór wirusa rozcieńczono 1 ml HBS i zmieszano ze 100 μΐ roztworu DNA znaczonego 32S (15 ng pRSVL, otrzymanej za pomocą metody Nick translacji). Kontrolnie prowadzono równolegle doświadczenia z taką samą ilością niezmodyfikowanego wirusa d 1312 Po 30 minutach próbki przeniesiono do probówek wirówkowych, ostrożnie pokryto 1 ml roztworu chlorku cezu (gęstość 1,33 g/ml) i wirowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 35 000 obrotów na minutę (wirnik SW60). Gradientpodzielił się na 5 frakcji: frakcja 1, Iml; frakcja 2, 0,6 ml; frakcje 3-5 po 200 pl każda. Zmierzono radioaktywność 200 μΐ części frakcji i przedstawiono na fig. 23. Frakcje zawierające wirusa (3-5), szczególnie frakcja 3, wykazywały znacznie wyższą radioaktywność niż kontrolna. Można to przypisać specyficznemu wiązaniu zmodyfikowanego polilizyną wirusa ze znakowanym DNA, a obecność chlorku cezu powoduje częściową dysocjację kompleksów.
b) Transfekcja komórek K562
Komórki K562 (ATCC CCL 243) hodowano w zawiesinie w podłużu RPMI 1640 (Gibco BRL lus 2 g wodorowęglanu sodu/1, z dodatkiem 10% FCS, penicyliny w ilości 100LU./ml, streptomycyny (100 pg/ml i 2 mM glutaminy) do gęstości 500 000 komórek/ml. 12 do 20 godzin przed transfekcją komórki umieszczono w świeżym podłożu zawierającym 50 μΜ desferioksyammy (powoduje to zwiększenie liczby receptorów transferyny). W dniu transfekcji, komórki zebrano, zawieszono w świeżym podłożu zawierającym 10% FCS plus 50 μΜ desferioksyaminy (250 000 komórek/ml) i 2 ml porcje umieszczono na płytce z 24 studzienkami.
Określoną ilość pCMVL-DNA (6,0,6,0,06 pg) w 100 pl HBS zmieszano z 50 pl koniugatu polilizyna-adenowirus (pLadeno) lub odpowiednią ilością (35 pl) kontrolnego adenowirusa dl312. Po 20 minutach dodano odpowiednich ilości (12, 1,2, 0,12 pg) koniugatu TfpL190B w 150 pl HBS. Po następnych 20 minutach mieszaninę dodano do komórek K562. Komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C i zbierano do testu na aktywność lucyferazy. Aktywność lucyferazy określono tak, hak opisano w poprzednich przykładach. Wartości podane na fig. 18 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
c) Transfekcja komórek HeLa
Jedną z metod zbadania aktywności koniugatów polihzyna-wirus jest sprawdzenie jego zdolności przenoszenia bardzo małych cząsteczek DNA (mniejszych niż 0,1 pg). Zwiększonej zdolności do przenoszenia DNA należy się spodziewać, jeżeli adenowirus jest bezpośrednio związany z DNA skondensowanym przez pohlizynę, ponieważ czynniki intemalizujące (transferyna i adenowirus (białko) są bezpośrednio związane z przenoszonym DNA. W celu sprawdzenia tego założenia, stałą ilość koniugatu polilizyna-adenowirus (2,5 pl, około 5 χ 107 cząstek wirusa) skompleksowano z różnymi ilościami (3 pg do 0,0003 pg) plazmidu reporterowego w 475 pl HBS. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do każdej próbki dodano koniugatu transferyna-polilizyna w ilości odpowiadającej masie DNA (wybrana ilość TfpL gwarantowała całkowite upakowane (obojętne elektrycznie) 50% plazmidowego
180 304
DNA i jednocześnie zapewniała przestrzeń dla wiązania koniugatu wirus-plilizyna). Po dodaniu TfpL mieszaninę inkubowano przez następnych 15 minut, następnie każdą mieszaninę umieszczono w 6 cm płytce hodowlanej zawierającej 300 000 komórek HeLa w 1 ml podłoża DMEM/2% FCS. Następnie, komórki inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C i dodano 4 ml podłoża DMEM/10% FCS. Jednocześnie równoważne ilości DNA kompleksowano z dwukrotnym nadmiarem TfpL (ilość wystarczająca do wywołania całkowitej kondensacji DNA) i użyto do przenoszenia genów do komórek HeLa (raz samego i raz w obecności 25 pl preparatu adenowirusadl312 me sprzężonego z polilizyną). Po 24 godzinach komórki zebrano i przygotowano ekstrakty i próbki badano na aktywność lucyferazy. Wyniki tego testu przedstawiono na fig. 25; przy braku adenowirusa nie stwierdzono żadnej aktywności lucyferazy przy ilościach DNA mniejszych niż 0,3 pg. Zarówno sprzężony z polilizyną i niesprzężony adenowirus dobrze działały z dużymi ilościami DNA (3 pg i 0,3 pg). Jednakże, wirus niesprzężony dawał około 100 razy mniejszą aktywność przy 0,03 pg i nieistotną aktywność poniżej tej ilości DNA. Natomiast, wirus sprzężony z polilizynązachowuje zdolność przenoszenia genów zarówno przy 0,003 jak i 0,0003 pg DNA. Taka ilość DNA odpowiada około 150 cząsteczkom DNA na komórkę i około 1 cząstce wirusa na komórkę.
Przykład 18 - Przenoszenie genów za pomocą adenowirusa sprzężonego enzymatycznie z polilizyną
a) Reakcja enzymatyczna ml preparatu adenowirusa (szczep d 1312; 5 χ 1010 PFU/ml) naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej Sephadex G-25 (Pharmacia) zrównoważoną 25 ml buforu do reakcji (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 2 mM DTT, 30% gliceryny). Elucję prowadzono 3,5 ml buforu do reakcji. Mieszanina reakcyjna do sprzęgania enzymatycznego zawierała 1150 pl wyeluowanej frakcji wirusa, 0,5 nmoli transglutaminazy z wątroby świnki morskiej (TG) (Sigma), 20 nmole lub 20 nmoli polilizyny 290,10 mM CaCl2 i bufor do reakcji do objętości końcowej 1500 pl. Reakcję prowadzono w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie zahamowano przez dodanie 30 pl 0,5 M EDTA. W celu określenia specyficzności sprzęgania mieszaninę reakcyjną przygotowano także bez transglutaminazy. Niewłączonąpolihzynę oddzielono od wirusa przez wirowanie w gradiencie CsCl (gęstość 1,33 g/ml, 170 000 xg, 2 godziny). Zbierano frakcje zawierające wirusy, zmieszano je z równąobjętościągliceryny, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -70°C.
b) Wykazanie wiązania polilizyny z adenowirusem
Reakcję prowadzono jak opisano powyżej, w obecności polilizyny, która jest znakowana l25I za pomocą odczynnika Bolton-Huntera (Amersham). Po odparowaniu w gradiencie CdCl frakcję wirusowąodciągnięto i wyizolowano za pomocą innego gradientu CsCl. Gradient następnie frakcjonowano i określono radioaktywność każdej frakcji za pomocąlicznika scyntylacyjnego. Jak przedstawiono na fig 26 stało się jasne, że w mieszaninie reakcyjnej z TG (dl312/Tg-pL), we frakcji, zawierającej wirusa zebrała się radioaktywna polilizyną. W mieszaninie kontrolnej bez TG (1312/pL), nie stwierdzono zbierania się radioaktywnej polilizyny we frakcji zawierającej wirusa.
C) Badanie frakcji zawierających adenowirusa zmodyfikowanego polilizyną pod kątem wpływu na wydajność transfekcji
i) Komórki i podłoża
Do transfekcji, 5 χ 105 komórek (hepatycyty mysie, ATCC No.: TIB 73) w podłożu DMEM; z dodatkiem 10% reaktywowanej ciepłem cielęcej surowicy płodowej (FCS), 2 mM glutaminy, penicyliny w ilości 1001.U./ml i streptomycyny (100 pg/ml) wysiano na płytki do hodowli o średnicy 6 cm.
ii) Wytwarzanie kompleksów wirus-DNA-transferyna pl frakcji zmodyfikowanego polilizyną wirusa zmieszano z 6 pg plazmidu pCMVL w 10 pl HBS i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do mieszaniny
180 304 dodano 8 pg koniugatu mysia transferyna-polilizyna 290B (mTfpL) i inkubowano przez następne 20 minut.
iii) Transfekcja mysich hepatocytów
Kompleksy wirus-DNA-transferynę zmieszano z 1,5 ml podłoża (DMEM z 2% FCS, 2 mM glutaminy i antybiotykami) i dodano do komórek, po usunięciu starego podłoża. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37°C, do komórek dodano 2 ml podłoża DMEM zawierającego 10% FCS, glutaminę i antybiotyki. Po następnych 2 godzinach inkubacji usunięto całe podłoże i dodano 4 ml świeżego podłoża DMEM zawierającego 10% FCS, glutaminę i antybiotyki.
iv) Określenie ekspresji lucyferazy godziny po transfekcji komórki zebrano i wykonano próbę na lucyferazę tak, jak opisano powyżej. Jak można zobaczyć na fig. 27, preparat wirusa, w którym adenowirus traktowano TG i 20 nmolami polilizyny (dl312/TG-20 nmoh pL) wykazuje najsilniejszą ekspresję (153540000 jednostek światła). Preparat wirusa, traktowanego TG i 2 nmolami polilizyny (d 1312/TG-2 nmoli pL) był nieco mniej aktywny (57880000jednostek światła). Frakcja kontrolna, w której adenowirusa traktowano 20 nmolami polilizyny ale bez TG, była około 500 razy mniej efektywna. Dla porównania, kompleksów użyto jeszcze do transfekcji wyjściowym preparatem adenowirusa nie traktowanego ani polilizynąani TG (dl 312). Preparat wykazywał aktywność 4403000 jednostek światła.
d) Zwiększenie wydajności transfekcji przez zmodyfikowanego polihzynąadenowirusa w porównaniu do niezmodyfikowanego adenowirusa, szczególnie dla małych ilości DNA
Transfekcję prowadzono tak, jak opisano w przykładzie c), przy użyciu 50 μΐ frakcji adenowirusa dl 3 12/TG-20 nmoli pL i 6 pg pCMVL-Luc/8 pg mTfpL, 0,6 pg pCMVL(==pCMV-Luc)/0,8 pg mTfpL, lub 0,06 pg pCMVL-Luc/0,08 pg mTfpL do kompleksowama. Dla porównania, przeprowadzono także transfekcję 6 pg, 0,6 pg, 0,06 pg kompleksów pCMVL-Luc/mTfpL i niezmodyfikowanym adenowirusem (dl312). Stwierdzono, że kompleksy zmodyfikowanego polilizyną adenowirusa dają wyższy poziom ekspresji nawet z małymi ilościami DNA, podczas gdy ekspresja z niezmodyfikowanym adenowirusem jest ostro zmniejszona (fig. 28).
Przykład 19 - Przenoszenie genów przez koniugaty, w których wiązanie pomiędzy adenowirusem i polilizyną uzyskuje się za pomocą mostka biotyna-streptawidyna
a) Biotynylacja adenowirusa dl312
2,4 ml roztworu adenowirusa dl312 po filtracji żelowej (Sephadex G-25, PD 10 Pharmacia) (około 1011 cząsteczek) w 150mMNaCl/5 mM HEPES pH 7,9/10% gliceryny zmieszano z 10 pl (10 nmoli) 1 mM roztworu NHS-LC biotyny (Pierce 21335). Po 3 godzinach w temperaturze pokojowej zmodyfikowanego biotyną wirusa oddzielono od nadmiaru reagentów przez filtrację żelową (jak wyżej). Dodatkiem gliceryny (objętość całkowita 3,2 ml) doprowadzono jej stężenie w roztworze do 40% i przechowywano w temperaturze -25°C. Biotynylację wirusa wykazano metodą wykrywania ilościowego, nakraplając różne rozcieńczenia na błony nitrocelulozowe i przeprowadzając następujące czynności, po osuszeniu w temperaturze 80°C przez 2 godziny pod obniżonym ciśnieniem, zablokowano za pomocą BSA, inkubowano ze sprzęzonąze streptawidyną fosfatazą alkaliczną (BRL), przemyto i inkubowano przez 1 godzinę z roztworem wywołującym NBT/X-fosforan (sól tetrazoliowa nitrobłękitu/5-bromo-4-chloroindoliIofosforan, sól toluidyny; Boehringer Mannheim) stwierdzono dodatnią reakcję barwną.
b) Wytwarzanie koniugatów streptawidyna-polilizyna
Sprzęganie streptawidyny z polilizyną osiągnięto przy użyciu metody opisanej przez Wagnera i wsp., 1990 i w EP/A1 388 758. 79 nmoli (4,7 mg) streptawidyny w i ml 200 mM HEPES pH 7,91300 mM NaCl traktowano 15 mM etanolowym roztworem SPDP (236 nmoli) Po 1,5 godzinie w temperaturze pokojowej zmodyfikowane białko poddano filtracji żelowej na kolumnie Sephadex G-25 i otrzymano 75 nmoli streptawidyny, zmodyfikowanej 196 nmoli linkera ditiopirydynowego. Zmodyfikowane białko poddano w atmosferze argonu reakcji z polilizyną zmo
180 304 dyfikowaną 3-merkaptopropionianem (75 nmola, średnia długość łańcucha 290 monomerów lizyny, zmodyfikowana 190 nmolami linkera merkapto-propionianowego) w 2,6 ml 100 mM HEPES pH 7,9,150 mM NaCl. Koniugaty izolowano metodą chromatografii kationowymiennej na kolumnie Mono S HR5 (Pharmacia). (Gradient: 20-100% bufora B. Bufor A: 50 mM HEPES pH 7,9; bufor B: bufor A + 3 M NaCl). Frakcja zawierająca produkt wymywała się przy stężeniu soli pomiędzy l,2Mi 1,7M. Dializa wobec HBS (20 mM HEPES pH 7,3,150mMNaCl) dałakoniugat zawierający 45 nmola streptawidyny i 53 nmola pohlizyny.
c) Transfekcja komórek HeLa
Komórki HeLa hodowano na płytkach hodowlanych o średnicy 6 cm tak, jak opisano w przykładzie 13. Transfekcję prowadzono przy gęstości 300 000 komórek na płytkę. Przed transfekcją komórki inkubowano w 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS.
pg pCMVL-DNA w 100 pl HBS zmieszano z 0,8 pg streptawidyny-polilizyny w 170 pl HBS. Po 20 minutach dodano 3 pg polilizyny pL 300 w 170 pl HBS. Po następnych 20 minutach dodano 65 pl biotynylowanego adenowirusa lub jako kontrolę odpowiednią ilość adenowirusa dl312 (30 pl, wirusa wyjściowego do modyfikacji). Mieszaninę kompleksów („biotyna AdV/kompleks A” lub „kontrola AdV”, patrz fig. 29) pozostawia się na następne 20 minut.
Alternatywne kompleksy przygotowano mieszając 65 pl biotynylowanego adenowirusa najpierw z 0,8 pg streptawidyny-pohlizyny w 50 pl HBS, a po 20 minutach dodano 6 pg pCMVL-DNA w 170 pl HBS, po następnych 20 minutach dodano 3 pg pohlizyny pL300 w 200 pl HBS. (Mieszanina kompleksu „biotyna AdV/kompleks B”).
0,6 pg pCMVL-DNA w 67 pl HBS zmieszano z 0,3 pg streptawidyny-polilizyny w 33 pl HBS. Po 20 minutach dodano 65 pl biotynylowanego adenowirusa lub jako kontrolę odpowiedniąilość adenowirusa dl312 (30 pi wirusa wyjściowego do modyfikacji). Mieszaninę kompleksu („biotyna AdV/kompleks A” lub kontrola AdV), patrz; fig. 29) pozostawiono na następne 20 minut, po czym rozcieńczono do 500 pl.
Alternatywny proces kompleksowania przeprowadzono mieszając 65 pl biotynylowanego adenowirusa najpierw z 0,3 pg streptowidyny-polilizyny w 50 pl HBS i po następnych 20 minutach dodając 0,6 pg pCMVL-DNA w 50 pl HBS. Mieszaninę kompleksu („biotyna AdV/kompleks B”) pozostawiono na następne 20 minut, po czym rozcieńczono HBS do 500 pl.
Mieszaniny dodano do komórek, i inkubowano komórki przez 2 godziny w temperaturze 37°C, po czym dodano 2,5 ml świeżego podłoża zawierającego 10% FCS. Komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, po czym zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Aktywność lucyferazy określono tak, jak opisano w poprzednich przykładach. Wartości podane na fig. 29 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
Równolegle prowadzono transfekcję komórek HeLa przy użyciu jako składnika wirusowego koniugatu biotynylowanego wirusa, który był inaktowowany przez obróbkę psolarenem/UV. Inaktywację prowadzono w następujący sposób: porcje po 200 pil preparatu biotynylowanego wirusa umieszczono w dwóch studzienkach 1,6 cm płytki do hodowli. Do każdej próbki dodano 2 μΐ (33 mg/ml) 8-metoksypsolarenu (w DMSO), płytki umieszczono na lodzie i napromieniono przez 10 minut lampąUV (365 nm, lampa UVP model TL-33), przy czym próbka znajdowała się w odległości 4 cm od filtra lampy. Po ekspozycji dwie próbki zmieszano i poddano filtracji żelowej na kolumnie (G50, kolumna Nick, Pharmacia), zrównoważonej wcześniej 40% gliceryną w HBS). 75 μΐ skompleksowano z 0,8 pg streptawidyny-polilizyny i użyto do transfekcji komórek HeLa jak opisano powyżej.
Testem cytopatologicznym wykazano, że dzięki inaktywacji miano wirusa zmniejszyło się o czynnik większy niż 104, podczas gdy zdolność do przenoszenia genów zmniejszyła się mniej niż w 50% przy wyższych stężeniach wirusa i 5-krotnie przy niższych stężeniach
d) Transfekcja komórek K562
Komórki K562 hodowano w zawiesinie w podłożu RPMI 1640 (Gibco BRL plus 2g wodorowęglanu sodu/1), z dodatkiem 10% FCS, penicyliny w ilości 100 I.U./ml, streptomycyny (100 pg/ml) i 2 mM glutaminy do gęstości 500 000 komórek/ml. 16 godzin przed transfekcją komórki umieszczono w świeżym podłożu zawierającym 50 pM desfenoksyaminy (Sigma)
W dniu transfekcji, komórki zebrano, zawieszono w świeżym podłożu zawierającym 10% FCS (plus 50 μΜ desferioksyaminy) przy gęstości 250 000 komórek/ml i umieszczono na płytce z 24 studzienkami po 2 ml w każdej studzience. Przygotowano trzy różne typy kompleksów DNA: a) Roztwór 6 pg pCMVL-DNA w 160 pl HBS (20 mM HEPES pH 7,3,150 mM NaCl) zmieszano z 12 pg koniugatu TfpL190B w 160 pl HBS, po 30 minutach dodano adenowirusa d 1312 i mieszaninę dodano do komórek K.562; b) Roztwór 800 ng streptawidyny-polilizyny w 160 pl HBS zmieszano z 20 pl biotynylowanego adenowirusa, przygotowano jak opisano w a), po 30 minutach dodano roztworu 6 pg pCMVL-DNA w 160 pl HBS, po następnych 30 minutach roztwór zmieszano z 10 pg koniugatu TfpL190B w 160 pl HBS. Po 30 minutach mieszaninę dodano do komórek; c) Kompleksy DNA przygotowano analogicznie jak w b) z tą różnicą że zamiast roztworu koniugatu TfpL190B dodano 3,5 pg poli(L)lizyny p(Lys)290.
Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny i zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości podane na fig. 30 przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
Przykład 20- Przenoszenie genów do pierwotnych komórek szpiku kostnego
a) Izolacja pierwotnych komórek szpiku kostnego
Pierwotne komórki szpiku kostnego otrzymano z myszy przez wymywanie z wyizolowanych kości udowych i piszczelowych podłożem do hodowli (IMDM zawierającego 10% FCS, 5 x 10'5M β-merkaptoetanolu, 1% podłoża kondycjonowanego IL-3 i antybiotyki) za pomocą igły do wstrzyknięć (o średnicy 0,4 mm lub 0,5 mm) połączonej z 1 ml strzykawką. Następnie komórki przemywano jeden raz podłożem przez wirowanie przy 100 x g przez 8 minut. Następnie przygotowano zawiesinę komórek o stężeniu 107 komórek/ml i wysiewano do kolb do hodowli T25. Po 4 godzinach komórki, które nie przylgnęły, przeniesiono do nowych kolb do hodowli T25 i hodowano przez noc w obecności 50 μΜ desferioksyaminy.
b) Wytwarzanie kompleksów adenowirus-DNA-transferyna
W celu otrzymania kompleksów adenowirus-DNA-transferyna 50 μΐ biotynylowanego adenowirusa inkubowano z 400 ng polilizyny zmodyfikowanej streptawidyną w 20 μΐ HBS przez 20 minut. Następnie dodano 20 μΐ HBS zawierającego 6 pg pCMVL. Po 20 minutach inkubacji dodano 7 pg koniugatu mysia transferyna-polilizyna (mTfpL) w 160 pl HBS i całą mieszaninę inkubowano przez następne 20 minut.
c) Transfekcja
Do transfekcji komórki szpiku kostnego odzyskano z podłoża do hodowli w kolbach T25 przez wirowanie przez 8 minut przy 100 x g. Osad komórek zawieszono w 3 ml podłoża do hodowli zawierającego 2% FCS i 250 pl kompleksów adenowirus-DNA-transferyna i hodowano przez 3 godziny w temperaturze 37°C w nowych kolbach do hodowli T25. Następnie dodano 3 ml, a po 2 godzinach następne 6 ml podłoża do hodowli zawierającego 10% FCS.
d) Określenie ekspresji lucyferazy
Komórki szpiku kostnego zebrano po 48 godzinach od transfekcji i analizowano kątem ekspresji lucyferazy, jak opisano powyżej. Transfekcja prowadziła do ekspresji lucyferazy odpowiadającej 310 χ 103 jednostek światła/100 pg całkowitego białka komórkowego.
Przykład 21- Transfekcja komórek neuroblastoma 48 kb kosmidem w obecności wolnego adenowirusa i koniugatów adenowirus-polilizyna
Komórki linii oznaczonej GI-ME-N, jak opisano w przykładzie 16, inkubowano z 48 kb kosmidem i z określonymi ilościami hTfpL, wolnej polilizyny i DNA. Mieszanina do inkubacji komórek zawierała ponadto, 100 μΜ chlorchiny (ścieżki 3 i 4) lub 10 μΐ roztworu adenowirusa dl 312 zawierającego 5x10 cząstek wirusa na ml (ścieżki 5 i 6). Ostatnie dwie próbki (ścieżki 7 i 8, StpL/Biotyna) zawierały 15 μΐ biotynylowanego adenowirusa d!312 (1 x 10 cząstek) inkubowanego z polihzyną-streptawidyną(0,8 pg przygotowane, jak w przykładzie 19) przez 30 minut w 150 pl HBS. Przez 30 minut w temperaturze pokojowej do próbki dodano 6 pg DNA w 150 pl HBS, następnie 150 pl HBS zawierającego 6 pg hTfpL + 1 pg wolnej pL Po następnych 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej mieszaninę dodano do komórek. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C do każdej płytki dodano 4 ml
180 304
DMEM + 10% FCS; po 24 godzinach komórki zbierano i mieszano aktywność lucyferazy. Wyniki przedstawiono na fig. 31.
Przykład 22- Przenoszenie genów do hepatocytów i komórek krwi
W doświadczeniach w tym przykładzie użyto następujących materiałów i metod:
Transfekcja komórek hodowli tkankowych: Komórki linii komórkowej BNL Cl.2 hodowano tak, jak opisano w przykładzie 6. Komórki HeLa i hepatocyty hodowano na płytkach hodowlanych o średnicy 6 cm. Transfekcję prowadzono przy gęstości 3 χ 105 komórek na płytkę. Przed transfekcjąkomórki inkubowano w 1 ml świeżego podłoża zawierającego 2% FCS, zamiast standardowego podłoża.
Tworzenie kompleksów podwójnych: Biotynylowanego adenowirusa (około 109 PFU; patrz przykłady 19a) i 19b)) zmieszano z roztworem 800 ng streptawidyny-pohlizyny w 50 μΐ HSB. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej dodano 6 pg pCMVL-DNA w 170 pl HBS, inkubowano przez 30 minut, po czym dodano 3 pg polilizyny pL300 w 200 pl HBS i po następnych 30 minutach mieszaniny użyto do transfekcji.
Tworzenie kompleksów potrójnych: Biotynylowanego adenowirusa (około 109 cząstek wirusa) zmieszano z roztworem 800 ng streptawidyny-polilizyny w 50 pl HSB. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej dodano 6 pg pCMVL-DNA w 170 pl HBS, inkubowano przez 30 minut i następnie dodano 10 pg TfpL 190B w 200 pl HBS i po następnych 30 minutach mieszaniny użyto do transfekcji.
Test β-galaktozydazy: Komórki BNL CL.2 wysiewano na szkiełka nakrywkowe i po 24 godzinach transfekowano genem reporterowym pCMV-P-gal (Lim i Chae, 1989). 48 godzin później badano aktywność β-galaktozydazy, jak w przykładzie 15.
a) Połączenie pomiędzy kondensatami DNA i adenowirusem bardzo zwiększa poziom ekspresji genu reporterowego lucyferazy
Wyniki przenoszenia DNA do hepatocytów za pomocą podwójnych i potrójnych kompleksów DNA przedstawiono na fig. 32. Efekt przenoszenia genów jest zwiększony w obecności wolnego adenowirusa. W przypadku pLAdenoV/TpfL adenowirusa połączono z pohhzyną za pomocą transglutaminazy i następnie poddano reakcji z DNA neutralizując część ładunków ujemnych DNA. Następnie dodano trasferyny-polilizyny neutralizując pozostałe ładunki W ten sposób zsyntetyzowano potrójny kompleks adnenowirus-polilizyna/streptawidynapolihzyna/DNA. Jak można zauważyć na lysunku uzyskano nadzwyczajnie wysoką ilość jednostek światła lucyferazy 1,5 χ I09 (lub około 5000 jednostek światła na komórkę). W przypadku adenoV + pL + TfpL, zmieszano adenowirusa z pohlizyną tak jak do traktowania transglutaminazą. Jednakże, w celu wykazania specyficzności wiązania polilizyny z wirusem za pomocą transglutaminazy, pominięto enzym. Następnie preparat wirusa skompleksowano z tąsamąilościąDNA i TfpL jak w pLAdenoV/TpfL. W tym przypadku, uzyskano umiarkowaną transfekcję, podobnie jak w AdenoV + TfpL, ponieważ w obu doświadczeniach wspólne umieszczanie się wirusa i DNA transferyny jest procesem stochastycznym, w odróżnieniu od przypadku pLAdenoV/TpfL, gdzie kointemalizacja zapewniona przez fizyczne połączenie wirusa i DNA w kompleksach potrójnych, daje wysoki poziom transfekcji z udziałem transferyny.
b) Transfekcja komórek K562 wskazuje na endosomolityczne własności adenowirusa
Linia ludzkich komórek erytroleukemii K562 zawierała około 150000 receptorów transferyny (Klausner, R.D. i wsp., 1983b). W obecności chlorchiny, komórki te można nawet bez obecności adenowirusa transfekować, na bardzo wysokim poziomie, za pomocą transferyny kompleksami polilizyna-transferyna reporterowy DNA (TfpL, fig 33) Te same kompleksy po dodaniu wolnego adenowirusa, ale bez obecności chlorchiny, dawały stosunkowo niski poziom ekspresji genu reporterowego (AdenoV/TfpL), prawdopodobnie ponieważ komórki K562, podobmejak inne komórki krwi (Silver, L iwsp., 1988; Horvath,J. i wsp., 1988) mająniski poziom receptorów adenowirusa Jeżeli adenowirus jest połączony z polilizyną za pomocą mostka biotyna-streptawidyna i reporterowy DNA jest całkowicie skondensowany przez dodanie nadmiaru polilizyny w celu wytworzenia pełnych kompleksów podwójnych (pLAdenoV/pL), wspomagana adenowirusem transfekcja osiąga średni poziom. Prawdopodobnie, niewiele receptorów
180 304 adenowirusa na komórkach K562 jest użytych wydajnie. Jednakże, jeżeli sprzężony adenowirus-polilizyna-reporterowy DNA jest całkowicie skondensowany i zneutralizowany przez dodanie polilizyny-transferyny w celu wytworzenia kompleksów potrójnych pLAdenoV/TfpL i wiele komórkowych receptorów transferyny zaczyna odgrywać rolę, wydajność transfekcji wzrasta przynajmniej o następne dwa rzędy wielkości (fig. 33), w wyniku wydajnego wiązania transferyny i endosomolitycznych własności wirusa.
c) Kompleksy potrójne prowadzą do ekspresji genu reporterowego prawie w 100% hepatocytów
Wydajność nowych kompleksów do przenoszenia DNA badano także na hepatocytach mysich (BNL CL.2), transfekowanych genem reporterowym β-galaktozydazy.
Na figurze 34 przedstawiono wyniki testu β-galaktozydazy na mysich hepatocytach po a) transfekcji za pomocątransferyny w obecności chlorchiny; b) transfekcji za pomocą transferyny w obecności wolnego adenowirusa dl312; c) transfekcji potrójnymi, sprzężonymi kompleksami adenowirus-polihzyna-transferyna-reporterowy DNA. Bez adenowirusa, po standardowej transfekcji reporterowego DNA za pomocą transferyny, gen reporterowy ulegał ekspresji tylko w kilku komórkach. Procent transfekcji był mniejszy niż 0,1%. Po dodaniu chlorchiny nastąpił wzrost do około 0,2% (fig. 34a). Przy transfekcji z wolnym adenowirusem gen reporterowy ulegał ekspresji w około 5-10% komórek, (fig. 34b), podczas gdy kompleksy potrójne wirusa modyfikowanego transglutaminazą prowadzą do ekspresji w większości, jeżeli nie we wszystkich komórkach (fig. 34c). Ponieważ kompleksy potrójne mogą być używane w dużych rozcieńczemach, toksyczne działanie widoczne przy wysokich dawkach wolnego adenowirusa (inaktywowanego) przeważnie nie zwiększa się Należy jednak zauważyć, ze jeżeli w celu osiągnięcia 100% tkankowych hodowli komórkowych używa się kompleksów potrójnych w wysokim stężeniu, podobne działanie toksyczne staje się zauważalne. Działanie toksyczne może być spowodowane przez pozostającą aktywność genów wirusowych, własności endosomohtyczne dodanego wirusa lub po prostu w wyniku bardzo wysokiego poziomu ekspresji transfekowanego genu.
d) Ekspresja transfekowanego genu reporterowego jest przemijająca, ale w nie dzielących się hepatocytach trwa tygodnie
Potrójne kompleksy przenoszące (pLAdenoV/TfpL) otrzymano z polilizyny-adenowirusa i zmodyfikowanego adenowirusa wcześniej zinaktywowanego przez traktowanie psoralenem. Zlewające się w 2/3 hepatocyty transfekowane jak na fig. 34b plazmidem pCMVL z genem reporterowym lucyferazy i określano aktywność lucyferazy w różnych punktach czasowych. Jak można zauważyć na fig. 35 aktywność lucyferazy była największa po 3 dniach i po tym czasie hepatocyty zlewają się i komórki przestająsię dzielić. W nie dzielących się komórkach ekspresja genu i reporterowego utrzymywała się przynajmniej przez 6 tygodni, bez stosowania selekcji na zatrzymanie genu, zwłaszcza jeżeli do wytwarzania potrójnych kompleksów przenoszących stosowano adenowirusy inaktywowane psoralenem.
Przykład 23- Użycie adenowirusa kurcząt CELO do zwiększenia dostarczania DNA do komórek człowieka '
W tym przykładzie badano zdolność adenowirusa kurcząt CELO do zwiększenia dostarczania DNA do ludzkich komórek HeLa w sposób podobny do powyższych doświadczeń, w których stosowano ludzkiego adenowirusa 5.
W tych doświadczeniach użyto adenowirusa kurcząt CELO (szczep Phelps, serotyp FAV-1,7, pasażowany w komórkach nerki kurczęcia). Wirusa (2 ml) przepuszczono przez kolumnę do filtracji żelowej PD-10, zrównoważoną 20 mM HEPES pH 7,3, 150 mM NaCl (HBS) 10% gliceryny i 2 ml eluatu poddano reakcji z 20 μΐ 1 mM roztworu NHS-LC-biotyny (Pierce) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie biotynylowanego wirusa dializowano wobec 3 x 300 ml HBS + 40% gliceryny w temperaturze 4°C i przechowywano w temperaturze -70°C.
Komórki HeLa (5 χ 103 komórek na płytkę 6 cm) inkubowano w 2 ml DMEM + 2% FCS z 6 pg kompleksu plazmidu pCMYL z pohlizyną(pLys) lub mieszaninami transferyna-polilizyna
180 304 (TfpL) w 500 μΐ HBS (kompleksy inkubowano wcześniej przez 30 minut w temperaturze pokojowej). Następnie próbki dodano do komórek w temperaturze 37°C w obecności ilości wirusa określonych na fig. 36. W przypadku próbek zawierających biotynylowanego wirusa CELO, przed dodaniem 6 pg plazmidu pCMVL w 100 μΐ HBS, określonąilość wirusa inkubowano wcześniej z określoną ilością streptawidyny-polilizyny (StrpL) w 200 μΐ HBS przez 30minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do komórek w temperaturze 37°C dodano określoną ilość TfpL. 2 godziny później do komórek dodano 5 ml DMEM + 10% FCS i 24 godziny później komórki zbierano i mieszano aktywność lucyferazy.
Jak pokazano na fig. 36, wolny wirus CELO zwiększył dostarczanie DNA do komórek HeLa (ścieżki 1-6). Jednakże, po zmodyfikowaniu wirusa CELO biotyną i włączeniu go w kompleks ze streptawidyną zarówno z dodatkiem pohhzyny-transferyny jak i bez, wirus zwiększył dostarczenie DNA do poziomu porównywalnego z poziomem uzyskanym za pomocą ludzkiego adenowirusa d 1312. Poszczególne linie komórek HeLa wykazywały wysoką zdolność wiązania kompleksów polilizyna/DNA w nieobecności transferyny (porównaj z aktywnością lucyferazy w próbkach 1 i 4 na fig. 36), tak więc, włączenie wirusa CELO w kompleksy polilizyna/DNA jest wystarczające do uzyskania wychwytu wirusa.
Przykład 24- Transfekcja mioblastów
a) Transfekcja mioblastów i miotubul kompleksami DNA/transferyna/polilizyna w obecności wolnego adenowirua i w obecności adenowirusa sprzężonego z biotyną-streptawidyną
Mioblasty C2C12 (BIau wsp., 1985; ATCC Nr: CRL 1772) i Mioblasty G8 (ATCC Nr: CRL 1456) hodowano w podłożu DMEM z wysoką zawartością glukozy, z dodatkiem 10% FCS. Hodowle mioblastów transfekowano w stanie przed zlaniem się komórek, przy gęstości około 5 x 105 komórek na płytkę o średnicy 6 cm. Hodowle miotubul otrzymano przez wysianie mioblastów na płytki o średnicy 6 cm (około 5 χ I (F komórek na płytkę) i zmianę podłoża na DMEM z wysoką zawartością glukozy plus 2% surowicy końskiej po zlaniu się komórek (Barr i Laiden, 1991; Drawan i wsp., 1991). Transfekcję miotubul prowadzono 5-7 dni później. Kompleksy do transfekcji przygotowano tak, jak opisano w przykładzie 19, przy użyciu określonych ilości TfpL, StrpL biotynylowanego wirusa dl 312. 20 godzin po transfekcji, komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy. Fig. 37 pokazuje otrzymaną aktywność lucyferazy, w jednostkach światła, dla próbek całych komórek: hodowle mioblastów i miotubul można transfekować z dużą wydajnością. Po zróżnicowaniu w biotubule obserwowano spadek wydajności transfekcji o rząd wielkości (C2C12) lub nie obserwowano znaczącego spadku (G8). W linii G8 różnicowanie się w miotubule zachodzi z mniejszą częstością i to może częściowo wpływać na brak wykrywalnego spadku wydajności w zróżnicowanych hodowlach. Rola wzajemnego oddziaływania transferyna/receptor transferyny w dostarczeniu DNA do komórek tego typu nie jest duża. We wszystkich czterech preparatach komórkowych, stwierdzono tylko słabe dostarczenie DNA za pomocą kompleksów TfpL/DNA w obecności wolnego adenowirusadl 312 (ścieżki 1,4,7, 10). Wydajność transfekcji zwiększono przez użycie sprzężonego układu ze sprzężonym wirusem (ścieżki 1, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12). Porównując z dostarczeniem DNA osiąganym za pomocą kombinacji kompleksów zawierających tylko wirusa i polilizynę/StrpL skondensowaną w kompleksy, które zawierają transferynę/polilizynę (porównaj, na przykład, ścieżkę 2, bez transferyny, ścieżkę 3, transferyna), stwierdzono, wzrost wydajności mniej niż o jeden rząd wielkości. Słaba transfekcja za pomocą wolnego wirusa i wysoka transfekcja za pomocąwirusa sprzężonego w kompleksy, zarówno w obecności transferyny-pL jak i bez, sugeruje, że w tych komórkach adenowirus służy jako ligand i przy braku sprzężenia wolny wirus może wnikać do komórki, ale kompleksy TfpL/DNA nie wnikająwydajnie. (DNA użytym w tym przykładzie był pCMVL, oznaczony na rysunku jako pCluc).
180 304
b) Histochemiczna analiza częstości transfekcji miotobul
Hodowle miotubul C2C12 (5 χ 105 komórek, jako mioblasty, wysiane na płytki o średnicy 6 cm i zróżnicowane w miotubule) otrzymano jak opisano w a). W przypadku próbek zawierających wolnego wirusa, pCMVp-gal DNA (6 pg) skompleksowano z 8 pg TfpL w 500 pl HBS i dodano do komórek w obecności 18 pl adenowirusa dl312 (1 x 1012 wirusów na ml) w 2 ml DMEM/2% FCS. Próbki sprzężonego wirusa otrzymano z pCMVLacZ DNA (6 pg) skompleksowanego z 7 pg T fpL i 800 ng StrpL plus 18 pl biotynylowanego adenowirusa dl312(lx 1012 wirusów na ml) w 500 pl HBS i dodano do komórek w 2 ml DMEM/2% FCS. Po 24 godzinach komórki barwiono i mierzono aktywność β-galaktozydazy, jak opisano w przykładzie 15.
Wzór barwienia β-galaktozydazy zgodny był z wynikami transfekcji za pomocą lucyferazy jako genu reporterowego (patrz a). W przypadku użycia wolnego wirusa, stwierdzono bardzo niską ekspresję genu uzyskaną w hodowlach miotubul, podczas gdy użycie wirusa sprzężonego z DNA dało wysoki poziom ekspresji genu. Obecność wybarwionych na niebiesko, wielojądrowych mikrotubul wskazywała na udane przenoszenie genów do tych zróżnicowanych komórek w obecności wolnego adenowirusa.
c) Dostarczenie DNA do pierwotnych hodowli mioblastów i miotubul myszy
Większe mięśnie szkieletowe obu tylnych nóg czterotygodniowych samców myszy szczepu C57B1/6 izolowano sterylnie do PBS i pocięto na kawałki długości około 5 mm. Tkankę zawieszono w 20 ml PBS, pozostawiono do osadzenia się przez około 2 minuty, następnie odsysano nadsącz. Przemywanie to powtarzano 3 razy. Następnie tkankę zmieszano z 3,5 ml PBS plus 0,5 ml trypsyny/EDTA, 0,5 ml 1 % (wag./obj.) kolagenazy (typ II, Sigma) i 0,5 ml 1% BSA (frakcja V, w 4 mM CaCl2) i inkubowano przez 30minut w temperaturze 37°C co jakiś czas delikatnie mieszając. Pod koniec 30 minutowej inkubacji pozostająca tkanka osadziła się, usunięto nadsącz i zmieszano z 5 ml DMEM + 20% FCS. Inkubację z proteaząpowtórzono 3-4 razy, aż do całkowitego zdyspergowania tkanki. Zawiesinę komórek przepuszczono następnie przez tkaninę filtracyjną (Falcon) w celu usunięcia agregatów i fragmentów tkanki i wirowano przy 500 x g przez 15 minut. Osad komórek zawieszono w 10 ml DMEM + 20% FCS i usunięto fibroblasty przez wysianie komórek na niepowlekane płytki hodowlane o średnicy 15 cm, na 60 minut. Komórki, które się nie przyczepiły, ostrożnie usunięto i wysiewano w 15 ml DMEM + 20% FCS na płytkę na 5 powlekanych lamininąpłytek hodowlanych o średnicy 10 cm. Po zlaniu się (około jednego tygodnia później) komórki trypsynizowano i przesiewano na 6 powlekanych lamininą płytek hodowlanych o średnicy 6 cm, około 1 χ 106 komórek na płytkę. W celu wytworzenia hodowli miotubul, około 5 dni później (po zlaniu się komórek) zmieniono podłoże na DMEM plus 2% surowicy końskiej i tydzień później przeprowadzono transfekcję. Transfekcję hodowli mioblastów prowadzono na płytkach o średnicy 6 cm przy zlaniu około 80%).
Płytki hodowlane powlekane lamininą otrzymano w następujący sposób. Płytki hodowlane powlekano 0,025 mg/ml polilizyny (MW 30000-70000, Sigma) w sterylnej wodzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano 3 razy sterylną wodą i suszono na powietrzu. Następnie płytki powlekano 8 pg/ml lamininy (EHS, Sigma) w sterylnej wodzie przez noc w temperaturze pokojowej. Przed wysianiem komórek, płytki przemywano 3 razy sterylną wodą
Kompleksy DNA do transfekcji przygotowano przez rozcieńczenie określonych ilości inaktywowanego psoralenem/UV biotynylowanego adenowirusa dl312 (otrzymanego jak opisano w przykładzie 19) w 150 μΐ HBS i dodanie 1 pg StrpL w 150 μΐ HBS i 30 minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej próbki dodano HBS (100 pl) zawierającego 6 pg pCMVL (oznaczonego na fig. jako pCluc) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wreszcie, do każdej próbki dodano 7 pg TfpL w 100 pl HBS, inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej i następnie dodano do hodowli mioblastów lub miotubul na płytkach o średnicy 6 cm zawierających 2 ml DMEM + 2% FCS. Po 1 godzinie inkubacji podłoże zastawiono
180 304 ml DMEM + 20% FCS (mioblasty) lub DMEM + 2% surowicy końskiej (miotubule) i 48 godzin później komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy. Wyniki przedstawiono na fig. 38.
Przykład 25- Poprawa dostarczania wirusa CELO do mioblastów przy użyciu ligandów lektynowych
a) Analiza porównawcza adenowirusa dl312 i CELO w komórkach HeLa i mioblastach C2C12
Próbki komórek HeLa lub mioblastów C2C12 (5 χ 105 komórek, na płytkę o średnicy 6 cm) transfekowano 6 pg pCMVL (oznaczonego na rysunku pCLuc) skompleksowanego z 1 pg StrpL/7 pg TfpL plus 5 pl biotynylowanego adenowirusa dl312 (patrz przykład 19, 1 χ 1012 cząstek/ml) lub 18 pl biotynylowanego wirusa CELO (patrz przykład 23, 0,3 χ 1012 cząstek/ml). Komórki inkubowano przez 20 godzin i zebrano do testu na aktywność lucyferazy. Wartości podane na fig. 39 przedstawiają aktywność lucyferazy w poszczególnych próbkach
Transfekcję komórek HeLa można uzyskać z podobną wydajnością przy użyciu kompleksów ludzki adenowirus d!312/StrpL/TfpL/DNA, które wnikają do komórki dzięki receptorom adenowirusa lub receptorom transferyny lub kompleksów wirus CELO/StrpL/TfpL/DNA, które wmkajądo komórki dzięki receptorom transferyny. Jednakże, o ile dostarczanie DNA do mioblastów C2C12 można byłoby przeprowadzić skutecznie przy użyciu kompleksów adenowirusa dl 312, to kompleksy wirusa CELO w tych komórkach działają źle. Wcześniejsze przykłady wykazały, że receptory transferyny grajątylko małąrolę w dostarczaniu do tych komórek kombinacji kompleksów, prawdopodobnie głównym miejscem wnikania sąreceptory adenowirusa. Słaba aktywność wirusa CELO w mioblastach może wynikać ze słabego wiązania do mioblastów zarówno wirusa CELO jak i transferyny.
b) Poprawa transfekcji za pomocąwirusa CELO do mioblastów przy użyciu aglutyniny zarodków pszenicy jako hgandu
W związku ze słabym dostarczaniem uzyskanym w a), wybrano nowy hgand do zastąpienia transferyny.
Biotynylowanąaglutyninę zarodków pszenicy (2-4 moli biotyny na mol białka) uzyskano z Boehnnger Mannheim. Biotynylowanego wirusa CELO otrzymano tak jak opisano wcześniej. Kompleksy zawierające 6 pg pCMVL plus określone ilości TfpL, StrpL, biotynylowanej aglutyniny zarodków pszenicy (WGA-B) i wirusa CELO przygotowano w następujący sposób. Wirusa i WGA rozcieńczono razem w 150 μΐ HBS. Także w 150 μΐ HBS rozcieńczono StrpL i oba roztwory zmieszano i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej Do roztworu StrpL/wirus/WGA dodano DNA, rozpuszczonego w 100 μΐ HBS i inkubowano przez następne 30 minut w temperaturze pokojowej. Wreszcie, do mieszaniny dodano TfpL w 100 μΐ HBS, i znów inkubowano próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kompleksy dostarczono do hodowli mioblastów C2C12 (5 χ 105 komórek, na płytkę o średnicy 6 cm) w 2 ml DMEM + 2% FCS. Po 1 godzinie inkubacji do komórek dodano 5 ml DMEM + 20% FCS i 20 godzin później komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy. Aktywność (jednostki światła) dla każdej próbki przedstawiono na fig. 40. (DNA użytym w przykładzie był pCMVL, oznaczony na rysunku jako pCLuc).
Przy braku wirusa stwierdzono bardzo słabe dostarczanie DNA zarówno z jak i bez WGA (ścieżki 1, 6). Ze sprzężonym wirusem CELO uzyskano średnie dostarczanie (ścieżka 2), natomiast 16-krotny wzrost dostarczania uzyskano, gdy kompleks zawierał WGA-B. Zwiększenie w kompleksie ilości WGA (od 1 pg do 5 pg) dało tylko niewielki wzrost dostarczania (porównaj ścieżki 3 i 4), także zwiększenie w kompleksie ilości StrpL (od 1 pg do 2 pg) dało niewielki wzrost dostarczania (porównaj ścieżki 3 i 5) Wyniki jasno wskazują, że WGA-B jako hgand zwiększa dostarczanie DNA, za pomocąwirusa CELO, do komórek C2C12
180 304
d) Ekspresja genu czynnika VIII w hodowlach mioblastów C2C12 i miotubul
Przygotowano hodowle mioblastów C2C12 i miotubul jak opisano powyżej. Transfekcję prowadzono stosując 6 pg plazmidu kodującego pełnej długości ludzki czynnik VIIIcDNA (Wood i wsp., 1984; Eaton i wsp., 1986) skompleksowanego z 5 lub 15 pg biotynylowanego adenowirusa (jak pokazano) plus 0,5 lub 1 pg StrpL, i 7 lub 6 pg TfpL, według standardowego protokołu tworzenia kompleksów.
Kompleksy DNA/wirus dostarczono do komórek w DMEM/2% FCS. Po 4 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C do każdej płytki dodano 3 ml świeżego DMEM + 10% FCS. 18 godzin później zebrano podłoże i badano na obecność czynnika VIII, za pomocą testu COATEST (KABI, Pharmacia), przy użyciu międzynarodowych standardów jako odnośników. Poziom czynnika VIII wykreślono w mihjednostkach wytworzonych w ciągu 24 godzin przez 1 χ 106 komórek (fig. 41).
Przykład 26 -Użycie białka wirusowego do dostarczania DNA
Adenowirusa (typ dziki 300) namnożono w komórkach HeLa, oczyszczono i biotynylowano tak, jak opisano dla adenowirusa dl312. 1,2 ml wirusa dializowano wobec 3 x 300 ml 5 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy), 1 mM EDTA pH 6,25, w temperaturze 4°C przez 18 godzin. Następnie materiał odwirowano przez 30 minut w 27 K w wirniku SW60 Nadsącz delikatnie usunięto, a osad zawieszono w HBS/40% gliceryny. Do nadsączu dodano HEPES pH 7,4 i NaCl do stężenia 20 mM i 150 mM i zarówno osad (zawierający wirusowe białko rdzenia i większość heksogalnego kapsydu, „rdzeń” fig. 42) jak i frakcję nadsączu, (zawierającą wiriony „wiriony” fig. 42) testowano pod kątem aktywności w dostarczaniu DNA do fibroblastów mysich Movl3 (Strauss i Jaenisch, 1992) lub komórek HeLa.
Wytwarzanie kompleksów DNA prowadzono następująco. Określone ilości każdej frakcji (wirusa rozbitego przed wirowaniem lub nienaruszonego wirusa) wyrażone jako pg białka oznaczone metodąBradforda, rozpuszczono w 300 pl HBS. Następnie dodano streptawidyny-pohlizyny (3 pg w 50 pl HBS) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Do pierwszego roztworu dodano 6 pg pCMVL (oznaczonego na rysunku pCLuc) rozpuszczonego w 100 pl HBS i inkubowano przez 30 minut. Wreszcie, dodano 2 pg TfpL w 100 pl HBS, i znów próbki inkubowano przez 30 minut. W przypadku próbek zawierających tylko TfpL, 8 pg TfpL w 170 pl HBS zmieszano z 6 pg pCMVL w 330 pl HBS i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do kompleksów TfpL/DNA dodano określonych ilości białka wirusowego rozpuszczonego w 300 pl HBS. Następnie wszystkie próbki dodano do 5 χ 105 komórek na płytkach o średnicy 6 cm, zawierających 2 ml DMEM/10% FCS (komórek HeLa lub fibroblastów Moc 13) na 1 godzinę. Po inkubacji do komórek dodano 5 ml świeżego podłoża zawierającego 10% FCS i 20 godzin później komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy. Powstającą aktywność (jednostki światła) dla komórek HeLa (panel A) lub fibroblastów Movl3 (panel B) przedstawiono na fig. 42.
W obu typach komórek stwierdzono zależne od dawki zwiększenie aktywności dostarczania DNA związanej z frakcją wierzchołkową (próbki 4-6 w obu panelach). Jeżeli ta sama ilość biotynylowanego białka wirusowego włączona jest w kompleksy TfpL/DNA pozbawione streptawidyny-polilizyny, obserwuje się dostarczanie DNA bliskie tła (próbka 3 w obu panelach).
Przykład 27 - Zwiększenie przenoszenia genów przez potrójne kompleksy DNA zawierające koniugaty z galaktoząjako ligandem
a) Kompleksy potrójne zawierające koniugaty peptydu grypy
Stwierdzono, że obecność w kompleksach DNA/transferyna-polilizyna sprzęgniętych z polihzynąpeptydów zawierających sekwencje N-końca podjednostki HA-2 hemaglutymny wirusa grypy istotnie zwiększa przenoszenie genów ze pośrednictwem transferyny-pohhzyny (przykłady 13 i 14).
180 304
Podobne kompleksy kombinowane, zawierające czteroczułkowe koniugaty ligand galaktozowy-polilizyna i zmodyfikowany polilizynąpeptyd grypy InflupL (otrzymane jak opisano w przykładzie 6 lub 13, odpowiednio) wytworzono przez dodanie koniugatu ligand-polilizyna do plazmidu DNA pCMVL w celu zobojętnienia połowy ładunku DNA, wykorzystując pozostałe ładunki do połączenia kompleksów z koniugatem peptyd grypy-polilizyna. Dostarczenie tych kompleksów DNA, zawierających syntetyczny ligand (gal)4, do hepatocytów BNL CL.2 (transfekcję prowadzono jak opisano w przykładzie 6 g) dało ekspresję genu lucyferazy (fig. 43) znacząco większą niż ekspresja uzyskana z trans feryną jako ligandem. Ekspresja była ponad 500 razy większa niż uzyskana w doświadczeniach kontrolnych, w których użyto kompleksów DNA nie zawierających peptydu grypy, ale zawierających takie same ilości polilizyny (fig. 43). Aktywność uzyskana z kombinowanymi kompleksami DNA była także około 30 razy wyższa niz uzyskana z kompleksami DNA/(gaI)4pL inkubowanymi z komórkami w obecności chlorchiny.
b) Kompleksy potrójne zawierające koniugaty adenowirusowe
Kompleksy otrzymano następująco: biotynylowanego wirusa dl312 S(otrzymanego jak opisano w przykładzie 19; 2 μΐ, 6 μΐ, 18 μΐ; 1012 cząstek/ml) w 50 μΐ HBS zmieszano ze streptawidyną-polilizyną (100 ng, 160 ng, 480 ng) w 100 μΐ HBS; po 30 minutach inkubacji dodano roztworu 6 pg pCMVL w 200 μΐ HBS i po następnych 30 minutach dodano 3,8 pg (gaI)4pL (otrzymanego jak opisano w przykładzie 6) lub 7 pg TfpL w 150 pl HBS.
Roztwory kompleksów DNA dodano do 300000 komórek (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, ATCC TIB76) rosnących na płytkach o średnicy 6 cm w podłożu DMEM z wysoką zawartością glukozy plus 2% FCS. Następne etapy hodowli i komórek i test lucyferazy prowadzono jak opisano. Ekspresję genów (po 24 godzinach) przedstawiono na fig. 44.
Przykład 28- Przenoszenie genów do hmfoblastoidalnych komórek-B
Koniugaty ludzka-Ig/polilizyna i koniugaty antyludzka-Ig/polilizyna otrzymano w sposób następujący. Sprzęganie prowadzono metodami znanymi w literaturze (Jung i wsp., 1981) przez wprowadzenie mostków dwusiarczkowych po modyfikacji sukcynymidylo-pirydyloditiopropionianem (SPDP, Jung i wsp., 1981).
a) Wytwarzanie koniugatów antyludzka-Ig/polilizyna
Roztwór 2 mg antyludzka-Ig kozy (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, ąL, USA) w HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 8,7) zmieszano z 14 pl 5 mM roztworu SPDP w etanolu (Pharmacia). Po 10 godzinach w temperaturze pokojowej, roztwór filtrowano w kolumnie Sephadex G25, (eluent 100 mM HEPES, pH 7,3) i uzyskano 1,3 mg antyludzkiej-Ig, zmodyfikowanej 30 nmolami reszt pirydyloditiopropionianowych. Poli(L)lizynę 300 (Sigma; średni stopień polimeryzacji 300 reszt lizyny) modyfikowano analogicznie i doprowadzono do formy zmodyfikowanej resztami merkaptanowymi przez traktowanie ditiotreitolem i filtrację żelową. Roztwór 12 nmoli polilizyny 300, zmodyfikowanej 29 nmolami grup merkaptanowych w 0,3 ml HBS zmieszano z powyższą antyludzką-Ig w warunkach beztlenowych i pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Stężenie soli doprowadzono do 0,6 M dodając 5 M NaCl. Koniugaty izolowano za pomocąchromatografii jonowymiennej (Pharmacia, Mono S HR 5/5); po dializie wobec 25 mM HEPES, pH 7,3, otrzymano koniugaty zawierające 0,33 mg antyludzkiej-Ig, zmodyfikowanej 4 nmolami polilizyny 300 (stosunek molowy 1:2).
b) Wytwarzanie koniugatów ludzka-Ig/polilizyna 300
Roztwór 19,5 mg (122 nmole) przeciwciała (Sigma 1-4506) z 2 ml HBS zmieszano z 39 pl 10 mM etanolowego roztworu SPDP (Pharmacia). Po 2,5 godzinach w temperaturze pokojowej, roztwór przepuszczono przez kolumnę żelową (Sephadex G 25, eluent 100 mM HEPES, pH 7,9) i uzyskano 19 mg (119 nmoli) ludzkiejIgG, zmodyfikowanej 252 nmolami reszt pirydyloditiopropionaniowych. Polilizynę 300 zmodyfikowano analogicznie do a) w celu uzyskania formy merkaptanowej. Roztwór 119 nmoli polilizyny 300, zmodyfikowanej 282 nmolami grup merkaptanowych w 1 ml HBS zmieszano z powyższą modyfikowaną ludzkąlgG w warunkach beztlenowych i pozostawiano na noc w temperaturze pokojowej Stężenie soli doprowadzono do 0,6 M dodając 5 M NaCl Koniugaty izolowano za pomocą chromatografii jonowymiennej
180 304 (Pharmacia, Mono S, 50 mM HEPES pH 7,3, gradient soli, 0,6 M do 3 M NaCl); po dializie wobec HBS, pH 7,3, otrzymano koniugaty zawierające 9 mg (57 nmoli) ludzkiejlgG, zmodyfikowanej 90 nmolami poli lizyny 300 (stosunek molowy 1:1,6).
c) Wytwarzanie kompleksów i transfekcja
Kompleksy wytwarzano następująco: biotynylowanego adenowirusa dl312 (30 pl; 1012 cząstek/ml) w 50 pl HBS zmieszano ze streptawidyną-polilizyną (800 ng) w 100 μΐ HBS. Po 30 minutach inkubacji dodano roztworu 9 pg pCMVL-L w 200 pl HBS i po następnych 30 minutach dodano roztworu 5,1 pg polilizyny (pLys450), 10,2pgTfpL, 12 pgkoniugatu ludzka-Ig/polilizyna lub 10 pg koniugatu antyludzka-Ig/polilizyna, w 150 pl HBS. Roztwór kompleksu DNA dodano do 106 limfoblastoidalnych komórek-B (otrzymanych przez unieśmiertelnienie ludzkich komórek monojądrzastych krwi obwodowej za pomocą wirusa Epstam-Barra tak, jak opisał Wells i Crawford, 1989), rosnących w 24-studzienkowych mikroplytkach, w RPMI 1640 + 2% FCS. Warunki hodowli i prowadzenie testu lucyferazy opisano poprzednio. Aktywność ekspresyjną genu lucyferazy w jednostkach światła przedstawiono na fig. 45.
Przykład 29- Przenoszenie DNA za pomocą transferyny-polilizyny w obecności wolnego i sprzężonego rhinowirusa
a) Otrzymywanie rhinowirusa HRV-2
Rhinowirusa HRV-2 otrzymano i oczyszczono takjak pisano (Skern i wsp., 1984).
400 pl roztworu rhinowirusa (około 30 pg) HBS (150 mM NaCl, 5 mM HEPES pH 7,9)/10% gliceryny potraktowano 10 nmolami NHS-LC biotyny (Pierce 21335). Po 3 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej wirusa oddzielono od mewłączonej biotyny przez intensywną dializę wobec HBS/40% gliceryny w temperaturze 4°C.
Rhinowirus wrażliwy na światło otrzymany przez namnażanie wirusa w obecności oranżu akrydynowego, inaktywowano takjak opisał Madshus i wsp., 1984.
b) Otrzymywanie kompleksów i transfekcja
i) Kompleksy transferyna-polilizynaZDNA wytworzono przez zmieszanie roztworu 6 pg DNA plazmidowego pCMVL w 330 pl HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,3) i roztworu 8 pgTfpL290w 170 pl HBS.
Kompleksy DNA zmieszano z 1,5 ml podłoża (DMEM + 2% FCS) i od 0,14 pg do 3,5 pg rhinowirusa HRV-2 (lub inaktywowanego HRV-2). Mieszaninę dodano do komórek NIH 3T3 (300000 komórek na płytkę o średnicy 6 cm). 4 godziny później podłoże do transfekcji wymieniono na 4 ml świeżego DMEM + 10% FCS. 24 godziny później komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy takjak to wcześniej opisano (fig. 46A).
ii) Kompleksy kombinowane zawierające transferynę-pohlizynę i koniugaty rhmowiruspohhzyna otrzymano następująco: 100 pl roztworu biotynylowanego rhinowirusa HRV-2 (3,5 pg) w HBS zmieszano z 1 pgstreptawidynylowanej polilizyny w 100 pl HBS. (Inne stężenia wirusa zmieszano z odpowiednimi ilościami). Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, roztwór zmieszano z 6 pg DNA plazmidowego w 150 pl HBS i po następnych 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, zmieszano z 6 pg TfpL290 w 150 pl HBS.
Kompleksy DNA zmieszano z 1,5 ml podłoża (DMEM + 2% FCS) i dodano do komórek NIH 3T3 (300000 komórek na płytkę o średnicy 6 cm). Dalszą hodowlę i test aktywności lucyferazy prowdzono takjak opisano w i) (fig. 46B).
Przykład 30- Transfekcja komórek HeLa kompleksami połączonymi zawierającymi rhinowirusa związanego jonowo
Wytwarzanie kompleksów A): kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie 30 pl adenowirusa dl 312 (około 109PFU)z 1 pg polizyny pLys450 (średnia długość łańcucha 450 monomerów) w 170 pl HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, roztwór zmieszano z 6 pg pCMVL-DNA w 170 pl HBS. Po następnych 30 minutach inkubacji kompleksy zmieszano z 9 pg TfpLl90 w 170 pl HBS Mieszaninę (10% = 50 pl roztworu, 600 ng DNA;
180 304 lub 1 % = 5 μΐ roztworu 60 ng DNA) rozcieńczono 1,5 ml podłoża DMEM + 2% FCS i dodano do komórek 300000 komórek HeLa. Po 4 godzinach dodano 2 ml DMEM + 20% FCS. 24 godziny po transfekcji zebrano komórki i przeprowadzono próbę na aktywność lucyferazy tak jak to opisano. Aktywność lucyferazy odpowiadająca ekstraktowi całkowitemu wynosiła 29115000 jednostek światła (w przypadku 600 ng DNA) i 1090000 jednostek światła (w przypadku 60 ng DNA).
Wytwarzanie kompleksów (doświadczenie kontrolne) B): kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie 6 pg pCMVL-DNA w 170 pl HBS z 1 pg polilizyny pLys450 (średnia długość łańcucha 450 monomerów) w 170 pl HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, zmieszanie z 9 pg TfpL190 w 170 pl HBS. Po następnych 30 minutach inkubacji kompleksy zmieszano z 30 pl adenowirusa d 1312 (około 109 PFU). Mieszaninę 10% = 50 pl roztworu, 600 ng DNA; lub 1% = 5 pl roztworu, 60 ng DNA) rozcieńczono 1,5 ml podłoża DMEM + 2% FCS i dodano do 300000 komórekHeLa. Po 4 godzinach dodano 2 ml DMEM + 20% FSC. 24 godziny po transfekcji komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy tak jak to opisano w poprzednich przykładach. Aktywność lucyferazy odpowiadająca ekstraktowi całkowitemu wynosiła 4050000 jednostek światła (w przypadku 600 ng DNA) i 200 jednostek światła (w przypadku 60 ng DNA).
Przykład 31 - Przenoszenie genów za pomocą niewirusowych czynników endosomolitycznych
a) Wytwarzanie peptydów rozrywających błony
i) Wytwarzanie peptydów
Peptydy wytwarza się w automatycznym syntetyzerze (ABI 431 A) metodą syntezy na fazie stałej przy użyciu żywicy p-alkoksybenzyloalkoholowej (0,97 mmola/g) jako fazy stałej i aminokwasów chronionych Fmoc. Końce karboksylowe aminokwasów sprzęgają się z żywicą za pomocą symetrycznych bezwodników. Następnie aminokwasy sprzęga się za pomocą metody 1-hydroksybenzotnazolodicykloheksylokarbodnmidowej. Używano następujących grup zabezpieczających łańcuchy boczne: (Trt)Asn, (Trt)Cys, [(t-Bu)Cys) w przypadku EALA i GLF], (t-Bu)Glu), (Trt)His, (t-Bu)Ser).
Peptydy miały następujące sekwencje:
EALA: (SEQ ID NO:5) Trp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly -Ser-Cys
GLF: (SEQ ID NO:6) Gly-Leń-Phe-Gly-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Głu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys
GLF-II: (SEQ ID NO:7) Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu- Ala-GluAla-Leu-Ala-Glu-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-GIy-Gly-Ser-Cys
GLF-delta: (SEQ ID NO:8) Gly-Leu-Phe-Glu-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-AIa-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-AlaGly-Gly-Ser-Cys
EALA-Inf: (SEQ ID NO:9) Gły-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-GlyGly-Ser-Cys
EALA-P50: (SEQ ID NO: 10) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-G ly-Gly-Ser-Cys
P50: (SEQ ID NO: 11) Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly- TrpGlu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys
Peptydy odcina się od żywicy i usuwa grupy zabezpieczające łańcuchy boczne [z wyjątkiem (t-Bu)Cys) za pomocą traktowania 100 mg podłoża z peptydem 3 ml mieszaniny fenol/etanoditiol/tioanizol/woda/kwastrifluorooctowy 0.75:0.25.0.5'0.5· 10 przez 1.5 godziny wtem
180 304 peraturze pokojowej]. Surowe peptydy wytrąca się eterem i przemywa dwa razy. Peptydy zabezpieczone S-t-Bu EALA i GLF rozpuszcza się w małej objętości IM wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) pH 8, rozcieńcza do 100 mM TEAB i następnie oczyszcza się metodą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Nucleosil 500-5C4 (gradient 0,1 % TFA - acetonitryl). Oba peptydy wymywają się przy około 50% acetonitrylu Cys-SH formę peptydu, otrzymano usuwając zabezpieczające grupy Trt-Cys w ten sam sposób jak opisany powyżej. Surowy peptyd (5 mg) rozpuszcza się w 100 μΐ 100 mM TEAB, pH 8, zawierającego 1 μΐ β-merkaptoetanolu i oczyszcza przez filtrację na żelu (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, 0,5 mM EDTA) i liofilizuje lub chromatografię jonowymienną (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7,3, gradient: 0 do 3 M NaCl, peptyd wymywa się przy 1,5 M NaCl.
ii) Modyfikacja N-(hydroksyetylo)maleimidem
C-końcowe grupy SH peptydów GLF-delta, GFL-II, EALA-Inf, EALA-P50 i P-50 zablokowano po filtracji na żelu formy z wolnymi grupami SH ((Sephadex G-25, 20 mM HEPES, pH 7,3, 0,5 mM EDTA) za pomocą reakcji z 1,3- do 10-krotnym molowym nadmiarem N-(hydroksyetylo)maleimidu (1 godzina, temperatura pokojowa). Nadmiar maleimidu usuwa się przez filtrację na żelu (Sephadex G-25, 100 mM TEAB, pH 8) i peptydy (GLF-delta-mal, GFL-II-mal, EALA-Inf-mal, Eala-P50-mal i Ρ-50-mal) po liofilizacji otrzymuje się w postaci soli trietylomoniowych.
iii) Modyfikacja 2,2'-ditiobispirydyną
Peptydy z wolnymi grupami SH poddaje się reakcji z 10 równoważnikami 2,2'-ditiobispirydyny (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 mM EDTA) przez noc w temperaturze pokojowej. Nadmiar odczynnika usuwa się przez filtrację na żelu (Sephadex G-25,100 mM TEAB, pH 8) lub chromatografię jonowymienną (Mono Q Pharmacia, 20 mM HEpES, pH 7,3, gradient: 0 do 3 M NaCl, peptyd wymywa się przy 1,5 M NaCl) otrzymuje się peptydy (2-dipirydylotio)-Cys (GLF-delta-SSpy, GFL-II-SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50-SSPy i P-50-SSPy).
iv) Dimeryzacja peptydów
Homodimer P50 (P50 dim) wytworzono przez reakcję równomolarnych ilości P50-Cys-(2-dipirydylotio) i P50-Cys-SH w 20 mM HEPES, pH 7,3, przez trzy dni w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozdziela się na kolumnie Mono Q (HR 5/5 Pharmacia, 20 mM HEPES, pH 7,3, gradient 0,09 M do 3 M NaCl, P50 dimer wymywa się przy stężeniu 1,1 M NaCl). Heterodimer GLF-SS-P50 wytworzono analogicznie przez reakcję peptydu P50, w formie z wolnymi grupami SH, ze zmodyfikowanym grupami dipirydylotio peptydem GLF.
b) Test przeciekania liposomów
Zdolność syntetycznych peptydów do rozrywania liposomów badano przez uwalnianie barwnika fluorescencyjnego z liposomów załadowanych samogaszącąsię ilościąkalceiny. Liposomy wytworzono z fosfatydylocholiny jaj metodą odparowywania odwróconej fazy (Szoka i Papahadjopoulos) z fazą wodną zawierającą 100 mM kalcenmy, 375 mM Na+, 50 mM CaCl, pH 7,3 i przefiltrowaniu przez 100 nm filtr poliwęglanowy (MacDonaldi wsp., 1991) w celu uzyskania jednorodnego rozkładu wielkości. Liposomy oddziela się od niewłączonego materiału przez filtrację na żelu Sephadex G-25, z izoosmotycznym buforem (200 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH 7,3). Do testu wypływu z liposomów w różnym pH, wyjściowy roztwór rozpuszcza się (6 μΐ/ml) w 2x buforze do testu (400 mM NaCl, 40 mM cytrynian). Objętość 100 μΐ dodaje się do 80 μΐ seryjnych rozcieńczeń peptydu w wodzie w 96-studzienkowej mikropłytce (końcowe stężenie lipidów. 25 μΜ) i po trwającej 30 minut inkubacji za pomocąfluorymetru do mikropłytek, określa się fluorescencję kalceiny, przy długości fali 600 nm (wzbudzenie 490 nm). Wypływ wielkości 100% określono po dodaniu 1 μΐ 10% roztworu Tritonu Χ-100. Jednostki wypływu obliczono jako odwrotność stężenia peptydu, przy którym obserwowano 50% wypływ (to znaczy objętość (μΐ) roztworu liposomów, która jest hzowana w 50% przez pg peptydu) Wartości poniżej 20 jednostek ekstrapolowano. Wyniki testu na przeciekanie liposomów przedstawiono na fig. 50. GLF i EALA wykazują najwyższą pH-specyficzną aktywność.
180 304
c) Test lizy erytrocytów
Świeże ludzkie erytrocyty przemyto kilka razy HBS i zawieszono w 2x buforze do testu (300mMNaCl, 30 mM cytrynian) do gęstości 6,6 x 107/ml. Objętość 75 μΐ dodano do 75 pl seryjnych rozcieńczeń peptydu w wodzie w 96-studzienkowej mikropłytce (typu stożkowego) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C ciągle mieszając. Po usunięciu niezlizowanych erytrocytów przez wirowanie (1000 ref, 5 minut) 100 μΐ supematantu przenosi się do nowych mikropłytek i określa się absorpcję przy długości fali 450 nm (korekcja na tło przy 750 nm). Lizę wielkości 100% określono po dodaniu przed wirowaniem 1 μΐ 10% roztworu TritonuX-100. Jednostki hemolityczne obliczono jako odwrotność stężenia peptydu, przy którym obserwowano 50% lizę (to znaczy objętość (pl) roztworu erytrocytów, która jest lizowana w 50% przez pg peptydu). Wartości poniżej 3 jednostek hemolitycznych ekstrapolowano. Wyniki podano na fig. 49. Jak widać P50 dim i EALA-P50 wykazywały najwyższą aktywność specyficzną wobec pH, jeśli chodzi o lizę komórek i/lub uwolnienie większych cząsteczek, takich jak hemoglobina
d) Wytwarzanie kompleksów połączonych DNA
Kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie najpierw 6 pg pCMVL-DNA w 150 pl HBS z 4 pg TfpL290 w 150 pl HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, zmieszanie roztworu z 4 do 20 pg poli(L)lizyny290 w 100 pl HBS. Po następnych 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, dodaje się 0,3 do 30 pg peptydu w 100 pl HBS i mieszaninę inkubuje się następne 30 minut. Optymalną ilość czynnika endosomolitycznego ustala się wcześniej przez miareczkowanie w czasie badania otrzymanej wydajności przenoszenia genów (patrz tabela 3 przenoszenie genów do komórek BNL CL.2). Jednoczesne dodanie pLys i czynnika endosomolitycznego, a także użycie większych objętości do wytwarzania kompleksów (objętość końcowa 1,5 ml) dało porównywalne wydajności transfekcji. W tych doświadczeniach wykazano także, że niepeptydowe substancje amfipatyczne, kwas dezoksycholowy i kwas oleinowy, zwiększają zdolności do dostarczania DNA.
e) Transfekcja komórek
Linie komórkowe rosnące w monowarstwie (hepatocyty BNL CL.2 lub komórki NIH 3T3, odpowiednio) hodowano przez 1-2 dni przed transfekcją na płytkach Petriego o średnicy 6 cm (podłoże DMEM zawierające 10% FCS; 300000 komórek na płytkę). Podłoże usuwano i dodawano 1,5 DMEM (2% FCS) i 500 pl kompleksów DNA. Ewentualnie, używano 0,5 ml DMEM 6% FCS i 1,5 ml kompleksów DNA. Po 4 godzinach inkubacji dodawano 2 ml DMEM (18% FCS). Ewentualnie, podłoże do transfekcji zastępowano 4 ml DMEM 10% FCS. 24 godziny później komórki zbiera się i mierzy się aktywność lucyferazy tak, jak to opisano w poprzednich przykładach. Podane wartości w jednostkach światła, przedstawiają całkowitą aktywność lucyferazy w transfekowanych komórkach.
Transfekcję komórek BNL CL.2 pokazano na fig. 52:
Figura 52A) Kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie najpierw 6 pg pCMVL-DNA w 250 pl HBS z 4 pg TfpL290 w 250 pl HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, zmieszanie roztworu z 20 pg poli(L)lizyny290 w 750 pl HBS. Po następnych 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, dodano określone ilości peptydu w 250 pl HBS. Po 30 minutach inkubacji kompleksy zmieszano z 1,5 ml DMEM 6% FCS i dodano do 450000 komórek.
Figura 52B) Kompleksy DNA otrzymano jak następuje: Roztwór 6 pg pCMVL-DNA w 500 pl HBS miesza się z 4 pg TfpL290 w 250 pl HBS i pozostawia na 30 minut w temperaturze pokojowej. 500 pl roztworu 20 pg poli(L)hzyny290 w HBS miesza się z określonymi ilościami peptydu w 250 pl HBS i natychmiast dodaje do mieszaniny TfpL/DNA Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej kompleksy miesza się z 0,5 ml DMEM 6% FCS i dodaje do 450000 komórek Zbieranie komórek po transfekcji i test lucyferazy prowadzono jako opisano poprzednio.
180 304
Doświadczenia przeprowadzone z komórkami NIH 3T3 pokazano na figurze 53. Wytwarzanie kompleksów według A) i B) było takie same jak przy transfekcji komórek BNL CL.2.
W doświadczeniach z komórkami, P50dim i EALA-P50 wykazywały najwyższą aktywność, GLF i EALA miały średnią aktywność, natomiast monomer P50 i melityna miały niską aktywność.
Przykład 32-Przenoszenie genów za pomocą syntetycznych niewirusowych peptydów z oligolizynowym rozszerzeniem C-końca
Peptyd o sekwencji: (SEQ ID NO.4) Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys wytworzono i oczyszczono sposobem opisanym w poprzednim przykładzie. Peptyd ten pochodzi od δ-toksyny Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 3) Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys, o której wiadomo, że posiada zdolność do rozrywania błon w kwaśnym pH (Thiaudiere i wsp., 1991; Alouf i wsp., 1989) i ma dodane dodatkowe 10 lizyn.
Kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie najpierw 6 pgpCMVL-DNA w 170 μΐ HBS z 4 pg TfpL290 w 170 μΐ HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmieszanie roztworu z 3 pg peptydu w 170 pi HBS. Po 30 minutach inkubacji kompleksy miesza się z 1,5 ml DMEM 6% FCS i dodaje do 450000 hepatocytów BNL CL.2. Po 20 godzinach, dodaje się 2 ml DMEM plus 20% FCS. Zbieranie komórek 24 godziny po transfekcji i test lucyferazy prowadzono jak opisano w poprzednich przykładach. Aktywność lucyferazy odpowiadająca ekstraktowi całkowitemu wynosiła 481000 jednostek światła.
Przykład 33 - Transfekcja hepatocytów w obecności melityny-peptydów z C-końcowym ogonem oligo-Lys
Peptydy o sekwencji (kierunek: od końca N do końca C) (SEQ ID NO: 12) Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (oznaczony mell) i (SEQ ID NO: 13) Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (mutant kwasowy, oznaczony mel2) wytworzono tak jak opisano w przykładzie 32.
Kompleksy DNA otrzymano przez zmieszanie najpierw pg pCM VL-DNA w 170 pl HBS z 4 pg TfpL290 w 170 pl HBS i po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, zmieszanie roztworu z 3 pg peptydu mel 1 lub 5 pgmel2 w 170 pl HBS. Po 30 minutach inkubacji kompleksy miesza się z 1,5 ml DMEM 6% FCS i dodaje do 450000 hepatocytów BNL CL 2 i hoduje się tak jak opisano w przykładzie 32. Po 4 godzinach, dodaje się 2 ml DMEM plus 20% FCS Zbieranie komórek 24 godziny po transfekcji i test lucyferazy prowadzono jako opisano w poprzednich przykładach. Aktywność lucyferazy odpowiadająca ekstraktowi całkowitemu wynosiła 92000 jednostek światła (w przypadku mell) i 94000 jednostek światła (w przypadku me!2).
Przykład 34 - Ekspresja interferonu a w komórkach HeLa
Komórki HeLa (5 χ 103 komórek na płytkę o średnicy 6 cm) transfekowano pAD-CMV 1 -IFN, kodującym ludzki interferon alfa2c pod kontrolą sekwencji wzmacniającej/promotora CMV (opisanym w DE 4021 917 A, pAD-CMV 1 -IFN wytworzono przez wklonowanie insertu w HindIH-XbaI IFN-a2c do pAD-CMVl). Próbki 6 pg DNA w 330 μΐ HBS miesza się z 8 μg TfpL w 330 pl HBS i pozostawia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Próbki 6-10 zawierajątylko 4 pg TfpL i po 30 minutach inkubacji do próbek 61 7 dodaje się P16pL (20 pg). Po następnych 30 minutach inkubacji dodaje się 160 pl HBS zawierających określone objętości wolnej P16 (syntezę P161P16L opisano w przykładzie 13): 10 pl (próbka 8) lub 50 pl (próbki 9 i 10). Po następnych 30 minutach inkubacji próbki dodaje się do komórek HeLa w 2 ml DMEM/2% FCS, w obecności następujących dodatkowych związków Próbki 2,7 i lOzawierały lOOpMchlorchiny, próbki3.4 zawierały 5 i 15 pl adenowirusa dl312 (1 x 1012 cząsteczek/ml), próbka 5 zawierała 15 pl wirusa inaktywowanego psolarenem Jako kontrolę stymulacji przez wirusa endogennego wytwarzania
180 304 interferonu, próbki 11,12 i 13 traktowano takimi samymi objętościami wirusa jak próbki 3,4 i 5. Zbieranie komórek po transfekcji i test lucyferazy prowadzono jako opisano poprzednio. 2 godziny po transfekcji do komórek dodaje się 5 ml świeżego DMEM plus 10% FCS. 48 godzin po transfekcji podłoże zastępuje się 2 ml DMEM + 10% FCS. Podłoże to zbiera się 72 godziny po transfekcji i prowadzi się test metodąELISA na zawartość interferonu alfa, tak jak opisano w DE 4021 917. Poziom interferonu alfa (w ng/ml) pokazano na fig. 54.
TfpL słabo dostarcza gen IFN do tych komórek, co jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami przy użyciu lucyferazy lub β-galaktozydazy. Obecność chlorchiny wytwarza wykrywalny sygnał (około 7 ng/ml, próbka 2), ale adenowirus dl312 stymuluje dostarczanie DNA w sposób zależny od dawki (próbki 3 i 4). Traktowanie tych komórek porównywalnymi ilościami wirusa w nieobecności kompleksów IFN DNA nie dało wykrywalnego sygnału interferonu (próbki 11 i 12). Transfekcja syntetycznym endosomolitycznym peptydem, pochodzącym z wirusów grypy P16 (patrz przykład 13), w postaci koniugatu (próbki 6 i 7) lub peptydu jonowo związanego z powierzchnią kompleksu TfpL/DNA (próbki 8,9 i 9, wiązanie peptydu opisano w przykładzie 31), dawała wykrywalny poziom wytwarzania interferonu, który był jeszcze większy w przypadku koniugatu peptydu w obecności chlorchiny (próbka 7).
Tabela 1A
Sposób transfekcji
Typ komórki TfpL TfpL + chlorchina Tfp + wolny AdenoV TfpL + sprzężony AdenoV TfpL + influpLys
Kompleks: (A.) (A) (B-) (E.) (F)
Hepatocyty Hep G2 BNL.C12 pierwotne - +/+/- +++ ++4 1 +++++ ++ -H-+
Mioblasty/miotubule C2C12 g8 pierwotne +/+/- +/+- +++++ +++++ +++
Fibroblasty 3T3 Mov-13 mysie komórki L pierwotne + +/+/- +4+/- + + +++++ +++++ +++++ -1-+++ ++ + ++
Komórki śródbłonka aorta świni +/- + +++ +/-
Ludzka linia komórkowa neuroblastomy Gl-ME-N +/- +/- +++ ++++
Komórki HeLa + -1- ++-r++ +++++ Ί—h+
180 304
Tabela IB
Typ komórki TfpL TfpL + chlorchina TfpL + wolny AdenoV TfpL sprzężony AdenoV TfpL + influpLys
Kompleks: (A.) (A.) (B.) (E.) (F.)
Mysie komórki ES CCE Bruce 4 +/- +/- + ++ + ++
Komórki erytroidalne K562 HD3 kurczaka ++ ++++ ++++ 4- 4-4-+ ++-H-+ lilii· +
Szpik kostny mysi kurczaka +/- + ++ -H-+
Transformowane EBV ludzkie komórki B - - - +++ +
Mysie komórki osocza linie (MPC11, SP2/0) + ++ +++
Aktywność lucyferazy +/1000-10000 jednostek światła na 106 komórek
10000-1 milion jednostek światła
1-5 milionów jednostek światła
5-50 milionów jednostek światła
50-100 milionów jednostek światła >100 milionów jednostek światła
TpfL transferyna-pohhzyna
AdenoV defektywny w replikacji adenowirus d!312
Influ-pLys N-końcowy peptyd HA-2 grupy-pohlizyna
Tabela 2A
Białka aktywne w stosunku do błon
Białka fuzyjne wirusa
N-końcowe sekwencje fuzyjne wirusy otoczkowe
wirus grypy myxovindae HA2 pH 5 White, 1990 i Takahashi, 1990
VSV rhabdovindae G pH 5 Hoekstra, 1990
wirus ospy 14kDa pH 5 Gong i wsp., 1090
wirus sendai paramyxoviridae FI pH 7 Hoekstra, 1990, Gething i wsp , 1978
wirus measles paramyxoviridae F pH 7 Hoekstra, 1990
wirus HIV retrovindae gp41 pH 7 Slepushkin i wsp , 1992
wirus S1V retrovindae gp41 pH 7 Ruysachaert i Vandenbranden, 1991, Franchmi i wsp., 1989
wirusy nieotoczkowe
wirus polio enterovmdae vpl pH 5 Fncke i Hogle, 1990
wirus coxackie enterovindae vpl pH 5 Gething i v\sp , 1978
rhmowirus vpl pH 5
180 304 wewnętrzne sekwencje fuzyjne wirusy otoczkowe
w. Semliki Forest togaviridae wirus sindbis wirusy nieotoczkowe rotawirus rezusa
El pH 5 White, 1990
White, 1990 vp 5 Maćków i wsp., 1988
Tabela 2B
Toksyny mikroorganizmów
streptolizyna 0 aktywowana grupami siarkowodorowymi, wiąże się do 20-80 mer. cholesterolu, 15 nm pory Streptococcus 69 kDa pH 7 Kehoe i wsp , 1987
hsteriolizyna O aktywowana grupami siarkowodorowymi, wiąże się do cholesterolu, pokrewna z C9 i streptohzyny O L monocytogenes 60 kDa pH 5 Geoffroy i wsp., 1987
a-toksyna powierzchni amfipatyczna, struktura typu β, uszkodzenie heksamerowe, 2 nm pory Streptococcus 34 kDa pH 7
hemolizyna 8 helis amfipatycznych E. coli 416 AA pH 7 Oropaza-werketie i wsp ,1992
hemolizyna analogia do perforyn, pokrewna z C9 Trypanosoma cruzi 75 kDa pH 5 Andrews i wsp , 1990
System immunologiczny kręgowców
perforyna cytotoksyczne komórki T Ojcius i Jung 1990
wnikanie do komórki zależne od jonów Ca+“ komplement pusty cylinder białkowy, kanał 10 nm, aktywność regulowana C9 (MACc5b-8,9i-4) Shadki i Tranum-Jensen, 1991
Białko fuzji jajeczko-plemnik
PH-30a-podjednostka białka powierzchniowego, wewnętrzna sekwencja fuzyjna pH7 Blobel i wsp , 1992
Tabela 2C
Peptydy aktywne w stosunku do błon
Toksyny obronne
mehtyna jad pszczoły 1991 26AA amfipatyczny, a-helix pro-zwimęta Blondelle i Houghten, 1991 Dempsey i wsp , 1991, Ikura i Inagaki,
bombohtyna 17AA amfipatyczny, a-hehx Argiolas i Pisano, 1985
jad trzmiela mastoparen 14AA amfipatyczny, a-helix Argiolas i Pisano, 1985
jad osy krabrolina 13AA amfipatyczny, a-helix Argiolas i Pisano, 1985
jad szerszenia pardaksyna z soli, odstraszająca rekiny 33AA amfipatyczny, cz-helix pio-zwinięta Shai i wsp , 1990
Peptydy przeciwbakteryjne sarkotoksyna 1A, Mucha mięsna (w hemolimfie)
cekropiny owady, system immunologiczny humoralny, jedwabnik 37AA amfipatyczny, a-helix pro-zwinięta Esser i wsp., 1991
maginina skóra Xenopus laevis 23AA amfipatyczny, a-helix Manon i wsp., 1988
alamecytyna grzyb, (Trichoderma vinde) 15-24AA amfipatyczny, a-helix, kwas a-aminomasłowy Esser i wsp., 1991
Toksyny bakteryjne
δ-toksyna Staphylococcus aureus 26AA amfipatyczny, a-helix, aktywowany kwasem Thiaudiers i wsp., 1991 Alouf i wsp., 1989
amoebapore Entoamoeba histolytica 25 AA amfipatyczny, a-helix, aktywowany kwasem Leippe i wsp ,1991
System immunologiczny kręgowców defenzyny neutrofile wielojądrowe 29-34AA mostki SS, struktura β Lehrer i wsp., 1991
Tabela 3
Transfekcja komórek BNL CL.2 (6 pg pCMV-L DNA, 4 pg TfpL290)
pLys 0 Mg 0,3 Mg 1 Mg 3 Mg 10 Mg 20 Mg 30 Mg
o Mg P50dtm GLF Melityna 160 330 490 0 540 290 0 300 340 0 70 425
4 Mg P50dim GLF EALA 3100 670 3140 200 600 150 430 170 560 180 410
10 Mg P50dim GLF EALA 5700 1950 2120 16600 16800 217000 179300 760 215000 181700 1330 1980 76360 3424800
20 Mg P50dim GLF EALA Melityna 3200 23300 418400 191000 6545 185100 320600 181000 7054800 294200 273600 9344000
Kwas dezoksycholowy 6730 34700 16000
Kwas oleinowy 12200 11900 4100 1
180 304
Literatura,
Abrahamson, D.R. et al., 1981, J. Celi Biol., 91, 270280.
Akopian, T.A. et al., 1991, Nuci. Acids Res. 19, 424.
Alouf, J.E., Dufourcq J., Siffert O., Thiaudiere E. und Geoffroy Ch., 1989, Eur. J. Biochem. 183, 381-390.
Anderson, P. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1130111304.
Andrews, N.W., Abrams C.K., Slatin S.L. und Griffiths G., 1990, Celi 61, 1277-87.
Ansardi, D.C. et al., 1991, J. Virology 65, 2088-2092.
Argiolas, A. und Pisano J.J., 1985, J. Biol. Chem. 260, 1437-1444.
Armentano, D., Yu, S-, Kantoff, P., von Riiden, T., Anderson, W.F. und Gilboa, E., 1987, J. Virol. 61, 1647-1650.
Armentano, D. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6141-6145.
Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23, 95101.
Ascoli, M. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253, 78327838.
Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rev. Biochem., 51, 531554.
Atherton, E., Gait, M.J., Sheppard, R.C. und Williams, B.J., 1979, Bioorg. Chem. 8, 351.
Barr, E. und Leiden, J., 1991, Science 254, 1507-1509.
Bartlett, G.R., 1959, J. Biol. Chem. 234, 466.
Berkner, K.L., 1988, BioTechnigues 6, 616-629.
Berns, K.I., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, 1743-1759.
Bhakdi, S. und Tranum-Jensen J., 1991, Iinmunology today 12, 318-320.
Blau, H. et al., 1985, Science 230, 758-766.
180 304
Blobel, C.P., Wolfsberg T.G., Turuck C.W., Myles D.G., Primakoff P. und White J.M., 1992, Naturę 356, 248-252.
Blondelle, S.E. und Houghten R.A., 1991, Biochemistry 30, 4671-4678.
Bondeson, J., Wijkander, J. und Sundler, R., 1984, Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27.
Boulanger, P.A. und Puvion, F., 1973, Eur. J. Blochem. 39, 37-42.
Bragg, R.R. et al., 1991, Onderstepoort J. Vet. Res. 58, 309-310.
Carpenter, G., 1984, Celi, 37, 357-358.
Chardonnet, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462477.
Cheng, S-Y. et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3425-3429.
Ciliberto, G., Dente, L., Cortese, R., 1985, Celi 41, 531-540.
Ciarkę, D.D., Mycek, M.J., Neidle, A. und Waelsch, H., 1959, Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354.
Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F., 1990, EMBO J. 9, 233-240.
Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H., Wagner, E., Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., und Birnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 4033-4037.
Davidson, D. und Hassell, J.A., 1987, J. Virol. 61, 1226-1239.
Davis, B.D. und Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, Sterilization and Disinfection, 1263-1274.
Defer, C., Belin, M., Caillet-Boudin, M. und Boulanger, P., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673.
Dempsey, C.E., Bazzo R-, Harvey T.S., Syperek I., Boheim G. und Campbell I.D., 1991, FEBS Lett. 281, 240-244.
180 304
De Wet, J., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. und Subramani, S., 1987, Mol. Celi. Biol. 7, 725-737.
Dhawan, J. et al., 1991, Science 254, 1509-1512.
Donti, E. et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 30, 225-231.
Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, The Naturę of Viruses, 853-884.
Eaton, D.L. et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347.
Esser, A.F., 1991, Immunology today 12, 316-318.
Fields, B.N. und Knipe, D.M., 1990, Virology, 2nd edition, Raven Press, Ltd., New York.
FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, I. und Willingham, M-, 1983, Celi 32, 607-617.
Folk, J.E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375.
Franchini, G., 1989, Science 244, 694-697.
Fricks, C.E. und Kogle J.M., 1990, J. Virol. 64, 19341945.
Fujiwara, et al. , 1981, J. Immunol. Meth. 45, 195.
Geoffroy, C., Gaillard J.-L., Alouf J.E. und Berche P., 1987, Infection and Inununity 55, 1641-1646.
Gething, M.J., White J.M. und Waterfield M.D., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2737-2740.
Ginsberg, H.S., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper & Row, Picornaviruses, 1095-1117.
Goldmacher, V.S., BlSttler, W.A., Lambert, J.M., Mclntyre, G. und Steward, J., 1989, Molecular Pharmacology 36, 818-822.
Goldstein, J.L. et al., 1982, Clin. Res., 30, 417-426.
Goldstein, J.L. et al., 1979, Proc. Natl Acad. Sci.
USA, 76, 333-337.
Goldstein, L.J. et al., 1980, Naturę 285, 66
Gong, S., Lai C. und Esteban M., 1990, Virology 178, 81-91.
Green
M. et al.
1989
Celi 58
215-223.
180 304
Hearst, J. E. und Thiry, L., 1977, Nuci. Acids Res. 4, 1339-1347.
Heldin, C-H. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 42164221.
Helene, C. und Toulme J.-J., 1990, Biochem. Biophys. Acta 1049, 99-125.
Herskowitz, I., 1987, Naturę 329, 219.
Hizuka, N. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256, 45914597.
Hoekstra, D., 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22, 121-155.
Holland, J.J., 1990, Virology,2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165.
Horvath, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345.
Horwitz, M.S., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven Press Ltd., New York, Adenoviridae and their replication, 1679-1721.
Hosang, M. et al., 1987, EMBO J. , 6, 1197-1202.
Huang, A.S., 1987, The Molecular Basis of Viral Replication, Ed. by Bercoff, R.P., Plenum Press New York and London, The Role of Defective Interfering (DI) Particles in Viral Infection, 191-194.
Ikura, T., Go N. und Inagaki F., 1991, Proteins 9, 8189.
Imamura, K. et al., 1987, J. Inununol., 139, 2989-2992. Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.
Jones, N. und Shenk, T., 1979, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 3665-3669.
Jung, et al., 1981, Biochem. Res. Commun. 101, 599.
Kapłan, J. et al., 1979, J. Biol. Chem., 254, 73237328.
Kasid, A., Morecki, S., Aebersold, P., Cornetta, K., Culver, K., Freeman, S., Director, E.z Lotze, M.T., Blaese, R.M., Anderson, W.F. und Rosenberg,
180 304
S.A., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 473-477.
Kehoe, M.A., Miller L., Walker J.A. und Boulnois G.J., 1987, Infect. Immun. 55, 3228-3232.
Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. und Wagner, E.F., 1985, Naturę 318, 149-154.
Khang, C. und Nagaraji. K.V., 1989, Am. J. Vet. Res. 50, 1466-1470.
Klausner, R.D. et al., 1983, J. Biol. Chem., 258, 47154724.
Klausner, R.D. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2263-2266.
Kuhn, L.C. et al., 1982, Trends Biochem. Sci., 7, 299302.
Kurachi, K., Davie, E.W., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79, 6461-6464.
Laver, W.G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.
Lehrer, R.I., Ganz T. und Selsted M.E., 1991, Celi 64, 229-230.
Leippe, M., Ebel S., Schoenberger O.L., Horstmann R.D. und Muller-Eberhard H.J., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7659-7663.
Lim, K. und Chae, C.B., 1989, BioTechnigues 7, 576-579.
Luthmann, H. und Magnusson, G., 1983, Nuci. Acids Res. 11, 1295-1308.
MacDonald, R.C. et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1061, 297-303.
Macgregor, G. und Caskey, C.T., 1989, Nuci. Acids Res. 17, 2365.
Maćków, E.R., Shaw R.D., Matsui S.M., Vo P.T., Dang M.N. und Greenberg H.B., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 645-649.
Madshus, I.H., Olsnes, S. und Sandvig, K., 1984, Virology 139, 346-357.
Malim, M. et al., 1989, Celi 58, 205-214.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manuał. Cold Spring
180 304
Harbor Laboratory, 474.
Marion, D., Zasloff M. und Bax A., 1988, FEB 227, 21. Marshall, S., 1985, J Biol. Chem., 250, 4133-4144.
Massague, J. et al., 1986, J. Celi. Physiol., 128, 216222.
McClure, M.O., Sonunerfelt, M.A., Marsh, M. und Weiss, R.A., 1990, J. General Virol. 71, 767-773.
Mellman, I.S. et al., 1984, J. Celi Biol., 98, 11701177.
Mizel, S.B. et al., 1987, 1987, J. Inununol., 138, 29062912.
Ojcius, D.M. und Young J.D., 1991, TIBS 16, 225-229.
Oropeza-Werkerle, R.L., Muller S., Briand J.P., Benz R., Schmid A. und Goebel W., 1992, Mol. Microbiol. 6, 115-121.
Otero, M.J. und Carrasco, L., 1987, Virology 160, 7580.
Pacini, D.L. et al., 1984, J. Infect. Dis. 150, 92-97. Parente, R.A. et al., 1990, Biochemistry 29, 8720-8728. Patek, P.Q., Collins, J.L. und Cohn, M. 1978, Naturę 276, 510-511.
Ponder, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 1217-1221.
Posner, B.I. et al., 1982, J. Celi Biol., 93, 560-567.
Precious, B. und Russell, W.C., 1985, Virology, ed.
Mahy, B.W.J., IRL Press, 0xford, Washington, DC, 193-205.
Rafalski, M., Lear, J.D. und DeGrado, W.F., 1990, Biochemistry 29, 7917-7922.
Reece, R.L. et al, 1987, Aust. Vet. J. 64, 365-367. Riordan, J.R. et al., 1989, Science, 245, 1066-1073.
Rosenberg, St.A. et al., 1992, Humań Gene Therapy 3, 75-90.
Ruysschaert, J.-M. und Vandenbranden M., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 872-879.
Sambrook, J. et al. (Eds.), 1989, Molecular Cloning,
180 304
2nd Edition, Vol. 3, 16.39-16.40.
Schalch, D.S. et al., 1986, Endocrinology, 118, 15901597.
Sennett, C. et al., 1981, Annu. Rev. Biochem., 50, 1053-1086.
Seth, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M. und Pastan, I., 1984, Mol. Celi. Biol. 4, 15281533.
Severne, Y., Wieland, S., Schaffner, W. und Rusconi, S., 1988, EMBO J. 7, 2503-2508.
Shai, Y., Bach D. und Yanovsky A., 1990, JBS 265, 20202-20209.
Sharon, N., 1987, Celi Separation: Mebhods and Selected Applications, Vol. 5, Academic Press Inc., pp.1344.
Silver, L. et al., 1988, Virology 165, 377-387.
Sipe, D.M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 256, 3469-3474.
Skern, T. et al., 1984, Virology 136, 125-132.
Slepushkin, V.A., Andreev S.M., Siderova M.V., Melikyan G.B., Grigoriev V.B., Chumakov V.M., Grinfeldt A.E., Manukyan R.A. und Karamov E.V., 1992, AIDS Res. Humań Retroviruses 8, 9-18.
Sly, W. et al., 1982, J. Celi Biochem., 18, 67-85.
Smith, K.A. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 864-867.
Stahl, P.D. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1399-1403.
Straubinger, R.M. und Papahadjopoulos, D., 1983, Meth. Enzymol. 101, 512-527.
Strauss, W. und Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417422.
Subbarao, N.K. et al., 1987, Biochemistry 26, 29642972.
Sullenger, B.A. et al., 1990, Celi 63, 601-608.
Svensson, U., 1985, J.Virol., 55, 442-449.
Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., 1978,
180 304
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75, 4194-4198.
Takahashi, S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264.
Takayama, K.M. und Inouye, M., 1990, Critical reviews in Biochem. and Mol.Biol. 25, 155-184.
Takese, K. et al., 1990, Nippon Juigaki Zasshi 52, 207215.
Thiaudiere, E., Siffert O., Talbot J.-C., Bolard J., Alouf J.E. und Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem. 195, 203-213.
Trono, D. et al., 1989, Celi 59, 113-120.
Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J. Biochem. 82, 1425-1433.
Urakawa, T., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 14531463.
Valerio, D., Mclvor, R.S., Williams, S.R., Duyvesteyn, M.G.C., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Martin, D.W. Jr, 1984, Gene, 31, 147-153.
van Oostrum, J. und Burnett, R.M., 1985, J. Virol. 56, 439-448.
Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 3410-3414.
Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. und Birnstiel, M.L., 1991a, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88, 42554259.
Wagner, E., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. und Birnstiel, M.L., 1991b, Bioconjugate Chemistry 2, 226-231.
Walker, F. et al., 1987, J. Celi Physiol., 130, 255261.
Walker, R.D. et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86, 9514-9518.
Walls, E.V. und Crawford, D.H., 1989, Lymphocytes, a practical approach, G.G.B. Klaus, Ed., IRL press Oxford, 149-162
Watson, J.D., et al., 1987, Mol. Biol. of the Gene,
180 304
Benjamin/Cummings Publ. Company Inc., 676-677.
Wharton, S.A., Martin, S.R., Ruigrok, R.W.H., Skehel, J.J. und Wiley, D.C., 1988, J. Gen. Virol. 69, 1847-1857.
White, J.M., 1990, Annu. Rev. Physiol 52, 675-697 Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Blochem. 171, 1.
Wilson, J.M., Danos, O., Grossman, M., Raulet, D.H. und Mulligan, R.C., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 439-443.
Willumsen, N.J., Davis, C.W. und Boucher, R.C., 1989, Am. J. Physiol. 256 (Celi Physiol. 25), 1033-1044.
Wood, W.I., Capon, D.J., Simonsen, C.C., Eaton, D.L., Gitschier, J., Keyt, B., Seeburg, P.H., Smith, D.H., Hollinshead, P., Wioń, K.L., Delwart, E., Tuddenham, E.G.D., Vehar, G.A., Lawn, R.M., 1984, Naturę, 312, 330-337.
Wu, R., Yankaskas, J.R., Cheng, E., Knowles, M.R. und Boucher, R., 1985, Am.Rev.Respir.Dis. 132, 311320.
Wu, G.Y. und Wu, C.H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 44294432.
Wu, G.Y. und Wu, C.H., 1988, J. Biol. Chem. 263, 1462114624.
Yankaskas, J.R., Stutts, M.J., Cotton, C.U., Knowles, M.R., Gatzy, J.T. und Boucher, R.C., 1987, Genetics and Epithelial Celi Dysfunction in Cystic Fibrosis, Alan R. Liss, Inc., pp. 139-149.
Yankaskas, J.R., Haizlip, J.E., Conrad, M., Koval, D., Schlegel, R. und Boucher, R.C., 1991, Am. Rev. Respir. Dis. 143, A139.
Zamecnik, P.C., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sarin, P.S., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 4143-4146.
Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. und Rainer, I., 1989, Lab. Invest. 61, 603-608.
Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug, H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.
180 304
USA 87, 3655-3659.
Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No.9, 539-549.
Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1980, Mack Publ.
Co., Easton, PA, Osol (ed.).
Trends Pharmacol. Sci. 10, 1989, 458-462.
180 304
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Kompozycja do wprowadzania kompleksów kwasu nukleinowego do komórek wyższych eukariontów.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 13 (iv) POSTAĆ DOSTĘPNA DLA KOMPUTERA:
(A) TYP NOŚNIKA: Floppy dysk (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Wydanie #1.0, Wersja #1,25 (EPO) (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1: Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala
180 304
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys
20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii)‘ TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2: Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
5
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys
15 20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie
180 304 (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3: Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser
5
Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe
15 20
Thr Lys Lys (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4: Met 1 Ala Gin Asp Ile 5 Ile Ser
Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys
10 15 20
Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
180 304 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5: Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu
Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu
1520
Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
2530 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd
180 304 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6: Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala
1520
Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
3035 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3 5 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7: Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala
1520
Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
3035 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 8:
180 304 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8: Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu
Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu
1520
Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
2530 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9: Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
180 304
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu
15 20
Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10: Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu
1520
Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
2530 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
180 304 (A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11: Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu
5
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys 10 15 20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 12: Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys
5
Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 10 15 20
Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
180 304 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ ŁAŃCUCHOWA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13: Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu
5
Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys
15 20
Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
180 304
Jednostki Światła
μρ DNA
180 304
Jednostki światła
Lichteinheiten
Jednostki światła Lichteinheiten
Jednostki światła
Lichteinheiten
180 304
Jednostki światła Lichteinheiten
180 304
Jednostki światła
FIG. 5A
komórek
180 304
300000
200000 <υ β
o
100000 ο
dl31 2 (103/Zelle) , ^Jtomócek ( 1.4x1 Ο^/μΙ)
<ο υι Ο c Ό Φ to νω
C
Ο)
180 304
FIG. 6 (2/2)
180 304
CO
180 304
Q- CD CD τ— C\|
rt cd
CD CD
180 304
Aktywność lucyferazy
Luziferaseaktivitat
C w
180 304
80000 c 70000 ·
FIG .10 A 32 «·£ 60000 s
+> c δ ή 50000 S £ Φ o 40000 · •Η
30000
20000 ·
10000 ·
dl312/Zelle( 1 O3) komórka
Konjugat konlugat oq
S
pL90 TfpL fiCD7pL gp120pL ng 12ug 12ng 12 ug ug pCMYL, 1xlO6 H9 Zellen komórek
180 304
FIG. 10B
5000 4000
3000 2000
1000 _ 0 komórka dL312/Zelle( 1 O3)
Konjugat konlugat \£> ώ σ\ <Ν φ
ug pCMYL --Οχ 10 primare Lymphozyten limfocyty pierwotne
180 304
komórek
180 304
180 304 esnjyn oubth
180 304
FIG. I2B
Miano wirusa Virustiter
Jednostki światła
Miano wirusa
Virustifer ---*
Lichteinheiten
Jednostki światła
180 304
FIG. 13
1000000
CM CM to
M 03 CM 03 O CM
100000
10000
1000
100 nie tak
0.1
0.1 1 5
Jednostki Światła
Lichteinheiten x 10 ΝΊΗ3Τ3 Zellen ko®órki pg pRSVL/12 pg pLTf ‘Chloro quin chlorchina
RVS (ml)
180 304
FIG. U
180 304
20000
C <u a φ «a c chlorchina
Chloroąuin
RVS(ml) 10XRVS(ml) pLTf(pg) pL90 (pg) hTf(pg)
FIG. 15
CM in to to
10000 a \O rr m
M7 G a CM in
ιη
8 nie
3 4
6 rein0.6
0.6
0.2 __12 4
0.2
900 χ ΙΟ6 NIH 3T3 &Π-16 pg pRSVL komórki
180 304
FIG. 16
komórek
180 304
Upłynnianie liposotnów
LIPOSOMENDURCHLASSIGKEIT (%)
FIG. 17
PH
---□— Influ (400 nM)
---♦— Influ-pLys (16 nM)
--π— Influ-pLys+DNA
180 304
Aktywność lucyferazy (jednostki świa
Luziferaseaktivitat (Lichteinheiten)
Aktywność lucyferazy (jednostki
Luziferaseaktivitat swlatła} (Lichteinheiten) no σ>
co
TfpL(12pg)
TfpL(6Pg)
TipL(6Pg)+pL(2pg)
TfpL(12pg) + Pl6pL(12pg)
TfpU^ P1GpL(12p.g)
T(pU6pg)+ Pl6pL(18pg) pU4^g) ♦ Ρΐ6Ρί(12Μ)
180 304
FIG. 20A
Luziferaseaktivitat (Lichteinheiten)
180 304
F1G.20C
Upłynnianie (?) Durchl. (%) □ lnflu2pL1:1 a Influ2pl_3:1 ln(lu2pL 8:1
100
10 20 30 t [min]
180 304
FIG. 21
180 304 (Jednostki światła) Lichteinheiten
FIG. 22 A pSPNeoLuc (δ Kb) □ Cos Luci (4d Kb)
DNA (pg) hTfpL (pg) pL90(pg) Chloroąuin Adenovirus komórki chlorchina
180 304
FIG. 22 B
1X1O6GI-M£-N Zellen pVZLuc (12 Kb)
Kz Q CosLucl (43 Kb)
Kz) chlorchina Chloroguin AdenoYirus
180 304
Radioaktywność
Radioaktivitat (cpm)
Fraktionsgradient frakcja gradientu
FIG. 23
AV-pL *--- AV Pfcntrolle kontrola
180 304
Aktywność lucyferazy Luziferaseaktivitat
FIG. 24
pLAdeno/TfpL
S Adeno/TfpL
180 304
Jednostki światła
Lichteinheiten ua ©
180 304 cpm
FIG. 26
dl312/TG-pL dl312/pl_
Fraktion
Frakcja
180 304
FIG. 27
Lichteinheiten Jednostki światła
180 304
FIG .28
E3 dl312
S dl312/TG-20nmol pL
Lichteinheiten
Jednostki Światła
180 304
Aktywność lucyferazy (jednostki światła) Luziferaseaktivitat (Lichteinheiten)
FIG. 29
DNA (pCMVL) control AdV kontrola □ biotinAdV / complex A biotyna adV kompleks A □ biotinAdV /complex B biotyna AdV kompleks B
180 304
FIG. 30
Aktywność lucyferazy
Luziferaseaktivitat
StpL= Streptavidin-Polylysin streptawidyna-polilizyna
180 304
Jednostki światła Lichteinheiten
komórki
180 304
FIG. 32A
Lichteinheifen Jednostki światła
104 105 106 107 108 109 1010
chlorchina . TfpL + Cnloroquin ... . I 1 1 , » 11185 * 183300000
Ad enoV + TfpL ///////
AdenoV + pL+TfpL 286500000
pLAdenoV/TfpL ////////, 149280000
180 304
FIG. 32B
L i C h t e i Π h ei ł en Jednostki światła
180 304
FIG.33A
Jednostkiświatła
Lichteinheiten
180 304
FIG.33B
Jednostki światła
Lichteinheiłen
180 304
FIG. 34
180 304
Jednostki światła Lichteinheiten
180 304
180 304
Jednostki światła Lichteinheiten
180 304
180 304
180 304
180 304
FIG. 41
Czynnik VIII Aktywność v mU
E2 15gldl312 0 5μΙά!312
180 304 ra
C <D
CU biotyna biotyna biotyna biotin-Ad*) yertices (pg) biotin~Ad5 core (pg) biotin-Ad*) pH6.2 (pg) pg TfpL__________ 2pgTfpL + 3pg StrpL
FIG. 42 A
400000 300000 200000 100000 0 in in in ro ro tn in oo in tn in CD \D in
1.2 4 12
I1|1,1|3.7|1 ί pg pCLuc, 5 χ 105 HeLa Ze Men komórki
180 304
O CD
50000 *
40000 30000
20000
10000
FIG. Z2B biotyna biotyna biotyna biotin-Ad5 yerlices (ug) bioun-Ad5 core (ug) biotin-Ad5 vH6.2 (ug) ug TfpL___________ ug TfpL + 3 ug StrpL in to
M m· in
S to w CM to cm
to Nł to in CM M
1.2 4 12 |1.715.7| 1~7
I 1|1.1|3.7|I) pg pCLuc, 5 X 105 Mov-13 Fibroblast en fibroblasty
180 304
Luziferaseaktivitat (Lichteinhei ten )
Aktywność lucyferazy (Jednostki światła)
1x10® 2x10®
FIG. 43
180 304
Aktywność lucyferazy (Jednostki światła)
Luziferaseaktivitat (Lichteinheiten)
Oe+O 2e+8 4e+8 6e+8 8e+8 1e+9
TiB73 / TfpL
T1B73 /galpL
TIB74 / TfpL
TIB74 /galpL
TIB75 / TfpL
T1B75 /galpL
T1B7S / TfpL
TIB76 /gaipL i 2337000
7466000
113692000 li 1882000
63324000
340338000
17726000
V////A 185987000
702435000
B 52186000
66076000
671435000
555000
31719000
190650000 |10040000 ^3 95026000
261448000
20530000
Α///Ά 183296000
Χ\\\\\\\\\\\\\\\\\1 621125000
123202000
670925000 \1 45849000
2μΙ Adv-biotin biotyna
6μΙ Adv-biotin biotyna
ΒμΙ Adv-biotin biotyna
180 304
FIG. i5
Aktywność lucyferazy (Jednostki światła)
Luziferaseaktivitat (Lichteinh.)
7
1x10 2x10 pLys
TfpL
Ig-pL antl Ig-pL
5175000
5375000
10370000
7//7/7Λ
13300000
180 304
FIG. 46
Aktywność lucyferazy Luziferaseaktivitat
180 304
FIG. 47
c
Lichteinheiten/5xlO Zellen Jednostki światła/ 5 x 10$ komórek
27pldl312
9μ1 dl312
3μ1 d!312
180 304
180 304
Jednostki upływności
180 304
FIG.51
Hamolytische Einh. (μΐ/μδ)
Jednostki hemolityczne
180 304 bez peptydu kein Peptid lOpg
P50 SS-Py 20pg
30ug
10pg
P50 dim
FIG. 52
6000
- ZZZZZZZ/siji06
20pg / 7 7/ 7 ////7//Ζλ 57}z^5
30uq
EALAP50mal iong . zZZZZZZZZZZZZ 3164445
15ug zzzzzzzzzzzzza
GLF //7/7/77 460965
3pg
Wg Y ZZZZZZZJ 391440
3pg
Y777777//77^
EALA 10μ9 ____________2Qpg //7/7777///7^ 3703595
ZZZZZZZZ] 426270 I -----. >1 > .1 ( 1 ^-rrrwi , P , ν,Ί
105 105 107 1O8
Lichteinheiten Jednostki światła
Lichts i “cis i t sn
Jednostki światła
180 304
FIG. 53 bez peptydu
Lichteinheiten jednostki światła
20gg
P50 dim
30gg
10μς λ\\\\\ΧΜ I691845 x\\\\\\\N \\ S 41 670
EALA P50 mai lx χ χ k * χ V χ ί I
2Qftg N\\X\\487615 ......... u > . -«--Ή----104 105 106 107
Lichteinheiten jednostki światła
180 304
FIG. 54
IFNa (ng/ml)
O 200 400 600 800 * 1- · * * * — 1 <
TfpL 1 <0.81 7.45
TfpL + chi 2
TfpL +5 Adeno 3 \ \ ^ 229
TfpL + 15 Adeno 4 . \ \ \ \ \ \ λ 718
TfpL + Ps Adeno 5 \ 138
TfpL/p16pL 6 ] 23 6
TfpL/p16pL+chl 7 \ \ X 245
TfpL +10 p!6 8 14.4
TfpL+ 50 p 16 9 \ X 124
TfpL+50 pl6+chl 10 S 62
5 Adeno 1 1 <0.81
15 Adeno 12 <0.81
PsAdeno 13 <0.81
180 304
Jednostki światła Lichteinheiten
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (35)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyższych eukariontów kompleksem kwasu nukleinowego i substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, wybranej spośród homologicznych lub heterologicznych peptydowych lub niepeptydowych polikationów i ewentualnie skoniugowanej z czynnikiem intemalizującym w omawianych komórkach, znamienna tym, że zawiera czynnik endosomolityczny, który sam ma zdolność internalizacji w danych komórkach i jest wybrany spośród wirusów ewentualnie inaktywowanych lub mutantów niezdolnych do replikacji lub składników wirusa, lub który jako taki nie jest czynnikiem intemalizującym w danych komórkach i jest związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i może być intemalizowany do danych komórek jako składnik kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i który jest wybrany spośród wirusów ewentualnie inaktywowanych lub mutantów niezdolnych do replikacji i składników wirusa, przy czym wymieniony kompleks zawiera ewentualnie czynnik intemalizujący w komórkach, który jest związany z substancjąwykazującą powinowactwo do kwasu nukleinowego w kompleksie i jest wybrany z grupy obejmującej transferynę, ligand receptora asialoglikoproteiny, ligand limfocytów T, ligand hepatocytów; wirusy są wybrane spośród adenowirusa, wirusa Molone/a, pikomawirusa, wirusa pryszczycy, wirusa gorączki Semliki Forest, wirusa grypy i wirusów defektywnych, natomiast składnik wirusa jest wybrany spośród jednego lub więcej peptydów grypy -hemaglutyniny HA2; oraz zawiera także fizjologicznie dopuszczalny nośnik wybrany spośród soli i/lub bufor.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik endosomolityczny jest kowalencyjnie związany z substancja mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego.
  3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik endosomolityczny jest niekowalencyjnie związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego.
  4. 4. Kompozycja według zastrz.3, znamienna tym, że wiązanie stanowi mostek biotynastreptawidyna.
  5. 5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że wiązanie ma charakter jonowy.
  6. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że adenowirus jest mutantem.
  7. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że adenowirus jest mutantem niezdolnym dą replikacji.
  8. 8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że adenowirus ma jedną lub więcej mutacji i/lub delecji w regionie E1A.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że adenowirus jest inaktywowany.
  10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że adenowirus jest inaktywowany promieniowaniem UV o małej długości fali.
  11. 11. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że adenowirus jest inaktywowany promieniowaniem UV/psolarenem.
  12. 12. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że adenowirus jest inaktywowany formaldehydem.
  13. 13. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wirus jest pikornawirusem.
  14. 14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, żepikomawirusjestrhinowirusem.
  15. 15. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że pikornawirus jest dezaktywowanym rhinowirusem.
  16. 16. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że pikornawirus jest wirusem polio.
  17. 17. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik endosomolityczny jest wirusem infekcyjnym dla gatunków innych niż człowiek.
  18. 18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że wirus jest adenowirusem ptasim.
    180 304
  19. 19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że adenowirus jest letalnym wirusem sierocym zarodków kurcząt.
  20. 20. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wirusami defekty wnymi są wirusy satelitarne.
  21. 21. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wirusami defektywnymi są wirusy towarzyszące adenowirusom.
  22. 22. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że peptyd grypy-hemaglutyniriy HA2 ma sekwencję Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-GIy-Phe-Iłe-Glu-Asn-Gly-Trp-GluGly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  23. 23. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że peptyd grypy-hemaglutyniny HA2 ma sekwencję Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-11 e-Ala-Gly-Phe-Ile-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
  24. 24. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnik intemalizujący jest tetragalaktozo-polilizyną.
  25. 25. Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyższych eukariontów kompleksem kwasu nukleinowego i substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, wybranej spośród homologicznych lub heterologicznych peptydowych lub niepeptydowych pohkationów i ewentualnie skoniugowanej z czynnikiem intemalizującym w omawianych komórkach, znamienna tym, że zawiera czynnik endosomolityczny, który jako taki niejest czynnikiem intemalizującym w danych komórkach i ma domenę wiążącąkwas nukleinowy lub jest związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i może być intemalizowany do danych komórek jako składnik kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i który jest wybrany spośród inaktywowanych lub niezdolnych do replikacji zmutowanych wirusów, składników wirusa lub niewirusowych, ewentualnie zmodyfikowanych naturalnych lub syntetycznych peptydów, przy czym wymieniony kompleks zawiera ewentualnie czynnik intemalizujący w komórkach, który jest związany z substancją wykazującą powinowactwo do kwasu nukleinowego w kompleksie i jest wybrany z grupy obejmującej lektynę, ligand limfocytów B, Ig, anty-Ig; natomiast składnik wirusa jest wybrany spośród jednego lub więcej białek adenowirusa, peptydów wirusowych i pustych kapsydów wirusowych oraz zawiera także fizjologicznie dopuszczalny nośnik wybrany spośród soli i/lub bufor.
  26. 26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że czynnik endosomolityczny jest bezpośrednio związany z kwasem nukleinowym przez domenę wiążącą kwas nukleinowy.
  27. 27. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że peptyd niewirusowy ma sekwencję Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Iłe-Glu-Gly-Phe-IIe-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-GlyGly-Cys.
  28. 28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że peptyd jest homo- lub heterodimerem peptydu zdefiniowanego w zastrz. 27.
  29. 29. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że peptyd jest homodimerem.
  30. 30. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że peptyd jest heterodimerem i ma sekwencję Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-IleGlu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-AlaLeu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  31. 31. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że peptyd niewirusowy ma sekwencję Trp-GIu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-LeuAla-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  32. 32. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że peptyd niewirusowy ma sekwencję Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-AlaGlu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Cys.
  33. 33. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że peptyd ma domenę wiążącą kwas nukleinowy.
  34. 34. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że peptyd ma rozszerzenie oligolizynowe.
    180 304
  35. 35. Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyższych eukariontów kompleksem kwasu nukleinowego i substancji mającej powinowactwo do kwasu nukleinowego, wybranej spośród homologicznych i heterologicznych peptydowych lub niepeptydowych polikationów i ewentualnie skoniugowanej z czynnikiem intemalizującym w omawianych komórkach, znamienna tym, że zawiera czynnik endosomolityczny, który jako taki nie jest czynnikiem internalizującym w danych komórkach i ma domenę wiążącąkwas nukleinowy lub jest związany z substancją mającą powinowactwo do kwasu nukleinowego i może być intemalizowany do danych komórek jako składnik kompleksu koniugat/kwas nukleinowy i który jest wybrany spośród inaktywowanych lub niezdolnych do replikacji zmutowanych wirusów, składników wirusa lub niewirusowych, ewentualnie zmodyfikowanych naturalnych lub syntetycznych peptydów, przy czym wymieniony kompleks zawiera ewentualnie czynnik intemalizujący w komórkach, który jest związany z substancją wykazującą powinowactwo do kwasu nukleinowego w kompleksie i stanowi lipoproteinę o niskiej gęstości; wirusy są wybrane spośród adenowirusa, wirusa Malone/a, pikomawirusa, natomiast składnik wirusa jest wybrany spośród jednego lub więcej białek adenowirusa i peptydów grypy - hemaglutyniny HA2; oraz zawiera także fizjologicznie dopuszczalny nośnik wybrany spośród soli i/lub bufor.
    * * *
PL92303106A 1991-09-30 1992-09-28 Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontówkompleksem kwasu nukleinowego PL PL PL PL PL PL PL180304B1 (pl)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02
PCT/EP1992/002234 WO1993007283A1 (de) 1991-09-30 1992-09-28 Zusammensetzung für das einbringen von nukleinsäure-komplexen in höhere eukaryotische zellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL180304B1 true PL180304B1 (pl) 2001-01-31

Family

ID=27560281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL92303106A PL180304B1 (pl) 1991-09-30 1992-09-28 Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontówkompleksem kwasu nukleinowego PL PL PL PL PL PL

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (pl)
EP (2) EP0607206B1 (pl)
JP (1) JPH10506001A (pl)
CN (1) CN1059705C (pl)
AT (1) ATE215990T1 (pl)
AU (1) AU671084B2 (pl)
BG (1) BG62740B1 (pl)
BR (1) BR9206559A (pl)
CA (1) CA2118816C (pl)
CZ (1) CZ293141B6 (pl)
DE (1) DE59209951D1 (pl)
DK (1) DK0607206T3 (pl)
EE (1) EE03195B1 (pl)
ES (1) ES2173083T3 (pl)
FI (1) FI941474A0 (pl)
HK (1) HK1013104A1 (pl)
HU (2) HU218846B (pl)
IL (1) IL103171A (pl)
MX (1) MX9205543A (pl)
NO (1) NO316744B1 (pl)
NZ (1) NZ244306A (pl)
PL (1) PL180304B1 (pl)
PT (1) PT607206E (pl)
RO (1) RO117861B1 (pl)
SG (1) SG44680A1 (pl)
SI (1) SI9200236B (pl)
SK (1) SK281682B6 (pl)
WO (1) WO1993007283A1 (pl)

Families Citing this family (418)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
AU671450B2 (en) * 1992-03-20 1996-08-29 Baylor College Of Medicine A DNA transporter system and method of use
DK0636028T3 (da) * 1992-04-03 2004-07-12 Univ California Selvorganiserende polynucleotidleveringssystem omfattende et amfipatisk kationisk peptid
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
AU6427994A (en) * 1993-03-19 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Process for preparing cancer vaccines
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
WO1995026411A2 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 The Uab Research Foundation Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
CA2190963A1 (en) * 1994-05-30 1995-12-07 Matthew Cotten Method for introducing foreign matter into higher eukaryotic cells
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US6465253B1 (en) * 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0785276A4 (en) * 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
DE69627644T2 (de) * 1995-03-09 2004-02-19 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vektoren, die therapeutische gene fuer antimikrobielle peptide enthalten, zur verwendung in der gentherapie
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
EP0832269A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
EP0874910A4 (en) * 1995-06-07 1999-04-21 Life Technologies Inc ENHANCED CATIONIC LIPID TRANSFECTION BY PEPTIDES
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
SI0833934T2 (sl) 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2279673A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses
ATE333892T1 (de) * 1996-02-09 2006-08-15 Pi-Wan Cheng Kationisches lipid und rezeptorligand erleichterte gabe von biologisch aktiven molekuelen
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
EP0904373A1 (en) 1996-03-14 1999-03-31 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
ATE252914T1 (de) 1996-08-13 2003-11-15 Chiron Corp Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
WO1998027209A1 (en) * 1996-12-18 1998-06-25 Emory University Polycationic oligomers
JP4289687B2 (ja) * 1997-03-14 2009-07-01 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物
WO1998049198A1 (en) * 1997-04-30 1998-11-05 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
WO1999002192A1 (en) * 1997-07-11 1999-01-21 Brandeis University Method of inducing apoptosis by reducing the level of thiamin
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
ATE417927T1 (de) 1997-07-30 2009-01-15 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
AU8179898A (en) * 1997-08-07 1999-03-01 University Of Maryland At Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US6197332B1 (en) * 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US5998386A (en) * 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
AU9692498A (en) * 1997-10-10 1999-05-03 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
EP1030929B1 (en) * 1997-11-14 2009-03-18 Cedars-Sinai Medical Center Transfection and transfer of non-human male germ cells for generation of transgenic non-human mammals
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
JP2002500201A (ja) 1998-01-05 2002-01-08 ユニバーシティ オブ ワシントン 膜破壊剤を使用する増強された輸送
EP2278011A3 (en) 1998-01-14 2012-03-07 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisseria meningitidis antigens
WO1999055365A1 (en) 1998-04-30 1999-11-04 Cornell Research Foundation, Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
AU761780B2 (en) 1998-05-01 2003-06-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Neisseria meningitidis antigens and compositions
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
AU8818398A (en) * 1998-08-21 2000-03-14 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
AU767975B2 (en) 1998-09-11 2003-11-27 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
JP2002527066A (ja) 1998-10-15 2002-08-27 カイロン コーポレイション 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
WO2000027795A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Invitrogen Corporation Transfection reagents
WO2000029600A1 (en) 1998-11-19 2000-05-25 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
PT1141331E (pt) 1998-12-16 2008-12-22 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinase dependente de ciclina humana (hpnqalre)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
EP1228217B1 (en) 1999-04-30 2012-11-21 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Conserved neisserial antigens
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
WO2000075164A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Mirus Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR DRUG DELIVERY USING pH SENSITIVE MOLECULES
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
CA2385538C (en) * 1999-09-17 2007-11-06 Tgt Laboratories, S.A. De C.V. Recombinant adenoviral vectors and their utilization in the treatment of various types of hepatic, renal and pulmonary fibrosis and hypertrophic scars
AU784203B2 (en) 1999-10-29 2006-02-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserial antigenic peptides
AU3366901A (en) * 1999-12-30 2001-07-16 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
WO2001051092A2 (en) * 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
EP2275129A3 (en) 2000-01-17 2013-11-06 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
JP4763210B2 (ja) 2000-02-28 2011-08-31 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ナイセリアのタンパク質の異種発現
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
EP1301612A2 (en) * 2000-05-31 2003-04-16 Genvec, Inc. Method and composition for targeting an adenoviral vector
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
JP2004501657A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 マックス−デルブルック−セントラム　フュール　モレクラーレ　メディツィン トランスフェクション効率の改良方法
WO2002010219A1 (en) * 2000-07-26 2002-02-07 Cho, Sung-Woo Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
CA2421864A1 (en) * 2000-09-20 2002-03-28 Crucell Holland B.V. Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
MX357775B (es) 2000-10-27 2018-07-20 J Craig Venter Inst Inc Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
WO2002034879A2 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Invitrogen Corporation Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US6892140B1 (en) * 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
AU2002240201A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-19 Yale University Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
AU2002250071B2 (en) 2001-02-13 2008-02-14 Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Vaccine for transcutaneous immunization
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
JP2004535388A (ja) * 2001-04-30 2004-11-25 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 脂質含有薬物送達複合体およびそれらの生成方法
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
KR100607612B1 (ko) 2001-06-20 2006-08-02 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
WO2003000707A2 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
EP2153843B1 (en) 2001-09-18 2012-08-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003052117A2 (en) * 2001-09-19 2003-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to non-viral transfection
NZ585001A (en) 2001-10-09 2011-08-26 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
EP1448586A4 (en) * 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
EP2325193A3 (en) 2001-11-02 2012-05-02 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
ATE406912T1 (de) 2001-12-12 2008-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia tracheomatis
US20030228305A1 (en) 2002-01-02 2003-12-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
WO2003078576A2 (en) * 2002-03-12 2003-09-25 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
WO2003105908A2 (en) * 2002-03-15 2003-12-24 Department Of Veterans Affairs, Rehabilitation R & D Service Methods and compositions using cellular asialodeterminants and glycoconjugates for targeting cells to tissues and organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
EP1571968A4 (en) 2002-04-16 2007-10-17 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMORS
MXPA04008891A (es) * 2002-04-25 2004-11-26 Crucell Holland Bv Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus.
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
ES2424971T3 (es) 2002-06-19 2013-10-10 Apeiron Biologics Ag Activación de ECA2 para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares y renales e hipertensión
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
EP2402036B1 (en) 2002-09-06 2018-02-14 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently attached thereto
AU2003268505A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-29 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
BR0314236A (pt) 2002-09-13 2005-08-09 Replicor Inc Formulação de oligonucleotìdeo, composição farmacêutica, kit, composto antiviral, preparação de oligonucleotìdeo e métodos para seleção de um oligonucleotìdeo antiviral para uso como um agente antiviral, para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um paciente, para tratamento profilático de câncer causado por oncovìrus, para identificação de um composto que altera a ligação de um oligonucleotìdeo a pelo menos um componente viral, para purificação da ligação de oligonucleotìdeos a pelo menos um componente viral e para enriquecimento de oligonucleotìdeos a partir de um agrupamento de oligonucleotìdeos
EP2272958A1 (en) 2002-09-26 2011-01-12 ISIS Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
CN1711475A (zh) * 2002-10-10 2005-12-21 退伍军人事务部 利用已标记的、针对肿瘤特异性表位的活化淋巴细胞进行肿瘤的检测、定位和分级
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
AU2003287505A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
EP1569695B1 (en) 2002-11-13 2013-05-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein b expression
PT2336318E (pt) 2002-11-13 2013-06-12 Genzyme Corp Modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteína b
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
NZ541637A (en) 2003-02-11 2008-07-31 Antisense Therapeutics Pty Ltd Modulation of insulin like growth factor I receptor
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
WO2004093788A2 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
CA2524495A1 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
US20100150968A1 (en) * 2003-06-09 2010-06-17 Corixa Corporation Dna vectors
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
EP1648914A4 (en) 2003-07-31 2009-12-16 Regulus Therapeutics Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR MODULATING SMALL NON-CODING RNA
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
PE20050469A1 (es) 2003-09-18 2005-09-10 Lilly Co Eli Modulacion de la expresion de eif4e
PT1678194E (pt) 2003-10-10 2013-09-30 Alchemia Oncology Pty Ltd Modulação da síntese e degradação de hialuronano no tratamento de doença
JP2007529199A (ja) 2003-10-23 2007-10-25 イルミジェン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ウイルス感染に対する抵抗性に関連する遺伝子である、ｏａｓ１における変異の検出
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
ES2411962T3 (es) 2003-10-24 2013-07-09 Gencia Corporation Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
SI2161283T1 (sl) 2003-11-17 2014-10-30 Genentech, Inc. Sestavki, ki obsegajo protitelesa proti CD79b, konjugirana na sredstvo, ki inhibira rast, ali na citotoksično sredstvo, in postopki za zdravljenje tumorja hematopoetskega izvora
DE602004027538D1 (de) 2003-12-01 2010-07-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
SG113562A1 (en) * 2004-01-12 2005-08-29 Agency Science Tech & Res Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
JP2007520222A (ja) 2004-01-20 2007-07-26 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド グルココルチコイドレセプター発現の調節
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US20050227940A1 (en) * 2004-01-23 2005-10-13 City Of Hope Amplifying interfering RNA (RNAi) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
DK1730280T3 (en) * 2004-03-26 2019-02-04 Curis Inc RNA interference modulators for hedgehog signaling and applications thereof
US8268324B2 (en) 2004-03-29 2012-09-18 Galpharma Co., Ltd. Modified galectin 9 proteins and use thereof
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
EP1799825B1 (en) 2004-10-05 2011-06-29 The California Institute of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
US8563511B2 (en) 2004-10-06 2013-10-22 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
CA2595407A1 (en) 2005-01-20 2006-07-27 University Of Rochester Thioredoxin interacting protein (txnip) as regulator of vascular function
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
EP2050763A3 (en) 2005-03-10 2009-07-15 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating vascular integrity
CA2603730A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
WO2007062380A2 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eif4e-bp2 expression
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
US20090074733A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-19 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20070299027A1 (en) 2006-01-26 2007-12-27 Gene Hung Compositions and their uses directed to huntingtin
EP1984399A4 (en) * 2006-02-10 2010-03-03 Univ California TRANSDUCIBLABLE DELIVERY OF SIRANA BY MEANS OF DSRNA BINDEDOMADE FUSIONS TO PTD / CPPS
JP5823663B2 (ja) 2006-03-03 2015-11-25 プロミス ニューロサイエンシズ インコーポレイテッド ミスフォールドｓｏｄ１媒介疾患を処置および検出するための方法および組成物
US7718193B2 (en) * 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
CN101437943A (zh) 2006-05-03 2009-05-20 波罗的科技发展有限公司 牢固结合的碱基-修饰的寡核苷酸和人工核酸酶组合的反义药剂
DK2054431T3 (da) 2006-06-09 2012-01-02 Novartis Ag Konformere af bakterielle adhæsiner
CA2659103C (en) * 2006-07-12 2019-05-21 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of nucleic acids by reversible phosphotriester charge neutralization protecting groups
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
EP2061443A4 (en) * 2006-08-18 2013-07-24 Arrowhead Res Corp POLYCONJUGATE FOR IN VIVO ADMINISTRATION OF POLYNUCLEOTIDES
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
WO2008030604A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced brain disease
EP2061484B1 (en) 2006-09-08 2012-11-07 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
US8158595B2 (en) 2006-11-09 2012-04-17 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
US20080213377A1 (en) * 2006-12-08 2008-09-04 Bhatia Sangeeta N Delivery of Nanoparticles and/or Agents to Cells
WO2008086807A2 (en) * 2007-01-19 2008-07-24 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of lna oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
EP2641971A1 (en) 2007-01-29 2013-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
WO2008103962A2 (en) 2007-02-22 2008-08-28 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
WO2008134879A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 University Health Network Il-12 immunotherapy for cancer
WO2009011855A2 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
MX2010003465A (es) 2007-10-02 2010-07-05 Amgen Inc Incremento de eritropoyetina utilizando acidos nucleicos que hibridan para micro-arn y precursores de los mismos.
WO2009049100A2 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Ultrathin multilayered films for controlled release of anionic reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
WO2009114942A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
BRPI0911332A2 (pt) 2008-04-04 2019-09-24 Calando Pharmaceuticals Inc composições e uso de inibidores de epas1
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) * 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
EP3081648A1 (en) 2008-08-25 2016-10-19 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides directed against connective tissue growth factor and uses thereof
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
KR101829469B1 (ko) 2008-12-04 2018-03-30 큐알엔에이, 인크. Ｅｐｏ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(ｅｐｏ) 관련된 질환의 치료
RU2551234C2 (ru) 2008-12-04 2015-05-20 КьюРНА,Инк.,US Лечение сиртуин 1 (sirt1)-связанных заболеваний путем ингибирования натурального антисмыслового транскрипта
JP5923306B2 (ja) 2008-12-04 2016-05-24 クルナ・インコーポレーテッド 腫瘍抑制遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による腫瘍抑制遺伝子関連疾患の治療
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
ES2658626T3 (es) 2009-02-12 2018-03-12 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) por inhibición de transcrito antisentido natural a GDNF
WO2010093904A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
EP2963116B1 (en) 2009-03-04 2020-11-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
EP2408919B1 (en) 2009-03-16 2017-10-18 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
ES2627763T3 (es) 2009-03-17 2017-07-31 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el homólogo tipo delta 1 (dlk1) por inhibición de transcrito antisentido natural a dlk1
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3524275A1 (en) 2009-04-22 2019-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune supression enables repeated delivery of long rna molecules
DK2424987T3 (en) 2009-05-01 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF HEMOGLOBIN (HBF / HBG) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTION TO HBF / HBG
CN102459596B (zh) 2009-05-06 2016-09-07 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
JP6250930B2 (ja) 2009-05-06 2017-12-20 クルナ・インコーポレーテッド トリステトラプロリン（ｔｔｐ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｔｐ関連疾患の治療
CN102575251B (zh) 2009-05-18 2018-12-04 库尔纳公司 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病
JP2012527248A (ja) 2009-05-22 2012-11-08 クルナ・インコーポレーテッド 転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置
KR101704988B1 (ko) 2009-05-28 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료
CA2765099A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 New York University Phosphorylated tau peptide for use in the treatment of tauopathy
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
WO2010148050A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Curna, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
CA2765509C (en) 2009-06-16 2021-08-17 Joseph Collard Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1
KR101807323B1 (ko) 2009-06-24 2017-12-08 큐알엔에이, 인크. Ｔｎｆｒ2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(ｔｎｆｒ2) 관련된 질환의 치료
CA2765815A1 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
EP2462229B1 (en) 2009-08-05 2016-05-11 CuRNA, Inc. Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
WO2011028950A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
CN102711826B (zh) 2009-10-22 2017-03-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于调控巨噬细胞刺激性蛋白的hepsin活化的方法和组合物
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110237540A1 (en) * 2009-11-23 2011-09-29 Crawford Thomas C Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
PE20121584A1 (es) 2009-11-30 2012-11-29 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores
EP2509953B1 (en) 2009-12-11 2016-03-30 Genecode AS Methods of facilitating neural cell survival using gdnf family ligand (gfl) mimetics or ret signaling pathway activators
KR101823702B1 (ko) 2009-12-16 2018-01-30 큐알엔에이, 인크. 막 결합 전사 인자 펩티다제, 부위 １(ｍｂｔｐｓ１)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｍｂｔｐｓ１ 관련 질환의 치료
RU2619185C2 (ru) 2009-12-23 2017-05-12 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2
CN102869776B (zh) 2009-12-23 2017-06-23 库尔纳公司 通过抑制肝细胞生长因子(hgf)的天然反义转录物而治疗hgf相关疾病
WO2011090740A2 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Opko Curna, Llc Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
US8962585B2 (en) 2009-12-29 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63
KR101878501B1 (ko) 2010-01-04 2018-08-07 큐알엔에이, 인크. 인터페론 조절 인자 8 (ｉｒｆ8)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인터페론 조절 인자 8 (ｉｒｆ8) 관련된 질환의 치료
KR101853509B1 (ko) 2010-01-06 2018-04-30 큐알엔에이, 인크. 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
US8883739B2 (en) 2010-01-19 2014-11-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
JP5981850B2 (ja) 2010-01-25 2016-08-31 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ＲＮａｓｅＨ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるＲＮａｓｅＨ１関連疾患の治療
JP5976548B2 (ja) 2010-02-22 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療
AR080243A1 (es) 2010-02-23 2012-03-21 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores
SG183374A1 (en) * 2010-02-24 2012-09-27 Arrowhead Res Corp Compositions for targeted delivery of sirna
WO2011127337A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Opko Curna Llc Treatment of fibroblast growth factor 21 (fgf21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fgf21
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
US20110294868A1 (en) 2010-04-29 2011-12-01 Monia Brett P Modulation of transthyretin expression
CA2798218A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Curna, Inc. Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
MA34291B1 (fr) 2010-05-03 2013-06-01 Genentech Inc Compositions et méthodes de diagnostic et de traitement d'une tumeur
JP5866106B2 (ja) 2010-05-12 2016-02-17 コロンビア ユニヴァーシティ インスリンを産生し分泌する腸内分泌細胞の製造方法
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP2576783B1 (en) 2010-05-26 2017-11-29 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
WO2012008361A1 (ja) 2010-07-10 2012-01-19 財団法人北九州産業学術推進機構 細胞への核酸導入方法および核酸複合体
JP5998131B2 (ja) 2010-07-14 2016-09-28 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｄｉｓｃｓｌａｒｇｅｈｏｍｏｌｏｇ（ｄｌｇ）ｄｌｇ１への天然アンチセンス転写物の阻害によるｄｌｇ関連疾患の治療
AU2011312205B2 (en) 2010-10-05 2015-08-13 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
RU2624048C2 (ru) 2010-10-06 2017-06-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4
WO2012054723A2 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Opko Curna Llc Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
US20130210893A1 (en) 2010-10-27 2013-08-15 Curna, Inc. Treatment of interferon-related developmental regulator 1 (ifrd1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ifrd1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
CA2817712C (en) 2010-11-12 2020-03-24 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
KR102010598B1 (ko) 2010-11-23 2019-08-13 큐알엔에이, 인크. Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료
US20130344053A1 (en) 2010-12-28 2013-12-26 University Of Rochester Methods of Modifying Insulin Signaling Using Biliverdin Reductase (BVR) and BVR Derived Peptides
EP2670411B1 (en) 2011-02-02 2019-04-10 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds targeting connective tissue growth factor (ctgf) for use in a method of treating keloids or hypertrophic scars
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
CN103561725B (zh) 2011-03-14 2018-08-31 国立大学法人北海道大学 用于肺递送的载体、导入剂及用途
EP2697244B1 (en) 2011-04-13 2017-05-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of ptp1b expression
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
JP6043347B2 (ja) 2011-06-16 2016-12-14 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 線維芽細胞増殖因子受容体４の発現のアンチセンス調節
US10350277B2 (en) 2011-09-07 2019-07-16 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Ceramidase and cell differentiation
CN103814132B (zh) 2011-09-20 2018-06-05 苏州瑞博生物技术有限公司 Gcgr表达的反义调节
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
CN103906838A (zh) 2011-10-25 2014-07-02 Isis制药公司 Gccr表达的反义调节
WO2013138374A2 (en) 2012-03-15 2013-09-19 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
CA2880869A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
WO2014041179A1 (en) 2012-09-17 2014-03-20 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
EP2908853B1 (en) 2012-10-21 2018-12-05 University Of Rochester Thy1 (cd90) as a therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
WO2014152497A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
EP2992112B1 (en) 2013-04-22 2020-06-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mutations in pdgfrb and notch3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
TWI736514B (zh) 2013-09-05 2021-08-21 美商薩羅塔治療公司 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含
US10036020B2 (en) 2013-09-19 2018-07-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for inhibiting JC virus (JCV)
PL3068797T3 (pl) 2013-11-11 2020-06-29 Wake Forest University Health Sciences Konstrukty wielowalentnego celowania w nowotwory
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
BR112016026581A2 (pt) 2014-05-14 2017-10-31 Alex Levitzki Man And Holdings Ltd vetores de polietilenoimina polietilenoglicol melhorados
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
WO2015200901A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
EP3169310A1 (en) 2014-07-15 2017-05-24 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
US11191811B2 (en) 2014-11-19 2021-12-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
AU2015364508A1 (en) 2014-12-18 2017-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ReversirTM compounds
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
US10849917B2 (en) 2015-06-01 2020-12-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type VII collagen
CN108026519A (zh) 2015-06-17 2018-05-11 波赛达治疗公司 将蛋白质定向至基因组中的特定基因座的组合物和方法
WO2017058881A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
CN108699555A (zh) 2015-10-09 2018-10-23 萨勒普塔医疗公司 用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
CA3007424A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Children's Hospital Los Angeles "mobilizing leukemia cells"
SG11201805341RA (en) 2015-12-23 2018-07-30 Univ Queensland Technology Nucleic acid oligomers and uses therefor
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US11060089B2 (en) 2016-04-18 2021-07-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
US11246868B2 (en) 2016-04-26 2022-02-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
AU2017312116A1 (en) 2016-08-17 2019-03-07 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs
WO2018209288A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded rna complexes and uses related thereto
EP3645546A4 (en) 2017-06-30 2021-12-01 Solstice Biologics, Ltd. CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AUXILIARIES AND THEIR METHODS OF USE
WO2019055460A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 The Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TRANSPOSON-ASSOCIATED DISEASES
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
US20210155959A1 (en) 2018-04-06 2021-05-27 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
WO2022226291A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (pl) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
WO1991017773A2 (de) * 1990-05-18 1991-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Neue protein-polykation-konjugate
WO1992006180A1 (en) * 1990-10-01 1992-04-16 University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
AU1922092A (en) * 1991-05-03 1992-12-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
DE69231736T2 (de) * 1991-05-14 2001-10-25 The Immune Response Corp., Carlsbad Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
ES2149774T3 (es) * 1991-06-05 2000-11-16 Univ Connecticut Aportacion dirigida de genes que codifican proteinas secretoras.
EP0666923A1 (en) * 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
US5547932A (en) 1996-08-20
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
SG44680A1 (en) 1997-12-19
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
BR9206559A (pt) 1994-11-08
PT607206E (pt) 2002-07-31
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
HUT71312A (en) 1995-11-28
NO316744B1 (no) 2004-04-26
BG98718A (bg) 1995-02-28
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
SK36894A3 (en) 1994-08-10
CN1070946A (zh) 1993-04-14
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
AU671084B2 (en) 1996-08-15
NO941154L (no) 1994-03-29
NO941154D0 (no) 1994-03-29
HU211925A9 (en) 1996-01-29
CA2118816C (en) 2003-06-17
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
US6077663A (en) 2000-06-20
US6274322B1 (en) 2001-08-14
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
FI941474A (fi) 1994-03-30
US6022735A (en) 2000-02-08
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
MX9205543A (es) 1993-05-01
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
AU2652692A (en) 1993-05-03
EE03195B1 (pl) 1999-06-15
HU218846B (hu) 2000-12-28
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
CN1059705C (zh) 2000-12-20
SI9200236A (en) 1993-03-31
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
IL103171A0 (en) 1993-02-21
SI9200236B (sl) 2002-10-31
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
NZ244306A (en) 1995-07-26
IL103171A (en) 2003-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL180304B1 (pl) Kompozycja do transfekowania in vitro komórek wyzszych eukariontówkompleksem kwasu nukleinowego PL PL PL PL PL PL
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
Cotten et al. [42] Receptor-mediated transport of DNA into eukaryotic cells
Persing et al. The preS1 protein of hepatitis B virus is acylated at its amino terminus with myristic acid
US5521291A (en) Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
JP3479298B2 (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
JP3222461B2 (ja) 新規タンパク質―ポリカチオン結合体
Chang et al. The use of additive and subtractive approaches to examine the nuclear localization sequence of the polyomavirus major capsid protein VP1
WO1996041606A2 (en) Improved pharmaceutical compositions for gene therapy
US5830852A (en) Compositions for insulin-receptor mediated nucleic acid delivery
US6503498B1 (en) Apolipoprotein A-1 adenovirus vector compositions and methods
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
US6479464B1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
WO1998035984A2 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
US20030100496A1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
CA2241040A1 (en) Improved pharmaceutical compositions

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20070928