BG62740B1 - Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки - Google Patents

Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки Download PDF

Info

Publication number
BG62740B1
BG62740B1 BG98718A BG9871894A BG62740B1 BG 62740 B1 BG62740 B1 BG 62740B1 BG 98718 A BG98718 A BG 98718A BG 9871894 A BG9871894 A BG 9871894A BG 62740 B1 BG62740 B1 BG 62740B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cells
gly
conjugate
nucleic acid
adenovirus
Prior art date
Application number
BG98718A
Other languages
English (en)
Other versions
BG98718A (bg
Inventor
David Curiel
Ernst Wagner
Matt Cotten
Kurt Zatloukal
Christian Plank
Max Birnstiel
Bernd Oberhauser
Walter Schmidt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
University Of North Carolina At Chapel Hill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, University Of North Carolina At Chapel Hill filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of BG98718A publication Critical patent/BG98718A/bg
Publication of BG62740B1 publication Critical patent/BG62740B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Съставът е за трансфекция на по-висши еукариотни клетки с комплекс от нуклеинова киселина и вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което евентуално е свързано с интернализиращ фактор за тези клетки. Той съдържа ендозомолитно средство, което представлява свободен или свързан вирус или вирусна компонента или един вирусен или невирусен пептид сендозомолитни свойства.

Description

Изобретението се отнася до въвеждане на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки.
Необходимост от ефективна система за въвеждане на нуклеинова киселина в живи клетки съществува преди всичко в областта на генната терапия. При това в клетките се вмъкват гени, за да се постигне на живо синтез на лечебноактивни генни продукти, като например в случай на генетичен дефект, да се подмени липсващиятгеНо Класическата генна терапия се основава на принципа чрез еднократно лечение да се постигне трайно излекуване. При това съществува необходимостта от методи на лечение, при които терапевтичноактивната ДНК (или също така мРНК) да се приложи еднократно или многократно според нуждата, като лекарствено средство ( генно лечебно средство ). Примери за генно предизвикани заболявания, при които генната терапия може с успех да се приложи, са хемофилията, бета-таласемията и ос
- 2 трата комбинирана имунна недостатъчност $CID), синдром, който се предизвиква от генетично обоснован недостиг на ензима аденозиндеаминаза. Съществуват по-нататък и други възможности за приложение при имунната регулация, при които чрез даване на функционална нуклеинова киселина, която кодира секретирането на протеин-антиген или на несецерниран протеин-антиген, чрез ваксинация се постига хуморален или вътрешноклетъчен имунитет. Други примери на генетични дефекти, при които могат да се приложи нуклеинова киселина, която кодира дефектния ген, като например се дава в индивидуална форма съобразно необходимостта, са мускулна дистрофия (дистрофин-ген), цистова фиброза (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene”), хиперхолестеролемия (З^Г-рецепто р-ген). Гении терапевтични методи на лечение са тогава от съществено значение, когато в организма трябва да се ситезират хормони, растежни фактори или цитотоксични или имуномодулиращо активни протеини.
Генната терапия представлява също така и перспективна възможност за лечението на рак, при което се прилага така наречената ракова ваксина. За да се повиши имуногеницитетността на туморни клетки, те бинат променяни;за да се направят или посилно антигенни или за да се предизвикат да произведат определени имунмоделиращи субстанции, като например цитокини, които след това проявяват имунна реакция. За да се постигне горното, клетките се трансфицират с ДНК, която е кодирана за някакъв цитокин, като например IirZ» Ilr4, IPN-гама, - алфа. До сега геннияттрансфер в автологични туморни клетки се провеждаше чрез ретровирусни вектори.
Най-напредналите до сега технологии за приложение на нуклеинови киселини в рамките на генната терапия използват ретро- 3 вирусни системи за трансфер на гени в клетките (wiison et al., 1990, Kasid et al., 1990). Използването обаче на ретровируси създава все пак проблеми, тъй като, макар и в малък процент, съществува опасността от странични явления^като инфекция с вируса (чрез рекомбинация с ендогенни вируси или заразяване с помощни вируси и възможна последваща мутация в патогенна форма) или образуване на рак. Освен това, стабилната трансформация на соматичните клетки на пациента, каквато се цели с помощта на ретровирусите, не при всеки случай е желателна, тъй като при появяване на странични ефекти пацентжгтрудно може да се върне в изходното му състояние. Освен това, при тази терапия е трудно да се получи достатъчно висок титър, за да могат достатъчно клетки да бъдат заразени.
Нуклеинови киселини се използват освен това като терапевтичноактивни вещества за инхибиране на определени функции на клетките. Така например безсмислени РНК и -ДНК се оказаха активни средства за селективно инхибиране на определени генпоследователности. Начинът им на действие дава възможност те да се прилагат като терапевтични средства за блокиране на експресирането на определени гени (като дерегулирани онкогени или вирусни гени) на живо. Вече беше показано, че къси безсмислени-олигонуклеотиди могат да се импортират в клетки и там те могат да проявят своето инхибиращо действие (Zamecnik et al., 1986), въпреки че вътрешноклетъчната им концентрация е твърде ниска, между другото и поради ограниченото им приемане през клетъчната мембрана въз основа на силно негативния заряд на нуклеиновите киселини.
Друг начин за селективно инхибиране на гени е чрез прилагането на рибозами. Тук също съществува необходимостта да се осигури възможно висока концентрация от активни рибозоми в
- 4 клетката, при което транспортирането към клетката е един от ограничаващите фактори.
Приложението на генната терапия за постигане на вътрешноклетъчен имунитет обхваща трансдукцията на гени, които притежават защитно действие срещу вируси (така наречените защитни гени ), например трансдоминантни мутации на гени, които кодират за вирусни протеини, или ДНК-молекули, които кодират така наречените ”ДНК декойс.
Поради това съществува необходимостта от методи, които да дадат възможност за експресиране на ДНК в клетката.
Вече са предложени много решения за подобряване на транспортирането на нуклеинови киселини в живи клетки, което представлява един от ограничиващите фактори при прилагането им като терапевтични средства.
За генно трансформиране на клетки от бозайници ин витро са известни различни техники. Тяхното приложение обаче на живо е твърде ограничено (към тях се числят техниката за въвеждане на ДНК посредством липозоми, електропорация, микроинжектиране, клетъчна фузия, ДЕАЕ-дакстран или калциевофосфатния утаечен метод).
Разработени са рекомбинантни вирусни вектори, които осъществяват трансфера на гени,като използват ефициентния входящ механизъм на изходните вируси. Тази стратегия бе приложена при конструирането на рекомбинантни ретровирусни и аденовирусни вектори?за да се постигне високоефективен генен трансфер ин витро и на живо (Berkner, 1988). При цялата тяхна активност, тези вектори представляват ограничения и то по отношение на големината и конструкцията на ДНК,която ще се трансферира. Освен това тези средства са рискови по отношение на Со-трансфе
- 5 ра на жизнеспособни вирусни ген-елементи на изходния вирус.
За да се избегнат тези ограничения, разработени са алтернативни стратегии за гентрансфер, в основата на чиито механизми лежи обслужването на клетката при транспорта от макромолекули. Пример за това е импортирането на гени в клетката през най-продуктивноспособния път на рецептор - ендоцитоза ( wu и Wu, 1987, Wagner et al., 1990 u EP-A1 0388 758).
Този начин използва бифункционални молекулни конюгати, които показват един ДНК свързващ домен и домен със специфичност за клетъчен повърхностен-рецептор ( wu и wu, 1987, Wagner et al., 1990). Когато познавателните домени се познаят от клетъчно-повърхностния рецептор, конюгатзгсе интернализира по пътя на рецептор - посредничест на ендоцитоза, при което свързаната с конюгата ДНК също се транспортира. С помощта на този метод могат да се постигнатгентрансферни количества, които го правят поне равностоен на съществуващите методи (Zenke et al., 1990).
можеше да бъде показано, че чрез тази система транспортираната ДНК в клетката може да бъде експериментирала и в случай че се използва инхибиращо действаща нуклеинова киселина, нейното инхибиращо действие не се повлиява от транспортната система.
РСТ заявката W09I/I7773 се отнася до система за транспортиране на нуклеинови киселини със специфично действие за Т-клетки. Тази система използва клетъчен повърхностен протеин на Тклетъчната-изходна линия, например СД4, на използвания от HIVвирус рецептор. Нуклеиновата киселина^която трябва да се транспортира, се комплексира с протеин-поликатион-конюгат, чиято протеинова част представлява протеин, който има способността да се свързва с Т-клетъчния-повърхностен протеин, примерно СД4, и клетки, които експримират този повърхностен протеин, се поставят в контакт с получените протеин-поликатйон/нуклеинова кисели
- 6 на комплекси. Доказано -е, че транспортираната с помощта на тази система в клетката ДНК, може да бъде еспериментирана.
Общ признак в тези две изобретения е, че използват специфични клетъчни функции, за да направят възможен транспорта на нуклеинова киселина в клетката или да го улеснят.
И в двата случая приемащите механизми протичат при участието на фактори, която в рамките на настоящото изобретение се означават като интернализиращи фактори. Под това трябва да се разбират фактори, които в по-тесен или в по-широк смисъл са специфични за клетъчния тип, евентуално при съдействието на други фактори (например клетъчен повърхностен протеин), които свързват към повърхността на клетката и интернализират. (При двете по^горе споменати изобретения интернализиращият фактор е трансферни, съответно протеин свързващ с подобен на Т-клетъчната повърхностен протеин, примерно едно анти-СД4-антитяло). Интернализиращият фактор е конюгиран с вещество с поликатйонен характер, които въз основа на тяхния афинитет към нуклеинови киселини образуват съединение между интернализиращия фактор и нуклеиновата киселина. (Поради това, такива вещества се означават като вещества с афинитет към нуклеинова киселина или във връзка с ДНК ДНК свързващи домени. Когато такова вещество като съставка на конюгата образува съединение между нуклеиновата киселина интернализиращ фактор, по-надолу ще се означава като свързващ фактор).
В хода на уези две изобретения е установено, че може да се постигне един оптимум при приемането на нуклеинова киселина в клетката и то тогава, когато съотношението конюгат : нуклеинова киселина е така подбрано, че интернализиращият фактор поликатион/нуклеинова киселина - комплексите в широка степен електронеутрален, Като се изхожда от това наблюдение, подобряват се методите, които използват интернализиращ фактор-свързващ фактор/нуклеинова киселина -комплекси за импортиране на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки.
От Анер и съавтори, 1991 , е описан метод, с помощта на който може да се подобри ефицентността на системи, при които приемането на нуклеинови киселини се извършва чрез интернализиращи фактори. Количеството на приетата в клетката нуклеинова киселина не се намалява, когато част на трансферин-поликатйон-конюгата се замени с нековалентно свързан полдкатион; в отделен случай може да се постигне дори значително увеличаване на приема на ДНК, Изследванията на молекулното състояние на трансферин-поликатион-плазмид-ДН.. - компелксите, които се получават при оптимално съотношение на ДНК/конюгат, показват, че плазмидната-ДНК в присъствие на конюгата се намира в уплътнени тороидни структури (подобни на понички”) с диаметър от около 80 - 100 им.
Проведените опити със свързани към Т-клетките протеини като интернализиращ фактор дават подобни резултати.
Прибавянето на свободна субстанция или субстанции с афинитет към нуклеинова киселина съдействува също така за повишаване ефициенцията на импортната система дори ако се използва като свързващ фактор друго вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
Описаните от Вагнер и съавтори;1991 , комплекси, които се поемат от по-висши еукариотни клетки чрез интернализиращ фактор през ендоцитоца, съдържащ нуклеинова киселина, комплексирана с един интернализиращ фактор-свързващ фактор-конюгат. Допълнително комплексите получават една или повече субстанции с афинитет към нуклеинова киселина, които евентуално са идентични със
- 8 свързващия фактор, в нековалентно свързана форма, по начин, че чрез конюгата получената интернализация и/или експресия на нуксе леиновата киселина покачва. Това на пърмо място може да се дължи на кондензиращо въздействие, но също така е възможно да се дължи и на други механизми.
Дори ако с помощта на този метод могат да се повишат експресионните количества на импортираната нуклеинова киселина, тя все пак подлежи на ограничения. Използваемостта на тази система в дадена връзка не се определя изключително чрез наличието на важен за системата клетъчен повърхностен рецептор;, ограниченията при приложението на тази система се дължат вероятно на това, че ендозомите,в които са интернализирани конюгат-ДНК-коиплексите, попадат в лизозомите, където те се разграждат ензимно. За да се увеличи частта от нуклеинова киселина, която попада в ядрото на клетката и там съгласно своето предназначение се експримира, са проведени опити, които предшествуват настоящото изобретение . и с които се опитва да се проведе трансфекция на клетки в присъствие на субстанции, които инхибират ензимната активност в лизозомите, така наречените лизозоматропни субстанции. С помощта на тази мярка можа да се постигне едно по-силно експресиране на импортираните ДНК; постигнатите реакции бяха все пак в зависимост от използваната субстанция много, различни подбрани лизоматропни субстанции предизвикват усилване на гентрансфера, докато други го дори инхибират. Така например беше установено, че ефициентниягимпорт на ДНК зависи от присъствието на слабата база хлорохин (Zenke et al·, 1990. Cotten Постигнатиятc хлорохин ефект не трябва да се счита, или поне не се дължи изключително на това, че хлорохин повишава рН-стойността на лизозомите. Въз основа на различни експерименти беше уста
- 9 новено, че други субстанции, които също като хлорохин притежават способността да модулират стойността на pH, като монензин, амониев хлорид или метиламин, не могат да заменят хлорохин, като при различни опити, някой от тези субстанции показват дори инхибиращ ефект. Освен това беше установено, че различни целеви клетки показват различни реакции върху еднакво лизозоматропнодействащо вещество.
Тъй като гентрансфера по физиологичен път, както го показва рецептор-посредничащ на ендоцитоза чрез нуклеинова киселина комплекси, показва голями предимства (нетоксичен механизъм на преминаване през клетъчната мембрана; възможност за приемане на биологично активни нуклеинови киселини, като гени, генни отрязъци или клетъчни функции на специфично инхибирани нуклеинови киселини, по прекъснат или непрекъснат начин; възможност за специфично за клетките таргетинг; получаване на конюгати в големи количества), съществува необходимостта, тази система да се направи по-ефициентна.
Задача на настоящото изобретение е, да се подобри импортът на нуклеинова киселина в по-висши еукариотни клетки. (Под имг порт, съответно трансфер в рамките на настоящото изобретение се има предвид освен влизането на комплексите на нуклеинова киселина в клетката през клетъчната мембрана, но също така и локализирането на комплексите, съответно на получените от тях освободени нуклеинови киселини вътре в клетката^до достигане на подходящо за тяхното експресиране място). По-висшите еукариотни клетки са известни за специалистите; дрождите не се числят към тях (Watson et al., 1987).
кногобройни вируси осъществяват проникването си в еукариотния гостоприемния чрез механизми, които по принцип отговарят на рецептор-посредничест на ендоцитоза. Вирусна инфекция на ба- IO за на този механизъм започва най-общо със свързването на вирусни частички към рецепторите на клетъчната мембрана. След това следва интернализирането на вируса към клетката. Това интернализиране следва общ път, отговарящ на навлизането на физиологични лиганди или на макромолекули в клетката; рецепторите върху повърхността на клетката се подреждат първоначално в групи , за да образуват така наречения котед пит” (coated pit ) $ след което мембраната се всмуква навътре и се образува обграден от обвивка везикел (vesikel);. След като този везикел се освободи от своята Клатрин-обвивка, във вътрешността му се извършва подкисляване с помощта на локализирана в .мембраната протонова помпа. С това се предизвиква освобождаването на вируса от ендозома. В зависимост от това дали вирусът притежава липидна обвивка или не притежава, се имат предвид два начина за освобождаване на вируса от ендозома: в случай на така наречените голи” вируси (например аденовирус, полиовирус, риновирус) беше предложено ниската pH-стойност да предизвика конформационни промени в*в вирусния протеин. С това се освобождават хидрофобни домени, които при физиологично pH не са достъпни. С това, тези домени получават способността да встъпят с ендозом· мембраните в обменни действия и с това да осъществят освобождаването на вирусния геном от ендозома в цитоплазмата. За вирусите с липидна обвивка (като например Vesicular Stomatitis Virus, Semliki Forest Virus, Influenza virud^ смята, че ниската pH стойност модифицира структурата или конформацията на някои вируспротеини, с което се насърчава фузията (сливането) на вирусната мембрана с ендозомната мембрана. Вирус··, които с помощта на този механизъм проникват в клетката, показват определени молекулни особености, които им дават възможност да разчупат ендозомната мембрана и с то- II ва да си осигурат вход в цитоплазмата.
Други вируси, като например притежаващите обвивка вируси
Sendai , HIV и някои Moloney -левкЕмични вирусни щамове, или непритежаващите обвивка вируси SV4O и polyoma нямат необходимостта от ниско pH на средата,за да проникнат в клетката. Те могат директно върху повърхността на клетката да предизвикат фузия с мембраната (Sendai virus , вероятно HIV) или . , могат да развият механизмите коитод^азчуп_нт клетъчната мембрана или да Я преминат. Приема се, че и независещите от pH-стойността вимогат да русиУизползват ендоцитозния път (McClure et al., 1990).
При решаването на поставената задача се излиза от предположението да се използва механизм^т на определени вирусите които те навлизат в еукариотни клетки, за да се подобри импорти на нуклеинови киселинни комплекси в клетките и с това да се повиши експресията.
Опитано -е протеини заедно с вируси да се интернализират в клетката (Otero и Carrasco, 1987). При това е установенол9епермеабилизирането на клетката от вируса се използва за вмъкване на макромолекули. При протичащите при това процеси може да се касае з'г> течнофазови механизми.
Въз основа на епидермалния растежен фактор ( Epidermal Growth Factor, EGP), конюгиран към токсин, бе установено, че този естествен лиганд, който след свързване със своя рецептор чрез ендоцитоза се поема в клетката, заедно с аденовируса, който също така се поема в клетката през рецептор - ендоцитоза, попада в същия ендозом и от него, също заедно с вируса, се освобождава В цитозола (FitzGerald et. al., 1983).
С изненада е установено, че присъствието на определени агенти (например вируси, вирусни компоненти или други активни вещества), които по отношение на входящия си механизъм в еука
- 12 риотни клетки показват свойства на определени вируси, съдействуват за значително повишаване на експресираното количество на част от комплекса на импортираната в клетката нуклеинова киселина. Това откритие бе преди всичко за това изненадващо, тъй като приетите в клетката нуклеиново киселинни комплекси са много големи.
Настоящото изобретение се отнася до състав за трансфекция на по-висши еукариотни клетки с комплекс от нуклеинова киселина и субстанция с афинитет към нуклеинова киселина, който евентуално е купелуван (свързан) с интернализиращ фактор за тези клетки. Съставът се характеризира с това, че съдържа средство, което има способността, поначало или като съставна част на нуклеиновокиселинния комплекс, да се поема от клетките които ще се трансфицинират^ и да освободи съдържанието на ендоа... омите, в които комплекса се локализира след навлизането в клетката, в цитоплазмата.
По-нататък, това средство ще се означава като ендозомолитно средство“.
Способността на ендозомолитното средство да се приема в клетките за трансфизиране и съдържанието на ендозомите, в които след навлизането в клетката те се локализират, да освободи в цитоплазмата, по-нататък ще се означава като приемаща функция. Тази приемаща функция се състои от способността активно- през рецептор-зависещиендоцитозни механизми, или пасивно през течната фаза или като съставка на нуклеинокиселинния комплекс, да се интернализира в клетката, и от способността да разпука ендозомите, които най-общо се означава ' като ендозомолитична активност или ендозомолиза.
В едно от изпълненията на изобретението ендозомолитичното средство е вирус. Съгласно друго изпълнение ендозомолитното
- 13 средство е вирусна компонента. Вирусът съответно вирусната компонента, които се използват съгласно изобретението, се означават по-нататък като ’’свободен вирус”, съответно като ’’свободна вирусна компонента.
В рамките на настоящото изобретение е изследвана нарастваща доза от аденовируси върху гентрансферния капацитет на константно количество трансферин-полизин-конюгат в Hela клетки, при които като репортерен ген се използва луциферазен ген. Предизвикания от аденовируса усилен гентрансфер , усилването достига един максимум при I х ΙΟ2*· вирусчастички на клетка, число, което отговаря на приблизителния брой от аденовирусии-рецептори на Hela - клетка. До 200 пъти усилената луциферазна -експресия спрямо експресията, която се постига само с трансферин-полилизин-конюгати, отговаря на по-високата вирусна доза. В друга серия от опити се изследва капацитетзтна лимитиращи количества от конюгат-ДНК-комплекси в присъствие на константна аденовирусна доза. Установено бе, че приемането на аденовируси в клетките при последничеството на трансферин-пслилизин при гентрансфера се усилва при широк диапазон от ДНК-дозировки. максималната сила на генекспресията, която се постига чрез конюгат-ДНК-комплекси, отговаря на силата, която се постига с IOO-кратно по-малко ДНК, когато се използват аденовируси за усилване на трансфекционефициенцията.
Действието на аденовирусите върху гентрансфера бе изследвано както с некомплексирани, така и с ДНК, които са с полилизин или с трансферин/конюгати комплексирани (фиг. ЗА). Съгласно този анализ присъствието на аденовирус усилва през време на трансфекцията трансфера на голи, некомплексирани ДНК само незначително. За разлика от това, трансферетна ДНК, комплексирани с полилизин или с трансферин-полилизин-конюгати,се усилва
- 14 при прибавянето на аденовирус, при което този ефект е значително по-силен при трансферин-полилизин-конюгатите. Тъй като поликатйонната част в конюгата не служи само за създаване на свръзката между ДНК и трансферни, но също така предизвиква и явни структурни промени в структурата на ДНК (компактиране в тороидни структури; Вагнер и съавтори 1991а), К&то въз основа на експериментите първоначално да не може дь се направи разлика, дали наблюдаваният ефект се дължи на усилен транспорт на кондензираната с поликатион ДНК в течната фаза или се дължи на предизвикано от вируса увеличаване на транспорта на рецепторсвързан конюгат-ДНК-комплекс. За да се направи разлика между тези две възможности, бяха проведени допълнителни опити за свързване (фигура ЗВ). Свързването на трансферин-полилизин-ДНК или полилизин-ДНК-комплекси при ниска температура без интернализиране дава възможност, преди третирането с аденовирус, излишният· комплекс в течната фаза да се отстрани (Фицжералд и съавтори, 1983). Когато се подходи така, транспортана рецептор-свързаните трансферин-полилизин-ДНК-комплекси се увеличава значително при прибавянето на аденовирус-частички. Това не се случва при полилизин-ДНК-комплексите. Поради това, специфично се усилва навлизането на ДНК в клетката през рецептор - ендоцитоза.
Освен това беше изследвано коя специфична функция на аденовируса способства за усилване на използвания като посредник рецептор гентрансфер (фигура ЗС). Слабо третиране с топлина на вирус-частичките не променя тяхната способност да се свързват с клетъчната мембрана на целевите клетки, но повлиява на способността им, след навлизане в клетката да разпука ендозома (Defer et al., 1990). Въз основа на тези дадености, можаха различните ефекти на вируссвръзката и на навлизането на вируса
- 15 в клетката да се изследват поотделно. При проведените в рамките на настоящото изобретение опити беше установено, че топлинно инактивиране на способността на вирусите, протичащиягпрез рецептор - ендоцитоза гентрансфер да бъде усилен, напълно отпада. От тук беше направен изводат, че усилването на генугрансфера чрез трансферин-полилизин-конюгати се дължи специфично на способността на аденовируса да разпуска (разгражда) ендозоми. Факта, че репликационно-дефектен вирусен щам може да доведе до усилване в на генекспресията, потвърждава схащането, че този феномен се дължи не на репликационната функция, а на приемащата функция на вируса.
За да се изключи възможността усилването на генекспресията да се дължи на евентуална трансактивация па импортирания ген чрез вируса, бяха проведени опити с клетъчна линия, която конститутивно експримира ES V-луцисреразния - ген: Аденовирусите не показаха при тази клетъчна линия ефект, докато в паралелната клетъчна линия, в която генът е въведен посредством трансферин-полилизин-конюгати, предизвиква ясно усилване на генекспресията. Тази констатация пояснява, че аденовирусигповлиява на събития, които настъпват преди транскрипцията, че тяхното ' усилващо действие въздействува върху генимпорта, с това на ниво на генимпорта, а не на ниво генекспресиране (фиг. 5).
В рамките на настоящото изобретение беше проверено и друго, какво въздействие показват аденовирусите върху гентрансфера посредством трансферин-полилизин-конюгати на подбрани клетъчни линии. Установено беше, че наличието на трансферин-рецептори върху целевите клетки е необходимо, но не във всички случай то е достатъчно^за да се направи възможен гентрансфергтпосредством трансферин-полилизин-конюгати. Специфични за клетките фактори, които са във връзка със съдбата на интернализираните в
- 16 ендозомите конюгат-ДНК-комплекси, изглежда че играят съществена роля за размера на гентрансфера, който може да се проведе по този път, С оглед на това, изследвани бяха няколко подбрани клетъчни линии, както по отношение на гентрансфер посредством трансферин-полилизин-конюгати, както и за усилване на гентрансфера чрез аденовируси (фиг. 4). Клетки на цистична фиброзна-клетъчна линия (CPTI) показаха умерена луциферазна-генекспресия след третиране с тренсферин-полилизин-ДНК-комплекси самостоятелно. Степента на експресия значително се повишава при третиране с аденовирус dI3I2. За разлика от това, КВ-клетки, които са третирани с трансферин-полилизин-ДНК-комплекси, въпреки наличието на трансферин-рецептори, показват луциферазна генекспресия, която едза надвишава нивото на фона. Третирането с аденовирус dl3I2 предизвиква все пак при тези клетки ясно доказуема луциферазна активност. По подобен начин се проявява и третирането с аденовируси на Hela-клетки, при което този ефект при тези клетки е значително по силен. Тъй като HeLa-клетки и КВ-клетки притежават приблизително еднакъв брой рецептори за аденовируса, можеше разликата в усилването на гентрансфера да се отрази в броя на трансферин-рецепторите, които са характерни за даден клетъчен тип. За разлика от тази резултати, клетъчните линии VVI-38 и МЕС-5, за които е известно, че при тях инфекцията с аденовирус само слабо се развива ( Precio.ua и Russell, 1985)·, с dI3I2 може да се постигне само много слабо усилване на чрез конюгат-ДНК-комплекси самостоятелно целената ген-експресия. Третирането с аденовирус може да усили генстрансфара посредством конюгат-ДНК-комплекси само в тези случай, при които е възможен гентрансфер през
- 17 същия път и той да протича инефициентно, както при Hela и КВТова клетките, ;че степента на усилване при различните целеви клетки значително варира, може да се дължи на факта, че този ефект е както функция на броя на вирус-рецепторите, например на аденовирус-рецепторите, на даден определен клетъчен тип, така и от броя на трансферин-рецепторите.
В случай на използване на свободен вирус, то веществото с афинитет към нуклеинова киселина е предимно органичен поликатйон, който предимно е конюгиран с един интернализиращ фактор, В рамките на настоящото изобретение беше установено, че при определени обстоятелства ДНК, която е комплексирана само с вещество с афинитет към нуклеинова киселина, също бе интернализиращ фактор ?в присъствие на свободен вирус може да бъде въведена в клетката. Освен това беше намерено, че при някой клетъчни линии приемането на комплекси, състоящи се от нуклеинова киселина и вещество с афинитет към нуклеинова киселина, може да се осъществи през течната фаза, когато концентрацията на комплексите е съответно висока. От опитите, които в рамките на настоящото и на предишни изобретения бяха проведени, беше направен изводат, че съществен елемент за способността за приемане на нуклеиновокиселинните комплекси е тяхната компактност, която се дължи на кондензацията на нуклеиновата киселина чрез веществото с афинитет към нуклеинова киселина. Ако веществото с афинитет към нуклеинова киселина освен способността си да възстанови широкоразпроотбиращата се електронеутралност на комплекса и да уплътни нуклеиновата киселина в компактна структура, притежава и достатъчна способност за свързване към повърхността на клетката, за да проникне заедно с вируса в клетката, тогава няма нужда за повишаване на приемащия капацитет, да се свързва интернализиращ фактор ковалентно към вещест
- 18 вото с афинитет към нуклеинова киселина, за да се прехвърли комплекса през рецептор - ендоцитоза в клетката. Някой клетки показват относително висок афинитет към определени вещества с афинитет към нуклеинова киселина, така че конюгатите от нуклеинова киселина и свързващ фактор се приемат в клетката, без да е необходимо съдействието на интернализиращ фактор. Това се отнася например за хепатоцитози, за които в рамките на настоящото изобретение беше установено, че приемат ДНК-полилизин-комплекси.
При едно предпочитано изпълнение на изобретението, ендозомолизното средство е вирус, който е свързан към веществото с афинитет към нуклеинова киселина и което има способността, да проникне в клетката като част на конюгат/нуклеинова киселинакомплекса и съдържанието на ендозомите, в които се локализира комплексът след навлизането в клетката да изпусне в цитоплазмата.
При друго предпочитано изпълнение ендозомолитното средство е вирусна компонента, която е свързана към вещество с афинитет към нуклеинова киселина и което притежава способността да проникне в клетката като част от конюгат/нуклеинова киселина комплекса и да изпусне съдържанието на ендозомите, в които комплексът се локализира след навлизането в клетката, в цитоплазмата.
Вирусите или вирусните компоненти, които са свързани към нуклеинова киселина-свързващ домен, независимо от начина на свързване, по-надолу ще се означават като вирусни конюгати.
Вирусните конюгати, които също така са предмет на настоящото изобретение, съдържат вируса или вирусния компонент като интегрална съставка на функционалната им конструкция и обединяват предимствата на векторните системи на базата на интер- 19 нализиращ фактор - конюгат с предимствата, които допринасят вирусите в системата.
Освен това, имат вирусните конюгати съгласно тези изпълнения на изобретението предимството, че избягват основните ограничения, който са присъщи на познатите бифункционални конюгатни системи за гентрансфер през рецептор - ендоцитоза, като разполагат със специфичен механизъм, който прави възможно освобождаването им°£летъчно-везикулната система. Вирусните конюгати съгласно изобретението представляват основно концепционално отвръщане от рекомбинантните вирусни вектори, като тази, която трябва да се транспортира чужда-ДНК се носи на външната страна на вирионите. Поради това с помощта на конюгатите съгласно изобретението , могат да се пренесат в клетката много големи генконструкции, при което, с оглед на последователността, не съществуват ограничения.
Пригодността на даден вирус, който като свободен или като свързан вирус или вирусна част ще се използва в рамките на настоящото изобретение, се определя от неговите приемащи функции. Подходящи вируси са,от една страна тези, който притежават способността, при трансфекция на клетките с нуклеиновокиселинния комплекс, през рецептор - ендоцитоза да проникнат в клетката и тяхното освобождаване - и с това освобождаването на нуклеиновата киселина - да проведат от ендозома в цитоплазмата. Без да искаме да се свързваме с тази теория, този механизъм може на импортираните в клетката нуклеиново киселинни комплекси дотолкова да им е от полза, доколкото те попадат при интернализирането в същите ендозоми,както и вирусители заедно с вирусите се пренасят от ендозомите в цитоплазмата. Ако нуклеиново киселинните комплекси съдържат вируса в свързана форма, те се облагодетелстват от ендозомолитната активност на вируса и се
- 20 преместват от ендозома в цитоплазмата. При това, би трябвало фузията между ендозомите и лизозомите и с това нормално протичащото в тези части на клетката ензимно разграждане да се избегне.
Примери на вируси и на по-висши еукариотни клетки, в които те могат да проникнат,са например описаните от Фиилдс и Кнайп, 1990. Възприемчивостта на дадена клетъчна линия за трансформация чрез вирус, който под формата на свободен вирус се използва за облекчаване навлизането на нуклеиновокиселинните комплекси в клетките, зависи от наличието и от броя на повърхностните рецептори за вируса на целевата клетка. По отношение на рецепторите върху клетъчната повърхност за аденовирус, описани са методи за определяне на броя им върху Hela и КВ - клетки ОТ Svensson, 1990 и Defer, 1990·
Към вируси, които са подходящи за състава съгласно изобретението^ чиято при започване на инфекцията протичаща функция на приемане се извършва през рецептор - ендоцитоза, се броят,от една страна вируси без липидна обвивка,като аденовирус, полиовирус, риновирус и от друга страна,вирусите с обвивка Vesicular Stomatitis Virus, Semliki Forest Virus, Influenza
Virus.
Освен това са подходящи и щамовете от Moloney -вирус, които зависят от стойността на pH. Особено предпочитани вируси за прилагане съгласно настоящото изобретение са аденовирус, подгрупа С, тип 5, Semliki Forest Virus, Vesicular Stomatitis вирус, полиовирус, риновируси и Moloney - левкемия вирусни щамове.
Използването на ΕΝΑ- вируси, които не притежават транскриптаза, за настоящото изобретение има предимството, че
- ΖΊ в резултат на трансфекция в присъствие на такъв вирус не:се образува вирусна ДНК. В рамките на настоящото изобретение беше показано, че риновирус HEV2, представител на пикорнавирусната група, повишава експресията на репортерен ген. Производителността на риновируса беше показана както в свободна форма, така и под формата на вирусен конюгат.
В обхвата на настоящото изобретение, под вируси - при предпоставката, че те се приемат от клетката и съдържанието на ендозомите, в които те попадат, се освобождава у се разбират освен дивите типове,но и мутанти, при които -...една или повече мутации,функции на дивия тип, които преди приемащата функция са били различни, по-специално репликационната им способност, са се загубили.
Такива мутанти се получават чрез мутации, съответно делитации в вирус-протеин-регионите, които са отговорни за репликационните функции и от които приемащата функция може да се лиши и които могат да се комплементират при използване на обичайните мутагенезни методи. Към тях се числят например в случая на аденовирус, ts-мутантите (температурночувствителни мутанти), EIA- и AIB-мутанти, мутанти, които проявяват в IviLP- култивирани гени (Беркер, 1988) и мутанти, които показват в области определени капсидпротеини. Подходящи са също така вирусни щамове, които проявяват съответните естествени мутации. Репликационната способност на вирусите може примерно да се изследва с помощта на познатите в литературата опити. При тях клетъчни култури се наслояват със суспензии с различна вирусна концентрация и с помощта на плаки на които те се виждат, се установява броятна лизираните клетки (Dulbecco, 1980).
- 22 Подходящи за използване в рамките на настоящото изобретение са освен това така наречените дефектни вируси. Това са вируси, при коитоведин или повече гени липсва необходимата функция за автономната вирусна репликация и за която те използват помощни вируси. Представители на тази група са Д1 частичките (defective interfering particles) , които се отличават от инфекциозния стандартен вирус, притежават същите структурни протеини^както стандартния вирус, показват мутации и стандартниягвирус им е необходим като помощен вирус за тяхната репликация ( Huang, 1987; Holland, 1990). Представители на тази група са освен това сателитните вируси ( Holland, 1990).
Друга група е класата на парвовирусите, които са означени като adena - associated virus (Berns, 1990)· Тъй като приемащите цикли на много вируси в клетките все още не са напълно изяснени, приема се, че има и други вируси, които проявяват ендозомолитнн активност, която е необходима,за да бъдат те пригодни за прилагането им в настоящото изобретение.
Освен това в рамките на настоящото изобретение подходящи са атенюирани живи ваксини ( Ginsberg, 1980) или щамове за ваксинация.
Освен това, под понятието вируси в рамките на настоящото изобретение попадат инактивирани вируси, като например чрез химическо третиране, като въздействие с формалдехид, чрез УВоблъчване, чрез химическа обработка,комбинирана с УВ-облъчване, примерно псорален</УВ- или бромдезоксиуридин/УВ-третиране, чрез гама-лъчи или чрез обстрелване с неутрони инактивирани вируси.
Инактивирани вируси, каквито например се използват и за ваксини, могат да се получат чрез познати в литературата стандартни методи (Davis u Dulbecco, 1980, Hearst и Thiry, 1977) и да се използват за повишаване на импорта на ДНК-комплекси.
- 23 При проведените в рамките на настоящото изобретение опити, аденовирусни препарати бяха инактивирани посредством обичайна УВ-стерилизационна лампа, съответно с формалин. С изненада бе установено, че степента на инактивиране на вирусите е значително по-голяма от тази на отнемане на гентрансферния ефект, койте бе постигнат, когато аденовирус се прибави към трансфекционната среда. Също при опити, които се проведоха с препарати от псориален/УВ-инактивиран биотинилиран аденовирус, който е конюгиран със стрептавидин-купелуван полилизин показват, че в резултат на инактивирането, вирусния титър спада значително по-силно от гентрансферния капацитет. Това ясно показва, че механизми, които при активния вирус са във връзка с нормалния инфекционен механизъм, могат да бъдат разрушени, без да се разруши ефект«г?който е съществен за гентрансфера.
Под понятието вирусни компоненти се подразбират части от вируси, например освободена от нуклеинова киселина протеинова част (празният вирускапсид, който може да се получи с помощта на рекомбинантни методи, виж например Ansardi et al., 1991, Urakawa et al., 1989)?
Протеини, които се запазват при фракционирането, или пептиди, които притежават съществената за приемащата функция ендозомолитна способност на интактния вирус. Тези вирусни компоненти могат да се получат и синтетично, в зависимост от големината им или посредством пептидна синтеза или посредством рекомбинантни методи. В рамките на настоящото изобретение. .
е доказано, че аденовирусни протеини, които са конюгирани чрез биотин/стрептавидин с полилизин, могат да усилят гентрансфера о Примери за протеинови фрагменти от различни от аденовируса вируси, които са съществени за интернализирането на вируса, обхващат инфлуенцавирус-хемщтлутидинин (НА). Азотният
край на последователността на инфлуенцавируса-хемагглутидинин НА2-подединица е отговорна за освобождаването на вируса от ендозома. Показано беше, че пептиди, които се състоят от 20 аминокиселини от тази последователност, могат да разпукат/разрушат липидни мембрани или да ги фузионират (Wharton et al., 1-988). В настоящото изобретение бяха използвани с успех автентични и модифицирани инфлуенцапептиди в различни изпълнения. Друг пример са o6biL·—ни протеини на ретровируси, например HIV ( Rafalski et al., 1990), съответно части от тези вирусни протеини.
Използването на вируси, които сами по себе си притежават способността да проникват в клетките, представлява само аспект на настоящото изобретение.
Вируси или вирусни компоненти, които само по себе си не носят способността да се свързват с клетката и да навлизат в нея, се използват предимно под формата на по-горе дефинираните вирусни конюгати. Копелуването на един ДНл-свързващ домен, например поликатйон, дава възможност, вирусът или вирусната компонента да получи силен афинитет към ДНК-молекули, с това да се комплексира и като съставка на ДНК-комплекса, който също така съдържа интернализиращ фактор/ДНК-свързващ домен-конюгат, да бъде 'г' транспортиран в кретката. Допълнително към така постигнатия транспортен ешект може свръзката на вируса, съответно на вирусната компонента с нуклеинова киселина-свързващия домен^в резултат на това да има подобрение на своите ендозомолитични свойства.
Чрез подбора на други интернализиращи фактори може практически всяка по-висша еукариотна клетка да се трансфицира със състава съгласно изобретението.
Дали даден вирус, съответно дадена вирусна компонента
- 25 може да бъде приета в смисъла на настоящото изобретение и с това да е подходяща за използване при усилване на гентрансфера, може да се установи чрез прост опит на скриниране. В такъв опит, например за тестуването на даден вирус за приложимостта му като свободен вирус, целевите клетки се поставят в контакт с ДНК-комплекса в присъствие или в отсъствие на вируса. Количеството ДНК-комплекс, което се освобождава в цитоплазмата, може след това чрез доказване с маркергенен-продукт, например луцифераза, да се установи. Ако присъствието на вируса осигурява по-голямо количество ДНК-комплекс да се приеме в клетката и да се освободи в цитоплазмата,отколкото отсъствието му, то тази приемателна функция може да се дължи на вируса. Възможно е също така, тестуваниятвирус да се сравни с друг вирус по отношение на приемателната му функция, за който е известно, че притежава подходяща приемателна функция, например с аденовирус, подгрупа С, тип 5. Такива тестове могат да се проведат също така и с вирусни конюгати, като при тези тестове могат да се включат и допълнителни параметри като различни интернализиращи фактор-конюгати, в различни количества. Освен това един среден специалист в областта може да използва опити от този вид, евентуално заедно с други изпитания, като например опит за пропускливост на липозомите ( Liposomen Leakage Assays), върху вирусни компоненти или други средства с потенциална ендозомолитна активност, за да ги изследва за способността им да повишават генекспресирането.
В случай на използване на интактни вируси целесъобразно е успоредно с предварителните опити, в които вирусът се изследва по отнешение способността му да усилва гентрансфера, да се изпита дали вирусзте способен да се репликира. Изследванията за репликационна способност в случай на цитопатични
- 26 вируси или в случай на вируси, които значително повлияват растежа на гостоприемника , се извършва с помощта на опити върху плаки (сравни по-горе). При други вируси се използват доказващи методи?специални за дадения вирус, например хемагглутионатион теста или химико-физични методи (елекронно микроскопски).
В рамките на настоящото изобретение, по-специално,когато се използват свободни вируси^се предпочитат такива вируси, които се добиват във висок титър, които са стабилни, които като див тип показват незначителна патогенност и при които е възможно целево изключване на репликационната функция, по-специално аденовируси. Когато трябва да се трансфицира определена клетъчна популация, предпочитат се вируси, които специфично инфицират тази клетъчна популация. В случай, че трансфекцията трябва да обхване различни клетъчни типове, могат да се използват вируси, които са инфекциозни за повече клетъчни типове.
Изискванията към вируспрепарати са по същество възможно най-голяма чистота, както и напасван към дадения вирус стабилизиращ буфер.
Във всеки случай за лечебно приложение на настоящото изобретение наъживо могат да се използват само такива вируси, съответно вирусни компоненти, при които рисковете по отношение на сигурност, по-специално по отношение на репликацията на вируса в клетката,както и рекомбинирането на вирус-ДНК с гостоприемник-ДНК, са сведени в най-голяма степен до минимум.
С предимство може да се използва входящиятмеханизъм на вируси, които заразяват други животни освен хора, за да се усили приемането и освобождаването на ДНК в по-висши еукариотвирусаг ни клетки, по-специално в човешки клетки, доколкотбЧпоказва способността в клетките да разпука ендозомите. Членове на фамилията на аденовирусите бяха изолирани от птичи видове,
- 27 от амфибии и от различни други животни (виж например Laver et al·· 1971; Bragg et al., 1991; Akopian et al., 1991; Takase et u Reece et. al., 1987).
al., 1990; Khang u Hagaraji,1989 / АмфибиЙНИ· ·, ПТИЧИ , говежди , кучешки , миши , овчи , свински и маймунски аденовируси, както и човешки аденовируси могат да се получат от Американската типова културална колекция, Роквил, мериленд (виж Американски типов културален каталог от животински вируси и антисеруми, Chlamydae and Rickettsiae, ¢. Aufl., 1990, C. Buck u. G. Paulino Hag., S· 1 - 17).
Възможни предимства при използване на вирус, например на аденовирус, от отдалечен вид може да бъде намалена токсичност в целевите клетки (примерно не се е очаквало от птичи- или жабешки аденовирус да се реплицира в клетки на бозайници или експресията да инициира по-рано гени), един в сравнение с човешки аденовирус намален риск за изследователя, който създава този вирус от отдалечен вид, и намалено смущение чрез антитела срещу човешкия или миши аденовирус. Липсата на смущение чрез човешки или миши антитела е особено важно, когато вирусите ще се използват за генна терапия при хора или при мишки.
Птичият аденовирус CEW (Chick Embryo Lethal Orphan Virus) не показва реактивоспособност с антитела, които разпознават главните групи епитопи на аденовирусите, които инфектират клетки на бозайници. Освен това СЕЮ вируси могат да се отглеждат в яйца с ембрионално развитие, за да се получат големи количества вируси (0.5 мг/яйце; Laver et al., 1971). Както се вижда от примерите, CEID-полилизин-конюгати усилват ДНК-транспорта в Hela-клетки в степен, сравнима с човешкия аденовирус dI3I2. Използването на CEW-конюгати за усилване на ДНК-транспорта е поради това за хуманната генна терапия много обещаващо.
- 28 Вируси от отдалечени видове се предпочитат като съставки на вирусни конюгати в комбинационни комплекси (съгласно дефиницията в рамките на настоящото изобретение).
В конюгатите съгласно изобретението, които съдържат вирус, може свързването на вируса към нуклеинова киселина-свързващ домен да бъде ковалентно или да не бъде ковалентно, като последното може да е през биотин-стрептавидинов мост или в случай, че вирусът притежава върху повърхностния си протеин региони, които са кисели и поради това могат да се свържат с поликатион, през йонна връзка.
При опити в рамките на настоящото изобретение бяха образувани комплекси, които позволяват йонно обменно действие между аденовируса и полилизин преди комплексирането с ДНК. Като контрола бяха проведени опити при условия, при които полилизин се неутрализира първоначално с ДНК и поради това не е свободен да се свърже към аденовируса. При тези опити комплексите с йонно свързан аденовирус се оказаха по-добри.
Примери за вирусни компоненти в конюгатите с ендозомолитна активност съгласно изобретението са празните вирусни капсиди или вирусни пептиди. Свързването на вирусните компоненти към нуклеиново киселини-свързващи-домени може да бъде ковалентно, например чрез химическо коплуване на вирусния пептид с полилизин, или неисовалентно, например йонно^в случай че вирусните компоненти имат кисели остатъци, за да се свържат към поликатион.
Съотношението на вирус или вирусни компоненти към вещестсе вото с афинитет към нуклеинова киселина може даУварира. В случая на инфлуенца-хемахглутининпептид-полилизин-конюгата в рамките на настоящото изобретение беше намерено, че гентрансфергт се усилва в по-голяма степен, когато съдържанието на вирусен
- 29 пептцд в конюгатите е по-високо.
Настоящото изобретение се отнася в друг аспект до методи за получаване на конюгати от в:*рус(компоненти) и вещества с афинитет към нукеинови киселини.
Вирусните конюгати могат (както интернализиращ фактор-по ликатйон-конюгатите) да се получат чрез свързване (котиране) на компонентите или в случай^че вирусната компонента и полика тионгтса пептиди по рекомбинантен начин. По отношение на методите на получаване се има предвид описанието на ЕР 388 758.
Коплуването (свързването) на вирус, вирусен протеин или -пептиди с полиаминовите съединения по химически начин може да се осъществи по сам по себе си познат път за свързване на пептиди, при което, ако е необходимо, отделните компоненти преди реакцията на свързване се снабдяват с линкерни субстанции (тази мярка е тогава необходима, ксгато няма налице покачало подходяща функционална група за свързването, примерно меркапто- или алкохолна rpynaji При линкерните зещества се касае за бифункционални съединения, които първоначално реагират с функционалните групи на отделните компоненти и след това се провежда свързването на модифицираните отделни компоненти.
Свързането може да стане чрез;
а) Дисулфидни мостове, които при редукционни условия отново могат да се разцепят (например при използване на сукцинимидилпиридилдитиопропионат (Jung et al., 11981).
8} При биологични условия,при което се получават стабилни съединения (например тиоетер чрез взаимодействие на малеимидолинкери с сулфхидрилни групи на свързаните към втората компонента линкери).
с) При биологични условия,при които се получават лабилни
- 30 мостове, примерно естерни връзки, или при слабо кисели условия се получават нестабилни ацетални или кетални съединения.
В рамките на настоящото изобретение проведените опити, ендозомолитни инфлуенца-хемахглутинин НА2-пептиди с полилизин се свързват по химичен начин чрез сукцинимидилпиридилдитиопропионат (5РДР). показано беше, че модифицирането на пептида с полилизин увеличава ендозомолитната активност. Трансфекционни експерименти показаха, че ефициенцията чрез посредничеството на трансферин-полилизин гентрансфер значително се покачва, когато инфлуенцапептидни-полилизин-конюгатите заедно с трансферин-полилизин в ДНК--комплексите са налице.
По-нататък, в рамките на настоящото изобретение, аденовирус бе свързан с помощта на различни методи към полилизин.
Един начин на свързване към полилизин става по подобен начин както при получаването на тренсферин-полилизин конюгати ( Wagner et al.., 1990) след модифициране на дефектния аденовирус СЙ312 чрез хетеробифункционален реактив. Несвързаният полилизин се отделя чрез центрофугиране. Способността за свързване на ДНК се потвърждава експериментално с радиоактивно маркирана ДНК.
В К562 клетки в отсъствие на хлорохин може с комплекси, състоящи се от ДНК, аденовирус-полилизин и трансферин-полилизин,кюже да се постигне значително по-висок гентрансферлотколкото с немодифициран аденовирус, който не е свързан към ДНК. Осен това беше намерено, че в HeLa клетки чрез полилизин-модифициран аденовирус ее осъществява ясна генекспресия само с 0.0003 мкг ДНК в 5 х 10^ HeLa клетки.
Ако вирусът, съответно вирусните компоненти^показват подходяща въглеводородна верига, те могат да се свържат с веществото с афинитет към нуклеинова киселина чрез една или повече
- 31 въглеводородни вериги на гликопротеина.
Подходящ метод за получаване на гликопротеин-поликатйонконюгати е описан в германска патентна заявка Р 41 15 038.4; описана на кратко от Вагнер и съавтори, 1991b.
Друг предпочитан метода за получаване на конюгатите съгласно изобретението е внзим;___έοτο свързване на вируса, съответно на вирусната компонента към вещество с афинитет към нуклеинова киселина, по-специално полиамин, чрез трансглутаминаза.
Групата на трансглутаминазите обхваща повече различни ензими, които между другото се срещат в епидермиса (епидермална трансглутаминаза), в кръвта (фактор XIII) и в клетките на различни тъкани (тъканна трансглутаминаза) ( Polk, 1985).
Трансглутаминазите катализират в присъствие на Са++ и при отцепване на NH^ образуването на £- (ух-глутамил)лизин свръзки. Предпоставка за това е в протеините да присъстват съответкоито могат да се превърнат от ензима.
ните глутамини и лизини,
Освен £-аминогрупата на лизина, могат да действуват като субстрат (поли)амини като етаноламин, путресцин, спермин или спермидин ( Clarke et al., 1959);. За сега не е изяснено от какви фактори зависи, дали даден глутамин или лизин на протеина или полиамин на ензим могат да бъдат превърнати, лзвестно е, че многобройни клетъчни протеини, като цитокератин ( Zatloukal et al., 1989) , тубулин, клетъчни мембранни протеини и също така повърхностни протеини на инфлуенцаьируси ( iwanij, 1977) могат да бъдат свързани към полиамини посредством трансглутами наза.
В рамките на настоящото изобретение можа да бъде показано,
- 32 че полилизин може да се свърже към аденовируси посредством трансглутаминаза. Установено беше, че свързването може да се проведе в присъствието на глицерин. Това дава предимството, че вирусен препарат, например един аденовирусен препараткойто съдържа глицерин в буфера като стабилизиращо средство, може да се използва директно за свързването.
С помощта на аденовирус-полилизин-конюгати, които съвместно с тренсферин-полилизин-конюгати с плазнид-ДНК са комплексирани, можа да се постигне многократно по-висока генекспресия., отколкото с трансферин-полилизин-конюгати в присъствието на пе-полплизин-свързан аденовирус.
Друг в рамките на настоящото изобретение предпочитан метод за получаване на конюгатите съгласно изобретението се състои в това, че вирус или вирусна компонента се свързва посредством биоо^ин-протеинов мост, за предпочитане биотин-стрептавидинов мост, към поликатйона.
Познатото силно асоцииране на биотин с стрептавидин, съответно авидин ( wilchek et. al., 1988), се използва за свързването на аденовирус към полилизин, като аденовируса се модифицира с биотин и стрепавидин по подобен начин^както при създаването на трансферин-полилизинконюгатите ( Wagner et al., 1990) се свързва химически с полилизин. Комплекси, състоящи се от ДНК и стрептавидин-полилизин, към които е свързан биотин-модифицирания вирус, и евентуално още не^ховалентно свързания полилизин, показват много висока трансфекционна ефициенция, дори при ниски ДНК-концентрации. Особено ефициентни комплекси се образуват, когато биотин-модифицирания комплекс се свърже първоначално към стрептавидин-полилизин и едва във втори етап да , . следва свързването към ДНК.
- 33 Евентуално свързването с бдощин може да се осъществи и чрез авидин.
Освен това е възможно, свръзката между вирус(компонентата) и полилизин да се осъществи, като от една страна вирусзтсе биотинилира и от друга се конюгира едно анти-биотин-антитело с полилизин и свръзката между вирус и полилизин се създава чрез биотин/антитело-свръзката, при което могат да се използват търговскидостъпни поликлонални или моноклонални антитела срещу биотин.
Свръзката между вируса и полилизин може също така да се получи, като полилизинктсе свърже с лектин, който притежава афинитет към вирус-повърхностенгликопротеин, при което свръзката при такъв конюгат се осъществява чрез свръзката между лектина и гликопротеина. Ако вирусвгсам по себе си не притежава подходящи въглехидратни странични вериги, той може да бъде съответно модифициран.
Вирусът може също така да се свърже и с вещество с афинитет към нуклеинова киселина, като първоначално на повърхността се модифицира с чужд за вируса антиген (например Дигоксигенин който може да се закупи от Бьорингер шанхайм, или с биотин) и съединението между модифицирания вирус и веществото с ауинитет към нуклеинова киселина се реализира през антитело, което се свързва с този антиген.
Кой метод за получаване на конюгатите съгласно изобретението ще се използва, се определя от различни критерии. Така, например, свръзката чрез биотин е най-неспецифична и поради най широко използваната методика, тя представлява много силна нековалентна връзка. Ензимната реакция с трансглутамяназа има предимството, че може да се провежда и в най-малки мащаби.
- 34 Химическото свързване най-общо се използва, когато трябва да се синтезират по-големи количества конюгати, този метод е обикновено целесъобразен, когато трябва да се свържат вирусни протеини или вирусни пептиди. Когато се използват инактивирани вируси, обикновено инактивирането се предприема преди свързването, когато свързването няма да се повлияе от инактивирането.
Когато един вирус, например аденовирус или ендозомолитна негова компонента, притежава достъпни свързващи домени, примерно кисели домени за свързване към поликатион, може свързването на вируса, съответно на вирусната компонента към поликатиона да бъде и йонно, В този случай положителните заряди на поликатлона, който евентуално може да е конюгиран с интернализиращ фактор, се неутрализират частична с киселите домени на вируса или вирусната компонента ., остатъкът от положителните заряди се неутрализира в голяма степен от нуклеиновата киселина.
Ако като вещество с афинитет към нуклеинова киселина се използва интеркалираща субстанция, то то се модифицира с подходящ за съответното свързване с вируса или вирусната компонента линкер, например за свързването с трансглутаминаза, със спермин или с бифункционална, за химическото свързване компетентна група може примерно да се използва активен естер.
Съотношението на вирус(компонента) : вещество с афинитет към нуклеинова киселина може да се варира, обикновено се установява емпирично, като например се конюгират постоянно количество вирус(компонента) с различни количества полилизин и така се подбира оптималниятконюгат за трансфекцията.
В друго изпълнение на изобретението, може вирускомпонентата, например ендозомолитвн вирусен пептид, да се модифицира, за да може директно да се свърже с ДНК. За тази цел може пеп
- 35 тидггсам по себе си да притежава ДНК-свързващ домен, който може да се запази, като пептидзтсе получи чрез пептидна синтеза, при което се предвижда отрязък от положително заредени аминокиселини, за предпочитане чрез удължаване на пептида, особено предпочитано на въглеродния край.
При едно друго изпълнение на изобретението ендозомолитното средство е не^вирусен, евентуално синтетичен пептид. Пептид от този тип се съдържа в състава съгласно изобретението, като е свързан йонно с веществото с афинитет към нуклеинова киселина, примерно към полилизин в случай на ДНК/интернализиращ фактор-полилизин-комплекси. По този начин се осъществява вграждането на ендозомолитния пептид в нуклеиновокиселинния-комплекс, като пептидзгчрез своите кисели аминокиселинни остатъци се свързва с положително натоварените нуклеиново киселиннисвързващи домени, за предпочитане полилизин. В зависимост от химическата структура на пептида, по-специално по отношение на крайната му група, може свързването с полилизин да се извърши и чрез описаните тук методи за свързване на пептиди с полилизин. За тази цел, когато се използва срещащ се в природата пептид, този пептид да се модифицира с подходяща терминална аминокиселина като дръжка” за конюгирането.
Друг начин не-вирусни ендозомолитни пептиди да се вградят в нуклеиновокиселинните-комплекси е този, те да се снабдят с последователности, които се свързват с ДНК. Положението на тази последователност трябва да е такова, че да не смущава ендозомолитната активност на пептида. Заради това,примерно пептиди, чиито М-край отговаря за тази активност, се удължава (елонгира) в С-край със свързващи се с ДНК-последователности. Удълженията от този вид могат да бъдат хомоложниили хетероложни ка
- 36 тионни олигопептиди, примерно една олиголизинопашка, или един естествен ДНК свързващ домен, например пептид,отведен от един хистон. За предпочитане те обхващат една интегрална част на ендозомолитния пептид образуващите ДНК-свързващи последователности пт около 10 - 40 аминокиселини. Това изпълнение на изобретението дава възможността за по-високо съотношение на ендозомолитна последователност : ДНК-свързваща последователност^отколкото в пептидните конюгати, които съдържат по-големи части от поликатиони, за да постигнат по-висока производителност на комплексите.
Не^вирусните ендозомолитни пептиди трябва да отговарят на следните изисквания.
По отношение на ендозомолитната активност трябва осъществената чрез пептида пропускливост на липидната мембрана даг ' е за предпочитане по-висока при ниска рН-стойност (5 - 6), отколкото при рН-стойност 7. Освен това, разрушените част,·! на мембраната трябва да са достатъчно големи, за да могат през тях да преминат по-голями ДНК-комплекси (малки пори не са достатъчни). За да се установи дали даден пептид отговаря на тези изисквания, могат да се проведат опити ин витро, в които пептидите в свободна или в свързана форма и/или вградени в ДНК-комплекс се изпитват. Такива опити могат да обхванат пропускливост на липозоми или еритроцити ( «leakage assays) и експерименти с клетъчни култури, в които се определя усилването на генната експресия. Тестове от този тип са описани в примерите. Оптималното количество пептид може да се установи в предварително титруване, като се определи производителността на получения е резултат гентрансфер. При това трябва да се има предвид, че производителността на различните пептиди и оп
- 37 тималното съотношение на комплекса могат да бъдат зависими от клетъчния тип.
Пептидите, които разкъсват мембраните, съдържат общо взето амфипатични последователност, а именно една хидрофобна страна, която може да извършва с липидната мембрана обменни действия, и една хидрофилна страна, която на мястото на разкъсване на мембраната стабилизира водната фаза.
В природата има няколко примера на пептиди, който разкъсват мембраните, обикновено за малки пептиди или за пептидни домени на по-големи пептиди. Тези пептиди могат съобразно тяхната Функция в естествен контекст да бъдат класифицирани, а именно или като пептиди нарушаващи мембраните (например пептиди на голи вируси) и/или фузиониращи мембраните пептиди (например пептиди на вируси с обвивка). За разпукването на ендозоми във връзка със синтетични пептиди могат да се използват и двата класа пептидни последователности. Повечето естествени пептиди могат да образуват амфипатични о<-хелицсм.
Чрез вграждане на кисели остатъци на хидрофилната страна на предполагаем амфипатимен -хеликс по начин, че хеликс^тда може да се образува само при кисела pH-стойност, но не и при неутрално pH, при което отблъсванията на зарядите между негатив· но натоварените кисели остатъци предотвравяват образуването на хеликс, може да се получи pH-специфичност. Това свойство се среща също така и при естествено срещащи се последователности (например азотния край на инфлуенца-НА2-пептида).
От Subbarao et al., 1987 и от Parente et al., 1990 е описан изцяло синтетичен амфипатичен пептид с pH специфични свойства за разкъсване на мембрани. От този пептид (в свободна форма) беше .показано^че образува в мембрани само малки пори,
- 38 които позволяват освобождаването само на малки съединения (Parente et al., 1990).
При едно от изпълненията на настоящото изобретение, при което се използват не вирусни, евентуално синтетични пептиди, се предприемат обикновено следните стъпки: От групата на естествено срещащите се или синтетични пептиди се избира една амфипатична пептидна последователност. Пептиди от този вид принадлежат към нивото на техниката; преглед на примери са дадени в таблица 2. Ако е необходимо, се въвеждат кисели остатъци (Glu, Asp} ? за да се направи активността на пегкглдите да разкъсват мембрани, по специфична от pH-стойността, например двоинокиселия мутант на инфлуенца-хема^глутининпептида с означението Р50, отговарящ на пример 37 . Ако е необходимо, могат кисели остатъци също да бъдат въведени, за да се улесни свързването на пептида към полилизина. Възможност да се предвиди такъв поликатйонен -свързващ домен може да се състои в това, да се осигури кисели удължения в въглеродния край, например една олиго-Glu - опашка.
Подходящи за настоящото изобретение ендозомолитни пептиди могат също така да се получат като срещащи се в природата и изкуствени последователности се обединят. В процеса на .настоящото изобретение проведени са примери с различни пептиди, производни на описания от Паренте и съавтори 1990 синтетичен пептид GALA. Някои от описаните в примерите на настоящото изобретение използвани производни бяха получени, като пептидзт GALA или негови модификации се комбинират с последователности на инфлуенца - пептида или негови модификации, например пептидите с означенията EAIA-инф и EALA-P50, съгласно пример 37.
Дължината на пептидната последователност може с оглед на
- 39 амфипатичния хеликс да е критична; повишаване на стабилността на къси домени, които са производни на естествени протеини и на които липсва контекста на стабилизиращия протеин, може да се постигне чрез удължаване на хеликса.
За да се усили ендозомолитната активност на пептидите, могат да се образуват хомодимери, хетеродимери или олигодимери; в примерите на настоящето изобретение беше показано, че Р5О-димера показва много по-силна активност от мономера·
Изобретателите са показали действието на синтетични пептиди за приемането на ДНК посредством трансферин-полилизин-конюгати. Синтезирани са многобройни различни пептиди, определена беше способността им да направят липозомите и еритроцитите пропускливи и беше изпитано действието им върху луци^'еразната-експресия в TIB 73 -клетки и в ШН 312 - клетки.
В друго изпълнение на настоящото изобретение ендозомолитното средство представлява на^пептидна амфипатична субстанция. Изискванията, на които такава субстанция трябва да отговаря, за да бъде подходяща за приложение в рамките на настоящото изобретение, са по същество същите, както и за амфипатичните пептиди, а именно да имат способността да се интегрират в нуклеиново киселинния комплекс, да са pH специфични и т.н.
Изобретението се отнася в друг аспект и до комплекси, които се приемат в по-висши еукариотни клетки, съдържащи нуклеинова киселина и един конюгат, който има способността, да образува комплекс с нуклеинова киселина, за въвеждане на нуклеинова киселина в по-висши еукариотни клетки. Комплексите се характеризират с това, че съдържат един конюгат, който се състои от вещество с афинитет към нуклеинова киселина и от ендозомолитно средство, което е свързано към веществото с афинитет към
- 40 нуклеинова киселина и което притежава способността, като съставка на конюгат/нуклеиново киселинен-комплекс да бъде прието клетката и вУсъдържанмето на ендозомите, в които комплексзт- след навлизане в клетката се локализира, да бъде освободено в цитоплазмата.
Нуклеиново киселинните комплекси, които се използват в рамките на настоящото изобретение, са предимно такива, при които нуклеиновата киселина е комплексирана с вещество с афинитет кам нуклеинова киселина по начин, че комплексите по същество електронеутрален.
При едно предпочитано изпълнение на изобретението ендозомолитното средство е вирус или вирусна компонента, което е ковалентно свързано към поликатион.
В рамките на настоящото изобретение ендозомолитните конюгати обхващат - допълнително към конюгатите, при които ендозомолитното средство е свързано йонно към ДНК-свързващ домен съгласно дефиниция също и ендозомолитни средства, които са свързани директно към ДНК, например чрез своето базично продължение, въпреки че конюгати от този вид строго взето не се получават чрез конюгиране, това ще рече чрез свързване на два компонента. Функцията на ендозомолитни средства от този тип като съставки на състава съгласно изобретението не зависи от това, дали са синтезирани чрез конюгиране на ендозомолитно средство и един ДНК-свързващ домен или дали в ендозомолитното средство е имало първоначално един ДНК-свързващ домен.
При едно предпочитано изпълнение на изобретението, комплексите съдържат допълнително към ендозомолитния конюгат и един допълнителен конюгат, в който вещество с афинитет към нуклеинова киселина, в случай на ендозомолитен поликатионен-конюгат най-общо същото,както това на конюгата, е съединено с
- 41 интернализиращ фактор с афинитет към целевата клетка. Това изпълнение на изобретението се прилага преди всичко тогава, когато целевата клетка няма или притежава само малко рецептори за вируса, който се прилага като съставка на ендозомолитния конюгат. Друго приложение на това изпълнение е, когато се използва вирусна компонента, съответно природно срещащ се, евентуално модифициран пептид, не^вирусен, евентуално синтетичен ендозомолитен пептид или вирус от отдалечен вид, които нямат способността сами по себе си да проникнат в трансфицирани клетки. В присъствието на един допълнителен интернализиращ фактор-свързващ,фактор-конюгат,използват тези ендозомолитни конюгати интернализиращата способност на втория конюгат, като заедно с него се комплексират към нуклеиновата киселина и като съставка на така получения комплекс, по-нататък означен като комбинационен комплекс1' или тернерен комплекс”, да се приемат от клетката. Без да искаме да се обвързваме с тази теория, комбинационните комплекси се приемат от клетките или чрез свързване към специфичния за интернализиращия фактор повърхностен рецептор или в случай,че се използва вирус или вирусна компонента, чрез свързване към вирусния рецептор или чрез свързване с двата рецептора по пътя на рецептор - ендоцитоза. при освобождаването на ендозомолитното средство от ендозомите се освобождава и съдържащата се в комплексите ДНК в цитоплазмата и с това се избягва лизомолихеичното разграждане.
При опитите съгласно настоящото изобретение с Hela клетки можаха почти всички клетки да се трансфицират със свободен аденовирус. Производителността за хепатоцити можа допълнително да се повиши, когато се използват тернерни ДНК-комплекси, в които репортер-ДНК са комплексирани с полилизин-трансферин
- 42 конюгати и са свързани с аденовирус. Тук се осигурява общо локализиране на ендозомолитния вирус и на лиганд/рецептор-комплекса в ендозома, при което при различни клетки, като BI\LL..CL2и НерС2-клетки се постига практически във всички клетки. Такава сходна ситуация може да се създаде.за опитите, при които тернерни, трансферни съдържащи комплекси навлизат в К562-клетките по-скоро през трансферин рецепторите отколкото през аденовирусните рецептори.
Изненадващо, терниерни комплекси транспортират ДНК дори в много ниски количества. Така, при прибавяне на 30 р^ ДНК за 3 х 10^ клетки се получават 1.8 х светлинни единици ( в резултат от експресията на получена върху плазмид съдържаща се, за луцифераза кодирана последователност). При такъв инпут върху една клетка се падат само 60 ДНК-молекули и I РРС1 на вирус (“Plaque Forming Unit). За сравнение: по-малко ефициентното калциевоутаително предписание използва 2 х 10 ДНК-молекули за клетка ( Sambrook et al., 1989). Поради това, настоящото изобретение представлява съществен напредък, тъй като позволява ефициентно трансформиране на по-висши еукариотни клетки с много малки количества ДНК.
Присъствието на вируси, вирусни компоненти или не^вирусни ендозомолитни средства като съставки на ендозолитни конюгати в ДНК-комплексите има следните предимства:
I) По-широка приложимост на ценната трансферна техника с нуклеиновокиселинни комплекси, тъй като ендозомолитното средство само по себе си, особено в случай, че се използва вирус или вирусна компонента, може да образува интернализиращия фактор или също така в комбинация с друг интернализиращ фактор (например трансферин или азиалофетуин и т.н.) може да се ком плексира към ДНК. Поради това е възможно, положителният ефект на вирусите да се използва и за клетки, които нямат рецептор за дадения вирус.
2) Подобряване на гентрансферната ефециенция, тъй като със свързването на ендозолитните конюгати към ДНК се осигурява съвместно приемане в клетките. Чрез кординираното приемане и освобождаване на вируси и ДНК. по-нататък се създава възможноста за намаляване на неоходимото количество ДНК и вируси^за да се получи ефициентен гентрансфер, което, особено при прилагане на/живо, е от особено значение.
Под интернализиращ фактор трябва в рамките на настоящото изобретение да се подразбират лиганди или фрагменти от тях, които след свързване към клетката през ендоцитоза, за предпочитане чрез рецептор,посредничещ на ендоцитоза, се интарнализират, или фактори, чиято връзка/интернализация се осъществява чрез фузиране с клетъчни мембранни елементи.
Към подходящи интернализиращ:: фактори се броят лигандите трансферни ( Klausner et. al., 1983), коналбумин ( Sennett et al., 1981), азиалогликопротеини (като азиалотрансферин, азиалокозомукоид или азиалофетуин), ( Ashwell et al., 1982), лектин (Goldstein, еt al.,1980 и Shardon, 1987), съответно субстанции, които съдържат галактоза и които се интернализират през азиалогликопротиенрецептора; маннозилирани гликопротеини (Stahl et al., 1987·)., лизозомални ензими (sly et al., 19 1982), LDL (Goldstein et al., 1982)·, модифициран LDL .,.. (Goldstein et al., 19?3), липопротиени, които се приемат в клетката чрез рецептори (apo BIOG/LDL); вирусни протеини, като HIV-протеин cjpI20; антитела (Mellman efc al., 1984, Kuhn et al., 1982, Abrahamson et al., 1982), съответно
- 44 Фрагменти от тях срещу антигени на клетъчната повърхност, например анти-СД4, анти-СД7; цикотин:: като интерлеукин-i (Mizel et al., 1987), интерлеукин-2 (Smith et al·, 1985), TNF (Imamure et al., 1987), интерферон (Anderson et al., 1982), CSF (Colony-stimulating Factor), (Walker et al·, 1987), фактори и растежни фактори като инсулин (Marshall, 1985}, EGF (Epidermal Growth Factor), (Carpenter, 1984); PDGF (Platelet-cLerivsd Growth Factor), (Heldin et al., 1982), TGFyi (Transforming Growth Factor β ), (Massague et al.r 1986), нервен растежен фактор ( Hosang et al. ,1987^нсулиноподобен растежен фактор I ( Insulin-like Growth Factor}, (Schalch et al., 198$), LH, FSH (Ascoli et. al., 1978), растежен хормон (Hizuka et al., 1981);^ролактин (Posner et al., 1982), глюкагон ( Asada - Kubota et al., 1983), тироидни хормони (Cheng et al., 1980), ρς-2-макроглобулин-протеази (Kaplan et al·, 1979), както и обезоръжени” токсини. Други примери са имуноглобулини или тяхни фрагменти като лиганди за PC-рецептора или антиимуноглобулин-антитела, които се сзързват към Sigs (Surface Immunoglobulins). Лигандите могат да са от естествен или от синтетичен произход (вж. Trends Pharmacol. Sci.,1989 и там цитираните източници).
Съществено за пригодността на такива интернализиращи фактори в рамките на настоящото изобретение е
а) да могат да се интернализират от специфичния клетъчен тип, в които трябва да се въведе нуслеиновата киселина и тяхната интернализираща способност да не се повлиява или да не се повлиява съществено, когато се конюгира със свързващия фактор и
б) да са в състояние в рамките на това свойство, по из45 ползвания от тях път,· да пренесат . нуклеиновата киселина.
В опитите в рамките на настоящото изобретение беше показана широката приложимост на изобретението по отношение на интернализиращия фактор, съответно на допълнителен интернализиращ фактор в комбинираните комплекси с помощта на човешки- и мишитрансферин-полилизин-конюгати, азиалофетуин-полилизин-конюгати, галактоза-полилизин-конюгати, аглутидин от пшеничени кълнове-рХг конюгати, Т-клетки-специфични jpI20-pI и антиСД7-р1гКОнюгати, на 1Д1-р1.-конюгати, Ig-pL- и анти-1с|-рЬ-конюгати, както и с помощта на ДНК-полилизин-комплекси, които не съдържат интернализиращ фактор. Освен това, с помощта на комплекси от ДНК и полилизин-конюгиран вирус (съответно вирусни компоненти), които не съдържат допълнителен интернализиращ шактор-свързващ факторкошогат, беше показана производителността на вирусните конюгати съгласно изобретението.
В предварителни опити може да се установи дали,в случай че се използва свободен вирус като ендозомолитно средство, използването на .интернализиращ ^актор, или дали в случай, че ендозомолитното средство е вирус или вирусна компонента или един нех-вирусен пептид като част на ендозомолитен конюгат, допълнителният интернализиращ фактор прави възможно или подобрява приемането на нуклеиново киселинни-комплекси. Такива опити обхващат паралелни трансфекции с нуклеиново киселинни комплекси един път без (допълнителен) интернализиращ фактор, например в случай на вирусни конюгати с комплекси, състоящи се от нуклеинова киселина и вирусен конюгат, и един път с комплекси, в които нуклеиновата киселина е с друг конюгат, който съдържа друг интернализиращ фактор, към който целевите
- 46 клетки имат рецептор.
При използването на интернализиращ фактор или на допълнителен интернализиращ фактор, т.е. когато се използва комбиниран комплекс, той преди всичко ще се дефинира от целевите клетки, например чрез определени повърхностни антигени или рецептори, които са специфични за даден клетъчен тип и с това дават възможност за направляван транспорт на нуклеиновата киселина в този клетъчен тип.
В рамките на настоящото изобретение подходящи вещества с афинитет към нуклеинова киселина са например хомоложни органични поликатиони като полилизин, полиаргинин, полиорнитин или хетероложни поликатиони с две или повече различно положително натоварени аминокиселини, при което тези поликатиони могат да имат различна дължина на веригата, също така не· пептидни синтетични поликатиони като полиетиленимин. Подходящи също така вещества с афинитет към нуклеинова киселина са природни ДНК свързващи протеини с поликатйонен характер като хистони или протамини, съответно тяхни аналози или фрагменти, както и спермин или спермидин.
Дължината на поликатйона не е от критично значение, доколкото комплексите с оглед на предпочитаното изпълнение са по същество електонеутрални. Предпочитана дължина на полилизиновата верига е от порядъка на от около 20 до около 1 000 лизин мономери. Не съществува обаче предписание за Д1К-дължината, която да е критична за поликатиона. Когато ДНК се състои от 6000 Ьр и от 12000 негативни заряда, то количеството на поликатйона за мол ДНК примерно да бъде:
мола полилизин 200 или мола полилизин 400 или
120 мола полилизин 100 и т.н.
- 47 Среден специалист в областта може чрез рутинни опити да подбере други комбинации на дължина на поликатиона и молно количествоо
Други подходящи вещества с афинитет към нуклеинова киселина като съставки на конюгати са интеркалиращи субстанции като етидиумдимери, акридин или интеркалиращи пептиди, които съдържат триптофан и/или тирозин и/или фенилаланин.
По отношение на качествения състав на нуклеиновите комплекси най-общо първо се уточнява нуклеиновата киселина, която ще се импортира в клетката. Нуклеиновата киселина преди всичко се определя от биологическия ефект, който се цели да се постигне в клетката. В случай че се прилага в рамките на генната терапия, от гена?който трябва да се доведе до експресиране, съответно ат генния отрязък, например с оглед да се замести дефектен ген, или от целевата последователност на гена, който ще се инхибира. При транспортираните в клетката нуклеинови киселини може да се касае до ДНК · или РНК· , при което по отношение на нуклеотидната последователност не съществуват никакви ограничения.
Когато изобретението се приложи върху туморни клетки, за да се използва като ваксина срещу рак, то кодира в ДНК въведената клетка предимно за имуномодулираща субстанция, например цитокин като IL - 2, IL - 4, IPN- гама, ΤΝΓ - са . От особена полза могат да са комбинации от ДНК-ни, които кодират за цитокини, например IL- 2 и IPN-гама. Друг ген, който е полезен за въвеждане в туморни клетки, е “ Multi Dru< Resietailce Sene„ ( mdr).B настоящото изобретение c успех са използвани трансферин-полилизин- и ниско плътноейи-липопротеин-конюгати заедно с аденовирус-конюгати за трансфекция на туморни клетки (меланом
- 48 ни клетки). В зависимост от специф”чното приложение може в предварителни опити да се установи, кой лиганд е подходящ за конкретните туморни клетки.
Възможно е също така да се въведат две или повече различни нуклеиново-киселинни последователности в клетката, например плазмид, който съдържа еДНК-ни, кодиращи за два различни протеина, под контрола на подходящи регулаторни последователности, или два различни плазмидни конструкта, съдържащи различни сДНК ·
Към терапевтичноактивните инхибиращи нуклеинови киселини, които се въвеждат в клетката с цел да инхибират специфични гении последователности, се числят генконструкти, от които се транскрибират безсмислена РНК или рибозоми. Освен това е възможно в клетката да се въведат олигонуклеотиди, например безсмислени олигонуклеотиди. Безсмислените олигонуклеотиди обхващат предимно 15 нуклеотида или повече. Олигонуклеотидите могат евентуално да са мултимеризирани. Рибозомите се въвеждат в клетката предимно като част на геннонструкт, който съдържа стабилизиращи генелементи, например t ЕШ-генелементи (тРНК-генелементи). Генконструкти от този тип са описани в ЕР А 0 38? 775. Инхибиращи нуклеинови киселини и тяхните механизми на действие са познати на специалистите от областта; в това отношение могат да се ползват обзорните статии на Helene u Toulme 1990;Takayama и Inouye, 1990, както и там цитираните източници.
Освен молекулите на нуклеинова киселина, която инхибира гени, например вирусни гени, въз основа на тяхната комплементарност, могат да се използват гени с друго инхибиращо действие. Примери за това са гени, които кодират · вирусни протеини,
- 49 тъй наречените трансдоминантни мутации,, . ( Herskowitz, 1987). експресията на гените в клетката дава протеини, доминираццнад съответния див тип протеини и по този начин пазят клетката, която придобива целуларен имунитет, като възпрепятствуват вирусната репликация. Подходящи са трансдоминантни мутации на вирусни протеини, които са необходими за репликацията и експресията, например Gag-, Tat- и Rev -мутанти,за които беше показано, че инхибират HIV-репликацията ( Trono et al., 1.989; Green et al., 1989; Malim et al., 1989).
Друг механизъм за постигане на интрацелуларен имунитет обхваща експресията на РНК-молекули, които съдържат мястото на свързване за жизнено важен вирусен протеин, например за така наречените ’’ TAR Decoys (Sullenger et al., 1990).
Примери за приложимите в рамките иа. соматичната генна терапия гени, които с помощта на настоящото изобретение като съставка на генконструкти могат да се вмъкнат в клетката, са фактор VIII (хемофилия А) , ( виж например Wood et al., 1984), фактор IX (хемофилия В), (виж например Kurachi et al., 1982), аденозиндеаминаза ( SCID)., (виж например Valerio et al., 1984), оч- I антитрипсин (белодробен ефизем), (виж например Ciliberto et al., 1985) или “ Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (Riordan et al., 1989).
Тези примери не представляват никакви ограничения.
По отношение на големината на нуклеиновата киселина могат да се използват нуклеинови киселини с различни големини; с помощта на настоящото изобретение могат да се вкарат в клетката молекули на нуклеинова киселина с големина от около 0.15 кЬ (в случай на съдържащ рибозом ген тРНК ген) до около 50 кЬ и повече; по-малки молекули на нуклеинова киселина могат да се
- 50 използват като олигонуклеотиди.
Очевидно е, че настоящото изобретение не подлежи на никакви ограничения по отношение на генната последователност, както и това,че с помощта на изобретението могат да се транспортират и много големи генконструкти, дава възможност то да има най-широко приложение.
Като се изхожда от нуклеиновата киселина се определя веществото с афинитет към нуклеинова киселина, предимно това е органична поликатйонна субстанция, която осигурява комплексирането на нуклеиновата киселина, като получаващите се комплекси са предимно по същество електронеутрални. Ако комплексите съдържат заедно с ендозомолитния конюгат и конюгат от един интернализиращ фактор и едно вещество с афинитет към нуклеинова киселина, то катионната част на двата конюгата се взима под внимание по отношение на аспекта на електронеутралност.
При разработването на предишни изобретения беше установено, че може да се постигне един оптимум за импорта на нуклеинова киселина в клетката, тогава, когато съотношението конюгата нуклеинова киселина е така подбрано, че комплексите интернализиращ фактор - поликатион/нуклеиново-киселинни комплекси да са в голяма степен електронеутрални. Установено беше, че количеството на приемащата се в клетката нуклеинова киселина не се намалява, когато част от трансферин-поликатион-кошогата се замени с не -ковалентно свързан поликатион. В определени случай това може дори да доведе до значително повишаване на ДНК-прие» ма (Wagner et al.t 1991а)· При това беше наблюдавано, че ДЕК вътре в комплексите се намира в уплътнена форма с тороидна структура е диаметър от 80 - 100 нм. Количеството поликатион •j се подбира с оглед на двата параметри електронеутралност и постигане на компактна структура, при което количеството
- 51 поликатион, което се определя с оглед постигане на електронеутралността от заряда на нуклеиновата киселина, осигурява найобщо и едно компактиране на ДНК.
Евентуално, съгласно друго изпълнение на изобретението комплексите съдържат допълнително вещества, свързващи нуклеиновата киселина в не ковалентно свързана форма, които могат да са еднакви или различни от свързващия фактор, значи от веществото с афинитет към нуклеинова киселина в конюгатите. В случая, че ендозомолитното средство е свободен вирус, комплексите обхващат нуклеинова киселина и интернализиращ фактор-конюгат» В случай, че се използва ендозомолитвн, например вирусен конюгат, то нуклеиновата киселина е комплексирана с този конюгат, евентуално заедно с един конюгат на допълнителен интернализиращ фактор. Лзборът на неИ<овалентно свързано свободно вещество с афинитет към нуклеинова киселина по вид и количество освен това се определя от конюгата, съответно от конюгатите, при което преди всичко трябва да се вземе под внимание съдържащия се в конюгата свързващ фактор: ако свързващият фактор е вещество примерно^което няма или само слабо притежава способността да се кондензира с ДНК, то с оглед на ефициентно интернализиране на комплексите е целесъобразно, такива вещества с афинитет към ДНК да се използват, които притежават тази способност в по-изразена степен. Ако самият свързващ фактор е кондензираща нуклеинова киселина субстанция и чрез него се получава с оглед на ефициентната интернализация достатъчно -.-*·* . нуклеинова, киселина, целесъобразно е, да се използва вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което въз основа на други механизми съдействува за повишаване на експресията.
Съгласно настоящото изобретение, към подходящите не^кова
- 52 лентно свързани вещества с афинитет към нуклеинова киселина се числят съединения със способността да кондензират нуклеинова 1 киселина и/или да я пазят от нежелано разграждане в клетката, особено вече въведените вещества с поликатйонен характер. Друга група подходящи вещества са тези, които чрез свързване към нуклеинова киселина, съдействуват за подобряване на транскрипцията/експресията, като подобряват достъпността на нуклеиновата киселина към експресионния механизъм на клетката. Пример на такова вещество е хромозомниятне-хмстонов-протеин HM&I, за който е установено, че притежава способността да компактира ДНК и да я доведе до експресия в клетката.
При определяне на моларните съотношения на ендозомолитното средство и/или интернализиращ фактор/вещество с афинитет към нуклеинова киселина/нуклеинова киселина или киселини трябва да се вземе под внимание, че се извършва комплексиране на нуклеиновата киселина или на нуклеиновите киселини и че трябва да се обезпечи образуваният комплекс да се свърже с клетката, да навлезе в клетката и било самостоятелно или с помощта на ендозомолитното средство да се освободи от ендозома.
Подбраното съотношение интернализиращ фактор/свързващ фактор/нуклеинова киселина се определя преди всичко от големината на поликатионната молекула,както и от броя и разпределението на положително натоварените групировки, критерии, които са съобразени от големината и структурата на подлежащата на транспортиране нуклеинова киселина или нуклеинови киселини, С предпочитание моларното съотношение възлиза на интернализиращ фактор:вещество с афинитет към нуклеинова киселина от около 10 : I до около I : 10.
След конструирането и синтезата на конюгатите и определяне
- 53 на оптималното за ефициенцията на трансфекцията съотношение на конюгат(и) : ДНК, може с помощта на титрация да се определи количеството на частта интернализиращ фактор-конюгат, която евентуално може да се замени със свободно вещество с афинитет към нуклеинова киселина. В случай,че се използват поликатиони както като свързващ фактор, така и като свободно вещество с афинитет към нуклеинова киселина, поликатионите могат да бъдат еднакви или различни.
При изпълнение на изобретението, при което се прилагат вирусни конюгати, съдествува подходяща методика за определяне на съотношението на съдържащите с в комплексите компоненти, като първо се определи подлежащият за имлортиране в клетката генконструкт и, както е описано по-горе, да се намери вирус или вирусна компонента, които са подходящи за специалната трансфекция. След това вирусът или вирусната компонента се свързва към поликатйона и се комплексира с генконструкта. Като се изхожда от едно определено количество вирусен конюгат^могат да се проведат титрации, като целевите клетки се третират с това (константно) количество к&гат и намаляващи ДЕК-концентрации, или обратно. По този начин се установява оптималното съотношение ДНК : вирусен конюгат. При използването на допълнителен интернализиращ фактор се подхожда примерно така, че като се изхожда от постоянно количество ДНК чрез титруване се определя съотношението между вирусен-конюгат и интернализиращ факторен конюгат.
Комплексите могат да се получат?като се смесят компонентите I) нуклеинова киселина, II) вирусен конюгат, евентуално III) интернализиращ иактор/свързващ фактор-конюгат и евентуално IV) не ковалентно свързано вещество с афинитет към нуклеинова' киселина, които се намират под формата на разредени разтвори.
- 54 В случай,че се използват поликатиони като свързващ иактор и същевременно като свободни поликатиони,най-общо е целесъобразно първоначално да се получи смес от конюгати със свободни поликатиони и тази смес да се съедини с ДНК. При това оптималното съотношение на ДНК към конюгат(и) и поликатиони се определя чрез титриращи опити, т.е, в поредица от трансфекционни експерименти с постояно количество ДНК и повишаващо се количество конюгат(и)/поликатионна смес. Оптималното съотношение от конюгат(и) : поликатиони в сместа моме с помощта на рутинни експерименти д: се получи, съответно чрез сравняване на оптималните съотношения на използваните при титрационните опити смеси.
Получаването на ДНК·-комплекси може да се извърши при физиологични концентрации на сол. Друга възможност е при използването на високфсонцентрации на сол (приблизително 2 ь NaCI) и след това нагласяне на физиологични условия чрез бавно разреждане, съответно диализа.
Най-подходящата последователност при смесване на компонентите нуклеинова киселина, конюгат(и), евентуално не ковалентно свързано свободно вещество с афинитет към нуклеинова киселина се определя чрез предварителни опити. В някои случай може да се окаже · .* целесъобразно, първо нуклеиновата киселина да се комплексира с конюгата и едва след това да се прибави свободното вещество с афинитет към нуклеинова киселина, например поликатйона, примерно в случай на трансферин^етидиумдимер-конюгата и полилизин.
При едно предпочитано изпълнение на изобретението (допълнителния) интернализиращ фактор трансферни и свързващия фактор е един поликатион. Под ’’трансфери?:” трябва да се подразбират както естествените трансферини, както и тези трансферинови мо
- 55 дификации, които се свързват с рецептора и се транспортират в клетката.
Приемането на нуклеиновата киселина става под формата на комплекси, в които са комплексирани интернализиращ фактор-поликатйон-конюгат с нуклеинова киселина. В случай^че се съдържа не ковалентно свързано вещество с афинитет към нуклеинова киселина, предпочита се то да е поликатйон, които е еднакъв или различен от поликатиона,съдържащ се в конюгата.
В случай на комбинирани комплекси, нуклеиновата киселина се интернализира под формата на комплекси, в които гот една страна?интернализиращ фактор-конюгат и?от друга страната комплексирани ендозомолитните с нуклеинова киселина.
Конюгатите интернализиращ фактор-поликатион, които се прилагат заедно със свободния вирус или с вирусните конюгати в комбинираните комплекси, могат да се получат по химичен или, в случай че поликатионзте полипептид- по рекомбинантен начин. По отношение на методите на получаване се има предвид описанието на ЕР 388 758.
Конюгатите могат да се получат също така, като гликопротеин, например тренсферин, и свързващиягфактор се свържат чрез една или повече въглеводородни вериги на гликопротеина. Тези конюгати са за разлика от конюгатите,получени посредством обичайните методи на свързване,свободни от модификации, които произхождат от използваните линкерни субстанции. Тези конюгати в случай на гликопротеини, които притежават само една или малко подходящи за свързване въглеводородни групи, например трансферни, имат и предимството, че са по отношение на мястото им на свързване гликопротеин/свързващ фактор точно дефинирани.
Количеството на използваното ендозомолитно средство, съ
- 56 ответно неговата концентрация,се определя от конкретната предприета трансфекция. Целесъобразно е, да се използва минималното количество вирус, съответно вирусна компонента, от необходимото, за да се гарантира интернализирането на вирус и нуклеиновокиселинния комплекс и освобождаването му от ендозома. Количеството от вирус(конюгат) се определя от дадения клетъчен тип, като се взима под внимание преди всичко инфекциозността на вируса за този клетъчен тип. Друг критерий е дадениятинтернализиращ фактор- свързващ фактор- конюгат, по-специално по отношение на интернализиращия фактор, за който целевата клетка притежава определен брой рецептори. Освен това количеството се определя за вирус(кошогата),от количеството на подлежащата за импортиране ДНК. За стабилна трансфекция, за което е необходимо само малко количество ДНК, най-общо е достатъчно малко количество вирус, докато за една транзитна трансфекция, за което е необходимо по-голямо количество ДНК, използваното количество вирус е по-голямо. За специално приложение, в предварителни опити се определя оптималната концентрация на вирус чрез титриране, като се работи с предвидените целеви клетки, евентуално със смесена клетъчна популация, и с предвидената за трансфекцията векторна система. При това е целесъобразно като ДНК да се използува един генконструкт, който по отношение на големината съвпада в широки граници с предвиденото за конкретното приложение и който с оглед на по-просто измерване на еуициенцията на гентрансфера съдържа един репортерен ген. В рамките на настоящото изобретение беше показана пригодността на луциферазнияи на /Ь -галактозидазния ген като репортерен ген при такива опити.
В друг аспект изобретението се отнася до метод за въвеж
- 57 дане на комплекси от нуклеинова киселина, вещество,свързващо нуклеиновата киселина и евентуално един интернализиращ фактор, в по-висши еукариотни клетки, йетодатсе характеризира с това, че клетките се поставят в контакт със средство, което притежава способността, било самостоятелно или като съставка на нуклеиновокиселинни компелкси, да се поема в клетките и да освободи в цитоплазмата съдържанието на ендозомите, в които нуклеиновокиселинния комплекс се локализира след навлизането в клетката.
Най-общо се предпочита едновременно '.даване на ендозомолитното средство и нуклеиновокиселинния комплекс, но даването може да стане и последователно, като в случай на разделено приложение последователността не е от критично значение, дотолкова7 доколкото даването става непосредствено едно след друго, за да може да се обезпечи по възможност едновременен контакт на клетката с компонентите. В случай,че се използва свободен вирус в по-специална формулировка, може едновременното даване на вирусния препарат и комплексите да се гарантира така, че вирусният препарат да е съставка на трансфекционната среда, която съдържа нуклеиновокиселинпия-комплекс. Когато се дават едновременно със свободния вирус, то нуклеиновокиселинните-комплекси и вирусната формулировка се смесват непосредствено преди употребата.
При едно предпочитано изпълнение на метода съгласно изобретението, ендозомолитното средство се прилага като съставна част на комбинирания-комплекс.
За да се усили генната експресия, могат съставите съгласно изобретението да се приложат и повторно.
При едно предпочитано изпълнение, клетките са първични туморни клетки. При едно особено предпочитано изпълнение нуклеиновата киселина е ДНК, която съдържа една или повече после
- 58 дователности, които кодират за имуномоделираща субстанция, за предпочитане за един цитокин.
При едно друго изпълнение клетките са миобласти, за предпочитане първични миобласти.
II ри друго изпълнение клетките са фибробласти, за предпочитане първични фибробласти.
При друго изпълнение клетките са хепатоцити, за предпочипървични хепатоцити.
ки.
При друго изпълнение клетките са първични ендотелни клетПри друго изпълнение клетките са първични епителни клетки на дихателния път.
при друго изпълнение клетките са
Т-клетки
При друго изпълнение клетките са
В-клетки.
На таблица I е показана успешна трансфекция с помощта на настоящото изобретение примерно при различни клетъчни типове.
Съставът съгласно изобретението беше проверен също така при трансфекция на кучешки-хемофилни В-фибробласти. При тези случай могат да се експримират както луцифераза, така и ^β-галактозидаза. Освен това използвана беше системата да се въведе в тези фибробласти 1.4-кучешки ^актор IX сДНК. Чрез Санвич-ЕЦбА можа фактор IX да се докаже 24 часа след трансфекцията.
В някой случай е целесъобразно, допълнително към ендозомолитното средство да се използва една лизозоматропна субстанция, например, когато ендозомолитното средство е пептиден конюгат или ретровирус, то неговата ендозомолитна активност не зависи стриктно от стойността на pH.
Известно е, че лизозоматропни субстанции задържат активността на протеззите и нуклеазите и с това могат да инхибират
- 59 разграждането на нуклеиновите киселини (Luthmann и Magnusson, 1983). Към тези субстанции се числят хлорохин, монензин, нигерицин и метиламин. Можа да бъде показано, че монензин може да предизвика покачване на репортерната генна експресия в случай на използване на молони вирус. Можа да бъде показано, че присъствието на хлорокин в практически 100 % от К562-клетки води до експресия на репортерен ген, като хлорохинвте въведен в клетките чрез ДНК-трансфер при посредник трансферни. BNL.CL2 или HepG2 -хепатоцити не реагират така добре на хлорофин както К562-клетките, все пак можа да бъде 5 до 10 % трансфицирано, когато се използват ендозомолитните свойства на прибавения реплика ционно дефектен или химически инактивиран аденовирус.
С помощта на настоящето изобретение се усилват предимствата на биологическите вектори. Въз основа на разпределението на рецепторите има тропизъм както аа интернализиращия фактор, така и за вируса. След съгласуване на тези два компонента към съответната клетъчна популация се постига по-висока селективност, която особено се използва преди всичко при прилагане на настоящото изобретение за терапевтични цели. Този аспект има по-специално значение при терапевтичното прилагане на настоящото изобретение при бял дроб, тъй като различните клетъчни популации в белия дроб притежават различни рецептори, което може да изисква конструкции на вектори с висок свързващ афинитет за определена клетъчна популация, например за ресничестите клетки за дихателните пътища. Като лиганди се имат предвид например лектини. Констукцията на такива конюгати изисква между другото потвърждаване на свързващите свойства на даден лиганден-кандидат в конюгат-корфомацията. Това потвърждаване може да се проведе например с антитела срещу лигандите с по
- 60 мощта на имунхистохимични оцветителни методи в тъканите, в които ще се преведе терапевтичното приложение.
В друг аспект настоящото изобретение се отнася до фармацевтични състави, които като активна съставна част съдържат комплекс на терапевтично активна нуклеинова киселина, за предпочитане като част на генконструкт, както и ендозомолитично средство, което евентуално е конюгирано и евентуално интернализиращ фактор-конюгат. Всеки инертен, фармацевтично приемлив носител може да се използва, например разтвор на готварска сол или фосфат буфериран- разтвор на готварска сол или всеки носител, в който ДНК- комплексите притежават подходящи способности за разтваряне, за да бъдат приложени в рамките на настоящото изобретение. Относно методите за формулиране на фармацевтичните препарати се има предвид Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1980.
Настоящото изобретение дава възможност за голяма.гъвкавост при приложението, между другото и като фармацевтични препарати. Съставът съгласно изобретението може като лиофилизат или в подходящ буфер да се съхранява в дълбокозамразено състояние. То може също така като готов за употреба реактив в разтвор, с предпочитание при охлаждане,да се транспортира и лагерува. Необходимите за трансфекцията компоненти, а именно ДНК, ендозомолитно средство, евентуално конюгирано или подготвено за конюгиране с отделен конюгиращ партньор, ДНК-свързващо вещество, евентуално конюгирано с интернализиращ фактор, евентуално свободен поликатйон, в подходящ буфер, разделени или частично разделени като съставки на трансфекционен набор, който също пред** ставлява предмет на настоящото изобретение. Трансфекционният набор се състои от носител, който съдържа едно или повече съд- 51 чета, като тръбички, шишенца или други подобни, които съдържат материалите,необходими при трансфекцията на по-висшите еукариотни клетки съгласно изобретението.
В такъв трансфекционен набор (комплект) може първото съдче да съдържа една или повече различни ДНК' , например кодирани за различни антигени. Втори съд може да съдържа един или повече различни интернализиращ фактор-конюгати, при което използването на трансфекционния комплект може да стане под формата на играта строител. Дали отделните съставки ще са под формата на готови за употреба формулировки или ще са поставени разделени, за да се смесят непосредствено преди употребата, зависи освен от специфичното приложение, но още и от стабилността на комплексите, които могат чрез тестове да се проверят и да се установи стабилността им. При едно предпочитано изпълнение в едно от съдчетата на комплекта се намира трансглутаминазно-свързан аденовирус-полилизин-конюгат, който се е оказал стабилен при лагеруване. При друго предпочитано изпълнение биотинилиран аденовирус и стрептавидин-полилизин са поставени в разделени съдчета и се смесват преди употреба. При използване гъвкавостта на изобретението, един среден специалист може да разработи многобройни различни трансфекционни комплекти.
Терапевтичното приложение на състава съгласно изобретението като фармацевтичен препарат може да се извърши системно, при което се предпочита интравенозниятпът. Целеви органи за тази форма на приложение са например чер дроб, далак, бял дроб, костен мозък, както и тумори. Примери за локално приложение са белодробните тъкани (приложение на състава съгласно изобретението като течност за капково вливане или под формата на аерозол за инхалиране). Заедно с висока специфичност на леганда за диференцираните белодробни клетки може при това да е необ- 62 ходимо, като съпровождаща мярка, различни фактори, които се намират в съседство на белодробната тъкан и които могат да повлияят на гентрансфера, да бъдат позлияни (например парализиране на ресничестите движения, разтваряне на бронхиалния мукус, въвеждане на протеазни инхибитори)» Освен това фармацевтичните препарати съгласно изобретението могат да бъдат приложени чрез директно инжектиране в черния дроб, в мускулната тъкан или в тумор или чрез локално приложение да попаднат в стомашно-чревния тракт. Друг метод на приложение на фармацевтичните състави е през жлъчната система. Този метод на приложение позволява директен достъп към хепатоцитните мембрани на жлъчните каналчета, при което се избягва обменното действие на състава със съставките на кръвта»
Напоследък беше показана възможността, миобласти (незряли мускулни клетки) да се използват,за да се въведат гени в мускулните снопчета на мишки. Тъй като беше показано за миобластите, че сецернират генпродукта в кръвта, този метод може да намери по-широко приложение от третирането на генетични дефекти на мускулни клетки, като например при дефекти във връзка с мускулна дистрофия. При това могат да се използват манипулирани миобласти^които да дадат генпродукти, които или въздействат в кръвта, или се транспортират от кръвта. Опитите от настоящото изобретение показаха, че както миобластни- така и миотубни-култури, дори примерни, могат да се трансфеигират с висока ефициентност. Трансфекционните среди, които дават най-добри резултати, съдържат комбинирани-комплекси от биотинилиран аденовирус, трансферин-полилизин и стрептавидин-полилизин. Освен репортерните гении продукти луцифераза и β-галактозидаза, в мускулните клетки се експримира и фактор VIII. Освен това беше приложен: и
- 63 птичи зденовирус СЕК) в комбинирани комплекси, съдържацаглутинин от пшеничени кълнове като допълнителен интернализиращ фактор.
Терапевтичното третиране може да се извърши също така и ех ♦ при което обработените клетки, например клетки от костен мозък, хепатоцити или миобласти,се връщат отново в тялото, примерно Ponder et al., 1991, Dhawan et al., 1991. Друго ▼iva приложение на настоящото изобретение се отнася до така наречената ваксина ср^щу рак. Принципът на този лечебен способ се състои в това, туморни клетки от даден пациент да се изолират и клетките да се трансфицират с ДНК, кодирана за един цитокин. В последващ етап клетките евентуално се инактивират, например чрез облъчване/! тс така, че повече да не се умножават, но все още да експримярат цитокина. След това, генетично променените клетки се прилагат като ваксина на пациента,от когото са взети. В околността на мястото на ваксиниране сеценираните цитокини активират имунната система, между другото,като активират цитотоксичните Т-клетки. Тези активирани клетки могат да проявят действието си в други части на тялото и нападат и нетретирани туморни клетки. По този начин се намалява рискът от туморни рецидиви и образуване на метастази. Предписание за приложението на ракови ваксини за генната терапия е описано от Rosenberg et al.., 1992. Вместо предложените от Розенверг ретровирусни вектори, може да се използва генната трансферна система на настоящото изобретение. При опити съгласно настоящото изобретение успешно се трансфицират меланоини клетки с репортерен ген, който се съдържа в комбинирани-комплекси от полилизин-свързан аденовирус и трансферин-полилизин илив1Д1» - полилизин.
- 64 Настоящото изобретение може да се използва също така в опити за определяне на имунния отговор на даден антиген. Антигенспецифични цитстоксични Т-лимфацити (CTL), които убиват заразени клетки, играят важна роля при защитата срещу вирусни инфекции или тумори чрез хазаина. Обменното действие между Т-клетки и антигенпредставляващи клетки (АРС) се ограничава от
HIA ( Human Lymphocytic Antigens » МНС, Major Histocompatibility
Molecules). За да се установи умъртвяването на клетки, които екйримират антиген, чрез CTL в in vitro ”CTL Killing
Assay” трябва антигенггда представи ctl в правилен HIA контекст, което обикновено означава на автоложната целева клетка. UCTL Killing Assay” може де се проведе,както следва: АРС се трансфицират с един ДНК-конструкт, който съдържа последователност, кодирана за антиген. Антигенни епитопи се свързват към МНС клас I молекули и на клетъчната повърхност представляват като цел за специфичен СТЪ- отговор. След инкубиране с про· ба от серум на пациента в зависимост от наличието на специфични CTL се лизират АРС. Лизирането на клетките може например да се измери чрез проследяване освобождаването на радиоактивен хром, който е прибавен в АРС преди прибавянето на серума. Установени предписания ( Walker et. al., 1989) използват b-lcl (В-лимфобластоидни клетъчни линии), които чрез трансфекция с ре· комбинантни ваксинни вируси се индуцират за експресиране на антигенни гени. При това обаче умират клетките, които около един ден са ефициентно експримирали антигена, поради литичното действие на ваксината. Тези затруднения могат да се преодолеят с помощта на ” CTL Killing Assays , използвани от гентрансферната система на настоящето изобретение, за да въведат в клетката за антиген кодиращи ДНК. нзпример,за да въведат във
- 65 фибробластите конструкти, кодиращи за HIV- или туморни антигени, за да могат те да експримират антиген. Примерни фибробласти могат лесно да се получат от биопсии, лесно се отглеждат и с помощта на настоящото изобретение се оказаха особено ефициентно трансфицируеми (около 50 до около 70 %). Тези опити са полезни,за да могат, с оглед разработването на ваксини, да се идентифицират епитопи, които се разпознават от убиващите клетки, Освен това те могат с предимство да се приложат за определяне на HIA - ограничения» имунен отговор на даден човек към даден антиген.
Въз основа на голямото количество, което с помощта на настоящото изобретение транспортираните гени в практически всички клетки се експримират, изобретението може да се използва за произвеждане на рекомбинантни протеини. И в този случай няма или малко има само(ограничения по отношение на последователността, съответно по отношение на големината на подлежащата за трансфериране ДНК, освен това съществува широк спектър клетъчни типове, които са трансфицируеми със състава от изобретението. От тук, почти всеки клетъчен тип може да се използва за получаването на рекомбинантни протеини, който гарантира, че рекомбинантният протеин ще бъде произведен в близка до природната и напълно модифицирана посттранслационно преработена форма, която осигурява високата биологическа активност на продукта.
Гентрансферетв клетките може да се постигне, както беше въз основа на луцифераза и на 1РМ-о< в предишните опити показано, като може да се транспортира всеки генконструкт, който води до създаването на желан протеинов продукт. Желаният протеинов продукт може 24 часа до една седмица или по-дълго след трансфекцията да се получи от клетъчната култура (или от клетъчния оста
- 66 тък или от подходящ клетъчен хомогенизат, съгласно предписанието за дадения протеинов продукт).
Използването на генната трансферна система съгласно настоящото изобретение за получаване на рекомбинантни протеини има следните предимства:
1) Поради високата трансфекционна ефициенция (повече от % на трансфицираните клетки|ногат да експримират гена в голями количества) не е необходима предварителна селекция на трансфицирани клетки; освен това не е необходимо да се установяват стабилни клетъчни линии. Клетъчна култура в малък мащаб може да е достатъчна, за да се получат използваеми количества протеин.
2) ьЮгат да се транспортират голями гекконструкти; могат кЬ успешно да се транспортират.
3) Генната експресия може да се осъществи в клетки, които осигуряват съответното след-транслационално процесиране и модифициране (например витамин К-зависещи карбоксллирания на фактори на съсирването, виж Armentano et. al·, 1990, или клетъчно специфично гликозилиране.
4) Чрез системата от изобретението има по-голям избор на целеви клетки, които могат да се използват за генекспресия.
Преглед на фигурите:
Фиг. I. Въздействие на адетовирусната инфекция върху гентрансфера чрез трансферин-полилизин-конюгат ;
Фиг. 2. Конюгат-ДНК-ко^плекс-ефект на дозата ;
фиг. 3; Усилване на трансферин-полилизин- гентрансфера чрез аденовируси;осъществен през рецептор^посредничещ на ендоцитоза:
A) въдействие върху комплексирана ДНК ;
B) въздействие върху свързана с рецептор ДНК ;
С) въздействие върху гентрансфера чрез трансферинполилизин-конюгати) да. 4. Въздействие на аденовирусна инфекция върху гентрансфера посредством трансферин-полилизин-конюгати в подбрани клетъчни линии)
Фиг. 5. Изследвания дали усилването на генната експресия се дължи на ниво на генния транспорт или на трансактивиране;
Фиг. 6. тетра-галактозен пептид-полилизин-кошогат ;
Фиг. 7. трансфекция на Нер02-клетки с pESVL-ДНК-комплекси в присъствие на аденовирус;
Фиг. 8. Трансфекция на Нер&2-клетки с рСМУХгДНК-комплекси в присъствие на аденовирус ;
Фиг. 9. Трансфекция на TIB73 с рСШПл-ДНК-комплекси:
A) Сравнителни стойности с хлорохин ;
B) В присъствие на аденовирус;
Фит. 10. Импортира не на рСЬ1У1?-ДШ{ в Т-клетки в присъствие на аденовирус:
A) Н9-клетки ;
B) първични лимфоцити
Фиг. II. УВ-инактивиране на аденовируси:
A) усилване на гентрансферния-ефект в HeLa-клетки чрез УВ-инактивирани вируси ;
B) сравняване на УВ-инактивиране с гентрансферния ефект ;
Фиг. 12. Инактивиране на аденовируси чрез формалдехид;
Фиг. 13. Трансфекция на ТИНЗТЗ-клетки чрез трансферин-полилизин-ДНК-комплекси в присъствие на Молони-вирус;
Фиг. 14. Изследвания дали гентрансферния-ефект при трансфек- 68 ция на ШНЗТЗ-клетки с трансферин-полилизин-ДНКкомплекси се дължи на молони-вирус
Фиг. 15. Обменни действия между трансферни и неговия рецептор играят роля при гентрансферния ефект на йалони-вируса ♦
Фиг. 16. Влияние на pH-стойността върху гентрансфера на рет_<. _ с : ровируси ’
Фиг. 17. Инфлуенца-хемагглутинин-пептид; изследване за пропускливост на липозомите ;
Фиг» 18. Трансфекция на К562-клетки с трансферин-полилизинконюгати в присъствие на инфлуенцапептид-полилизинконюгат;
Фиг. 19. Трансфекция на НеХа-клетки с трансферин-полилизинконюгати в присъствие на инфлуенцапептид-полилизинконюгат \
Фиг. 20. На място доказване на уЗ-галактозидазна експресия след трансфекция на Hela-клетки с трансферин-полилизин-рСмУ-уЗ -jaI-ДНК в присъствие на аденовирус;
Фиг. 21. На място β -галактозидазна експресия в HeLa-клетки в присъствието на аденовирус ·
Фиг. 22. Трансфекция на клеткисс 48 кЬ козмид в присъствие на аденовирус!
A) Hela-клетки;
B) неуробластомни клетки ;
Фиг.23. Получаване на аденовирус-полилизин чрез химическо свързване у
Фиг. 24. Трансфекция на К562-клетки с химически свързан аденовирус-конюгат ;
Фиг. 25. Трансфекция на HeLa-клетки с химически свързан аденовирус-конюгат J
- 69 Фиг. 26. Свързване на полилизин към аденовирус чрез трансглутаминаза·
Фиг, 27. Трансфекция на миши-хепатоцити чрез трансглутаминазасвързан аденовирус-полилизин-конюгат;
Фиг. 28. Усилване на трансфекционната ефициенция чрез трансглутаминаза-свързан аденовирус-полилизин-конюгат в сравнение с несвързан вирус ;
Фиг. 29. Трансфекция на HeLa-клетки с биотин-стрептавидинсвързан аденовирус-конюгат ;
Фиг, 30. Трансфекция на 2562-клетки с биотин-стрептавидинсвързан аденовирус-конюгат;
Фиг, 31. Трансфекция на невробластомни клетки с един 48 кЬ ксзмид посредством биотин-стрептавидин-свързан аденовирус-конюгат j
Фиг. 32. Трансфекция на хепатоцитл в присъствие на хлорохин или на аденовирус '
Фиг. 33. Трансфекция на К562-клет?:и в присъствие на различни ендозомолитни срадства;
Фиг. 34. Сравняване на трансфекционните протоколи на клетъчно ниво с β> -галактозидаза като репортерен ген в присъствието на различни ендозомолитни средства;
Фиг. 35. Дългосрочна-луциферазна експресия при кснфлуентни, не-пцелящи се хепатоцити;
Фиг. 36. Експресия в Hele-клетки, трансфицирани в присъствие на свободен и чрез биотин-стрептавидин към полилизин свързан СЕ10-вирус ·,
Фиг. 37. Трансфекция на миобласти и миотуби в присъствие на свободен и чрез биотин-стрептавидин към полилизин свързан аденовирус ,
- 70 Фиг. 38. Трансфекция на първични миобластни- и миотубяи култури j
Фиг. 39. Сравняване на аденовирус dI3I2 и CEIO-вирус при трансфекция на Hela-клетки и С2С12-миобласти;
Фиг. 40; Подобряване на трансфекцията с CEID-вирус чрез използване на лектин-лиганд;
Фиг. 41. Експресиране на фактор VIII сДНК в С2С12-миобластни и миотубни-култури;
Фиг. 42. Усилване на ДНК-транспорта чрез аденовирус-протеини:
А) Hela-клетки )
8) Фибробласти
Фиг. 43. Галактоза-инфлуенцапептид-кошогат за ДНК транспорт в хепатоцити^
Фит. 44. Галактоза-аденовирус-конюгат за ДНК транспорт в хепатоцити;
Фиг. 45. Гентрансфер в В-лимфобластоидни В-клетки
Фиг. 46; ДНК-трансфер с трансферин-полилизин в присъствие на риновирус
A) свободен риновирус '
B) конюгиран риновирусJ
Фиг. 47; Трансфекция на първични хуманни меланомни клетки с комбинирани-комплекси,съдържащи трансферин- и аденовирусни-конюгати»
Фиг. 48. Трансфекция но първични хуманни мелановни клетки с комбинирани-комплекси,съдържащи 1Д1 - и аденовирусконюгати)
Фиг. 49. Гентрансфер в епителни клетки на дихателни пътища при п»хове науживо;
Фиг. 50. Изпитания за пропускливост на липозоми с амфипа- 71 тични пептиди)
Фиг. 51. Изпитания за пропускливост на еритроцити с амфипатични пептидиФиг. 52. Трансфекция на BNLCL.2 клетки в присъствие на амфипатични пептиди;
Фиг. 53. Трансфекция на ЖНЗТ-клетки в присъствие на амфипатични пептиди;
фиг. 54. Експресия на 1РМ-с( в Hela-клетки, трансфицирани в присъствие на различни ендозомолитни средства,
В следващите примери, които илюстрират настоящето изобретение, ако не е казано друго, са използвани следните материали и методи:
Получаване на трансферин-полилизин/ДНК-комплекси.
а) Човешки трансферин-полилизин-конюгат
Използва се методнгописан от Вагнер и съавтори 19916, при който свързването на полилизин се извършва към страничните въглеводородни вериги на трансферина.
Разтвор от 280 мг (3.5 мкмола) човешки трансферин (свободен от желязо, Сигма) в 6 мл 30 ш.; натриев ацетатен буфер, pH 5, се охлажда до 0° С и се прибавя: 750 мкл 30 мМ натриев ацетатен буфер pH 5, съдържащ II мг (51 мкмола) натриев перйодат. Сместа се оставя да престои в ледена баня в продължение на 90 минути на тъмно. За отстраняване на нискомолекулните продукти се провежда гелно филтруване (Сефадекс G· - 25, Фармация), при което се получава разтвор със съдържание на около 250 мг окислен трансферин (измерване чрез нинхидринов тест). (За да се докаже окислената форма, която съдържа алдехиди и при оцвет тяване с анасонов алдехид дава цветна реакция, пробите се на-72 капват върху силикагелна-тънкослойна плочка, сушат се и плочките се потапят в р-анизол алдехид/сярна киселина/етанол (I/I/I8), сушат се и се нагряват). Модифицираният трансферин-разтвор бързо се прибавя (в разстояние на 10 до 15 минути) към разтвор, който съдържа 1.5 мкмола флуоресцентно маркиран поли(Х)лизин със средна дължина на веригата от 190 лизинови мономера в 4.5 мл 100 Μίνΐ натриев ацетат pH 5. Стойността на pH на разтвора се прави на 7.5 чрез прибавяне на I м натриев карбонатен буфер. Към сместа, в интервали от по един час се прибавят 4 порции от по 28.5 мг (450 мкмола) натриев цманоборохидрид. След 17 часа се прибавят 2 мл 5 У натриев хлорид, за да се направи разтворят с обща концентрация от около 0.75 м. Реакционната смес се нанася върху катйонообменна колона (Фармация моно > НЕ 10/10) и със солев градиент от 0.75 м до 2.5 М натриев хлорид с постояно съдържание от 25 мЕ НЕ2Е$ pH 7.3 се фракционира. Високата концентрация на сол при зареждане на колоната и със започване на градиента е съществено за получаването на поликатион-конюгатите. малко трансферни (около 30 %) заедно със слаба флуорисцентна активност елуират при протичането; главното количество флуоресцентно маркиран конюгат елуира при концентрация на солта между 1.35 М и 1.9 М и се събира в три фракции. Тези фракции дават (по реда на тяхното елуиране) след двукратна диализа срещу 2 л 25 мМ НЕРЕ5 pH 7.3 една фракция A (TfpU90A) със съдържание 45 мг (0.56 мкмола) трансферни, модифициран с 366 нмола полилизин, една фракция В (Т^рЦ90В ) със съдържание 72 мг (0.90 мкмола) трансферни, модифициран с 55? нмола полилизин, и една фракция
С ( ьдържаща 7 мг (85 нмола) трансферни, модифициран с 225 нмола полилизин. Транс*ериновите-конюгати, ако не се използват незабавно, се охлаждат шоково в течен азот при -20° С
- 73 и се съхраняват в свободна от желязо форма. Преди вграждането на желязо проби (0.5 до I мг) се довеждат с натриев хлорид до физиологична концентрация на солта (150 мм). Вграждането на желязото се извършва чрез прибавяне на 4 мкл 10 мМ желязо (III) цитратен буфер (съдържащ 200 мм цитрат, чрез прибавяне на натриев бикарбонат се наглася на pH 7.8) за мг трансфериново съдържание. Съдържащите желязо конюгати се получават в малки количество преди използването им за образуване на ДНК-комплекси, охлаждат се шоково в течен азот или в сух лед/етанол и се съхраняват при -20° С. (Тази мерка се оказа целесъобразна, след като се показа, че многократно размразяване и замразяване води до разваляне на конюгатите).
б) Еиши-трансферин-полилизин-конюгат
Работи се аналогично по метода,даден за човешки трансферни, като свързването става през въглехидратните странични вериги. От 4.1 мг (51 нмола) миши трансферни и 2.1 мг (34 нмола) р!290 се получават конюгати от 15.5 нмола миши трансферни и 13 нмола pL290.
Плазмид-ДНК
a) pE5rL- ДНК мкг от ДНК-плазмида pE^VI. (съдържащ Photinus pyralis луциферазния ген под контролата на Rous Sarcoma virus LTR Enhancer/Promoters (Uchida et al., 1977, De Wet et al., 1987), получен чрез тритон X лизния стандартен метод ( Maniatis), последвано от Csd/EtBr равновеснопльтностен-градиентно-центрофугиране, обезцветяване с бутанол-± и диализа срещу 10 мЕ трис/HCI pH 7.5, I мЕ ЕДТА) в 350 мкл HBS (150 мм KaCI, 20 мш HEPES pH 7.3) се смесват 30 минути преди прибавяне към клетките с 12 мкг трансферин-полилизин-конюгат в 150 мкл HBS.
- 74 б) pCkiV-ДНК
Пл8змид5гpCi-.1V се получава, като BamHl -мнсерта на плазмида PSTCX556 (Beverne et al., 19.88) се отстранява, плазмидзтсе третира с Klenoww -фрагмент и HindiII/Sspt, както и Klenow -третирания фрагмент от плазмцда pRSVL, който съдържа за луцифераза кодиращата последователност, съответно за β -галактозидаза ( Macgregor и Caskey, 1989) се прибавя. Образуването на комплекса се извършва анологично на pasvL.
Получаване на вирус-препарати
а) Аденовирусни препарати
Използва се описания от Jones и Shenk, 1979 аденовирусен щам dI3I2, който показва делеция в EIa-региона. Размножаването на вируса се провежда в Е1а-транс-комплементираща клетъчна линия 293, при което получаването се извършва голямсклащабно , както е описано от Davidson и Hassell, 1987. Пречистеният вирус се съхранява в съхраняващ буфер (100 мм Трие, pH 8.0, 100 Miu 1ЧаС1, 0.1 %BSA, 50 % глицерин) или в HBS/4O % глицерин в аликвотни части при -70° С. Определянето на вирионкенцентрацията се провежда чрез УВ-спектрофотометричен анализ на екстрахиран геномичен вирус-ДНК ( Formel: една оптична плътностна единица (ОД, Α^θ) отговаря на 10 с вирусни частички/мл; (Chardonnet u Dales, 1970))·
б) Ретровирусни препарати
Moloney-мишилевкемичния-ретровирус N2 се опакова в една екотропична отаковъчна линия ( Keller et al., 1985, Annentano et al.,1987).Остатъци от вирус експримиращи клетъчни линии се събират, шоково се замразяват в течен азот и се съхраняват при -20° С. Остатъците, които се използват в примерите, имат ти- 75 r тър от около 10 of и /мл, който се измерва посредством неомицин-резистентни- колониини образувания с ГПНЗТЗ - клетки. За експериментите с вирусна концентрация остатъците се изпращат под налягане на азот през 300 кЬ мембранен филтър ( PILTROH) в AMICOH - разбъркваща клетка-концентратор.Нормално при това 10 - 30 мл остатък може да се концентрира десетократно.
Клетки и среди
Hela - клетки се отглеждат в ДДЕЬ1 - среда, допълнена с % топлинно инактивиран зародишен телешки серум ( pcs), пеницилин до 100 I.E./мл, стрептомицин до 100 мкг/мл и 2 мК глутамин. WI-38, MRC-5 и КВ - клетки се култивират в LhviEbl среда ( Eagle’s modified essential medium), допълнена c 10 % топлинно инактивиран PCS, антибиотици като ДДОД - среда 10 мш не^жизненоважни аминокиселини и 2 м& глутамин. cpti, една респираторна цистична фиброзна епителна клетъчна линия (създадена по описания от Yanka ska s et al., 1991, метод; CPTI -клетъчната линия се характеризира с това, че е хомоциготна за A F5O8 - делецията СР - мутацията) се отглужда в PI27Х-среда ( Willumsen et al., 1939). За гентрансферните опити, клетките се култивират в 6 ом клетъчни културални платки, докато са около 50 % конфлуентни (5 х 10^ клетки). Средата се отстранява и се прибавя I мл ДмПм- или ЕмЕМ/2 % PCS среда. След това се прибавят конюгат-ДНК-комплексите, непосредствено след това аденовирус 41312 (0.05 - 3.2 х частички/клетка) и сравним обем от вирусен,-лагеруващ буфер (1-80 мкл). Платките се поставят обратно за един час в инкубационен шкаф (5 % С02, 37° С), след това се прибавя 3 Ш1 комялетна среда. След нови 24 часа инкубиране клетките се реколтират, за да се определи луциферазната генна експресия. В случай на CPTI
- 76 клетки, клетките преди гентрансферните експерименти се отглеждат 4 часа в Р12-7Х-среда без човешки трансферин.
Следните клетъчни линии се набавят от АТСС, достъпни под дадените каталожни номера:
Hela-клетки: CCL2, К562-клетки: CCL243, Нерв2 - клетки: НВ 8065. TIB - 73 - клетки: TIB 73 (BKLCL.2), NIH3T3 клетки: CELI658, 293 - клетки: CELI573, КВ- клетки: CCLI7, VVI - 38 - клетки: CCL75, МЕС - 5 - клетки: CCLI7I.
Н9 - клетки: получават се ОТ AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S· Department of Health and Human Services, каталожен № 87.
Първични лимфоцити се получават като проба от 25 мл кръв от пъпна връв се постави в пробна тръбичка,съдържаща ЕДТЕ. Аликвотни части се подслояват с 4.5 мл ?icoil-hypaque (Фармация) и в продължение на 15 минути се центрофугират при 2500 об/мин. Кафеникавият слой между горния плазмен слой и бистрия фиколен слой се отделя (около 10 мл). Прибавят се 40 мл 1МДМ плюс 10 % FQ5, пробата се центрофугира 15 минути при 1200 об/ мин и клетъчния пелет се поставя в 50 мл пресен 1мДК плюс 10 % PC5 (плътността на клетките възлиза на около 2 х Юб клетки в мл). Аликвот от 25С мкл фитохемагглутин (РНА Р, Дифко) се прибавя, културата се инкубира при 37° С и 5 % СО^ в продължение на 48 часа, след което се прибавя рекомбинантен IL- 2 (ВМВ) (концентрация: 20 единици/мл). След това клетките се разделят с 1мДк:/20 % РС5, 2 единици/мл IL - 2 1:3. Аликвотни части от клетките се замразяват в течен азот в РС5 плюс 5 % диметилсулфоксид. Преди употреба клетките се култивират в ВДЖ плюс 20 % PCS плюс 2 единици/мл IL- 2.
За изследване на свързването на последователностите Kela
- 77 клетки се еквилибрират при 4° С в I мл ДЬЖ, допълнена с 2 % PCS . Както при другите опити се прибавят конюгат-ДНК-комплексите и платките се инкубират 2 часа при 4° С. След това платките се промиват изобилно с ледено студена Дш1ш/2 % PCS, като след това : от тази среда се прибавят 2 мл. Отгоре се наслоява аденовирус dI3I2, съответно вирусен буфер, клетките се затоплят бавно,преди да се поставят нови 24 часа в инкубационен шкаф. След инкубирането клетките се реколтлрат и се изследват за луциферазна-генекспресия.
Луциферазни изпитания
Получаването на клетъчни екстракти, стандартизирането на протеиновото съдържание, както и определянето на луциферазната активност се провежда,както е описано от zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, съответно както е описано в
ЕР 388 758.
ПРИмЕР I.
Определяне действието при третиране с аденовирус върху гентрансфера чрез трансферин-полилизинконюгати
Първоначално се изследва действието на повишаваща се вирус-дозировка върху способността на определено количество конюгат-ДНК-комплекс да постигне гентрансфер. За това се смесват б мкг от плазмида pEbVLc 12 мкг чззешки трзнсферин-полилизинконюгат (КТ-[рП90В),за да се образува комплекс. Към HeLaклетките се прибавят конюгат-ДНК-комплекс плюс различни количества от аденовируса ott3I2 (0.05 - 3.2 х 10^ вирусни частички в клетка). Резултатзгот този анализ е даден на фигура I. Луциферазната активност е изразена в светлинни единици за 50 мкг общ клетъчен протеин. Според този анализ се получаваме пови
- 78 шаващи се количества прибавен вирус водят до усилване на гентрансфера. На фигурата са дадени средните стойности от 2 - 4 отделно проведени експеримента; стълбчетата показват стандартните отклонения.
IIEILEP 2.
Конюгат-ДНК-комплекс - ефект от дозата
Логаритмични разреждания на конюгат-ДНК- комплексите, получени.както е описано в пример I, се прибавят към НеХа-клетки, а именно с или без прибавяне на константна доза аденовирус 01312 (1 х ΙΟ2*· вирусни частички/клетка). Луциферазната активност се определя^както е посочено в пример 1. Резултатите са дадени във фигура 2.
ПРИи1ЕР 3/
Усилване на генстнасфера,осъществен чрез трансферин-полилизин чрез аденовируси^реализиран прев рецептор- като посредник на ендоцитозата,
а) Въздействие при третиране с аденовирус върху трансфера на комплексирана ДНК.
За трансфекцията се използват следните компоненти.
б мкг pEbVL - ДНК без тренсферин-полилизин-конюгат (ДНК);
б мкг pE0VL.- ДНК плюс 6 мкг нвл-конюгиран полилизин270 (ДНК + pi); 6 мкг pESVL - ДНК плюс 12 мкг от използваните в предишния пример трансферин-полилизин-конюгати (ДНК + hT-fpHSOB). Тези трансфекционни материали се прибавят към НеХа - клетките с или без аденовирус dl3l2 (o(I3I2) (I х 1сЛ вирусни частички/клетка). Получаването на клетъчните екстракти, стандартизирането съгласно общия протеин и определянето на луциферазната активност се извършва,както в предишните опити. Резултататот преведените опити е даден във фигура ЗА.
- 79 б) Въздействие на гентрансфера на рецептор-свързана ДНК при третиране с аденовирус,
Конюгат-ДНК-комплекси (ДНК + ИТ^рЦ90В) или полилизинДНК-комплекси (ДНК + pl} се свързват към Hela - клетки, без да се интернализират, като се инкубират при 4° С. Несвързани комплекси преди прибавянето се отстраняват с аденовирус ΛΙ3Ι2 (I х ΙΟ2*· вирусни частички/клетка) или със сравнимо количество буферен обем. Последващата инкубация се провежда при 37° С, за да се даде възможност за интернализиране на свързаните ДНКкомплекси и аденовирусите. Определянето на луциферазната активизвършва ,както е дадено (фигура ЗВ).
Действие на аденовирусното третиране върху гентрансфера чрез трансферин-полилизин-конюгати, Конюгат-ДНК-комплекси, съдържащи 6 мкг рЕ VI - ДНК мкг трансферни - полилизин (ДНК + И1^рП90В);се прибавят при концентрация от I х 10^ аденовирусни частички (di312)/клетка или сравнимо количество топлинноинактивирани аденовируси dl3I2 (dI3I2 h.l .) към Hela - клетките. Инактивирането чрез топлина се извършва чрез 30-минутно инкубиране при 45° С ( Defer et. al., 1990),.
ΠΡΙΙΚ-ίΕΡ 4,
Въздействието на третиране с аденовирус върху гентрансфер чрез трансферин-полилизин-конюгати при подбрани кленост се
с) плюс 12 тъчни линии.
Конюгат-ДНК-комплекси (6 мкг pESVL + 12 мкг ИТ^рИ90В) се прибавят към клетки от клетъчните линии 0?Т1, KB, Hela, WI38 и МЕС5 с или без аденовирус oISIZ (I х ΙΟ2*· вирусни частички/клетка. Ефициентността на гентрансфера за различните клетъчни линии се определя;както в предходните примери чрез
- 80 луциферазни изпитания (фиг. 4). ПРдНЕР 5,
Усилването на луциферазната-генекспресия функционира на ниво на ген-транспорта, а не на трансактивиране, Създадена е луцифераза конститутивно експримираща целева линия с означението К562 10/6, като клетки се трансфицират с плазмид, който съдържа един rsv -луциферазен-генфрагмент (един Apal/Pvul -фрагмент от pRSVL (De Wet et al., 1987)), клонкран в CIaI-мястото на pUCju. - локуса ( Collins et al., 1990). Този плазмид се комплексира с един трансферин-полилизин-конюгат и К562-клетките се трансфицират с този комплекс, при което се подхожда по описания от Cotten et al·, 1990 метод. Тъй като рис/ц - локус - плазмид^гсъдържа един неомицин-резистентен ген, може въз основа на неомицин-резистенцията да се селекционират клони експримиращи върху луцифераза. За по-следващите опити се подбра клон с означението К562 10/6.
Аликвотни части от паренталната клетъчно линия К562 (в 200 мкл ЕРм1 1640 плюс 2 % FC3 ; 500.000 клетки/проба) се третират или с 12 мнг TfpL плюс 6 мкг pRSVD или с 4 мкг рЬ90 плюс 6 мкг pRSVL, всеки път в 500 мкл HBS . Дадените количества аденовирус oiI3I2 (фиг. 5) се оставят 1.5 часа при 37° С да въздействат върху клетките, след което се прибавя 2 мл ЕРм1 и 10 % PCS. След това инкубирането при 37° С продължава нови 24 часа,след което клетките се подготвят за определяне активността на луциферазата. Намерено беше, че инкубацията с аденовирус допринася определено за увеличаване активността на луциферазата (фиг. 5А). Това важи както за TfpL - комплексите, (200 светлинни единици срещу 25 000 светлинни единици), така и за р!90 - комплексите (0 срещу 1.9 х 10 светлинни единици).
- 61 От тука произлиза, че К562 - клетъчната линия показва способността да интернализира pESVL/полилизин - комплекси и че това интернализиране, измерено чрез луциферазната - експресия, значително се повишава в присъствието на аденовирус.
Аналогични опити се провеждат с EsVL- луцийераза - ген конститутивно експримиращи К 562 10/6 - клетки, при което се прибавят подобни количества от аденовирус СЦ312. Аликвотни части от 500000 клетки (в 200 мкл ЕРгЛ плюс 2 % PCS ) се инкубират с посочените във фигура 5В количества аденовирус 61312 в продължение на 1.5 часа при 37° С. След това, както при паренталннта клетъчна линия се прибавя EPMI плюс 10 % PCS , инкубирането продължава още 24 часа и се определя луциферазната активност. Както се вижда от фигура 5В, третирането с аденовирус на тези клетки не дава доказуеми промени в луциферазната активност; контролните стойности са в същите граници^както тези за пробите, третирани с вирус.
ПРШиЕР 6«
Трансфекция на чернодробни клетки с азиалофетуин - полилизин - конюгати (APpL) съответно с тетра - галактозенпептпд - pL - конюгати ((^al)4pl) в присъствието на аденовирус .
а) Получаване на лактозилиран пептид.
3.5 мг (1.92 мкмола) от разклонения пептид lys -(Nt lys) Lys-Gly-Ser-Gly-Sly-fier-Gly-Gly-Ser-Gly-Ply-Cys , получен по йпос - метода при използването на Applied Biasyatem 431А >eptid - синтезатор, съдържащ дитиопиридинова група за Cys , се третират с разтвор на 7.85 мг лактоза в 40 мкл 10 mL воден разтвор на натриев ацетат pH 5 при 37° С. Към раз твсра се прибавят 4 порции по 0.6 мг (10 мкмола) натриев цианоборохидрид в интервали от по около 10 часа. След общо 64 часа при 37° С се прибавят 0.5 мл НЕРЕ5 рЕ 7.3 и 15 ми? дитиотреитол (ДТТ). След фракциониране чрез гелно филтруване (Сефадекс G-10, 12 х 130 мм, елуенти: 20 mL натриев хлорид) в среда на аргон се получава 3.6 мл разтвор на лактолизиран пептид в свободна меркаптоформа (1.73 мкмола, съгласно теста на Елман; 84 % добив). Пробите от модифициран пептид показват цветна реакция с анасонов алдехид, но не дават цветна реакция с нинхидрин; това съвпада с схващането, че всички 4^райни аминогрупи са лактозирани. Тетра - галактозния пептид - полилизин - кошогатгге показан на фигура 6.
б) Получаване на 3-дитиопиридинпропионат-модифициран полилизин,
Към гел-филтриран разтвор от 0.60 мкмола поли-Ъ-лизин с средна дължина на веригата от 290 лизинови мономера (р!290, хидробромид, Сигма) в 1.2 мл 100 мК НЕРЕб pH 7.9 се прибавят при интензивно смесване 400 мкл от 15 мм етанолов разтвор на «5РДР (6.0 мкмола). След един час се прибавят 500 мкл I м натриев ацетат pH 5; след гелно филтруване (Сефадекс 025) с 100 ммола натриев ацетат към разтвора се прибавят 0.56 мкмола р1290 с 5.77 мкмола дитиопиридин - линкер.
с) Конюгиране на пептида с полилизин.
Конюгати се получават^като се смесят 1.5 мкмола от получения в а) лактозилиран пептид в 3 мл 20 Mia натриев хлорид с 0.146 мкмола от получения в б) модифициран р!290 в 620 мкл 100 мм натриев ацетатен буфер в атмосфера на аргон. След прибавяне на 100 мкл 2 Li HEPES pH 7.9 реакционната смес се оставя при стайна температура в продължение на 18 часа. Чрез прибавяне на
- 83 натриев хлорид концентрацията на сол се довежда до 0.66 м и конюгатите се изолират чрез катоионнообменнз хроматография (Фармация KioHO b колона НЕ 5/5; градиентно елуиране, буфер А: 50 idi НЕРЕ5 pH 7.3; буфер В: буфер А плюс 3 bi натриев хлорид).
Фракциите от продукта елуират при концентрация на сол от около
1.2 Li - 1.8 Li и се събират в 2 конюгатни фракции; конюгатните фракции се означават с (gal)4pll и (cjaI)4pL2. При диализиране срещу 25 мЬ1 HEPES pH 7.3 дава конюгатните фракции (jal)4pl*[, съдържаща 24 нмола модифициран р1290 и (jal)4pl2, съдържаща
24.5 нмола модифициран р1290.
д) Получаване на азиалофетуин - конюгати.
Конюгатите се получават по същия принцип, както трансферин-конюгатите; подобен метод за получаване на азиолоорозомукоид-полилизин-кошогати е описан от Wu u Wu, 1988.
Свързването на азиалофетуин към полилизин се осъществява през дисулфидни мостове след модифициране с би^ункционалния реактив 5РДР (Фармация). Разтвор на 100 мг (2.2 мкмола) азиалофетуин (Сигма) в 2 мл 100 мМ НЕРЕ5 pH 7.9 се подлага на гелно филтруване върху Сефадекс G-25-колона. От така получените 4 мл разтвор 330 мкл се прибавят при енергично смесване към 15 мм етанолен разтвор на 5РДР (5.0 мкмола). След един час при стайна температура се пречиства чрез повторно гелно филтруване (Сефадекс G-25); получава се 5 мл разтвор на 1.4 мкмола азиалофетуин, модифициран с 2.25 мкмола дитиопиридин линкер.
Конюгати се получават,като 1.4 мкмола модифициран азиалофетуин в 5 мл 100 мБ Н2РЕ5 pH 7.9 се смеси с 0.33 мкмола модифициран рИ90 (съдържащ 1.07 мкмола меркаптопропионатни групи; при това се подхожда точно както при получаването на транс ферин - конюгатите) в 6.5 мл 200 ь-Ш ΗΕΡΕύ pH 7.6 в атмосфера
- 84 на аргон. Реакционната смес се оставя да престои 24 часа при стайна температура. Конюгатите се изолират от реакционната смес чрез катионобменна хроматография (Фармация Моно Уколона HE 10/10; градиентно елуиране, буфер А: 50 мМ HEPES pH 7.9; буфер В: буфер А плюс 3 М натриев хлорид) #като преди зареждането на колоната се прибавя натриев хлорид до крайна концентрация от 0.6 Ь1. Фракцията от продукта елуира при концентрация на сол от около 1.5 М. Диализа срещу НВ$ дава конюгати, съдържащи 0.52 мкмола азиалофетуин, модифициран с 0.24 мкмола рН90.
е) Трансфекция на Нер&2-клетки с pESVL - ДНК комплекси.
НерО-2 - клетки се култивират в ДМЕМ - среда плюс 10 %
PCs 100 I.E./мл пеницилин, 1и0 мкг-мл стрептомицин и 2 мМ глутамин в Т25 -фишета. Трансфекцията се провежда при плътност от 400.000 клетки/шише. Преди трансфекцията клетките се промиват с 4 мл прясна среда, съдържаща 10 % PCS. Непосредствено преди трансфекцията се прибавя хлорохин (Сигма), така че край ната концентрация в клетъчната суспензия възлиза на 100 мкм (плюс ДНК - разтвора).
мкг pE$VL- ДНК в 330 мкл НВ5 се смесват с посочените във фигура 7 количества от ΊψρΙ.190 - конюгат (A-fpI), полилизин 290 (р!) или тетра-галактоза-пептид-полилизин-конюгат (cjaI)4pL в 170 мкл НВб . В сравнителните експерименти се прибавят след минути 240 мкг азиалофетуин (Ца1)4р1. + (о^а!)4). Сместа се прибавя към клетките; клетките се инкубират в продължение на 4 часа при 37° С. След това трансфекционната среда се заменя с мл прясна ДМЕМ - среда плюс 10 % ?С$ . След 24 часа луцифераз ните клетки се реколтират за луциферазното изпитание. Посочени- 85 те на фигура 7 стойности показват общата луциферазна активност на трансфицираните клетки. Както се вижда от фигурата, pL-и
ват, както се очаква, стойностите.
Р Трансфекция на HepG2 - клетки с pCLVL - ДНК комплекси.
НерОклетки се култивират в 6 см платки до плътност на клетките от 300.000 клетки/платка, както е дадено в е). Преди трансфекцията клетките се промиват с I мл пресна среда, съдържаща 2 % РС$.
мкг pCMVL- ДНК в НВ5 се смесват с дадените на фигура 8
мкл НВ£> След 30 минути към всеки ДНК-конюгат-комплекс се прибавя I мл ДкЕИ, съдържаща 2 % РС5 и 50 мкл аденовирус - разтвор от вида dI3I2. В сравнителните експерименти, както е показано,
клетките; клетките се инкубират в продължение на 2 часа при 37 °C,след което ое прибавя 1.5 мл среда,съдържаща 10 % РС5 . След 24 часа клетките се реколтират,за да се проведе луциферазният тест. Стойностите на фигура 8 показват общия луциферазен активитет на трансфицираните клетки. pLys 290 показва ефект,
4рЬ показва по-силен ефект; прибавяне на (оа1)4, който конкури ра за азиалогликопротеиновия рецептор, редуцира стойностите до стойностите,получени от полилизин.
- 86 о) Трансфекция на ΤΙΒ73 - клетки с pCLVL - ДНК комплекси
Клетки от ембрионална мишка - чернодробна клетъчна линия АТСС TIB73 ( BNL CL.2; Patek et al,, 1978). се култивират при 37° С в 5 % СОг - атмосфера в high glucose Д1Ж (0.4 % глюкоза), допълнена с 10 % топлинно инактивиран РС$, съдържащ 100 I.E./мл пеницилин, 100 мкг/мл стрептомицин и 2 Μίύ глутамин, в 6-см -ови платки.
Трансфекцията се провежда при плътност на клетките 300.000 клетки/платка. Преди трансфекцията клетките се промиват с I мл прясна среда плюс 2 % FC5.
мкг pCLVL - ДНК в 300 мкл НВ5 се смесват с дадените количества миши трансферни - полилизин290 - кснюгат ( mTfpL), Азиалофетуин-рЪ-конюгат (AFpL), полилизин 290 (pLys29O), (gal)4pI1 или (gal)4pL2 в 170 мкл НВ5. След 30 минути към всеки ДНК- конюгат-комплекс се прибавя I мл ДмЕм, съдържаща 2 % ?С5 и 50 мкл аденовирус - разтвор ат щама о(1312. Сместа се прибавя към клетките, клетките се инкубират при 37° С в продължение на 2 часа и след това се прибавя1 1.5 мл среда, съдържаща 10 % FCS · След 2 часа трансфекционната среда се заменя с мл прясна среда. След 24 часа се събират за луциферазното изпитание ,κοτο показаните на Фигура 9А стойности представляват общата луциферазност активност на трансфицираните клетки.
За сравнение трансфекцията се провежда без аденовирус в присъствие на хлорохин. Трансфекциите се провеждат при плътност на клетките 300.000 клетки/платка. креди трансфекцията клетките се промиват с I мл прясна среда, съдържаща 2 % ГС^. Непосредствено преди трансфекцията се прибавя хлорохин (Сигма), така че крайната концентрация в клетъчната суспензия (плюс ДНК
- 87 разтвора) възлиза на 100 мкМ. б мкг pCLVL-ДНК в 530 мкл НВ5 се смесват с дадените количества xnT|pL, A$pL, ply$290, (^al) 4рП или (<jal)4pl2 в 170 мкл HBS . След 30 минути се прибавят към клетките ДНК- комплексите. Клетките се инкубират в продължение на два часа при 37° С и след това се прибавя среда, съдържаща 10 % ГС5 и 100 мкМ хлорохин. Два часа по-късно трансфекцисниата среда се заменя с 4 мл прясна среда. След 24 часа клетките се събират,за Αθ се определи луциферззата им. Получените за луцийеразна активност стойности са дадени на фигура 9 В.
ПРЮР 7.
Въвеждане на ДНК в Т - клетки ,
а) Получаване на антиСД7-полилизин190-конюгат .
Към разтвор на 1.3 мг антиСД?-антитяло (Лмунотех) в 50 Mid HEPES pH 7.9 се прибавят 49 мкл Ιμϊ.ϊ етанолен разтвор на 6РДР (Фармация).(След I час при стайна температура! След I час при стайна температура се филтрува през гелколона Сефадекс G-25 (елуент 50 НЕРЕ5 - буфер pH 7.9)?при което се получава1 Ι.Ι9 мг (7.5 нмола) анти СД7, модифициран с 33 нмола пиридилдитиопропионатни остатъци. Поли(Ь)лизин19О. флуоресцентна маркировка чрез PITC, се модифицира аналогично с 5РДР и чрез третиране с дитиотреитол и последващо гелно филтруване се получава модифицирана със свободни меркаптогрупи форма.
Разтвор от 11 нмола пслилизин190, модифициран с 35 нмола меркаптогрупи, в 0.2 мл 30 ιώί натриев ацетатен буфер се смесва при отсъствие на кислород с модифициран антиСД7 (в 0.5 мл 300 мм ΗΞΡΕ5 pH 7.9) и се оставя в продължение на една нощ при стайна температура. Чрез прибавяне на 5 1а натриев хлорид. реакционната смес се довежда до съдържание на приблизително
О.б И. Изолирането на конюгатите се извършва чрез йоннообменна хроматография (Echo 5, Фармация, 50 Mid ΗΕΡΕό pH 7.3, солеви градиент О.б М до 3 Е натриев хлорид); след диализа срещу 10 мЕ НЕРЕЗ pH 7.3 се получават съответните конюгати, състоящи се от 0.51 мг (3.2 нмола) антиСД7-антитела, модифицирани с 6.2 нмола полилизин190.
б) Получаване на jpl20 - полилизин 190 - конюгати.
Свързването се извършва по познати от литературата методи чрез тиоетерно - свързване след модифициране с 6-малеимидокапронова киселина-Н-хидроксисукцинимидов естер (ЕМСЗ, Сигма) ( Fujiwara et al., 1981).
Тиоетер-свързан qpI20 - полилизин 190 - конюгат:
Към разтвор на 2 мг рекомбинантен ^р120 н 0.45 мл 100 мМ HEPES pH 7.9 се прибавят 17 мкл 10 мМ разтвор на ЕшСб в диметилформамид. След I час при стайна температура се филтрува през гелна колона Сефадекс 0-25 (елуент 100 м! HEPES -буфер 7.9). Към разтвора на продукта (1.2 ил) веднага,при отсъствие на кислород,се прибавя разтвор на 9.3 нмола полилизин 190, *
Флуоресцентно маркиран и модифициран с 30 нмола меркаптогрупи (в 90 мкл 30 мЕ натриев ацетат 5.0) и се оставя една нощ при стайна температура. Реакционната смес чрез прибавяне на 5 м натриев хлорид се довехсда до съдържание на около 0.6 м. Изолираното на конюгата става чрез йонообменна хроматография (моно 5 , Фармация) 50 мм НЕРЕЗ ρΗ 7.3, солеви градиент 0.6 iw до 3 м натриев хлорид). След фракциониране и диализа срещу 25 НЕРЕЗ pH 7.3 се получават три Фракции от конюгати А, В и С, състоящи се от 0.40 мг rgpl2O кодифициран с 1.9 нмола полилизин 190 (при фракция А), съответно с 0.25 мг rgp 120 модифициран с 2.5 нмола полилизин 190 (фракция В), съответно 0.1 мг rgp
- 89 120 модифициран с 1.6 нмола полилизин 190 (фракция С).
pCi.iVL - ДНК (6 мкг/проба) се комплексират с дадените количества полилизинЗО или с давеното количество полилизин - конюгат в 500 мкл HBS. междувременно бяха получени алквотни части от Н9-клетки (10^ клетки в 5 мл EPkil с 2 % РС£) или първични човешки лимфоцити (3 х 10 -клетки в Iscore’e модифицирана среда на Dulbecco: (IMDM) плюс 2 % FCS). Полилизин-ДНК-комплексите се прибавят към всяка клетъчна проба. Пет минути след tobs се прибавя посоченото количество аденовирус 61312. Клетките си инкубират при 37° С 1,5 часа, след това към всяка проба се прибавят 15 мл ЕРЬП (в случай на Н9 - клетки) или НДК (при първични лимфоцити) плюс 20 % РС5. Клетките се култивират при 37° С в продължение на 24 часа, събират се и се изследват за определяне на луциферазната активност?както и при другите примери. Резултатягот проведените опити е даден на фигура I0A (Н9клетки), съответно на фигура 10 В (първични лимсоцити): При Н9 клетки показва антиСД7-конюгата (фигура 10А, колонки 7 - 9) и gpI20 - конюгата (колонки 10 - 12) най-добрите резултати по отношение на постигнатия с аденовирус гентрансфер, като при това ^р120 - конюгата постига ясна експресия на луциферазен-ген дори при отсъствие на аденовирус. Забележително е, че при проведените опити само gpI20 - конюгатате в състояние, да въведе ДНК в първични лимфоцити, и това само в присъствието на дефектен аденовирус (фиг. I0B, колонки 7 и 8).
ПРДК1ЕР 8.
йнактивиране на аденовируси,
а) УВ - инактивиране
Аденовирусен dI3I2 - препарат, получен и съхраняван жакто е описано във въведението к$м примерите, се поставя в 2 см вдлъб- 90 натини на платка за клетъчни култури (300 мкл/вдлъбнатина) върху лед на разстояние 8 см от две УВ - лампи (Филипс ТУВ15). Вирусът се облъчва с ултравиолетова светлина за времето^посочено на фигура ПАл аликвотни части от всеки препарат се изследват по отношение на вируститъра^както и по отношение на способността дали и в каква степен са в състояние да усилват гентрансфера с полилизин-трансферин-конюгати в НеХа - клетки.
Отглеждането на клетките и трансфекцията се извършва главно;кактс е дадено по-горе7в клетки и среди; използваните за трансфекцията компоненти се виждат от сфигура IIA. Комплексите от pCMVL - ДНК и 12 мкг T-fpI се получават в 500 мкл НВ& и се прибавят 3 х 10^ Hela - клетки (в I мл ДМЕМ плюс 2 % РС$).
След около 5 минути се прибавят по 54 мкл от всеки вирусен препарат към всяка култура и културата се инкубира при 37° С един и половина до два часа. След това се прибавят по 5м§ликвотни части ДЬщЛл плюс 10 % FC5 към всяка култура, инкубирането при 37° С продължава още 24 часа, културите се събират и се изследват за луциферазна активност. Количеството от 54 мкл необлъчен вирус не е в обхвата на насищането, това ще рече,че тестзте чувствителен към поне три пъти по-голямо количество от вируса. Получените стойности за луциферазната експресия са дадени на фигура ПВ (затворени квадрати).
Вирусният титър на всеки препарат се определя при използване на EIA комплементираща клетъчна линия 293. Първоначално се приготовляват серийни разреждания на необлъчените и облъчени вирусни проби в ДШ1 плюс 2 % FC&. Паралелно с това се подготвят и проби от 5 х Ю2*· 293-клетки (във вдлъбнатина от 2 см) и се поставят в 200 мкл Д1&ЕМ плюс 2 % РС5. Аликвотни 5 мкл проби от всяко разреждане се поставят за сравнение във втора
- 91 вдлъбнатина. За да се осъществи свързването на вируса към клетките,се култивира час и половина при 37° С, след това във всяка вдлъбнатина се поставят по 2 мл Д1Ж плюс 10 % ГС5. След 48 часа културите се броят, за да се установи цитопатичниятефект. Онова разреждане, над тези,които показват по-малко от 50 % от клетките на културата след 48 часа ясен цитопатичен ефект, показва относителното количество инфекциозни вируси във всеки от вирусните препарати. Получените стойности са дадени на фигура ИВ (отворени квадрати). Резултатзтот проведените в този пример опити показва, че при ултравиолетовото облъчване,докато вируститързгсе намалява с около 4 десетипотенцйи: , то при луциферазния - гентрансфер има само 20-кратна редукция. Това показва,че механизмите, които са меродавни за инфекциозността на вируса, могат да бъдат разрушени, без при това да се повлияе на способността на вируса да усилва гентрапсиера.
Наблюдава се, че при по-ниски вирусни дозировки, много малко се намалява усилването на гентрасфера чрез вируса (Вж. фигура ПА, колонки 3 - б) и че този ефект се проявява по-ясно при високите дози (колонки 7-10).
б) йнактивиране на аденовируса с формалдехид мл аденовирусен препарат се пропуска през 10 мл 025 колона (Фармация РД 10 &, 25 Μ), предварително еквилибрирана с 150 ьШ натриев хлорид, 25 мМ НЕРЕ5 pH 7.9, 10 % глицерин, и се събира обем от 2.5 мл. Аликвотни части от получения вирусен препарат се инкубират върху лед без (0), с 0.01 % или I % форналдехид в продължение на 20 часа. Върху пробите се поставя трие pH 7.4 до концентрация от 100 мм, след това пробите се диализират първо в продължение на 2 часа срещу 1 л 150 мм натриев хлорид, 50 Mil трие pH 7.4 и 50 % глицерин х накрая, след престояване една нощ, срещу 2 х I Λ 150 мм натриев хлорид, 20 мм НЕРЕ5 pH 7,9 и 50 % глицерин.
Аликвотни части от вируса след това се изследват върху 293 - клетки за титъра ИМ (CPE -Plaque - Assay, Precious и Russel, 1985). След това се определя действието на третираните с формалдехид вируси върху гентрансфера в НеЬа - клетки (300 000),както в предишните опити, като се измерва луциферазната активност. 90 мкл от вирусния препарат предизвиква ДНК трансфер, който отговаря на повече от 10с светлинни единици. Третирането на вируса с 0.01 % или с 0,1 % формалдехид дава само малко понижаване на генстрансферната активност (около 10кратно намаляване при 0.1 %). При все че при третиране с I % формалдехид води до очевидна загуба на генстрансферната активност, все пак 90 мкл от вируса могат да предизвикат генна експресия^, отговаряща на ΙΟ2* светлинни единици.
При третиране с 0.1 % формалдехид вируснияттитър намалява на IO^ppu (Plaque forming units), което обаче е свързано с намаляване на луциферазната активност само с около 10 %. Резултататот проведените опити е посочен на фигура 12А.
с) йнактивиране на аденовирус с вълговълнов УВ/8метоксипсорален,
Аликвотни части от пречистения вирусен препарат се довеждат до концентрация от 0.33 мкг/мл 8-метоксипсорзлен (изходна концентрация 33 мкг/мл 8-метоксипсорален,разтворен в диметчлсулфоксид),и се поставя върху лед на разстояние 4 см от лампения филтър на 365 нм УВ - светлинен източник ( UVP модел TL33). Времетраенето на облъчването е от 15 до 30 минути, както се вижда от фигура I2B. Вирусните проби след това се прекарват през Сефадекс G-25 колона (Фармация, РД-10) еквилибрирана с HBS
- 93 + 40 % глицерини се съхранява при г70° С. Вирусните препарати се изследват,от една страна.,за способността им да усилват чрез pCMVL/hT-fpl - комплекси гентрансфера в Hela - клетки (отразено дясна като светлинни единици, ос на фигура 12 В) , от друга страна-за способността им в 293 - клетки да реплицират (вирусен титър, лява ос във фигура I2B).
ПРИЬдЕР 9,
Трансфекция на NIH3T3 - клетки с kioloney - вирус.
В този и в следващите примери, които показват усилването на интернализирането на трансферин-полилизин-ДНК - комплекси чрез ретровируси, се използват, ако не е казано друго, следните материали и методики:
Трансферин-полилизин190-конюгати и конюгат-ДНК - комплекси се получават аналогично на предишните примери, с тази разлика, че реакцията за образуване на комплекси се провежда в обем от 500 мкл натриев хлорид, 20 HEPEb, pH 7.4.
NIH3T3 - клетките се култивират в ДМЕм - среда с прибавка на 10 %ГС5, ЮО I.E./мл пеницилин, 100 мкг/мл стрептомицин и 2 мм глутамин. За трансфекцията 5 - 7 х 10^ клетки за Т25 шише се нанасят на плочка 18 до 24 часа преди трансфекцията. Непосредствено преди трансфекцията клетките се поставят в прясна среда и различните използвани при трансфекцията компоненти се прибавят в следния ред:
хлорохин (100 мкМ, там,където е дадено), полилизин-трансферин-ДНК - комплекс, ретровирусен препарат. След това клетките се инкубират в продължение на 4 часа при 37° С, следва смяна на средата и клетките се събират след 24 часа. Получават се екстракти, при които се прилагат три замразяващи/разтопяващи цикъла. Аликвотни части от екстракта, стандартизирани по отно
- 94 щение нз съдържанието на протеин, се изследват за луциферазна активност, както е дадено за предишните примери.
При посочените условия се провеждат трансфекции на 10 ШНЗТЗ - клетки с Tfpl - ДНК -комплекси в присъствие или в отсъствие на хлорохин, както е показано на фигура 13. Установява се, че без хлорохин стойностите за луциферазна активност постигат само нивото на фона (колонка ’), докато в присъствие на хлорохин, можа да се измери висока експресия на pE$VI репортерния ген (колонка 2). Повишаващи се количества на LioLoney-левкемичния-вирус, които се прибавят към клетките едновременно с ДНК - комплексите, могат да предизвикат покачващо се увеличаване на луциферазната генка експресия.
([количествата посочени на фигура 13 са мл)» ПРШЙЕР 10.
Изследвания, дали покачването на гентрансфера се дължи на ретровируса
Използваният в пример 9 вирусен препарат представлява суров, нефракциониран остатък от ре трсвирус-експримиращи клетки. За да се получи потвърждение и доказателство на това, че увеличаването на ДНК - импортгг, получен с този вирусен препарат, се дължи действително на вируса, остатъквгсе подлага на по-горе описаните диализа/концентрационно пречистване, при което ретровирусниятостатък (даден във фигурата като EV5) се концентрира около фактор 10. Ако ретровирусът е отговорен за усилването, то остатъкат в мембраната трябва да има активност (независимо от евентуално инактивиране на крайно лабилния ретровирус в етапа на концентрирането, приблизително десетократен на изходния s' остатък. Както в предходния пример 10° NIH3T3 - клетки се трансфицират при посочените във фигура 14 условия» От фигура 14
- 95 се вижда, че в остатъкъгот мембраната има гентрансЛер-усилващ ефект (използвани са 20 - 600 мкл, колонки 3 - б). Освен това се вижда, че 200 и 600 мкл на десетократно концентрирания препарат са приблизително на половина активни, колкото 2 или 6 мл на изходния, неконцентриран ретровирусен препарат (колонки 7 и 8).
Паралелно на това се проведоха опити с човешки К562 клетки, които не показват рецептори за екотропния миши-ретровирус. Както се и очаква, не се постигна усилване на генната експресия.
ПРЖшР II.
При гентрансиерния ефект на мо!опеу-вирус играят роля обменните действия между трансферни и неговия рецетор,
За да се изключи възможността, трансферът на комплексите в клетките да се дължи на неспецифично свързване на полилизин към ретровируса и за да се доизясни входящиятмеханизъм, ретривирус се изследва относно способността му да вмъкне плазмид -ДНК в клетката, която е комплексирана само с полилизин. Количеството на използвания полилизин отговаря на по-рано установеното количество-оптимум, което предизвиква напълно кондензиране на плазмид * ДНК и е подобно на количеството полилизин, което се прилага с полилизин-трансшерин-конюгата ( Wagner et ele, 199ta>. Опитите, чиито резултати са дадени на фигура 15, показват, че репортерниягген при отсъствие на хлорохин не се експримира нито под форма на . TfpL-pRSVL комплекси,нито под форма на pL-pRSVL - комплекси (колонки I и 2). За разлика от това, в присъствие на ретровируса, приложената като TfpL - комплекс репортер-ДНК експримира, не обаче под формата на pL - ДНК - комплекс (сравни колонки 3 и 4 с колонки и 6). Освен това, проведените опити показват, че присъствието на излишен свободен трансферни способства за намаляване на улеснения чрез ретровируса ДНК - импорт (колонки 7 и 8). И тези резултати потвърждават представата, че обменни действия между трансферни и неговия рецептор играят съществена роля за усилване на приема на ДНК, осъществен чрез ретровируса.
ПРИК1ЕР 12.
Влияние на pH-стойността върху гентранс^ерния ефект на ретровируси,
Проведените в този пример опити имат за цел да изследват влиянието на рН-стсйюстта върху способността на ретрсвирусите да усилват гентрансфера. Трансфекционните опити се провеждат, както в предишните примери. За да се установи, дали ниска стойност на pH е от съществено значение за гентрансферния ефект, използват се двата добре характеризирани инхибитора на ендозомалното понижаване на pH стойността монензин и амониев хлорид. Като изходна точка служи разсъждението, че тези две вещества тогава ще повлияят иа гентрансфера, когато .· ретровирусвгза гентрансферния,-ефект се нуждае от по-ниска pH-стойност на ендозома. Ако обаче се използват други механизми за този ефект, а именно директна фузия върху повърхността на цитоплазмата, подобно както при HIV - входящия механизъм, то тогава тези вещества или няма да имат негативен ефект, дори евентуално да имат усилващ ефект, ако променят пътя на ρι» - ДНК - комплексите. Експерименталните резултати, които са дадени на фигура 16, подкрепят по-скоро последната хипотеза. Изследвано бе въздействието на двете вещества върху Т^рЬ - ДНК -трансфера и се намери, че никое от двете вещества не може да замени функционално хлорохин. Същевременно се установява незначително повишаване на луци
- 97 феразната-генна експресия при по-високи кинцентрации на амониев хлорид (колонки 1-5). Самостоятелно ретровирусзгпоказва наблюдаваното и в предишните примери леко усилване на ДНК - транспорта (колонка б). Наблюдава се силно усилване, когато ретровирусатсе прилага в присъствие на I мкм мснезин (колонка 7). жалко по-малко силен ефект се наблюдава при по-висока концентрация на монензин (колонка 8), както и в присъствие на амониев хлорид (колонки 9 и 10).
ПРЛЬЕР 13,
Усилване на постигнатия чрез трансферин-конюгат гентрансфер посредством П-крайния ендозомолитен пептид на инфлуенца-хемагглутина НА2, а) Синтез на пептида
Пептидатна последователността (SEQ ID N0:1). Gly-Leu-PheGlu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-MetIle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cya се получава с помощта на (флуоренилметоксикарбонил)-метода (Atherton et al., 1979}, чрез синтеза, при което се използва Applied Biosystems 431А Peptidsynthesizer. Защитните групи на страничните вериги са терц. бутил за Cys, Glu и Asp и тритил за Asn. След реакцията на свързване се провежда нинхидринов тест, който показва градус на свързване,повече от 98 % за всеки етап. Започвайки с А-19,се провеждат двойни свързвания. N-крайната Мое - група се отстранява от част от пептидната смола с помощта на 20 % пиперидин в KLP (N-метилпиролидон. След това мое-защитените и незащитени фракции се промиват с ДСж (дихлорметан) и се сушат при висок вакуум. Добивите възлизат на 293.6 мг свободна от
Мое пептидна смола, съответно 366.5 мг Мое-защитена пептидна смола. III.I мг от Ртос-свободната пептидна смола в продъл
- 98 жение на 1.5 часа се подлага на разцепване с трифлуороцетна киселина,при което се използва смес от 10 мл ТГА, 0.75 г фенол, 300 мкл ЕДТ (етандитиол), 250 мкл етилметилсулфид и 500 мкл вода. Пептидвтсе отделя от смолата чрез филтруване върху стъклен нучфилтър. Смолата се промива с дихлорметан и промивния разтвор се прибавя към филтрата. Филтратът се концентрира до около 2 мл и след това на капки се прибавя към 40 мл етер при бъркане. Утайката от пептида се центрофугира и етерният слой се изхвърля. Утайката се промива три пъти с по 40 мл етер и се суши под висок вакуум. Получените 58 мг суров продукт се разтварят в 3.5 мл 20 мК1 NH^HCO^, съдържащ 300 мкл 25 % амонлк/л. Разтворът се пропуска през Се^адекс 0-25 колона (Фармация РД-10) при използване на същия буфер за гелнс филтруване. Целият материал се нанася върху Моно-Q, - колона (Фармация 100 х 14) (градиент: 0-10 мин 100 % А, 10 - 100 мин 0 - 100 % В. А: 20 мм НН^НСО^ + 300 мкл НН^/л. В:А + 3 м натриев хлорид. Измервания при 280 мм, Тгр-флуоресцентно доказване при 354 нм. Скорост нз протичане I мл/мин). Продуктът се елуира с 1 П натриев хлорид. Главната фракция на моно Gl-колоната се пречиства по-нататък чрез реверсивна фазова високоефективна течна хроматография при използване на BiORAD-Hi-Pore RP-3O4 - колона (250 х 10 мл) (градиент: 50 - 100 % буфер В в Ϊ2.5 мин, 12.5 - 25 мин 100 % В. А: 20 мМ NH^HCO^ + 300 мкл МН^/л, В: А в 98 % метанол. Скорост на протичане: 3 мл/мин. измервания при 237 нм). Продуктът елуира при 100 % В. Фракцията с продукта се концентрира върху speedrac, разтваря се отново в буфер А и накрая се лиофилизира. Добивът възлиза на 8.4 мг на HPLC- пречистения продукт в цистеинзащитената форма (пептидзт е означен с PI6 ). За да се получи пептид^т в,свободна меркаптоформа, терц.-бутил защитената субстанция се третира в продължение на 30 минути при стайна температура с тиоанизол/етандитиол/трифлуороцетна киселина/трифлуорметансулфонова киселина (2/1/40/3; трифлуорметансулфоновата киселина се прибавя след другите компоненти в посоченото съотношение). Пептидът се утаява с етер, провежда се гелно филтруване (Сефадекс 6- -25) с горепосочения буфер А в атмосфера на аргон и така се изолира.
б) Свързване на инфлуензапептида с полилизин.
б I) директно свързване през СРДР (сукцинимидилпиридилдитиопроппонат)
19.8 мг полилизин(рЬ)300 - хидробромид (Сигма) се гелно филтруват върху Сефадекс 0--25 колона (Фармация рД-10) в натриев ацетат pH 5, за да се отстранят нискомолекулните фракции. Въз основа на нинхидриновия тест, рЪ - концентрацията след гелното филтруване възлиза на 3.16 мг/мл. pH стойността на разтвора си наглася на 7 - 8 с помощта на I wl натриева основа. Към
2.5 мл на pL - разтвора (7.9 мг рЪ = 0.13 мкмсла) се прибавят 0.64 мкмола СРДР (Фармация: 40 м.2 разтвор в абсолютен етанол). Това отговаря на молно съотношение на СРДР : pL от 5 : I. Сместа се оставя през нощта да 'реагира и гелно се филтрува в 20 mi,; HH^HCO^ pH 8.2 върху 6-25 колона. След редуциране на аликвотна част от филтрата с ДТТ (дитиотреитол), измерването на тиопиридон показва, че реакцията е протекла цялостно. 0.3 мкмола pl-СРДР (по отношение на мкмол СРДР) в 2.212 мл се оставят да реагират в тиолната форма с 0.35 мкмола пептвд. Получената при смесването на пептида с pL бяла утайка се разтваря при прибавянето на 2 М гуанидинхидрохлорид, при което реакцията протича при престояване една нощ. Фотометрични измервания на тиопири
- 100 - дон в реакционната смес отново потвърждават цялостното протичане на реакцията. След това сместа се диализира два пъти срещу 2 л 20 мм HEPES/0.5 ivl гуапидинхидрохлорид. Полученият разтвор се нанася върху .«оно S-колона (0.7 х 6 см, ^армация) (градиент: 0 - 2U мин ΐοϋ / А, 20 - 140 мин 0 - 100/1 В. А: 20 мМ НЕРЕ6 pH 7.3/0.5 Б гуапидинхидрохлорид, В: 20 мМ ΗώΡΕ^ ?П 7.3/3 ш гуанидинхидрохлорид, 0.3 мл/мин. Доказване при 280 нм и флуорисцентно доказване при 354 нм, активиране при 280 нм). фракцията от продукта, която се елуира с 1.5 м гуапидинхидрохлорид, се диализира срещу 2 х 2 л НВ£. Последващото определяне чрез нинхидриновия тест на pL - концентрацията показва концентрация от около 1.14 мг/мл. Пептидното количество в разтвора на конюгата се изчислява от абсорбцията му при 280 нм; получените резултати говорят за моларно съотношение на пептид : pL от 4:1.
б 2) Свързване през полиетиленгликол-линкер
14.6 мг pL 300 хидробромид (Сигма) се гелно филтруват, както е описано пои б I). Въз основа на нинхидриновия тест pL - концентрацията след гелното филтруване възлиза на 4.93 мг/мл. pH стойността на разтвора се наглася на 7 - 8 с помощта на I М натриева основа. Към 2.7 мл рЪ - разтвор (13.3 мг pL = 0.22 мкмола) се прибавят 4.33 мкмола СРДР (Фармация) 30 мм разтвор в абсолютен етанол). Това отговаря на молно съотношение от СРДР: pL от 20 : 1. След 1.5 часа реакционната смес се гелно филтрува върху Сефадекс & - 25-колона в 0.1 м натриев ацетат/3 м гуанидинхидрохлорид. След редуциране на аликвотна част с ДТТ, се провежда определение на тиопиридон, при което се установи съдържание на 3.62 мкмола СРДР в фракцията на продукта. СРДР-модифицирания рЮ се редуцира чрез прибавяне на 79 мг ДТТ в разтвора. След 2 часа редуциране разтворът отново се гелно филтруΙΟΙ ва върху 025 при посочените по-рано условия. Тиолното определение чрез Елман - теста показва тиолна концентрация от 3.15 мкмола в 2.224 мл.
17.62 мг = 5 мкмола РОЕ (полиоксиетилен-бис(б-аминохексил), Сигма) се разтварят в 500 мкл 20 мМ КаНСО^/З М гуанидинхидрохлорид pH 7-8 и се оставят да реагират с 13.8 мг ЕМС$ (8,-малеимидокапронова киселина-М-хидроксисукцинимидов естер) (Сигма) (= 44.7 мкмола), разтворени в 300 мкл ДМР (диметилформамид). След 30 минути разтворът се гелно филтрува върху G- - 25 (20 мМ натриев бикарбонат/3 М гуанидинхидрохлорид). Фотометричното определяне на малеимидо - групата при 300 нм показва концентрация от 6.36 мкмола^реагирал ЕМС5 в 2 мл разтвор.
Към 1.049 мл от този разтвор (отговаря на 3.34 мкмола EMCS) при интензивно размесване на Вортекс на капки в поток от аргон ее прибавят 1.39 мкмола от пептида в тиолна форма (в 2.5 мл 20 мМ натриев бикарбонат/3 М гуанидинхидрохлорид). 15 минути по-късно, с теста на Елман вече не могат да се докажат свободни тиолни групи.
Разтворът на редуцирания СРДР-модифициран pL чрез прибавяне на I М натриева основа се докарва до pH 7 - 8. 1.373 мл от този разтвор при интензивно разбъркване с помощта на Вортекс се прибавя към горната реакционна смес. При това моларното съотношение на пептид->Н:Р0Е-ЕМС5:рЪ-6Н е 1:2.4:1.4 (по отношение на ЕМС$, съответно зН). След ^реагиране в продължение на 2.5 часа с теста на Елман не могат да се докажат повече тиолни групи. Продуктът се диализира през нощта срещу 2 л 20 мМ НЕРЕЗ pH 7.3/0.6 М натриев хлорид и след това се нанася върху Моно $ -колона (градиент: 0-20 минути 22 % А, 20 - 150 мин 22 - 100 %В, А: 20 мМ HEPES pH 7.3, В: А + 3 М натриев хлорид. Скорост на
- 102 протичане 0.3 мл/мин. Измерванията се извършват при 280 нм, а флуоресцентното измерване при 354 нм). Продуктът, които се елуира с 1.5 - 1.6 М натриев хлорид, се диализира срещу 2 л НВ5 . Определяне на pL - концентрацията чрез нинхидринов тест и фотометричното определяне на пептидната концентрация при 280 нм дава пресметнато количество на пептид : pL от 12 : I при plr концентрация от 9.49 мг/мл в общ обем от 4.5 мл.
с) Липозомни препарати
Чрез 2EV - метода ( ’’reverse-phase evaporation^ получават липозоми ( Szoka и Papahadjopoulos, 1978;straubingei^ Papahadjopoulos, 1983}: водна фаза 10 мМ НЕРЕЗ pH 7.3, 100 мМ калцеин 150 мМ натриев хлорид; органична фаза: разтвор от 300 мкмола L-сх-лецитин (от жълтъци, предимно палмитоилолеоилфосфатиг дилхолин; Avanti Polar Lipids). в 260 мкл хлороформ се концентрират с помощта на ротационен изпарител. След това материалът се суши под висок вакуум и след това отново се разтваря в 3 мл диетилов етер. I мл от водната фаза се смесва основно с етерната фаза чрез Вортекс и се третира с ултразвук в продължение на 5 минути при 0° С в соникатор (тип баня). След престояване 30 минути върху лед, материалът още веднаж в продължение на 10 мин се третира с ултразвук. Получената в резултат стабилна емулсия бавно се изпарява върху ротационен изпарител. След отстраняване на диетиловия етер при 100 мбара се прибавя 0.75 мл от водната фаза. Останали следи от етера се отстраняват чрез ново изпаряване при 50 мбара за 30 минути. Получената емулсия (1.7 мл) се центрофугира при 500 об/мин и след това се екструдира през нуклеопорна поликарбонатмембрана (0.1 мкм),при което се получава краен обем от 0.7 мл липозомен разтвор. Липозомите се отделят от не^инкорпорирания материал чрез гелно филтруване (Сефа- 103 декс G· - 50 среда, Фармация; 23 мл гел-обем, 10 мМ НЕРЕ5 pH 7.3/ 150 мМ натриев хлорид). Събират се шест фракции от по 500 мкл. Липидният фосфор се определя по метода на Бартлет, 1959, с 2 мМ.
д) Изпитания за пропускливост на липозомите. Освобождаването иа съдържанието на липозомите ( Leakage) се измврва въз основа на излизането на включения калцеин и от там произлизащото разреждане, при което се получава самоизгасване на флуоресценцията (Bondeson et al., 1984).
Калцеиновата флуоресценция се измерва с Контрон 5МР 25 спектрален флуориметър (възбуждане при 490 нм, емисия при 515 нм) За целта 100 мкл-ови аликвотни части от горния разтвор на липозоми се разрежда 100 кратно с 0.1 М натриев ацетат или 10 мМ ΗΕΡΕΓ/Ι50 мМ натриев хлорид буфер със съответната pH -стойност (4.3, 4.5, 5.0, 6.0 7.3), за да се получи обем от I мл. Към тези разтвори се прибавят 2.5 мкг от пептида (терц.-бутил защитена форма; I мкг/мкл разтвор в НВ5)в кювети при смесване със слаб поток от аргон,(крайна концентрация 400 нМ пептид). Калцеиновата флуоресценция се измерва в различни моменти след прибавяне на пептида. Стойностите за 100 % ликаж (пропускливост)се определят чрез прибавяне на 2 мкл тритон Х-100 (Флука).
По същия начин се работи за измерване на калцеиновата флуоресценция след прибавяне на пептид-р1^конюгат към липозомения разтвор. 2.5 мкг от конюгата (I мкг/мкл, концентрация,отнасяща сесамо за количеството pL)ce прибавя към I мл разтвор на липозоми (крайна концентрация 20 нМ модифициран пептид). Аналогично, 2.5 мкл пептид-полилизин-конюгат след 15*минутно инкубиране с 5 мкг ДНК се подлага на изпитания за пропускливост на липозомите (ликажни - изпитания).
- 104 Намерено беше, че пептидггспособства за освобождаването на съдържанието на липозомите само в кисела среда (фиг· 17). Пептидният конюгат е активен при значителна по-ниска pH-стойност, като при това и при неутрална pH-стойност е силно активен, която активност при понижаване на pH още се усилва.
Комплексирането на конюгата с ДНК елиминира активността при неутрална pH-стойност, докато при кисела среда има ясно изразена активност.
е) Трансфекция на К562 - клетки
К562 - клетки се култивират в суспензия в BPMI 1640 - среда (Гибко BHL плюс 2 г натриев бикарбонат/I) плюс 10 % PCS , 100 единици/мл пеницилин, 100 мкл/мкл стрептомицин и 2 мМ глутамин до плътност 500.000 клетки/мл. 12 до 20 часа преди трансфекцията клетките се поставят в прасна среда, която съдържа 50 мкМ десфериоксамин (тази мярка се предприемала да се увеличи броят на трансферинрецепторите). Сутринта преди трансфекцията клетките се събират, суспендират се в прясна среда,съдържаща 10 % РС£ плюс 50 мкМ десфериоксамин (250.000 клетки/мл)?и всеки 2 мл се поставят в блюдо с 24 вдлъбнатини.
мкг pCMVI - ДНК в 160 мкл НВ$ се смесват с посочените на фигура 18 количества ТфрЬ - конюгат или с р1300 в 160 мкл НВ5, и след 15 минути се прибавят посочените количества инфлуенценпептид-рЬ-конюгат (ΡΙ6ρΙ·). След нови 15 минути сместа се прибавя към К562 - клетките. Клетките се инкубират при 37° С в продължение на 24 часа и след това се събират за определяне на луциферазата. Луциферазната активност се определя^както в предишните опити. Дадените във фигура 18 стойности показват общата луциферазна активност на трансфицираните клетки.
) Трансфекция на Hela - клетки
- 105 Hela - клетки се отглеждат в 6-сантиметрови културални блюда, както е описано в Клетки и среди. Трансфекциите се провеждат при плътност 300.000 клетки/плочка. Преди трансфекцията клетките се инкубират с I мл прасна среда, съдържаща 2 % РСЬ.
мкг pCMVL - ДНК в 160 мкл НВ$' се смесват с посочените на фигура 19 количества T}pL - конюгат или с р!300 или със смес от двете в 160 мкл HBS. След 15 минути се прибавя посоченото количество инфлуенцапептид-рЬ-конюгат (nPI6pL) и след нови 15 минути се прибавя сместа към клетките. Клетките се инкубират 2 часа при 37° С, след това се прибавя прясна среда с добавка от 10 % PCS . Клетките се инкубират при 37° С в продължение на 24 часа и след това се проверяват за луцифераза. Луциферазната активност се определя, както е показано в предишните опити. Дадените във фигура 19 стойности представляват общата луциферазна активност на трансфицираните клетки.
ПРЛЬаЕР 14,
Усилване на предизвикания чрез трансферин-конюгати гентрансфер с помощта на допълнителен N-крайен ендозомолитен инфлуенца-хемагглутинин-НА2-пептид
а) Получаване на пептид-полилизинови конюгати
Пептидггна последователността ( seq id N0:2) Giy-Leu-pheGly-A la-I le-Al a-aiy-Phe-Il e-G1 u-A вп-G ly. Ттр-в 1 u-Gly-Me t-I leAsp-Giy-siy-Giy-cye c означението P4I) се синтезира по аналогичен начин на описания в пример 13 а) пептид. Свързването на пептида към полилизина (р1*300) се провежда, както в пример 13 61) чрез свързване чрез 4РДР. При това се получават конюгати с моларно съотношение на пептид към полилизин от 4:1.
б) Трансфекция на Hela - клетки с инфлуенцапептид конюгати.
- 106 HeLa - клетки, както беше казано, се отглеждат в 6-сантиметрови блюда, трансфекцията се провежда при плътност от 300 000 клетки/блюдо. Преди трансфекцията клетките се инкубират с 1.5 мл прясна среда, съдържаща 2 % РС& 6 мкг pCMVL-ДНК в 160 мкл HBS (150 мМ натриев хлорид, 20 мМ НЕРЕЗ pH 7.3);се смесват с 6 мкг от конюгата TfpLI90B в 160 мкл HBS , след 15 мин се прибавят 10 мкг инфлуенцапептид-полилизинконюгат Р41р1или, за сравнение, 18 мкг инфлуенцапептид-полилизинконюгат Р16р1/(виж пример 13); посочените количества за двата пептидни конюгата бяха тестувани,че представляват оптималните количества за усилване на гентрансфера. След нови 15 минути се прибавя сместа от клетки. След 24 часа клетките се събират,за да се изпитат за луцифераза. Посочените във фигура 20/)стойности представляват общата луциферазна активност на трансфицираните клетки.
При сравняване на опитите с двата пептидни конюгата се вижда повече от 3.5 пъти по-високо усилване на гентрансфера чрез пептидния конюгат P4Ip]^
с) Трансфекция на ВЩ, CI2 клетки с инфлуенцапептиден конюгат
BNL CL. 2 клетки се култивират, както в пример 6. Инфлуенцапептиж P4I се конюгира с полилизинЗОО при моларно съотношение пептид : полилизин от 1:1, 3:1 и 8:1. Комплекси от 6 мкг pCMVL- ДНК и 20 мкг от конюгатите се прибавят към клетките. За сравнение се използват 20 мкг р!300 или 20 мкг Р16-полилизинконюгати, получени,както е описано в пример 13. Клетките се инкубират при 37° С в продължение на 4 часа, след това се прибавят 2 мл среда, съдържаща 18 % PCS. След 24 часа клетките се събират за луциферазния тест, резултатите от който са дадени на фигура 20 В. В липозомното ликахно изпитание (фиг. 20 С),
- 107 което се προвежда,както в пример 13 е описано, активността на конюгата (оъответствуващ на 2.5 мкг полилизин, pH стойност 5) се повишава със съдържанието на пептид в тях (на фигурата Ρ4Ι е означен като ”инфлу2”).
ПРИМЕР 15,
Трансфекция на Hela-клетки с ^“галакт°зидаза - репортергенен конструкт и на място доказване на ^й-галактозидазната - експресия,
а) култивиране и трансфекция на клетките.
За трансфекцията се култивират Hela - клетки в ДМЕМ - среда, съдържаща 5 % FC5, пеницилин, стрептомицин и глутамин, както е дадено в предишните опити, в 3 см културални блюда върху покривните стъкла (3 х Ю^клетки/блюдо).
За трансфекцията 6 мкг от ft -галактозидаза-репортергенния конструкт (pCMV- р - гал) в 160 мкл НВ£ се комплексира с 12 мкг TfpLI90B в 160 мкл НВ5 и се инкубира 30 минути при стайна температура.
При друг опит 6 мкг pCMV—/5 -гал в 160 мкл НВ5 се инкубират с 6 мкг Т{рП90В в 80 мкл НВ$ 15 минути при стайна температура. След това се прибавят 12 мкг в получения в пример 13 инфлуенцапептид-конюгат (PI6pL) в 80 мкл НВ5 и сместа се инкубира нови 15 минути. Тези ДНК-поликатйон-комплекси се смесват след това с I мл ДМЕМ плюс 2 % PCS, антибиотика и глутамин, както е дадено по-горе. За да се покаже ефектжгот хлорохин и аденовирус върху производителността на трансфекцията, при следващите експерименти се прибави хлорохин при крайна концентрация от 100 мкМ или 50 мкл от разтвора на аденовирусния щам б1312Сгдопълнително към средата, която съдържа ДНК - поликатион - комплексите.
- 108 За трансфекцията първоначалната културална среда се отстранява от клетките и I мл среда, съдържаща ДНК- комплексите с или без хлорохин или вирус,се прибавя вместо нея. След инкубационно време от 2 часа при 37° С към клетките се прибавя I мл ДМЕМ, съдържащ 10 %£С5, антибиотик и глутамин и инкубирането продължава още 2 часа. След това се отстранява цялата среда и клетките се отглеждат в 3 мл пресен ДМЕМ пл$с 10 %, антибиотик и глутамин.
б) β -галактозидазни изпитания часа след трансфекцията средата се отстранява, клетки* те се промиват I х с фосфатно буфериран разтвор на натриев хлорид (РВЬ) и се фиксират с 0.5 % глутардиалдехид в РВ5 в продължение на 5 минути при стайна температура. След това средството за фиксиране се отстранява и клетките се промиват I х с PBSСлед това се инкубира с оцветяващ разтвор (10 мМ фосфатен буфер pH 7.0, 150 мМ натриев хлорид, I мМ магнезиев хлорид, 3.3 мМ К4Ре(СН)6ЗН20, 3.3 мМ К3?е(СН)6 и 0.2 % 5-бром-4-хлор-3индолил-β -галактопиранозоид) при 37° С 20 минути до 3 часа ( Lim и chae, 1909). След това покриващите стъкла се изплакват с РВ5, вода и 96 %-ен етанол, сушат се и се покриват с мовиол. За анализа се използва Цайс Аксипот микроскоп.
Фигура 21 показва снимките на микроскопските увеличения ( х 112). A: HeLa - клетки, трансфицирани с 6 мкг pCMV-p -гал, комплексирани с 12 мкг T-fplI90B. Цветната реакция за β -галактозидаза се провежда за 3 часа. Фигурата показва, че много малко клетки (55 клетки; групата на оцветените клетки е показана със стрелка) експримират jJ-галактозидазния ген. В: НеЬа-клетки, трансфицирани с 6 мкг pCMV-^-гал, комплексирани с 6 мкг и 12 мкг PI6pL. Цветна реакция: 3 часа. Малко клетки
- 109 (250 клетки) експримират ^-галактозидазния ген. Реакцията на клетките е все пак по-силна, отколкото в А. С: Hele-клетки, тран фицирани с 6 мкг гал, комплексирани с 6 мкг и
мкг PI6pL в присъствие на 100 мкМ хлорохин. Цветна реакция:
часа. Много групи клетки показват силно позитивна реакция (повече от 1000 клетки). Д: Hela - клетки, трансфицирани с 6 мкг pCMV-j?>-гал, комплексирани с 12 мкг TfpLI90B в присъствие на аде· новирус dI3I2. Цветна реакция: 20 мин. Почти всички клетки (повече от 90 %) показват положителна реакция. Е: не^трансфицирани Hela - клетки (контрола за специфичността на - галактозидната реакция). Цветна реакция: 3 часа.
ПРИМЕР 16.
Трансфекция на HeLa - клетки с 48 кЬ козмид в присъствие на свободен аденовирус,
а) Получаване на козмид, съдържащ за луцифераза кодираща последователност,
3.0 кЬ Sail - фрагмент, съдържащ една единствена кодираща за Р. pyraiis луциферазна последователност под контрола на E5V - промотора^се лигира на единственото sail - място на козмидния клон CI-7а1, за да образува конкатамери. (CI-7а1 съдържа един 37 кЬ хуманен геномен ДНК sau^A - фрагмент ( Teilrerdau), некодиращ за явни гени, клониран в ватш - мястото на козмидния вектор pWI5 ( stratagene))?. Лигационният реакционен продукт след това се опакова ин витро и аликвотна част на получените фагни частички се инфицират в Е. ooli MN544 и се плати*· рат върху IB amp платки. Рекомбинантите се скринират чрез колониино хибридизиране при използване на 3.0 кб sail - фрагмент (52-Р-маркиран чрез рандомизиран праиминг) като хибридизираща сонда и някои от позитивните се анализират чрез рестрикционно
- no картиране. Козмиден-конструкт ( Cosluc), съдържащ едно единст вено копие на sail- инсерта, се култивира и се пречиства върху цезиев градиент (обща големина: 48 кЬ). Един малък контролен и козмид (12 ко) се получава чрез verdau. от Cosluc с Not I, религиране, трансформиране на бактерии и изолиране на правилния плазмид. Това дава 12 кЬ ДНК - молекула, на която липсва част от хуманния ДНК - инсерт и една част на полилинкера от CosLuc. Плазмидът pSPNeoLuo (8 кЬ) е плазмида,описан в пример 5, един E$V -луциферазен генфрагмент (един A pal/Prul-фрагмент от pSSVL, клониран в Clal - мястото на рисмк - локуса).
б) Транспортиране на козмида в НеХа - клетки
НеХа - клетки (3 х ΙΟ2* клетки за 6 см блюдо), покрити с I мл ДМЕМ + 2 % PCS,се комплексират с Т^рХ/ДНК - комплекси, получени,както е описано във въведението към примерите, съдържащи посоченото количество hTf.pl/ , свободен полилизин и ДНК, и се инкубират. Допълнително инкубационната смес получава или 100 мкМ хлорохин (колонки I и 2) или 10 мкл аденовирус 0I3I2, съдържащ 5 х 10^ частички за мл (колонки 3 - 12). След двучасово инкубиране при 37° С към всяко блюдо се прибавят 4 мл ДМЕМ + 10 % PCS . След 24 часа клетките се събират и се измерва луциферазната активност. Резултатите са показани на фигура 22 А.
с) Транспортиране на козмида в неуробластомни клетки.
Клетки от неуробластомна - клетъчна линия с означението SI-ME-N (Donti et al., 1998) (I χ Юб клетки за 6 СМ блюдо), покрити с 1 мл ДМЕМ + 2 % PCS 7се комплексират с
T^pL/ДНК - комплекси, посочените количества получени,както беше описано, съдържащи hTfpL, свободен полилизин и ДНК.
Допълнително към инкубационните смеси се прибавят или 100 мкМ хлорохин (колонки 3 и 4) или 10 мкл аденовирус 0I3I2, съдър- Ill IT жаш 5 x Юх частички в мл (колонки 5 и 6). След всеки два часово инкубиране при 37° С към всяко блюдо се прибавят по 4 мл ДМЕМ + 10 % ГСЬ. След 24 часа клетките се събират и се измерва луциферазната активност. Резултатите са дадени на фигура 22В. ПРИМЕР 17.
Гентрансфер посредством химически свързани аденовирусполилизин - конюгати.
а) Получаване на аденовирус-полилизин - конюгат чрез химическо свързване
2.35 мл от гелфилтруван (Сефадекс G-25 РДЮ, Фармация) разтвор на аденовирус ¢1312 (около 10^ частички) в 150 мМ натриев хлорид/25 мМ НЕРЕЗ , pH 7.9/10 % глицерин, се смесва с 10 мкл (10 нмола) I мМ разтвор от 6РДР (Фармация). След 3.5 часа при стайна температура модифицираният вирус се отделя от излишните реактиви чрез гелно филтруване (както по-горе). Разтворът се изплаква с аргон и се модифицира при отсъствие на кислород в среда на аргон с 42 мкл разтвор на PITC-маркиран полилизин (I нмол), и се оставя да реагира с 2.3 нмола меркаптопропионатнигрупи (полученикакто е описано в ЕР 388 758). След 18 часа при стайна температура, половината от разтвора се прехвърля в епруветка за цетрофугиране, внимателно като долен слой се въвежда I мл цезиевхлорид в разтвор (плътност 1.33 г/мл) и 2 часа се центрофугира при 35000 об./мин (6W 60 ротор) при стайна температура. Вирусният слой се събира като 200 мкл цевиев хлоридна фракция и се разрежда с НВЗ/50 % глицерин до I мл.
ДНК-изпитанията за свързване се провеждат с 300 мкл от модифицирания вирус: вирусният разтвор се разрежда с I мл HBS и се прибавят 100 мкл разтвор на 355 - маркирана ДНК (15 нг pESVL, получен чрез Ник-транслация). За контрола, експеримен- 112 тите се провеждат със същото количество немодифициран вирус 41312,успоредно с първите. След 30 минути пробите сее прехвърлят в епруветки за центрофугиране, внимателно се подслоява I мл разтвор на цезиев хлорид (плътност 1.33 г/мл) и при стайна температура се центрофугира два часа при 35000 об/мин (5W60 ротор). Градиентът се разделя при всяка на 5 фракции; фракция I, I мл; фракция 2, 0.6 мл; фракция 3 - 5, по 200 мкл. Радиоактивността на всяка от 200 мкл -овите фракции се определя и е дадена на фигура 23. При това във фракциите,съдържащи вирус (3 до 5), главно фракция 3, има значително по-висока радиоактивност ? отколкото в контролните опити. Това се дължи на специфичното асоцииране на полилизин-модифицирания аденовирус с маркираната ДНК.
б) Трансфекция на К562 - клетки
К562 - клетки (ATCC CCL 243) се култивират в суспензия в KPMI 1640 - среда (Гибко BHL плюс 2 г натриев бикарбонат/л) плюс 10 % PCS, 100 единици/мл пеницилин, 100 мкл/мкл стрептомицин и 2 мМ глутамин до плътност от 500 000 клетки/мл. 12 до 20 часа преди трансфекцията клетките се поставят в прясна среда, която съдържа 50 мкМ десфериоксамин (тази мярка се предприема^ за да се повиши броя на трансферни рецепторите). На сутринта на трансфекцията, клетките се събират, суспендират се в прясна среда^съдържаща 10 % PCS плюс 50 мкМ десфериоксамин (250 000 клетки в мл),и по 2 мл се поставят в блюдо с 24 вдлъбнатини.
Прибавят се и се смесват посочените количества pCMVLДНК (6, 0.6, 0.06 мкг) в 100 мкл НВ5 с 50 мкл полилизин - аденовирус (р1Адено), съответно със съответното количество (35 мкл) контролен аденовирус (Ц312. След 20 минути се прибавят съответни количества (12, 1.2, 0.12 миг) Т[рИ90В - конюгат в
- из 150 мкл НВ$. След нови 20 минути сместа се прибавя към К562 клетките. Клетките се инкубират при 37° С в продължение на 24 часа и след това се подлагат на луциферазни изпитания. Луциферазната активност се определя^както в предишните примери. Дадените във фигура 24 стойности представляват общата луциферазна активност за трансфицираните клетки.
с) Трансфекция на Hela - клетки
Един метод за установяване на активността на даден полилизин-вирусен конюгат е чрез проверка на конюгата по отношение на способността му да транспортира много малки ДНК - количества .. (по-малко от мкг). Очаква се повишен ДНК - трансферинкапацитет, когато аденовирусгге свързан директно към полилизин-кондензирана ДНК, тъй като интернализиращите фактори (трансферни и аденовирусен-фибропротеин) са директно асоциирани с подлежащата на транспортиране ДНК. За да се провери достоверността на това твърдение, константно количество от полилизин-аденовирус-конюгата п
(2.5 мкл, около 5 х 10 вирусни частички) се комплексира с различни количества (3 мкг до 0.0003 мкг) от репортернкя плазмид в 476 мкг НВЬ. След 15-минутно инкубиране при стайна температура, към всяка проба се прибавя съответно количество от трансферин-полилизин, отговарящо на масата ДНК (това количество T|'pL беше избрано, тъй като осигурява цялостно ” packaging (електронеутралност) на 50 % на плазмидната - ДНК и същевремено обезпечава свързващо - свободно пространство за вирус-полилизин конюгата. След прибавяне на Tf.pL смесите се инкубират 15 минути и след това всяка смес се поставя в културално блюдо, съдържащо 300 000 Hela - клетки в I мл ДМЕМ/2 % ?С5. След това клетките се инкубират 1.5 часа при 37° С и се прибавят 4 мл ДМЕМ/10 % iC$ . Успоредно с това еквивалентни количества ДНК
- 114 се комплексират с двукратен масов излишък на Tfpl/ (количество за напълно ДНК - кондензиране) и се прилага за гентрансфер в Hela - клетки (веднаж самостоятелно и веднаж в присъствие на 25 мкл на не-полилизин - свързан аденовирус 0ΪΙ3Ι2 - препарат). След 24 часа клетките се събират, получават се екстракти и аликвотни части се изследват за луциферазна активност. Резултатите от тези опити са дадени на фигура 25. При отсъствие на аденовирус, когато количеството на ДНК е под 0.3 мкг, не се доказва луциферазна активност. Както полилизин-свързания, така и несвързания аденовирус функционират добре при по-големи количества ДНК (3 мкг и 0.3 мкг). Все пак, при несвързания аденовирус се наблюдава близо 100 - кратно намаляване на активността при 0.03 мкг и пренебрежително малка активност под това количество ДНК. За разлика от това, полилизин-свързания вирус запазва гентрансферния си капацитет както при 0.003, така и при 0.0003 мкг ДНК. Това количество отговаря на около 100 ДНК молекули на клетка ДНК и на около I вирусна частичка/ДНК - молекула.
ПРИ1ЖР 18.
Гентрансфер посредством ензимно свързан към полилизин аденовирус.
а) Ензимна реакция мл Аденовирусен препарат (вид dI3I2; 5 х I010 РРЦ/мл) се нанасят на Сефадекс G-25 гелфилтрираща колона (Фармация), еквилибрирана с 25 мл реактивен буфер (0.1 М Трис-HCI; pH 8.0, 2 мМ ДТТ, 30 % глицерин). Елуирането се извършва с 3.5 мл реактивен буфер. Реактивната добавка за ензимно свързване се състои от 1150 мкл от вирусната елуентна фракция, 0.5 нмола трансглутаминаза от чер дроб на морско свинче (TG) (Сигма), 2 нмола, съот- 115 ветно 20 нмола полилизин290, 10 мМ калциев двухлорид и реактивен буфер в краен обем от 1500 мкл. Реакцията се провежда при 37° С в продължение на I час и след това се прекратява чрез прибавяне на 30 мкл 0.5 М ЕДТА. За контрола за специфичността на свързването се провежда реакция без трансглутаминаза. Не^инкорпориран полилизин се отделя от вирусите чрез центрофугиране върху CsCI-градиент (плътност 1.33 г/мл; 170000 х г, в продължение на 2 часа). Фракцията7съдържаща вирусите,се изтегля и се разрежда с равен обем глицерин, замразява се в течен азот и се съхранява при -70° С.
б) Демс/Ьтриране свързването на полилизин към аденовируси
Реакцията се провежда с полилизин, маркиран cj чрез Болтон - Хънтеров реактив (Амершам), както е описано по-горе. След CSCI - градиентното центрофугиране, вирусната фракция се изтегля и се разделя над нов СьС1-градиент. След това градиента се фракционира и се определя радиоактивността във всички фракции с помощта на сцинтилационен брояч. Както е показано на фигура 26, е видно, че при прибавяне на ТО (¢1312/TG-pL), вирусната фракция (вирус) е -обогатена на радиоактивен полилизин. При контролата, без TG» (di312/pL)z няма .обогатяване на вирусната фракция с радиоактивен полилизин.
с) Изпитване на полилизин-модифицирани аденовирусни фракции по отношение на техния ефект върху трансфекционната ефициенция,
I) Клетки и среди
За трансфекцията се правят посявки от 5 х 10^ клетки (мишихепатоцити; АТСС № : TIB 73) в ДМЕМ с 10 % топлинно инактивиран телешки зародишен серум (PCS), 2 мМ глутамин, 100 1.Е./
- lie мл пеницилин и 100 мкг/мл стрептомицин в 6 сантиметрови култура л ни блюда.
II) Образувания на вирус-ДНК-трансферин - комплекси 50 мкл на съответната полилизин-модифицирана вирусна фракция се смесват с 6 мкг на ДНК-плазмида pCMVL в 10 мк BHS и се инкубират 20 минути при стайна температура. След това към сместа се прибавят 8 мкг мишитрансферин-полилизин29ОВ (wuTf-pIz) и се инкубира нови 10 минути.
III) Трансфекция на миши хепатоцити
Вирус-ДНК-трансферин-комплексите се смесват с 1.5 мл среда (ДМЕМ с 2 % PCS, 2 мМ глутамин и антибиотик) и се прибавят към клетките,след като на тях предварително е била отстранена старата среда. След инкубиране в продължение на 2 часа при 37° С, към клетките се прибавят 2 мл ДЮ с 10 % PCS, глутамин и антибиотик. След допълнителна фаза на инкубиране от 2 часа, цялата среда се отстранява и към клетките се прибавят 4 мл пресна ДмЕм с 10 % PCS, глутамин и антибиотик.
IV) Определяне на луциферазната експресия часа след трансфекцията клетките се събират и се провежда луциферазното изпитание, по начина,описан по-горе.
Както се вижда от фигура 27, вирусниятпрепарат, при който аденовирусите са третирани с ΤΘ- и с 20 нмола полилизин (ciI3I2/ TG-20 нмола pL ), дават най-силната експресия (153540000 светлинни единици). Вирусният препарат с Т6· и 2 нмола полилизин (OI3I2/TG- - 2 нмола pL) е малко по-малко активен (57880000 светлинни единици). Контролната фракция, при която аденовирусите са обработени с 20 нмола полилизин, но не и с TG-, е близо около фактора 500 по-малко активна. За сравнение се използват за трансфекцията комплекси с изходните препарати от адено- 117 вирус, които не са третирани с TG- или пък с полилизин (dI3I2). При тези препарати се получават 4403000 светлинни единици.
д) Повишаване на трансфекционната ефициенция чрез полилизин-модифицирани аденовируси в сравнение с немодифицирани аденовируси, особено при ниски количества ДНК
Трансфекцията се провежда,както е описано в пример Зс)7при което за образуването на комплексите се използват 50 мкл от аденовирусната фракция dl3I2/TG-20 нмола и 6 мкг pCMVL/8 мкг n-nT^pL, 0.6 мкг рСМУ-Хчс/0.8 мкг m-Tj-pI или 0.06 мкг pCMVL/ 0.08 мкг -ήτΤ^ρΙ. За сравнение се провеждат също така трансфекции с 6 мгк, с 0.6 мкг, 0.06 мкг рСЮТ/^гTfpL - комплекси и с немодифицирани аденовируси (dI3I2). Оказа се, че комплексите с полилизин-модифицирани аденовируси дават високи стойности на експресиране дори и при ниски количества на ДНК, докато при немодифицирани аденовируси експресията силно намалява (фигура 28).
ПРИМЕР 19,
Гентрансфер с конюгати, при които свръзката между аденовирус и полилизин се осъществява през биотин-стрептавидинов мост е
а) Биотинилиране на аденовирус 0Ц312
Към 2.4 мл гелфилтриран (Сефадекс GC5 РДЮ, Фармация) разтвор от аденовирус (Д312 (около 10** частички) в 150 мМ натриев хлорид/5 мМ HEPES » pH 7.9/ 10 % глицерин, се прибавят 10 мкл (10 нмола) от I мМ разтвор на НН5- IC - биотин (Пирсе 21335). След 3 часа при стайна температура биотин - модифицирания вирус се отделя чрез гелно филтруване (както по-горе) от излишния реактив. Чрез прибавяне на глицерин разтворът се
- 118 довежда до концентрация 40 % глицерин (общ обем 3.2 мл) и се съхранява при -25° С. Биотинилирането на вируса може да бъде качествено доказано чрез капки с различни разреждания върху целулозна - нитратна мембрана: след изсушаване при 80° С в продължение на два часа във вакумна сушилна камера, брониране с В%, инкубиране със стрептавидин - конюгирана алкална фосфатаза (BEL), промиване и един час инкубиране с проявяващия разтвор NBT / Х-фосфат (нитросиньо - тетразолиева сол / 5бром - 4-хлор-З-индолилфосфат, толуидинова сол; Бьорингер Манхайм) беше намерена положителна цветна реакция.
б) Получаване на стрептавидин - полилизин - конюгати Свързването на стрептавидин с полилизин се извършва съгласно описания в EP-AI 388 758 от Вагнер и съавтори, 1990, метод.
нмола (4.7 мг) стрептавидин в I мл 200 мМ НЕРЕбрН 7.9 и 300 мМ натриев хлорид се третират с 15 мМ етанолов разтвор на 5 РДР (236 нмола). След 1.5 часа при стайна температура, модифицираният протеин се гелно филтрува през Сефадекс 0-25 колона, при което се получават 75 нмола стрептавидин, модифициран с 196 нмола дитиопиридинов линкер. Модифицираният протеин се оставя да реагира с 3-меркаптопропионат - модифициран полилизин (75 нмола, средна дължина на веригата 290 лизинови мономери, модифицирани с 190 нмола меркаптопропионат - линкер) в 2.6 мл 100 мМ ВЕРЕ Ь pH 7.9, 150 мМ натриев хлорид в атмосфера на арн гон. Конюгатите се изолират посредством катйообменна хроматография върху Моно S НЕ5 - колона (Фармация). (Градиент: 20 100 % буфер. Буфер А: 50 мМ HEPES pH 7.9; Буфер В: буфер А плюв 3 М натриев хлорид. Фракцията с продукта елуира при концентрация на сол между 1.2 М и 1.7 М. След диализа срещу НВ5 (20
- 119 мМ НЕРЕ5 pH 7.3, 150 мМ натриев хлорид) се получава конюгат, състоящ се от 45 нмола стрептавидин и 53 нмола полилизин.
с) Трансфекция на Heia - клетки
HeLa - клетки се култивират в 6 см културални блюда, както е описано в пример I. Трансфекцията се провежда при плътност от 300 000 клетки-плочка. Преди трансфекцията клетките се инкубират с I мл прясна среда, съдържаща 2 % PCS.
мкг pCMVL - ДНК в 100 мкг НВ5 се смесват с 0.8 мкг стрептавидин - полилизин в 170 мкл НВб. След 20 минути се прибавят 3 мкл полилизин рЪЗОО в 170 мкл HBS. След нови 20 минути се прибавят 65 мкл биотинилиран аденовирус или за контрола съответното количество аденовирус 6I3I2 (30 мкл, изходен вирус при модифицирането). Комплексната смес (биотин адв/комплекс А ,съответно контролен адв1’, виж фигура 29) се оставя нови 20 минути да престои.
Провежда се алтернативно комплексообразуване, като 65 мкл биотинилиран аденовирус се смесва първоначално с 0.8 мкг стрептавидин - полилизин в 50 мкл НВ5, след 20 минути се прибавят 6 мкг pCklVL*- ДНК в 170 мкл НВ$ . След нови 20 минути се прибавят 3 мкл полилизин р1300 в 200 мкл НВ$. (Комплексна смес биотинадв/комплекс В”).
0.6 мкг pCMVL - ДНК в 67 мкл HBS се смесват с 0.3 мкг стрептавидин - полилизин в 33 мкл НВ& След 20 минути се прибавят 65 мкл биотинилиран аденовирус или като контрола съответното количество от аденовирус 61312 (30 мкл, изходния вирус за модефикацията). Смесите от комплексите ( биотинадв/комплекс Ау съответно контролен адв’’, виж фигура 29) се оставят да престоят нови 20 минути и се разреждат след това с НВЗ до 500 мкл. Алтернативното комплексообразуване се провежда,като първона
- 120 чално 65 мкл биотинилиран аденовирус се смеси с 0.3 мкг стрептавидин-полилизин в 50 мкл НВ5, след 20 минути се прибавят 0,6 мкг pCMVL - ДНК в 50 мкл НВ5. Комплексната смес (биотинадв/ комплекс В) се оставят да престои 20 минутни след това се разрежда с HBS до 500 мкл.
Сместа се прибавя към клетките. Клетките се инкубират два часа при 37° С, след това се прибавят 2.5 мл пресна среда с добавка на 10 % РС$. Клетките се инкубират 24 часа при 37° С и след това се събират и се подлагат на луциферазно изпитание. Определянето на луциферазната активност става,както в предишните опити. Посочените във фигура 29 стойности представляват цялостната луциферазна активност на трансфицираните клетки.
Успоредно се провежда трансфекция на HeLa - клетки, при което вирусната компонента на конюгата е биотинилиран вирус, който е инактивиран члез псорален/УВ - третиране. Инактивирането се извършва.както следва: По 200 мкл биотинилиран вирусен препарат се поставят във две вдлъбнатини на 1.6 тъканна културална платка. Към всяка проба се прибавят по 2 мкл (33 мг/мл) 8-метоксипсорален (в диметилсулфоксид), блюдото се поставя върху лед и в продължение на 10 минути се облъчва с УВ - лампа (365 нм; UVP Т1гЗЗ лампа), при което разстоянието между пробата и филтъра възлиза на 4 см. След облъчването двете проби се обединяват и гелно се филтруват (G 50, Ник-колона, Фармация), при което колоната е предварително еивилибрирана с 40 % глицерин в НВ . Аликвотни части от по 75 мкл се комплексират с 0.8 мкг стрептавидин-полилизин и се използват за трансфекция на Hele клетки по гореописания начин.
Чрез цитопатични определения се установява, че вирусният титър благодарение на инактивирането е намалял с фактор повече
- 121 от Ιθ\ докато трансферният капацитет при по-високи концентрации е намалял с по-малко от 50 %, а при ниски концентрации с фактор около 5.
д) Трансфекция на К5 62 - клетки
К562 - клетки се култивират в суспензия на EPMI 1640 - среда (Гибко BEL , плюс 2 г натриев бикарбонат за литър) + 10 % PCs, 100 единици/мл пеницилин, 100 мгк/мл стрептомицин и 2 мМ глутамин до плътност на клетките 500 000 клетки/мл. 16 часа преди трансфекцията клетките се поставят в прясна среда/съдържаща 50 мкМ дефереоксамин (Сигма). На сутринта след трансфекцията клетките се пр5:върлят при плътност 250 000 клетки/мл в прясна среда, съдържаща 10 % РС6 + 50 мкМ дефериоксамин ,и се разпределят по 2 мл във вдлъбнатина върху платка с 24 вдлъбнатини.
Получават се три различни вида ДНК - комплекси:
а) Разтвор от 6 мкг pCMVL - ДНК в 160 мкл НВ5 (150 мМ натриев хлорид, 20 мМ НЕРЕ5 pH 7.3) се смесва., с 12 мкг от в 160 мкл НВ5 , след 30 минути се прибавят мкл аденовирус dI3I2 - препарат и сместа се прибавя към клетките.
б) Разтвор на 800 нг стрептавидин-полилизин в 160 мкл НВ5 се смесва с 20 мкл биотинилиран аденовирус, получен както е описано в а), след 30 минути се прибавя разтвор от 6 мкг pCMVL - ДНК в 160 мкл НВ5 и след нови 30 минути разтворът се смесва с 10 мкг от конюгата полилизи TfpLI90B в 160 мкл НВ5 0 След 30 минути се прибавя сместа пт. клетките.
с) ДНК - комплексите се получават, както е описано в б), с тази разлика, че вместо T-fpIZ90B се прибавя разтвор от 3.5 мкг поли(1)лизин р(lys)290. Клетките се инкубират 24 часа при 37° С и след това се събират за луциферазните изпитания. Даде
- 122 ните на фигура 30 стойности представляват общаталуциферазна активност на трансфицираните клетки.
ПРИМЕР 20,
Гентрансфер в първични клетки от костен мозък
а) Изолиране на клетки от костен мозък
Първични клетки от костен мозък се взимат от мишки като културална среда (1МДМ, съдържаща 10 % PCS , 5 х 10^ Μ βмеркаптоетанол, I % IL - 3 кондиционирана среда и антибиотик) се вкарва с помощта на инжекционна игла (0.4 мм или 0.5 мм диаметър) , свързана с I мл ампула, в изолирани кости на бедрото и подбедреницата и клетките чрез преплакване се извличат» След това клетките се мият I х в културална среда чрез центрофугиране при 100 х г 8 мин. След това клетките othob_jo се суспендират при концентрация 10 клетки/мл и се засяват в култура лни шишета. След 4 часа неприлепналите клетки се прехвърлят в ново Т25 - културално шише и се култивират една нощ в присъствие на 50 мкМ дефероксамин.
б) Образуване на аденовирус - трансферни - полилизин/
ДНК - комплекси
За образуването на комплекси 50 мкл биотинилиран аденовирук се култивира с 400 нг стрептавидин - модифициран полилизин в 20 мкл НВ5 в продължение на 20 минути. После се прибавят 20 мкл HBS , съдържащ 6 мкг рСЮТ. След инкубиране 20 минути се прибавят 7 мкг миши трансферин-полилизин-конюгат в 160 мкл НВ5 и общата смес се инкубира нови 20 минути.
с) Трансфекция
За трансфекцията клетките от костния мозък се получават от културалната среда чрез 8*минутно центрофугиране при 100 х г. Утайката от клетки се поема в културална среда, съдържаща 2 %
- 123 РС$ и 250 мкл аденовирус-трансферин-полилизин/ДНК - комплекси и в ново Т25 - шише се култивират при 37° С 3 часа. След това се прибавят 3 мл и след 2 часа нови 6 мл културална среда, съдържаща 10 % PCS.
д) Определяне на луциферазната експресия часа след трансфекцията клетките се събират и както при другите примери,се изследва луциферазната им експресия. Трансфекцията води до луциферазна активност/отговаряща на 310 х 10^ светлинни единици/100 мкг общ клетъчен протеин.
ПРИМЕР 21,
Трансфекция на неуробластомни клетки с 48 кЬ козмид в присъствие на свободен аденовирус и на аденовирусполилизин-конюгати,
Клетки от клетъчната линия с означение d-iviE-N, както са описани в пример 16, се трансфицират с 48 кЬ козмид с посочените количества ИД^рЬ, свободен полилизин и ДНК. Допълнително към инкубационните смеси се прибавят или 100 мкМ хлорохин (колонки 3 и 4) или 10 мкл аденовирус ¢312, съдържащ 5 х частички в мл (колонки 5 и 6). Последните две проби (колонки 7 и 8, StpL/биотин) получават 15 мкл биотинилиран аденовирус ¢312 (I х ΙΟ1* частички), 30 минути се инкубират с стрептавидин - полилизин (0.8 мкг, получен;както е описано в пример 19) в 150 мкл НВЬ. След това към пробата се прибавят 6 мкг ДНК в 150 мкл НВ5, оставя се да престои 30 минути при стайна температура, след което се прибавят 150 мкл НВ5, съдържащ 6 мкг КГ^-pL + I мкг свобо· ден pL. След ново инкубиране в продължение на 30 минути при стайна температура, сместа се прибавя към клетките. След двучасово инкубиране при 37° С, към всяко блйдо се прибавят по 4 мл ДМЕМ + 10 % PCs. 24 часа по-късно клетките се събират и се из
- 124 мерва луциферазната активност. Резултатите са показани на фигура 31.
ПРИМЕР 22.
Гентрансфер в първични епителни клетки от дихателните пътища
Предварителни опити с оглед на генетична коректура на цистична фиброза показаха, че имортализирани клетъчни линии, получени от епител на дихателните пътища, са достъпни за гентранс* ферния метод съгласно изобретението. За да се изключи възможността този феномен да се дължи на промени на епитела от дихателните пътища,индуцирани от имортализацията, опитите с трансферин-полилизин-конюгатите се провеждат и с първични епителни клетки от дихателните пътища (I °АЕ).
1°АЕ - клетки се получават от проби на полипи в носа на пациенти, както е описано от Yanka ska а et al., 1987. Тъканите се промиват в стерилен разтвор на натриев хлорид, след тов® при 4° С в Joklik Mininum Essential среда (MEM) плюс антибиотик (пеницилин 50 Е/мл, стрептомицин 50 мкг/мл, гентамицин 40 мкг/мл) се пренасят в лабораторията. Пробата се освобождава от Кнорпел- и излишната субмикозна тъкан и епителният слой се инкубира в протеазен разтвор (Сигма, тип 14, 0.1 мг/дл) в МЕМ при 4° С в продължение на 16 до 48 часа. За неутрализиране на протеазата се прибавят 10 % PBS (говежди серум от зародиш) и клетките се освобождават чрез леко движение. Получената суспензия се филтрува през 10 мкм найлонова решетка, за да се отстранят клетъчните остатъци, центрофугират се (150 х г 5 минути) и се мият в -PI2 + 10 $ РВ5 .
След това клетките се третират с трансферин-полилизинконюгати ( hTfpL) в кодиращ за луцифераза плазмид (pRSVL)
- 125 като репортерен ген. При тези изследвания първичните клетки не показват възприемчивост към тези комплекси^както това правят съответните имортализирани клетъчни линии (основа = 429 светлинни единици; при прибавка на конюгат : 543 светлинни единици) , което води до извода, че I °АЕ клетките са сравнително бедни на трансферин - рецептори.
За да се използва алтернативен рецептор върху клетките, прилагат се биотинилирани аденовируси (сравни пример 19). Клетките,третирани с този конюгат, показват значително по-силна експресия от базовите стойности (прибавкя на конюгати 2585752 ί 453585 светлинни единици). Освен това и други първични епителни клетки от дихателните от други видове се оказаха достъпни на този метод на гентрансфер (мишка = 3230244 + 343153; маймуна = 53498880 - 869481 светлинни единици).
ПРИК1ЕР 23.
Гентрансфер в хепатоцити и в кръвни клетки.
При експериментите в тези примери се използват следните материали и методи:
Трансфекция на тъканни културални клетки: Клетки от клетъчната линия BNLCL.2 се култивират, както е описано в пример 6. НеТа - клетки и хепатоцити се отглеждат в 6 см петриеви блюда. Трансфекцията се провежда при клетъчна плътност от около 3 х е
клетки в паничка. Преди трансфекцията стандартната културална среда се сменя с I мл прясна среда,съдържаща 2 % ГС5.
Образуване на бинерни комплекси: Биотинилирани аденовируΛ си (около 10^ РРСХ, виж пример 19 а) и 19 б)) се оставят да реагират с 800 нг стрептавидинилиран полилизин в 50 мкл HBS . След 30 минути при стайна температура се прибавят 6 мкг pCMVL - ДНК
- 126 в 170 мкл НВ$ , инкубира се 30 минути и след това се прибавят мкг р!300 в 200 мкл НВ£> и след нови 30 минути разтворът се използва за трансфекционните опити.
Образуване на терциерни комплекси: Биотинилирани аденовиQ руси (около Пг РРЦ.)) се оставят да взаимодействат с 800 нг стрептавинилиран полилизин в 50 мкл HBS . След 30 минути при стайна температура се прибавят 6 мкг pCMVL - ДНК в 170 мкл НВ5, 30 минути се инкубира и след това се прибавят 10 мкг Т^рБ190В в 200 мкл HBS и след нови 30 минути разтворът се използва за трансфекционните опити.
β - галактозидазни изпитания: BNL-CL.2 - клетки се посяват върху покривни стъкла и 24 часа клетките се трансфицират с репортерния плазмид pCMV - β gal (Lim и chae, 1989) След 48 часа се провежда β -галактозидазния тест, както е дадено в пример 15.
а) Връзката между ДНК - кандензати и аденовирус усилва в силна степен луциферазната-репортергенна експресия.
Резултата от трансфера на ДНК в хепатоцити посредством бинерни и терциерни ДНК - комплекси ;е показан на фигура 32: Гентрансферният ефект се усилва рус. Колонките pLAdenoV/TfpL фекции с аденовирус, който е полилизин и след това е оставен да реагира с ДНК, която неутрализира част от негативния товар. По-късно се прибавя трансферин в присъствие на свободен аденовипоказват резултатите от трансконюгиран чрез трансглутаминаза с полилизин, който донуетрализира остатъчния негативен заряд.
По този начин се образува терциерен комплекс аденовирус-полилизин/трансферин-полилизин/ЦНК. Както се вижда от фигурата, получава се изключително висока стойност от 1.5 х 10^ светлинни единици (отговарящи на около 5000 светлинни единици за клетка).
- 127 За изобразения в колонка аденовирус + pL + Т4р1 опит, аденовирус се смесва с полилизин, както при третирането с трансглутаминаза. За да се покаже специфичността на осъществената чрез трансглутаминаза връзка на полилизин към вируса, изключва се ензими Тогава вирусният препарат се комплексира със същото количество
е умерена както с аденовирус + TpL, тъй като и в двата експеримента съвместното локализиране на вирус и ДНК/трансферин-полилизин - комплекс представлява стохастичен (статистически вероятностен) процес, за разлика от показания в колонка рХаденовирус/T^pL екперимент, при който съвместното локализиране чрез свръзката на вирус и ДНК в ернерния комплекс осигурява висока степен на трансфекция с трансферни.
б) Трансфекцията К562 - клетки показва ендозомолитните свойства на аденовируса.
Клетки на човешка еритролевкемична -клетъчна линия К562 съдържат около 150 000 трансферни - рецептори ( Klausner et al., 1983 b). В присъствие на хлорохин тези клетки могат д дори в отсъствие на аденовирус в силна степен да се трансфицират с-ДНК - комплекси (фигура 33 T-fpL), както то ва е докладвано от (Cotten et al., 199О).Тези същите комплекси обаче в присъствие на свободен аденовирус, но в отсъствие на хлорохин, дават сравнително слаба репортергенна експресия (аденов/TfpL), вероято поради това, че К562 клетки, както и ДРУГИ кръвни клетки ( Silver et al., 1988; Horvath et al, 1988) показват само малък брой аденовирусни рецептори. Ако аденовирусзгсе свърже към полилизина чрез биотин/стерептавидинов мост и репортер-ДНК чрез прибавяне на повече полилизин се кондензира цялостно, за да се комплетира бинернляткомплекс ( pude
- 128 noV/р]», постига средни стойности при подпомогнатата от аденовируса трансфекция, вероятно поради това, че малкото аденовирусни рецептори се използват ефициентно. Ако все пак комплексираната с аденовирус -полилизин ДНК е цялостно кондензирана и чрез прибавка на трансферин-полилизин при образуване нферциерен комплекс (р1аденовирус-Т^ pL) се неутрализира и многобройните клетъчни трансферинрецептори влезат в действие, то тогава трансфекционната ефициенция - както благодарение на ефициентното трансферинно свързване, така и на ендозомолитните свойства на вируса - се повишава най-малко с две допълнителни степени (фигура 33).
с) Тройни ДНК - комплекси водят до експресиране на репортерния ген в почти 100 % от хепатоцитите.
За да се изпита ефициенцадта на транспортната система в миши хепатоцити BKLL CI.2, клетките се трансфицират с ^З-галактозидазен - репортерен ген. Фигура 34 показва - галактозидазните изпитания след а) трансфекция с трансферни в присъствие на хлорохин, б) трансфекция с трансферни в присъствие на свободен аденовирус (dI3I2) - полилизин - трансферни - ДНК - комплекси. В отсъствие на аденовирус след стандартна трансфекция с трансферни само малко клетки експримират репортергена. Процентната част на трансфекцията с трансферни възлиза на по-малко от 0.1 Когато присъства и хлорохин, то процентзтсе покачва на около 0.2 % (фигура 34 А). Със свободен аденовирус експримират около 5 - 10 % на клетките репортерния ген (фигура 34 В), докато тройните комплекси с трансглутаминаза - модифициран вирус водят до експресия в повечето, ако не във всички клетки (фиг.
С). Тъй като тройните комплекси могат да се използват при високо разреждане, обикновено не се наблюдава токсичниягефект,
- 129 възникващ при високите дози на свободен (инактивиран) аденовирус. Все пак трябва да се вземе под внимание, че при използване на тройните комплекси във висока концентрация, за да се постигнат 100 % от тъканните културални клетки, може да се забележи подобен токсичен ефект. Причина за токсичното действие може да бъде остатъчната вирусна генна активност или да се дължи на ендозомолитните свойства на прибавения вирус ·, или то е просто в резултат на много високата експресия на трансфицирания ген.
д) Експерсията на трансфицирания репортерен ген е транзиентна, може обаче в на-делящи се хепатоцити да се задържи в продължение на седмици,
Тройни (терциерни) транспортни комплекси (рЬаденовирус/ TfpL) се получават с полилизин-аденовирус и с модифициран аденовирус, който е допълнително инактивиран чрез въздействие с псорален. До 2/3 конфлуентна хепатоцитна - клетъчна култура, както е посочено в експериментите от фигура 34 В, се трансфицира с луцифераза - репортергенплазмид pCMVL и се измерва луциферазната активност през различни интервали от време. Както се вижда от фигура 35, луциферазната активност е най-висока след 3 дни, тогава когато хепатоцитната клетъчна култура става конфлуентна и клетките престават да се делят. Експресирането на репортерния ген се запазва в неделящата се клетъчна култура, без да се прилага селекция за задържането на гена и продължава поне 6 седмици, особено когато се използва псорален - инактивиран аденовирус за образуване на тройните комплекси.
ПРШР 24,
Използване на пилешки-аденовирус CELO за усилване на ДНК - транспорта в човешки клетки .
- 130 В този пример се изпитва пилешкият- аденовирус СЕЮ по отношение способността му да усилва ДНК-трансфера в човешки Hela - клетки, аналогично на предишните примери, при които се изпитва човешки аденовирус тип 5.
Използва се пилешки - аденовирус СЕЮ (вид Фелпс, серотип rAV-1,7, пилешки бъбречни клетъчни пасажи). Вирусът (2 мл) се нанася върху РД-Ю гел филтрираща колона, еквилибрирана с 20 мМ НЕРЕ$ pH 7.3, 150 мМ натриев хлорид (НВ5 ) + 10 % глицерин и 2 мл от елуата се оставят да взаимодействат с 20 мкл I мМ ΝΗθ -Ю-биотин (Гшрсе) в продължение на 3 часа при стайна температура. Биотинилираният вирус след това се диализира срещу 3 х 300 мл НВ$ + 40 % глицерин при 4° С и в аликвотни части се съхранява при -70° С.
Hela - клетки (5 х 10^ клетки за 6 см блюдо) се инкубират в 2 мл ДМЕМ + 2 % PCS с 6 мкг от плазмида pCMVL, комплексиран с полилизин (₽1уь)- или трансферин-полилизин(Т^рЬ )-смеси в 500 мкл HBS (предварително комплексите се инкубират 30 минути при стайна температура). След това пробите се прибавят към клетките в посочените на фигура 36-вирусни количества. При пробите, които съдържат биотинилиран СЕЮ - вирус, посоченото количество вирус заедно с посоченото количество стрептавидин-полилизин (S-brpL) се предварително инкубират в продължение на 30 минути при стайна температура в 200 мкл НВ5, преди към тях да се прибавят 6 мкг от плазмида pCMVL в 100 мкл НВ . След инкубиране 30 минути при стайна температура към клетките се прибавя посоченият TfpL -материал при 37° С. Два часа по-късно към клетките се прибавят 5 мл ДМЕМ + 10 % -FCS. След 24 часа клетките се събират и се подготвят за луциферазните изпитания.
Както се вижда от фигура 36, СЕЮ - вирусът в свободна фор
- 131 ма усилва ДНК - транспорта в Hela - клетки (колонки 1-6). Ако обаче СЕЮ - вирусзте модифициран с биотин и е получен в комплекс със стрептавидин, се вижда, че вирусжгкакто с, така и без допълнителен трансферин-полилизин, усилва ДНК - трансфера в сравнително еднакъв порядък с този постигнат чрез човешки аденовирус ot3I2. Специалната линия от Hela - клетки показва висок капацитет на свързване за полилизин/ДНК - комплекси в отсъствие на трансферни (сравни луциферазната активност на пробите I и 4 във фигура 36). От тук,включването на СЕЮ - вируса в полилизинДНК-комплексите е достатъчно, за да се осъществи приемането на комплекса0
ПРАмЕР 25.
Трансфекция на миобласти ·././
а) Трансфекция на миобласти и миотуби с ДНК-трансферинполилизин - комплекси в присъствие на свободен аденовирус и в присъствие на биотин/стрептавидин-свъзан аденовирус *
C2CI2 миобласти ( Blau et al., 1985; ATCC te: CEL 1772) и G8 - миобласти (ATCC te: CEL 1456) се трансфицират във високо глюкозен ДМЕМ + 10 % РС$ миобластни култури при субконфлус ентност с около 5 х 10 култури за 6 см блюдо. Миокубни култури се получават като миобласти се нанасят в 6 см блюда (около 5 х 10^ клетки за блюдо) и средата се подменя с високо глюкозна ДМЕМ + 2 % конски серум, след като клетките станат конфлуентни ( Вагг и Leiden, 1991.; Dhawan et al., 1991). Трансфекцията на клетките (миотубите) се провежда 5 до 7 дни по-късно. Трансфекционните комплекси се получават ^както е описано в пример 19, при което се използват посочените количества от TfpL, strpL и биотинилиран аденовирус dt3i2. Клетките се събират
- 132 20 часа след трансфекцията и се измерва луциферазната активност. Посочената на фигура 37 луциферазна активност се отнася за цялата клетъчна проба. Вижда се, че както биобластите, така и миотубните култури могат да се трансфицират с висока ефициентност. След диференциране на миотубите трансфЕКЦИонната ефициенция спадна с по-малко от I loo (C2CI2) или не показва зна чително намаление (G8). Образуването на миотуби се осъществява при Θ8 - клетъчната линия с по-малка фреквенция, което частично може да е отговорно за липсата на доказуемо намаляване на производителността в диференцираната култура. Ролята на обменнотЙействие между трансферин и трансферинния рецептор при ДНК - транспорта не е съществена при този клетъчен тип. При всичките четири клетъчни препарата се реализира само слаб
ДНК - транспорт при използването на комплекси в присъствие на свободен аденовирус dl3I2 (колонки I, 4, 7, 10).
При използването на свързан вирус се усилва производителността на трансфекцията (колонки 2, 3, 5, 6, 8, 9, II, 12). При сравняване с комбинирани - комплекси, съдържащи само вирус и полилизин/5БгрЬ, постигнатияггентрансфер с резулатите, получени с комплекси, които включват трансферин-полилизин, се получава приръст на производителността с по-малко от I Ioq (сравни на пример колонка 2, без трансферин, с колонка 3, (с трансферин). Малката трансфекция със свободен вирус и силната трансфекция със свързани вирускомплекси, както в присъствие z така и в отсъствие на трансферин - полилизин дават възможност да се направи предположението, че аденовирусзгпри тези клетки служи ка то лиганд и че без свързване свободниягвирус може да проникне в клетките, но TypL/ДНК - комплексат не преминава в продуктивно количество (използваниятв този пример pCMVL-ДНК е означен във
- 133 фигурата с pCLuc).
б) Хистохимичен анализ на трансфекционната честота в миотуби.
C2CI2 миотубни култури (както миобластите в 6 см блюда,засадени, 5 х 10^ клетки, диференцирани в миотуби) се получават както е описано в а). При пробите със свободен вирус pCLIV^ — гал ДНК (6 мкг) се комплексират с S мкг T-ipLB присъствие на
500 мкл НВ$ и се прибавят към клетките в присъствие на 18 мкл аденовирус dI3I2 (I х 10^ вирусни частички в мл) в 2 мл ДМЕМ/ % iOS» Пробите със свързан вирус се получават с pCMVIacz ДНК (6 мкг), комплексирани с ? мкг T|pL и 800 нг StrpL + мкл биотинилиран аденовирус <Й312 (I х 10*^ вируси в мл) в 500 мкл
НВЗ , и се прибавят към клетките в 2 мл ДМЕМ/2 % PCS» След инкубиране в продължение на 24 часа, клетките се оцветяват, както е описано в пример 15, за определяне на Д-галактозидазната активност.
Галактозидазните - цветни проби съвпадат с резултати те от трансфекцията, при които се използва луцифераза като репортерен генен продукт (виж а)). При миотубните култури се получава много ниска генекспресия, когато се използва свободен вирус, докато свързването на вирус и ДНК дава високо ниво на генекспресиране. Присъствието на синьооцветени многоядрени тубули показва успешния трансфер на даден ген в тези диференцирани клетки в присъствие на свободен аденовирус.
с) Трансфер на ДНК в първични миши-биобластии- и миши-миотубни култури.
Голямите скелетни мускули от двата задни крака на 4 седмична мъжка мишка C57BI/6 мишка се изолират стерилно в ΡΒ3ι се надробяват на парчета от около 5 мм. Тъканта се суспендира
- 134 в 20 мл РВ5 , оставя се да престои около 2 минути и да се утаи и горниятслой се изсмуква. Това промиване се повтаря 3 пъти. Тъканите след това се смесват с 3.5 мл I % (т/о) колагеназа, тип 2 Сигма и 0.5 мл I % BSA (фракция V в 4 мМ калциев двухлорид) и при 37° С в продължение на 30 минути при често внимателно бъркане се оставят да се инкубират. В края на 30-минутната инкубация остатъчната тъкан ее|зставя да се утаи, горният слой се отстранява и се смесва с 5 мл ДМЕМ + 20 % ГС5. Инкубирането с протеаза се повтаря 3-4 пъти, докато тъканта напълно се диспергира. Клетъчната суспензия след това се прекарва през клетъчно сито (Фалкон), за да се отстранят агрегатите и клетъчните фрагменти и се центрофугира при 500 х г в продължение на 15 минути. Утайката от клетките се отново суспендира в 10 мл ДМЕМ + 20 °/Q PCS и фибропластите се отстраняват, като клетките се платират в непокрито тъканно културално блюдо с диаметър 15 см в продължение на 60 минути. Неприкрепените клетки внимателно се отделят и се платират върху пет ламинин-покрити 10 см тъка нни културални блюда с 15 мл ДМЕМ + 20 %-РС$за блюдо. След постигане на конфлуензия (около една седмица по-късно) клетките се трипзинират и отново се реплатират по около I х 10 клетки за блюдо върху ламинин-покрити 6 см блюда. За да се образуват миотубни култури, около 5 дни по-късно (когато клетките са постигнали конфлуентност) средата се подменя с ДМЕМ + 2 % конски серум и след една седмица се провежда трансфекцията. Трансфекцията на миобластните култури се предприема в 6 см блюда при около 80 % конфлуентност. Ламинин-покритите клетъчни културални платки се получават,както следва: Клетъчни културални блюда се покриват с 0.025 мг/мл полилизин (МО 30 000 - 70 000 Сигма) в стерилна вода в продължение на 30 минути при стайна темпера
- 135 тура. Платките се преплакват 3 х със стерилна вода и се оставят да изсъхнат на въздуха. След това платките се покриват с 8 мкг/ мл ламинин (EHS, Сигма) във вода през нощта при стайна температура. Преди засаждане на клетките платките се мият три пъти.
Използваните за трансфекцията ДНК - комплекси се получават, като даденото количество псорален/УВ -инактивиран биотинилиран аденовирус 4I3I2 (получен съгласно пример 19) се разрежда в 150 мкл НВ5 , прибавя се I мкг StrpL в 150 мкл НВ5 и след това се инкубира 30 минути при стайна температура. После на всяка проба НВ5 (100 мкл), съдържаща 6 мкг рСШПДвъв фигурата означено рСШс), и се инкубира нови 30 минути при стайна температура. Накрая към всяка проба се прибавят 7 мкг T-fpL в 100 мкл ΗΒγ) и след това се прибавя или към миобластната- или към миотубната култура в 6 см блюдо, съдържащо 2 мл ДМЕМ + 2 % iC$ . След един час инкубиране средата се подменя с 5 мл ДМЕМ + 20 % PCS (миобласти), съответно с ДЬ1ЕМ + 2 % конски серум (миотуби) и след 48 часа клетките се събират,за да се проведе луциферазния анализ. Луциферазната активност за цялата клетъчна проба е дадена на фигура 38.
ПРЯмЕР 26.
Подобряване на трансфера чрез СЕЮ - вирус в миобласти при използването на лектин - лиганд.
а) Сравнителни анализи на аденовирус 4I3I2 и CEI0 - вирус в НеХа - клетки и C2CI2 - миобласти
Проби или от НеХе-клетки или от С2С12-миобласти (5 х 10^ клетки за 6 см блюдо) се трансфицират с 6 мкг рСМУЬ(във фигурата означено с pCLuc), комплексиран с I мкг 0trpL/7 мкг T|pL плюс 5 мкл биотинилиран аденовирус dI3I2 (виж пример 19, I х частички в мл), или с 18 мкл биотинилиран СЕЪО-вирус (вж,
- 136 TO пример 24, 0.3 x 10 частички в мл). След 20-часово инкубиране клетките се събират и се подготвят за определяне на луциферазната активност. На фигура 39 е показана получената луциферазна активност от всяка цялостна клетъчна проба.
Трансфекцията в Hela - клетки се провежда със сравняема ефициенция при използването на човешки аденовирус ot3I2/strpb/ T^pL/ДНК - компелкси, които могат да навлезат в клетките или през аденовирус-рецептора или чрез трансферин-рецептора или при използване на CELO -вирус/б^рХ/Т^рЪ/ДНК - комплекси, които могат да навлезат чрез трансферин-рецептора. Докато все пак трансферагна ДНК в С2С12-миобластите с аденовирус а|1312 може да се проведе ефициентно, то комплексите с CEIO - вируси функционират лошо в тези клетки. Предишни опити показват, че трансферин-рецептора играе само малка роля при транспортиране на комбинирани комплекси в тези клетки; предполага се, че аденовирусния-рецептор е главното място за навлизане. Слабата активност на CEIO - вируса в миобласти може да се дължи също на слаба връзка както на CEW - вируса, така и на трансферин към · C2CI2 - миобластите.
б) Подобряване на трансфекцията на С2С12-миобласти с CEIO - вирус при използване на аглутинин от пшеничени кълнове като лигант
Въз основа на слабия транспорт^получен в а), избран бе нов лиганд като заместител на трансферин, а именно биотинилиран аглутинин от пшеничени кълнове (2-4 мола биотин за мол протеин; Бьорингер Манхайм). Биотинилиран CEW - вирус се получава7както вече беше описано. Комплекси, съдържащи 6 мкг рСЮТ плюс даденото количество SLrpL, TfpL, биотинилиран аглутинин от пшеничени кълнове (WCA-B) и CELO - вирус се получават^както
- 137 следва: вируса и ΪΤ&Α заедно се разреждат в 150 мкл HBS* StrpL също така се разрежда в 150 мкл НВб, двата разтвора се смесват и се инкубират 30 минути при стайна температура. ДНК, разредена в 100 мкл НВ5, се прибавя към Strpl/вирус/ WGA - разтвора и отново се инкубира 30 минути при стайна температура. Накрая към разтвора се поставя T-j'pL в 100 мкл HBS и пробата отново се инкубира 80 минути при стайна температура.
Комплексите се прибавят към С2С12-миобластите (5 х 10 клетки за 6 см блюдо) в 2 мл ДМЕМ + 2 % PCS · След един час към клетките се прибавят 5 мл ДМЕМ + 10 % PCS и след 20 часа клетките се препарират за определяне на луциферазната активност. Активността (светлинни единици) за всяка обща клетъчна проба е дадена на фигура 40 (използваната в този пример ДНК е рСВД, във фигурата,означена с рС1цс).
В отсъствие на вирус се получава много слаб ДНК - трансфер, както с, така и без WGA (колонки 1,6). Умерен трансфер се получава със свързан CEW-вирус (колонка 2), но се получава 16кратно увеличение, когато WG-A-B се съдържа в комплекс. Увеличаване съдържанието на WGA в комплекса (от I мкг на 5 мкг) води до леко понижаване на трансфера (сравни колонки 3 и 4), докато увеличаване съдържанието на St-rpL в комплекса (от I мкг на 2 мкг) леко повишава трансфера. Тези резултати ясно показват, че WGA-В като лиганд увеличава транспорта на ДНК в C2CI2 клетките посредством CEIO - вируси.
д) Експресиране на фактор VIII в C2CI2 - миобластни и миотубни култури
Ьаиобластните- и миотубни култури се получават,както е описано по-горе. Трансфекцията се провежда при използване на 6 мкг от плазмид, съдържащ full length фактор VIII сДНК
- 138 (Wood et al., 1984; Eaton et al., 1986) и комплексиран съгласно обичайното предписание за комплексиране с 5 или 15 мкл биотинилиран аденовирус (както е посочено) плюс 0.5 или I мкг 6trpL и 7 или 6 мкг Tfpl.
ДНК/вирусните комплекси се прибавят към клетките в 2 % PCs/ДМЕМ. След четири/часово инкубиране при 37° С се прибавят 3 мл пресна ДМЕМ + 10 % PCS към всяко блюдо. След 18 часа средата се събира и при използване на Коатест (Каби, Фармация) система за тестуване с интернационален стандарт като референтен, се изследва за наличието на фактор VIII. Количествата фактор VIII се нанасят като мединици, образувани за 24 часа за I х 10 6 клетки (фигура 41).
ПРИМЕР 27,
Използване на аденовирус - протеин за ДНК -транспорт Аденовирус (див тип 300) се отглежда в НеЪа - клетки, пречиства се и се биотинилира, както е описано за аденовирус dI3I2.
1.2 мл от вируса се диализира в продължение на 18 часа срещу 3 х 300 мл 5 мМ МЕ£ (2-(П-морфолино)етансулфонова киселина), I мМ ЕДТА pH 6.25, 4° С. ...След това материалягсе центрофугира 30 минути при 27 К в 5И60-ротор. Горният слой внимателно се отстранява, утайката (пелета) се суспендира отново в НВ /40 % глицерин. НЕРЕ$, pH 7.4 и натриев хлорид се прибавят към горния слой в количества 20 мМ и 150 мМ и както пелета (съдържащ вирусните Core - протеини и главното количество от хексонкапсида; във фигура 42 core), така и горната фракция (съдържаща вертиците; във фигура 42 vertices) се изследват за тяхната ДНК - транспортираща активност в Мот13 миши фиб1992) робласти ( Strauss и Jaeniscli,HnH в НеЬа - клетки.
- 139 Комплескообразуването с ДНК се извършва,както следва: посочените количества от всяка фракция, нарушен вирус преди центрофугирането или интактен вирус (изразен като миг протеин, определен с теста на Брадфорд),се разреждат в 300 мкл НВ$ . Прибавя се стрептавидин - полилизин (3 мкг в 50 мкл НВ5) и 30 минути се инкубира при стайна температура. 6 мкг pCiuVL , във фигурата означено рСДцс , се разреждат в 100 мкл HBS и се прибавят към първия разтвор за 30-минутно инкубиране. Накрая се прибавят 3 мкг Т| рЪ в 100 мкл HBS , последвано от ново 30минутно инкубиране. В пробите, които са получени само с T^pL, се смесват 8 мкг Т|рЪ в 170 мкл HBS с 6 мкг pCMVL в 330 мкл НВБ 30 минути при стайна температура. Посочените количества вирусен протеин се разреждат в 300 мкл НВ5 и след това се прибавят към Т,{рЪ/ДНК - комплексите. Всички проби след това се прибавят за един час към 5 х 10·^ клетки в 6 см блюдо, съдържащо 2 мл ДМЕМ-10 % РС5 (или Hela - клетки или MoVI3 - фибробласти). След това се прибавят 5 мл прясна среда, съдържаща 10 % FC5 и след 20 часа клетките се препарират за определяне на луциферазната активност. Получената луциферазна активност (в светлинни единици) е дадена на фигура 42, както за Hela - клетки (таблица А), така и за МоУ13-фибробласти (таблица В).
И при двата типа клетки има зависещо от дозата увеличаване на ДНК - трансферната активност във връзка с вертекс фракцията (проби 4 - 6 в двете таблици). Ако се съдържат същите количества биотинилиран вирусен протеин в TfpL/ДНК - комплексите без стрептавидин - полилизин, наблюдава се ДНК-транспорт близост до базовите стойности (проба 3 на всяка от таблиците).
ПРЛМЕР 28.
Усилен гентрансфер при използване на тройни ДНК-комплек- 140 си, съдържащи галактозен-лиганденконюгат.
а) Тройни комплекси, съдържащи инфлуенцапептиден-конюгат Примерите 13 и 14 показаха, че полилизин-конюгирани пептиди съдържат последователности, получени от М-края на инфлуенцавирус-хемаглутинин НА-2-подединица, увеличават гентрансфера в ДНК/трансферин-полилизин-комплексите посредством трансферинполилизин.
Получават се подобни ДНК-комбинационни-комплекси, съдържащи тетра-антенерен галактоза-лиганд-полилизин-конюгат (получен както е описано в пример 6, съответно в пример 13), като лиганден-полилизин-конюгат се прибави към плазмид-ДНК pCMVL, за да се неутрализира половината от ДНК - заряда, и остатъкатот заряда се използвала да се заредят комплексите с инфлуенцапептид-полилизин-конюгати. Транспортътна тези ДНК - комплекси, които съдържат синтетичния лиганд (gal)4, към BNLCK2 хепатоцити (трансфекциите се провеждат, както е описано в пример при което се получава луциферазна генна експресия (фиг. 43), ко· ято е значително по-висока от експресията,получена с трансферни като лиганд. Експресията е повече от 500 пъти по-висока от тази,която се получава в контролните експерименти с ДНК - комплекси без инфлуенцапептиди, но със същото количество полилизин (фигура 43). Получената с ДНК-комбинационни комплекси активност е също така около 30 пъти по-висока,отколкото с ДНК/ (cjaI)4pL - комплексите, с които клетките са инкубирани в присъствие на хлорохин.
б) Тройни комплекси, съдържащи аденовирус - конюгат , Комплексите се получават по следния начин.
Биотинилиран аденовирус dI3I2 (получен,както в пример 19; 2 мкл, 6 мкл или 18 мкл; Ючастички в мл) в 50 мкл HBS се
- 141 смесва със стрептавидин-полилизин (100 нг, 160 нг или 480 нг) в 100 мкл НВ$. След 30-минутно инкубиране се прибавя разтвор от 6 мкг рСЮТ в 200 мкл НВ5 и след нови 30 минути се поставя разтвор на 3.8 мкг (oaI)4pL (получен както в пример 6) или 7
мкг Tfpl в 150 мкл НВ£. ДНК-комплексните разтвори се отглеждат по 300 000 клетки (ATCC TIB73, ATCC TIB74, ATCC TIB75, АТСС TIB76) в 6 см блюда в високо глюкозна ДМЕМ” + 2 % FC5. Понататъшното отглеждане на клетъчната култура и луциферазните изпитания се провеждат;както е описано в предишните опити,като получените стойности за генна експресия след 24 часа са дадени на фигура 44.
ПРИМЕР 29.
Гентрансфер в В-лимфобластоидниВ-клетки .
чават,както следва, при което свързването се провежда аналогично на познати от литературата методи чрез въвеждане на дисулфидни моатове със сукцинииидил-пчридилдитио-пропионат (spdp, Jung et al., 1981),.
а) Получаване на анти-човешки-1о-полилизин 300конюгат.
Към разтвор на 2 мг кози-анти-човешки-lq ( Soithern Bio technology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA); В НВЬ (150 M натриев хлорид, 20 мМ НЕРЕЗ, pH 7.8) се прибавя 14 мкл 5 мМ етанолов разтвор на РДР (Фармация). След 10 часа при стайна температура се филтрува през гелколона Сефадекс 6- 25 (елуент 100 мМ HEPES-буфер pH 7.3), при което се получават 1,3 мг анти-човешки-lij, модифициран с 30 нмола пиридилдитиопропионатни остатъци. Поли(1)лизин 300 (среден градус на полимеризация от 300 лизинови остатъка (Сигма) се модифицира ана
- 142 логично със РДР и чрез третиране с дитиотреитол и последващо гелно филтруване минава във модифицирана форма със свободни меркаптогрупи. Разтвор на 12 нмола полилизин 300, модифициран с 29 нмола меркаптогрупи, в 0.3 мл НВ$> , се смесва в отсъствие на кислород с по-горе получения, модифициран анти-човешки-Iij и се оставя една нощ при стайна температура. Реакционната смес чрез прибавяне на 5 М натриев хлорид се довежда до съдържание на 0.6 М натриев хлорид. Изолирането на конюгатите се извършва чрез йонообменна хроматография (Фармация, Моно £?Н2 5/5); след диализа срещу 25 мМ HEPES pH 7.3 се получават съответните кон югати, състоящи се от 0.33 мг анти-човешки
модифициран с 4 нмола полилизин 300 (молно съотношение 1:2).
б) Получаване на човешки-1оС - полилизин 300 - конюгат
Към разтвор на 19.5 мг (122 нмола) антитела (Сигма I4506) в 2 мл НВб се прибавят 39 мкл етанолов разтвор на сукцинимидил-пиридилдитио-пропионат (5РДР, Фармация). След 2.5 часа при стайна температура се филтрува през гелколона Сефадекс & 25 (елуент 100 мМ HEPES - буфер pH 7.9), при което се получа ват 19 мг (119 нмола) човешки-IjO, модифициран с 252 нмола пиридилдитиопропионатни остатъци. Еоли(Ъ)лизин 300 (средна сте пен на полимеризация от 300 лизинови остатъка; Сигма) по анало гичен начин се модифицира с БРДР и чрез третиране с дитиотре итол и последващо гелно филтруване се довежда до модифицирана форма със свободни меркаптогрупи. Разтвор на 119 нмола полилизин 300, модифициран с 282 нмола меркаптогрупи, в I мл HBS се смесва при отсъствие на кислород с гореспоменатия модифициран човешки- се оставя да престои една нощ при стайна температура. Към реакционната смес се прибавя 5 М натриев хлорид за да се получи 0.6 М съдържание на натриев хлорид. Изолирането на
- 143 конюгатите се извършва чрез йонообменна хроматография (Еоно$, »
Фармация) 50 мМ HEPES pH 7.3, солеви градиент 0.6 Е до 3 М натриев хлорид); след диализа срещу HBS pH 7.3 се получават съотмодифинирани с ветните конюгати.; състоящи се отгуО' нмола полилизин 300 9 мг (57 нмола) антитела (молно съотношение I : 1.6).
с ) Образуване на комплекси и трансфекция, Комплексите се получават.както следва.
Биотинилиран аденовирус 0I3I2 (30 мкл; Ю^частички в мл) в 50 мкл НВ5 се смесва със стрептавидин - полилизин (800 нг) в 100 мкл НВ$ ; след 30-минутно инкубиране се прибавя разтвор на 9 мкг pCMVL в 200 мкл НВЗ. След нови 30 минути се прибавя разтвор на 5.1 мкг полилизин (р!уг>450), 10.2 мкг TfpL , 12 мкг човешки-1д6-полилизин - конюгат или 10 мкг анти-човешки-1^-полилизин - конюгат в 150 мкл HBS. ДНК- комплексите се прибавят
Zкъм всеки 10° В-лимфобластоидни клетки (клетките се получават от човешки периферни мононуклОарни кръвни клетки чрез имортализиране с Епщайн Бар вирус,както е описано от Walls и Crawford, 19S9 , и се култивират в платки с 24 вдлъбнатини в I мл EPMI
1640 + 2 % ГС5); По-нататъшното разработване на клетъчната култура и луциферазните изпитания се провеждат,както беше вече описано в предишните опити. Получените стойности за генна експресия (луциферазна активност в светлинни единици) е дадена на фигура 45.
ПРИЕЕР 30.
ДНК -транспорт с трансферин-полилизин в присъствие на свободен и конюгиран риновирус
а) Риновирус HEV - 2 препарати
Риновирус HEV-2 се получава и пречиства,както е описано от
Skern et al., 1984.
- 144 400 мкл разтвор на риновирус (около 30 мкг) в НВЗ (150 λ
мМ натриев хлорид/5 мМ НЕРЕ5 pH 7.9)/10 % глицерин се третира с 10 нмола NH5 -LC-биотин (Пирс 21335). След три часа инкубиране при стайна температура вируса се отделя от невградениятбиотин чрез удължена диализа срещу НВ^О% глицерин при 4° С.
СвеАчувствителен риновирус, получен чрез култивиране нз вируса в присъствието на акридиново оранжево, се инактивира, както е описано ОТ Madshus et al., 1984.
б) Получаване на ДНК - комплекси и трансфекция
I) Трансферин-полилизин/ДНК комплекси се получават като разтвор на 6 мкг плазмид-ДНК pCMVL в 330 мкл ΗΒό (150 м!й натриев хлорид, 20 мМ НЕРЕ5 pH 7.3) се смесва с разтвор на 8 мкг Т|р1290 в 170 мкл НВ$. ДНК - комплексите се смесват с 1.5 мл среда (ДМЕМ + 2 % РС5) и с 0.14 мкг до 3.5 мкг риновирус HEV-2 (или инактивиран HEV-2). Сместа се разпределя като ΝΙΗ ЗТЗ-... клетки 300 000 клетки се поставят в 6 см блюдо. Четири часа покъсно трансфекционната среда се заменя с 4 мл прясна среда (ДН Ebi + 10 % РСЬ). Клетките се събират след 24 часа и се изследват за луциферазна активност, както по-рано беше вече описано (фигура 46А).
II) ДНК - комбинационни-комплекси, съдържащи трансферин полилизин- и риновирус-полилизин-конюгати,се получават както следва: 100 мкл разтвор от биотинилиран риновирус HEV-2 (3.5 мкг) в НВ$ се смесва с I мкг dtrpl в 100 мкл HBS ( другите вирусни концентрации се смесват със съответните части). След 30 минути при стайна температура разтворът се смесва с 6 мкг плазмид-ДНК в 150 мкл НВ^ инкубира се нови 30 минути при стай на температура и се смесва с 6 мкг Т^р1290 в 150 мкл НВ5. ДНК- комплексите се смесват с 1.5 мл среда (ДмЕк 4? 2 % PCS)
- 145 и се прибавя към NIH ЗТЗ - клетките (300 000 клетки за 6 мл блюдо). По-нататъшното обработване на културите и луциферазните изпитания се провеждат,както е описано в I) (фигура 46В).
ПРИМЕР 31.
Трансфекция на HeLa - клетки с комбинационни-комплекси, съдържащи йонно свързан аденовирус ,
Образуване на комплекси А): ДНК - комплексите се получават, като първоначално 30 мкл аденовирус 4I3I2 (около Ю9 РР1С&) се смесят с I мкг полилизин р!уеА50 (средна дължина на веригата *'·450 мономера) в 170 мкл HBs и след това към него се прибавя след престояване 30 минути при стайна температура 6 мкг pCMVI, ДНК в 170 мкл НВ5. След ново инкубиране с продължителност 30 минути комклексите се смесват с 9 мкг в I7D НВ5 .
Аликвотна част от комплексната смес (10 % = 50 мкл разтвор, 600 нг ДНК; или I % = 5 мкл разтвор, 60 нг ДНК) се разрежда в 1.5 мл ДмЕМ + 2 PCS и се прибавят 300 000 Hela - клетки. След 4 часа се прибавят 2 мл ДМЕМ + 20 % FC^· Събирането на клетките и луциферазните изпитания се провеждат ?както обикновено. Луциферазната активност„отговаряща на цялия екстракт,възлиза на 29.115.000 светлинни единици ( в случая на 600 нг ДНК) и 1.090.000 светлинни единици (при 60 нг ДНК).
Образуване на комплекси В) (контролен опит): ДНК -комплексите се получават,като първоначално 6 мкг рСМУЪ-ДНК в 170 мкл НВ5 се смеси с I мкг полилизин р!у$450 в 170 мкл HBS и след 30 минути при стайна температура се прибавят 9 мкг Т|рИ90 в 170 мкл HBS След инкубиране в продължение на нови 30 минути, към Комплексите се прибавят 30 мкл аденовирус 6I3I2 (около IO9 PPLLs). Аликвотна част от комплексната смес (10 % = 50 мкл разтвор, 600 нг ДНК; или I % = 5 мкл разтвор, 60 нг ДНК) се
- 146 разрежда в 1.5 мл ДМЕМ + 2 % FCSvl се прибавят 300 000 Hela а клетки. След 4 часа се прибавят 2 мл Д1ЛЕМ + 20 % ?С5. Прибирането на клетките и луциферазните определения се извършват,както обикновено. Луциферазната активност,отговаряща за цялостния екстракт?възлиза на 405 000 светлинни единици ( при 600 нг ДНК) и 200 светлинни единици (при 60 нг ДНК).
ПРИМЕР 32,
Локално поставяне на ДНК/аденовирус/трансферин-полилизинкомплекси в черен дроб на плъх.
а) Директно инжектиране
ДНК - комплексите се получават?както е описано в пример
19. Те съдържат 200 мкл аденовирус dI3I2, 6.4 мкг стрептавидинполилизин, 48 мкг pCMVL и 48 мкг Tf р!290 в общ обем от 2 000 .· мкл HBS. Мъжки Sprague-Dawley плъх (те лоно тегло 240 г) се анестезира с авертин и се прави 4-сантиметрова лапаротомия. Инжектирането на комплекса се извършва в продължение на 2 минути в левия страничен чернодробен дял. След това раната от лапоротомията се затваря пластово. Плъхът в състояние на наркоза, се убива 48 часа след инжектирането на комплексите и се измерва луциферазната експресия в различни проби от черния дроб. Показа се луциферазна активност от 5.615 светлинни единици/мг протеиново съдържание в хомогената от чер дроб в областта на мястото на инжектиране; Общата активност възлиза на 370 600 светлинни единици. На места от черния дроб, отдалечени от мястото на приложение на инжекцията, не се измерва никаква луциферазна активност.
б) Приложение на комплексите чрез жлъчната система в черния дроб.
Комплексите се получават по следния начин: 200 мкл биоти- 147 нилиран аденовирус dI3I2, разреден с 200 мкл ΗΒό се инкубират * при стайна температура в продължение на 30 минути с 6.4 мкг стерпетавидин-модифициран полилизин в 400 мкл НВ5. След това се прибавят 48 мкг pCMVL в 900 мкл НВ5. За приложението на комплексите се използват мъжки плъхове от горния вид (телесно тегло 250 г), анестезирани с аверитен и корема им се отваря с медиален разрез. Червата се изместват в лявата страна на тялото и в жлъчния път се въвежда 27 0 игла, свързана с маркуч и спринцовка от I мл. Инжектирането на комплексите продължава 4 минути. След това иглата се изтегля от жлъчния път и мястото на инжектиране се затваря с фибринова лепенка (Лмуно). Коремният разрез се затваря със шевове и метални аграфи. След 30 часа плъхът се убива и се изследват проби от различни места на черния дроб за луциферазна активност. Най-високите стойности за луциферазна активност възлизат на 19 000 светлинни единици за мг протеин; пресметнатата обща експресия на цялия черен дроб е от порядъка на 2.7 х 10 светлинни единици.
вена на опашката на мишки..
Комплексите се образуват, както е описано в пример 19. Те се състоят от 45 мкл аденовирус oll3I2, 0.8 мкг стрептавидин полилизин, 6 мкг р(ЖЬ и 24 мкг в общ обем от 150 мкл
НВ5. Комплексите се инжектират в опашката във вената на мъжка СЗН/Не мишка (възраст: 2 месеца) под наркоза с авертин. Непосредствено в края на инжектирането вената на опашката в проксималния и дистиналния си край се компримира, така че комплексният разтвор., през времето на компримиране (25 минути) да се задържи в отрязъка от вената на опашката и да не може да се отмие с
- 148 кръвта. 48 часа след инжектирането мишката се убива чрез цервикална дислокация и инжектираната вена на опашката се препарира. Експресията от луцифераза се измерва в хомогенат от отрязъка на вената на опашката. Получава се луциферазна активност от 2 600 светлинни единици/3 см вена от опашката.
ПРИМЕР 34,
Трансфекция от първични човешки меланомни клетки
а) Трансфекция с аденовирус - полилизин/трансферни полилизин - комбинационни комплекси
Първични меланомни клетки се изолират от хирургически отстранен меланом от пациент. За целта, туморът механично се раздробява в EEMI 1640 клетъчна културална среда с 5 % PCS 2мМ глутамин и добавка на антибиотик и частичките от тъканта се прекарват през метално сито. След това туморните клетки се промиват няколкократно чрез центрофугиране и наново суспендиране и се засяват в Т25 клетъчни културални стъкла. 24 часа след изолирането на туморните клетки следва трансфекция с тройни комплекси,състоящи се от: 3 мкл, 9 мкл или 27 мкл биотинилиран то аденовирус 6I3I2 (I х 10хс/мл), 0.5 мкг стрептавидин-полилизин, 6 миг pCMVL и 7 мкг Т|р1290 (в добавка на 27 мкл аденовирус:
I мкг стрептавидин - полилизин и 6 мкг в общ обем от
500 мкл HBS . 36 часа след трансфекцията клетките се събират и луциферазната активност (светлинни единици) се измерва (вж0 фигура 47; горната графа показва резултатите с клетки в суспензия, долната-с прикрепените клетки).
б) Трансфекция с аденовирус - полилизин/ниска плътност липопротеин - полилизин - комбинационни комплекси, I) Получаване на 1ДХ*- полилизин - конюгати
- 149 Разтвор от 10 мг (14.3 нмола) IflL (липопротеин с ниска плътност) Сигма, L- 2139, молекулно тегло 3 500 000, диаметър на частичките около 26 нм) в 2 мл НВ5 се смесва с 143 мкл 10 мМ етанолов разтвор на $РДР (1.43 мкмола; Фармация) и се оставят да реагират в продължение на два часа при стайна температура. След гелно филтруване през Сефадекс G25 колона (14 х 140 мм) с HBS се получават 3.2 мл разтвор на около 10 мг 1ДЬ, модифициран с 0.70 мкмола пиридилдитиопропионатни остатъци. Разтворът се смес ва с 1.2 мл 5 М натриев хлорид.за да може при следващото прибавяне на полилизин да не се получи утаяване, както· в противен случай ще настъпи. Поли(Ъ)лизин със средна дължина на веригата 300 мономера, се модифицира,както е описано с $РДР, третира се с дитиотреитол и гелно се филтрува,при което се довежда до модифицирана с меркаптогрупи форма. Гореописаният модифициран 1ДЪразтвор се смесва с разтвор от 0.33 мкмола полилизин 300, модифициран с 0.76 мкмола меркаптогрупи, в 4 мл 2 М натриев хлорид, 0.5 М HEPES , pH 7.9, в атмосфера на аргон и се оставя при стайна температура да престои 48 часа. Реакционният разтвор се разрежда със стерилна вода до 32 мл (концентрацшя на натриевия хлорид около 0.5 !.!) и се разделя чрез йонообменна хроматография (Биорад макропреп 5» Ю * Ιθθ мм» 20 мМ НЕРЕ$ pH 7.3, градиент от 0.2 - 3 М натриев хлорид). Фракциите от продукта елуират при концентрация на сол от 1.8 М - 2.2 М и се събират. След диализа срещу HBS се получават конюгати,състоящи се от 2.35 мг (3.4 нмола) БДЬ модифициран с 190 нмола полилизин (отговарящ на 7.5 мг на свободната форма полилизин - база). Това отговаря на средно модифициране на - частичките с около 55 полигизинови вериги.
II) Образуване на комплекси и трансфекция.
- 150 18 мкл Биотинилиран аденовирусен 6II3I2 препарат се разреждат с НВ6 до 100 мкл обем. 1.2 мкг стрепатавидин - полилизин се допълват до 100 мкл с НВ5 и се смесват с 100 - те мкл аденовирусен препарат. След 30 минути се прибавят 150 мкл НВ$ с 6 мкг pCMVL, След нови 30 минути се добавят 300 мкл HBS с 4 мкг 1ДХрЪ (полилизиново съдържание 20 мкг). Така полученият разтвор се смесва с 1.5 мл (10 % ?CS) и се прибавя към 3 х 10^ първични мелановми клетки (получени,както е описано в а) и означени с Hiiiiil и НШ), които се намират в клетъчно културално блюдо с 6 см диаметър. По-нататъшния ход на работа и луциферазните измервание се провеждат, както а описано под а). Генната експресия е дадена във фигура 48. А) показва резултатите с меланомни клетки ΗΜΜΙ, всички опити са проведени с AdpL-конюгати, които «А Г-.Ч не означени специално на фигурата. В) показва опитите с меланомните клетки НШД; всички опити са проведени с A dpi - конюгати, тези са отделно показани в последната колонка (означението d I3I2/I6 се отнася за специалния вирусен препарат). В дадените в колонка 2 опити, е приложен в 25 кратен излишък, в резултат на което, при съревнованието за IflL - рецептора, води до намаляване на гентрансферната ефициенция.
ПРИМЕР 35.
Трансфекция на първични човешки фибробласти
Биопсии от кожа на хора се поставят в 6 см петриево блюдо съдържащо ДМЕМ, 2 тлМ глутамин, 20 % PCS и антибиотик. След това биопсиите с помощта на хирургически нож се много надробяват и се култивират в присъствие на 3 мл среда в продължение на 5 дни. След това клетките се промиват с прясна среда (виж по-горе) и отново се отглеждат 7 дни. След този период от време клетките се трипсинизират и се субкултивират в ново петриево блюдо.
- 151 Когато клетките станат почти конфлуентни, те отново се трипси9 низират и до трансфекцията се замразяват. За трансфекзията клетките се размразяват, засаждат се в б см петриеви блюда и се отглеждат в ДМЕМ, съдържаща 2 мМ глутамин, 10 % PCS и антибиотик. Конюгатите за трансфекцията се получават по следния начин: 3 мкл, 10 мкл, 20 мкл и 30 мкл биотинилиран аденовирус dI3I2 се инкубират с 0.1 мкг, 0.3 мкг, 0.5 мкг и 0.8 мкг полилизин - модифистрептавидин в 150 мкл НВ$ минути при стайна темперациран тура. След това се прибавят 6 мкг от плазмида pCNiVgs -гал в 170 мкл НВ5 и сместа се инкубира нови се прибавят 7.8 мкг T-fpL за конюгатите с 3 мкл Ц1312, 7 мкг TfpL за 10 мкл dI3I2 и 6 мкг Т|р1 за конюгатите с 20 мкл и с 30 мкл dl3I2 в 170 мкг НВб. След инкубиране в продължение на минути, конюгатите се поставят върху клетките в 2 мл ДШ1, съдържаща 2 мм глутамин, 2 % РСЬ и антибиотик и клетките се инкубират 4 часа при 37° С. След това средата се отстранява и култерата се разработва при 37° С с ДмЕм, съдържащ 2 мк глутамин, 10 % PCS и антибиотик. След 48 часа се определя експресията на β -галактозидазата, както беше описано в предишните опити.
При трансфекция с 3 мкл dl3I2, 14 % от клетките показват J5 -галактозидазна продукция, при 10 мкл 31312 се получават 32 % позитивни клетки, с 20 мкл d!3I2 39 % и с 30 мкл dI3I2 64 % минути. В последния етап от клетките са позитивни.
ПРЮР 36»
Гентрансфер в епителни клетки от дихателни пътища на плъхове нахживо с помощта на комбинационни - комплекси, а) Получаване на T-j'pL/AdpL - комбинационни комплекси Човешки трансферни - полилизин - ДНК - комплекси (hT-fpL) се получават чрез комбинация на 8 мкг трансферин - полилизин
- 152 (Серва Биохемикъл) в 150 мкл НВ5 (150 мМ натриев хлорид/20 мм НЕРЕ5 pH 7.3) с б мкг pCkiVL - ДНК в 350 мкл НВ5 и се инкубират 30 минути при стайна температура. Аденовирус - полилизин конюгатите се получават,както е описано в пример 19 с),като се използва поораленДВ-инактивиран аденовирус. Комбинационнитекомплекси се получават съгласно преписанието в пример 23 с)
б) Прилагане на комплексите ин виво през интратрахиалния път
За тези опити се използват плъхове sigmodon hispidue, за които се е оказало, че представляват подходящ модел на животни за човешки аденовирусни белодробни заболявания ( Pacini et al., 1984)·. Животните се анестезират с метоксифлуран. След вертикален отвор на вентралната страна на врата се препарира въздушната тръба. Комплексите (250 до 300 мкл; 3 мкг плазмид-ДНК) се инжектират директно във въздушната тръба под ъгъл 45° на лежащите под наклон животни. Във времената посочени във фигура 49 след инжектирането, животните се убиват с С0£ и въздушната тръба, заедно с белия дроб веднага се преплакват със студен буфериран разтвор на натриев хлорид (PBS) и се заделят. За луциферазния тест, белодробната тъкан се хомогенизира в екстракционен буфер, лизатите се стандартизират по отношение на общо протеиново съдържание и се измерва по описания вече начин луциферазната експресия. Посочените светлинни единици се отнасят за 1.250 мкг общ протеин, получен от белодробните лизати. Опитите се провеждат в 3 и 4 - кратни повторения, резултатите са посочени като средни стойности - 5ЕМ.
ПРИМЕР 37.
Гентрансфер при използване на н&^вирусни ендозомолитни
- Σ53 средства,
а) Синтез на разпукващи мембраната пептиди.,
I) Синтез на пептиди:
Пептидите се синтезират върху автоматичен синтезатор (ABI 43IA) посредством твърд фазов, метод при използване на р-алкоксибенилалкохолна смола (0.97 ммола/г) като твърда фаза и Рмос-защитени аминокиселини. Карбокси-треминалната аминокиселиа се свързва към смолата чрез симетричния анхидрид. Следните аминокиселини се свързват посредством 1-хидроксибензотриазол-дициклсхексилкарбодиимид-ния метод. Използват се следните защитни групи за страничните вериги: (lrt).Aent (Trt)Gys /(t-Bu)Cys в слу· чай на EALA и GL?/» (t-Bu)Glu, (Trt)His, (t-Bii/Ser.
Пептидите имат следните последователности:
EALA:
(SEQ ID N0j5)
Trp
Glu
Ala
Ala
Leu
Ala
Glu
Ala
Leu
Ala
Glu Ala Leu Ala
Glu
His
Leu
Ala
Glu
Ala
Leu
Ala
Glu
Ala
Leu Glu Ala Leu
Ala
Ala
Gly
Gly
Ser
Cys
GL?
(SEQ ID N0:6).
Gly
Leu
Phe
Gly
Ala
Leu
Ala
Glu
Ala
Leu
Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu
Ala Glu Ala Leu. Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLP-II (SEQ ID N0:7) Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu
Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala
Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLP - delta (SBQ ID N0:8) Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
EALA - Inf (SEQ ID NO:$) Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly
- 154 Phe lie Glu Aan Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala
Glu Ala Leu. Glu Ala Leu Aj.a Ala Gly Gly Ser Cys
SALA-P50 (SEQ ID NO: 10) Gly Leu Phe Glu Ala He Glu Gly Phe lie Gli Aso Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cye
P5O (SEQ ID N0: 1.1) Gly Leu Phe Glu Ala He Glu Gly
Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met He Asp Gly Gly Gly Cys
Пептидите се отцепват от смолата и защитните групи на страничните вериги, с изключение на (тарц.-бутил)Суз, се отстраняват чрез третиране на 100 мг от пептид-натоварената твърда фаза с 3 мл смес от фенол/етандитиол/тиоанизил/вода/трифлуороцетна киселина в съотношение 0.75:0.25:0.5:0,5:10 в продължение на 1.5 часа при стайна температура. Суровите пептиди се утаяват с етер и се мият 2 пъти. S-терц.-бутил защитените пептиди ΕΑξΑ и GIP се разтварят в малък обем I Л триетиламониев бикарбонат (ТЕАВ) pH 8, разреждат се до 100 мМ ТЕАВ и по-нататък се пречистват чрез реверсивна фазова високоефективна течна хроматография върху нуклеозил 500 - 5С4 колона (0.1 % ТРА/ацетонитрилградиент), като и двата пептида елуират при около 50 % ацетонитрил. Свободната Суб - SH - форма на пептидите се получава, като от Тг±-Су5-пептидите се отстранят защитните групи по точно същия начин на описания по-горе. Суровите пептиди (5 мг) се разтварят в 100 мкл 100 M1Z ТЕАВ, pH 8, съдържащ I мкл β -меркаптоетанол и чрез гелно филтруване (Сефадекс G-25, 100 мМ ТЕАВ, 0.5 μϊ« ЕДТА) и сушене чрез замразяване или йонообменнарсроматография
- 155 (Моно 0. Фармация, 20 мМ HEPES, pH 7.3, градиент 0 до 3 М натриев хборид; пептида елуира при 1.5 М натриев хлорид) става пречистването.
II) Модифициране с Н-(хидроксиетил)малеимид,
С - крайната $Н-група на пептидите &1₽ - делта, СЪР - II, EAIA - инф, EAIA-P50, Р 50, след гелно филтруване (Сефадекс & 25, 20 мМ НЕРЕЬ, pH 7.3, 0.5 мМ ЕДТА) за освобождаване от свободната 5Н-форма, се блокира чрез взаимодействие с 1.3 до 10кратен излишък от Н-(хидроксиетил)малеимид (1час при стайна температура). Излишният малеимид се отстранява чрез гелно филтруване (Сефадекс G-25, 100 мМ ТЕАВ, pH 8) и пептидите (&IP делта-мал, CIP-II-мал, ЕАЬА-Инф-мал, ЕАЪА-Р50-мал, Р50-мал) се получават след сушене чрез замразяване като триетиламониеви соли.
III) Модифициране с 2,2’-дитиобиспиридин.
Свободните SH-пептиди се оставят да взаимодействат с 10 еквивалента 2,2 ’-дитиобиспиридин (20 мГА HEPEb, pH 7.9, 0.5 мЬЛ ЕДТА) една нощ при стайна температура. Излишният реактив се отстранява чрез гелно филтруване (Сефадекс 0-25, 100 мМ ТЕАВ, pH 8) или чрез йонообменна хроматография (Моно Q Фармация, 20 мМ HEPEs, pH 7.3, градиент 0 до 3 мола натриев хлорид; пептидзг елуира при 1.5 м натриев хлорид),при което се получават (2-пиридилтио)- Сув -пеПТиДйТе-1 (Gir-del^a-SSPy, GLF-If-SSfyy ’ ~ EALA-Inf-SSPy,EALA-P5O-SSPy, P5O-SSPy).
IV) Димеризиране на пептидите
Хомодимерът на Р50 (Р50 дим) се получавалкато се оставят да реагират в продължение на 3 дни при стайна температура еквимоларни количества от Р50-Су5-(2-пиридилтио) и Р50-Су^-51 в 20 мМ HEPES, pH 7.3. Реакционната смес се разделя върху Моно 0. ко
- 156 лона (HE-5/5 Фармация, 20 мм НЕРЕ6, pH 7.3, градиент 0.09 м до 3 М натриев хлорид; Р50-димера елуира при I.I м натриев хлорид). Хетеродимера G1P-S£-P5O се получава аналогично чрез взаимодействие на пептида Р50 (свободна меркапто форма) с пиридилтиомодифициран пептид G1P.
б) Изпитания за пропускливостта на липозомите
Способността на синтетичните пептиди да разпукват липозомите се измерва въз основа на излизането на флуоресцентно багрило от липозомите, които са натоварени с намаляваща концентрация от калцеин. Липозомите се получават чрез EEV-метода (reverse phase evapdfation) (Szoka u Papahadjopoulos, 1978) c водна фаза от 100 мм калцеин, 375 мМ Ма+, 50 мМ натриев хлорид, pH 7.3 и се екструдират през 100 нм поликарбонатен филтър (MacDonald et al., 1991)?за да се получи еднакво разпределение по големина на частичките. Липозомите се отделят от несвързания материал чрез гелно филтруване върху Сефадекс G-25 с изо-осмотичен буфер (200 мм натриев хлорид, 25 мк HEPES, pH 7.3). При изпитанията за пропускливост (ликаж) изходният разтвор се разрежда при различни pH стойности (6 мкл/мл) в 2 х изпитателен буфер (400 натриев хлорид, 40 мм натриев цитрат). Аликвотна част от 100 мкл се поставя към SO мкл от серийни разреждания на пептида във вода в микротитърна платка с 96 вдлъбнатини (крайна концентрация на липида: 25 мкМ) и след 30-минутно инкубиране при стайна температура и при 600 нм (възбуждане при 490 нм) се поставя върху микротитърни платки - флуоресцентен фотометър за изследване на калцеин флуоресценцията. Стойностите за 100 % ликаж се получава чрез прибавяне на I мкл от 10 %-ен разтвор на тритон Х-100. Ликажните единици се пресмятат като реципрочна стойност на пептидната концентрация, при която се наблюдава
- 157 50 % ликаж (т.е. обемът в мкл липозомен разтвор, които се лизират 50 % от мкг пептид). Стойностите под 20 единици се екстраполират. Резултатите от липозомните ликажни изпитания са дадени на фигура 50. 61Р и EAIA показват най-висога рН-специфичнн активност.
с) Еритроцитни - лизни - изпитания
Пресни човешки еритроцити се промиват няколкократно с НВ5 и отново се суспендират в 2 х изпитателен буфер с подходяща pH стойност (300 мМ натриев хлорид, 30 мМ натриев цитрат) при конп центрация от 6.6 х 10 /мл. Аликвотна част от 75 мкл се прибавя към 75 мкл серийно разреждане на пептида въ^в вода в микротитерна платка с 96 вдлъбнатини (конусен тип) и в продължение на един час при постоянна равномерно клатене се инкубира. След отстраняване на не*-лизираните еритроцити чрез центрофугиране (1000 об/мин, 5 мин) 100 мкл от горния слой се прехвърлят в нова микротитърна платка и се определя хемоглобинната абсорбция при 450 нм (основен коректор при 750 нм). 100 %-но лизиране се определя чрез прибавяне на I мкл 10 %-ен разтвор на тритон Х-100 преди центрофугирането. Хемолитичните единици се пресмятат като реципрочна стойност на пептидната концентрация, при която се наблюдава 50 %-ен ликаж (т.е. обемът в мкл на еритроцитния разтвор, които се лизират 50 % от мкг пептид). Стойностите под 3 хемолитични единици се екстраполират. Стойностите са посочени на фигура 51. От там е видно, че Р50 дим и EALA-P50 показват най-високата специфична от pH активност по отношение лизирането на клетки и/или по отношението на освобождаването на поголями молекули, като хемоглобин. Р50-мономерите Р50 и Р50
-Ру имат по-ниска активност. Мвлитин показва най-висока активност, която обаче не е специфична за кисели pH-стойности.
- 158 д) Получаване на ДНК - комбинационни комплекси
ДНК- комплексите се получават,като първоначално се смесят мкг pCMVL-ДНК в 150 мкл НВ5 с 4 мкг T-fpl290 в 150 мкл НВ<5 и след 30 минути при стайна температура се смесва с 4 до 20 мкг Ро1у(1/)лизин290 в 100 мкл НВ6. След нови 30 минути инкубиране при стайна температура се прибавят 0.3 до 30 мкг пептид в 100 мкл HBS и отново се инкубират 30 минути. Оптималното количество ендозомолитно средство се определя в предварителни опити, при което се измерва получената производителност на гентрансфер (виж таблица 3: гентрансфер в BNLCI.2 - клетки). Оказа се, че едновременното прибавяне на полилизин и ендозомолитно средство, както и използването на по-големи обеми за получаването на комплекси (1.5 мл крайен обем) дава сравними или по-добра трансфекционна ефициенция. При тези опити се установи също така, че и неипептидни амфипатичнйевещества дезоксихолова киселина и олеинова киселина усилват трансфера на ДНК.
е) Трансфекция на клетки
Адхерентни клетъчни линии (BNL CL.2 хепатоцити, съответно ΝΙΗ ЗТЗ-клетки)>се култивират I до 2 дни преди трансфекцията в б см блюда (ДИМ среда с 10 % PCS ; 300 000 клетки/блюдо). Средата се отстранява и се прибавят 1.5 мл ДИМ + 2 % PCS и 500 мкл ДНК - комплекси. Алтернативно се използват 0.5 мл ДИМ + б % FC5 и 1.5 мл ДНК - комплекси. След 4-часово инкубиране се прибавят 2 мкл ДМЕМ (18 % PCS). (Установено бе, че алтернативно средата може да се замени с 4 мл ДИМ с 10 % РСЗ). Събирането на клетките и луциферазните изпитания се провеждат.както вече беше описано 24 часа след трансфекцията. Показаните стойности за светлинните единици представляват цялостната луциферазна активност на трансфицираните клетки. Трансфекцията на
- 159 BNL CL.2 хепатоцити е показана на фигура 52.
Фигура 52А: ДНК - комплексите се получават,като първона чално се смесват 6 мкг рСЛЬ - ДНК в 250 мкл НВ£> с 4 мкг в 250 мкл НВ$и след тоза, след 30 минути при стайна температура, се прибавят 20 мкг поли(Ъ)лизин29О в 750 мкл HBS След нови 30 минути инкубиране при стайна температура се прибавят посочените количества пептиди в 250 мкл НВ§. След ново инкубиране от 30 минути се прибавят към комплексите 0.5 мл ДЬЖ плюс 6 % PCS и се прибавят 450 000 клетки.
Фигура 52 В: ДНК-комплексите се получават,като първоначално се смесват 6 мкг рСЬППгДНК в 500 мкл НВ$ с 4 мкг Т^р1290 в 250 мкл HBS и се оставят да престоят 30 минути при стайна температура. 500 мкл разтвор на 20 мкг поли(Ь)лизин290 в НВ5 се.смесва с посочените количества пептиди в 250 мкл НВ5 и веднага се прибавя към сместа. След нови 30 минути ин· кубиране при стайна температура към комплексите се прибавят 0.5 мл ДмЕМ + 6 % PCs и се прибавя към 450 000 клетки. Клетките се събират след 24 часа след трансфекцията и определянето на луциферазната активност се извършва по описания по-рано начин.
Проведените с ШН ЗТЗ - клетки опити са отразени на фигура 53. Получаването на комплексите А) и В) е същото, както при трансфекцията на BI!L CI-2 - клетки.
При тези експерименти с клетъчни култури, пептидите Р50 д дим и EALA-P50 показват най-висока активност, EAIA и &LP имат средна активност, докато Р50-мономерите и мелитин имат ниска активност.
ПРШР 38.
Гентрансфер при използване на синтетичен не^вирусен пептид с олиголизин-удължение в С-края ,
- 160 Пептид от последователността (SEQ ID N0:4). Met Ala Gin Asp lie He Ser Thr lie Gly Asp Leu Val Lys Trp lie He Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lye се синтезира по метода«описан в предишния пример,и също така се пречиства. Този пептид е отведен от Staphylococcus aurens & - toxin (Seq
ID NO: 3:) Met Ala Gin Asp He He Ser Thr lie Gly Asp
Leu Val Lys Trp He lie Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys за който е известно, че е специфичен за проникване през мембрани при кисела pH-стойност, като този пептид е удължен с 10 допълнителни лизина.
ДНК - комплексите се получават,като първоначално се смесват 6 мкг pCmVL - ДНК в 170 мкл HBS и 4 мкг Т^р1290 в 170 мкл НВ5 и след 50 минути при стайна температура се придабят около 3 мкг пептид в 170 мкл НВ5. След нови 30 минути инкубиране при стайна температура, комплексите се смесват с 1.5 мл ДМЕМ + 2 % PCS и се прибавят 450 000 BML CL.2 хепатоцити. След 2 часа се прибавят 2 мл ДМЕМ + 20 % ГС5. След 24 часа след трансфекцията се събират клетките и се измерва луциферазната активност по начин,описан в предишните примери. Луциферазната активност се отнася за цялостния екстракт и възлиза на 481.000 светлинни единици.
ПРИМЕР 39*
Трансфекция на хепатоцити в присъствие на мелитин-пептиди с олиголизинова опашка в С - края /
Пептиди от последователностите (Посока: Ν- към С-край) (SEQ ID N0: 12) Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr
Gly Leu Pro Ala Leu Ila Ser Trp lie Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (означена като
- 161 mel 1)
И (SEQ ID NO: 13) Gly He Sly Ala Vai Leu Glu Vai Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu He Ser Trp lie Lys Arg Lye Arg Gin Gin Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
Λ (кисели мутанти, означени като mel 2) се синтезират, както е описано в пример 38.
ДНК - комплексите се получават, като първоначално се смесят 6 мкг pCMVL - ДНК в 170 мкл НВ5 с 4 мкг Т^р1290 в 170 мкл HBS и след 30 минути при стайна температура се прибавят около мкг пептид мел1или 5 мкг мел 2 в 170 мкл НВ5. След ново инкубиране в продължение на 30 минути компелксите се смесват с
1.5 мл ДмЕк; + 2 % PCS и 450 000 BNL CL.2 клетки, които са култивирани, както е описано в пример 38, се прибавят към горното. 24 часа след трансфекцията клетките се събират и се подлагат на луциферазен тест, както вече беше описано. Луцифераз1ната активност, отнасяща се за цялия екстракт, възлиза на 9,200 светлинни единици (в случая на мел1) и 9 400 светлинни единици (в случай на мел 2).
ПРЖЕР 40,
Експресиране на интерферон алфа в Hela - клетки
Hela - клетки (5 х 10^ клетки за 6 см брюдо) се трансфицират с плазмида рАД—CI.1VI—1ТЪ1, който кодира за човешки интерферон алфа2с под контрола на CMV енхансер/промотор - последователността (плазмидът е описан в ДЕ 40 21 917 А. рАД-СЖ-1РН се получава^като се реклонира Hindill-xbal ifn-c<2c инсерат в рАД-CMVI). Към проби от 6 мкг ДНК в 330 мкл НВ5 се прибавят 8 мкг Т-^pI/ в 330 мкл HBS и се оставят да престоят 30 минути при стайна температура. Пробите б - 10 получават само мкг TfpLn след първите 30 минути инкубиране към пробите 6
- 162 - и 7 се прибавя по аликвотна част PI6pL (20 мкг) в 160 мкл HBS, а към пробите 8, 9 и 10 по аликвотна част от ply5 290 (20 мкг). След нови 30 минути инкубиране, се прибавят аликвотни части от 160 мкл НВ , съдържащи 10 мкл (проба 8) или 50 мкл (проби 9 и 10) свободен PI6, (за синтезата на PI6 и Р16рЬвиж пример 13). След 30-минутно инкубиране пробите се нанасят върху НеХа - клетки в 2 мл ДМЕМ/2 % PCS в присъствие на следните допълнителни компоненти: Пробите 2, 7 и 10 получават 100 мкМ хлорохин, прота бите 3 и 4 получават 5 и 15 мкл аденовирус dI3I2 (I х 10 с частички/мл), проба 5 получава 15 мкл от същия псорален-инактивиран вирус. (Като контрола за стимулирането на ендогенна интерферон-продукция чрез аденовирус, пробите II, 12 и 13 се третират с аликвотни части от вируса,както в примерите 3, 4 и 5). Два часа след трансфекцията се прибавят 5 мл прясна среда ДЩ плюс 10 % РС> към клетките. 48 часа след трансфекцията средата се отстранява и се заменя с 2 мл прясна ДШ + 10 % PCS . Тази среда се събира 72 часа след трансфекцията и се провежда ELISAтест за определяне на IPN -с< , както е описано в ДЕ 40 21 917 А. Количествата IPN - с< (в нг/мл) са посочени във фигура 54.
В съгласие с по-рано напразените наблюдения, при използване на луцифераза- или β -галактозидаза- репортерни гени, T^.pL функционира слабо при трансфер на 1₽М - гена в тези клетки. / Присъствието на хлорохин дава доказуем сигнал (около 7 нг/мл) проба 2, аденовирус oiI3I2 стимулира ДНК - трансфера по начин зависещ от дозировката (проби 3 и 4). Третирането на тези клетки със сравнителни количества вирус в отсъствие на 1ГМ-ДНК комплекси не дава доказуем IFN - сигнал (проби II и 12). Трансфекцията със синтетичния, от инфлуенцапептид отведен ендозомолитен пептид PI6 (виж пример 13) като конюгат (проби 6 и
- 163 7) или като йонно на повърхността на Т|РЬ/ДНК - комплексите свързан пептид (проби 8, 9 и 10, за свързването на пептида виж пример 37) дава доказуема интерферонова продукция, която се усилва с пептидния конюгат в присъствие на хлорохин (проба 7).
- 164 -
Таблица ΙΑ Трансфекционни методи
Клетъчен тип TfpL T|pL +
комплекс : (А.) хлорохин (А.)
хепатоцити
HepG2 - +/-
BN МС 12 - +/-
първични - -
миобласти/миотуби
C2CI2 +/-
G8 +/-
фибробласти
ЗТЗ +
Μον -13 +/- +/-
миши 1гклетки +/- +
първични ендотелни клетки
свинска аорта +/-
Човешка неуробластомна клетъчна линия
GI-ME-M +/- +/-
HeLa клетки + +
- 165 Таблица ΙΑ (продължение)
Трансфекционни методи
Клетъчен тип T-fpL + свобо- ден аденовирус TfpL + свър- зан аденовирус TfpL· инфлу· Р1У5
комплекс (В.) (Е.) (₽.)
хепатоцити
Нер&2 +++
BKL.CI2 ++++ +++++ +++
първични - ++
миобласти/миотуби
C2CI2 +/- +++++
38 +/- +++++
първични +++
фибробласти
ЗТЗ +++ +++++ ++
Мо\а13 +++++ +
миши Ь-клетки + +++++ ++
първични ++++
ендотелни клетки
свинска аорта + +++ +/“
човешка неуробластомна клетъчна линия
M-ME-N +++ ++++
HeLa клетки +++++ +++++ +++
- 166 Таблица IB
Миши Е5 клетки
ССЕ +/-
Вгисе 4 +/-
еритроидни клетки
К562 - ++++
птичи НДЗ ++ ++++
костен мозък
мишка -
пиле +/-
EBV - трансформирани
човешки В-клетки - -
миша-плазмена клетъч-
на линия (МРСП.ЬР2/0 +
- 167 Таблица миши Е 5 клетки
ССЕ
Вгцсе 4 еритроидни клетки
К562 пилешки НДЕ костен мозък мишка пиле
EBV-т ра нсфо рмирани човешки В-клетки миша-плазмена клетъчна линия (МРСПЛР2/0
IB (продължение)
+ ++ ++
++ +++
+ +++++ +
+++ +++++
- ++
+ +++
- +++ +
++ +++
+/- луциферазна активност +
++ +++ ++++ +++++ повече от
1000-00 000 светлинни единици за 10 клетки
000-10° светлинни единици
1-5 х 10° светлинни единици
5-50 х 10° светлинни единици
- 00 х 10° светлинни единици с
100 х 10 светлинни единици
TfpL трансферин-полилизин аденовирус репликационно дефектен аденовирус dI3I2
Инфлу-рЪу^ инфлуенца НА-2 Х-краен пептид-полилизин
- 168 Таблица 2 A мембранактивни протеини
Вирусни фузионни протеини
Η-крайна фузионна последователност
Вируси с обвивка
Influenzavirus Myxoviridae HA 2 pH 4 White,1990; Takaha- shi, 1990
VSV Rhabdoviridae G pH' 5 Hoekstra, 1990
Vacciniavirus 14 kDa pH 5 Gong et al., 1990
Sendaivirus Parainfl uenzav. ./1 pH 7 Hoekstra 19901
Getning et al., 1978
морбили вирус Para inf1uenzav < pH 7 Takahashi, 1990
HIV Retroviridae gp41 PH 7 Slepushkin et al.,
1992
SIV Rerroviridae gp41 PH 7 Ruysschaert u. Vanden-
branden, 1991;
Franchini, 1989
Вируси без обвивка
Poliovirus Enteroviridae vp1 pH 5 /ricks u Hogle, 1990
Coxackievirus Enteroviridae vp1 pH 5 Getting et al.,1978
Rhinovirus vp1 pH 5
Вътрешна фузионнц последователност Вируси с обвивка
Semliki Forest V. Togaviridae Е1
Sindbisvirus pH 5 White, 1990
White, 1990
Вируси без обвивка
Rhesus Rotavirus vp5
Mackow et al., 1988
- 163 Таблица 2В
Токсини и микроорганизми
Streptolysin 0 Streptococcus 69 kDa pH 7 Kehoe et al., 1987 сулфхидрил-активиран свързва се c холестерин пори
20-80mer, 15 nm Poren
Listeriolysin 0 L.monocytogenes 60kDa pH 5 Geoffroy et al., 1 сулфхидрил-активиран 1987 свързва се c холестерин сроден с С9 и стрептолизин токсин Staphylococcus амфипатична повърхност
-sheet структура, хексамерни връзки nm пори
Хемолизин Е. colt amphip. Helixes
Хемолизин Trypanosoma cruzi аналогия c перфорини сроден с С9
Имунна система на гръбначни
Perforin ц
Са^+-зависещи
Membraninsertion
Complement С9 (МАС С5Ь, 91-4);
кух протеинов цилиндър нм канал високо- регулирана активност kDa pH 7
416 ΑΛ pH. 7 Oropeza-Werkerle et al., 1992 kDa pH 5 Andrews et al.,
1990 итотоксични Т-клетки
Bhakdi u TranumJensen, 1991
Esser,1991
- 170 Таблица 2 В (продължение) speimium -яйчев-фузионен протеин
РН-30 о(-подединица на pH 7 Blobel et al., повърхностния протеин, 1992 вътрешна фузионна последователност
- 171 Таблица 2 С
Мембранактивни пептиди
Защитни токсини
2бАА amph. -Helix
Melittin пчелна отрова
Pro- усукан
Bombolitin отрова на замна
Mastoparan отрова на оса
Crabrolin отрова на стършел
Pardaxin
17АА amph.c< -Helix пчела
14АА amph. -Helij
13АА amph. cZ-Helix
33AA amph. (X-Helix
Blondelle u. Houghten, 1991; Dempsey et al., 1991; Ikura u. Inagaki 1991
Argiolas u Pisano,
1985
Argiolas u Pisano,
1985
Argiolas u Pisano,
1985
Shai et al., 1990 репелент за акули
Антибактериални пептиди
Sarcotoxin ΙΑ месна муха (в хемолимфи)
Cecropins 37АА amph. ex -Helix инсекти Pro- усукан (хуморална имунна система, копринен молец)
Maganin 23АА amph. «X-Helix Marion et al.,
Esser, 1991 кожен Xenopus leavis 1988
Alameticin 15-24AA amph. ¢/-Helix Esser, 1991
Fungus (Trichoderma viride) ίχ-амино-масБактериални токсини δ*- Toxin лена киселина
2бАА amph. \-Helix Thiaudiere et al,,
1991;
- 172 Таблица 2 С (продължение)
Staphylococcus aurens киселинно индуциран Alouf et al.,
1989
Amoеbaрог
25AA amph· c\-He lix Leippe et al.,
1991
Entamoeba histolytica киселинно индуциран
Имунна система на гръбначни
Defensine 29-34АА β-sheet
Lehrer et al..
многоядрени неутрофили (ss-мост)
1991
- 173 Tab. 3
Таблица 3
Трансфекция на
Transfektion von BNL CL.2 (6 pg pCMV-L DNA, 4 pg TfpL29O)
pLys 0 pg 0.3 pg 1 И9 3 pg 10 pg 20 pg 30 pg
o pg P50cfim GLF Meiittin 160 330 490 0 540 290 0 300 340 0 70 425
4 pg P50 dim GLF EALA 3 100 670 3 140 200 600 150 430 170 560 180 410
10 pg P50dim GLF EALA 5 700 1 950 2 120 16 600 16 800 217 000 179 300 760 215 000 181 700 1 330 1 980 76 360 3 424 800
20 pg P50 dim GLF EALA MelGttin 3 200 23 300 418 400 191 000 6 545 185 100 320 500 181 000 7 054 800 294 200 273 600 9 344 000
DesoxycboSc add 6 730 34 700 16 000 •
Oleic add 12 200 11 900 4 100
- 174 -

Claims (117)

1. Състав за трансфекция на по-висши еукариотни клетки с комплекс от нуклеинова киселина и вещество с афинитет към нуклеиновата киселина, което е незадължително конюгирано с интернализиращ фактор за тези клетки, характеризиращ се с това, че съдържа средство, което притежава способността или per se или като съставка на нуклеинова киселина - комплекса, да се приема от клетките, които ще се трансфектират, и съдържанието на ендозомите, в които комплексът след навлизането в клетките се локализира, да се освободи в цитоплазмата.
2. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус или вирусна компонента, който съответно по начало е интернализиращ фактор per se за клетките.
3. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство има свързващ нуклеинова киселина домен или е свързано към вещество с афинитет към нуклеинова киселина и проявява способността като съставка на конюгат/нуклеинова киселина - комплекса да се приема от клетките, при което комплексът съдържа незадължително допълнителен интернализиращ фактор за клетките.
4. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е свързано ковалентно към вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
5. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е свързано нековалентно към веществото с афинитет към нуклеинова киселина.
6. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че връзката се осъществява чрез биотин - стрептавидинов мост.
7. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че свързването
- 175 - е йонно.
8. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че ендозомотиличното средство е свързано към веществото с афинитет към нуклеинова киселина директно чрез свързващ нуклеинова киселина домен.
9. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус или вирусна компонента.
10. Състав съгласно претенции 2 или 9, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е аденовирус.
11. Състав съгласно претенция 10. характеризиращ се с това, че аденовирусът е мутант.
12. Състав съгласно претенция 11. характеризиращ се с това, че аденовирусът е репликационно инкомпетентен мутант.
13. Състав съгласно претенция 12. характеризиращ се с това, че аденовирусът има една или повече мутации и/или делеции в EIA - региона.
14. Състав съгласно претенция 10. характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран.
15. Състав съгласно претенция 14. характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез късовълнови ултравиолетови лъчи.
16. Състав съгласно претенция 14. характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез ултравиолет/ псорален.
17. Състав съгласно претенция 14. характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез формалдехид.
18. Състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вирусната компонента се състои от един или повече аденовирусни протеини.
19. Състав съгласно претенция 2 или 9, характеризиращ се с това, че вирусът е пикорнавирус.
20. Състав съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че пикорнавирусът е незадължително инактивиран риновирус.
21. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че
- 176 - ендозомолитичното средство не е per se интернализиращ фактор за клетките и че нуклекиселинният комплекс съдържа освен това интернализиращ фактор за тази клетка, който е свързан към вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
22. Състав съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус или вирусна компонента, които съответно не са интернализиращ фактор за човешка клетка.
23. Състав съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус, който е инфекциозен за вид, различен от човека.
24. Състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че вирусът е аденовирус.
25. Състав съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че аденовирусът е птичи аденовирус.
26. Състав съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че аденовирусът е летален Orphan Virus от пилешки ембрион.
27. Състав съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е евентуално модифициран, ендозомолитичен вирусен пептид.
28. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че ендозомолитичният пептид е грипен хемаглутинин НА2 пептид.
29. Състав съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-GlyTrp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
30. Състав съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-GlyTrp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
31. Състав съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е невирусно и е незадължително модифициран при
- 177 - роден или синтетичен пептид.
32. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че пептидът притежава последователността Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-GluAsn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
33. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че пептидът представлява хомо- или хетеродимер на определения в претенция 32 пептид.
34. Състав съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че пептидът е хомодимер.
35. Състав съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че пептидът е хетеродимер с последователността Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Glu-Gly-PheIle-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
36. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че пептидът притежава последователността Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
37. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че пептидът притежава последователността Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
38. Състав съгласно претенция 27 или 31, характеризиращ се с това, че пептидът притежава нуклеинова киселина - свързващ домен.
39. Състав съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че пептидът има олиголизиново удължение.
40. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е трансферни.
41. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е лиганд за Т - клетки.
42. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че
- 178 - интернализиращият фактор е лиганд за В - клетки.
43. Състав съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е имуноглобулин.
44. Състава съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че лигандът е анти-имуноглобулин.
45. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е лиганд за хепатоцити.
46. Състав съгласно претенция 45. характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е лиганд за азиалогликопротеиновия рецептор.
47. Състав съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е тетрагалактоза-полилизин.
48. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е лектин.
49. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ се с това, че интернализиращият фактор е липопротеин с ниска плътност.
50. Комплекс като съставка на състав съгласно една от претенциите 3 до 49, характеризиращ се с това, че съдържа една или повече за експримиране в клетката нуклеинови киселини, ендозомолитично средство, което само по себе си има нуклеинова киселина-свързваш домен или е свързано към вещество с афинитет към нуклеинова киселина и евентуално освен това интернализиращ фактор, който е свързан към вешество с афинитет към нуклеинова киселина.
51. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че съдържа лечебноактивна нуклеинова киселина.
52. Комплекс съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина се състои от една или повече гентерапевтично действащи ДНК - молекули.
53. Комплекс съгласно претенция 52. характеризиращ се с това, че ДНК - молекулите кодират цитокини.
- 179 -
54. Комплекс съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина съдържа нуклеотидна последователност, от която се транскрибират РНК - молекули, които специфично инхибират клетъчни функции.
55. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се това, че веществото с афинитет към нуклеинова киселина е органичен поликатион.
56. Комплекс съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че поликатионът е полилизин.
57. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство и интернализиращият фактор са свързани и двата са свързани към една и съща субстанция с афинитет към нуклеинова киселина.
58. Комплекс съгласно претенция 57, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство и интернализиращият фактор са свързани към полилизин.
59. Комплекс съгласно претенция 58, характеризиращ се с това, че съдържа и нековалентно свързан полилизин.
60. Конюгант като съставка на комплекс съгласно една от претенциите 50 до 59, характеризиращ се с това, че конюгатьт се състои от ендозомолитично средство и от вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
61. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е свързано ковалентно към вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
62. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е свързано нековалентно към вещество с афинитет към нуклеинова киселина.
63. Конюгат съгласно претениця 62, характеризиращ се с това, че свързването се осъществява чрез биотин-стрептавидинов мост.
64. Конюгат съгласно претенция 62, характеризиращ се с това, че
- 180 - свързването е йонно.
65. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус или вирусна компонента.
66. Конюгат съгласно претенция 65, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е аденовирус.
67. Конюгат съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че аденовирусът е мутант.
68. Конюгат съгласно претенция 67, характеризиращ се с това, че аденовирусът е репликационно инкомпетентен мутант.
69. Конюгат съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че аденовирусът има една или повече мутации и/или делеции в EIA- региона.
70. Конюгат съгласно претенция 66, характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран.
71. Конюгат съгласно претенция 70, характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез късовълнови ултравиолетови лъчи.
72. Конюгат съгласно претенция 70, характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез ултравиолет/псорален.
73. Конюгат съгласно претенция 70, характеризиращ се с това, че аденовирусът е инактивиран чрез формалдехид.
74. Конюгат съгласно претенция 65, характеризиращ се с това, че вирусната компонента се състои от един или повече аденовирусни протеини.
75. Конюгат съгласно претенция 65, характеризиращ се с това, че вирусът е пикорнавирус.
76. Конюгат съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че вирусът е евентуално инактивиран риновирус.
77. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство не е per se интернализиращ фактор за подлежащата за транфектиране клетка.
78. Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се с това, че
- 181 - ендозомолитичното средство е вирус или вирусен компонент, който съответно не е интернализиращ фактор за човешка клетка.
79. Конюгат съгласно претенция 78, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е вирус, който е инфекциозен за вид, различен от човека.
80. Конюгат съгласно претенция 79, характеризиращ се с това, че вирусът е аденовирус.
81. Конюгат съгласно претенция 80, характеризиращ се с това, че аденовирусът е птичи аденовирус.
82. Конюгат съгласно претенция 81, характеризиращ се с това, че аденовирусът е летален Orphan вирус от пилешки ембрион.
83. Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е евентуално модифициран ендозомолитичен вирусен пептид.
84. Конюгат съгласно претенция 83, характеризиращ се с това, че ендозомолитичният пептид е грипен-хемаглутинин НА2-пептид.
85. Конюгат съгласно претенция 84, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Gly Leu Phe Glu Ala lie Ala Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met He Asp Gly Gly Gly Cys.
86. Конюгат съгласно претенция 84, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe lie Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met He Asp Gly Gly Gly Cys.
87. Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се с това, че ендозомолитичното средство е невирусен, евентуално модифициран природен или синтетичен пептид.
88. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се с това, че пептидът притежава последователността Gly Leu Phe Glu Ala He Glu Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met lie Asp Gly Gly Gly Cys.
89. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се с това, че пепти
- 182 - дът е хомо- или хетеродимер на дефинирания в претенция 88 пептид.
90. Конюгат съгласно претенция 89, характеризиращ се с това, че пептидът е хомодимер.
91. Конюгат съгласно претенция 89, характеризиращ се с това, че пептидът е хетеродимер и че притежава последователността Gly Leu Phe Glu Ala lie Glu Gly Phe lie Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
92. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
93. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се с това, че пептидът има последователността Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys.
94. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се с това, че пиптидът има свързващ нуклеинова киселина домен.
95. Конюгат съгласно претенция 94, характеризиращ се с това, че пептидът притежава олиголизиново удължение.
96. Ендозомолитичен пептид, подходящ за включване в състав съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че представлява изкуствен пептид и че има ендозомолитичен домен и нуклеинова киселина-свързващ домен.
97. Пептид съгласно претенция 96, характеризиращ се с това, че свързващият нуклеиновата киселина домен представлява олиголизиново удължение.
98. Метод за получаване на конюгат съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че вирус или (поли)пептидно ендозомолитично средство и полиамин се свързват ензимно в присъствието на трансглутаминаза.
99. Метод за получаване на конюгат съгласно претенция 61, характе
- 183 - ризиращ се с това, че вирус или (поли) пептидно ендозомолитично средство и полиамин се свързват химически.
100. Метод за получаване на конюгат съгласно претенция 62, характеризиращ се с това, че вирус или вирусна компонента се модифицира от биотин и се свързва към стрептавидин свързан полиамин.
101. Метод за въвеждане на нуклеинова киселина в по-висши еукариотни клетки, характеризиращ се с това, че клетките се третират със състав съгласно претенции 1 до 49.
102. Метод съгласно претенция 101, характеризиращ се с това, че клетките са човешки клетки.
103. Метод съгласно претенция 102, характеризиращ с се това, че клетките са ту морни клетки.
104. Метод съгласно претенция 102, характеризиращ се с това, че клетките са миобласти.
105. Метод съгласно претенция 102, характеризиращ се с това, че клетките са фибробласти.
106. Метод съгласно претенция 102, характеризиращ се с това, че клетките са хепатоцити.
107. Метод съгласно претенция 102, характеризиращ се с това, че клетките са ендотелни клетки.
108. Метод съгласно претенция 107, характеризиращ се с това, че клетките са от дихателните пътища.
109. Метод съгласно една от претенциите от 101 до 108, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина в състава е гентерапевтично активна.
110. Метод съгласно претенции 103 и 109, характеризиращ се с това, че туморните клетки се третират със състава наживо и че ДНК кодира една или повече имуномодулиращи субстанции, предимно цикотини.
111. Метод за получаване на хетероложен протеин е по-висша еукариотна клетка, характеризиращ се с това, че клетката се третира със състав съгласно
- 184 - претенция 1, при което нуклеиновата киселина съдържа ДНК последователност, която кодира желания протеин, клетките се култивират при условия, подходящи за експресирането на протеина, и протеинът се изолира.
112. Фармацевтичен препарат, съдържащ състав съгласно една от претенциите от 1 до 49, съдържащ терапевтично активна нуклеинова киселина и фармацевтично приемлив носител.
113. Трансфектиращ комплект, съдържащ носещо устройство, в което се намират два или повече съда, при което в единия съд се намира вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което евентуално е свързано към интернализиращ фактор за по-висша еукариотна клетка, и втори съд, в който има средство, което притежава способността поначало да прониква в по-висши еукариотни клетки и да освобождава съдържанието на ендозомите в цитоплазмата.
114. Трансфектиращ комплект, съдържащ носещо устройство, в което се намират два или повече съда, при което в първия съд се съдържа вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което е евентуално свързано към интернализиращ фактор за по-висша еукариотна клетка, и втори съд, който съдържа вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което е свързано към средство, притежаващо способността като съставка на комплекс на нуклеинова киселина да прониква в по-висши еукариотни клетки и да освобождава съдържанието на ендозомите в цитоплазмата.
115. Трансфектиращ комплект съгласно претенция 114, характеризиращ се с това, че в първия съд се съдържа трансглутаминаза-свързан аденовирусполилизин - конюгат.
116. Трансфектиращ комплект, съдържащ носещо устройство, в което се намират два или повече съда, при което в първия съд се съдържа биотинмодифицирано ендозомолитно средство, и втори съд, в който се намира вещество с афинитет към стрептавидин-модифицирана нуклеинова киселина.
- 185 -
117. Трансфектиращ комплект съгласно претенция 116, характеризиращ се с това, че в първия съд се съдържа биотинилиран аденовирус, а във втори съд се намира стрептавидин-полилизин.
BG98718A 1991-09-30 1994-04-14 Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки BG62740B1 (bg)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02
PCT/EP1992/002234 WO1993007283A1 (de) 1991-09-30 1992-09-28 Zusammensetzung für das einbringen von nukleinsäure-komplexen in höhere eukaryotische zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98718A BG98718A (bg) 1995-02-28
BG62740B1 true BG62740B1 (bg) 2000-06-30

Family

ID=27560281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98718A BG62740B1 (bg) 1991-09-30 1994-04-14 Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (bg)
EP (2) EP0545016A1 (bg)
JP (1) JPH10506001A (bg)
CN (1) CN1059705C (bg)
AT (1) ATE215990T1 (bg)
AU (1) AU671084B2 (bg)
BG (1) BG62740B1 (bg)
BR (1) BR9206559A (bg)
CA (1) CA2118816C (bg)
CZ (1) CZ293141B6 (bg)
DE (1) DE59209951D1 (bg)
DK (1) DK0607206T3 (bg)
EE (1) EE03195B1 (bg)
ES (1) ES2173083T3 (bg)
FI (1) FI941474A0 (bg)
HK (1) HK1013104A1 (bg)
HU (2) HU218846B (bg)
IL (1) IL103171A (bg)
MX (1) MX9205543A (bg)
NO (1) NO316744B1 (bg)
NZ (1) NZ244306A (bg)
PL (1) PL180304B1 (bg)
PT (1) PT607206E (bg)
RO (1) RO117861B1 (bg)
SG (1) SG44680A1 (bg)
SI (1) SI9200236B (bg)
SK (1) SK281682B6 (bg)
WO (1) WO1993007283A1 (bg)

Families Citing this family (419)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
AU671450B2 (en) * 1992-03-20 1996-08-29 Baylor College Of Medicine A DNA transporter system and method of use
WO1993019768A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
CN1119459A (zh) * 1993-03-19 1996-03-27 柏伦格-英格尔海姆国际股份公司 肿瘤疫苗的制备方法
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
US5578475A (en) * 1993-07-12 1996-11-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
AU2194895A (en) * 1994-03-25 1995-10-17 Uab Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
AU709148B2 (en) 1994-05-30 1999-08-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for introducing foreign matter into higher eukaryotic cells
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US6465253B1 (en) * 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
WO1996010089A1 (fr) * 1994-09-29 1996-04-04 Ajinomoto Co., Inc. Modification d'un peptide et d'une proteine
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
EP0817858B1 (en) * 1995-03-09 2003-04-23 Austrian Nordic Biotherapeutics AG Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
JPH11506722A (ja) * 1995-06-07 1999-06-15 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体
JP4338106B2 (ja) * 1995-06-07 2009-10-07 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ペプチド増強カチオン脂質トランスフェクション
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
DK0833934T4 (da) * 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) * 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2190304A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Elazar Rabbani Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
JP4512882B2 (ja) * 1996-02-09 2010-07-28 チェング ピー―ワン 受容体リガンドにより促進される生物活性分子の送達
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
CA2248538A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
JP4320054B2 (ja) 1996-08-13 2009-08-26 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU5729898A (en) * 1996-12-18 1998-07-15 Emory University Polycationic oligomers
ES2355588T3 (es) * 1997-03-14 2011-03-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Composiciones para uso en terapia génica para el tratamiento de hemofilia.
EP0979102A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc DETAILED POLYPEPTIDE MODIFIED BY POLYALKYLENE OXIDE
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
AU8569698A (en) * 1997-07-11 1999-02-08 Brandeis University Method of inducing apoptosis by reducing the level of thiamin
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
DE69840361D1 (de) 1997-07-30 2009-01-29 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US5998386A (en) * 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
US6555367B1 (en) * 1997-10-10 2003-04-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
BR9813930A (pt) 1997-11-06 2006-12-19 Chiron Spa antìgeno neisserial
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US6316692B1 (en) 1997-11-14 2001-11-13 Cedars Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
JP2002500201A (ja) 1998-01-05 2002-01-08 ユニバーシティ オブ ワシントン 膜破壊剤を使用する増強された輸送
WO1999036544A2 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Chiron S.P.A. Neisseria meningitidis antigens
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
JP5102414B2 (ja) 1998-05-01 2012-12-19 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 髄膜炎菌抗原および組成物
WO2001031019A2 (en) 1999-10-29 2001-05-03 Chiron Spa Neisserial antigenic peptides
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) * 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
JP2002525065A (ja) 1998-09-11 2002-08-13 ジェンベク、インコーポレイティッド 選択的にターゲッティングされるアデノウイルス
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1121437B1 (en) 1998-10-15 2008-02-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
PT1129064E (pt) 1998-11-12 2008-01-31 Invitrogen Corp Reagentes de transfecção
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
AU1628800A (en) 1998-11-19 2000-06-05 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
EP1141331B1 (en) 1998-12-16 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HUMAN CYCLIN-DEPENDENT KINASE (hPNQALRE)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
CN100392082C (zh) 1999-04-30 2008-06-04 启龙股份公司 保守的奈瑟球菌抗原
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
EP1102785B1 (en) * 1999-06-07 2013-02-13 Arrowhead Research Corporation COMPOSITIONS FOR DRUG DELIVERY USING pH SENSITIVE MOLECULES
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
JP4173663B2 (ja) * 1999-09-17 2008-10-29 テヘテ ラボラトリーズ，エセ．ア．デ セ．ウベ． 組換えアデノウイルスベクター、肝臓、腎臓、肺および肥大性の瘢痕の各種の線維症の治療におけるその利用
CN101041079A (zh) * 1999-12-30 2007-09-26 诺瓦提斯公司 用于基因治疗的新的胶体合成载体
WO2001051092A2 (en) * 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
CN1416352B (zh) 2000-01-17 2011-05-25 启龙股份公司 含有脑膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白质的外膜囊(omv)疫苗
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
MXPA02008314A (es) 2000-02-28 2002-12-09 Chiron Spa Expresion heterologa de proteinas de neisseria.
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
WO2001092549A2 (en) * 2000-05-31 2001-12-06 Genvec, Inc. Method and composition for targeting an adenoviral vector
DE50109166D1 (de) * 2000-06-28 2006-05-04 Max Delbrueck Centrum Verfahren zur verbesserung der transfektionseffizienz
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
EP1322774A2 (en) * 2000-09-20 2003-07-02 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
CA2427068A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Invitrogen Corporation Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
EP1328543B1 (en) 2000-10-27 2009-08-12 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
US20030170826A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Peter Rabinovich Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
WO2002064162A2 (en) 2001-02-13 2002-08-22 Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Vaccine for transcutaneous immunization
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
JP2004535388A (ja) * 2001-04-30 2004-11-25 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 脂質含有薬物送達複合体およびそれらの生成方法
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
EP2000482A1 (en) 2001-06-20 2008-12-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1404698A4 (en) 2001-06-21 2004-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc ANTI-SENSE MODULATION OF SOLUBLE SUPEROXIDE DISMUTASE 1 EXPRESSION
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
NZ531674A (en) 2001-09-18 2009-03-31 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20060199778A1 (en) * 2001-09-19 2006-09-07 Rutledge Ellis-Behnke Methods and products related to non-viral transfection
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
AU2002334895B2 (en) 2001-10-09 2006-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
EP1448586A4 (en) * 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
WO2004033620A2 (en) 2001-11-02 2004-04-22 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of rna interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
ES2386386T3 (es) 2001-12-12 2012-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunización contra Chlamydia trachomatis
KR100623128B1 (ko) 2002-01-02 2006-09-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225791A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Department Of Veterans Affairs, Rehabilitation R And D Service Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
AU2003230874A1 (en) 2002-04-16 2003-11-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
AU2003240331B2 (en) * 2002-06-19 2008-08-21 University Health Network ACE2 activation for treatment of heart, lung and kidney disease and hypertension
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
CN102516417B (zh) 2002-09-06 2014-12-10 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
WO2004022716A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
EA008940B1 (ru) 2002-09-13 2007-10-26 Репликор, Инк. Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
WO2004031350A2 (en) 2002-09-26 2004-04-15 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
US20060171883A1 (en) * 2002-10-10 2006-08-03 Phillips Catherine A Detection, localization and staging of tumors using labeled activated lymphocytes directed to a tumor specific epitope
WO2004044132A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
WO2004044138A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
AU2003294281B2 (en) 2002-11-13 2010-05-20 Kastle Therapeutics, Llc Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004072284A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
CA2522184A1 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
CA2524495A1 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
EP1639109B1 (en) * 2003-06-09 2011-04-13 Corixa Corporation Dna vectors
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
EP1678194B1 (en) 2003-10-10 2013-06-26 Alchemia Oncology Pty Limited The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
AU2004283294B2 (en) * 2003-10-23 2011-03-17 Kineta Two, Llc Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, OAS1
JP4838722B2 (ja) 2003-10-24 2011-12-14 ゲンシア コーポレーション ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
EP1689432B1 (en) 2003-11-17 2009-12-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
SG113562A1 (en) * 2004-01-12 2005-08-29 Agency Science Tech & Res Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
EP2363480A3 (en) 2004-01-20 2015-10-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
WO2005069987A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 City Of Hope Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
WO2005086896A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering rna, micro-rna and antisense rna
EP1730309B1 (en) 2004-03-15 2016-05-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of rna by rnase h
ES2707393T3 (es) * 2004-03-26 2019-04-03 Curis Inc Moduladores de interferencia de ARN de señalización de hedgehog y usos de los mismos
JP4792390B2 (ja) 2004-03-29 2011-10-12 株式会社ガルファーマ 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
WO2006042112A2 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
JP2008515908A (ja) 2004-10-06 2008-05-15 ユニバーシティー オブ ロチェスター 組織因子経路を阻害する薬剤を使用する、肺高血圧症の治療
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
EP1856526A4 (en) 2005-01-20 2008-11-12 Univ Rochester THIOREDOXIN-INTERACTING PROTEIN (TXNIP) AS REGULATOR OF VASCULAR FUNCTION
WO2006086667A2 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
US7524510B2 (en) * 2005-02-23 2009-04-28 The Uab Research Foundation Alkyl-glycoside enhanced vaccination
CA2597325A1 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating vascular integrity
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
AU2006318194B2 (en) 2005-11-21 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eiF4E-BP2 expression
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090074733A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-19 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007067733A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods to monitor rna delivery to cells
PL3210633T3 (pl) 2006-01-26 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i ich zastosowania ukierunkowane na huntingtynę
AU2007215275B2 (en) * 2006-02-10 2013-01-17 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of siRNA by dsRNA binding domain fusions to PTD/CPPS
DK2495327T3 (da) 2006-03-03 2017-01-02 Promis Neurosciences Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til at behandle og opdage sygdomme fremkaldt af fejlfoldet SOD1
WO2007109584A1 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 University Of Washington Temperature-and ph-responsive polymer compositions
EP2007428A2 (en) 2006-04-05 2008-12-31 Genentech, Inc. Method for using boc/cdo to modulate hedgehog signaling
JP2009535383A (ja) 2006-05-03 2009-10-01 バルティック テクロノジー デヴェロプメント，リミテッド 強く結合した塩基で修飾されたオリゴヌクレオチドと人工ヌクレアーゼを組み合わせたアンチセンス作用物質
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
US20090093425A1 (en) * 2006-07-12 2009-04-09 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of nucleic acids by reversible phosphotriester charge neutralization protecting groups
US8198253B2 (en) 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
JP5274461B2 (ja) * 2006-08-18 2013-08-28 アローヘッド リサーチ コーポレイション ポリヌクレオチドのインビボ送達のためのポリ結合体
US9308198B2 (en) 2006-09-08 2016-04-12 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced brain disease
JP5864077B2 (ja) 2006-09-08 2016-02-17 ロード アイランド ホスピタル アルコール誘発性肝疾患の治療、予防および回復
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
US20090093551A1 (en) * 2006-12-08 2009-04-09 Bhatia Sangeeta N Remotely triggered release from heatable surfaces
EP2118118B1 (en) * 2007-01-19 2017-09-27 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of lna oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
CA2676790A1 (en) 2007-02-22 2008-08-28 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
EP2205741A2 (en) 2007-10-02 2010-07-14 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-rna and precursors thereof
WO2009049100A2 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Ultrathin multilayered films for controlled release of anionic reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
US8568709B2 (en) * 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
AU2009232355A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of EPAS1 inhibitors
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) * 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
KR101762734B1 (ko) 2008-08-25 2017-07-28 엑스칼리아드 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 결합 조직 성장 인자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 그의 용도
JP6209309B2 (ja) 2008-09-22 2017-10-04 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション サイズが減少した自己送達用ＲＮＡｉ化合物
KR101866152B1 (ko) 2008-12-04 2018-06-08 큐알엔에이, 인크. 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
CN102317458B (zh) 2008-12-04 2018-01-02 库尔纳公司 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗
CN102307997B (zh) 2008-12-04 2018-03-30 库尔纳公司 通过抑制针对沉默调节蛋白1的天然反义转录物来治疗沉默调节蛋白1(sirt1)相关的疾病
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
EP2396408B1 (en) 2009-02-12 2017-09-20 CuRNA, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
HUE026280T2 (en) 2009-02-12 2016-06-28 Curna Inc Treatment of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) -related diseases by inhibition of natural antisense transcripts associated with BDNF \ t
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
US20110319317A1 (en) 2009-03-04 2011-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt1
WO2010107733A2 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
JP5904935B2 (ja) 2009-03-17 2016-04-20 クルナ・インコーポレーテッド デルタ様１ホモログ（ｄｌｋ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｄｌｋ１関連疾患の治療
WO2010107991A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment and prevention of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3524275A1 (en) 2009-04-22 2019-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune supression enables repeated delivery of long rna molecules
ES2661787T3 (es) 2009-05-01 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con hemoglobina (hbf/hbg) por inhibición de transcrito antisentido natural para hbf/hbg
ES2609655T3 (es) 2009-05-06 2017-04-21 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para TTP
CA2761152A1 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Opko Curna, Llc Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene
US8957037B2 (en) 2009-05-18 2015-02-17 Curna, Inc. Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
CN102549158B (zh) 2009-05-22 2017-09-26 库尔纳公司 通过抑制针对转录因子e3(tfe3)的天然反义转录物来治疗tfe3和胰岛素受体底物蛋白2(irs2)相关的疾病
EP2435571B1 (en) 2009-05-28 2016-12-14 CuRNA, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
WO2010144711A2 (en) 2009-06-10 2010-12-16 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
KR101702689B1 (ko) 2009-06-16 2017-02-06 큐알엔에이, 인크. Ｐｏｎ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(ｐｏｎ1) 관련된 질환의 치료
CA2765889A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
EP2446037B1 (en) 2009-06-26 2016-04-20 CuRNA, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
CN102762731B (zh) 2009-08-05 2018-06-22 库尔纳公司 通过抑制针对胰岛素基因(ins)的天然反义转录物来治疗胰岛素基因(ins)相关的疾病
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
ES2599076T3 (es) 2009-09-02 2017-01-31 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de utilización del mismo
EP2488210A4 (en) 2009-10-12 2014-04-30 Smith Holdings Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING GENE EXPRESSION USING IN VITO OR IN VITRO-ADMINISTERED OLIGONUCLEOTIDE MEDICAMENTS
BR112012009409A2 (pt) 2009-10-22 2017-02-21 Genentech Inc método de identificação de uma substância inibidora, molécula antagonista, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para fabricar a molécula, composição, artigo de fabricação, método de inibição de uma atividade biológica, método de tratamento de uma condição patológica, método para detectar msp em uma amostra e método para detectar hepsina em uma amostra
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
WO2011056234A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Fibrogen, Inc. Treatment for radiation-induced disorders
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
EA201200617A1 (ru) * 2009-11-23 2012-11-30 Серулин Фарма Инк. Полимеры на основе циклодекстрина для доставки лекарственных средств
TWI507524B (zh) 2009-11-30 2015-11-11 Genentech Inc 診斷及治療腫瘤之組合物及方法
MX2012006580A (es) 2009-12-11 2012-09-28 Genecode As Metodo para facilitar la sobrevivencia de celulas neurales usando mimeticos de ligandos (gfl) de la familia gdnf o activadores de la ruta de señalizacion de ret.
CN102712927B (zh) 2009-12-16 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制膜结合转录因子肽酶，位点1(mbtps1)的天然反义转录物来治疗mbtps1相关疾病
CN102781480B (zh) 2009-12-23 2018-07-27 库尔纳公司 通过抑制解偶联蛋白2(ucp2)的天然反义转录物而治疗ucp2相关疾病
CN102869776B (zh) 2009-12-23 2017-06-23 库尔纳公司 通过抑制肝细胞生长因子(hgf)的天然反义转录物而治疗hgf相关疾病
CN102770540B (zh) 2009-12-29 2017-06-23 库尔纳公司 通过抑制肿瘤蛋白63(p63)的天然反义转录物而治疗p63相关疾病
EP2519633B1 (en) 2009-12-29 2017-10-25 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
CN102906264B (zh) 2010-01-04 2017-08-04 库尔纳公司 通过抑制干扰素调节因子8(irf8)的天然反义转录物而治疗irf8相关疾病
CN102822342B (zh) 2010-01-06 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制胰腺发育基因的天然反义转录物而治疗胰腺发育基因相关疾病
JP6027893B2 (ja) 2010-01-11 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 性ホルモン結合グロブリン（ｓｈｂｇ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による性ホルモン結合グロブリン（ｓｈｂｇ）関連疾患の治療
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
NO2529015T3 (bg) 2010-01-25 2018-04-14
US8962586B2 (en) 2010-02-22 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1
WO2011106297A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
PT2539451E (pt) 2010-02-24 2016-03-28 Arrowhead Res Corp Composições para entrega de arnsi dirigida ao alvo
KR101900962B1 (ko) 2010-04-09 2018-09-20 큐알엔에이, 인크. 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21) 관련된 질환의 치료
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
CN102958941A (zh) 2010-05-03 2013-03-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
CA2798218A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Curna, Inc. Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
CN103429739B (zh) 2010-05-12 2018-11-13 哥伦比亚大学纽约管理委员会 制备产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
NO2576783T3 (bg) 2010-05-26 2018-04-28
EP2594638B1 (en) 2010-07-10 2016-05-25 Kinki University Method for introducing nucleic acid to cell and nucleic acid complex
ES2663598T3 (es) 2010-07-14 2018-04-16 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el homólogo de discos grandes (dlg) mediante la inhibición del transcrito antisentido natural a dlg
ES2588981T3 (es) 2010-10-05 2016-11-08 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
KR101886457B1 (ko) 2010-10-06 2018-08-07 큐알엔에이, 인크. 시알리다아제 4 (neu4)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 neu4 관련된 질환의 치료
EP2630241B1 (en) 2010-10-22 2018-10-17 CuRNA, Inc. Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
DK2633052T3 (en) 2010-10-27 2018-07-16 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
EP2638149B1 (en) 2010-11-12 2019-05-15 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
KR102010598B1 (ko) 2010-11-23 2019-08-13 큐알엔에이, 인크. Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료
EP2658567A4 (en) 2010-12-28 2014-09-24 Univ Rochester METHOD FOR MODIFYING INSULIN SIGNAL TRANSMISSION BY BILIVERDINREDUCTASE (BVR) AND BVR-DERIVED PEPTIDES
CA2825059A1 (en) 2011-02-02 2012-08-09 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (ctgf)
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
EP2687204B1 (en) 2011-03-14 2020-10-14 National University Corporation Hokkaido University Vector for pulmonary delivery, inducing agent, and uses
EP2697244B1 (en) 2011-04-13 2017-05-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of ptp1b expression
US9593330B2 (en) 2011-06-09 2017-03-14 Curna, Inc. Treatment of frataxin (FXN) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FXN
WO2012174476A2 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
HUE051021T2 (hu) 2011-09-07 2021-01-28 Sinai School Medicine Ceramidáz és sejtek differenciálódása
EP2758533B1 (en) 2011-09-20 2018-04-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of gcgr expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
RU2014119787A (ru) 2011-10-25 2015-12-10 Айсис Фармасьютикалс, Инк. Антисмысловая регуляция экспрессии gccr
HUE040179T2 (hu) 2012-03-15 2019-02-28 Curna Inc Agyi eredetû neutrotróf faktorral (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) összefüggõ betegségek kezelése a BDNF-fel kapcsolatos természetes antiszensz transzkriptumok gátlása révén
IN2015DN01765A (bg) 2012-08-20 2015-05-29 Univ California
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9694050B2 (en) 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
WO2014152497A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
EP2992112B1 (en) 2013-04-22 2020-06-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mutations in pdgfrb and notch3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
ES2862125T3 (es) 2013-06-13 2021-10-07 Antisense Therapeutics Ltd Terapia combinada para acromegalia
JP6618910B2 (ja) 2013-09-05 2019-12-11 サレプタ セラピューティクス，インコーポレイテッド 酸性α−グルコシダーゼにおけるアンチセンス誘導エクソン２包含
EP3047023B1 (en) 2013-09-19 2019-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
WO2015070210A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Wake Forest University Health Sciences Epha3 and multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
CA2937539A1 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
SG10201911695SA (en) 2014-05-14 2020-01-30 Targimmune Therapeutics Ag Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
EP3160503B1 (en) 2014-06-26 2021-02-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
JP7175608B2 (ja) 2014-11-19 2022-11-21 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 加齢に伴うフレイルのための治療としてのオステオカルシン
EP3234141A4 (en) 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
US10849917B2 (en) 2015-06-01 2020-12-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type VII collagen
JP2018521689A (ja) 2015-06-17 2018-08-09 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
CN108699555A (zh) 2015-10-09 2018-10-23 萨勒普塔医疗公司 用于治疗杜兴肌营养不良和相关病症的组合物和方法
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3370734B1 (en) 2015-11-05 2023-01-04 Children's Hospital Los Angeles Antisense oligo for use in treating acute myeloid leukemia
JP7412079B2 (ja) 2015-12-23 2024-01-12 レプルカ プロプライアタリー リミティド 核酸オリゴマーとその用途
CA3019952A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EA201892366A1 (ru) 2016-04-18 2019-03-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Антисмысловые олигомеры и способы их применения для лечения заболеваний, связанных с геном кислой альфа-глюкозидазы
US11246868B2 (en) 2016-04-26 2022-02-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
US11981703B2 (en) 2016-08-17 2024-05-14 Sirius Therapeutics, Inc. Polynucleotide constructs
WO2018209288A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded rna complexes and uses related thereto
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019055460A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 The Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TRANSPOSON-ASSOCIATED DISEASES
JP7394753B2 (ja) 2017-10-18 2023-12-08 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド アンチセンスオリゴマー化合物
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
KR20200141470A (ko) 2018-04-06 2020-12-18 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 체세포 재프로그래밍 및 각인의 조정을 위한 조성물 및 방법
US20240209371A1 (en) 2021-04-22 2024-06-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating cancer
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (bg) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
DE59106279D1 (de) * 1990-05-18 1995-09-21 Genentech Inc Neue protein-polykation-konjugate.
AU660629B2 (en) * 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
AU1922092A (en) * 1991-05-03 1992-12-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
DE69231736T2 (de) * 1991-05-14 2001-10-25 The Immune Response Corp., Carlsbad Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
CA2103371C (en) * 1991-06-05 2003-09-16 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
CA2116107A1 (en) * 1991-09-05 1993-03-18 George Y. Wu Targeted delivery of poly-or oligonucleotides to cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
AU6133394A (en) 1993-02-09 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
NO941154D0 (no) 1994-03-29
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
US6022735A (en) 2000-02-08
PT607206E (pt) 2002-07-31
NZ244306A (en) 1995-07-26
CN1059705C (zh) 2000-12-20
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
NO316744B1 (no) 2004-04-26
HU211925A9 (en) 1996-01-29
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
IL103171A0 (en) 1993-02-21
SK36894A3 (en) 1994-08-10
CA2118816C (en) 2003-06-17
MX9205543A (es) 1993-05-01
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
BR9206559A (pt) 1994-11-08
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
US6077663A (en) 2000-06-20
SI9200236B (sl) 2002-10-31
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
IL103171A (en) 2003-04-10
AU2652692A (en) 1993-05-03
SG44680A1 (en) 1997-12-19
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
US6274322B1 (en) 2001-08-14
NO941154L (no) 1994-03-29
SI9200236A (en) 1993-03-31
HUT71312A (en) 1995-11-28
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
EE03195B1 (bg) 1999-06-15
FI941474A (fi) 1994-03-30
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
US5547932A (en) 1996-08-20
CN1070946A (zh) 1993-04-14
BG98718A (bg) 1995-02-28
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
AU671084B2 (en) 1996-08-15
HU218846B (hu) 2000-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG62740B1 (bg) Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5521291A (en) Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
JP3479298B2 (ja) 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体
JP5025059B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための配合剤
JPH10503469A (ja) 緻密にした核酸および細胞へのデリバリ
HU230488B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
CA2222550A1 (en) Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
JP2001521381A (ja) ポリマー修飾ウイルス
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
WO2003078460A1 (fr) Peptides, compositions medicinales contenant ce peptide et compositions medicinales anticancereuses
US20020168339A1 (en) Biological material for treating a mammal by antibody gene transfer and pharmaceutical composition containing same
RU2138553C1 (ru) Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции
EP1007549B1 (en) Compositions and methods for highly efficient transfection
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice
US5658774A (en) IRF-1 DNA expression inhibits growth of cells expressing c-myc or FosB
WO2002031139A1 (fr) Vecteur d&#39;expression de transporteur compulsif pour infection organique
CA2241040A1 (en) Improved pharmaceutical compositions