JP2001521381A - ポリマー修飾ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポリマー修飾ウイルス、それらを製造する方法およびそれらの使用に関する。好ましい実施態様においては、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施態様においては、ポリマーは直接共有結合によりウイルスに結合している。他の実施態様においては、ポリマーは間接的に共有結合により中間カップリング剤を介してウイルスに付着する。さらに他の実施態様においては、ポリマーは間接的にリガンドを介してウイルスに共有結合により付着している。好ましい実施態様においては、リガンドはウイルス表面成分に特異性を有する。たとえば、リガンドは抗体であってもよい。本発明はさらに、ポリマーによって修飾されたウイルスを作成するにあたり、修飾されたウイルスは感染性を維持する方法を提供する、本発明の他の実施態様は導入遺伝子を標的細胞に導入する方法であって、標的細胞をポリマー修飾ウイルスと接触することおよびウイルスは導入遺伝子を含有することからなる方法を提供する。本発明はさらに、腫瘍にウイルスを送達する方法において本発明のポリマー修飾ウイルスをこのような処置を要する患者に、ポリマー修飾ウイルスが腫瘍に局在する条件下に投与する方法を提供する。他の実施態様においては、ポリマーで修飾されたウイルスと担体からなる組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー修飾ウイルス 本出願は、それぞれ1997年４月３日、９月15日、および10月22日に出願された 英国特許出願第9706735.9号、9719625.7号および9722316.8号に基づく優先権を 主張する。 発明の背景 ウイルスは、多くの治療的利用の可能性を有する。たとえば、ウイルスゲノム を異種遺伝子に対するベクターとして用いる遺伝子療法、ならびにワクチン接種 および、たとえばある種の腫瘍におけるウイルスの選択的複製後の細胞の破壊を 利用するウイルスの腫瘍の崩壊現象を活用する癌療法が知られている。 しかしながら、ウイルスの臨床的利用には、ある種の問題がある。たとえば、 ヒト主体の多くは通常のウイルスたとえばアデノウイルスに対して予め免疫され ていて、すなわち循環抗体を有する。循環抗体が自然に中和を示す場合は、投与 されたウイルス粒子の感染性は低下するかまたは感染性を全く示さない。大部分 のウイルスは高度に免疫原性であるから反復投与はこの問題を一層悪化させる。 免疫応答もまたウイルス投与の毒性に寄与し、細胞性免疫が関与する場合には、 重篤な組織傷害を生じることがある。 免疫系に関連する問題に加えて、ウイルス粒子はまた他のクリアランス機構に 対し傷害性である可能性がある。粒子は、マクロファージによるファゴサイト／ エンドサイト取り込みの関与する機構を介して肝臓および脾臓によってろ過され る傾向がある。ウイルスの攻撃はこのような機構により排除されることがある。 加えて、ウイルスによる補体系の活性化は一部のウイルスベクターの不活性化に 関与するファクターである場合がある。タンパク分解および、関連する場合は、 脂肪分解がウイルス粒子を傷害する可能性もある。 ウイルス粒子はまた、多くの場合、特異的な組織分布を有する。これはウイル スを意図した治療的応用には必ずしも望ましいことではない。たとえば、自然の ウイルスの組織分布を回避するため，多分同時にウイルスを腫瘍のような新たな 部位に「標的化」することがあるセッティングには望ましい。ウイルスベクター の適当な修飾によって、能動的および受動的標的化戦略の両者がこのようなベク ターで実行可能になると思われる。しかしながら、組織特異的局在システムの阻 害は、ウイルス粒子の非特異的取り込み機構にさらに敏感にする可能性がある。 とくに癌の遺伝子治療またはウイルス崩壊現象に使用するウイルスベクターに関 連する受動的標的化の一形態にはいわゆる透過性と貯留効果の増大があり，これ は腫瘍における漏れやすい脈管構造と貧弱なリンパ管のドレイナージを利用する ものであって、粒子の局在の増大を達成できる。 ウイルス粒子にはまた獣医学的および農学的使用もあり、上記の問題の一部を 共通してもっている。 ポリマー／タンパク質およびポリマー／リポソーム構築体の関係で、ポリマー 修飾が多くの問題を解決する可能性を有することが明らかにされた。たとえば、 ポリマーカバーは、抗原性および免疫原性を低下させることが証明されている。 さらに、軽いポリマーカバーは、抗原を寛容原に変えることもできる。ポリマー カバーはまた網内細胞系（ＲＥＳ）の粒子の取り込みを改善することもできる。 さらにポリマーはリンカーとして働き、標的化デバイスを他の分子またはマクロ 分子構造の表面にカップリングさせてそれらを特定の部位に標的化する。 しかしながら、生存ウイルスはタンパク質およびリポソームに比べてそれらの 特性がきわめて異なっている。感染性に関与する表面構造はポリマー修飾により 弱体化することがあり得る。実際にウイルスのすべての臨床的適用は、感染性が 維持されていることを要求する。 本発明によれば驚くべきことにウイルス粒子はポリマーにより修飾できるが， なお感染性を維持していることが見出された。ウイルスのポリマー修飾は、中和 抗体の存在下における感染能力の改善のような有利な性質の獲得を生じることも 発見された。 発明の概要 本発明はポリマーにより修飾されたウイルスを提供する。好ましい実施態様に おいては、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施態様に おいては、ポリマーはウイルスに直接共有結合する。他の実施態様においては、 ポリマーは間接的に、中間カップリング残基を介してウイルスに共有結合により 付着する。さらに他の実施態様では、ポリマーは、ウイルスにリガンドを介して 間接的に非共有結合により結合する。好ましい実施態様においては、リガンドは ウイルス表面成分に特異性を有する。たとえばリガンドは抗体であってもよい。 本発明はさらに、ウイルスをポリマーで修飾する方法を提供する。この場合、 修飾されたウイルスは感染性を維持する。 本発明の他の実施態様は、導入遺伝子からなるポリマー修飾ウイルスと標的細 胞を接触させることからなる標的細胞への導入遺伝子の導入方法を提供する。 本発明はさらに、本発明のポリマー修飾ウイルスを、このような処置を必要と する患者に、ポリマー修飾ウイルスが腫瘍に局在するような条件下に投与するこ とからなる腫瘍へのウイルスの送達方法を提供する。 他の実施態様においては、本発明はポリマーで修飾されたウイルスおよび担体 からなる組成物を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、３％（w/v）ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧで処理したアデノウイルスの 毛細管エレクトロフェログラフを示す。 図２は、３％（w/v）ＴＭＰＥＧで処理したアデノウイルスの毛細管エレクト ロフェログラフの移動性の変化の時間経過のグラフである。 図３Ａ〜Ｄは、ＰＥＧ化時のウイルス粒子サイズの変化を示す光子相関分光光 度法の結果を示す。 図４は、単回の３％ＴＭＰＥＧ，３％ＭＰＥＧおよび対照ウイルスに０〜６時 間暴露した感染性（ＣＰＲＧ）アッセイの結果を示す。 図５Ａ〜Ｅは、５％ＰＥＧ₅₀₀₀，ＰＥＧ₁₂₀₀₀またはＰＥＧ₂₀₀₀₀の段階的添 加による感染性（ＣＰＲＧ）アッセイの結果を示す。 図６Ａ〜Ｃは、３％、５％、または８％ＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加による感染性 （化学ルミネッセンス、ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。 図７Ａ〜Ｃは、５％ＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加による感染性（化学ルミネッセン ス、ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。 図８Ａ〜Ｃは、５％ＰＥＧ₁₂₀₀₀およびＰＥＧ₂₀₀₀₀の段階的添加による感染 性（化学ルミネッセンス、ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。 図９は、３％ＰＥＧ₅₀₀₀の単回添加による感染性（化学ルミネッセンス、ＲＬ Ｕ）アッセイの結果を示す。 図10ＡおよびＢは、感染性の中和に対する５％ＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加のイン パクトの抗体中和アッセイ（化学ルミネッセンス、ＲＬＵアッセイ）のグラフを 示す。抗体分子：ウイルス粒子10,000:1 図11ＡおよびＢは、感染性の中和に対する５％ＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加のイン パクトの抗体中和アッセイ（化学ルミネッセンス、ＲＬＵアッセイ）のグラフを 示す。抗体分子：ウイルス粒子5,000:1 図12ＡおよびＢは、感染性の中和に対する５％ＰＥＧ₁₂₀₀₀の段階的添加のイ ンパクトの抗体中和アッセイ（化学ルミネッセンス、ＲＬＵアッセイ）のグラフ を示す。抗体分子：ウイルス粒子10,000:1 図13は、ＴＭＰＥＧを用いて修飾した抗-ヘキソン抗体のフロレスカミンアッ セイのグラフを示す。 図14は、シアヌル酸クロリド-ＭＰＥＧを用いて修飾したMab 8052のフロレス カミンアッセイのグラフを示す。 図15は、ＰＥＧ化抗-ヘキソン抗体によるアデノウイルスヘキソンの免疫沈降 を表すＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを示す。 図16Ａ〜Ｅは、Superose 12カラム上抗体およびＰＥＧ化抗体のゲル浸透クロ マトグラフィーを記述する。 図17Ａ〜Ｊは、ＰＥＧ抗体の濃度を上昇させ，ウイルスに結合することによる ビオチン化抗-ヘキソン抗体の競合を示す抗体競合ＥＬＩＳＡを記述する。 図18Ａ〜Ｃは、クロマトグラフィー後ＤＥＡＥイオン交換樹脂からの対照およ びＴＭＰＥＧ処理ウイルスの溶出像を示す。 図19Ａ〜Ｃは、１mlのResource Qカラム（Pharmacia）からの非処理（パネル1 9ａ）、ＭＰＥＧ処理（パネル19ｂ）、およびＴＭＰＥＧ処理（パネル19ｃ）ア デノウイルスＯＮＹＸ-015の溶出像を示す。 図20は、アデノウイルスＯＮＹＸ-015に段階的に５％ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＭ ＰＥＧ₅₀₀₀を添加したのちの感染性アッセイの結果（ヘキソンタンパク質に対す るＥＬＩＳＡ）を記述する。 図21Ａ〜Ｆは、非処理アデノウイルスＯＮＹＸ−015（パネルＡおよびＢ）お よび５％ＭＰＥＧ₅₀₀₀（パネルＣおよびＤ）またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（パネルＥお よびＦ）とインキュベートしたＯＮＹＸ-015の細胞変性効果（ＣＰＥ）を証明す る写真のレーザーコピーを示す。 図22は、ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀とインキュベートしたアデノウイルスＯＮＹＸ-015の 感染性および複製を証明する免疫蛍光写真（抗-ヘキソン抗体で染色）のレーザ ーコピーを示す。 図23は、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加後にワクシニアウイ ルスのプラークアッセイにより測定した感染性を示す。 図24は、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加後、ワクシニアウイ ルスのβ-ガラクトシダーゼ発現により測定した感染性を証明する写真を示す。 図25は段階的添加を用いてＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀とインキュベー トしたワクシニアウイルスでの感染後における初期遺伝子の発現（γ-ＩＦＮｇ 受容体の産生）を証明するＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフを示す。 図26は、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（段階的添加）とインキュベート したワクシニアウイルスの感染後における後期遺伝子（ＩＬ-１β受容体）の発 現を証明する。 図27は、ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（段階的添加）とインキュベートしたワクシニアウイ ルスの抗-ワクシニア血清による中和からの保護を証明する。 図28ＡおよびＢは、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加後にレト ロウイルスのプラークアッセイによって測定した感染性を示す。 図29Ａ〜Ｆは、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（段階的添加）とインキュ ベートしたレトロウイルスの感染後におけるlacＺの発現を示す。 図30ＡおよびＢは、ＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＴＭＰＥＧ₅₀₀₀の段階的添加後のヘル ペスウイルスのプラークアッセイにより測定した感染性を示す。 図31ＡおよびＢは、ＰＶＰ（パネルａ）および活性化ＰＶＰ（パネルｂ）とイ ンキュベートしたＯＮＹＸ-015の１ml Resource Qカラム（Pharmacia）からの溶 出像を示す。 図32は、ＰＥＧ化ウイルス（ＡおよびＢ）または対照ウイルス（Ｃ）を注入し たＬＳ174Ｔヒト結腸癌を担うヌードマウスから採取した肝臓（Ａ）および腫瘍 切片（ＢおよびＣ）の免疫蛍光染色を示す。 図33は、ＰＥＧ化またはシャム処置アデノウイルスベクターで感染させたマウ スにおける導入遺伝子の発現を示す。 発明の詳細な説明 本発明はポリマーによって修飾されたウイルスを提供する。このようなウイル ス粒子はそれに共有結合または非共有結合によって結合した１個または２個以上 のポリマー分子を有する。本発明のポリマー修飾ウイルスは感染性の生物学的性 質を維持している。 本発明によれば、ポリマーは一般的に、共有結合により連結した小分子鎖から なる大きな非免疫原性の、生物学的に不活性な分子である。本発明に有用なポリ マーはウイルスに共有結合または非共有結合によって結合した場合、検出可能な レベルの感染性を維持し、実質的に非免疫原性であるポリマー修飾ウイルスを提 供する。ポリマーは好ましくは平均分子量約200〜約20,000ダルトンである。 ポリマーは生物適合性であり、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。ポリマーはホモポ リマーまたはヘテロポリマーである。本発明における使用に適当なポリマーには ポリアルカレンオキシドのようなポリアルカレン化合物およびグリコールを包含 する。ポリアルカレン化合物にはポリオキシメチレン、ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）およびオキシド、およびメトキシポリエチレングリコールおよびそれ らの誘導体たとえばポリメチル-エチレングリコール、ポリヒドロキシプロピレ ングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルプロピレングリコール、 ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリヒドロキシプロピレンオキシドおよ びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が包含される。 本発明における好ましいポリマーはＰＥＧである。ＰＥＧは水溶性のポリマー であり、式：Ｈ(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＨ（式中、ｎは反復単位の数であり、平均 分子量を決定する）を有する。平均分子量200〜20,000ダルトンを有するＰＥＧ が市販されている。本発明によれば、200（ＰＥＧ₂₀₀）〜20,000（ＰＥＧ_20,000 ）の平均分子量を有するＰＥＧがＰＥＧによって修飾されたウイルスの製造に使 用される。好ましい実施態様においては、ＰＥＧは平均分子量約2000〜約12,000 を有する。さらに好ましい実施態様においては、ＰＥＧは約5000の平均分子量を 有する。 本発明によれば、ポリマー修飾ウイルスは抗原性の低下を示す一方、感染性は 維持することが発見された。したがって、本発明に有用なウイルスは、感染性の 性質をもつウイルスを包含し、抗原性は低下ぢていることが望ましい。さらに、 本発明のポリマー修飾ウイルスはインビボにおいて上昇した循環時間を示すもの である。すなわち、本発明のポリマー修飾ウイルスは治療的および診断的にイン ビボ適用において有用性を有する。 ポリマー修飾ウイルスは、医学および獣医学実務における医薬治療および診断 に、ならびに農業において有用性を有する。それらは遺伝子療法（たとえば、所 望の遺伝子生成物の局在する発現のための遺伝子の送達）および非遺伝子療法的 適用、たとえばそれらに限定されるものではないがウイルスの腫瘍崩壊にとくに 有用である。ウイルスは、たとえば遺伝子、毒素および／または診断マーカーの 送達に有用である。その他の適用には、ウイルス抗原に対する寛容原の創成があ る。さらに詳しくは、本発明は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスから選択されるウ イルスを意図するものである。用いられる好ましいウイルスには、以下の科およ び属から選択されるウイルスがある。すなわちアデノウイルス（Adenoviridae） 科;ビルナウイルス（Birnaviridae）科;ブンヤウイルス（Bunyaviridae）科;カ リチウイルス（Caliciviridae）科；カピロウイルス（Capillovirus）属；カル ラウイルス（Carlavirus）属；カルモウイルス（Carmovirus virus）属；コウリ モウイルス（Caulimovirus）属;クロステロウイルス（Closterovirus）属；コメ リナ黄色・マダラウイルス（Comnlelina yellow mottle virus）属；コモウイル ス（Comovirus virus）属；コロナウイルス（Coronaviridae）科；ＰＭ２ファー ジ（ＰＭ２ phage）属；コルチコウイルス（Corcicoviridae）科;クリプティッ クウイルス（Cryptic virus）属：クリプトウイルス（Cryptovirus）属;キ ュウカモウイルスグループ科φ６ファージ属（Cucumovirus virus group Family φ6 phage group）；シストウイルス（Cystovirisae）科;カーネーションリン グスポット（Carnation ring spot）属;ジアントウイルス（Dianthovirus virus ）属；ブロードビーンウィルト（Broad bean wilt）属；ファバウイルス（Fabav irus）属；フィロウイルス（Filoviridae）科；フラビウイルス（Flaviviridae ）科；フロウイルス（Furovirus）属；ジェミニウイルス（Geminivirus）属；ギ アルジアウイルス（Giardiavirus）属；ヘパドナウイルス（Hepadnaviridae）科 ；ヘルペスウイルス（Herpesviridae）科：ホルデイウイルス（Hordeivirus vir us）属；イラウイルス（Ilarvirus）属；イノウイルス（Inoviridae）科；イリ ドウイルス（Iridoviridae）科；レヴィウイルス（Leviviridae）科；リポスリ ックスウイルス（Lipothrixviridae）科；ルテオウイルス（Luteovirus virus） 属；マラフィウイルス（Marafivirus virus）属；メイズクロチックドウオルフ ウイルス（Maize chlorotic dwarf virus）属；イクロウイルス（Icroviridae） 科；ミオウイルス（Myoviridae）科；ネクロウイルス（Necrovirus）属；ネポウ イルス（Nepovirus virus）属；ノダウイルス（Nodaviridae）科；オルトミクソ ウイルス（Orthomyxoviridae）科；アデノに関連するウイルスを含有するパポウ イルス（Papoviridae）科；パラミクソウイルス（Paramyxo viridae）科；パー スニップ-黄色-マダラ-ウイルス（Parsnip yellow fleck virus）属；パルティ ティウイルス（Partitiviridae）科；パルボウイルス（Parvoviridae）科；ピー エネーションモザイクウイルス（Peaenation mosaic virus）属；フィコドナウ イルス（Phycodnaviridae）科；ピコルナウイルス（Picornaviridae）科；プラ ズマウイルス（Plasmaviridae）科；ポドウイルス（Podoviridae）科；ポリドナ ウイルス（Polydnaviridae）科；ポテックスウイルス（Potexvirus）属；ポティ ウイルス（Potyvirus）属；ポックスウイルス（Poxviridae）科；レオウイルス （Reoviridae）科；レトロウイルス（Retroviridae）科；ラブドウイルス（Rhab doviridae）科；リジディオウイルス（Rhizidiovirus）属；シフォウイルス（Si phoviridae）科；ソベモウイルス（Sobemovirus）属；ＳＳＶ１-型ファージ属； テクティウイルス（Tectiviridae）科；テヌイウイルス（Tenuivirus）属；テト ラウイルス （Tetraviridae）科；トバモウイルス（Tobamovirus）属；トブラウイルス（Tob ravirus）属；トガウイルス（Togaviridae）科；トムバスウイルス（Tombusviru s）属；トロウイルス（Torovirus）属；トチウイルス（Totiviridae）科；チモ ウイルス属（Tymovirus）；植物ウイルス付随体である。 導入遺伝子の送達の目的でとくに好ましいウイルスには、たとえば、レトロウ イルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスおよびポック スウイルスが包含される。アデノウイルスがとくに好ましい。 本明細書で使用するウイルスの語は、組換え遺伝子操作ウイルスを包含する。 たとえば、ウイルスは複製不可能なように操作されている、最小遺伝子の発現を 示すウイルスであってもよい。組換えウイルスは、導入遺伝子を含有することが できる。導入遺伝子は本明細書においては、そのウイルスにネイティブではない 核酸として定義される。たとえば、導入遺伝子は生物学的に機能するタンパク質 もしくはペプチド、アンチセンス分子、またはマーカー分子をコードすることが できる。 本発明のポリマー修飾ウイルスはウイルスに対するポリマーの直接共有結合、 間接共有結合または間接非共有結合による付着により提供される。 共有結合および非共有結合による付着には多様な組立てがある。１）ポリマー はウイルス表面への直接共有結合カップリングを介して付着する、２）ポリマー は間接共有カップリングを介して付着する（たとえば、ポリマーをウイルス表面 に連結する中間カップリング残基を介して）、または３）間接非共有結合を介し て、たとえば適当なＰＥＧ化リガンドを用いて付着する。適当なリガンドは表面 タンパク質または脂質に対する抗体に限定されるものではなく、疎水性表面成分 をもつウイルス粒子、たとえばエンベロープウイルスに対する疎水性リガンドを 包含することができる。 ポリマーは、他の分子たとえばタンパク質へのポリマーの共有結合付着につい て本技術分野で一般的に知られている方法により、ウイルス表面への直接または 間接共有結合カップリングを介して付着することができる。ポリマー修飾の標的 には、それによりポリマーまたはカップリング剤が相互作用できるウイルス表面 上の反応基が包含され、たとえば一級および二級アミノ基、チオール基ならびに 芳香族ヒドロキシ基である。すなわち、ウイルスのポリマー修飾の好ましい方法 は特定のウイルスの表面上において利用できる標的部位に依存する。特定の標的 基に対するポリマー修飾の特定の方法の特異性はよく知られていて、したがって 通常の知識を有する技術者によれば、所望の標的に適当な方法を選択することが できる。 ポリマー修飾の別の方法は、ウイルスがエンベロープをもつかもたないかに依 存して選択することができる。エンベロープをもたないウイルスの表面はタンパ ク質殻またはカプシドであり、多くの場合多重型のポリペプチドを含んでいる。 代表的なエンベロープをもたないウイルスには、アデノウイルス、パルボウイル スおよびピコルナウイルスが包含される。エンベロープを有するウイルスでは、 タンパク質カプシドはウイルスにコードされるポリペプチドを含有する脂質二重 層によって封入される。代表的なエンベロープをもつウイルスには、ヘルペスウ イルス、ポックスウイルスおよびバキュロウイルスが包含される。カプシドおよ びエンベロープポリペプチドの両者は、ポリマー修飾の標的を提供する。たとえ ば、エンベロープをもたないウイルスたとえばアデノウイルスでは、ヘキソン、 ペントン細胞ベース、および線維タンパク質がポリマー修飾の標的である。中和 抗体に対して暴露されたエピトープの部位を提供するウイルスポリペプチド、た とえばアデノウイルスのヘキソンタンパク質はとくに好ましいポリマー修飾部位 である。これらの部位の修飾はエピトープを中和抗体からマスクし、したがって 抗原性が低下したウイルスベクターを提供する。 本技術分野で知られたポリペプチドにポリマーを直接または間接に共有結合に より付着させる方法は、本発明のポリマー修飾ウイルスの提供に使用することが できる。これらの方法は、たとえばＷＯ90/04606，ＵＳ特許4,179,337ならびに5 ,612,460に記載されている。これらの開示は引用により本明細書に導入される。 一般的にポリマーは、ポリマーの末端残基を活性化残基に変換することにより、 またはポリマーに活性化カップリング残基を付着させることによって活性化され る。活性化されたポリマーは、ついで活性化残基を介して標的にカップリングさ れる。活性化残基または活性化カップリング残基は、ウイルス表面における所望 の標的部位に対するその親和性に基づいて選択することができる。 たとえば、ＰＥＧのヒドロキシル末端基は、反応性官能基に変換するか、また は活性化カップリング残基に付着させて「活性化」ＰＥＧとして知られた分子を 提供してもよい。活性化ＰＥＧの様々な型が本技術分野で知られていて、市販品 を入手できる。ウイルスへの直接共有結合に適当な活性化ＰＥＧは、ＭＰＥＧ- トレシレート（ＴＭＰＥＧ）であり、これはε-リジン基、またはＭＰＥＧ-アル デヒドと反応するものと考えられる。間接共有結合による連結には他の型の活性 化ＰＥＧが本技術分野で知られていて、市販品を入手できる。これらには、たと えばメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）誘導体、たとえばシアヌル酸 クロリドで活性化されたＭＰＥＧ、アミノ基と反応するＰＥＧＮ-ヒドロキシス クシンイミドＰＥＧ（ＮＨＳ-ＰＥＧ）、およびＰＥＧ-Ｎ-スクシンイミドカル ボネートがある。これらのおよび他の活性化ＰＥＧは、ＷＯ95/06058，ＵＳ特許 4,179,337および5,612,460に開示されている。これらは引用により本明細書に導 入される。 たとえば、ウイルス表面へのＰＥＧの共有結合による付着はウイルスを活性化 ＰＥＧたとえばＴＭＰＥＧとインキュベートすることによって達成される。数種 のインキュベーション基準を使用できる。たとえば、穏やかに攪拌しながらまた は撹拌しないで、活性化ポリマーの１回添加を使用することができる。抗原性が 低下し感染性を維持する修飾ウイルスを達成するのにＴＭＰＥＧとウイルス粒子 の至適比率は、以下に記述するアッセイを実施することにより決定される。たと えば、ウイルスと活性化ＴＭＰＥＧは、活性化ＰＥＧとリジン残基のε-アミノ 末端が約1:1〜約400:1のモル比になるように混合される。ウイルスに加える活性 化ポリマーの量が増大するに従い、活性化ポリマーを段階的様式で添加すること がまた有利である。段階的添加の背後にある理由はウイルス粒子が凝集しやすい こと、これがある種の活性化ポリマーたとえばＴＭＰＥＧのとくに高い濃度で増 悪されるからである。すなわち初期の低ポリマー濃度でのＰＥＧ化は以後の高い ポリマー濃度における凝集傾向を低下させることに役立ち、したがって高度のＰ ＥＧ化を達成するのを助けることができる。たとえば、活性化されたＰＥＧたと えばＴＭＰＥＧはウイルス保存溶液に30分毎に別の工程で加え、反応混合物中各 回のポリマー濃度を３％、５％または８％（w/v）ずつ上昇させ、それぞれ 最終ポリマー濃度12％、20％および32％（およそのw/v、すなわち、ポリマーの 容量に対して補正されない）を得る。加えて、最後のポリマーの添加後、さらに インキュベーション時間も許される。通常の熟練を有する技術者は至適結果を得 るため、工程の数、ポリマーの濃度および時間間隔を調整することができる。 反応は、透析または過剰のリジンの添加たとえば10〜100倍過剰のリジンの添 加により停止させることができる。別法として、反応は完全に（すなわち、活性 化ＰＥＧたとえばＴＭＰＥＧが、完全にＰＥＧ化反応に消費されるかまたは加水 分解によって不活性になる時点まで）進行させてもよい。 一部の適用においては、たとえばポリマー修飾ウイルスの反復投薬を要求する 適用においては、ついで意図された使用のために必要に応じて、標準方法により 精製される。分離および精製は本技術分野で既知の方法により、たとえばイオン 交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配 精製によって実施できる。抗体の間接ＰＥＧ化の場合は、ヘキソン親和性樹脂が 未反応ＰＥＧからＰＥＧ化された抗体を分離するために有用である。 一部の適用においては、修飾されたウイルスから非修飾ウイルスを分離するこ とが望ましい。ポリマーがポリアルキレングリコールの場合には、非修飾ウイル スから修飾されたウイルスの分離は水性二相系中ポリアルキレングリコール溶液 に分配することによって行われる。たとえば、ＰＥＧとデキストランの水性二相 系中での相分配は非修飾ウイルスからＰＥＧ修飾されたウイルスの分離を可能に する。分配は向流分布によって実施されてもよい。一般に相システムはデキスト ランとＰＥＧの溶液を混合することによって調製される。ＰＥＧおよびＰＥＧ- 修飾ウイルスを相システム中に導入し、上下または左右回転により混合し、分離 させる。ＰＥＧ-修飾ウイルスはＰＥＧ相に分配され、非修飾ウイルスはデキス トラン相に分配する。 ウイルスのＰＥＧによる修飾（ＰＥＧ化）はイオン交換クロマトグラフィー、 毛細管電気泳動（ＣＥ）、光子相関分光光度法（ＰＣＳ）、および標識たとえば ビオチン化ＰＥＧの定量的ＥＬＩＳＡにおける使用を包含する本技術分野で周知 の方法によって評価することができる。 イオン交換クロマトグラフィー、たとえばＤＥＡＥ-クロマトグラフィーは、 変化した電荷に基づき修飾ウイルスを評価する標準方法により実施できる。 全ウイルスＣＥはポリマーによるウイルスの修飾を改変された表面電荷の関数 としてモニターする手段を提供する。たとえば、ウイルス表面へのＰＥＧの共有 結合による付着は、ウイルス粒子上のネガティブな表面電荷の遮蔽を生じ、した がってこのポリマー修飾ウイルスは、そのウイルスに、より中性の移動性を発揮 させるものと思われる。ＣＥは、本技術分野の通常の熟練者に周知の方法により 実施できる。たとえば、真の高圧分離が始まる前に、ウイルスが安定性のために 処方される高度移動性塩イオンを電気泳動させるために傾斜した低-高圧前処置 が使用される。ＣＥから誘導されるプロットにおいて、ＰＥＧと共有結合により 付着したウイルス粒子はＰＥＧと共有結合で付着していないウイルスよりも中性 点に近い位置で進行する。ＣＥはＰＥＧのウイルス粒子への共有結合による付着 に関して、モル比、濃度およびインキュベーション時間を含む各種条件の影響を 評価するために有利に使用することができる。中性度の増大は、ウイルス表面に おけるＰＥＧ-鎖密度の増加を反映する。 ＰＣＳは、粒子のサイズに関し正確な測定値を得るため、粒子サイズと懸濁液 中の移動性（ブラウン運動）の間の関連づけに使用される。この方法はリポソー ム、マイクロスフィアおよびナノ粒子を含む粒子へのポリマーの付着のモニター に、それらのサイズの増加を測定することにより広く適用されている。これらの データは、共有結合で付着したＰＥＧが比較的低密度において球形の「きのこ」 状形態を形成し、したがってサイズの増加は比較的小さいことを示唆している。 共有結合によって付着したＰＥＧ鎖の密度の上昇が期待される条件の変更は、比 較的粒子サイズの大きな増加を反映するポリマーのさらに拡張されたコンフォー メーションまたは「ブラシ」状形態を生じる。すなわち、ＰＣＳは本技術分野の 通常の熟練者に周知の方法を用いて、様々な反応条件下におけるウイルス粒子の サイズ変化をモニターするために使用される。 ビオチン化ＰＥＧのＥＬＩＳＡ分析は、ウイルス粒子に共有結合したＰＥＧの 分子数の最も定量的な評価を提供する。ＥＬＩＳＡは、本技術分野で周知の標準 方法によって実施できる。 本発明の好ましい実施態様においては、ポリマー修飾ウイルスはＰＥＧにより 共有結合で修飾されたウイルスを提供すると考えられる条件下で製造される組換 えウイルスである。とくに好ましい実施態様では、ウイルスは、組換えアデノウ イルスベクターである。適当な組換えアデノウイルスベクターには、Ｅ1領域に ついて欠失したアデノウイルス２型（Ａd2）および５型（Ａd5）から誘導される ベクターが包含される。導入遺伝子の送達に有用な、代表的アデノウイルスベク ターは、Zabnerら（1995）J Clin Invest 6:1504，Zabnerら（1993）Cell 75:20 7，ＵＳ特許5,707,618および5,670,488に開示されている。これらの開示は引用 により本明細書に導入される。好ましい実施態様においては、組換えアデノウイ ルスベクターは導入遺伝子を含有し、これにはたとえば嚢胞性線維症膜貫通伝導 性レギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子が包含される。 本発明の他の実施態様においては、ポリマー修飾ウイルスはウイルス腫瘍崩壊 としても知られている腫瘍特異的細胞崩壊を誘導することができる組換えアデノ ウイルスである。ウイルス腫瘍崩壊に有用な代表的アデノウイルスは、Bischoff ら（1996）Science 274:373，Heiseら（1997）Nature Medicine 3:360およびＥ Ｐ689447Ａにより開示されている。これらの開示は引用により本明細書に導入さ れる。 本発明の他の実施態様においては、ポリマーは適当なポリマー修飾リガンドを 介してウイルスに間接的に非共有結合により付着している。適当なリガンドには それらに限定されるものではないが、ウイルス表面成分、たとえばウイルス表面 タンパク質または脂質に対して特異性を有するリガンドであり、疎水性表面成分 を有するウイルス粒子たとえばエンベロープウイルスの疎水性リガンド、および イオン性リガンドが包含される。好ましい実施態様においては、リガンドは抗体 または抗体フラグメントであり、たとえば非中和抗-ウイルス抗体またはそのフ ラグメントを包含する。本明細書に用いる抗体の語はモノクローナルおよびポリ クローナル抗体を包含する。とくに好ましい実施態様においては、リガンドは非 中和抗ヘキソン抗体である。このような抗体は、市販品を入手可能であり、たと えば、Chemicon International，Temecula，CA，USAから入手できるＭＡｂ8052 およびＭＡｂ805が包含される。 ウイルスへのポリマーの間接的非共有結合による付着は、ウイルスを予めポリ マーの共有結合付着によって修飾した適当なリガンドとインキュベートすること により達成される。ポリマーは上述したように標準方法によってリガンドに共有 結合で付着できる。たとえば、非中和抗-ウイルス抗体たとえば抗-ヘキソン抗体 は、上述のように活性化ＰＥＧ分子を使用してＰＥＧ化することができる。好ま しい実施態様においては、抗-ヘキソン抗体はＴＭＰＥＧを用いて修飾される。 通常の知識を有する熟練者は、抗体の至適な修飾を達成するため、活性化ＰＥＧ と抗体の至適な比率、活性化ＰＥＧおよび抗体の濃度、ならびにインキュベーシ ョンの緩衝液および時間と温度を決定することができる。ポリマー修飾リガンド をついでウイルス粒子とインキュベートして、ポリマー修飾リガンドをウイルス 表面に非共有結合させる。 エピトープ結合部位でＰＥＧにより修飾された抗体は、ウイルスに非共有結合 によっては効率的に付着しない。エピトープ結合部位での抗体のＰＥＧ化を避け るために、ＰＥＧ修飾を固定化された抗体上で実施することができる。たとえば 抗-ヘキソン抗体を精製された固定化ヘキソン（たとえばヘキソン-Sepharose） に、抗体のＰＥＧ修飾前に結合させる。ＰＥＧ化抗体をついで固定化ヘキソンよ り放出させる。別法として、抗-ヘキソン抗体をＰＥＧにより修飾し、エピトー プ結合部位および他の部位にＰＥＧ化された抗体の集団を創成する。修飾された 抗体をついで固定化ヘキソンとインキュベートして、これにエピトープ結合部位 以外の部位において修飾された抗体のみを結合させる。これらのＰＥＧ化抗体を ついで、本発明に使用するため固定化ヘキソンから遊離させる。 ポリマー修飾リガンドを介したポリマーの間接非共有結合による付着は、競合 固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）においてウイルスから標識リガンドの置換に よりモニターできる。たとえばＰＥＧ化-抗ヘキソン抗体がウイルス表面に結合 する能力は、たとえばビオチン化-抗ヘキソン抗体を用いて標準競合ＥＬＩＳＡ において測定される。 本発明のポリマー修飾ウイルスは、感染性を維持し、抗原性の低下を示す。本 発明によれば、ウイルスの感染性は付加的なポリマー修飾により最終的に低下す ることが見出されている。以下のアッセイを含む標準アッセイの利用により感染 性および抗原性を評価することによって、本技術分野の熟練者は、感染性の保持 および抗原性の低下を可能にするポリマー修飾の方法および条件を決定すること ができる。直接ＴＭＰＥＧポリマー修飾アデノウイルスを提供するように設計さ れた条件下においては、約５〜20％w/vのＴＭＰＥＧへの暴露によるＰＥＧ化に 関連する方法が好ましく、約10％w/vの濃度によるＰＥＧ化に関連する方法がと くに好ましい。 本発明のポリマー修飾ウイルスの感染性を維持する能力は標準感染アッセイで 評価できる。たとえば、ウイルスが細胞に感染する能力は、ウイルス内に含まれ る導入遺伝子たとえばレポーター遺伝子の発現をモニターすることによって評価 できる。遺伝的レポーターシステムは本技術分野で周知であり、たとえばShort Protocols in Molecular Biology ，1995，Ausubelら編，3版，Wiley and Sons， Inc．に開示されている。ウイルスは標準方法によって導入遺伝子を含有するよ うに操作し、ポリマー修飾ウイルスは、ウイルスに許される細胞を感染するのに 使用される。標準方法で感染したのち、細胞を溶解し、導入遺伝子の産物の存在 を分析する。たとえば、導入遺伝子の産物は発色法、ケミルミネッセンスもしく は蛍光アッセイまたはイムノアッセイにより評価できる。この方法では、本技術 分野の通常の熟練者は非修飾ウイルスと修飾ウイルスを比較し、ポリマー修飾ウ イルスによって感染性の維持を生じるポリマー修飾のための至適な百分率および 条件を決定することができる。感染性の維持は本明細書においては、治療的価値 を有するのに十分なレベル、たとえば非修飾ウイルスに対して少なくとも約20％ の感染性として定義される。一部の治療的実施態様では、ポリマー修飾ウイルス は少なくとも60％の感染性を維持する。他の治療的実施態様では、ポリマー修飾 ウイルスは少なくとも80％の感染性を維持することが好ましい。少なくとも５％ の低い百分率の感染性も、ウイルスの腫瘍崩壊のような適用には治療的に有用で ある。 感染性のアッセイの特定の例では、一般的にβ-ガラクトシダーゼ（β-gal） レポーター遺伝子（lacＺ）を含有するように修飾されたアデノウイルスを各種 濃度のＴＭＰＥＧに暴露することにより共有結合的に修飾する。アデノウイルス 感染に許される細胞系、たとえば293ヒト胚腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＣ1573）を β-gal遺伝子含有非修飾および修飾アデノウイルスに暴露する。細胞をつい でβ-galの発現に適当な条件下にインキュベートする。細胞溶解物中におけるβ -galの存在は標準発色法、蛍光法、または化学ルミネッセンス法によるアッセイ で測定される。293細胞溶解物中のβ-galの量は非修飾およびＰＥＧ修飾ウイル スの293細胞の感染能力の測定を提供する。非修飾ウイルスに対して、50％の感 染性を維持するＰＥＧ修飾ウイルスは感染性を維持するものとみなす。 本発明のポリマー修飾ウイルスは、非修飾ウイルスに対して抗原性の低下を示 す。抗原性の低下はポリマー修飾ウイルスのそのウイルスに対する中和抗体への 結合における統計的に有意な（ｐ＞0.05）低下として定義される。抗原性の低下 はインビトロおよびインビボのアッセイを含めた本技術分野で周知の方法により 評価できる。たとえば、レポーター遺伝子を含有する修飾および非修飾両ウイル スを、中和抗体または血清の存在下または不存在下にインキュベートする。抗体 処理ウイルスおよび抗体非処理対照ウイルスをついで上述のように用いて細胞を 感染させ、感染細胞内のレポーター遺伝子の発現を上述のように実施した。非修 飾ウイルスの場合、中和抗体による処理は低レベルの感染、すなわち低レベルの 導入遺伝子の発現を生じる。本発明のポリマー修飾ウイルスはポリマーコーティ ングによって中和から保護され、したがって、中和抗体に暴露された非修飾ウイ ルスに比べて本アッセイにおいて感染性の増大および導入遺伝子の発現の増加を 提供する。 上記アッセイを利用することにより、本技術分野の通常の熟練者は、感染性を 維持し抗原性の低下を示す修飾ウイルスを提供するのに必要なＰＥＧ修飾の条件 を決定することができる。 本発明の他の実施態様においては、導入遺伝子を標的細胞に導入する方法を提 供する。この方法は、本発明のポリマー修飾ウイルスを標的細胞に導入すること からなり、この場合ウイルスは導入遺伝子からなる組換えウイルスベクターであ る。本ポリマー修飾ウイルスを標的細胞への導入遺伝子の送達に使用することは たとえば、導入遺伝子産物が欠損した、不十分なまたは機能障害のある各種疾患 の処置に有用である。また、導入遺伝子の発現は、標的細胞において望ましくな い遺伝子または遺伝子産物の発現または機能を遮断する働きがある。 ポリマー修飾ウイルスは本技術分野において周知の方法により、たとえば感染 によって宿主細胞に導入される。インビボにおける標的細胞の感染は標的細胞を ポリマー修飾ウイルスと接触させることにより達成される。ポリマー修飾ウイル スは生理学的に許容される担体と組合わせた組成物として送達される。本明細書 で用いる「生理学的に許容される担体」の語は任意のすべての溶媒、希釈剤、等 張性試剤等を包含する。このような組成物のためのメジウムおよび試剤の使用は 本技術分野において周知である。本発明のポリマー修飾ウイルスは、たとえば摂 取、注射、エアゾル、吸入等を含む標的細胞に適当な方法によって、標的細胞に 送達される。組成物は組織たとえば脳もしくは腫瘍への注射により、または体腔 たとえば胸腔または腹腔への注射により静脈内へ送達することができる。好まし い実施態様においては、導入遺伝子はＣＦＴＲ、または標的細胞に機能的に調節 されたクロリドチャンネル活性を提供するその類縁体または変異体をコードする ＤＮＡ分子であり、複合体は吸入により気道上皮に送達される。ＣＦＴＲをコー ドするＤＮＡ分子は本技術分野において周知であり、たとえばＷＯ94/12649およ びＷＯ95/25796に開示されている。これらの開示は引用により本明細書に導入さ れる。 本発明はさらに、ウイルスを腫瘍に送達させるにあたり、本発明のポリマー修 飾ウイルスをこのような処置を必要とする患者に、ポリマー修飾ウイルスが腫瘍 に局在するような条件下に投与することからなる方法を提供する。本発明のポリ マー修飾ウイルスが、感染性の維持および中和抗体のインパクトの低下を提供す る能力は、ポリマー修飾ウイルスの使用の付加的方法を開くものである。サイズ 範囲100〜200nmの粒子はいわゆるＥＰＲ効果（上昇した透過性および貯留）に関 連して受動的な腫瘍標的化を受ける。腫瘍は漏れやすい脈管、したがって長い循 環粒子は循環を去って、腫瘍の血管における孔を通って腫瘍の軟組織に入る機会 がある。腫瘍は、組織からのマクロ分子および粒子の除去のための主要なシステ ムであるリンパ管を欠く（ＥＰＲの貯留要素の基礎）。ＰＥＧは、循環時間の増 加を介してリポソームの腫瘍への受動標的化を増大させるために使用されてきた 。しかしながら、科学論文におけるデータは、このアプローチが生成物の寿命の 大部分について受入れ難い低い腫瘍対血液比（すなわち、１未満）のような好ま しくない性質を招くことを示している。別の至適原理を使用して、循環時間 の改善以外のＰＥＧ化の付加的な効果がこの問題を解決するため開発され、良好 な腫瘍局在化と高い腫瘍対血液比の両者、ならびに高い腫瘍対正常組織比が達成 されることが示されている（ＷＯ96/34598）。すなわち、本発明はウイルス粒子 の腫瘍局在を改善する手段を提供する。これはウイルスベクターが遺伝子の送達 に使用される遺伝子療法的適用、および非遺伝子療法的適用の両者に関係する。 後者は、ウイルスの腫瘍崩壊を介して腫瘍細胞を殺滅する能力を有するｐ53欠損 腫瘍細胞の感染のため選択された最近見出されたシステムを包含するものである （Bischoff JR，Kirn DH，Williams A，Heise C，Horn S，Mura M，Ng L，Nye J A，Sampson-Johannes A，Fattaey，McCormick F，1996;Science 274:373-376;He iseら，1997，Nature Medicine 3:369-645;およびＥＰ689447Ａ，これらは引用 により本明細書に導入される）。 本方法によれば、ポリマー修飾ウイルスは患者に、上述のように生理学的に許 容される担体と組合わせたポリマー修飾ウイルス組成物として投与される。この 組成物は、腫瘍の位置から考慮して適当な方法より、たとえば摂取、注射、エア ゾル、吸入等を含む方法で投与される。好ましい実施態様においては、組成物は 静脈内に送達される。 本発明はさらに、ポリマー修飾ウイルス、およびさらに生理学的に許容される 担体からなる組成物を提供する。好ましい実施態様においては、ポリマー修飾ウ イルスは共有結合で付着したＰＥＧにより修飾された組換えウイルスベクターで ある。 組成物の処方は本技術分野で一般に周知でありRemington's Pharmaceutical S ciences，17版，Mack Publishing Co.，Easton，PAを参照すれば便利である。こ の複合体の投与に適当な形態には滅菌水溶液および分散液が包含される。主題の ポリマー修飾ウイルスは適当な生理学的に許容される担体および／または希釈剤 とともにその有効量を便利かつ有効に投与するための化合物である。 ヒトに適用される本発明の方法においては、用いられるポリマー修飾ウイルス の正確な有効量は、患者の年齢、体重および状態における個々の差を考慮して、 本技術分野の通常の熟練者により投与される。 投与上の便宜また投与量の均一性から、非経口投与用組成物は投与量単位剤形 に処方することがとくに有利である。本明細書において使用する投与量単位剤形 の語は、処置すべき哺乳動物患者の単位投与量として適当な物理的に個別の単位 を意味する。各単位は所望の効果を産生するように計算された活性物質の既定量 を所要の担体と配合して含有する。本発明の新規な投与量単位剤形の明細はポリ マー修飾ウイルスの独特の特性および混合技術に固有の制限により、またそれら に依存して意図される。組成物が補充的な活性成分を含む場合には、投与量はそ の活性成分の通常の用量および投与様式を参考に決定される。 本発明をさらに以下の特定の実施例により例示するが、これらはいかなる意味 でも本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 これらのアッセイを実施する場合、熟練した技術者には明らかなように、ウイ ルス表面に共有結合によって付着できない母体ポリマーへのウイルスの暴露およ びポリマーを含まない緩衝液中でのウイルスの処理は、ウイルスの感染性に影響 することがある。これらの作用は、用いられる活性化ポリマーの種類およびその 長さにより増悪することもある。したがって、ウイルス表面のポリマー修飾によ り感染性の非特異的低下が起こらないように注意が必要である。適当な対照には ウイルス表面に共有結合により付着できない母体ポリマーによるウイルスのシャ ム処理およびウイルスを同じインキュベーションであるが、ポリマー溶液を除い た緩衝液（非ポリマー緩衝液）に暴露する処理対照を包含させる。 実施例１ アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合による付着 ＭＰＧＥ₅₀₀₀を用いてトレシル-モノメトキシポリエチレングリコール（ＴＭ ＰＥＧ）を調製した。本実施例および以後の実施例では、とくに他の指示がない 限り、ＴＭＰＥＧはＷＯ95/06058(それぞれ、1995年６月６日および1996年２月2 3日に出願されたＵＳ出願08/471,348および08/601,040に相当する）に記述され たようにして調製した。この開示は引用により本明細書に導入される。 ２型アデノウイルス（β-galレポーター遺伝子をもつように遺伝学的に修飾し た）をＵＳ特許5,670,448に開示されたように、等密度CsCl密度遠心分離による バンディングで調製して（３ラウンド）、５％スクロース含有リン酸緩衝 食塩溶液（ＰＢＳ，ｐＨ7.2）に対し外延的に透析した。使用した保存溶液は6.4 ×10¹⁰感染単位/ml（4.8×10¹¹粒子/ml）を含有した。ウイルス保存株を、乾燥 ＴＭＰＥＧ、通常は保存液100μlに3.0mgの添加により３％w/vにした。サンプル は25℃において24時間、回転混合しながらインキュベートした。 ポリマー処理ウイルスを、Beckman P/ACE 5010システムと50μm内径の57cmシ リカ毛細管を用い（入口＝陰極）、毛細管電気泳動（ＣＥ）を介してモニターし た。1.5分間の予備的な１Ｍ NaOH中での洗浄ならびに第２の洗浄を流動緩衝液（ 20ｍＭリン酸塩緩衝液，ｐＨ7.0，5.0ｍＭ NaCl）中で実施した。インキュベー ション後、サンプルをＣＥ装置に移すと、ここでオートサンプラーが数ナノリッ トルを10ｓにセットした加圧注入器によって除去し、分離は最終の17Kvまで２分 の段階的電圧を用いて行った。 全ウイルスＣＥは、ＰＥＧによる処置時のウイルスの表面電荷における変化を モニターする。ＰＥＧとのインキュベーションはウイルスに対するより中性な移 動性の進行的な増加と相関する。中性の増加はウイルス表面上のＰＥＧ鎖の密度 の増加と一致する。 図１（上方パネル）は、３％（w/v）ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧに対して暴露 されたアデノウイルスに二重焼き付けした毛細管エレクトロフェログラフを示す 。各プロットにおける脱落部分は中性点によりマークされる。ＴＭＰＥＧ処置ウ イルスはシャム処置ＭＰＥＧよりも中性点に有意に近い位置を進行した。これら のＰＥＧ化条件下には、残留非ＰＥＧ化ウイルスは明らかでない（すなわち、対 照ウイルスに相当するＴＭＰＥＧトレース上のピークまたは肩はない）。 移動性のシフトが人為的なものではないことを確認するため、２つのサンプル の等容量の混合物を負荷した（図１、下方パネル）。上方パネルに示したピーク に相当する２つのよく分離されたピークが明らかであった。 図２は、300μlのウイルス保存液と３％（w/v）ＴＭＰＥＧを用いてほぼ上述 のように調製したウイルスのＴＭＰＥＧ３％（w/v）暴露時の電気泳動における 移動性の変化の時間経過を示す。％移動性は以下のようにして計算した。すなわ ち（修飾ウイルスのピークの移動性−中性位置の移動性）／（非修飾ウイルスの ピークの移動性−中性位置の移動性）×100である。反応共生成物が流動緩衝液 に影響することがあるので、これは矢印を付した点で更新した。すなわち、100 μlの反応混合物をこの点まで分析し（ＣＥ装置の反復サンプリング機能を用い て、すなわち混合せず）、以後は反応混合物の新鮮な100μlアリコートを使用し た。 実施例２ アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合による付着 実施例１と同様に調製した２型アデノウイルスの保存溶液（1.35×10¹⁰感染単 位/ml;9.3×10¹¹粒子/ml）を、反復したサイズ分析が可能なように回転混合を使 用しないほかは３％（w/v）ＴＭＰＥＧを用いてＰＥＧ化した。 ウイルスの粒子サイズは、Malvern InstrumentのZetaMaster 5で光子相関分光 光度法（ＰＣＳ）を用いてモニターした。 図３ａおよび３ｂは、それぞれＴＭＰＥＧ処理および非処理ウイルスの直径対 時間を示す。結果は％時間０値で表す。図３ｃおよび３ｄは長期にわたるＰＥＧ 化反応時に得られた測定値を示す。ＴＭＰＥＧとの反応は図３ｄに、ＭＰＥＧに よるシャム処理は図３ｃに示す。ＴＭＰＥＧ処理は粒子サイズの増大を生じ（図 ３ｂおよび３ｄ）、これは対照の非処理ウイルス（図３ａ）またはＭＰＥＧ処理 ウイルス（図３ｃ）では認められない。サイズの増加は、図３ｂおよび３ｄに示 す。ＰＣＳは数のデータを与え、したがって、この方法はサンプルを能力により ランクづけできる利点がある。 実施例３ ＰＥＧ化およびシャム処理ウイルスの感染性アッセイ ＰＥＧ処理の数種の基準を感染性の残留に関して評価した（実施例４参照）。 ３％（w/v）ＴＭＰＥＧへの暴露に加えて、段階的添加も使用した（高い最終的 なＰＥＧ化を達成する目的で）。段階的添加の背後にある理由は、ウイルス粒子 に凝集する傾向があること、およびこれはとくに高濃度でＰＥＧにより増悪する ことである。しかしながら、ＰＥＧ化は、他の粒子に関連して（たとえば、リポ ソーム）凝集を防止することが示されている。すなわち低ポリマー濃度での初期 のＰＥＧ化は以後の高いポリマー濃度での凝集傾向を低下させるように働くこと が可能で、したがって高度のＰＥＧ化を達成できる。３段階での添加基準が使用 された。すなわち、ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧは、ウイルス保存溶液（実施例１ のように調製）に30分毎に添加し、反応混合物中のポリマー濃度を３％、５％ま たは８％ずつ増加させた。これらの実験に用いたウイルス保存溶液は1.35〜7.6 ×10¹⁰感染単位/mlおよび9.3〜20×10¹¹粒子/mlの範囲とした。各実験で、乾燥 粉末の最大４回添加を行い、最終ポリマー濃度を12％、20％および32％とした（ おおよそのw/v，すなわち、ポリマーの容量による補正は行わない）。一部の実 験では、第４の添加は30分後にサンプリングを行いさらにインキュベーション時 間を設けた（５反応条件を与えた）。 感染性は２つの方法で測定した（実施例４参照）。β-gal発現を培養液中ウイ ルスに暴露したヒト293細胞（Grahamら，J.Gen.Virol．36:59-72，1977）中でモ ニターした（この細胞系はアデノウイルスの複製を許容する）。アッセイの前に 細胞を１日トリプシン処理し、１×10⁶/ml細胞懸濁液を用いて、24ウエルマイク ロタイタープレートに各ウエルあたり400μlを接種した。24時間までに単層が確 立されたので、反応混合物10μlを293細胞を含む４個のレプリケートウエルのそ れぞれに加えた。細胞を完全に加湿された大気中５％ＣＯ₂雰囲気下、37℃で一 夜インキュベートしてβ-galを発現させた。 細胞単層からメジウムを枯渇させついでＰＢＳで洗浄した。ついで溶解緩衝液 (15％ triton X-100，250ｍＭ Tris−HCl，ｐＨ7.0）60μlを加え、マイクロタ イタープレートを回転シェーカー中室温において30分インキュベートした。細胞 を30分間溶解したのちに、各サンプル50μlを新たなマイクロタイタープレート に移した。同じマイクロタイタープレートにβ-gal標準のセット（溶解緩衝液中 5.5単位を溶解緩衝液中二重に希釈）を添加した。ＣＰＲＧ基質緩衝液（1.6ｍＭ ＣＰＲＧ，60ｍＭリン酸塩緩衝液；１ｍＭ MgSO₄；10ｍＭKCl；50ｍＭ β-メル カプトエタノール：250mlの蒸留水）150μlを各ウエルに加えた。短時間（４分 間）混合したのち、プレートをマイクロタイタープレートリーダー（Titertek M ultiskan Plus MKII，ICN，flow Laboratory，Switzerland）上555nmで読み取っ た。 ３％（w/v）ＴＭＰＥＧの単回添加はＣＰＲＧアッセイを用いて検査した。図 ４は、ＴＭＰＥＧ処理ウイルス（白丸）およびＭＰＥＧシャム処理ウイルス（三 角）ならびに対照ウイルス（黒丸）についてのＣＰＲＧアッセイの結果を示す。 いずれの処理も試験した期間（６時間）にわたり感染性の低下の傾向を生じなか った。第二の独立した実験では、対照ウイルス、ＴＭＰＥＧ処理ウイルスまたは ＭＰＥＧシャム処理ウイルス（データは示していない）のいずれでも、６時間に わたり、ＯＤに有意な低下傾向は示さなかった。すなわち、実施例１および２に おけるウイルスのＰＥＧ処置では感染性に低下のないことが証明された。 ５％のＰＥＧ₅₀₀₀，ＰＥＧ₁₂₀₀₀またはＰＥＧ₂₀₀₀₀の段階的添加は、感染性に 様々なインパクトを生じた（図５）。パネルＡおよびＢは５％ ＰＥＧ₅₀₀₀の段 階的添加のインパクトを示す（各２の平均および４レプリケートの平均±ＳＤ， 一部のバーは記号により隠されている）。ＴＭＰＥＧ（黒丸）はＭＰＥＧ（白丸 ）に比べて感染性の低下を生じた。ＰＥＧ₁₂₀₀₀（パネルＣおよびＤ、同じ記号 ）では、ある実験ではＴＭＰＥＧはウイルスの感染性をＭＰＥＧ処理ウイルスに 比べて低下させたが、他ではＭＰＥＧとＴＭＰＥＧには有意差はなかった（すな わち、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧは感染性に対して同じ作用を有した）。またＴ ＭＰＥＧ₂₀₀₀₀による処理は等量のＭＰＥＧ₂₀₀₀₀より有意に大きな作用を示すこ とはなかった（パネルＥ，同じ記号）。 実施例４ ＰＥＧ化およびシャム処理ウイルスについての感染性アッセイ ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧの単回および段階添加は実施例３のように調製し、 ウイルスによってコードされたβ-ガラクトシダーゼの検出のための化学ルミネ ッセントのレポーターアッセイシステム（Galacto-Light−登録商標）を使用し て感染性について分析した。このアッセイシステムは化学ルミネッセント基質を 使用し、製造業者の説明書に従って実施した。 図６ａ〜ｃは、ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（黒丸）またはＭＰＥＧ₅₀₀₀（白丸）の３％、 ５％および８％の漸増添加のウイルスの感染性に対する影響を比較する。図６ａ およびｂにおいて、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理ウイルスサンプルは同じ感染 性を示すことに留意すべきである。ＭＰＥＧまたはＴＭＰＥＧのいずれかによる 処理では感染性のわずかな低下傾向が観察された。ＰＥＧの対照を用いない以後 の実験では、これらは感染性に同様の低下傾向を示し、これは処理効果であ り、ＰＥＧによるものではないことが示唆された。図６ｃでは、ＭＰＥＧおよび ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは同様に実施した。すなわち、この実験はＴＭＰＥＧま たはＭＰＥＧでの処置は感染性の喪失を生じないことを示す。 ＰＥＧ鎖の添加による見掛け上の感染性の喪失は、５％漸増添加スキームでの ＰＥＧ₅₀₀₀を用いた実験において２回観察された（図７ａおよびｂ。黒丸：ＴＭ ＰＥＧ，白丸：ＭＰＥＧ）。同じサンプルの以後のアッセイでは図７ｂに示すよ うに、ＭＰＥＧとＴＭＰＥＧ処理の間に有意の差は認められず、有意な感染性の 喪失は実際に起こらなかったことを指示した（図７ｃ，同じ記号）。 図８は、ＰＥＧ₁₂₀₀₀（パネルＡおよびＢ，黒丸：ＴＭＰＥＧ，白丸：ＭＰＥ Ｇ）およびＰＥＧ₂₀₀₀₀（パネルＣ，同じ記号）の匹敵する結果を示す。上述の ように、条件０は非処理ウイルス対照を、条件１〜４は、５％ＴＭＰＥＧまたは ＭＰＥＧの段階的添加である。ＰＥＧ₁₂₀₀₀については、２回の実験の１つで、 ＴＭＰＥＧの３回目および４回目の添加後にＴＭＰＥＧによるわずかな感染性の 喪失があった（パネルＢ）。ＰＥＧ₁₂₀₀₀を用いた他の実験では（パネルＡ）、 ＴＭＰＥＧでもＭＰＥＧでも、感染性における有意な低下は観察されなかった。 ＰＥＧ₂₀₀₀₀では、ＴＭＰＥＧ処理は、最初の添加を含むすべての添加について ＭＰＥＧよりも低い感染性を生じたが、ＴＭＰＥＧの４回目の添加後にも初期の 感染性の値のほぼ1/3は残存していた。 ３％ＰＥＧ₅₀₀₀の単回添加すなわち実施例３における製造では、化学ルミネッ センスアッセイでわずかな感染性の低下傾向があった（図９）。長時間にわたっ て観察された感染性の低下傾向はＴＭＰＥＧ（黒丸）およびＭＰＥＧ処置ウイル ス（白丸）の場合の両者ならびに非処置「処理」対照（三角）でも見られた。 実施例５ 中和抗体による感染性の低下に対するＰＥＧ化のインパクト 実施例４に示した感染性のアッセイを用い、ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧ処理ウ イルスの中和抗体への暴露を使用して、ポリマー処理によって与えられる中和抗 体からの保護の証拠を探究した。 導入遺伝子の発現をウサギ抗-ヘキソン血清からヘキソン親和性樹脂を用いて 精製したポリクローナル中和抗体の存在下および不存在下にモニターした。ポリ クローナル抗体は非処理ウイルスで力価を測定し、中和抗体の存在下に30〜50％ の感染性が残存している比率を確立した。10,000:1（〜30％）もしくは5,000:1 （〜40-50％）と指示された（抗体分子対ウイルス粒子）２種の抗体力価を使用 した。 図10〜12は、抗体の中和における５％ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀（図10および11）および ＴＭＰＥＧ₁₂₀₀₀（図12）の漸増添加のインパクトを示す。抗体処理は黒い記号 により、ＭＰＥＧ処理は丸い記号により、ＴＭＰＥＧ処理は四角い記号により示 す。下方のパネルでは、斜線入りの棒グラフはＴＭＰＥＧ処理を指示する。 すべての３つの場合、中和からの有意な保護および最大の保護を与える最高／ 最長のＴＭＰＥＧ暴露での保護の改良傾向が明らかである。各図の上方のパネル は生データを示し、下方のパネルは同等の非抗体処置対照の％として導入遺伝子 の発現を表す。図10では、アッセイに加えるウイルスの量は非抗体処置対照の感 染単位の数の差を補償するように調整した。図11および12では、各条件について 同数のウイルス粒子をアッセイした。抗体力価は、それぞれ10,000:1，5,000:1 および10,000:1とした。 これらのデータは免疫認識からの保護を示す。明瞭にするため、保護は、試験 される免疫剤（たとえば、抗体または細胞懸濁液）の存在下において非処理対照 に観察された発現と比較した導入遺伝子の統計的に有意な発現と定義する。 ３％ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀の単回添加は２つの独立のアッセイにおいて４時間および ６時間のインキュベーション後にある程度の保護を示した。上記例における結果 と合わせて考えると、ＰＥＧによる処理がすべての感染性を除去しないで、抗体 による中和から統計的に有意な保護をもたらすＰＥＧ化の「ウインドウ」の存在 を指示する。 実施例６ 非中和抗-ヘキソン抗体を用いるアデノウイルスの間接的ＰＥＧ化 本発明はポリマー修飾ウイルス、それらを得る方法、およびそれらの使用に関 する。本発明はまた、ポリマー分子をウイルス粒子に付着させ、一方、修飾ウイ ルスの感染性は維持する手段を提供する。 抗-ヘキソン抗体のＰＥＧ化に関する初期の実験は、Chemicon（Mab 8052）か らの市販の抗-ヘキソン抗体を使用した。２種類の活性化ＰＥＧを抗体、すなわ ち、シアヌル酸クロリド活性化ＰＥＧおよびＰＥＧトレシレート（ＴＭＰＥＧ） をＰＥＧ化するそれらの能力について試験した。ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀はShearwater P olymers，Huntsville，ALから入手した。 ＴＭＰＥＧを用いる抗-ヘキソン抗体のＰＥＧ化は以下のようにして達成され た。すなわち、50μgのMab 8052をＴＭＰＥＧと次のＰＥＧ：リジンのモル比0.2 :1，0.5:1，1:1，2:1，5:1でインキュベートした。ＴＭＰＥＧと抗体を室温で１ 時間、"Vari-Mix"上で穏やかに振盪しながらインキュベートし、ついで反応混合 物をさらに使用するまで４℃または−80℃において保存した（一部の実験では、 ＰＥＧ処理を過剰のリジンを用いて停止させた。しかしながら、サンプルをフル オレスカミンアッセイで分析したところ、反応は温度を下げることによって停止 した）。モル比を計算するとＩｇＧあたり90リジン残基と推定された。ＴＭＰＥ Ｇで処理したＩｇＧのフルオレスカミンアッセイはLaurelらの方法（1994）Meth ods in Enzymology 228（引用により本明細書に導入する）によって実施し、Ｔ ＭＰＥＧで処理した抗-ヘキソン抗体のリジン置換の量を評価した。このアッセ イではＰＥＧで処理したリジン残基はフルオレスカミンとの反応に利用されない ことから、抗体結合フルオレスカミンの相当する低下を生じる。フルオレスカミ ンアッセイの結果は図13に示す。ＩｇＧリジンの％修飾は１−（修飾ＩｇＧ勾配 ／非修飾ＩｇＧ勾配）として、Laurelらの方法を用いて計算した。結果は表１に 示す。 ＰＥＧ：リジンの比の増加は、ＰＥＧで置換されたリジン残基の数の相当する 増加を招くか、またはＰＥＧによる処理はＩｇＧ上の利用可能な遊離のリジン残 基数を低下させると結論される。 シアヌル酸クロリド活性化ＰＥＧを用いた抗-ヘキソン抗体のＰＥＧ化は次の ように達成された。抗-ヘキソン抗体Mab 8052を0.1Ｍ重炭酸ナトリウムｐＨ９中 に透析した。透析後、25μgのMab 8052をシアヌルクロリドで活性化したｍＰＥ Ｇと、ＰＥＧ：リジン残基を2:1，10:1，100:1と増加させインキュベートした。 ＰＥＧと抗体は室温で１時間、"Vari-Mix"上で穏やかに振盪しながらインキュベ ートし、ついで反応混合物をさらに使用するまで、４℃または−80℃で保存した 。モル比を計算するとＩｇＧあたり90リジン残基と推定された。ＰＥＧ化抗-ヘ キソン抗体のリジン置換量を評価するためには、ＰＥＧ処理したＩｇＧのフルオ レスカミンアッセイをLaurelらの方法（1994）Methods in Enzymology 228に従 って実施した。フルオレスカミンアッセイの結果を図１４に示す。 ＩｇＧリジンの％修飾は１−（修飾ＩｇＧ勾配／非修飾ＩｇＧ勾配）としてLa urelらの方法を用いて計算した。結果は表２に示す。 抗-ヘキソン抗体Mab 8052はシアヌルクロリド活性化ｍＰＥＧを用いて成功裡 にＰＥＧ化されたと結論される。ＰＥＧ化反応時にＰＥＧ：リジンの比を増加さ せると、抗体上のリジン残基の修飾に相当する増加を生じることがフルオレスカ ミンアッセイを用いて示された。 実施例７ ＰＥＧ化抗-ヘキソン抗体はなおウイルスのヘキソンを認識することの証明 ＴＭＰＥＧ修飾Mab 8052（実施例６で調製されたように100:1のＰＥＧ：リジ ン比で修飾）および非修飾抗体を、アデノウイルスの界面活性剤溶解分画ととも に４℃で２時間インキュベートした。抗体抗原複合体をStaph A膜で捕獲し、Ｓ ＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した。図15は、ＰＥＧ化抗体がウイルスヘキソンの 免疫沈降において非ＰＥＧ化抗体と同等に有効であることを示している。すなわ ち、ＰＥＧ化は抗体の抗原認識部位に全体的に影響しなかった。 実施例８ ＰＥＧ化抗-ヘキソン抗体を用いる間接アデノウイルスＥＬＩＳＡ ＰＥＧ化抗-ヘキソン抗体がなおアデノウイルスを認識することを証明するた めに間接アデノウイルスＥＬＩＳＡも実施した。ＥＬＩＳＡの操作は次の通りで ある。すなわち、マイクロタイタープレートの96のウエルに、コーティング緩衝 液（100ｍＭカルボネート，ｐＨ9.2，Pierce）中不活性化アデノウイルス0.1μg を取り４℃で一晩インキュベートした。一夜インキュベーション後プレートに各 ウエルあたり150μlのブロック緩衝液を加え、37℃で１時間インキュベートした 。プレートを、洗浄緩衝液(0.05％Tween 20，0.5％ＢＳＡ含有ＰＢＳ， Pierce）で３回洗浄した。ついでウエルに、1:250に希釈した抗体（対照、実施 例６で調製したＴＭＰＥＧ−Abおよび実施例６で調製したシアヌル酸クロリドＰ ＥＧでＰＥＧ化した抗体）２mg/mlを含む溶液100μlを加えた。抗体の２倍希釈 系列をプレートを横切って作成した。プレートを抗体と一夜インキュベートし、 ついでウエルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ウイルスに結合した抗体を標準スト レプトアビジン-ＨＲＰアッセイキット（Pierce Chemical，Rockfold，IL）を用 いて定量した。結果は表３に示す。 表２の結果は、シアヌル酸クロリドＰＥＧでＰＥＧ化した抗-ヘキソン抗体が 対照またはＴＭＰＥＧでＰＥＧ化した抗体に比較して、アデノウイルスに対する 力価が低いことを証明する。これは、ＴＭＰＥＧを用いた抗体のＰＥＧ化が、シ アヌル酸クロリド活性化ＰＥＧよりも、大きな程度の抗体の抗原認識部位を保存 することを示唆する。 抗体のＰＥＧ化が、ウイルス抗原に対する抗体の親和性に大きな変化を生じる が否かを決定するために、競合ＥＬＩＳＡを設計した。抗-ヘキソン抗体をＴＭ ＰＥＧまたはシアヌル酸活性化ＰＥＧでＰＥＧ化した。ＴＭＰＥＧでＰＥＧ化し た抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおけるビオチン化抗-ヘキソン抗体の競合によって 示されるように、シアヌル酸クロリド活性化ＰＥＧでＰＥＧ化した抗体よりも、 良好にウイルスに結合できた。ＥＬＩＳＡプレートは実施例９に記載したように アデノウイルスでコートした。コーティング後、ウエルにビオチン化抗体単独、 またはビオチン化抗体とＴＭＰＥＧ抗体またはシアヌル酸クロリド-ＰＥＧ抗体 を加えた。ウイルスに結合したビオチン化抗体を、ついで標準ストレプトアビジ ン-ＨＲＰアッセイを用いて定量した。ＰＥＧ化抗体がビオチン化母体抗体とウ イルス上の部位で効率的に競合できるならば、ウイルス表面に結合するビオチン 化抗体の量が低下し、低い力価を生じるはずである。結果を表４に示す。 表４は、ＰＥＧ：リジン10:1および100:1の比でＴＭＰＥＧによりＰＥＧ化し た抗体は、ウイルスに対してビオチン化母体抗体となお効率的に競合できたこと を示している。これがウイルスに結合したビオチン化抗体の量を低下させ、した がって低い力価を生じた。ＰＥＧ：リジン200:1の比でＴＭＰＥＧによりＰＥＧ 化した抗体はビオチン化母体抗体との競合において効果的ではなく、このＰＥＧ の高い比では抗体の抗原結合部位が低下していることを示唆する。 シアヌル酸クロリド活性化ＰＥＧでＰＥＧ化された抗体はウイルスに対する結 合でビオチン化母体抗体と効率的に競合せず、シアヌル酸クロリド活性化ＰＥＧ によるＰＥＧ化は抗体の抗原結合部位を低下させることを示唆する。 実施例９ ＰＥＧ化抗体による間接的ＰＥＧ化 American Type Culture Collection，Rockville，MDのハイブリドーマ細胞系 HB8117から精製した非中和抗-ヘキソン抗体を、ウイルスにＰＥＧを付着させる リガンドとして使用した。抗体をＰＢＳ中、回転ミキサーを用いて室温で２時間 、ＴＭＰＥＧ（実施例１に記載）とインキュベートした。抗体の最終濃度は、10 0μg/mlであり、ＴＭＰＥＧは過剰のＴＭＰＥＧ：ＮＨ₂を与えるように10.6mg/m lを加えた。過剰のＴＭＰＥＧはグリシンを加えて中和し、さらに２時間インキ ュベートした。 抗体のＰＥＧ化はゲル透過性クロマトグラフィーによって示されるサイズの増 大により確認した（図16）。抗体プレパレーションは有意な割合の残留非修飾抗 体を含まなかった（非修飾位置における補足的なピークの欠落に注意）。抗体を ＴＭＰＥＧ-5Ｋの濃度を増加させてインキュベートすると、タンパク質のピーク は修飾の程度の増大を指示する約11.1mlから約9.5ml，9.1mlおよび8.95mlへと進 行的に置換された（図16，左パネル）。10.6mg/mlおよび22.5mlで調製した反応 混合物は有意な割合の残留非修飾抗体を含まなかった（非修飾位置における補足 的なピークの欠落に注意）（図16，上方２つの左パネル）。しかしながらＴＭＰ ＥＧ濃度を45mg/mlに増加させると（図16，下方左パネル）、反応混合物は少量 の非修飾抗体を含有した。これは、高濃度のポリマーにより誘導されたタンパク 質の部分的沈殿によるものと思われ、すなわち、タンパク質をＰＥＧ化に利用不 能にするものであろう。抗体を、ＴＭＰＥＧ-12Ｋとインキュベートすると、タ ンパク質ピークの約7.98mlおよび7.52mlへの置換を招いた（図16，右パネル）。 いずれの混合物も有意な割合の非修飾抗体を含まなかった。タンパク質溶出ピー クのＰＥＧ化による置換は、ＴＭＰＥＧ-5Ｋで調製された接合体に観察されるよ りも、ＴＭＰＥＧ-12Ｋで得られた接合体の場合の方がより顕著であった。すな わちＴＭＰＥＧ-12Ｋで得られた接合体は、ＴＭＰＥＧ-5Ｋで得られた接合体よ りも、大きい全体的な流体力学的半径を有する。大きな流体力学的半径は、ａ） ＴＭＰＥＧ-5Ｋの場合よりもＴＭＰＥＧ-12Ｋの場合のＰＥＧ鎖あたりの大きな インパクト、ｂ）ＴＭＰＥＧ-5ＫよりもＴＭＰＥＧ-12Ｋに付着したＰＥＧ鎖の 方が大きな数のいずれかを指示するものであろう。しかしながら、クロマトグラ ムはこれらの２つの可能性の間の識別を可能にするものではない。 修飾程度の範囲をカバーするＰＥＧ化抗体の５種のプレパレーション、３種の ＭＰＥＧ-5Ｋ抗体接合体（Superose 12カラム上の溶出容量それぞれ9.31ml，9.0 8mlおよび8.96mlのプレプ１〜３）および２種のＭＰＥＧ-12Ｋ抗体接合体（Supe rose 12カラム上の溶出容量それぞれ7.98mlおよび7.72mlのプレプ４および５） についてウイルス表面への結合について試験した。 ＰＥＧ化抗体は、ビオチン化抗-ヘキソン抗体を用い、競合ＥＬＩＳＡにおい てウイルスに結合することが可能である（図17）。マイクロタイタープレートの ウエル（96ウエル）に、コーティング緩衝液中1μg/mlの不活性化アデノウイル ス保存株100μlを加え、４℃で一晩インキュベートした。一夜インキュベーショ ン後、プレートに各ウエルあたり150μlのブロック緩衝液を加え、37℃で１時間 インキュベートした。プレートを、ついで各ウエルあたり400μlの洗浄緩衝液で ３回洗浄した。ウエルについで、21.6ｎＭのビオチン化抗体および1.1ｎＭ〜540 ｎＭの濃度範囲で増加する試験抗体（対照、ＭＰＥＧ処理またはＴＭＰＥＧ処理 ）を含有する溶液100μlを添加した。プレートを37℃で１時間インキュベートし 、ついで、ウエルを洗浄緩衝液400μlで３回洗浄した。ウイルスに結合したビオ チン化抗体を、次に標準ストレプトアビジン-ＨＲＰアッセイを使用して定量し た。不活性化アデノウイルス２型保存株200μg/バイアルはLeeBiomolecular Res earch，San Diego，CA，Cat.No.405001から、凍結乾燥型として得られた。１μg /mlの保存液を製造するためには、凍結乾燥粉末を１mlの蒸留水に溶解し、つい で50μlをコーティング緩衝液で10mlまで希釈した。 コーティング緩衝液は100ｍＭカルボネート、ｐＨ9.2（Pierce）とした。ブロッ ク緩衝液は0.05％Tween 20，0.5％ＢＳＡ（Pierce 10×）とした。洗浄緩衝液は 0.05％Tween 20含有ＰＢＳとした。ビオチン化抗体は10.8μＭ濃度とした。 図17は、非処理モノクローナル抗-ヘキソン抗体（点線）、ＭＰＥＧ（白丸） およびＰＥＧ-抗体（黒丸）とインキュベートしたモノクローナル抗-ヘキソン抗 体の濃度を増大させて存在させた場合の、ウイルス表面へのビオチン化抗-ヘキ ソン抗体の結合を示す。後者はモノクローナル抗-ヘキソン抗体のＴＭＰＥＧと のインキュベーションによって得られた（クロマトグラムは図16参照）。ＰＥＧ 化抗体はウイルス表面へのＰＥＧの結合のための別のアプローチとして働く。 実施例10 ＰＥＧ化アデノウイルスベクターの定量分析 Ad2/β-ga12ベクター（ＵＳ特許5,670,488ならびにZabnerら，1996;J.Virol 7 0 :6994に記載されている）を0.01％，0.1％,1.0%または5.0％のビオチン化ＮＨ Ｓ-ＰＥＧ₅₀₀₀（Shearwater Polymers）によりＰＥＧで共有結合によって修飾し た。ＰＥＧ化ベクタータンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ- ＰＡＧＥにより、ヘキソン、ペントンベースおよび線維はＰＥＧによる共有結合 的修飾の一次標的であり、ＰＥＧの濃度の増加は、付加的タンパク質の修飾を導 くことが証明された。 アデノウイルスのＰＥＧ化もまた定量的に評価した。Ad2/β-ga12ベクターを 、ＴＭＰＥＧ-ビオチンの量を５％，10％，またはＮＨＳ-ＰＥＧ-ビオチンの量 を0.01％，0.1％，１％，５％に増加させて処理した。両ＰＥＧ₅₀₀₀はいずれもS hearwater Polymersから入手した。ＰＥＧの段階的添加は、ＴＭＰＥＧ-ビオチ ンについては１時間、ＮＨＳ-ＰＥＧ-ビオチンについては２時間の期間まで30分 毎に行った。ＰＥＧ処理後、非処理ＰＥＧはＰＥＧ-ウイルスからCsCl勾配精製 によって分離し、ウイルスに付着したＰＥＧ-ビオチンの量はレポーターとして アビジンＨＲＰを用い、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。ＰＥＧ-ビオチ ン（0〜250ng/ml）の標準曲線はウイルス粒子に付着したＰＥＧ-ビオチンの分子 数を決定するために発生させた。結果は表５に示す。 アデノウイルスのＴＭＰＥＧ-ビオチンまたはＮＨＳ-ｍＰＥＧ-ビオチンいず れかの処理は、ウイルス表面へのＰＥＧ-ビオチンの共有結合的付着を導いた。 データは、匹敵する濃度のトレシルおよびＮＨＳ-ＰＥＧ-ビオチンにおいて、さ らに多くのＰＥＧ-ビオチンが、ＮＨＳ-ＰＥＧ-ビオチン処理後にウイルス粒子 に付着したことを指示し、これはＮＨＳ-ＰＥＧとリジンの反応が、延長された 時間（２〜３時間）にわたって起こるリジン残基とトレシルｍＰＥＧの反応に比 べて速やかに（30〜45分）起こるとの報告と一致する。 このデータは共有結合したＰＥＧの範囲に関しての定量的結果を提供する。 実施例11 アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合による付着 ２型アデノウイルス（β-galレポーター遺伝子をもつように遺伝的に修飾）は 等密度CsCl密度遠心分離による帯状化ついでリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ，ｐＨ 7.2）に対する外延的透析により調製した。３種の異なる型のｍＰＥＧすなわち 、ａ）シアヌル酸クロリド活性化ｍＰＥＧ₅₀₀₀，ｂ）ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀，およびｃ ）アミノ-ＰＥＧ₅₀₀₀をアデノウイルスをＰＥＧ化するそれらの能力について試 験した。ｍＰＥＧはShearwater Polymersから入手した。ｍＰＥＧのシアヌル酸 クロリドによる活性化は、１個のｍＰＥＧ分子あたり１個のトリアジン環がカッ プリングする。この活性化されたｍＰＥＧはタンパク質上のアミノ基と反応する ことができる。また、ｍＰＥＧはトレシルクロリド（2,2,2-トリフルオロエタン スルホニルクロリド）により活性化されて、タンパク質上のε-ア ミノ基と反応可能で高度に安定なアミン連結を形成するトレシル化ｍＰＥＧを形 成する。ＳＰＤＰ-アミノｍＰＥＧはタンパク質にシステイン残基を介してカッ プリングする。ＳＰＤＰの活性化ＮＨＳエステル末端はアミノＰＥＧ上のアミノ 基と反応しアミド連結を形成する。他の末端における2-ピリジルジチオール基は 遊離でありスルヒドリル基と反応してジスルフィド連結を形成できる。ＳＰＤP- アミノＰＥＧは、メタノールの存在下アミノＰＥＧにＳＰＤＰ（Ｎ-スクシンイ ミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート）の付加により合成された。一夜 室温でインキュベーション後、ＳＰＤＰ-アミノＰＥＧをエーテルで沈殿させて 集めた。 Ａd2/β-ga12ウイルスをａ）シアヌル酸クロリド活性化ｍＰＥＧ，ｂ）ＴＭＰ ＥＧ、またはｃ）アミノＰＥＧのいずれかと、ＰＥＧ：リジンの比を上昇させて インキュベートした。Ad2/β-gal2ウイルスを、0.15Ｍ NaClを含有する0.1Ｍ炭 酸ナトリウム緩衝液ｐＨ8.5に透析しついでシアヌル酸クロリド活性化ｍＰＥＧ で処理するか、または0.15Ｍ NaClを含有する0.2Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ 7.5に透析しついでＴＭＰＥＧで処理した。ＰＥＧ化反応はすべて室温で実施し た。サンプルを、ロータリープラットフォーム上で混合した。ＰＥＧ化反応は過 剰のリジンの添加または温度を低下させることによって停止させた。ＰＥＧ化ウ イルスの感染性は、ＰＥＧ化ウイルスで293細胞を感染させ、ついで導入遺伝子 の発現（β-ガラクトシダーゼ）をＸ-gal染色を用いて測定することにより最初 に評価した。このアッセイを用いて、ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは、シアヌル酸ク ロリド活性化ＰＥＧまたはＳＰＤＰ-ＰＥＧで処理したウイルスよりも高い感染 性をもつことが分かった。ＴＭＰＥＧ処理ウイルスについてはさらに、Rich DP ，Couture LA，Cardoza LM，Guiggio VM，Armentano D，Espino PC，Hehir K，W elsh MJ，Smith AE & Gregory RJ，1993;Hum.Gen.Ther，4:461-476に記載された ように、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）-接合抗-ヘキソン抗体を用い293 細胞中終点希釈のさらに定量的なアッセイを使用して感染性を測定した。 結果は表６に示し、ウイルスの感染性はＴＭＰＥＧによるＰＥＧ化ののちにも 維持されることを証明した（アッセイの誤差は±0.5log）。 実施例12 ＰＥＧ化ベクターに対する中和抗体の結合の低下 Ad2/β-gal2ウイルスを、実施例11に記載のようにＴＭＰＥＧでＰＥＧ化した 。ウイルスを、中和抗体ヒト血清の２倍系列希釈と１時間37℃インキュベートし 、293細胞を加えた。アッセイは単独でインキュベートした293細胞がコンフルー エントに達したときに読み取った。中和力価は、血清に暴露しないウイルスとイ ンキュベートした細胞に比較して、細胞変性作用から293細胞の検出可能な保護 を示した血清最高希釈の逆数として定義した。アッセイに先立ち100％の細胞変 性作用が起こる最低の希釈を確かめるために、試験する様々なウイルスプレパレ ーションについてその力価を試験した。結果は表７に示す。 この結果によれば、非処理ウイルスに比較してＰＥＧ化ウイルスを中和するた めには、より多くの血清を要し、ＰＥＧ化は中和抗体によって認識される部位を カバーすることが示唆される。 実施例13 ＰＥＧ化ウイルス粒子のイオン交換クロマトグラフィー Ad2/β-gal2ウイルスを、50モルおよび10モルＰＥＧ：リジンの比で、実施例1 1に記載のようにＴＭＰＥＧによってＰＥＧ化した。そのウイルスを、NaCl含有 リン酸塩緩衝液中ＤＥＡＥイオン交換樹脂（Millipore，Bedford，MA）に適用し た。結合したウイルスを樹脂から塩を上昇させた勾配で溶出し、貫流ピークおよ び溶出したタンパク質ピークを、対照ウイルス、50：1 ＰＥＧ：リジンの比でＴ ＭＰＥＧにより処理したウイルスおよび10：1 ＰＥＧ：リジンの比でＰＥＧによ り処理したウイルスについて分析した。すべてのサンプルはクロマトグラフィー 前は等しいタンパク質値を示した。 図18、パネルＡは、対照ウイルスのクロマトグラフィー後、ＤＥＡＥ-イオン 交換樹脂（Millipore，Bedford，MA）からの溶出像を示す。１つの主要なタンパ ク質ピークが樹脂から溶出し、これは感染性ウイルス粒子を含有することを示し た（データは示していない）。図18、パネルＢは、ＴＭＰＥＧ（10：１比）で予 め処理したウイルスのクロマトグラフィー後、ＤＥＡＥ-イオン交換樹脂からの 溶出像を示す。対照ウイルスのプロファイルと異なり、溶出したタンパク質ピー クに加えて、サイズの低下した貫流ピークの出現がみられた。貫流ピークの出現 は、これらの条件下ではも早ＤＥＡＥ-樹脂に結合できないウイルス粒子が発生 し、その結果として、今や非処理ＰＥＧとともに貫流ピーク中に存在することを 示唆する。イオン交換クロマトグラフィーはタンパク質とイオン交換樹脂の間の 電荷相互作用に基盤を有するので、見掛け上、ＰＥＧ化は表面電荷が変化したウ イルスの不均一集団が産生された。表面変化に有意な差を有するウイルスは、も 早樹脂に結合せず、貫流ピーク中に回収された。ＴＭＰＥＧにより50:1の比でＰ ＥＧ化されたウイルスのクロマトグラフィー後、ＤＥＡＥ-イオン交換樹脂から の溶出像は類似のプロファイルを示した。このサンプル中の貫流ピークは有意に 大きく、一方、溶出タンパク質ピークはこれに反して低下していた。貫流ピーク 中に溶出した粒子の大部分に生じたＰＥＧ：リジン50:1の比の増加の時点でウイ ルス粒子はＰＥＧ化のレベルが増加した。表８は、ＰＥＧ化の間に使用されたＰ ＥＧ：リジン比に関して２つのピークのサイズを示す（ピーク下面積として表す ）。結論として、イオン交換クロマトグラフィーはＰＥＧ化ウイルス粒子の不均 一性集団の分割に使用可能であり、電荷の差に基づいて軽度にＰＥＧ化され た粒子から高度にＰＥＧ化されたウイルス粒子を分離するために使用できる。 実施例14 免疫マウスにおけるＰＥＧ化Ad2/β-gal2による導入遺伝子の発現 実施例１のように調製した２バッチの２型アデノウイルス保存溶液を混合して （5.38×10¹⁰感染単位/ml，2.055×10¹¹粒子/mlのバッチ２mlならびに1.35×10^{1 0} 感染単位/ml，9.3×10¹¹粒子/mlのバッチ４ml）、実施例３におけるように５％ ＴＭＰＥＧの段階的添加基準を用いてＰＥＧ処理に付した。２および３回のＴＭ ＰＥＧ添加（すなわち、それぞれ計10％および15％）後に得られたサンプルを、 段階勾配ならびに２つの継続的平衡勾配を包含する標準CsCl（Sigma Chemical， St.Louis，MO）遠心分離操作により非反応ＴＭＰＥＧから精製した。精製された ＰＥＧ処理ベクターをついで５％スクロースを含むリン酸塩緩衝食塩溶液に対し て透析して、少量のアリコート毎に−80℃で凍結した。力価は、Rich DP，Coutu re LA，Cardoza LM，Guiggio VM，Armentano D，Espino PC，Hehir K，Welsh MJ ，Smith AE & Gregory RJ，1993;Hum.Gen.Ther，4:461-476に記載されたように 、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）-接合抗-ヘキソン抗体を用い293細胞上 終点希釈によって決定された。生成ＰＥＧ処理ウイルス懸濁液は2.7×10¹¹粒子/ ml（3.9×⁹感染単位/ml）を含有する計15％ＴＭＰＥＧで製造し、精製ＰＥＧ処 理ウイルス懸濁液は2.4×10¹¹粒子/ml（6.4×⁸感染単位/ml）で製造した。 ２種のＰＥＧ化ウイルス懸濁液を非処理２型アデノウイルス（3.19×¹⁰感染単 位/ml）とナイーブな前免疫処置ＢＡＬＢ/cマウスでインビボにおける遺伝子移 送を行う能力について比較した。マウスに、ヒトＣＦＴＲ（Ａｄ2/ＣＦＴＲ） をコードする複製欠陥２型アデノウイルス10⁹感染単位を鼻内投与した。試験に 選択した動物は約1/25,000〜1/50,000の血清抗-アデノウイルス抗体を有する。 ナイーブなＢＡＬＢ/cマウスはアデノウイルスベクターに暴露されていない単純 なマウスであった。日０にウイルスプレパレーションを以下のように投与した。 すなわち、ａ）非処理ウイルス、２×10⁸感染単位をナイーブ群における４匹の マウスならびに前免疫群の４匹のマウスのそれぞれに100μlの容量で滴下した、 ｂ）「ＰＥＧ化ウイルス10％」、３×10⁸感染単位(2.7×10¹⁰粒子）をナイーブ 群における４匹のマウスならびに前免疫群の４匹のマウスのそれぞれに100μlの 容量で滴下した、ｃ）「ＰＥＧ化ウイルス15％」、6.4×10⁷感染単位（2.4×10^{1 0} 粒子）をナイーブ群における４匹のマウスおよび前免疫群の４匹のマウスのそ れぞれに100μlの容量で滴下した。前免疫群のすべての動物は滴下の日に眼から 採血を行い血液は抗体力価について分析した。滴下後３日にすべてのマウスを屠 殺し、肺組織、右尾状葉および左葉を切除した。各条件（非処理、「ＰＥＧ化ウ イルス10％」および「ＰＥＧ化ウイルス15％」すべての４匹のナイーブな動物お よび４匹の免疫動物からの右尾状葉をＡＭＰＧＤアッセイにおけるa-galの定量 に用いた（Galacto-Light−登録商標−キット，Tropix，Bedford，MA）。肺ホモ ジネートのタンパク質濃度はBioRad DC試薬（BioRad，Hercules，CA）を用いて 測定した。２匹のナイーブな動物および２匹の免疫動物からの各条件での左尾状 葉はx-gal染色に使用した。 表９には、非処理ウイルス、「ＰＥＧ化ウイルス10％」および「ＰＥＧ化ウイ ルス15％」のナイーブおよび前免疫処置マウス両者についてタンパク質１μｇあ たりのβ-ガラクトシダーゼの発現（比較的軽い単位、タンパク質１μgあたりの ＲＬＵ）を示す。ナイーブなマウスにおけるβ-ガラクトシダーゼの発現は各条 件につき４匹すべてのマウスで３つのすべてのウイルスプレパレーションについ て観察した。前免疫処置マウスでは、非処理ベクターは４匹すべてのマウスにお いてわずかバックグランドレベルのβ-ガラクトシダーゼの発現を与えたのみで あった。これに反して、２種のＰＥＧ化ウイルスプレパレーションは、それぞれ 「ＰＥＧ化ウイルス10％」および「ＰＥＧ化ウイルス15％」について4/4および3 /4動物で、対照動物の場合以上のβ-ガラクトシダーゼのレベルを与え た（表５）。すなわち、ウイルスのＰＥＧ化はインビボにおいて標的組織にベク ターの実質的な発現を生じるインビボにおける中和からの保護をもたらす。 実施例15 アデノウイルスＯＮＹＸ-015のＰＥＧ化 限定された許可のある複製コンピーテントウイルスを製造するためのウイルス の遺伝的修飾について多数の例を証明した（たとえば、４種の腫瘍細胞、低酸素 組織、および特異的プロモーターを有する組織）。アデノウイルスＯＮＹＸ-015 （ＯＮＹＸ Pharmacutical）はこのようなウイルスの例であり、腫瘍において選 択的に増殖するように設計された。ウイルスはアデノウイルス２型および５型の キメラであり、調節タンパク質ｐ53を欠く細胞において、より効率的に複製す る。このような細胞には多数の腫瘍細胞系が包含される。ウイルスへのポリマー の共有結合による付着はウイルスの腫瘍標的化能力の上昇が期待され、一方理想 的にはその感染性の維持と中和抗体の作用からのウイルスの保護を達成しＰＥＧ 化による利点をさらにそれらに付加する。 ＴＭＰＥＧは実施例１に開示されたように調製した。アデノウイルスＯＮＹＸ -015はヒト293細胞の感染後に、PerSeptive BioSystemsクロマトグラフィーワー クステーション上でResource Qメジウムを用いたイオン交換クロマトグラフィー （ＩＥＣ）により調製した。使用した流動緩衝液は次の通りである。緩衝液Ａ： 150ｍＭ ＨＥＰＥＳ：20mg/mlスクロース；２ｍＭ MgCl₂，ｐＨ7.5（NaOHで調整 ）；緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中1.5Ｍ NaCl。 ウイルスの精製は０〜５分，20％Ｂ勾配；５〜15分，20〜50％Ｂ；15〜20分， 100％Ｂ；25〜30分，20％Ｂを用いて行った。ウイルスの濃縮保存溶液（9×10¹¹ pfu/ml)をウイルス保存緩衝液（ＶＳＢ 10ｍＭ Tris塩基，ｐＨ７．４，１ｍＭ MgCl₂，150ｍＭ NaCl，10％グリコール）で希釈し1×10¹¹pfu/mlの作業濃度とし た。ウイルスのアリコートは−70℃で保存した。ＴＲＩＳは求核性であり、十分 に希釈するかまたは緩衝液を交換しなければならないので、ＰＥＧ化反応には不 適当であることに留意すべきである。 アデノウイルスＯＮＹＸ-015（1×10¹¹pfu/mlおよび約1×10¹²粒子/ml）は５ ％（w/v）ＰＥＧの段階的付加（実施例３に記載の通り）を用い、ＰＥＧ₅₀₀₀と 反応させた。各活性下ポリマー添加物をロータリーホイール上、25℃で30分イン キュベートした。ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧの最終濃度5，10，15および20％（w /v）が得られた。ポリマー修飾ウイルスはＩＥＣで評価した。ＩＥＣ法はＨＰ11 00ＨＰＬＣシステムを用いて１mlのResource Qカラム（Pharmacia）で行った。 使用した流動緩衝液は次の通り、緩衝液Ａ：150ｍＭ ＨＥＰＥＳ；20mg/mlスク ロース；２ｍＭ MgCl₂，ｐＨ7.5（NaOHで調整）；緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中1.5Ｍ N aCl。それらは０〜５分，20％Ｂ勾配；５〜15分，20〜50％Ｂ；15〜20分，100％ Ｂ；25〜30分，20％Ｂの勾配を用いて行った。 使用したＩＥＣ法では、ＴＭＰＥＧで処理したウイルスサンプル中、ＰＥＧ鎖 の遮蔽作用がウイルス粒子の表面電荷の十分な中和を生じカラムとの相互作用を 阻害したことを証明する。図19におけるクロマトグラムはこの作用を証明する。 非処理ウイルス粒子（図19ａ）は10.90分（570ｍＭ NaCl）で効率的に溶出し、 一方、ＭＰＥＧ処理ウイルス粒子（図19ｂ）では、サンプルは10.91分（570ｍＭ NaCl）で溶出した。ＴＭＰＥＧ処理サンプルでは、この位置にピークはなく、 カラムの空隙容量にピークが観察された（図19ｃ）。 ＴＭＰＥＧ処理サンプルの0.75分にもまたピークが現れ、その位置でのスペク トルの検査は（示していない）、ＰＥＧ化ウイルスによる新たなピークに一致し た。一部の実験では、この位置における新たなピークよりむしろピーク高の上昇 が観察され、この位置にはＰＥＢ化ウイルスのみでなく、他の物質も溶出できる ことを指示する。 実施例16および比較例16 ＰＥＧ処理（ＴＭＰＥＧ）およびシャム処理（ＭＰＥＧ）アデノウイルスＯＮ ＹＸ-015の感染性アッセイ ＰＥＧ化アデノウイルスＯＮＹＸ-015を実施例15のようにして調製し、感染性 アッセイで評価した。感染性は主要構造のヘキソンタンパク質の抗体検出を用い 、ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。 ヒト293細胞を96-ウエルプレート（100ml/ウエル）中５×10⁵細胞/mlに接種し 、好ましくは一晩、または37℃で少なくとも２時間接着させた。ＰＥＧと反応し たウイルスサンプルを、２％ウシ胎児血清を含むダルベッコの最小必須培地（Ｄ ＭＥＭ）に希釈して、ウイルス濃度１×10⁶，５×10⁵を得て、ついで４個の半ロ グ希釈した。セミコンフルーエントな細胞単層は、100μl/ウエルの希釈ウイル スで、48時間37℃、５％ＣＯ₂において感染させた（それぞれについて６レプリ ケート）。 48時間後、細胞を細胞変性作用（ＣＰＥ）について、位相差顕微鏡を用いて調 べ、結果を写真によって記録した。 細胞を次に1000rpmで２分間ペレット化しリン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中 で２回洗浄し、５％酢酸を含む冷エタノール中に10分間20℃で固定し、ＰＢＳ中 で洗浄し、ついでSuperblock（Pierce Chemical Co.，Cat No．37535）中室 温で１時間または４℃で一夜ブロックした。細胞を室温で１時間、一次抗-ヘキ ソン抗体、Access Biomedic Inc．（３％ウシ血清アルブミンからなるＰＢＳ中1 :1000希釈−ＢＳＡ−ＰＢＳＢ）とインキュベートした。ついで二次抗体（ウサ ギアルカリホスファターゼ、0.1％Triton Ｘ-100を有するＰＢＳＢ中1:1000に希 釈，Pierce Cat No．121）中室温で１時間インキュベートした。細胞をＴris緩 衝食塩溶液（ＴＢＳ）中で洗浄し、製造業者の説明書に従って調製したＰＮＰＰ （ｐ-ニトロフェニルリン酸塩、ニナトリウム塩、Pierce Cat No.37620）基質中 、20分間インキュベートした。反応は100μl/ウエル２Ｎ NaOHで停止させ、結果 を405nmで読み取った（Molecular Devices Exam Microplate Reader)。 ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀およびＭＰＥＧ₅₀₀₀の単回および段階的添加を実施例15のよう に調製し、そのプレパレーションをＩＥＣでＰＥＧ化についてモニターした。 図20ａ〜ｄはアデノウイルスＯＮＹＸ-015の感染性に対する ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀ならびにＭＰＥＧ₅₀₀₀の５％添加の影響を示す。５または10％Ｐ ＥＧで処理したウイルスの感染性は、それぞれ処理したウイルスサンプル（白丸 ：ＭＰＥＧ，黒丸：ＴＭＰＥＧ）および非処理サンプル（三角）と類似し、一方 、15および20％ＰＥＧではＴＭＰＥＧ処理ウイルスの感染性は他の２種のサンプ ルに関して低下するが、依然として十分なレベルに維持される。図21ａ〜ｆは、 非処理ウイルス（ａおよびｂ），ＴＭＰＥＧ処理ウイルス（ｃおよびｄ）および ＭＰＥＧ処理ウイルス（ｅおよびｆ）で感染した細胞が提示するＣＰＥが類似す ることを示し、ＴＭＰＥＧでの処理はこのウイルスの感染性または複製能力の実 質的な喪失を生じないことを示唆する。 ウイルスの感染性に対するＰＥＧ処理の効果はまた、プラークアッセイを用い ても評価した。ウイルスサンプルは実施例１および15におけるようにして調製し た。ＰＥＧ処理および非処理ウイルスサンプルはＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ含有）に 系列希釈し、最初の接種（1×10¹¹pfu/ml）の10^-4〜10^-9の希釈液を得た。 ＨＥＫ293細胞のセミコンフルーエントな単層を6-ウエルプレートにセットア ップし、37℃で一夜確立させた。メジウムを除去し、細胞を希釈ウイルス種の20 0μlで感染させた。細胞は37℃で１時間感染させ、種を除去し、細胞を２× ＤＭＥＭ（10％ＦＣＳ含有）と３％ Seaplaque agarose（Flow laboratories）( 1:1 v/v)で被覆した。被覆を凝固させ、次いでＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）で 被覆した。アッセイは二重にセットアップし、37℃でインキュベートした。アッ セイは感染後５〜６日（dpi）におけるプラーク形成を調べた。プラークが観察 されたならば、アッセイを中性赤染料（ＰＢＳ中0.1％）で染色し、プラーク数 を記録した。 ３％ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀およびＭＰＥＧ₅₀₀₀で処理したウイルスサンプルはそれぞ れ、3.0×10⁹pfu/mlおよび4.5×10⁹pfu/mlのプラーク力価を生じたが、非処置対 照ウイルスは6×10⁹pfu/mlの力価を産生した。これは両サンプルの取扱いおよび ＰＥＧ鎖の付着は、感染性に中等度の独立したインパクトを有することを示唆し た。 ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀およびＭＰＥＧ₅₀₀₀の５％付加で処理したサンプルは、20％の ＰＥＧ処理を生じ、それぞれ6.8×10⁹pfu/mlおよび７×10⁹pfu/mlの力価が得ら れた。比較すると、非処理ウイルスは５×10⁹pfu/mlの力価を生じた。すなわち 、この実験では、取扱いもＰＥＧ鎖の付着も感染性または複製能力の低下は生じ ないようである。 ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀処理されたウィルスを用いて感染させた細胞に対する更なる観 察を抗体染色および免疫蛍光顕微鏡によって行った。 ウイルスサンプルは、実施例15に記載したように、ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀ならびにＭ ＰＥＧ₅₀₀₀で処理した。 ＨＥＫ293細胞のセミコンフルーエントな単層を、8-ウエルスライドチャンバ ー（Nunc）にセットアップし、37℃で一夜付着させた。メジウムを除去し、細胞 を、ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ含有）で1×10⁶pfu/mlに希釈した（50μl/ウエル）Ｔ ＭＰＥＧ処理、ＭＰＥＧ処理または非処理ウイルスの種で感染１時間37℃におい て感染させ、ついで種を５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭに置換した。細胞を37℃ でインキュベートし、感染48および72時間後に顕微鏡観察用に次のように準備し た。 細胞をＰＢＳ中で洗浄し（５分間）、ＰＢＳＢ中室温において１時間ブロック し、ＰＢＳ中で洗浄し、ついで一次抗-ヘキソン抗体（ＰＢＳＢ中1:1000に希 釈、Access Biomedic Inc.）中37℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ 中で洗浄し、二次ヤギ抗-ウサギＦＩＴＣ接合体（ＰＢＳ中1:80に希釈、Sigma C hem．Co.）中37℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で徹底的に、滅 菌蒸留水で３回洗浄して、Citiflour anti-fade mountant（Agar AccessoriesLt d.）に搭載させた。スライドは、Olympus Epifluoresence Microscopeによって 観察した。 図22の免疫蛍光マイクログラフは、ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀処理ＯＮＹＸ-015で感染さ せた細胞中インキュベーション48時間後の抗-ヘキソン抗体での染色を示し、 ＴＭＰＥＧでの処理はウイルスの複製に対する阻害作用を生じないことを示唆 する。 実施例17 ポクスウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合による付着 ポックスウイルス科からの代表的なウイルスベクターとして、ワクシニアウイ ルス株ＭＪを選択した。β-ガラクトシダーゼを（ＶＶＭＪ．lacＺ）コードする 1acＺ遺伝子を含有するワクシニアウイルスのＭＪ株を、ポックスウイルスベク ターへのＴＭＰＥＧの共有結合による付着を証明するために使用した。ワクシニ アウイルスＭＪ株のlacＺは、感染ＢＳ-Ｃ-1細胞から、10％ＦＣＳ補充最小必須 培地（ＭＥＭ）中で増殖させて調製した。ワクシニアウイルスＭＪ株のlacＺな らびにＢＳ-Ｃ-1細胞はA.Alcami博士（ウイルス学教室，病理学部，ケンブリッ ジ大学，Tennis Court Road，Cambridge，UK）により恵与された。精製ウイルス 保存液は、スクロースクッションにより沈降で調製し、ＰＢＳに対して４℃で一 夜透析し、ＴＫ-143Ｂ細胞（A.Alcami博士より恵与された）中プラークアッセイ により力価を測定した。6×10⁹pfu/mlの力価が得られた。 ウイルスのアリコートを、実施例15に記載のように５％（w/v）段階により、 ＴＭＰＥＧ₅₀₀₀およびＭＰＥＧ₅₀₀₀と反応させた。５％および20％反応からのサ ンプルを２％ＦＣＳ補充最小必須培地（ＭＥＭ）中に希釈して10^-5〜10^-9の希釈 系列を作成した。 プラークアッセイはＴＭＰＥＧによる５％および20％（w/v）処置の感染性に 対する効果を評価するため実施した。10％ＦＣＳ補充ＭＥＭ中で増殖させたＴＫ -143Ｂ細胞を6-ウエルプレート内に接種し、37℃で一夜付着させた。細胞の単層 は、10^-1〜10^-8のＴＭＰＥＧ処理およびＭＰＥＧ処理ウイルスの希釈液（500μl /ウエル）と37℃で１時間感染させた。２％ＦＣＳ含有ＰＢＳで洗浄後、細胞を2 .5％ＦＣＳおよび1.5％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）含有ＭＥＭで被 覆した。２日後、細胞単層を15％エタノール中0.1％クリスタルバイオレットで 染色しプラーク数を記録した。プラーク数の低下を図23に示す（上方および下方 パネルにおける２つの独立した実験の結果）。pfu/ml数はウイルスの用量と直線 関係のないこと、すなわち感染性の残留％は正確に確認することはできないがＴ ＭＰＥＧ処理はすべての感染性を阻害しないことに留意すべきである。 感染性アッセイはＴＫ-134Ｂ細胞でプラークアッセイによって実施した。２日 後、細胞にβ-ガラクトシダーゼの300μg/mlの添加により染色し、一夜インキュ ベーション後に確認した。上記の所見に広く一致する結果を表24に示す。 ワクシニアウイルスの複製に対するＴＭＰＥＧの効果は初期および後期ウイル スタンパク質の発現のためのアッセイを用いて、免疫修飾活性で評価した。初期 プロモーターから発現した可溶性インターフェロン-g受容体を次のように評価し た。すなわち、ＴＫ-143Ｂ細胞単層を、１pfu/細胞の感染の多重度（moi）でワ クシニアウイルスで感染させた。培養上清を感染後24時間（hpi）に収穫し、ク ロスリンキングアッセイを用いてＩＮＦ-γ受容体の発現を試験した。非感染ま たは感染培養液からのメジウム（24hpi）を1.7ｎＭ¹²⁵Ｉ-ＩＮＦ-γと、100倍過 剰のＩＬ-1βまたはＩＮＦ-γの不存在下または存在下にインキュベートした。 ＩＮＦ-q複合体をＥＤＣの添加によって架橋しサンプルを12％ポリアクリルアミ ドゲル中ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーに付した（図25） 。ＩＮＦ-γ受容体の発現に対するＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧ処理の効果は24hpi に、非感染または感染培養液から、指示された培地の用量（μl）を用いて図25 に示す。発現における変動は検出されなかった。ＩＮＦ-γ結合活性は、吸収期 間後に収穫したメジウムには検出されなかった（データは示していない）。ワク シニアＩＬ-1β受容体またはワクシニアＩＮＦ-γ受容体を発現する組換えバキ ュロウイルス-感染細胞をそれぞれネガティブおよびポジティブ対照として使用 した。¹²⁵Ｉ-ＩＮＦ-γ結合の特異性は非標識ＩＮＦ-γとの競合に よって確認されたが、非標識ＩＬ-1βとは競合しなかった。 後期プロモーターから発現される可溶性インターロイキン-1β受容体の発現は 次のようにアッセイした。ＴＫ-143Ｂ細胞単層を、１pfu/細胞のmoiでワクシニ アウイルスにより感染させた。培養上清を24hpiに収穫し、可溶性結合アッセイ でＩＬ-1β受容体の発現について試験した。非感染ならびに感染培養液（24hpi ）からのメジウムを140ｐＭ¹²⁵Ｉ-ＩＬ-1βと、100倍過剰のＩＬ-1βまたはＩＮ Ｆ-γの存在下または不存在下にインキュベートした。結合したＩＬ-1βをポリ エチレングリコールとの沈殿により決定し、沈殿物をWhatman GF/Cろ紙上に集め た。結合メジウムの存在下に沈殿したバックグランド放射能を差し引いた。1μl のメジウムは1500の細胞に相当した。特異的結合放射能（±標準誤差）を図26に 示す。指示された用量（μl）において、20％ＭＰＥＧおよび20％ＴＭＰＥＧ処 理ウイルスで乾癬させた細胞からのメジウムは、ほとんどまたは全く活性を示さ なかった。吸収期間後に収穫されたメジウムの結合活性はｔ＝０として与えられ る。ワクシニアＩＬ-1βまたはワクシニアＩＮＦ-gを発現する組換えバキュロウ イルス感染細胞からの上清をそれぞれネガティブおよびポジティブ対照として使 用した。 図27は、抗ワクシニア血清によるウイルスの中和に対するＴＭＰＥＧ₅₀₀₀また はＭＰＥＧ₅₀₀₀とのインキュベーションのインパクトを示す。ＭＰＥＧ処置ウイ ルスでは、血清のすべての希釈がpfu/mlに類似の低下を生じ、中和を指示してい た。ＴＭＰＥＧ処理サンプル中の保護作用は血清の1/1000，1/500希釈で明らか であり、多分、1/250希釈でも認められる。実施例18 レトロウイルスに対するポリエチレングリコールの共有結合による付着 レトロウイルスベクターの代表的な例として、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、 モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）をＴＭＰＥＧ処理ウイルスサンプル における感染性の維持の証明に使用した。 β-ガラクトシダーゼ配列（ＡＭ−１２．ｌａｃＺ）をコードするlacＺ遺伝子 を含有するＭＭＬＶは、Massimo Pizzato（癌研究所、Inlham Road，London，UK ）より恵与され、血清を含まないＤＭＥＭ中で増殖させた３Ｔ３線維芽細胞で 産生させた。細胞の単層を感染の低多重度（moi）により37℃で24時間感染させ た。ウイルス株を培養上清から収穫し、使用前に0.45μmフィルターでろ過した 。ウイルス株の力価を３Ｔ３細胞中感染性アッセイにより測定し、1×10⁶pfu/ml であることが見出された。1×10⁶pfu/mlを含有するろ過した培養上清を実施例16 に記載したように５％段階でＴＭＰＥＧ₅₀₀₀またはＭＰＥＧ₅₀₀₀により処理した 。反応は25℃で実施し、各添加に30分を要した。反応のｐＨをモニターし、ＴＭ ＰＥＧ15％および20％ではｐＨ7.0からｐＨ6.8への低下が記録された。 ３Ｔ３およびＣＥ細胞の単層は、24ウエルプレートにセットアップし、37℃で 一夜付着させた。ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧ処理ＭＭＬＶは血清を含まないＤＭ ＥＭ培地（10^-1〜10^-5希釈）に希釈し、各希釈液毎に（０．５ｍｌ／ウエル）37 ℃で４時間感染させた。インキュベーション後、ウイルスの種を除去し、10％Ｆ ＣＳ含有ＤＭＥＭ１mlで置換した。感染後48時間に（hpi）細胞を37℃で一夜、 Ｘ-gal（300mg/ml）により染色した。β-ガラクトシダーゼ活性を発現する細胞 を計数し、代表的な希釈を写真に記録した。 ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧ処理ＭＭＬＶの感染性は図28に示す（２つの独立の 実験を28ａおよび28ｂに示す）。両実験とも、ＴＭＰＥＧ処理サンプルが当量の ＭＰＥＧ処理対照よりも若干低い感染性を示した。ＭＰＥＧでのシャム処理のイ ンパクトは２つの実験間で相違し、図28ａにおける中等度の感染性の低下と、図 28ｂにおける５％ＭＰＥＧでの非処理対照における見掛け上の増大およびそれぞ れ10，15および20％ＭＰＥＧでの低下なしを示した。 β-ガラクトシダーゼ活性を示す細胞を図29に表示する。パネルＡおよびＢは それぞれ希釈10^-1および10^-4での非処理ウイルスを示す。残りのパネルには、処 理サンプルにおける感染性の最も匹敵するレベルを与える希釈を示す。パネルＣ およびＤは、いずれも10^-4希釈における５％および20％ＴＭＰＥＧ処理ウイルス を示し、パネルＥおよびＦはそれぞれ10^-2および10^-3希釈での５％および20％Ｍ ＰＥＧ処理ウイルスを示す。 実施例19 ヘルペスウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合的付着 ヘルペスウイルスベースベクターの例としてHerpes simplex Ｉ株１７（ＨＳ Ｖ-1株17）はS.Efstathiou博士（ウイルス学教室，病理学部，ケンブリッジ大学 ，Tennis Court Road，Cambridge，UK）から恵与され、ヘルペスウイルスベクタ ーへのＴＭＰＥＧの共有結合による付着を証明するためおよびウイルスの感染性 に対するポリマーの影響をひょうかするために使用した。 ＨＳＶ-1株17の保存ウイルスはＢＨＫ細胞のローラーボトルを0.01のmoi（0.0 1pfu/細胞）において感染することによって調製した。感染細胞は10％のＦＣＳ （＋ペニシリン/ストレプトマイシン1000単位/ml）を含有するGlasgow ＭＥＭ（ GMEM Life Technologies，Inc.）中、37℃で、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が 認められるまでインキュベートした。両感染細胞からのウイルスおよび培養上清 を収穫し、エンドトキシンを含まないＰＢＳ中15％ Ficoll勾配上で精製した。 ついでウイルスを超遠心分離によって分離し、ＰＢＳに再懸濁した。精製ウイル ス株のアリコートを−70℃で保存した。この株の種の力価をプラークアッセイに より調べ、1.1×10⁹と測定された。 精製ウイルスのアリコートを、実施例16に記載したように５％段階（w/v）で ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧのいずれかと反応させた。反応はロータリーホイール 上25℃で実施し各ＰＥＧの添加に30分を要した。各工程で反応のｐＨをモニター したｐＨ＝７で安定であることが分かった。ＰＥＧによる処理後、反応したウイ ルスサンプルを−70℃に保存した。 ＨＳＶ-1の感染性の維持はＴＭＰＥＧでの処置後に、次のように評価した。 すなわち、Vero細胞およびＢＨＫ細胞を標準操作によってトリプシン化し、氷上 に保持した。非処理、ＭＰＥＧ処理およびＴＭＰＥＧ処理ウイルスサンプルの-1 0倍希釈系列を２％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ中に調製した。２×10⁶vero細胞および３ ×10⁷ＢＨＫ細胞を各ウイルス希釈液（10^-3〜10^-8）に加え、細胞を37℃で穏や かに振盪しながら感染させた。感染細胞を、10％ＦＣＳ（＋ペニシリン/ストレ プトマイシン1000単位/ml）と１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含 有するＧＭＥＭの添加とともに６cmの皿に接種した。細胞を37℃で48時間インキ ュベートした。48hpiに、アッセイを10％ホルマリンに固定し、トルイジンブル ーで染色した。プラークの数を記録した。 図30は、それぞれVero細胞（パネルＡ）およびＢＨＫ細胞（パネルＢ）に実施 したＨＳＶ-1感染性アッセイを示す。５％ＭＰＥＧとの反応はVero細胞で感染性 の低下を生じたが、ＭＰＥＧへのこのレベルの暴露ではＢＨＫ細胞では影響しな かった。ＴＭＰＥＧ処理はＨＳＶ-1の感染性にある程度の喪失を生じたが、両細 胞系ともに、感染性のある程度の維持が認められた。 実施例20 アデノウイルスＯＮＹＸ-015へのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の共有結合 による付着 ＰＶＰは、ポリエチレングリコールと同じ様式で活性化できる線状の水溶性ポ リマーである。本実施例では、ＰＶＰカルボン酸をスクシンイミジル活性化エス テル法（Delgadoら，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Syst．9:149-304，1992） によって活性化し、ＰＶＰ-修飾ウイルスを形成できる活性化ＰＶＰを得た（F． Veronese博士，University of Pauda，Pauda，Italyによって恵与された）。 ＰＶＰカルボン酸はウイルスに共有結合で付着しないので、ウイルスをシャム処 理する対照ポリマーとして用いた。活性化および不活性なポリビニルピロリドン （ＰＶＰ）は、アデノウイルスＯＮＹＸ-015（1×10¹¹pfu/ml）に５％（w/v）濃 度で添加し、25℃で30分間インキュベートした。ついでサンプルを、ほぼ実施例 15に記載したようにＩＥＣを用いてポリマーの付着を評価した。緩衝液Ａおよび Ｂを上に詳述したように使用したが、勾配条件は次の通りとした。０〜５分０％ 緩衝液Ｂ，５〜22分０〜50％緩衝液Ｂ，22〜27分100％緩衝液Ｂ。 ＩＥＣのデータは図31ａおよびｂに示す。不活性化ＰＶＰで処理したウイルス サンプルには、非修飾ウイルスのピークが17.3分に検出されるが、５％活性化Ｐ ＶＰで処理したサンプルにはこの位置にピークは検出されず、５％活性化ＰＶＰ でウイルスの完全な修飾が起こったことが示唆される。図31ａにおける約11分の ピークは、図31ｂでははるかに小さく、可変性の人為的なものである。活性化Ｐ ＶＰで処理したサンプルでは、大きなピークが2.2分に明らかである（図中では 先端が切れている）。これはサンプル中のＰＶＰに関連するが、ＰＶＰ-ウイル スとしてはこれも理解できない。ウイルス粒子の表面電荷のＰＶＰによる遮蔽が 予測され、したがってＰＶＰ-修飾ウイルスはウイルス自体よりもはるかに 早く溶出することが期待される。 実施例21 ＰＥＧ化ウイルスの腫瘍局在 ＰＥＧ化アデノウイルスＯＮＹＸ-015をＴＭＰＥＧ₅₀₀₀と最終濃度20％ポリマ ーを与えるように実施例16に記載したようにインキュベートした。対照アデノウ イルスＯＮＹＸ-015はＭＰＥＧ₅₀₀₀とのインキュベーションによって調製した。 ＰＥＧ化および対照ウイルスサンプルは実施例15に記載したようにＩＥＣによっ て分析したところ、20％ＴＭＰＥＧサンプルでは修飾ウイルスを含まないことが 見出された。 ヒトＬＳ174Ｔ結腸癌（Clinical Oncology Department，Royal Free Hospital Scool of Medicine，London，NW3，UK）はヌードマウス（ＭＦ1）（Comparativ e Biology Unit，Royal Free Hospital Scool of Medicine，London，NW3，UK） の腹側部の皮膚の下に腫瘍の小片を置くことにより移植した。腫瘍が確立したな らば（通常、移植３週後）、動物の尾静脈に、ＰＥＧ化または対照ウイルスを用 量1×10⁸pfu/動物当量で（100nl/動物）注射した。注射の24時間後に動物を屠殺 し、腫瘍および肝臓を摘出した。組織は顕微鏡検査用に次のように準備した。組 織を小片に切断し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、３％ホルムアルデヒド/0.3％グルタ ルアルデヒドに１時間４℃で固定し、ついで2.3Ｍスクロースに４℃で24〜48時 間浸漬した。サンプルを−20℃に凍結し、スライド上低温で切片とした。薄い切 片を一次抗-ヘキソン抗体（Access Biomedic，Inc.，ＰＢＳＢに1:1000に希釈） により室温で１時間染色し、ＰＢＳ中で洗浄し、ついで二次ヤギ抗-ウサギＦＩ ＴＣ接合体（Sigma，ＰＢＳ中1:40に希釈）とインキュベートした。切片をＰＢ Ｓおよび蒸留水で洗浄し、Citiflour Anti-fade Moutantのスライドに搭載した 。切片は共焦点顕微鏡で検査した。 腫瘍組織から採取した切片は、組織内にＰＥＧ化および対照ウイルスの分布を 示した（図32ＢおよびＣ）。肝臓組織から採取した切片では、ＰＥＧ化ウイルス （図32Ａ）および対照ウイルス（データは示していない）のいずれにもウイルス の局在は示さなかった。ＰＥＧ化ウイルスの腫瘍における局在は図32Ｂに示す。 一部の腫瘍局在はシャムＰＥＧ化ウイルス（図32Ｃ）でも見られた（図32Ｂと図 32Ｃは同じ倍率である）。 実施例22 免疫マウスにおけるＰＥＧ化Ad2/β-gal4ウイルスの導入遺伝子の発現 Ad2/β-gal4ウイルス（ＵＳ特許5,670,488)は、すでに記載した10％トレシル ｍＰＥＧ（ＴＭＰＥＧ-Sigms Chemicals，St.Louis，MO）でＰＥＧ化した。ＰＥ Ｇ化ウイルスは未反応ＴＭＰＥＧから塩化セシウム勾配上にバンディングにより 精製した（Richら，Human Gene Therapy 4:461-476，1993）。精製されたＰＥＧ 化ウイルスは５％スクロースを含むリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）に透析し、力 価をＨＥＫ293細胞上終点希釈により、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）-接 合抗-ヘキソン抗体（Richら，1993）を用いて測定した。対照およびシャム処理 ベクターは非反応性ＭＰＥＧによって処理し、精製し、ＴＭＰＥＧウイルスにつ いて記載したように力価を測定した。ＰＥＧ化およびシャム処理ウイルスは免疫 およびナイーブマウスに滴下した。各ベクターの用量は2×10⁸lu/マウス（約2× 10¹⁰粒子に相当）とし、マウスあたりの投与容量は100μlとした。 免疫マウスは以前にAd2/ＣＦＴＲ-8べクター（ＵＳ特許5,707,618）を滴下され たことがあり、アデノウイルスに対する力価の範囲は25,000〜51,200であった。 滴下後３日に動物を屠殺し、個々の動物からの肺組織をホモジナイズして、ホ モジネート中のβ-ガラクトシダーゼの活性を市販のアッセイキットを製造業者 の説明書に従って用いて評価した（Galactolight Kit，Tropix，MA）。肺ホモジ ネートのタンパク質濃度はBioRad DC試薬（BioRad，Hercules，CA）を用いて測 定し、結果は相対軽度単位（ＲＬＵ）/μgタンパク質で表した。 図33は、ＰＥＧ化ウイルス（Ad tmＰＥＧ）およびシャム処理ウイルス（AdmＰ ＥＧ）についてβ-ガラクトシダーゼの発現を示す。結果は個々の動物から得ら れた値の平均±標準偏差を示す。β-ガラクトシダーゼの発現は、ＭＰＥＧおよ びＴＭＰＥＧの両者のナイーブマウス（Ｎ＝２）のウイルスプレパレーションの 肺で測定した。前免疫マウス（Ｎ＝４）では、シャム処理ウイルス（Ad ＭＰＥ Ｇ）はβ-ガラクトシダーゼの発現のレベルの低下を示し（ナイーブ動物におい て測定されたβ-ガラクトシダーゼの発現の〜47％）、アデノウイ ルス特異的抗体での中和による可能性が考えられた。これに反し、前免疫マウス （Ｎ＝３）ではＰＥＧ化ウイルスは、ナイーブ動物で測定された値に相当するβ -ガラクトシダーゼの発現レベルを与えた（ナイーブ動物において測定された発 現の〜89％）。すなわち、アデノウイルスのＰＥＧ化はウイルスを中和から保護 し、免疫応答の存在下に標的組織においてベクターの完全な発現を可能にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９７２２３１６．８ (32)優先日 平成９年10月22日(1997．10．22) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 オリオルダン，キャサリン アール. アメリカ合衆国，マサチューセッツ，ボス トン，ゴールドスミス ストリート 39 (72)発明者 フランシス，ジリアン イー. イギリス国，バークシャー，リーディン グ，ケーン エンド，サマー コッテイジ (72)発明者 パークス，ビンセント イギリス国，ハートフォードシャー，ボア ラム ウッド，イダフト ロード 28 (72)発明者 デルガド，クリスチナ イギリス国，ロンドン，キャンフィールド ガーデンズ，117，フラット ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１個の結合したポリマー分子を有するウイルス粒子を含むポリ マー修飾ウイルス。 ２．上記ポリマーはポリアルカレンオキシドまたはポリアルカレングリコール である請求項１記載のポリマー修飾ウイルス。 ３．上記ポリマーはポリオキシメチレン、ポリエチレングリコール、ポリエチ レンオキシドまたはメトキシポリエチレングリコールである請求項１記載のポリ マー修飾ウイルス。 ４．上記ポリマーは、ポリメチル-エチレングリコール、ポリヒドロキシプロ ピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルプロピレングリコー ル、ポリヒドロキシプロピレンオキシド、およびポリビニルピロリドンからなる 群より選択される請求項１記載のポリマー修飾ウイルス。 ５．上記ポリマーは、ポリエチレングリコールである請求項１記載のポリマー 修飾ウイルス。 ６．上記ポリエチレングリコールは平均分子量200ダルトン〜20,000ダルトン を有する請求項５記載のポリマー修飾ウイルス。 ７．上記ポリエチレングリコールは平均分子量2000ダルトン〜12,000ダルトン を有する請求項５記載のポリマー修飾ウイルス。 ８．上記ポリエチレングリコールは平均分子量約5000ダルトンを有する請求項 ５記載のポリマー修飾ウイルス。 ９．上記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、 ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスである請求項１記載のポリマー修飾ウ イルス。 10．上記ウイルスはアデノウイルスである請求項１記載のポリマー修飾ウイル ス。 11．上記ウイルスはアデノウイルスであり、上記ポリマーはポリエチレングリ コールである請求項１記載のポリマー修飾ウイルス。 12．上記アデノウイルスは組換えアデノウイルスベクターである請求項11記載 のポリマー修飾ウイルス。 13．上記ウイルスは導入遺伝子からなる組換えウイルスベクターである請求項 １記載のポリマー修飾ウイルス。 14．上記ポリマー分子は直接共有結合で上記ウイルス粒子に結合している請求 項１記載のポリマー修飾ウイルス。 15．上記ポリマー分子は間接的に共有結合で上記ウイルス粒子に結合している 請求項１記載のポリマー修飾ウイルス。 16．上記ポリマー分子は間接的に１価の共有結合で上記ウイルス粒子に結合し ている請求項１記載のポリマー修飾ウイルス。 17．上記ポリマー分子は間接的に１価の共有結合でリガンドにより上記ウイル ス粒子に結合している請求項16記載のポリマー修飾ウイルス。 18．上記リガンドはウイルス表面成分に特異性を有する請求項17記載のポリマ ー修飾ウイルス。 19．上記リガンドは抗体である請求項17記載のポリマー修飾ウイルス。 20．上記リガンドは、非中和抗-ウイルス抗体である請求項17記載のポリマー 修飾ウイルス。 21．上記リガンドは、非中和抗-ヘキソン抗体である請求項17記載のポリマー 修飾ウイルス。 22．少なくとも１個の結合したポリマー分子を有するウイルス粒子を含むポリ マー修飾ウイルスを製造する方法において、ポリマーを活性化し活性化ポリマー を提供し、その活性化ポリマーを上記ウイルスにカップリングさせる方法。 23．ポリマーはポリマーの末端残基を活性化残基に変換するか、または上記ポ リマーに活性化カップリング残基を付着させる請求項22記載の方法。 24．活性化ポリマーは活性化ポリエチレングリコールである請求項22記載の方 法。 25．活性化ポリエチレングリコールは、メトキシポリエチレングリコール-ト レシレート（ＴＭＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール-アセトアルデヒ ド、シアヌル酸クロリドで活性化されたメトキシポリエチレングリコール、Ｎ- ヒドロキシスクシンイミドポリエチレングリコール（ＮＨＳ-ＰＥＧ）またはポ リエチレングリコール-Ｎ-スクシンイミドカルボネートである請求項２４記載の 方法。 26．少なくとも１個の結合したポリエチレングリコール分子を有するウイルス 粒子を含むポリエチレングリコール修飾ウイルスを製造する方法において、メト キシポリエチレングリコール-トレシレートを上記ウイルス粒子にカップリング させる方法。 27．上記ウイルスは組換えアデノウイルスベクターである請求項26記載の方法 。 28．上記組換えアデノウイルスベクターは導入遺伝子を含有する請求項27記載 の方法。 29．少なくとも１個の結合したポリマー分子を含むポリマー修飾ウイルスの製 造方法において、上記方法はリガンドを上記ポリマーに共有結合によって付着さ せてポリマー修飾リガンドを提供し、そのポリマー活性化リガンドを上記ウイル ス粒子とインキュベートする方法。 30．上記リガンドは抗体または抗体フラグメントである請求項29記載の方法。 31．上記リガンドは非中和抗-ウイルス抗体である請求項29記載の方法。 32．上記非中和抗-ウイルス抗体は非中和抗-ヘキソン抗体である請求項31記載 の方法。 33．上記ウイルスは組換えアデノウイルスベクターである請求項29記載の方法 。 34．上記組換えアデノウイルスベクターは導入遺伝子を含有する請求項33記載 の方法。 35．標的細胞に導入遺伝子を導入する方法において、請求項13のポリマー修飾 ウイルスを標的細胞に導入することを含む方法。 36．上記ウイルスはアデノウイルスである請求項35記載の方法。 37．上記ポリマー修飾ウイルスを上記標的細胞に感染により導入する請求項35 記載の方法。 38．ウイルスを腫瘍に送達する方法において、請求項１記載のポリマー修飾ウ イルスを腫瘍を有する患者に、ポリマー修飾ウイルスが上記腫瘍に局在する条件 下に投与する方法。 39．上記ポリマー修飾ウイルスは生理学的に許容される担体とともに組成物中 に存在する請求項38記載の方法。 40．請求項１〜12記載のポリマー修飾ウイルスと担体を含む組成物。