KR101955909B1 - Ppsa 및 pspa 폴리머-바이러스 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PPSA 또는 PSPA 폴리머와 바이러스의 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, PPSA 또는 PSPA 폴리머를 이용하여 폴리머-바이러스 복합체를 형성하여 이용하는 경우, 세포로의 형질도입 효율이 향상되므로 약제학적 조성물에 활용하는 경우 우수한 치료 효과를 얻을 수 있어, 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PPSA 및 PSPA 폴리머-바이러스 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물{PPSA AND PSPA POLYMER-VIRUS COMPLEX AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING CANCER COMPRISING THE SAME AS ACTIVE INGREDIENTS}
본 발명은 PPSA 및 PSPA 폴리머-바이러스 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
지난 20년 동안, 바이러스성 및 비바이러스성 벡터는 암 유전자 치료를 위한 잠재적인 전달 시스템으로 부상하였다(1-4). 그러나 각각의 시스템은 생물의학적 적용을 제한하는 단점을 가지고 있다. 유전자 치료를 위하여 adenovirus(Ad), lentivirus, retrovirus 및 adeno-associated virus와 같은 다양한 바이러스 유전자 전달 시스템이 연구되었다(5-7). 아데노바이러스는 효율적인 감염, 높은 역가 용량 및 삽입 돌연변이 유발의 부재 등 몇 가지 고유한 특성을 가지고 있다. 그 결과, 아데노바이러스는 잠재적인 항암치료방법으로 폭넓게 사용이 되고 있다. 그러나 아데노바이러스를 이용한 유전자 전달은 형질도입(transduction)을 위해 CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)에 의존한다는 점에서 제한적이다(8).
비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비하여 몇 가지 장점을 가지고 있다. 비바이러스성 벡터는 낮은 수준의 면역 반응을 나타내고 재현성이 좋으며, 품질 제어과정이 상대적으로 단순하다. 잠재적인 비바이러스성 유전자 운반체로서 양이온 폴리머가 광범위하게 검토되어왔다. 여기에는 polyethylenimine(9-11), poly(amidoamine)(12-16), poly(amino ester)(17) 및 poly(L-lysine)(18-20)이 포함된다.
그러나 양이온 폴리머 기반 유전자 전달 시스템은 바이러스성 유전자 전달 시스템에 비해 형질도입 효율이 낮다는 단점이 있다. 최근, 양이온 아르기닌(arginine, Arg) 및 아르기닌 잔기를 가지는 Tat 펩티드의 세포 침투 특성에 대한 많은 연구들이 진행되었다. 아르기닌 잔기는 세포 내 전좌를 통하여 핵산을 효과적으로 전달할 수 있는데(21-24), 이는 아르기닌의 일부분이 막 투과성을 보이기 때문인 것으로 추정되고 있다(25-27). 이에 따라, chitosan(27), poly(amidoamide), dendrimers(28-31) 등의 다양한 양이온 폴리머를 아르기닌 잔기로 변형하는 연구가 수행되었으며, 변형되지 않은 폴리머에 비해 형질도입 효율이 유의하게 향상되는 결과를 나타내었다.
기존의 연구에서, 본 발명의 발명자들은 바이러스성 벡터에 비바이러스성의 장점을 결합시키고자 하였다. 이에 따라, 아르기닌을 접합한 생환원성의 폴리머인 ABP(Arginine grafted bioreducible polymer)를 제작하였으며, ABP와 아데노바이러스의 복합체인 Ad/ABP가 나출형 Ad(naked Ad)에 비해 형질도입 효율이 향상되며 선천성 면역반응을 감소시킨다는 것을 확인하였다(32). 그러나 복합체 벡터의 크기가 500 nm를 초과하면 효과적인 세포 흡수를 위한 이상적인 크기에 비해 크다는 단점이 있었다(32). 비특이적이며 클라트린(clathrin)-의존적 과정을 통하여 효과적으로 세포에 흡수될 수 있는 최대 크기는 200 nm 미만이기 때문이다.
따라서, 이러한 기존의 문제점을 해결하여 크기가 200 nm 미만이면서도 효과적인 생체 내 유전자치료 적용이 가능한 생환원성의 폴리머-바이러스 복합체의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 기존의 양이온 폴리머-바이러스 복합체에 비해 작은 크기를 가지며 형질도입 효율이 향상되고 치료 효과가 우수한 폴리머-바이러스 복합체를 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PPSA (mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG) 또는 PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI, PAPS) 폴리머를 이용하여 폴리머-바이러스 복합체를 형성하는 경우, 이를 이용한 폴리머-바이러스 복합체의 형질도입 효율이 향상되고, 우수한 치료 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명은 화학식 1로 표시되는 PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG) 폴리머 또는 화학식 2로 표시되는 PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI) 폴리머를 제공하는 데 있다..
본 발명의 다른 목적은 상기 PPSA 또는 PSPA 폴리머가 바이러스 표면에 결합된 폴리머-바이러스 복합체를 제공하는 데 있다..
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG) 폴리머를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016078673653-pat00001
상기 화학식 1에서 n, m은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서 n 및 m은 각각 독립적으로 1 일 수 있다.
PPSA 폴리머를 합성과정을 간략히 설명하면 다음과 같다:
우선 mPEG-PEI를 합성하기 위하여 PEI(poly ethyleneimine) 1.8 kDa을 mPEG-NHS(succinimidyl ester methoxy polyethylene glycol)과 반응시켰다. 그 다음, mPEG-PEI-g-Arg을 합성하기 위하여, 아르기닌을 폴리머에 접합하였다. 그 다음, mPEG-PEI-g-Arg-SH를 합성하기 위하여, mPEG-PEI-g-Arg에 이미도티올레인(imidothiolane)을 처리하여 말단에 티올기(thiol group)를 연결시켰다. 마지막으로, 말단 티올기를 연결시켜 이황화 결합에 의해 신규한 생환원성의 폴리머인 PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-PEI-mPEG)를 합성하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI) 폴리머를 제공한다. 상기 PSPA 폴리머는 PAPS 폴리머 라고도 하며, 본 발명 명세서에서 PSPA 폴리머와 PAPS 폴리머를 혼용하여 사용할 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112016078673653-pat00002
상기 화학식 2에서 x 및 y는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 2에서 x 및 y는 각각 독립적으로 1 일 수 있다.
PSPA 폴리머를 합성과정을 간략히 설명하면 다음과 같다:
우선, PEI-Arg를 합성하기 위하여 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)에 아르기닌을 처리하였다. 그 다음, PEI-Arg-mPEG를 합성하기 위하여 PEI-Arg에 mPEG-NHS(succinimidyl ester methoxy poly(ethylene glycol))를 처리하였다. 그 다음, PEI-Arg-mPEG-SH를 합성하기 위하여 PEI-Arg-mPEG에 이미도티올레인(imidothiolane)을 처리하여 말단에 티올기(thiol group)를 연결시켰다. 마지막으로, 말단 티올기를 연결시켜 이황화 결합에 의해 신규한 생환원성의 폴리머인 PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI)를 합성하였다.
본 발명의 PPSA 또는 PSPA 폴리머의 양전하성 부위(chargable portion)는 생체 내 pH, 구체적으로 중성 pH 부근에서 상기 폴리머에 양전하를 부여하여 바이러스의 표면(예컨대, 아데노바이러스의 음전하성 표면)과 이온성 상호작용에 의해 결합할 수 있도록 한다.
이황화 결합을 포함하는 생환원성 부위는 생체 내 산성 환경 하에서 환원되면 이황화 결합이 SH기로 전환되어 이에 따라 폴리머 구조의 파쇄가 이루어지고, 결국 결합되어 있는 바이러스(naked virus)가 방출되도록 한다.
이러한 측면에서 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리머가 바이러스의 표면에 결합된 폴리머-바이러스 복합체를 제공한다. 구체적으로 화학식 1의 PPSA 폴리머가 바이러스 표면에 결합된 또는 화학식 2의 PSPA 폴리머가 바이러스 표면에 결합된 폴리머-바이러스 복합체 일 수 있다.
상기 폴리머-바이러스 복합체의 경우 기존의 양이온 폴리머-바이러스 복합체에 비해 작은 크기를 가지며, 형질도입 효율이 향상되고 치료 효과가 우수함을 본 발명의 일 구현예에서 확인 하였다. 따라서 상기 폴리머-바이러스 복합체는 세포로의 약제학적 유효성분의 전달 효율을 높여 치료 효과가 우수한 바, 대상 질병에 대한 약제학적 유효성분을 달리하면 질병의 종류에 상관없이 다양한 질병의 치료, 예방 및 개선에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리머-바이러스 복합체에서 이용되는 바이러스는 어떠한 바이러스도 포함하며, 구체적으로 치료제, 백신, 약물전달체, 벡터 또는 유전자 전달체 등에 포함되어 질병의 치료에 사용될 수 있는 바이러스라면 모두 포함된다. 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 배시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구현예에 따르면, PPSA 폴리머 또는 PSPA 폴리머가 아데노바이러스의 표면에 결합된 복합체의 경우 형질도입 효율이 우수하고, 치료효과가 우수함을 실험적으로 확인하였다.
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 게놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 게놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 cis-엘리먼트이다. 게놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 한편, 세포 내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 구체적으로 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되며, 보다 구체적으로 결실된 E1 영역에 삽입된다.
본 명세서에서 게놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 게놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 적합한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 게놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 게놈에 삽입하여 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온(virion)을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt(eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표된 바 있다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994)) 에 따르면, 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(MMLV)의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템에 사용될 수 있다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시에 형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 기타 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명에서 이용될 수 있다. 예컨대, 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 본 발명에서 이용될 수 있다.
본 발명의 복합체는 치료용 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 치료용 유전자란 세포 내에서 발현 시 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 암호화 할 수 있는 유전자(폴리뉴클레오타이드 서열)를 의미한다. 상기 치료용 유전자는 본 발명의 복합체에 포함될 수 있는 것이라면 대상 질병의 종류의 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 위한 별도의 프로모터 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료용 유전자는 단독으로 또는 둘 이상이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 폴리머-바이러스 복합체 또는 조성물의 투여로 질병 또는 질환의 억제, 병증의 호전 또는 경감과 같이 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, 병증이 억제되거나 발 병을 지연시키는 "예방"을 포함하는 의미이다.
상기 치료용 유전자가 복합체에 포함된 형태는 제한되지 않으며, 일 예로 그 자체로 치료 효과를 갖거나/갖도록 변형된 바이러스 일 수 있고, 또는 본 발명의 복합체 또는 바이러스에 결합 또는 담지된 형태로 포함될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 일 구체예로, 상기 치료용 유전자는 암 세포 내에서 발현 시 치료 효과를 나타내는 암치료 유전자 일 수 있고, 구체적으로 약제감수성 유전자(drug-sensitizing gene), 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene), 항원성 유전자(antigenic gene), 사이토카인 유전자(cytokine gene), 세포독성 유전자(cytotoxic gene), 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene), 친-세포사멸 유전자(pro-apoptotic gene) 및 항신생 혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 폴리머-바이러스 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 치료용 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 폴리머-바이러스 복합체 및/또는 치료용 유전자를 유효성분으로 이용하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 폴리머-바이러스 복합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물은 그 질병의 종류에 상관없이 적용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 복합체를 포함하는 약제학적 조성물은 추가로 포함되는 다양한 약제학적 유효성분에 따라 적용되는 질병에 다양하게 적용될 수 있으므로, 상기 복합체를 포함하는 약제학적 조성물은 질병의 종류에 제한 없이 다양한 용도로 적용될 수 있다. 상기 약제학적 유효성분은 그 종류에 제한되지 않고 본 발명의 복합체와 함께 조성물에 포함되거나, 본 발명의 복합체에 포함되는 형태로 조성물에 포함 될 수 있고, 일 예로 치료용 유전자 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리머-바이러스 복합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물은 그 질병의 종류에 상관없이 모두 본 발명에 포함된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 질병의 종류에 제한받지 않으나, 바람직하게는 항암 치료에 유용할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 약제학적 조성물은 항암용 약제학적 조성물 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 치료용 유전자를 포함하는 바이러스를 본 발명의 폴리머로 코팅한 폴리머/바이러스 복합체를 이용하여 종양세포 살상능을 확인 한 결과, 코팅되지 않은 바이러스보다 더 높은 종양세포 살상능을 보였고, 세포내에서 치료용 유전자의 발현 및 발현의 증가를 실험적으로 확인 하였다.
본 발명의 조성물에 포함되는 폴리머-바이러스 복합체에 암세포 살상효능을 나타내는 유전자를 삽입하는 경우, 다양한 암세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 또는 신경계의 암의 치료에 이용될 수 있다. 상기 암은 구체적으로 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암(뼈암), 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암(두경부암), 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 자궁암, 직장암, 위암, 항 문부근암, 항문암, 대장암, 결장암, 유방암, 나팔관암(난관암), 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또 는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 간암, 혈액암, 기관지암, 골수암, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종 등의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리머-바이러스 복합체 또는 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강 내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하 기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 105-1 × 1015 pfu/㎖의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질병을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 질병을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질병을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명은 생환원성 폴리머인 PPSA, PSPA 폴리머 및 이를 포함하는 폴리머-바이러스 복합체, 그리고 상기 폴리머-복합체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공하며, 본 발명의 복합체를 이용하는 경우함, 기존의 폴리머-바이러스 복합체에 비해 높은 형질도입효율 및 우수한 치료효능을 나타내므로 약제학적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 D20에서 분석한 샘플들의 1H NMR 스펙트럼이다. (A) mPEG-PEI (B) mPEG-PEI-g-Arg (C) PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG)
도 2는 PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG)의 MALDI-TOF 스펙트럼을 보여주는 도표이다.
도 3a 및 도 3b는 A549 및 MCF7 세포에서 PPSA의 세포독성을 MTT 어세이로 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d, 도 4e 및 도 4f는 A549, MCF7, CT-26 세포에서 PEI 25k, PPSA 및 PSPA 폴리머의 처리 농도 및 시간에 따른 세포독성을 MTT 어세이로 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 Ad/PPSA 나노복합체의 특성을 분석한 것이다. (A) Ad/PPSA의 겔 지연 어세이 분석 결과, (B) 다양한 몰비에서의 나출형 Ad 또는 Ad/PPSA의 평균 크기 분포, (C) 다양한 몰비에서의 나출형 Ad 또는 Ad/PPSA의 제타 전위(Zeta-potential) 값.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 Ad/PPSA 복합체의 특성을 나타내는 그래프이다. (A) 시간에 따른 평균입자 크기, (B) 시간에 따른 제타전위, (C) DTT(5 mM) 처리 전후의 나출형 Ad 또는 Ad/PPSA의 평균 크기 분포.
도 7A, 7B 및 도 7C는 Ad/PSPA 나노복합체의 특성을 나타내는 그래프이다. (A) Ad/PAPS 복합체의 겔 지연 어세이 분석 결과, (B) Ad/PAPS 복합체의 평균 크기 분포 및 제타전위, (C) DTT 처리 전후의 나출형 Ad, Ad/PAP 및 Ad/PAPS의 평균 크기 분포.
도 8A 및 도 8B는 A549 및 MCF7 세포에서 나출형 Ad, Ad/25K PEI, Ad/ABP 또는 Ad/PPSA의 형질도입 효율을 분석한 결과이다. (A) 형질도입된 세포의 형광현미경 이미지, (B) A549 및 MCF7 각각의 세포에서 유세포분석기로 측정한 형질도입 효율.
도 9A 및 도 9B는 나출형 Ad, Ad/ABP 및 Ad/PPSA의 경쟁 어세이 결과이다. (A) GFP 형광현미경 이미지, (B) 유세포분석기로 측정한 GFP 발현레벨.
도 10A, 도 10B, 도 10C 및 도 10D는 FITC로 표지한 나출형 Ad, Ad/PPS 및 Ad/PPSA의 세포흡수 효율을 공초점 현미경 이미지(A, C) 및 FACS로 분석한 결과(B, D)이다.
도 11A, 도 11B 및 도 11C는 A549(도 11A), MCF7(도 11B) 및 CT-26(도 11C) 세포 각각에서 바이러스와 바이러스/폴리머 복합체의 GFP 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 12A, 도 12B 및 도 12C는 A549(도 12A), MCF7(도 12B) 및 CT-26(도 12C) 세포 각각에서 Ad/PSPA 복합체, Ad/PPSA 복합체, Ad/PEI 복합체 실험군의 GFP 발현 정도를 보여주는 그래프이다.
도 13A 및 도 13B는 A549 (A) 및 MCF7(B)에서 DWP418, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA의 종양살상 효능을 보여주는 그래프이다.
도 14A, 14B 및 도 14C는 A549(A), MCF7(B) 및 CT-26에서 바이러스/폴리머 복합체의 종양살상 효능을 보여주는 그래프이다.
도 15A 및 15B는 바이러스/폴리머 복합체의 세포 내에서 유전자 발현 여부 및 증가 효과를 확인한 결과이다.
도 16A 및 도 16B는 (A) MCF7 종양이 이종이식된 누드마우스에서 DWP418, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA의 항암효능을 보여주는 도표이다. (B) 각 그룹의 종양절편을 H&E, E1A, PCNA 또는 TUNEL 염색한 현미경 사진이다.
도 17A, 도 17B 및 도 17C는 Ad에 대한 선천성 및 후천성 면역반응을 확인한 결과이다. (A) ELISA로 혈청 내 IL-6 레벨을 분석하여 나출형 DWP418, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA에 대한 선천성 면역반응을 평가한 결과이다. (B, C) 나출형 Ad(dE1/GFP) 또는 Ad/PPSA 복합체를 Ad-특이적인 중성화 항체가 포함된(또는 포함되지 않은) 혈청으로 반응시키고 GFP 발현레벨을 관찰하여 나출형 Ad 및 Ad/PPSA에 대한 후천성 면역반응을 확인한 결과이다.
도 18A 및 도 18B는 혈청 내 ALT(A) 및 AST(B) 레벨을 분석하여 DWP418, DWP418/ABP 및 DWP418/PPSA의 간독성을 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 통상의 기술자에 있어 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
1. 실험물질
메톡실 PEG 숙신이미딜 카보네이트 NHS(Methoxyl PEG succinimidyl carbonate NHS)를 Nanocs(USA)로부터 구입하였다. 아르기닌, N,Ndiisoproylethylamine(DIPEA), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 트리이소프로필살린(triisopropyl silane, TIPS), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine 1.8kDa, 50wt%) 및 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethylenimine, 25 kDa), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 2-이미도티오레인 하이드로클로라이드(imidothiolane hydrochloride, Traut's reagent), DL-디티오트레이톨(DL-dithiothreitol), dimethylsulfoxide(DMSO), 2-이미도티오레인(2-imidothiolane), EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 및 DMF(dimethylformaldehyde)를 Sigma(St Louis, USA)로부터 구입하였다.
HBTU(2-(1-H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)를 Novabiochem(San Diego, CA)로부터 구입하였다. Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH는 Anaspec, Inc.(San Jose, CA)로부터 구입하였다. Ellman's reagent를 Thermo scientific(Rockford, IL)로부터 구입하였다. Deuterium oxide를 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.(Andover, MA)로부터 구입하였다.
2. mPEG- PEI -g- Arg -S-S- Arg -g- PEI -mPEG( PPSA ) 합성
(1) mPEG- PEI ( Methoxy Poly(ethylene glycol)Polyethylenimine ) 합성
PEG-PEI를 참고문헌에 기재된 바에 따라 합성하였다(33). 폴리에틸렌이민을 PBS(pH 7.4) 3.0㎖에 용해하였다. 그 다음, 1 당량(molar equivalent)의 메톡실 PEF 숙신이미딜 카보네이트 NHS(mPEG-NHS, 2.0 kDa)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 하루 밤 동안 섞어주었다. 생성물을 Slide-A-Lyzer 투석용 카세트(2.0 kDa MWCO, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 실온에서 2 시간 동안 이차 증류수에 대해 투석하고 감압하에 동결건조하여, 엷은 흰 색의 물질을 만들어내었다(75% 수율). 1H NMR로 D20 용해된 샘플을 300 MHz(Mercury Plus 300 MHz Spectrometer, Varian, Inc. Vernon Hills, IL, USA)에서 관찰하여 화학구조를 확인하였다. 특징적인 PEG(3.6 ppm, -(CH2CH2O)) 및 PEI(2.0 to 3.0 ppm) 피크를 관찰하였다.
(2) mPEG- PEI에 아르기닌이 접합된 (mPEG- PEI -g- Arg ) 합성
참고문헌에 기재된 바에 따라 아르기닌을 mPEG-PEI에 접합하였다(28). 9 당량의 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 HBTU을 12 당량의 DIPEA(in DMF 1.0 ㎖)과 실온에서 48시간 동안 결합하여 접합이 일어나도록 하였다. 반응하지 않은 시약들을 제거하기 위하여 결과적인 생성물을 다이에틸에테르(diethyl ether)에 두 번 침전시켰다. Fmoc-Arg(Pbf)OH에서 Fmoc 모이어티(moiety)를 제거하기 위하여, 침전물을 동일한 부피의 30% 피페라딘(piperidine in DMF, Sigma, St Louis, MO, USA) 용액과 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 침전 과정을 두 번 반복하였다. 아르기닌 잔기에서 Pbf 그룹을 제거하기 위하여 시약용액(TFA: TIPS: H20, 95/2.5/2.5 v/v)을 침전물에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 반응을 수행하였다. 에테르로 폴리머를 침전시켰다. 최종생성물인 mPEG-PEI-g-Arg를 이차증류수에 대해 하루 밤 동안 투석하고(2.0 kDa MWCO), 감압하에 동결건조시켜, 흰 색의 생성물을 만들어 내었다(60% 수율). 상기 기재된 바와 같이 1H NMR로 화학구조를 확인하였다. PEG(3.6 ppm,(CH2CH2O)), PEI(2.0 to 3.0 ppm) 및 아르기닌(1.66 ppm(HCCH2CH2CH2NH); 1.86 ppm(HCCH2CH2CH2NH); 3.24 ppm(HCCH2CH2CH2NH); 3.86 ppm(HCCH2CH2CH2NH))의 특징적인 피크를 확인하였다.
(3) mPEG- PEI -g- Arg -S-S- Arg -g- PEI -mPEG( PPSA ) 합성
mPEG-PEI-g-Arg를 PBS(2.0 ㎖, pH 7.4, 4 mg/㎖ EDTA)에 용해하였다. mPEG-PEI-g-Arg의 표면의 아민(amine) 당 8 당량(equivalent)의 2-imidothiolane hydrochloride(Traut's reagent)을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 계속해서 섞어주었다. 반응하지 않은 시약들을 제거하기 위하여 생성물을 2차 증류수(2.0 kDa MWCO)에 대해 투석한 다음, 감압하에서 동결건조시켰다.
동결건조된 mPEG-PEI-Arg-SH을 1× PBS에 용해시킨 다음, SH 그룹을 산화시키기 위하여 500 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 48시간 동안 섞어주었다. 생성물을 다시 2차 증류수(2.0 kDa MWCO)에 대해 24시간 동안 투석하였다. 최종적으로, 생성물인 mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG(PPSA)를 감압하에서 동결건조시켜, 흰색의 생성물을 만들어 내었다(80% 수율). 참고문헌에 기재된 바와 같이 Ellman 테스트로 이황화물 가교(disulfide cross-linking)를 확인하였다(34).
3. PEI - Arg -mPEG-S-S-mPEG- Arg - PEI ( PSPA ) 합성
( 1)PEI - Arg ( poly ( ethylenimine )- arginine ) 합성
문헌 Enhanced in-vitro transfection and biocompatibility of L-arginine modified oligo(-alkylaminosiloxanes)-graft-polyethylenimine에 보고된 절차 따라 아르기닌을 폴리에틸렌이민에 컨쥬게이션하였다. 아르기닌 아미노산(350 mg, 2.0 mmol)의 카복실산 기는 인산염완충액(phosphate saline buffer, pH 7.4, 3.0 ㎖)에서 4°C조건으로 4시간 동안 커플링제 EDC/NHS(EDC, 384 mg, 2.0 mmol 및 NHS = 230 mg 2.0 mmol)로 엑티베이션 되었다. 그 다음, PEI(polyethylenimine, 360 mg, 0.2 mmol)을 활성화된 아르기닌에 첨가하고 실온에서 18시간 동안 반응을 유지하였다. 반응하지 않은 화합물을 제거하기 위하여 생성물을 하루 동안 2차 증류수에 대하여 투석한(MWCO 1.0 kDa) 다음, 감압하에 동결건조시켰다. 1H NMR(300MHz, D2O)로 화학구조를 확인하였다. PEI 의 특징적인 피크는 2.0 내지 3.0 ppm 이었고, 아르기닌의 피크는 1.66-(-HCCH2CH2CH2NH-);1.86(-HCCH2CH2CH2NH-);3.24(-HCCH2CH2CH2NH-); 3.86(-HCCH2CH2CH2NH-) 이었다.
(2) PEI - Arg -mPEG 합성
아르기닌이 접합된 폴리(에틸렌이민)을 pH 7.4에서 PBS 3.0 ㎖에 용해시켰다. 그 다음, 1 당량의 메톡실 PEG 숙신이미딜 카보네이트 NHS-2.0 kDa를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 섞어(stir)주었다. 생성물을 Slide-A-Lyzer 투석용 카세트(2.0 kDa MWCO, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 실온에서 24 시간 동안 이차 증류수로 투석하고 감압하에 동결건조하여 PEI-Arg-mPEG를 수득하였다.
1H NMR(300MHz, D2O)을 이용하여 화학구조를 확인하였다. NMR 스펙트럼은 PEG의 특징적인 피크(3.6 ppm, -(CH2CH2O)-), PEI의 피크(2.0 내지 3.0ppm) 및 아르기닌의 피크 1.66-(-HCCH2CH2CH2NH-); 1.86(-HCCH2CH2CH2NH-); 3.24(-HCCH2CH2CH2NH-); 3.86(-HCCH2CH2CH2NH-)을 나타내었다.
(3) PEI - Arg -mPEG-S-S-mPEG- Arg - PEI(PSPA)의 합성
PEI-Arg-mPEG는 1X 인산염완충액(2.0 mL, pH=7.4, 4 mg/mL EDTA)에 용해시켰다. PEI-Arg-mPEG의 표면 아민(amine) 당 8 당량(equivalent) 이상의 2-imidothiolane hydrochloride(Traut's reagent)을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 계속해서 섞어주었다. 반응하지 않은 시약들을 제거하기 위하여 투석 카세트(Slide-A-dialysis cassette 2.0 kDa MWCO)를 이용하여 상기 생성물을 2차 증류수에 대해 투석한 다음, 생성물 PEI-Arg-mPEG-SH를 감압하에서 동결건조시켰다. 그리고, 상기 동결건조된 mPEG-PEI-Arg-SH 폴리머를 1× PBS에 재용해시킨 다음, SH 그룹을 산화시키기 위하여 500 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 섞어주고, 그 다음 생성물을 다시 투석 카세트(Slide-A-dialysis cassette 2.0 kDa MWCO)를 이용하여 2차 증류수에 대해 24시간 동안 투석하였다. 생성물을 감압하에서 동결건조시켜 PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI(PSPA)를 수득하였다
4. 세포주 및 세포배양
다음의 세포주를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하였다: HEK293, Ad E1 복제 단백질을 발현하는 인간 태아 신장 세포주; A549, 비소세포성 폐암 세포주; MCF7, 유방암 세포주; 및 CT-26, 대장암 세포주. 모든 세포주를 10% FBS(Gibco BRL) 및 페니실린/스트렙토마이신(Gibco BRL)을 포함하고 있는 DMEM(Gibco BRL, Grand Island, NY) 배지에서 37°C, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
5. 아데노바이러스 (Ad) 준비
E1 부위에서 CMV 프로모터 조절하에 GFP(green fluorescent protein)를 발현하는 비복제성 Ad(dE1/GFP) 및 종양살상 Ad(DWP418 또는 RdB/IL-12/Decorin;oAd)를 사용하였으며, 기본적으로 본 발명자들의 기존 연구에 기재된 바와 같은 방법을 사용하였다(35-38). 모든 Ad를 HEK293 세포에서 번식시킨 다음, CsCl(Sigma, St Louis, MI) 농도 구배 정제를 하였다. 바이러스 입자(VP)의 수를 OD260 측정에서 흡광도 1을 1012 VP/㎖와 동등한 것으로 하여 계산하였다.
HEK293 세포에 대한 한계희석검정법을 이용하여 바이러스 역가(Infectious titers, PFU/mL)를 결정하였다. dE1/GFP 및 DWP418의 바이러스 파티클/PFU 비율은 각각 29:1 및 81:1이었다. MOI를 바이러스역가로부터 계산하였다.
6. 세포독성 분석
본 발명의 폴리머 및 다양한 양이온성 폴리머들의 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, 25 kDa 분지 폴리에틸렌이민(branched polyethylenimine, 25kDa PEI), 기존의 Ad와 결합되어 사용된 폴리머 ABP, 그리고 PSPA(PAPS) 폴리머 및 PPSA 폴리머에 대하여 작용시간에 따라 MTT를 포르마잔(formazan)으로 전환시키는 것을 측정하는 방법을 이용하여 정량적인 세포 생존률을 분석하였다(39, 40).
A549 및 MCF7 세포를 각각 96 well 플레이트에서 50% 밀집될 때까지 배양한 다음, 25k PEI 폴리머, ABP 폴리머 및 PPSA 폴리머 각각을 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖, 5㎍/㎖ 및 10㎍/㎖ 농도로 각각의 세포에 처리하였다. 폴리머를 처리하고 3일 후(72시간 처리), 100 ㎕의 MTT(2 ㎎/㎖)를 각 well에 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 따라내어 버린 다음, 침전물을 100 ㎕의 DMSO에 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA)로 540 nm에서 플레이트를 분석하였다.
또한, A549, MCF7 및 CT-26에 대하여 25k PEI 폴리머, PPSA 폴리머 및 PSPA(PAPS) 폴리머 각각을 0.1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖, 5㎍/㎖ 및 10㎍/㎖으로 처리하고, 처리 시간을 24시간과 72시간으로 하는 조건 외에 동일한 방법으로 폴리머의 세포 독성을 측정하였다.
7. Ad/ PPSA 복합체 준비
Ad/PPSA 복합체를 제작하기 위하여, Ad 입자(2 × 1010 VP/PBS, pH 7.4)를 다양한 농도의 PPSA 폴리머와 혼합하였다. 그 결과 Ad 입자 당 2 × 104, 1 × 105, 4 × 105 및 1 × 106 PPSA 비율이 되었다. 사용하기 전에 용액을 실온에서 30분 동안 배양하였다.
8. Ad/ PSPA 복합체 준비
Ad/PSPA 복합체를 제작하기 위하여, Ad 입자(2 × 1010 VP/PBS, pH 7.4)를 다양한 농도의 PSPA 폴리머와 혼합하였다. 그 결과 Ad 입자 당 1×103, 5×103, 1×104, 5×104, 1×105, 5×105, 1×106 PSPA 비율이 되었다. 상기 용액은 사용되기 전에 실온에서 30분 동안 인큐베이션 되었다.
9. 입자크기 및 표면 변화측정
나출형(naked) Ad 및 Ad/PPSA의 평균 입자크기 표면 변화를 각각 488 nm에서의 DLS(dynamic laser scattering) 및 633 nm에서의 제타 입자 분석(90° 고정 각도 산란)을 이용하여 측정하였으며, 이를 위해 HeNe 레이저를 보유한 Zetasizer 3000HS(Malvern Instrument Inc., Worcestershire, UK)를 실온에서 이용하였다.
또한, Ad/PAPS 복합체에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 평균 입자 크기, 제타전위 등의 표면 변화, DTT 처리에 따른 평균입자 사이즈의 변화를 확인 하였다.
본 명세서에서의 크기 및 변화 값은 5번의 독립적인 수행결과의 평균값이다.
10. 겔 지연분석(Gel Retardation)
Ad/PSPA 와 Ad/PPSA 복합체의 각각의 캡슐형성 프로파일을 조사하기 위하여 겔 지연분석을 수행하였다. Ad/PPSA 복합체 생성 후, 바이러스 용해 버퍼(0.1% SDS, 1 mM Tris-HCl(pH7.4), 0.1 mM EDTA)를 Ad/PPSA 복합체에 첨가하고 56°C에서 30분 동안 반응시켰다. Ad/PPSA 복합체 샘플을 1× TAE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1%(v/v) 아세트산, 1 mM EDTA)내의 1%(w/v) 아가로로스 겔(w/EtBr)에 로딩하였다. 동일한 버퍼로 100 V에서 30분 동안 전기영동을 수행하였다. DNA 밴드의 위치를 ChemiDoc gel documentation system(Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 시각화하였다. Ad/PAPS 복합체에 대해서도 상기 방법과 동일하게 겔 지연분석을 수행하였다.
11. 형질도입 효율분석
각각의 암 세포(A549, MCF7 및 CT-26)를 24-well 플레이트에 분주하고, 형질도입 에세이 하루 전에 60% 밀집될 때까지 배양하였다. 세포를 나출형 Ad(dE1/GFP) 또는 Ad(dE1/GFP)/폴리머 복합체(Ad/25KDa PEI, Ad/ABP, Ad/PSPA 또는 Ad/PPSA)로 처리하였다.
2 × 104, 1 × 105, 4 × 105 및 1 × 106 폴리머:바이러스 몰 비를 갖는 PPSA:Ad 복합체, 25k PEI 복합체 및 ABP 복합체에 대하여 A549 및 MCF7 세포주 각각에서 GFP 발현 레벨을 확인하여 형질도입 효율을 분석 하였다.
또한, 1×103, 5×103, 1×104, 5×104,1×105, 5×105, 1×106 의 폴리머:바이러스 몰 비율을 갖는 PAPS:Ad 복합체, PPSA:Ad 복합체 및 25 kDa PEI:Ad 복합체를 사용하여 A549, MCF7 및 CT-26 세포주 각각에서 형질도입 효율을 분석하였다. 각 세포주의 차이가 나는 Ad 민감성으로 인해 A549, CT-26 및 MCF7에 서로 다른 MOI를 적용하였다.
형질도입된 세포를 추가로 48시간 동안 배양하였다. 형광현미경(Olympus IX81; Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포의 이미지를 획득하고, FACS 분석용 BD FACScan analyzer(BectonDickinson, San Jose, CA) 및 CellQuest software(Becton-Dickinson)를 이용하여 GFP 발현레벨을 정량분석 하였다. 10,000 이벤트로부터 데이터를 수집하였으며 세 번의 독립적인 실험의 평균± 표준편차를 나타내었다.
12. 경쟁 에세이
A549 세포(5×104 cells/well)를 24-well 플레이트에 분주하였다. 24시간 동안 배양한 다음, 세포를 PBS 또는 정제된 Ad fiber knob 단백질(2 또는 10 ㎎/㎖ )로 30분 동안 전 처리하였다. 세포를 PBS로 3번 세척한 다음, 5% FBS를 보충한 DMEM에 준비한 30 MOI의 나출형 Ad 또는 Ad/PPSA 복합체(1×106 PPSA:Ad 몰 비율)를 처리하였다. 세포를 2일 동안 배양하고, 형광현미경(Olympus IX81; Olympus Optical)으로 이미지를 획득한 다음, BD FACScan analyzer(Beckton-Dickinson) 및 CellQuest 소프트웨어(Beckton-Dickinson)로 분석하였다.
13. 종양선택적 살상 아데노바이러스이 세포살상능 검증
종양선택적 살상 아데노바이러스의 암세포에 대한 살상능을 검증하고자, A549 와 MCF7 세포주를 96 well plate에 각각 분주하고, 24시간 후 나출형 DWP418과 DWP418/ABP, DWP418/PPSA 복합체를 처리하였다. 48시간 후에 배지를 제거하고 100 ㎕의 MTT(2 ㎎/㎖)를 각 well에 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 따라내어 버린 다음, 침전물을 100 ㎕의 DMSO에 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA)로 540 nm에서 플레이트를 분석하였다.
또한, A549, MCF7 및 CT-26 세포주를 96 well plate에 각각 분주하고, 24시간 후 나출형 RdB/IL-12/Decorin;oAd, oAd/PPSA 및 oAd/PAPS 복합체를 처리하였다. 48시간 후에 배지를 제거하고 100 ㎕의 MTT(2 ㎎/㎖)를 각 well에 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 따라내어 버린 다음, 침전물을 100 ㎕의 DMSO에 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA)로 540 nm에서 플레이트를 분석하였다.
14. 웨스턴 블로팅 (Western blotting)
디코린(Decorin)과 IL-12를 발현하는 바이러스의 표면이 PAPS로 코팅된 oAd/PAPS 복합체가 CT-26세포주에 감염되었을 때, 세포 내에서 DCN 단백질이 생성되는 것을 검증하기 위하여, CT-26 세포에 100, 200 및 500 MOI의 나출형 oAd와 oAd/PAPS(1 x 105 의 폴리머:바이러스 몰비율)를 각각 처리하고 48시간 뒤에 세포 배양액과 세포를 모두 수거하여 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 전기영동 후 gel에 있는 단백질들을 PVDF(poltvinylidene fluoride) 멤브레인(membrane)에 전기 이동 시킨 후, 디코린(decorin)을 특이적으로 인지하는 항체를 일차항체로 결합 시켰다. HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 goat anti-mouse IgG를 이차항체로 반응시킨 뒤, ECL(enhanced chemiluminescence)(Pierce, Rockford, IL, USA)방법으로 LAS4000을 이용하여 멤브레인(membrane) 상의 단백질과 항체와의 결합여부를 조사하고 단백질의 발현 양상을 확인하였다.
15. IL-12 발현 변화 ELISA 분석
디코린(Decorin)과 IL-12를 발현하는 바이러스의 표면이 PAPS로 코팅된 oAd/PAPS 복합체가 CT-26세포주에 감염되었을 때, 세포 배양액으로 사이토카인이 분비되는 것을 확인하고 위해서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. CT-26 세포주를 5 × 105 cell/well로 12 well plate에 분주한 뒤, 다음날 100 MOI 및 200MOI의 나출형 oAd와 oAd/PAPS를 각각 처리한 후 48시간 후에 세포로부터 배지를 회수하여 ELISA를 통하여 IL-12 발현양을 정량하였다.
16. In vivo 항암 효과 및 조직학적 분석
MCF7 세포(5× 106)를 6주령의 암컷 누드 마우스(Orientbio Inc., Gyeonggi-do, Korea)에 피하 주사하였다. 종양부피가 대략 100 mm3가 되었을 때, 마우스의 종양 내로 PBS, 나출형 Ad, ABP, PPSA, Ad/ABP, 또는 Ad/PPSA(5 × 1010 VP/1회 주사, 1 × 106 PPSA:Ad 몰 비율)을 5일 동안 이틀 간격으로 주사하였다(총 3회 주사). 종양의 성장을 2일 마다 캘리퍼 측정(caliper measurement) 및 다음과 같은 부피 계산에 의해 측정하였다: 부피(mm3)=0.523× 길이(mm)× 넓이(mm2). 조직학적 분석을 위해, 최종 처리 후 3일 후에 종양을 채취하여 10% 포르말린에 고정하고, 파라핀에 박아두었다. 종양 절편(5 ㎛ 두께)을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고 광학현미경을 이용하여 100× 비율로 조사하였다.
면역조직화학분석을 위해, 파라핀에 박힌 종양조직을 자일렌에 10분 동안 반응시켜 파라핀을 우선 제거한 다음, 계속해서 100%, 90% 및 70% 에탄올로 각각 5분 동안 인큐베이션하였다.
조직을 실온에서 2시간 동안 3% BSA(bovine serum albumin)로 블록킹한 다음, Ad E1A 특이적 항체(SC-430; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 증식세포 핵 항원(PCNA)-특이적 항체(Neomarkers, Freemont, CA)로 염색하였다. 절편들을 Mayer's 헤마톡실린으로 대비 염색하였다. Apoptag 검출키트(Serologicals Corp., Norcross, GA)를 제작자의 지시에 따라 이용하여, TUNEL 분석에 의한 세포자멸(Apoptosis) 검출을 수행하였다.
17. 선천성 면역반응 분석
나출형 DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA 복합체의 선천성 면역반응에 대한 효과를 분석하기 위하여, Balb/C 마우스에 나출형 DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA 복합체(2× 1010 VP/마우스, 1× 106 PPSA:Ad 몰 비율)를 전신 주사하였다. 주사 후 6시간 후에 혈청 샘플을 수집하였다. IL-6 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 제작사의 지시에 따라 이용하여, IL-6 혈청 레벨을 정량분석 하였다.
18. 후천성 면역반응 분석
Ad에 대한 후천성 면역반응을 분석하기 위하여, Balb/c 마우스에 나출형 Ad(dE1/GFP)를 1× 1010 VP의 단일 용량으로 정맥주사한 다음, 14일 후, Ad에 대한 중성화 항체를 생성하기 위하여 Ad를 다시 투여하였다. 두 번째 주사 후 14일 후에 나출형 Ad로(또는 나출형 Ad 없이) 면역화한 마우스 혈청을 채취하고, 혈액 complement를 비활성화시키기 위하여 56°C에서 45분 동안 반응시킨 다음, 20°C에 보관하였다. PPSA 폴리머(1× 106 분자/VP)(30 MOI)로 코팅된 나출형 dE1/GFP(30 MOI) 또는 dE1/GFP를 PBS 또는 혈청(Ad-특이적 중성화 항체가 있거나 또는 없는 혈청)에 37°C에서 30분 동안 노출한 다음, 인간 암세포주인 A549 세포에 처리하였다. 배양 2일 후, 형광현미경(Olympus BX51) 및 FACScan 유세포분석기(Beckton-Dickinson)로 GFP 발현레벨을 분석하였다.
19. In Vivo 독성평가
생체 내 잠재적인 독성을 평가하기 위하여 나출형 DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA(2× 1010 VP/마우스, 1× 106 PPSA:Ad 몰 비율)를 정맥주사로 Balb/C 마우스에 주사하였다. 주사 후 3일 후, AST(Aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine transaminase) 혈청 레벨을 측정하였다.
20. 통계분석
데이터를 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계분석을 양측 Student t 검정(SPSS 13.0 software; SPSS, Chicago, IL)으로 수행하였으며, P 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험 결과
1. 생환원성의 폴리머의 합성 및 특성 확인
고분자량의 분지 폴리에틸렌이민(branched polyethylenimine, 25K PEI)은 in vitro 및 in vivo에서 높은 형질도입 효능을 가지고 있으므로, 비바이러스성 유전자 전달을 위한 기준(benchmark)으로 이용되고 있다(42). 그러나 상기 폴리머는 심각한 세포독성을 가지고 있으며, 생분해가 불가능해서 임상 적용이 제한되는 문제점이 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 기존의 연구에서 새로운 저분자량(1.8 kDa) PEI를 이용하여 낮은 세포독성을 나타내면서 생분해가 가능한 양이온 폴리머를 설계하고 합성하였었다. PEG와 복합된 PEI의 경우, PEI 단독에 비해 세포독성이 감소하였다(43). 생환원성의 연결을 이용하여 가교(cross-linking)한 PEI도 세포독성이 감소하는 결과를 나타내었다(44).
한편, 아르기닌 잔기를 가지는 세포 침투 펩타이드는 세포 내 전좌(translocation)를 통하여 핵산을 효과적으로 전달한다는 것이 알려져 있다(26, 45). 이와 같은 기존의 발견에 기초하여, 개선된 바이오폴리머(biopolymer)인 PPSA 및 PSPA를 합성하였다.
PPSA(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-PEI-mPEG)의 주요 합성 경로를 반응식 1에 정리하였다.
[반응식 1]
Figure 112016078673653-pat00003
우선, mPEG-PEI를 합성하기 위하여 PEI 1.8 kDa을 mPEG-NHS(succinimidyl ester methoxy polyethylene glycol)과 반응시켰다(33). 그 다음, mPEG-PEI-g-Arg을 합성하기 위하여, HTBU/DIPEA28의 존재 하에 Fmoc-Arg(Pbf)-OH을 이용하여 아르기닌을 폴리머에 접합하였다. 그 다음, mPEG-PEI-g-Arg-SH를 제조하기 위하여, mPEG-PEI-g-Arg에 이미도티올레인(imidothiolane)을 처리하여 말단에 티올기(thiol group)를 연결시켰다. 마지막으로, 말단 티올기를 디메틸설폭시드(DMSO)를 이용하여 가교하여 신규한 생환원성의 폴리머(mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-PEI-mPEG; PPSA)를 합성하였다.
PPSA의 합성을 1H NMR을 이용하여 확인하였다(도 1). 3.64와 3.36 ppm에서의 스펙트럼 피크 발생은 CH2CH2O 및 OCH3 PEG의 말단기에 해당하는 메틸렌(methylene) 양성자의 존재를 나타낸다. 2.23.0 ppm에서 관찰되는 세 개의 피크는 PEI의 CH2 NH메탄(methane) 양성자에 해당된다(도 1A). 이러한 결과는 기존의 보고와 일치하는 것이다(33). 아르기닌기를 첨가한 후, 1.44, 1.70, 3.2, 3.86 ppm에서 각각(HCCH2CH2CH2NH), (HCCH2CH2CH2NH), (HCCH2CH2CH2NH) 및 (HCCH2CH2CH2NH)의 메틸렌 및 메틴(methyne) 양성자에 해당되는 특유의 아르기닌 피크가 나타났다(도 1B). 접합된 아르기닌의 양을 2.33.0 ppm PEI 메틸렌 피크(CH2CH2N) 및 1.7 ppm 아르기닌 메틸렌 피크(HCCH2CH2CH2NH) 아래의 면적을 적분하여 계산하였다. 이 계산에 의하면 mPEG-PEI 당 약 7개의 아르기닌이 접합된 것으로 나타났다. 또한, 1.82.2 ppm에서 새로운 특유의 피크가 관찰되었다. 이 피크는 가교인 이미티올레인 메틸렌 양성자(NHCH(NH2)CH2CH2CH2SS)에 해당하는 것으로서(도 1C), (mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-g-PEI-mPEG; PPSA)가 합성되었다는 것을 확인시켜 주는 것이었다. 또한, MALDI-TOF-Mass로 분자량을 분석하였다. 분석결과, 최종 폴리머 분자량이 약 10.6 kDa임을 확인하였다.
PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI)의 주요 합성 경로를 반응식 2에 정리하였다.
[반응식 2]
Figure 112016078673653-pat00004
다음 단계에 따라 PSPA를 합성하였다: 커플링제인 EDC/NHS의 존재 하에 실온에서 18시간 동안 PBS에서 PEI(polyethylenimine)에 아르기닌을 처리하여 PEI-Arg를 합성하였다. PEI-Arg의 1H NMR 스펙트럼에서, 1.44, 1.70, 3.2 및 3.86에서의 공명 피크는 PEI와 함께 접합된 아르기닌에서 (-HCCH2CH2CH2NH-); (-HCCH2CH2CH2NH-); (-HCCH2CH2CH2NH-); 및 (-HCCH2CH2CH2NH-)의 메틴(methyne) 양성자에 해당하는 것이다. 또한, 접합된 아르기닌의 양을 2.33.0 ppm PEI 메틸렌 피크(CH2CH2N) 및 1.7 ppm 아르기닌 메틸렌 피크(HCCH2CH2CH2NH) 아래의 면적을 적분하여 계산하였다. 이 계산에 의하면 PEI 당 약 5-6개의 아르기닌이 접합된 것으로 나타났다. 생체적합성 및 친수성 블록을 향상시키기 위하여, PEI-Arg를 PBS 버퍼에서 succinimidyl ester methoxy poly(ethylene glycol)(MPEG-NHS)로 처리하여 PEI-Arg-mPEG가 형성되도록 하였다. 1H NMR로 화학구조를 분석한 결과, PEI-Arg 피크와 함께 에틸렌 글리콜(CH2-CH2-O) 및 메틸(OCH3) 양성자에 해당하는 3.4 및 3.6 ppm의 새로운 피크가 나타났으며, 이는 PEG의 연결을 확인시켜주는 것이었다. 다음으로, PEI-Arg-mPEG-SH를 합성하기 위하여 PEI-Arg-mPEG를 imidothiolane으로 처리하고, PBS 및 DMSO 혼합물의 존재 하에 티올 말단을 실온에서 48시간 동안 산화시켜 생환원성의 폴리머인 PSPA(PEI-Arg-mPEG-S-S-mPEG-Arg-PEI)를 합성하였다. 폴리머 PSPA의 화학구조를 1H NMR(300 MHz, D2O)로 확인하였다. PEI-Arg-mPEG와 함께 가교인 이미도티오레인 메틸렌 양성자(-NH-CH(NH2)-CH2-CH2-CH2-S-S-)-에 해당하는 1.8-2.2 ppm에서 새로운 특징적인 피크가 나타났으며, 이는 PSPA(PEI-Arg-mPEGS-S-mPEG-Arg-PEI)의 합성을 확인시켜 주는 것이었다.
2. PPSA 및 PSPA 폴리머의 세포독성 분석
(1) PPSA의 세포독성 분석
PPSA의 잠재적인 세포독성을 평가하기 위하여, 대조군(Mock), PPSA, 25K PEI 및 ABP를 각각 처리한 A549 및 MCF7 세포에서 MTT 에세이를 수행하였다. 세포를 0.5, 1, 5, 10 ㎍/㎖의 다양한 농도의 폴리머로 각각 처리한 다음, 72시간 동안 배양하고, 세포 생존률을 분석하여, 대조군에 대한 상대값으로 나타내었다.
도 3 A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 25K PEI의 경우, 시험한 모든 농도 범위에서 세포 생존율을 감소시켰다. ABP 또는 PPSA의 경우, 10 ㎍/㎖까지 독성 효과를 나타내지 않았다. 25K PEI, ABP 및 PPSA를 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우, A549 세포 생존률은 각각 약 46%, 92% 및 97%였다. 동일한 투여량에서 MCF7 세포의 생존률을 분석한 결과, 25K PEI, ABP 및 PPSA의 경우에 각각 약 36%, 94% 및 97%였다. 이러한 결과는 ABP가 포유류 세포에서 명백한 독성을 나타내지 않는다는 기존의 보고와 일치하는 것이다(32). 한편, 더 중요한 것은 PPSA도 세포독성을 보이지 않았다는 것인데, 이는 낮은 PEI 분자량(1.8 kDa) 및 PEG 컨쥬게이션 때문일 것으로 추정된다(46).
(2) 시간에 따른 폴리머의 세포독성 분석
폴리머 처리시간에 따른 폴리머의 잠재적인 세포독성을 평가하기 위하여 다양한 농도의 PPSA, 25K PEI 및 PAPS 폴리머 각각을 A549, MCF7 및 CT-26 세포에 처리하고, 세포 생존능을 확인하였다. 폴리머는 0.1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖, 5㎍/㎖ 및 10㎍/㎖의 농도로 각각 처리하고, 24 시간 및 72 시간 이후에 세포 생존률을 분석하여, 대조군에 대한 상대값으로 나타내었다.
도 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F 및 4G에 나타낸 바와 같이, 10 ㎍/㎖의 PAPS 폴리머를 A549 세포주에 24시간 동안 처리한 경우, 83%의 세포 생존율을 나타내었다. 대조적으로, 핵산 전달을 위해 광범위하게 사용되는 PEI 10 ㎍/㎖을 A549 세포주에 24시간 동안 처리한 경우, 15%의 세포 생존율을 나타내었다(도 4A). 또한 동일한 양의 PAPS, PPSA, PEI 폴리머를 72 시간 동안 처리한 경우, 각각 75%, 78%, 21%의 세포 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 PAPS 폴리머가 PPSA의 세포독성과 유사한 세포 생존율을 보여주었고, PEI에 비해서는 현저하게 독성이 낮다는 것을 보여주는 것이다. 생분해성의 특징을 가진 PAPS는 더 낮은 분자량으로 환원될 수 있기 때문에 생분해성이 없는 PEI에 비해 더 낮은 세포독성을 나타내는 것으로 추정된다. 따라서 PAPS는 25kDa PEI에 비해 현저하게 증가된 생체적합성을 가지고 있다. 동일한 농도 및 처리시간에 따른 유사한 결과를 다른 세포주인 MCF7와 CT-26에서도 관찰 할 수 있었다.
3. 나노 복합체의 특성 분석
(1) Ad/ PPSA 나노 복합체의 특성 분석
PPSA가 Ad와 복합체를 형성할 수 있는 능력을 평가하기 위하여, Ad 입자 당 폴리머의 몰비(molar ratio)를 0(naked Ad), 2x104, 1×105, 4x105, 1×106 로 하여 아가로스 겔 지연 전기영동 분석(comparative agarose gel retardation electrophoresis assay)을 수행하였다.
도 5A, 5B 및 5C에 나타낸 바와 같이, Ad의 이동은 PPSA:Ad 몰비가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였다. Ad의 이동은 몰비 1×106에서 완전히 지연되었는데, 이는 Ad 표면이 PPSA 폴리머로 포화되었음을 나타내는 것이었다(도 5A).
비특이적이고 클라트린(clathrin)에 의존적인 과정을 통하여 효과적으로 세포에 흡수되기 위해서, 유전자 전달 벡터는 적절한 크기(<200 nm)를 갖는 것이 중요하다(47, 48). 또한, 음전하의 세포막에 더 효과적으로 부착되기 위하여 복합체는 전체적으로 양전하를 띠는 것이 필요하다. Ad/PPSA 나노입자의 생물리학적 특성을 평가하기 위하여, DLS와 제타전위 분석기를 이용하여 수화 크기(hydrated size) 및 표면 전하를 각각 측정하였다. 용액 내에서 나출형 Ad 입자의 평균 크기는 지름 110.8 nm이었으며, PPSA:Ad 몰비 증가에 비례하여 200 nm(1×106 몰비)까지 증가하였다(도 5B).
DLS 데이터에 일치하게, 표면 전하도 PPSA:Ad 몰비 증가에 비례하여, 19.7 ± 1.2 mV(naked Ad)에서 19.6± 0.9 mV(1× 106 몰비)로 증가하였다(도 5C). 이러한 결과는 PPSA가 정전기적 상호작용을 통하여 Ad의 표면에 성공적으로 코팅되었으며, 음전하를 차폐하여 1×105 이상의 몰비에서 최종적으로 양전하를 가지고 있음을 나타낸다.
Ad 입자 당 폴리머의 몰비(molar ratio) 4x105, 1×106인 Ad/PPSA 복합체에 대하여 나노입자의 평균 크기 및 표면 전하를 측정하는 방법으로 실온에서 PBS 버퍼에서의 Ad/PPSA 나노입자의 콜로이드 안정성을 72시간까지 측정하였다. 또한, 또한, 환원제인 DTT(dithiothreitol)를 처리하여 PPSA 및 nonreducible mPEG-PEI-g-Arg(PPA)의 환원성을 조사하였다. DTT를 처리하거나, 처리하지 않은 나출형 Ad, Ad/PPSA 및 Ad/PPA 복합체의 입자크기를 DLS 분석기로 측정하였다.
도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, Ad/PPSA 나노입자의 평균 크기와 표면 전하는 72시간 동안 크게 변하지 않았으며, 이는 PPSA 양이온성 폴리머로 코팅된 Ad의 콜로이드 안정성이 우수함을 암시하는 것이다.
또한, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 나출형 Ad 또는 Ad/PPA 복합체의 크기는 DTT 처리에 의해 변하지 않았다. 그러나 PPSA 코팅된 Ad 복합체의 평균 입자 크기는 DTT 처리 후 유의하게 감소하여, 나출형 Ad의 크기에 근접하였다. 이러한 결과는 PPSA가 환원 미세 환경에서 생분해될 수 있음을 명백하게 확인시켜주는 것이다.
종합적으로, 상기 실험결과들은 Ad/PPSA 복합체가 성공적으로 제작되었으며, 직경 200 nm 미만의 입자를 이루며(도 6 A), 양전하의 표면을 생성하고(도 6B), Ad/PPSA가 효과적으로 세포에 형질도입될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
(2) Ad/ PSPA 나노 복합체의 특성 분석
다양한 농도비에 따른 Ad/PAPS 복합체와 아데노바이러스의 상호작용을 아가로즈 겔 지연 전기영동 어세이(agarose gel retardation electrophoresis assay)로 분석하였다. 실험은 Ad 입자 당 폴리머의 몰비(molar ratio)가 1x103, 5× 103, 1×104, 1×105, 5×105 및 1×106 인 복합체에 대하여 실시하였다.
도 7A에 나타낸 바와 같이, 폴리머의 비율이 증가함에 따라 겔에서의 Ad 이동이 지연되었으며, 이는 폴리머가 Ad와 상호작용하여 Ad의 표면전하가 양성으로 전환되었다는 것을 의미한다. 폴리머 및 Ad의 비율이 중성화 포인트를 초과하는 경우, 복합체 표면 전하는 양성전하로 전환되어 이동을 멈추었다. 몰비가 1×105 인 경우 이동이 일어나지 않았는바, 이는 상기 농도에서 Ad의 표면이 PAPS에 의하여 포화 되었음을 의미한다. 또한, 이러한 결과는 Ad 밴드가 보이지 않는 것으로 보아 PAPS 폴리머가 효과적으로 Ad와 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다.
Ad/PAPS 나노입자의 생물리학적 특성을 평가하기 위하여, DLS와 제타전위 분석기를 이용하여 수화 크기(hydrated size) 및 표면 전하를 각각 측정하였다. 용액 내에서 나출형 Ad 입자의 평균 크기는 지름 124.8 nm이었으며, PSPA:Ad 몰비가 1×105까지는 200 nm 미만 수준으로 머물렀으며, 그 이상의 몰비에서는 증가에 비례하여 935.6 nm (1× 106 몰비)까지 증가하였다(도 7B).
DLS 데이터에 일치하게, 표면 전하도 PAPS:Ad 몰비 증가에 비례하여, -21.8 ± 0.75 mV(naked Ad)에서 19.7 ± 4.9 mV(1× 106 몰비)로 증가하였다(도 7B). 이러한 결과는 PAPS가 정전기적 상호작용을 통하여 Ad의 표면에 성공적으로 코팅되어 최종적으로 양전하를 가짐을 나타낸다.
또한, 환원제인 DTT(dithiothreitol)를 처리하여 PAPS 및 nonreducible PEI-Arg-mPEG(PAP)의 환원성을 조사하였다. DTT를 처리하거나, 처리하지 않은 나출형 Ad, Ad/PAPS 및 Ad/PAP 복합체의 입자크기를 DLS 분석기로 측정하였다. 분석결과, 나출형 Ad 또는 Ad/PAP 복합체의 크기는 DTT 처리에 의해 변하지 않았다(도 7C). 그러나 PAPS 코팅된 Ad 복합체의 평균 입자 크기는 DTT 처리 후 유의하게 감소하여, 나출형 Ad의 크기에 근접하였다. 이러한 결과는 PAPS가 환원 미세 환경에서 생분해될 수 있음을 입증한다.
종합적으로, 상기 실험결과들은 Ad/PAPS 복합체가 성공적으로 제작되었으며, 폴리머 : Ad 1×105 몰비에서 직경 200 nm 미만의 입자를 이루며, 양전하의 표면을 생성하고, Ad/PAPS가 효과적으로 세포에 형질도입될 수 있다는 것을 보여준다.
4. Ad/ PPSA 복합체의 향상된 형질도입 효율
Ad에 의해 매개된 유전자 전달은 타겟 세포막의 CAR 발현레벨에 의존적이다. 그러나 악성 종양의 경우 종종 CAR 발현이 감소되어 Ad의 종양 감염력이 낮아지는 결과를 나타낸다(49, 50). 따라서, 효과적인 유전자 치료제의 전달을 보장하기 위해서는 CAR 경로에 의존하지 않는 전달방법을 개발하는 것이 필요하다.
Ad/PPSA가 CAR-매개 전달을 우회할 수 있는 능력이 있는지를 확인하기 위하여, CAR(+) A549 세포와 CAR(-) MCF7 세포에 Ad/PPSA를 형질도입하였으며, 대조군으로 25K PEI 및 Ad/ABP 복합체를 사용하였다. 본 발명자들은 기존 연구에서, Ad/ABP 복합체는 CAR-독립적인 세포 전달경로를 통하여 세포 내로 들어가며, Ad 감염에 내성이 있으며 CAR 발현이 낮은 세포에서도 유전자 전달을 촉진한다는 것을 확인한 바 있다(32).
도 8A 및 8B에 나타낸 바와 같이, Ad/PPSA의 형질도입 효율은 A549와 MCF7 세포 모두에서 나출형 Ad에 비해 현저하게 증가하였다. 이는 Ad/PPSA가 CAR 발현에 의존하지 않고, 효과적으로 암세포에 형질도입될 수 있음을 시사해주는 것이다. 중요한 것은, PPSA 복합체의 효과가 CAR(-) MCF7 세포에서도 나타났다는 것인데, 나출형 Ad에 비하여 형질도입 효율이 107배(4 × 105 PPSA:Ad 몰비) 및 110배(1 × 106 PPSA:Ad 몰비) 증가하였다(P < 0.001). 더욱 중요한 것은, 4× 105 폴리머:Ad 몰비에서, Ad/PPSA를 처리한 경우, Ad/ABP를 처리한 경우에 비해 A549 및 MCF7 세포에서의 GFP 발현이 2배 증가(P < 0.001)하였다는 것이다. 이는 형질도입 효율의 측면에서 Ad/PPSA의 우수성을 나타내는 것이다. 한편, Ad/25K PEI를 처리한 세포의 경우, GFP 발현이 나출형 Ad를 처리한 경우에 비해 낮았는데, 이는 25K PEI의 심각한 세포독성 때문인 것으로 추정된다.
또한, Ad/PPSA의 CAR-독립적인 세포 도입을 추가적으로 확인하기 위하여, CAR에 결합하는 Ad5 knob 단백질을 이용하여 경쟁 분석(competition assay)을 수행하였다.
도 9A 및 도 9B에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 knob 단백질로 전 처리한 경우, 나출형 Ad를 처리한 세포에서 용량 의존적으로 유의한 GFP 발현의 감소를 나타내었는데, 각각 56.1%(2 mg/㎖ knob 단백질 처리) 및 81.1%(10 mg/㎖ knob 단백질 처리)의 감소를 나타내었다. 반면, Ad/ABP의 경우, GFP 발현이 27.2%(2 mg/㎖ knob 단백질 처리) 및 53.8%(10 mg/㎖ knob 단백질 처리) 감소하였으며, Ad/PPSA의 경우, GFP 발현이 12.2%(2 mg/㎖ knob 단백질 처리) 및 23.3%(10 mg/㎖ knob 단백질 처리) 감소하였다. 이러한 결과는 Ad/ABP 및 Ad/PPSA의 세포 도입이 주로 CAR-독립적인 세포 흡수에 의해 매개된다는 것을 나타내는 것이며, 임상의 악성 암세포 치료에서 치료적 가치를 가지고 있음을 시사해주는 것이다.
FITC 형광 표지를 이용하여 Ad/PPSA 복합체의 세포 흡수효율을 나출형 Ad 또는 mPEG-PEI-S-S-PEI-mPEG(PPS) 코팅된 Ad와 비교하여 조사하였다.
도 10A, 10B, 10C 및 10D에 나타낸 바와 같이, Ad가 PPS 또는 PPSA와 복합체를 형성한 경우, 나출형 Ad에 비해 세포 흡수효율이 현저하게 향상되었다(P < 0.001). 중요한 것은, Ad/PPSA를 처리한 경우, 세포 흡수효율이 Ad/PPS에 비해 유의하게 증가하였다는 것이다(P < 0.05). 이는 아르기닌 접합이 세포 흡수효율을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
5. Ad/ PSPA의 향상된 형질도입 효율
In vitro에서 Ad/PSPA 나노복합체의 형질도입 효율을 조사하기 위하여, 낮은 CAR 발현레벨을 가지는 MCF7 세포주, CT-26 세포주 및 A549 세포주에서 Ad/PAPS 복합체의 GFP 발현레벨을 분석하였다.
Ad/PSPA 복합체의 형질도입 효율을, PEI 25 kDa와 본 발명의 또 다른 양태인 Ad/PPSA 복합체와 비교하였다. pH 7.4에서 500 MOI(VIRUS OD titer 2× 1010 VP)의 나출형 Ad(naked Ad), Ad/PSPA 나노복합체, Ad/PPSA 나노복합체 및 Ad/PEI 25kDa 나노복합체를 1× 103, 5× 103, 1× 104, 5× 104, 1× 105, 5× 105, 1× 106 폴리머:Ad 몰비로 각각 A549, MCF7 및 CT-26 세포에 48시간 동안 형질도입하였다. 상기 처리된 각각의 벡터의 형질도입 효율을 시각적으로 확인하기 위하여, 형광현미경으로 세포의 녹색 형광이미지를 분석하였다.
도 11 B, 11C와 도 12B, 12C에 나타낸 바와 같이, MCF7 및 CT-26 세포에서 나출형 Ad는 GFP의 발현을 나타내지 않은 반면, 폴리머로 코팅된 Ad 나노복합체는 현저하게 높은 GFP의 발현을 나타내었다. Ad/PPSA 복합체의 경우, 낮은 농도에서는 GFP의 발현을 나타내지 않았으나 용량 의존적으로 GFP의 발현이 증가하였다. Ad/PEI 25 kDa 복합체의 경우 낮은 농도에서는 높은 GFP 발현을 나타내었으나 용량이 증가함에 따라 GFP의 발현이 감소하였다. 이는 Ad/PEI 25 kDa 복합체가 높은 농도에서 세포독성을 나타내기 때문인 것으로 추정된다. Ad/PAPS 복합체의 경우, 1× 105 폴리머:Ad 몰비에서 높은 GFP 발현을 나타내었으며, 폴리머:Ad 몰비가 증가하면서 GFP 발현이 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 Ad/PAPS 복합체가 CAR(-) 세포에서 Ad/PPSA에 비해 낮은 폴리머:Ad 몰비에서도 형질도입 효율을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
또한, 도 11C 및 도 12C에 나타낸 바와 같이, A549 세포에서 역시 나출형 Ad 와 비교하여 Ad/PAPS의 형질도입 효율이 현저하게 증가하였다. 이는 Ad/PAPS 역시 CAR 발현에 의존하지 않고, 효과적으로 암세포에 형질도입될 수 있음을 시사해주는 것이다.
6. 바이러스/ 폴리머 복합체의 암세포 살생 효과
(1) 치료 유전자를 포함하는 바이러스/ PPSA 복합체의 항암효과
PPSA의 잠재적인 치료 가치를 추가적으로 평가하기 위하여, 종양살상 Ad(Oncolytic Ad)인 DWP418와 PPSA를 복합체로 제작하였다. DWP418의 경우, 복제는 변형된 TERT 프로모터(promoter)에 의해 조절되며 릴랙신(relaxin)을 치료 유전자로 포함하고 있다. 기존 연구에서 본 발명자들은 DWP418이 암세포의 공통 특성인, 높은 텔로머라제(telomerase) 활성을 보이는 세포에서만 복제되며, 릴랙신의 발현은 세포 외 기질 성분을 감소시킴으로써, 종양 조직 전반에 걸친 바이러스 확산을 증가시킨다는 것을 확인한 바 있다(36).
도 13A 및 13B에 나타낸 바와 같이, 나출형 DWP418는 CAR(+) A549 세포에서 세포의 용해를 유도하였으나, CAR(-) MCF7 세포에서는 용해를 유도하지 않았는데, 이는 나출형 DWP418가 세포 도입에서 CAR 발현에 의존적임을 의미한다. 이와 대조적으로, DWP418가 1× 106 폴리머:Ad 몰비로, ABP 또는 PPSA로 코팅된 경우, 세포살상 효능이 현저하게 증가하였는데, 즉, MCF7 세포에서 각각 34%, 80% 향상된 세포살상 효능을 나타내었다(P < 0.001). 마찬가지로, CAR(+) A549 세포에서 DWP418/ABP(18% 증가) 및 DWP418/PPSA(40% 증가)의 세포살상 효능이 나출형 DWP418에 비해 증가한 것을 관찰하였다(P < 0.001). 이러한 결과는 나출형 Ad에 비해 향상된 나노복합체의 유전자 전달 효율과 일치하는 것으로서(도 8A 및 8B), 바이러스의 표면을 PPSA로 코팅함으로써 종양살상 Ad의 치료 효과가 현저하게 증가할 수 있다는 것을 보여준다.
(2) 바이러스/ 폴리머 복합체의 항암효능
종양살상 Ad(Oncolytic Ad;oAd)인 RdB/IL-12/Decorin를 PPSA 폴리머와 PAPS 폴리머로 각각 표면을 코팅하여 복합체를 제작하였다. 복합체는 1 x 105 의 폴리머:바이러스의 몰비율로 제작하였다.
도 14A, 14B 및 14C에 나타낸 바와 같이, CAR(+) A549 세포에서 각 실험군을 1, 2, 5 MOI로 처리한 경우, 각각의 MOI에서 41%, 61%, 69%로 향상된 세포살상 효능을 나타내었다 (P < 0.001). 또한 CAR (-) MCF7 및 CT-26에서 각각 50, 100, 200 MOI 그리고 100, 500, 1000 MOI로 처리한 경우 MCF7 세포에서는 200 MOI로 처리한 경우 oAd/PAPS 및 oAd/PPSA에서 55%, 29%의 세포 살상 효능이 나출형 oAd에 비해 증가한 것을 확인했다. CT-26 세포에서 1000 MOI로 처리한 경우 oAd/PAPS 및 oAd/PPSA에서 63%, 45%의 세포 살상 효능이 나출형 oAd에 비해 증가한 것을 확인했다. 이러한 결과는 나출형 Ad에 비해 향상된 Ad/폴리머 복합체의 유전자 전달 효율과 일치하는 것으로서, PPSA 또는 PAPS로 표면을 코팅함으로써 종양살상 Ad의 치료 효과가 현저하게 증가할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
7. Ad/PAPS 복합체의 유전자 발현 효율 증가 확인
디코린(Decorin)과 IL-12를 발현하는 바이러스의 표면을 PAPS로 코팅한 oAd/PAPS 복합체가 CT-26세포주에 감염되었을 때, 세포 내에서 DCN 단백질이 생성되고, IL-12 사이토카인이 생성되어 세포 배양액으로 분비되므로, 본 발명의 복합체를 이용하는 경우 유전자 발현 효율이 증가하는 것을 확인하기 위하여 CT-26 세포에 100, 200 500 MOI의 나출형 oAd와 oAd/PAPS를 각각 처리하고 48시간 뒤에 세포 배양액과 세포를 모두 수거하여 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 감염시켰던 종양세포와 배지를 모두 수거하여 디코린(Decorin)을 검출하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하였다.
다음으로 IL-12 발현 확인을 위해서 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 시행하였다. 100, 200 MOI의 나출형 oAd와 oAd/PAPS를 CT-26세포주에 처리한 후 48시간 후에 세포로부터 배지를 회수하여 ELISA를 통하여 IL-12 발현 양을 정량하였다.
도 15A 및 15B에 나타낸 바와 같이, 500 MOI를 처리한 oAd/PAPS의 세포 용해물(cell lysate)에서 디코린(decorin)의 생성을 확인할 수 있을 정도의 양이 관찰 되었다. 그러나 나출형 oAd를 처리한 경우에는 디코린의 발현을 확인할 수 없었다. 이는 나출형 oAd의 경우 CAR (-)인 CT-26 세포주에 유입되는 것이 불가능 하기 때문이다. 이를 통해 oAd/PAPS의 경우 CAR (-)인 CT-26 세포주에도 유입이 가능하고, 세포 내에서 디코린(decorin)을 생성하는 것을 확인하였다.
또한, IL-12 발현을 확인한 결과 실험에 이용한 나출형 oAd를 처리한 경우 발현이 관찰되지 않았지만, oAd/PAPS를 처리한 경우 MOI가 증가함에 따라 증대되는 IL-12의 발현양을 확인할 수 있었다. 이는 oAd/PAPS 복합체는 CAR 비의존적으로 세포 내로 유입되어 치료 유전자의 발현을 통해 치료 물질의 생성을 유도할 수 있음을 의미한다.
8. Ad/ PPSA의 잠재적인 항암효능
DWP418/PPSA의 치료적 항암효능을 검증하기 위하여, 누드마우스에 이종접합된 MCF7 종양을 대상으로, PBS, ABP, PPSA, DWP418, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA를 격일로 5일 동안 종양 내에 주사하였다(총 3회 주사).
도 16A 및 16B에 나타낸 바와 같이, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA를 종양 내에 주사한 경우, 나출형 DWP418과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 양이온 폴리머-코팅된 DWP418의 종양살상 항암활성이 향상되었다는 것을 보여주는 것이다(P < 0.01). PBS, ABP, PPSA, DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA을 처리한 MCF7 이종이식 종양의 부피는, 처리 19일 후에 각각 1520± 30, 1325± 47, 1297± 91, 1084± 42, 802± 42, 및 483± 79 mm3이었다(도 16A). DWP418, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA를 처리한 마우스의 종양 부피는 PBS를 처리한 대조군에 비해 각각 28.7%, 47.2% 및 68.2% 감소하였다. 처리 19일 후의 종양의 크기는, DWP418/ABP 또는 DWP418/PPSA를 처리한 경우가 나출형 DWP418를 처리한 경우에 비해 각각 1.3배, 2.24배 감소하였다(P < 0.01). 이러한 결과는 항암효능에서 DWP418/PPSA의 우수성을 나타내는 것이며, DWP418/ABP보다 치료 효과가 개선되었다는 것을 의미한다(P < 0.01).
조직학적 및 면역조직화학적 분석을 위해, PBS, ABP, PPSA, DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA를 처리한 MCF7 종양을 마지막 주사 3일 후에 채취하였다. 그 다음, 조직절편을 표준 H & E 염색뿐만 아니라 Ad E1A 특이적 항체, PCNA, TUNEL에 대해 염색하였다(도 16B). DWP418/PPSA을 처리한 종양 조직의 경우, 광범위한 괴사를 보였으며, DWP418 또는 DWP418/ABP를 처리한 종양과 비교하여 Ad가 더 넓게 확산되었다. 종양 조직 내의 Ad E1A의 진한 염색은 PPSA 방출에 따라, 감염된 암세포에서 종양살상 Ad가 활발하게 복제되고 있음을 나타내는 것이다. 또한, DWP418/PPSA를 처리한 경우, 나출형 DWP418 또는 DWP418/ABP를 처리한 경우에 비해 조직의 PCNA(proliferating cell nuclear antigen) 발현이 현저히 감소하였다. 이러한 결과는 DWP418/PPSA이 종양 세포 증식을 억제하는데 더 효과적임을 나타내는 것이다. 이와 유사하게, DWP418/PPSA를 처리한 그룹의 경우, E1A 양성인 세포와 같은 구역에서 TUNEL 양성인 자살 세포가 많이 관찰되었다. 종합적으로, 이러한 결과는 종양살상 Ad/PPSA 복합체는 나출형 종양살상 Ad 및 종양살상 Ad/ABP 복합체에 비해 감염능력이 향상되었으며 항암효능이 증가되었음을 의미한다.
9. Ad에 대한 선천성 및 후천성 면역 반응
Ad의 정맥주사는 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있으며, 이는 Ad의 치료 효율을 제한하게 된다. DWP418/PPSA가 선천성 면역반응을 회피할 수 있는지 확인하기 위해, 처리 6시간 후에 마우스에서 전염증성 사이토카인 IL-6의 분비를 측정하였다.
나출형 DWP418의 경우, Balb/C 마우스에서 IL-6 혈청 레벨이 기준레벨보다 4.87배 증가되었다(P < 0.01)(도 17A). 이와 현저히 대조적으로, DWP418/ABP 및 DWP418/PPSA를 처리한 경우, PBS를 처리한 경우와 거의 동등한 IL-6 혈청 레벨을 나타내었다. 이러한 결과는 ABP 및 PPSA로 Ad 표면을 코팅하는 경우, Ad에 대한 선천성 면역반응을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
또한, DWP418/PPSA가 Ad에 대한 후천성 면역반응을 회피할 수 있는 잠재적 효능을 가지고 있는지를 확인하였다. 나출형 Ad(dE1/GFP)를 처리한 마우스에서 얻은 Ad 특이적 중화 항체를 포함하는 혈청의 경우, 나출형 dE1/GFP의 형질도입 효율을 94.8% 감소시켰다(도 17B 및 17C). 이와 대조적으로, Ad/PPSA 복합체의 형질도입 효율은 감소하지 않았다. 이러한 결과는 PPSA 복합체가 기존에 존재하는 중화 항체를 회피할 수 있다는 것을 나타내는 것이며, 또한, Ad/PPSA 나노복합체가 systemic multidose treatment에 사용될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
10. 정맥 주사된 Ad/ PPSA의 in vivo 간독성
Ad 치료 관련 간독성을 평가하기 위하여, 나출형 DWP418, DWP418/ABP, 또는 DWP418/PPSA를 정맥주사 한 후 ALT 및 AST의 혈청 레벨을 측정하였다.
도 18A 및 18B에 나타낸 바와 같이, 나출형 DWP418를 처리한 마우스의 경우, 주사 3일 후 PBS를 처리한 대조군에 비해 유의하게 높은 트랜스아미나아제(transaminase) 혈청 레벨을 나타내었다(P < 0.05). 대조적으로, DWP418/PPSA 처리한 마우스의 경우, ALT 및 AST 레벨의 유의한 증가를 관찰할 수 없었다. DWP418/ABP 처리한 마우스의 경우, ALT 및 AST의 혈청 레벨이 DWP418만을 처리한 경우에 비해 약간 감소하였지만, PBS 처리한 대조군에 비해서는 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 Ad의 PEGylation이 Ad 관련 간독성을 감소시킨다는 것을 보여주는 것이다. DWP418/PPSA를 처리한 경우, DWP418/ABP에 비해 간독성 수치가 낮게 관찰된 것은 PPSA 상에 있는 PEGylated PEI로 인한 결과인 것으로 추정된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 통상의 기술자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 생환원성(bioreducible) 폴리머.
    [화학식 2]
    Figure 112017073907918-pat00006

    상기 화학식 2에서 x 및 y는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
  2. 제 1 항에 따른 화학식 2의 폴리머가 바이러스의 표면에 결합된 폴리머-바이러스 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 배시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 폴리머-바이러스 복합체.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스인 폴리머-바이러스 복합체.
  5. 제 2 항의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 유전자 전달용 조성물
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 치료용 유전자를 추가로 포함하는 것인 유전자 전달용 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 배시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 전달용 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스인 유전자 전달용 조성물.
  9. 제2항의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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