JP2002523054A - ポリマーにより修飾されたアデノウイルスのカチオン性複合体 - Google Patents
ポリマーにより修飾されたアデノウイルスのカチオン性複合体Info
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- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
Abstract
(57)【要約】
少なくとも１種のポリアルカレングリコールポリマーが結合したカチオン性分子およびアデノウイルスの複合体を含むアデノウイルス複合体。ポリアルカレングリコールポリマーは、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリメチルエチレングリコール、ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリメチルプロピレングリコールを包含するが、これらに限らない。ポリマーの分子量は２００ないし２００００ダルトンの範囲であり、２０００ないし１２０００ダルトンが好ましい。好ましくは、アデノウイルスは導入遺伝子を含む組み換えウイルスベクターのごとき組み換えアデノウイルスベクターである。ポリマーは共有結合または非共有結合手段によりウイルス粒子に直接または間接的に結合している。好ましくは、カチオン性分子はＤＥＡＥ−デキストランのごときカチオン性ポリマーであるか、あるいはカチオン性脂質である。アデノウイルス複合体および担体を含有する組成物も開示する。
Description
【０００１】発明の背景 遺伝病および後天的な疾患を治療するための導入遺伝子の有効な使用には、導
入遺伝子の効率的なデリバリーが必要である。導入遺伝子を標的細胞にデリバリ
ーできる種々のベクター系が開発されている。改良された特徴を有する比較的新
しい世代のベクターが開発されているが、利用可能な遺伝子導入方法の効率を改
善する必要がまだある。完全された効率は、導入遺伝子を標的細胞にデリバリー
して細胞の欠陥を修正するベクターの能力を増大させ、あるいは所望生成物をコ
ードする遺伝子を提供し、ならびにベクターの必要量を減少させ、そのことによ
り免疫原性を包含する毒性を低下させるために望ましい。
入遺伝子の効率的なデリバリーが必要である。導入遺伝子を標的細胞にデリバリ
ーできる種々のベクター系が開発されている。改良された特徴を有する比較的新
しい世代のベクターが開発されているが、利用可能な遺伝子導入方法の効率を改
善する必要がまだある。完全された効率は、導入遺伝子を標的細胞にデリバリー
して細胞の欠陥を修正するベクターの能力を増大させ、あるいは所望生成物をコ
ードする遺伝子を提供し、ならびにベクターの必要量を減少させ、そのことによ
り免疫原性を包含する毒性を低下させるために望ましい。
【０００２】 アデノウイルスベクターは、アデノウイルスを核酸導入に適したビヒクルとす
るアデノウイルスの望ましい特徴を利用するように設計されている。アデノウイ
ルスはエンベロープのない、約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウイルスであ
り、古典的な遺伝学および分子生物学における研究により十分に特徴がわかって
いる（Horwitz, M.S., "Adenoviridae and Their Replication," in Virology,
2nd edition, Fields et al., eds., Raven Press, New York, 1990）。そのウ
イルス遺伝子は、２種の一時的なクラスのウイルス蛋白の発生に関連して初期（
Ｅ１〜Ｅ４として知られる）転写ユニットおよび後期（Ｌ１〜Ｌ５として知られ
る）転写ユニットに分類される。これらのイベント間に境界をもたらすものはウ
イルスＤＮＡ複製である。赤血球凝集、腫瘍原性、ＤＮＡ塩基および蛋白のアミ
ノ酸組成および相同性、ならびに抗原性の関連を包含する種々の特性に基づいて
、ヒトアデノウイルスは多くのセロタイプに分類される（約４７種であり、６つ
のサブグループに分類される）。
るアデノウイルスの望ましい特徴を利用するように設計されている。アデノウイ
ルスはエンベロープのない、約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウイルスであ
り、古典的な遺伝学および分子生物学における研究により十分に特徴がわかって
いる（Horwitz, M.S., "Adenoviridae and Their Replication," in Virology,
2nd edition, Fields et al., eds., Raven Press, New York, 1990）。そのウ
イルス遺伝子は、２種の一時的なクラスのウイルス蛋白の発生に関連して初期（
Ｅ１〜Ｅ４として知られる）転写ユニットおよび後期（Ｌ１〜Ｌ５として知られ
る）転写ユニットに分類される。これらのイベント間に境界をもたらすものはウ
イルスＤＮＡ複製である。赤血球凝集、腫瘍原性、ＤＮＡ塩基および蛋白のアミ
ノ酸組成および相同性、ならびに抗原性の関連を包含する種々の特性に基づいて
、ヒトアデノウイルスは多くのセロタイプに分類される（約４７種であり、６つ
のサブグループに分類される）。
【０００３】 組み換えアデノウイルスベクターは、分裂性細胞および非分裂性細胞の両方に
対する向性、複製して高力価となりベクターストック調製に適していること、な
らびに大きなインサートを担持する潜在能力を包含する遺伝子導入ベクターとし
て使用されるいくつかの利点を有している（Berkner, K.L., Curr. Top. Micro.
Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:51-64, 1994
）。
対する向性、複製して高力価となりベクターストック調製に適していること、な
らびに大きなインサートを担持する潜在能力を包含する遺伝子導入ベクターとし
て使用されるいくつかの利点を有している（Berkner, K.L., Curr. Top. Micro.
Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:51-64, 1994
）。
【０００４】 アデノウイルスベクターのクローニング容量はベクター中に存在するアデノウ
イルスゲノムのサイズに比例する。例えば、約８ｋｂのクローニング容量はウイ
ルス増殖に不可欠なウイルスゲノムの特定領域、例えばＥ３を欠失させ、２９３
細胞（Graham, F.L., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）またはＡ５４９細胞（I
mler et al., Gene Therapy 3:75-84, 1996）からその機能がトランスで修復さ
れうるＥ１のごときゲノム領域を欠失させることにより得ることができる。かか
るＥ１欠失ベクターは複製欠損となる。ベクターＤＮＡの最適担持容量の上限は
野生型ゲノムの長さの約１０５〜１０８％である。他のウイルス遺伝子産物、例
えばＥ２ａの相補（Zhou et al., J. Virol. 70:7030-7038, 1996）、Ｅ４の相
補（Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6:1575-1586, 1995; Wang et al., Ge
ne Ther. 2:775-783, 1995）、あるいは蛋白ＩＸの相補（Caravokyri et al., J
. Virol. 69:6627-6633, 1995; Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6:1575-15
86, 1995）をトランスで供給する細胞系を用いるベクターの設計において更なる
アデノウイルスゲノムの修飾が可能である。
イルスゲノムのサイズに比例する。例えば、約８ｋｂのクローニング容量はウイ
ルス増殖に不可欠なウイルスゲノムの特定領域、例えばＥ３を欠失させ、２９３
細胞（Graham, F.L., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）またはＡ５４９細胞（I
mler et al., Gene Therapy 3:75-84, 1996）からその機能がトランスで修復さ
れうるＥ１のごときゲノム領域を欠失させることにより得ることができる。かか
るＥ１欠失ベクターは複製欠損となる。ベクターＤＮＡの最適担持容量の上限は
野生型ゲノムの長さの約１０５〜１０８％である。他のウイルス遺伝子産物、例
えばＥ２ａの相補（Zhou et al., J. Virol. 70:7030-7038, 1996）、Ｅ４の相
補（Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6:1575-1586, 1995; Wang et al., Ge
ne Ther. 2:775-783, 1995）、あるいは蛋白ＩＸの相補（Caravokyri et al., J
. Virol. 69:6627-6633, 1995; Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6:1575-15
86, 1995）をトランスで供給する細胞系を用いるベクターの設計において更なる
アデノウイルスゲノムの修飾が可能である。
【０００５】 細胞への遺伝子導入および遺伝子治療に用いられるアデノウイルスベクターは
、通常には、初期領域１（Ｅ１）遺伝子を欠失させることにより得られる（Berk
ner, K.L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:39-66, 1992）。Ｅ１遺伝子の欠
失はベクターを複製欠損にし、ベクター中に存在する残りのウイルス遺伝子の発
現を減少させる。しかしながら、アデノウイルスベクター中の残りのウイルス遺
伝子の存在は下記の１つまたはそれ以上の理由により、トランスフェクション細
胞に対して有害でありうる：（１）発現されたウイルス蛋白に対して指向された
細胞性免疫応答の刺激、（２）発現されたウイルス蛋白の細胞毒性、および（３
）細胞死を導くベクターゲノムの複製。
、通常には、初期領域１（Ｅ１）遺伝子を欠失させることにより得られる（Berk
ner, K.L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:39-66, 1992）。Ｅ１遺伝子の欠
失はベクターを複製欠損にし、ベクター中に存在する残りのウイルス遺伝子の発
現を減少させる。しかしながら、アデノウイルスベクター中の残りのウイルス遺
伝子の存在は下記の１つまたはそれ以上の理由により、トランスフェクション細
胞に対して有害でありうる：（１）発現されたウイルス蛋白に対して指向された
細胞性免疫応答の刺激、（２）発現されたウイルス蛋白の細胞毒性、および（３
）細胞死を導くベクターゲノムの複製。
【０００６】 アデノウイルスベクターによって今日に至るまで発現された導入遺伝子はｐ５
３（Wills et al., Human Gene Therapy 5:1079-188, 1994）；ジストロフィン
（Vincent et al., Nature Genetics 5:130-134, 1993）；エチスロポイエチン
（Descamps et al., Human Gene Therapy 5:979-985, 1994）；オルニチントラ
ンスカルバミラーゼ（Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1:2
41-256, 1990; We et al., J. Biol. Chem. 271;3639-3646, 1996）；アデノシ
ンデアミナーゼ（Mitani et al., Human Gene Therapy 5:941-948, 1994）；イ
ンターロイキン−２（Haddada et al., Human Gene Therapy 4:703-711, 1993）
；およびα１−アンチトリプシン（Jaffe et al., Nature Genetics 1:372-378,
1992）；スロンボポイエチン（Ohwada et al., Blood 88:778-784, 1996）；お
よびシトシンデアミナーゼ（Ohwada et al., Hum. Gene Ther. 7:1567-1576, 19
96）を包含する。
３（Wills et al., Human Gene Therapy 5:1079-188, 1994）；ジストロフィン
（Vincent et al., Nature Genetics 5:130-134, 1993）；エチスロポイエチン
（Descamps et al., Human Gene Therapy 5:979-985, 1994）；オルニチントラ
ンスカルバミラーゼ（Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1:2
41-256, 1990; We et al., J. Biol. Chem. 271;3639-3646, 1996）；アデノシ
ンデアミナーゼ（Mitani et al., Human Gene Therapy 5:941-948, 1994）；イ
ンターロイキン−２（Haddada et al., Human Gene Therapy 4:703-711, 1993）
；およびα１−アンチトリプシン（Jaffe et al., Nature Genetics 1:372-378,
1992）；スロンボポイエチン（Ohwada et al., Blood 88:778-784, 1996）；お
よびシトシンデアミナーゼ（Ohwada et al., Hum. Gene Ther. 7:1567-1576, 19
96）を包含する。
【０００７】 呼吸管細胞に対するアデノウイルスの特別な向性は、白人の最もありふれた常
染色体性劣性疾患であるのう胞性線維症（ＣＦ）に対する遺伝子導入におけるア
デノウイルスの使用に適したものである。気道上皮細胞においてｃＡＭＰにより
調節されているＣｌ−チャンネルを撹乱するのう胞性線維症膜貫通コンダクタン
スレギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子における変異は、肺の機能不全を引き起こ
す（Zabner et al., Nature Genetics 6:75-83, 1994）。ＣＦＴＲ遺伝子を担持
するように処理されたアデノウイルスベクターが開発され（Rich et al., Human
Gene Therapy 4:461-476, 1993）、これらのベクターがＣＦ患者の鼻上皮（Zab
ner et al., Cell 75:207-216, 1993）、コットンラットおよび霊長類の気道上
皮（Zabner et al., Nature Genetics 6:75-83, 1994）、およびＣＦ患者の呼吸
器上皮（Crystal et al., Nature Genetics 8:42-51, 1994）にＣＦＴＲをデリ
バリーする能力が示されている。最近の研究は、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡ配
列を含むアデノウイルスベクターをＣＦ患者の気道上皮細胞に投与することは、
治療された上皮細胞中のクロライドイオンチャンネルの機能を回復させうること
を示している（Zabner et al., J. Clin. Invest. 97:1504-1511, 1996; １９９
７年９月２３日に付与された米国特許第５６７０４８８号）。
染色体性劣性疾患であるのう胞性線維症（ＣＦ）に対する遺伝子導入におけるア
デノウイルスの使用に適したものである。気道上皮細胞においてｃＡＭＰにより
調節されているＣｌ−チャンネルを撹乱するのう胞性線維症膜貫通コンダクタン
スレギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子における変異は、肺の機能不全を引き起こ
す（Zabner et al., Nature Genetics 6:75-83, 1994）。ＣＦＴＲ遺伝子を担持
するように処理されたアデノウイルスベクターが開発され（Rich et al., Human
Gene Therapy 4:461-476, 1993）、これらのベクターがＣＦ患者の鼻上皮（Zab
ner et al., Cell 75:207-216, 1993）、コットンラットおよび霊長類の気道上
皮（Zabner et al., Nature Genetics 6:75-83, 1994）、およびＣＦ患者の呼吸
器上皮（Crystal et al., Nature Genetics 8:42-51, 1994）にＣＦＴＲをデリ
バリーする能力が示されている。最近の研究は、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡ配
列を含むアデノウイルスベクターをＣＦ患者の気道上皮細胞に投与することは、
治療された上皮細胞中のクロライドイオンチャンネルの機能を回復させうること
を示している（Zabner et al., J. Clin. Invest. 97:1504-1511, 1996; １９９
７年９月２３日に付与された米国特許第５６７０４８８号）。
【０００８】 かくして、のう胞性線維症（ＣＦ）患者の気道上皮へののう胞性線維症膜貫通
コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）ｃＤＮＡの導入は、細胞の欠陥、す
なわち電解質輸送におけるＣＦ欠陥を修正する遺伝子導入の成功例を提供する。
アデノウイルスベクター（Zabner et al. (1993) Cell 75: 207; Knowles et al
. (1995) New Engl. J. Med. 333: 823; Hay et al. (1995) Hum. Gene. Ther. 6 : 1487; Zabner et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1504 および米国特許第
５６７０４８８号）およびカチオン性脂質（Caplen et al. (1995) Nat. Med. 1
: 39 米国特許第５６５００９６号）を含むベクター系は、繊毛の生えた成熟し
たヒト気道上皮にＣＦＴＲ ｃＤＮＡを導入し、ＣＦＴＲを発現させうることが
示されている。かかる細胞における成功したデリバリーは、治療された細胞にお
ける機能的なクロライドイオンチャンネルの出現の証拠である。
コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）ｃＤＮＡの導入は、細胞の欠陥、す
なわち電解質輸送におけるＣＦ欠陥を修正する遺伝子導入の成功例を提供する。
アデノウイルスベクター（Zabner et al. (1993) Cell 75: 207; Knowles et al
. (1995) New Engl. J. Med. 333: 823; Hay et al. (1995) Hum. Gene. Ther. 6 : 1487; Zabner et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1504 および米国特許第
５６７０４８８号）およびカチオン性脂質（Caplen et al. (1995) Nat. Med. 1
: 39 米国特許第５６５００９６号）を含むベクター系は、繊毛の生えた成熟し
たヒト気道上皮にＣＦＴＲ ｃＤＮＡを導入し、ＣＦＴＲを発現させうることが
示されている。かかる細胞における成功したデリバリーは、治療された細胞にお
ける機能的なクロライドイオンチャンネルの出現の証拠である。
【０００９】 ＣＦＴＲ ｃＤＮＡを標的細胞にデリバリーして発現させることはできるが、
現在のアデノウイルスベクターは気道上皮にＣＦＴＲ ｃＤＮＡをデリバリーす
るには最適なものではない。なぜなら、上皮の頂上（露出）表面へのウイルスの
結合が限られたものだからである（Grubb et al. (1994) Nature 371: 802）。
限られた感染は、ウイルスと頂上表面との間の接触時間を延長することにより部
分的に克服されうる（Zabner et al. (1996) J. Virol. 70: 6994）。
現在のアデノウイルスベクターは気道上皮にＣＦＴＲ ｃＤＮＡをデリバリーす
るには最適なものではない。なぜなら、上皮の頂上（露出）表面へのウイルスの
結合が限られたものだからである（Grubb et al. (1994) Nature 371: 802）。
限られた感染は、ウイルスと頂上表面との間の接触時間を延長することにより部
分的に克服されうる（Zabner et al. (1996) J. Virol. 70: 6994）。
【００１０】 カチオン性脂質ベクターにより媒介される成熟ヒト気道上皮への遺伝子導入も
最適なものではない（Caplen et al. (1995) Nat. Med. 1: 39）。カチオン性分
子は細胞表面に結合し、いくつかの場合には細胞によって取り込まれるように思
われるが、導入遺伝子発現に対する重要な障壁はエンドソームからのＤＮＡ放出
、核への侵入、カチオン性分子からのＤＮＡ放出、ならびにＤＮＡの転写である
かもしれない（Zabner et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 18997）。
最適なものではない（Caplen et al. (1995) Nat. Med. 1: 39）。カチオン性分
子は細胞表面に結合し、いくつかの場合には細胞によって取り込まれるように思
われるが、導入遺伝子発現に対する重要な障壁はエンドソームからのＤＮＡ放出
、核への侵入、カチオン性分子からのＤＮＡ放出、ならびにＤＮＡの転写である
かもしれない（Zabner et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 18997）。
【００１１】 ウイルス成分と非ウイルス成分とを混合した遺伝子導入系が報告されている（
Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11548; Wu et al.
(1994) J. Biol. Chem. 269: 11542; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 6099; Yoshimura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2300; Cu
riel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 8850; Kupfer et al. (19
94) Hum. Gene Ther. 5: 1437; および Gottschalk et al. (1994) Gene Ther. 1 : 185）。大部分の場合において、アデノウイルスが遺伝子デリバリー系中に組
み入れられてそのエンドソーム溶解特性が利用されている。一般的には、報告さ
れたウイルス成分および非ウイルス成分の組み合わせは、遺伝子デリバリー複合
体へのアデノウイルスの共有結合あるいは未結合アデノウイルスとカチオン性脂
質：ＤＮＡ複合体との同時インターナリゼーションのいずれかを用いるものであ
る。さらに、導入される遺伝子は、アデノウイルスに対して外来性であるプラス
ミドＤＮＡ中に含まれている。これらの処方においては大量のアデノウイルスが
必要であり、遺伝子導入があまり増加しない。
Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11548; Wu et al.
(1994) J. Biol. Chem. 269: 11542; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 6099; Yoshimura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2300; Cu
riel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 8850; Kupfer et al. (19
94) Hum. Gene Ther. 5: 1437; および Gottschalk et al. (1994) Gene Ther. 1 : 185）。大部分の場合において、アデノウイルスが遺伝子デリバリー系中に組
み入れられてそのエンドソーム溶解特性が利用されている。一般的には、報告さ
れたウイルス成分および非ウイルス成分の組み合わせは、遺伝子デリバリー複合
体へのアデノウイルスの共有結合あるいは未結合アデノウイルスとカチオン性脂
質：ＤＮＡ複合体との同時インターナリゼーションのいずれかを用いるものであ
る。さらに、導入される遺伝子は、アデノウイルスに対して外来性であるプラス
ミドＤＮＡ中に含まれている。これらの処方においては大量のアデノウイルスが
必要であり、遺伝子導入があまり増加しない。
【００１２】 したがって、導入遺伝子を標的細胞に効率的にデリバリーするための改良され
たベクター系が当該分野において必要である。本発明は、アデノウイルスベクタ
ー系の望ましい特徴を保持しつつアデノウイルスベクターに関連したある種の制
限を克服するものである。
たベクター系が当該分野において必要である。本発明は、アデノウイルスベクタ
ー系の望ましい特徴を保持しつつアデノウイルスベクターに関連したある種の制
限を克服するものである。
【００１３】発明の概要 本発明は、カチオン性分子および少なくとも１種のポリアルキレングリコール
ポリマーが結合したアデノウイルスのアデノウイルス複合体である。使用可能な
ポリアルカレングリコールポリマーの例は、ポリエチレングリコール、メトキシ
ポリエチレングリコール、ポリメチルエチレングリコール、ポリヒドロキシプロ
ピレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリメチルプロピレングリ
コールを包含し（これらに限らない）、そのうちポリエチレングリコールがより
好ましい。ポリエチレングリコールポリマーは２００ダルトンないし２００００
ダルトンの平均分子量を有し、２０００ダルトンないし１２０００ダルトンが好
ましく、約５０００ダルトンがさらに好ましい。
ポリマーが結合したアデノウイルスのアデノウイルス複合体である。使用可能な
ポリアルカレングリコールポリマーの例は、ポリエチレングリコール、メトキシ
ポリエチレングリコール、ポリメチルエチレングリコール、ポリヒドロキシプロ
ピレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリメチルプロピレングリ
コールを包含し（これらに限らない）、そのうちポリエチレングリコールがより
好ましい。ポリエチレングリコールポリマーは２００ダルトンないし２００００
ダルトンの平均分子量を有し、２０００ダルトンないし１２０００ダルトンが好
ましく、約５０００ダルトンがさらに好ましい。
【００１４】 本発明のもう１つの具体例において、ポリアルカレングリコールポリマーは活
性化ポリアルキレングリコールポリマーである。使用可能な活性化ポリアルキレ
ングリコールポリマーの例は、メトキシポリエチレングリコール−トレシレート
（ＴＭＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール−アセトアルデヒド、塩化シ
アヌルで活性化されたメトキシポリエチレングリコール、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール
−Ｎ−サクシンイミドカーボネートおよびそれらの混合物を包含するが、これら
に限らない。
性化ポリアルキレングリコールポリマーである。使用可能な活性化ポリアルキレ
ングリコールポリマーの例は、メトキシポリエチレングリコール−トレシレート
（ＴＭＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール−アセトアルデヒド、塩化シ
アヌルで活性化されたメトキシポリエチレングリコール、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール
−Ｎ−サクシンイミドカーボネートおよびそれらの混合物を包含するが、これら
に限らない。
【００１５】 好ましくは、複合体のアデノウイルス成分は組み換えアデノウイルスベクター
である。ＣＦＴＲをコードする核酸のごとき導入遺伝子を含むアデノウイルスベ
クターが特に好ましい。
である。ＣＦＴＲをコードする核酸のごとき導入遺伝子を含むアデノウイルスベ
クターが特に好ましい。
【００１６】 本発明によれば、ポリアルカレングリコールポリマーをウイルス粒子に直接共
有結合させ、介在カップリング部分によりウイルス粒子に間接的に共有結合させ
、ウイルス粒子に直接非共有結合させ、あるいはリガンドによりウイルス粒子に
間接的に非共有結合させる。間接的非共有結合用リガンドは、好ましくは、抗体
のような、ウイルス表面成分に対して特異性を有するリガンドである。使用すべ
き１の特に好ましい抗体は、非−中和抗−ヘキソン抗体のごとき非−中和抗−ア
デノウイルス抗体である。
有結合させ、介在カップリング部分によりウイルス粒子に間接的に共有結合させ
、ウイルス粒子に直接非共有結合させ、あるいはリガンドによりウイルス粒子に
間接的に非共有結合させる。間接的非共有結合用リガンドは、好ましくは、抗体
のような、ウイルス表面成分に対して特異性を有するリガンドである。使用すべ
き１の特に好ましい抗体は、非−中和抗−ヘキソン抗体のごとき非−中和抗−ア
デノウイルス抗体である。
【００１７】 本発明の複合体のカチオン性分子成分カチオン性ポリマーであり、ＤＥＡＥ−
デキストランが好ましい。あるいはまた、カチオン性分子はカチオン性脂質であ
る。
デキストランが好ましい。あるいはまた、カチオン性分子はカチオン性脂質であ
る。
【００１８】 もう１つの具体例において、本発明は、担体中の上記アデノウイルス複合体を
含む組成物を提供する。
含む組成物を提供する。
【００１９】発明の詳細な説明 本発明は、有利なことに、増大した感染性および低下した免疫原性を示す、カ
チオン性分子およびポリマー修飾アデノウイルスの複合体を提供する。驚くべき
ことに、本発明のカチオン性複合体は、未処理（すなわち未免疫）細胞において
感染性レベルを高める以外に、すでにアデノウイルスで免疫された細胞において
も感染性レベルを高めることが見出された。
チオン性分子およびポリマー修飾アデノウイルスの複合体を提供する。驚くべき
ことに、本発明のカチオン性複合体は、未処理（すなわち未免疫）細胞において
感染性レベルを高める以外に、すでにアデノウイルスで免疫された細胞において
も感染性レベルを高めることが見出された。
【００２０】 本発明によれば、アデノウイルスベクター粒子がウイルスへの共有結合または
非共有結合によりポリアルカレングリコールポリマーで修飾され、そのことによ
りウイルスベクターが実質的に非免疫原性となる。好ましくは、本発明に使用さ
れるポリアルカレングリコールポリマーは約２００ないし約２００００ダルトン
の平均分子量を有する。使用可能なグリコールポリマーの例は、ポリオキシメチ
レングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレング
リコール、およびそれらの誘導体、例えばポリメチル−エチレングリコール、ポ
リヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリメ
チルプロピレングリコールを包含するが、これらに限らない。
非共有結合によりポリアルカレングリコールポリマーで修飾され、そのことによ
りウイルスベクターが実質的に非免疫原性となる。好ましくは、本発明に使用さ
れるポリアルカレングリコールポリマーは約２００ないし約２００００ダルトン
の平均分子量を有する。使用可能なグリコールポリマーの例は、ポリオキシメチ
レングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレング
リコール、およびそれらの誘導体、例えばポリメチル−エチレングリコール、ポ
リヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリメ
チルプロピレングリコールを包含するが、これらに限らない。
【００２１】 本発明に使用される好ましいグリコールポリマーはＰＥＧである。ＰＥＧは式
Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは繰り返し単位数であり、平均分子量を
決定する］を有する水溶性ポリマーである。２００ないし２００００ダルトンの
平均分子量を有するＰＥＧは種々のソースから市販されている。本発明によれば
、平均分子量２００（ＰＥＧ２００）ないし平均分子量２００００（ＰＥＧ２０ ０００ ）のＰＥＧを用いてＰＥＧで修飾されたアデノウイルスを調製することが
できる。好ましい具体例において、ＰＥＧは約２０００ないし約１２０００の平
均分子量を有し、約４０００ないし約６０００（例えば５０００）の平均分子量
を有するものがより好ましい。
Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは繰り返し単位数であり、平均分子量を
決定する］を有する水溶性ポリマーである。２００ないし２００００ダルトンの
平均分子量を有するＰＥＧは種々のソースから市販されている。本発明によれば
、平均分子量２００（ＰＥＧ２００）ないし平均分子量２００００（ＰＥＧ２０ ０００ ）のＰＥＧを用いてＰＥＧで修飾されたアデノウイルスを調製することが
できる。好ましい具体例において、ＰＥＧは約２０００ないし約１２０００の平
均分子量を有し、約４０００ないし約６０００（例えば５０００）の平均分子量
を有するものがより好ましい。
【００２２】 本発明によれば、ウイルス粒子へのポリアルカレングリコールポリマーの直接
共有結合、間接共有結合、または間接非共有結合によりアデノウイルスがポリマ
ー修飾される。共有結合および非共有結合のための種々のスキームが存在する：
１）アデノウイルス表面への直接共有結合によりグリコールポリマーを結合させ
ることができ；２）間接共有結合（例えば、アデノウイルス表面にポリマーを結
合させる介在カップリング部分により）によりグリコールポリマーを結合させる
ことができ；あるいは３）例えば適当なペジル化（PEGylated）リガンドを用い
る間接非共有結合によりグリコールポリマーを結合させることができる。適当な
リガンドの例は、表面蛋白、脂質または糖類に対する抗体を包含するが、これに
限らない。
共有結合、間接共有結合、または間接非共有結合によりアデノウイルスがポリマ
ー修飾される。共有結合および非共有結合のための種々のスキームが存在する：
１）アデノウイルス表面への直接共有結合によりグリコールポリマーを結合させ
ることができ；２）間接共有結合（例えば、アデノウイルス表面にポリマーを結
合させる介在カップリング部分により）によりグリコールポリマーを結合させる
ことができ；あるいは３）例えば適当なペジル化（PEGylated）リガンドを用い
る間接非共有結合によりグリコールポリマーを結合させることができる。適当な
リガンドの例は、表面蛋白、脂質または糖類に対する抗体を包含するが、これに
限らない。
【００２３】 ポリマー修飾の標的は、ポリマーまたはカップリング剤が相互作用しうるウイ
ルス表面上の反応性基を包含し、例えば、第１級および第２級アミン基、チオー
ル基および芳香族ヒドロキシ基を包含する。当業者に明らかなように、アデノウ
イルスをポリマー修飾するための好ましい方法は、ウイルス表面に見出される利
用可能な標的部位に左右される。アデノウイルスへのグリコールポリマーの結合
に利用できる標的部位の例は、ヘキソン、ペントン細胞ベース、およびファイバ
ー蛋白を包含するが、これらに限らない。アデノウイルスヘキソン蛋白はアルカ
レングリコールポリマーの結合にとり特に好ましい部位である。理論により拘束
されることを望まないが、これらの部位の修飾は中和抗体からのエピトープをマ
スクして、アデノウイルスベクターの抗原性および／または免疫原性を低下させ
ると考えられる。
ルス表面上の反応性基を包含し、例えば、第１級および第２級アミン基、チオー
ル基および芳香族ヒドロキシ基を包含する。当業者に明らかなように、アデノウ
イルスをポリマー修飾するための好ましい方法は、ウイルス表面に見出される利
用可能な標的部位に左右される。アデノウイルスへのグリコールポリマーの結合
に利用できる標的部位の例は、ヘキソン、ペントン細胞ベース、およびファイバ
ー蛋白を包含するが、これらに限らない。アデノウイルスヘキソン蛋白はアルカ
レングリコールポリマーの結合にとり特に好ましい部位である。理論により拘束
されることを望まないが、これらの部位の修飾は中和抗体からのエピトープをマ
スクして、アデノウイルスベクターの抗原性および／または免疫原性を低下させ
ると考えられる。
【００２４】 当該分野で知られたポリペプチドにポリマーを直接または間接的に共有結合さ
せる方法を用いて本発明のポリマー修飾アデノウイルスを得てもよい。例えば、
ＷＯ９０／０４６０６および米国特許第４１７９３３７および５６１２４６０号
にその方法が記載されており、出典明示により本明細書に一体化させる。一般的
には、ポリマー末端部分を活性化部分に変換することにより、あるいは活性化カ
ップリング部分をポリマーに結合させることにより、グリコールポリマーが活性
化される。次いで、活性化部分を介して活性化ポリマーを標的にカップリングさ
せる。ウイルス表面上の所望部位に対するアフィニティーに基づいて活性化部分
または活性化カップリング部分を選択することができる。
せる方法を用いて本発明のポリマー修飾アデノウイルスを得てもよい。例えば、
ＷＯ９０／０４６０６および米国特許第４１７９３３７および５６１２４６０号
にその方法が記載されており、出典明示により本明細書に一体化させる。一般的
には、ポリマー末端部分を活性化部分に変換することにより、あるいは活性化カ
ップリング部分をポリマーに結合させることにより、グリコールポリマーが活性
化される。次いで、活性化部分を介して活性化ポリマーを標的にカップリングさ
せる。ウイルス表面上の所望部位に対するアフィニティーに基づいて活性化部分
または活性化カップリング部分を選択することができる。
【００２５】 例えば、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基を反応性官能基に変換することができ、
あるいは活性化カップリング部分に結合させて「活性化」ＰＥＧとして知られる
分子を得ることができる。種々の形態の活性化ＰＥＧが当該分野において知られ
ており、市販されている。アデノウイルスへの直接共有結合に関しては、適切な
活性化ＰＥＧは、ε−リジン基と反応すると考えられるＭＰＥＧ−トレシレート
（ＴＭＰＥＧ）、またはＭＰＥＧ−アセトアルデヒドである。間接共有結合に関
しては、他の形態の活性化ＰＥＧが当該分野において知られ、市販されており、
例えば塩化シアヌルで活性化されたメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ
）のごときＭＰＥＧ誘導体、アミン基と反応するＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、およびＰＥＧ−Ｎ−サクシンイミドカーボ
ネートを包含する。これらのおよび他の活性化ＰＥＧはＷＯ９５／０６０５８お
よび米国特許第４１７９３３７および５６１２４６０号に開示されており、出典
明示により本明細書に一体化させる。
あるいは活性化カップリング部分に結合させて「活性化」ＰＥＧとして知られる
分子を得ることができる。種々の形態の活性化ＰＥＧが当該分野において知られ
ており、市販されている。アデノウイルスへの直接共有結合に関しては、適切な
活性化ＰＥＧは、ε−リジン基と反応すると考えられるＭＰＥＧ−トレシレート
（ＴＭＰＥＧ）、またはＭＰＥＧ−アセトアルデヒドである。間接共有結合に関
しては、他の形態の活性化ＰＥＧが当該分野において知られ、市販されており、
例えば塩化シアヌルで活性化されたメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ
）のごときＭＰＥＧ誘導体、アミン基と反応するＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、およびＰＥＧ−Ｎ−サクシンイミドカーボ
ネートを包含する。これらのおよび他の活性化ＰＥＧはＷＯ９５／０６０５８お
よび米国特許第４１７９３３７および５６１２４６０号に開示されており、出典
明示により本明細書に一体化させる。
【００２６】 活性化ＰＥＧ（例えばＴＭＰＥＧ）とともにウイルスをインキュベーションす
ることによりアデノウイルス表面へのＰＥＧの共有結合（ペジル化（PEGylation
））を行う。単一回添加または複数回添加法を用いてもよい。抗原性を低下させ
、感染性を増加させるためのアデノウイルス粒子に対するＴＭＰＥＧの最適割合
を、下記の種々のアッセイを行うことによって確認してもよい。直接ＴＭＰＥＧ
修飾アデノウイルスを得るように設計された条件下において約５〜２０％ ｗ／
ｖの濃度でペジル化するのが好ましく、約１０％ ｗ／ｖの濃度が最も好ましい
。
ることによりアデノウイルス表面へのＰＥＧの共有結合（ペジル化（PEGylation
））を行う。単一回添加または複数回添加法を用いてもよい。抗原性を低下させ
、感染性を増加させるためのアデノウイルス粒子に対するＴＭＰＥＧの最適割合
を、下記の種々のアッセイを行うことによって確認してもよい。直接ＴＭＰＥＧ
修飾アデノウイルスを得るように設計された条件下において約５〜２０％ ｗ／
ｖの濃度でペジル化するのが好ましく、約１０％ ｗ／ｖの濃度が最も好ましい
。
【００２７】 好ましくは、高濃度（例えば１０％またはそれ以上）のグリコールポリマーを
ウイルスに結合させる場合には、活性化ポリマーをステップワイズ（stepwise）
様式で添加する。高濃度ではウイルス粒子が凝集する傾向があるので、ステップ
ワイズ添加が好ましいが、ステップワイズ添加によりペジル化の全体的な効率が
低下する。そのうえ、ある種の活性化ポリマー、例えばＴＭＰＥＧを用いること
により凝集がひどくなる。よって、ステップワイズ様式において最初に低いポリ
マー濃度を用いることにより粒子の凝集傾向を減少させることができる。例えば
、３０分ごとに別個の工程においてＴＭＰＥＧのごとき活性化ＰＥＧをウイルス
ストック溶液に添加して反応混合物中のポリマー濃度を３％、５％または８％（
ｗ／ｖ）ずつ増加させて、最終ポリマー濃度をそれぞれ１２％、２０％および３
２％としてもよい（概算のｗ／ｖ、すなわちポリマー体積に関して修正していな
い）。さらに、グリコールポリマーの最終添加後に、更なるインキュベーション
時間をとってもよい。最適結果を得るためのこれらの反応パラメーターの必要な
調整（例えば、工程数、ポリマー濃度、および反応時間）は当業者により容易に
行われる。
ウイルスに結合させる場合には、活性化ポリマーをステップワイズ（stepwise）
様式で添加する。高濃度ではウイルス粒子が凝集する傾向があるので、ステップ
ワイズ添加が好ましいが、ステップワイズ添加によりペジル化の全体的な効率が
低下する。そのうえ、ある種の活性化ポリマー、例えばＴＭＰＥＧを用いること
により凝集がひどくなる。よって、ステップワイズ様式において最初に低いポリ
マー濃度を用いることにより粒子の凝集傾向を減少させることができる。例えば
、３０分ごとに別個の工程においてＴＭＰＥＧのごとき活性化ＰＥＧをウイルス
ストック溶液に添加して反応混合物中のポリマー濃度を３％、５％または８％（
ｗ／ｖ）ずつ増加させて、最終ポリマー濃度をそれぞれ１２％、２０％および３
２％としてもよい（概算のｗ／ｖ、すなわちポリマー体積に関して修正していな
い）。さらに、グリコールポリマーの最終添加後に、更なるインキュベーション
時間をとってもよい。最適結果を得るためのこれらの反応パラメーターの必要な
調整（例えば、工程数、ポリマー濃度、および反応時間）は当業者により容易に
行われる。
【００２８】 透析によりあるいは過剰のリジン（例えば１０ないし１００倍過剰のリジン）
を添加することにより、結合反応を不活性化させてもよい。別法として、完結す
るまで反応を行ってもよい（すなわち、ペジル化反応系においてＴＭＰＥＧのご
とき活性化ＰＥＧが完全に消費される時点、あるいは活性化ＰＥＧが加水分解に
より不活性化される時点）。
を添加することにより、結合反応を不活性化させてもよい。別法として、完結す
るまで反応を行ってもよい（すなわち、ペジル化反応系においてＴＭＰＥＧのご
とき活性化ＰＥＧが完全に消費される時点、あるいは活性化ＰＥＧが加水分解に
より不活性化される時点）。
【００２９】 本発明のもう１つの具体例において、適当なリガンドを介してグリコールポリ
マーをアデノウイルスに間接的に非共有結合させる。好ましい具体例において、
リガンドは抗体または抗体フラグメントであり、例えば、非中和抗−ウイルス抗
体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ）を包含する
。本明細書の用語「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包
含する。特に好ましい具体例において、リガンドは非中和抗−ヘキソン抗体であ
る。かかる抗体は市販されており、例えば、Chemicon International, Temecula
, CA, USAから市販されているＭＡｂ８０５２およびＭＡｂ８０５を包含する。
マーをアデノウイルスに間接的に非共有結合させる。好ましい具体例において、
リガンドは抗体または抗体フラグメントであり、例えば、非中和抗−ウイルス抗
体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ）を包含する
。本明細書の用語「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包
含する。特に好ましい具体例において、リガンドは非中和抗−ヘキソン抗体であ
る。かかる抗体は市販されており、例えば、Chemicon International, Temecula
, CA, USAから市販されているＭＡｂ８０５２およびＭＡｂ８０５を包含する。
【００３０】 ポリマーの共有結合により修飾された適当なリガンドとともにウイルスをイン
キュベーションすることにより、アデノウイルスへのグリコールポリマーの間接
的非共有結合を行う。本明細書において上で説明した標準的方法によりグリコー
ルポリマーをリガンドに共有結合により付着（すなわち結合）させることができ
る。例えば、上記の活性化ＰＥＧ分子を用いて抗−ヘキソン抗体のごとき非中和
抗−ウイルス抗体をペジル化（PEGylated）してもよい。好ましい具体例におい
て、ＴＭＰＥＧを用いて抗−ヘキソン抗体を修飾する。当業者は、抗体を最適に
修飾するための抗体に対する活性化ＰＥＧの最適割合、活性化ＰＥＧおよび抗体
の濃度、インキュベーションのバッファーおよび時間および温度を確認できる。
次いで、ポリマー修飾リガンドをアデノウイルスとともにインキュベーションし
て、ウイルス表面にポリマー修飾リガンドを非共有結合させる。
キュベーションすることにより、アデノウイルスへのグリコールポリマーの間接
的非共有結合を行う。本明細書において上で説明した標準的方法によりグリコー
ルポリマーをリガンドに共有結合により付着（すなわち結合）させることができ
る。例えば、上記の活性化ＰＥＧ分子を用いて抗−ヘキソン抗体のごとき非中和
抗−ウイルス抗体をペジル化（PEGylated）してもよい。好ましい具体例におい
て、ＴＭＰＥＧを用いて抗−ヘキソン抗体を修飾する。当業者は、抗体を最適に
修飾するための抗体に対する活性化ＰＥＧの最適割合、活性化ＰＥＧおよび抗体
の濃度、インキュベーションのバッファーおよび時間および温度を確認できる。
次いで、ポリマー修飾リガンドをアデノウイルスとともにインキュベーションし
て、ウイルス表面にポリマー修飾リガンドを非共有結合させる。
【００３１】 エピトープ結合部位（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲｓ））においてＰＥＧ
で修飾された抗体はアデノウイルスに対して低下したアフィニティーを示し、そ
れゆえ、非共有結合の効率が低下する。エピトープ結合部位におけるペジル化を
避けるために、好ましくは、ＰＥＧ修飾前に抗体を固定化する。例えば、抗体を
ＰＥＧ修飾する前に抗−ヘキソン抗体を精製固定化ヘキソン（例えば、ヘキソン
−セファロースＲ）に結合させる。次いで、ペジル化抗体を固定化ヘキソンから
遊離させる。
で修飾された抗体はアデノウイルスに対して低下したアフィニティーを示し、そ
れゆえ、非共有結合の効率が低下する。エピトープ結合部位におけるペジル化を
避けるために、好ましくは、ＰＥＧ修飾前に抗体を固定化する。例えば、抗体を
ＰＥＧ修飾する前に抗−ヘキソン抗体を精製固定化ヘキソン（例えば、ヘキソン
−セファロースＲ）に結合させる。次いで、ペジル化抗体を固定化ヘキソンから
遊離させる。
【００３２】 別法として、固定化されていない抗−ヘキソン抗体をペジル化し、他の部位の
ほかにエピトープ結合部位においてペジル化した抗体の集団を得て、その後、免
疫アフィニティークロマトグラフィーにより分離してもよい。例えば、修飾抗体
の混合集団を固定化ヘキソンとともにインキュベーションすると、エピトープ結
合部位以外の部位のみにおいて修飾された抗体が固定化ヘキソンに結合するであ
ろう。次いで、これらのペジル化抗体を固定化ヘキソンから遊離させて本発明に
使用する。
ほかにエピトープ結合部位においてペジル化した抗体の集団を得て、その後、免
疫アフィニティークロマトグラフィーにより分離してもよい。例えば、修飾抗体
の混合集団を固定化ヘキソンとともにインキュベーションすると、エピトープ結
合部位以外の部位のみにおいて修飾された抗体が固定化ヘキソンに結合するであ
ろう。次いで、これらのペジル化抗体を固定化ヘキソンから遊離させて本発明に
使用する。
【００３３】 いくつかの適用例、例えば、ポリマー修飾ウイルスを繰り返し投与することを
要する適用例のためには、未反応グリコールポリマーをポリマー修飾アデノウイ
ルスから分離し、次いで、意図された使用に必要とされる標準的方法により精製
することが望ましいかもしれない。当該分野において知られた方法、例えば、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、または塩化セシウ
ム勾配精製により分離および精製を行ってもよい。抗体が間接的にペジル化され
る場合、ペジル化抗体を未反応ＰＥＧから分離するにはヘキソンアフィニティー
樹脂が有用であるかもしれない。
要する適用例のためには、未反応グリコールポリマーをポリマー修飾アデノウイ
ルスから分離し、次いで、意図された使用に必要とされる標準的方法により精製
することが望ましいかもしれない。当該分野において知られた方法、例えば、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、または塩化セシウ
ム勾配精製により分離および精製を行ってもよい。抗体が間接的にペジル化され
る場合、ペジル化抗体を未反応ＰＥＧから分離するにはヘキソンアフィニティー
樹脂が有用であるかもしれない。
【００３４】 さらに、ポリマー修飾アデノウイルスから未修飾アデノウイルスを分離するこ
とが望ましいかもしれない。水性二相ポリアルキレングリコール溶液中に分配さ
せることによりポリマー修飾ウイルスからの未修飾ウイルスの分離を行ってもよ
い。例えば、ＰＥＧおよびデキストランの水性二相系における相分配により未修
飾ウイルスからＰＥＧ修飾ウイルスが分離されうる。向流分配により分配を行っ
てもよい。一般的には、デキストランおよびＰＥＧの溶液を混合することにより
相系を分離させる。ＰＥＧおよびＰＥＧ修飾ウイルスを相系に含ませて、転倒ま
たは回転により混合し、次いで、放置して分離させる。ＰＥＧ修飾ウイルスはＰ
ＥＧ相中に分配され、未修飾ウイルス粒子はデキストラン相に分配される。
とが望ましいかもしれない。水性二相ポリアルキレングリコール溶液中に分配さ
せることによりポリマー修飾ウイルスからの未修飾ウイルスの分離を行ってもよ
い。例えば、ＰＥＧおよびデキストランの水性二相系における相分配により未修
飾ウイルスからＰＥＧ修飾ウイルスが分離されうる。向流分配により分配を行っ
てもよい。一般的には、デキストランおよびＰＥＧの溶液を混合することにより
相系を分離させる。ＰＥＧおよびＰＥＧ修飾ウイルスを相系に含ませて、転倒ま
たは回転により混合し、次いで、放置して分離させる。ＰＥＧ修飾ウイルスはＰ
ＥＧ相中に分配され、未修飾ウイルス粒子はデキストラン相に分配される。
【００３５】 イオン交換クロマトグラフィー、細管式電気泳動（ＣＥ）、光子相関スペクト
ル法（ＰＣＳ）を包含する当該分野において知られた方法により、そして定量的
ＥＬＩＳＡにおいて標識（例えば、ビオチン化）ＰＥＧを用いることにより、ア
デノウイルスのポリマー修飾の効率を評価する。標準的な方法によりイオン交換
クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−クロマトグラフィー）を行って、変化
した電荷に基づいて修飾ウイルスの評価を行うことができる。
ル法（ＰＣＳ）を包含する当該分野において知られた方法により、そして定量的
ＥＬＩＳＡにおいて標識（例えば、ビオチン化）ＰＥＧを用いることにより、ア
デノウイルスのポリマー修飾の効率を評価する。標準的な方法によりイオン交換
クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−クロマトグラフィー）を行って、変化
した電荷に基づいて修飾ウイルスの評価を行うことができる。
【００３６】 全ウイルスＣＥは、グリコールポリマーによるアデノウイルスの修飾を変化し
た表面電荷の関数としてモニターするための手段を提供する。例えば、アデノウ
イルス表面へのＰＥＧの共有結合はウイルス表面上の負電荷を覆い隠して、その
ことによりウイルスがより中性の移動度を示すように思われる。当業者に知られ
た方法によりＣＥを行ってもよい。例えば、真の高電圧分離を行う前に勾配のあ
る低電圧−高電圧での前処理を用いて、安定性のためにウイルスを処方すること
のできる非常に可動性のある塩イオンを泳動させる。ＣＥで得られたプロットに
おいて、ＰＥＧが共有結合したウイルス粒子は、ＰＥＧが共有結合していないウ
イルスよりも中性点付近の位置に泳動する。都合良くは、モル比、濃度およびイ
ンキュベーション時間を包含する、ウイルス粒子へのＰＥＧの共有結合に対する
種々の条件の影響を評価するためにＣＥを用いてもよい。中性度の増加はウイル
ス表面上のＰＥＧ鎖密度の増加を反映する。
た表面電荷の関数としてモニターするための手段を提供する。例えば、アデノウ
イルス表面へのＰＥＧの共有結合はウイルス表面上の負電荷を覆い隠して、その
ことによりウイルスがより中性の移動度を示すように思われる。当業者に知られ
た方法によりＣＥを行ってもよい。例えば、真の高電圧分離を行う前に勾配のあ
る低電圧−高電圧での前処理を用いて、安定性のためにウイルスを処方すること
のできる非常に可動性のある塩イオンを泳動させる。ＣＥで得られたプロットに
おいて、ＰＥＧが共有結合したウイルス粒子は、ＰＥＧが共有結合していないウ
イルスよりも中性点付近の位置に泳動する。都合良くは、モル比、濃度およびイ
ンキュベーション時間を包含する、ウイルス粒子へのＰＥＧの共有結合に対する
種々の条件の影響を評価するためにＣＥを用いてもよい。中性度の増加はウイル
ス表面上のＰＥＧ鎖密度の増加を反映する。
【００３７】 ＰＣＳは粒子サイズと懸濁液中での運動（ブラウン運動による）との間の関連
性を用いて粒子サイズを正確に測定するものである。この方法は、サイズの増加
を測定することにより、リポソーム、微小球およびナノ粒子を包含する粒子への
ポリマーの結合をモニターするために広く利用されている。これらのデータは、
比較的低密度で共有結合したＰＥＧが丸い「マッシュルーム」形態を形成し、か
くして、サイズの増加が比較的少ないことを示唆する。共有結合ＰＥＧ鎖の密度
が増加すると考えられる条件を変化させると、より拡張されたポリマーのコンホ
ーメーションまたは「ブラシ」形態を生じ、それは粒子サイズの比較的大幅な増
加により反映される。よって、当業者に知られた方法を用いてＰＣＳを使用して
、異なる反応条件下でのウイルス粒子のサイズ変化をモニターしてもよい。
性を用いて粒子サイズを正確に測定するものである。この方法は、サイズの増加
を測定することにより、リポソーム、微小球およびナノ粒子を包含する粒子への
ポリマーの結合をモニターするために広く利用されている。これらのデータは、
比較的低密度で共有結合したＰＥＧが丸い「マッシュルーム」形態を形成し、か
くして、サイズの増加が比較的少ないことを示唆する。共有結合ＰＥＧ鎖の密度
が増加すると考えられる条件を変化させると、より拡張されたポリマーのコンホ
ーメーションまたは「ブラシ」形態を生じ、それは粒子サイズの比較的大幅な増
加により反映される。よって、当業者に知られた方法を用いてＰＣＳを使用して
、異なる反応条件下でのウイルス粒子のサイズ変化をモニターしてもよい。
【００３８】 ビオチン化ＰＥＧのＥＬＩＳＡ分析は、アデノウイルス粒子に共有結合したＰ
ＥＧ分子数についての最も定量的な評価を提供しうる。当該分野で知られた標準
的方法によりＥＬＩＳＡを行うことができる。
ＥＧ分子数についての最も定量的な評価を提供しうる。当該分野で知られた標準
的方法によりＥＬＩＳＡを行うことができる。
【００３９】 競合酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、アデノウイルス由
来の標識リガンドの置換により、ポリマー修飾リガンドを介するグリコールポリ
マーの間接的非共有結合をモニターすることもできる。例えば、ペジル化抗−ヘ
キソン抗体のアデノウイルス表面への結合能を、ビオチン化抗−ヘキソン抗体を
用いる標準的な競合ＥＬＩＳＡにおいて測定する。
来の標識リガンドの置換により、ポリマー修飾リガンドを介するグリコールポリ
マーの間接的非共有結合をモニターすることもできる。例えば、ペジル化抗−ヘ
キソン抗体のアデノウイルス表面への結合能を、ビオチン化抗−ヘキソン抗体を
用いる標準的な競合ＥＬＩＳＡにおいて測定する。
【００４０】 本明細書の用語「アデノウイルス」は、遺伝子操作されたアデノウイルス（す
なわち、組み換えアデノウイルス）を包含する。好ましくは、本発明のアデノウ
イルスは、複製できないように、かつ、アデノウイルス遺伝子の最小限発現を示
すように処理された組み換えアデノウイルスである。適当な組み換えアデノウイ
ルスは、Ｅ１領域を欠失したアデノウイルス２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）お
よび６型（Ａｄ６）由来のアデノウイルスベクターを包含する。導入遺伝子のデ
リバリーに有用な典型的なアデノウイルスベクターはZabner et al., (1996) J.
Clin. Invest. 6: 1504、Zabner et al., (1993) Cell 75: 207、米国特許第５
７０７６１８および５６７０４８８号に開示されており、出典明示によりそれら
の開示を本明細書に一体化させる。
なわち、組み換えアデノウイルス）を包含する。好ましくは、本発明のアデノウ
イルスは、複製できないように、かつ、アデノウイルス遺伝子の最小限発現を示
すように処理された組み換えアデノウイルスである。適当な組み換えアデノウイ
ルスは、Ｅ１領域を欠失したアデノウイルス２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）お
よび６型（Ａｄ６）由来のアデノウイルスベクターを包含する。導入遺伝子のデ
リバリーに有用な典型的なアデノウイルスベクターはZabner et al., (1996) J.
Clin. Invest. 6: 1504、Zabner et al., (1993) Cell 75: 207、米国特許第５
７０７６１８および５６７０４８８号に開示されており、出典明示によりそれら
の開示を本明細書に一体化させる。
【００４１】 また好ましくは、組み換えアデノウイルスは適当なプロモーターおよび他の調
節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む。本明細書において「導入遺伝
子」とは、アデノウイルスに対して本来的でない核酸であると定義される。使用
される導入遺伝子の例は、生物学的に機能のある蛋白またはペプチド、アンチセ
ンス分子、またはマーカー分子をコードする核酸である。プロモーターは内在性
アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期
プロモーター（ＭＬＰ）であってもよく、あるいは異種真核プロモーター、例え
ばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたはサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。同様に、当業者は内在性または異
種性のポリＡ付加シグナルを用いてアデノウイルスベクターを構築することがで
きる。
節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む。本明細書において「導入遺伝
子」とは、アデノウイルスに対して本来的でない核酸であると定義される。使用
される導入遺伝子の例は、生物学的に機能のある蛋白またはペプチド、アンチセ
ンス分子、またはマーカー分子をコードする核酸である。プロモーターは内在性
アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期
プロモーター（ＭＬＰ）であってもよく、あるいは異種真核プロモーター、例え
ばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたはサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。同様に、当業者は内在性または異
種性のポリＡ付加シグナルを用いてアデノウイルスベクターを構築することがで
きる。
【００４２】 好ましい具体例において、組み換えアデノウイルスベクターは、のう胞性線維
症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）をコードする核酸のごとき
導入遺伝子を含む。ＣＦＴＲは肺、腸、膵臓および汗腺中の上皮細胞の先端膜に
存在する、リン酸化およびヌクレオシド三リン酸により調節されるＣｌ−チャン
ネルである。調査するには、例えばWelsh et al., (1992) Neuron 8: 821を参照
すること（出典明示により本明細書に一体化させる）。のう胞性線維症（ＣＦ）
は、ＣＦＴＲをコードする遺伝子中の変異により生じる個体上皮細胞中の機能的
でないＣｌ−チャンネルによって起こる。かかる変異はクロライドチャンネルの
機能喪失を引き起こし、かくして、罹病上皮細胞において電解質輸送を欠損させ
る。野生型ＣＦＴＲをコードするＤＮＡが当該分野において知られており、例え
ば米国特許第５６７０４８８号（出典明示により本明細書に一体化させる）にそ
の配列が開示されている。調節されたＣｌ−チャンネルをコードするＣＦＴＲの
欠失変異体がSheppard et al. (1994) Cell 76: 1091ならびに米国特許第５６７
０４８８および５６３９６６１号に開示されている（これらの開示を出典明示に
より本明細書に一体化させる）。ＣＦＴＲをコードする導入遺伝子を含む組み換
えアデノウイルスベクターの他の例はＡｄ２／ＣＦＴＲ−２、Ａｄ２／ＣＦＴＲ
−８、およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−１６であり、それぞれZabner et al. (1996) J
. Clin. Invest. 97(6): 1504-1511、米国特許第５７０７６１８号および１９９
７年４月１４日出願の米国出願第０８／８３９５５２号において見出される（出
典明示によりすべて本明細書に一体化させる）。
症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）をコードする核酸のごとき
導入遺伝子を含む。ＣＦＴＲは肺、腸、膵臓および汗腺中の上皮細胞の先端膜に
存在する、リン酸化およびヌクレオシド三リン酸により調節されるＣｌ−チャン
ネルである。調査するには、例えばWelsh et al., (1992) Neuron 8: 821を参照
すること（出典明示により本明細書に一体化させる）。のう胞性線維症（ＣＦ）
は、ＣＦＴＲをコードする遺伝子中の変異により生じる個体上皮細胞中の機能的
でないＣｌ−チャンネルによって起こる。かかる変異はクロライドチャンネルの
機能喪失を引き起こし、かくして、罹病上皮細胞において電解質輸送を欠損させ
る。野生型ＣＦＴＲをコードするＤＮＡが当該分野において知られており、例え
ば米国特許第５６７０４８８号（出典明示により本明細書に一体化させる）にそ
の配列が開示されている。調節されたＣｌ−チャンネルをコードするＣＦＴＲの
欠失変異体がSheppard et al. (1994) Cell 76: 1091ならびに米国特許第５６７
０４８８および５６３９６６１号に開示されている（これらの開示を出典明示に
より本明細書に一体化させる）。ＣＦＴＲをコードする導入遺伝子を含む組み換
えアデノウイルスベクターの他の例はＡｄ２／ＣＦＴＲ−２、Ａｄ２／ＣＦＴＲ
−８、およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−１６であり、それぞれZabner et al. (1996) J
. Clin. Invest. 97(6): 1504-1511、米国特許第５７０７６１８号および１９９
７年４月１４日出願の米国出願第０８／８３９５５２号において見出される（出
典明示によりすべて本明細書に一体化させる）。
【００４３】 本発明によれば、ＣＦＴＲ蛋白をコードするＤＮＡは上記公表配列ならびに当
業者に知られたＣＦＴＲをコードする他のＤＮＡを包含する。知られたＤＮＡ分
子の修飾物、例えば、機能的なＣＦＴＲ蛋白をコードする、すなわちクロライド
チャンネルをコードする変異体、置換体、欠失体、挿入体および相同体も包含さ
れる。
業者に知られたＣＦＴＲをコードする他のＤＮＡを包含する。知られたＤＮＡ分
子の修飾物、例えば、機能的なＣＦＴＲ蛋白をコードする、すなわちクロライド
チャンネルをコードする変異体、置換体、欠失体、挿入体および相同体も包含さ
れる。
【００４４】 本発明のもう１つの具体例において、ポリマー修飾組み換えアデノウイルスは
、ウイルス性腫瘍崩壊としても知られる腫瘍特異的細胞溶解を引き起こすことの
できるアデノウイルスである。ウイルス性腫瘍崩壊に有用な典型的なアデノウイ
ルスはBischoff et al. (1996) Science 274: 373; Heise et al. (1997) Natur
e Medicine 3: 630;およびEP689447Aに開示されている（出典明示により本明細
書に一体化させる）。
、ウイルス性腫瘍崩壊としても知られる腫瘍特異的細胞溶解を引き起こすことの
できるアデノウイルスである。ウイルス性腫瘍崩壊に有用な典型的なアデノウイ
ルスはBischoff et al. (1996) Science 274: 373; Heise et al. (1997) Natur
e Medicine 3: 630;およびEP689447Aに開示されている（出典明示により本明細
書に一体化させる）。
【００４５】 本発明によれば、ポリマー修飾アデノウイルスがカチオン性分子と複合体化さ
れる。カチオン性分子は哺乳動物に対して最小の毒性を示し、ポリマー修飾ウイ
ルスの感染性を低下させないカチオン性化合物であればよい。好ましくは、カチ
オン性分子は、対応未修飾アデノウイルスにより示される感染性レベルに匹敵（
それ以上でないとしても）する感染性をポリマー修飾ウイルスに与える。使用さ
れうるカチオン性分子の例はカチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性
糖類、カチオン性蛋白、またはカチオン性デンドリマーを包含するが、これらに
限らない。カチオン性分子を非カチオン性分子と組み合わせることもできる。カ
チオン性ポリマーの例はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン、およびヒストン（フラクションＶ−Ｓ）、プロタミン、ポリブレン（臭化ヘ
キサジメトリン）ならびにカチオン性デンドリマー（これらに限らない）を包含
するが、ＤＥＡＥ−デキストランが好ましい。あるいはまた、１９９８年５月２
１日出願で継続中の米国出願第０９／０８２５１０号（出典明示により本明細書
に一体化させる）に示されたように、ポリマー修飾アデノウイルスをリン酸カル
シウムのごとき金属塩沈殿中に分散させることもできる。当業者は、本明細書に
記載した方法による最適な遺伝子導入を可能にするカチオン性ポリマーの分子量
を決定することができる。好ましくは、平均分子量２５ｋＤａのＰＥＩを用いる
。
れる。カチオン性分子は哺乳動物に対して最小の毒性を示し、ポリマー修飾ウイ
ルスの感染性を低下させないカチオン性化合物であればよい。好ましくは、カチ
オン性分子は、対応未修飾アデノウイルスにより示される感染性レベルに匹敵（
それ以上でないとしても）する感染性をポリマー修飾ウイルスに与える。使用さ
れうるカチオン性分子の例はカチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性
糖類、カチオン性蛋白、またはカチオン性デンドリマーを包含するが、これらに
限らない。カチオン性分子を非カチオン性分子と組み合わせることもできる。カ
チオン性ポリマーの例はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン、およびヒストン（フラクションＶ−Ｓ）、プロタミン、ポリブレン（臭化ヘ
キサジメトリン）ならびにカチオン性デンドリマー（これらに限らない）を包含
するが、ＤＥＡＥ−デキストランが好ましい。あるいはまた、１９９８年５月２
１日出願で継続中の米国出願第０９／０８２５１０号（出典明示により本明細書
に一体化させる）に示されたように、ポリマー修飾アデノウイルスをリン酸カル
シウムのごとき金属塩沈殿中に分散させることもできる。当業者は、本明細書に
記載した方法による最適な遺伝子導入を可能にするカチオン性ポリマーの分子量
を決定することができる。好ましくは、平均分子量２５ｋＤａのＰＥＩを用いる
。
【００４６】 カチオン性脂質は当業者に知られている。典型的なカチオン性脂質は米国特許
第５２８３１８５号、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１７４（ＷＯ９６／１８３７２）
および米国特許第５６５００９６号に開示されたものを包含する（出典明示によ
りこれらの開示を本明細書に一体化させる）。好ましい具体例において、カチオ
ン性脂質は米国特許第５２８３１６５号に開示された（Ｎ−［Ｎ１，Ｎ１−ジメ
チルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）である。
もう１つの好ましい具体例において、カチオン性脂質はＷＯ９６／１８３７２お
よび米国特許第５６５０，０９６号に開示されたＮ４−スペルミンコレステロー
ルカルバメート（ＧＬ−６７）またはＮ４−スペルミジンコレステロールカルバ
メート（ＧＬ−５３）である。他の典型的なカチオン性脂質は（２，３−ジオレ
イルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Promeg
a, Madison, WIからTRANSFECTAMRとして市販されているジオクタデシルアミドグ
リシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カル
ボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；Ｎ−［１−（２，３−
ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチ
ルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−２（２，３−ジオレイルオキシ）プ
ロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；（±
）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（デトラ
デシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；（±）−Ｎ−
（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ
）−１−プロパンアミニウムブロミド（βＡＥ−ＤＭＲＩＥ）；ジメチルジオク
タデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Life Technologies, Gaithersbur
g, MDから市販されているＤＯＴＭＡおよびジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）混合物であるLIPOFECTINR；Life Te
chnologies, Gaithersburg, MDから市販されているＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥの
３：１（ｗ／ｗ）処方であるLIPOFECTAMINER; Life Technologies, Gaithersbur
g, MDから市販されているDDABおよびＤＯＰＥの１：２．５（ｗ／ｗ）処方であ
るLIPOFECTACETM；Promega, Madison, WIか市販されているＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオ
イルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨーダイドおよびＤＯＰＥからなる
ＴｆｘＴＭ−５０；ならびにLife Technologies, Gaithersburg, MDから市販さ
れているＤＭＲＩＥおよびコレステロールの１：１（モル比）処方であるＤＭＲ
ＩＥ−ＣＴＭを包含する。好ましい具体例において、カチオン性脂質をＤＯＰＥ
またはコレステロールのごとき共存脂質と混合してもよい。
第５２８３１８５号、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１７４（ＷＯ９６／１８３７２）
および米国特許第５６５００９６号に開示されたものを包含する（出典明示によ
りこれらの開示を本明細書に一体化させる）。好ましい具体例において、カチオ
ン性脂質は米国特許第５２８３１６５号に開示された（Ｎ−［Ｎ１，Ｎ１−ジメ
チルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）である。
もう１つの好ましい具体例において、カチオン性脂質はＷＯ９６／１８３７２お
よび米国特許第５６５０，０９６号に開示されたＮ４−スペルミンコレステロー
ルカルバメート（ＧＬ−６７）またはＮ４−スペルミジンコレステロールカルバ
メート（ＧＬ−５３）である。他の典型的なカチオン性脂質は（２，３−ジオレ
イルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Promeg
a, Madison, WIからTRANSFECTAMRとして市販されているジオクタデシルアミドグ
リシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カル
ボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；Ｎ−［１−（２，３−
ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチ
ルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−２（２，３−ジオレイルオキシ）プ
ロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；（±
）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（デトラ
デシルオキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；（±）−Ｎ−
（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ
）−１−プロパンアミニウムブロミド（βＡＥ−ＤＭＲＩＥ）；ジメチルジオク
タデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Life Technologies, Gaithersbur
g, MDから市販されているＤＯＴＭＡおよびジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）混合物であるLIPOFECTINR；Life Te
chnologies, Gaithersburg, MDから市販されているＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥの
３：１（ｗ／ｗ）処方であるLIPOFECTAMINER; Life Technologies, Gaithersbur
g, MDから市販されているDDABおよびＤＯＰＥの１：２．５（ｗ／ｗ）処方であ
るLIPOFECTACETM；Promega, Madison, WIか市販されているＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオ
イルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨーダイドおよびＤＯＰＥからなる
ＴｆｘＴＭ−５０；ならびにLife Technologies, Gaithersburg, MDから市販さ
れているＤＭＲＩＥおよびコレステロールの１：１（モル比）処方であるＤＭＲ
ＩＥ−ＣＴＭを包含する。好ましい具体例において、カチオン性脂質をＤＯＰＥ
またはコレステロールのごとき共存脂質と混合してもよい。
【００４７】 複合体形成に使用されるポリマー修飾アデノウイルスに対するカチオン性分子
の割合は様々である。当業者に明らかなように、カチオン性分子：ウイルスの割
合に影響しうる因子は、選択されたカチオン性分子、選択されたポリアルキレン
グリコールポリマー、および感染標的とされる細胞タイプを包含する。しかしな
がら、当業者は最適なカチオン性分子：ウイルスの割合を、本明細書記載の感染
性アッセイを用いて容易に決定できる。本発明の複合体のいくつかの典型的なカ
チオン性分子：ウイルスの割合を以下に示す。ＤＥＡＥ−デキストランをポリマ
ー修飾アデノウイルスと複合体化させる場合、ウイルス粒子１個あたりのＤＥＡ
Ｅ−デキストランは１００〜３０００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あた
り４００〜６００分子が好ましい。ＰＥＩを複合体化させる場合、ウイルス粒子
１個あたり２００〜１２００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり４００
〜６００分子が好ましい。プロタミンを複合体化させる場合、ウイルス粒子１個
あたり４００〜４００００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり３０００
〜５０００分子が好ましい。ポリブレンを複合体化させる場合、ウイルス粒子１
個あたり４ｘ１０３〜４ｘ１０５分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり３
．５ｘ１０５〜４．５ｘ１０５分子が好ましい。カチオン性脂質ＧＬ−６７を複
合体化させる場合、ウイルス粒子１個あたり９ｘ１０５〜９ｘ１０６分子の割合
であり、ウイルス粒子１個あたり８．５ｘ１０６〜９．５ｘ１０６分子が好まし
い。あるいはまた、リン酸根（ＰＯ４ −）に対してモル比で過剰のカルシウム（
Ｃａ２＋）を混合することにより（Ｃａ２＋：リン酸根は６：１ないし４２：１
であり、１３：１ないし１５：１が好ましい）、ポリマー修飾ウイルスの存在下
でリン酸カルシウムを共沈させることもできる。
の割合は様々である。当業者に明らかなように、カチオン性分子：ウイルスの割
合に影響しうる因子は、選択されたカチオン性分子、選択されたポリアルキレン
グリコールポリマー、および感染標的とされる細胞タイプを包含する。しかしな
がら、当業者は最適なカチオン性分子：ウイルスの割合を、本明細書記載の感染
性アッセイを用いて容易に決定できる。本発明の複合体のいくつかの典型的なカ
チオン性分子：ウイルスの割合を以下に示す。ＤＥＡＥ−デキストランをポリマ
ー修飾アデノウイルスと複合体化させる場合、ウイルス粒子１個あたりのＤＥＡ
Ｅ−デキストランは１００〜３０００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あた
り４００〜６００分子が好ましい。ＰＥＩを複合体化させる場合、ウイルス粒子
１個あたり２００〜１２００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり４００
〜６００分子が好ましい。プロタミンを複合体化させる場合、ウイルス粒子１個
あたり４００〜４００００分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり３０００
〜５０００分子が好ましい。ポリブレンを複合体化させる場合、ウイルス粒子１
個あたり４ｘ１０３〜４ｘ１０５分子の割合であり、ウイルス粒子１個あたり３
．５ｘ１０５〜４．５ｘ１０５分子が好ましい。カチオン性脂質ＧＬ−６７を複
合体化させる場合、ウイルス粒子１個あたり９ｘ１０５〜９ｘ１０６分子の割合
であり、ウイルス粒子１個あたり８．５ｘ１０６〜９．５ｘ１０６分子が好まし
い。あるいはまた、リン酸根（ＰＯ４ −）に対してモル比で過剰のカルシウム（
Ｃａ２＋）を混合することにより（Ｃａ２＋：リン酸根は６：１ないし４２：１
であり、１３：１ないし１５：１が好ましい）、ポリマー修飾ウイルスの存在下
でリン酸カルシウムを共沈させることもできる。
【００４８】 適当な条件下で成分を混合することにより本発明の複合体を簡単に製造するこ
とができる。例えば、ｐＨ７のリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を用いてウ
イルス粒子およびカチオン性分子の懸濁液を調製する。２つの懸濁液を混合する
前に、懸濁液を３０℃まで暖めて複合体形成を容易ならしめる。２つの懸濁液を
混合し、適当には１５分間３０℃でインキュベーションして十分な複合体を形成
させる。しかしながら、所望ならば、さらにインキュベーション時間を延長して
室温で複合体形成を行ってもよい。次いで、複合体化したポリマー修飾アデノウ
イルスをＰＢＳに再懸濁し、宿主への投与準備をする。
とができる。例えば、ｐＨ７のリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を用いてウ
イルス粒子およびカチオン性分子の懸濁液を調製する。２つの懸濁液を混合する
前に、懸濁液を３０℃まで暖めて複合体形成を容易ならしめる。２つの懸濁液を
混合し、適当には１５分間３０℃でインキュベーションして十分な複合体を形成
させる。しかしながら、所望ならば、さらにインキュベーション時間を延長して
室温で複合体形成を行ってもよい。次いで、複合体化したポリマー修飾アデノウ
イルスをＰＢＳに再懸濁し、宿主への投与準備をする。
【００４９】 すでに述べたように、ポリマー修飾（例えばペジル化）アデノウイルスのカチ
オン性複合体は免疫個体および未処理（未免疫）個体の両方において上昇した感
染性レベルを示す。しかしながら、１５％をこえるウイルスのペジル化はウイル
ス感染性の低下または喪失を引き起こし、そのことによりさらなるペジル化を抑
止する。結合用に選択したグリコールポリマー（例えば、ＴＭＰＥＧ対ＭＰＥＧ
）にもよるが、通常には、１０％またはそれ未満のペジル化レベルにおいてはウ
イルス感染性の低下が起こらない。したがって、本発明のカチオン性複合体は、
未修飾（すなわち、ポリマーで修飾されていない）アデノウイルスに匹敵するウ
イルス感染性を維持しつつ、使用ポリマー修飾レベルを有意に増大させることに
より（例えば、２０％またはそれ以上に）この問題を解決する。実際には、後で
実施例に示すように、本発明の複合体は未修飾アデノウイルスおよびポリマー修
飾アデノウイルスよりも有意に高い感染性レベルを提供する。
オン性複合体は免疫個体および未処理（未免疫）個体の両方において上昇した感
染性レベルを示す。しかしながら、１５％をこえるウイルスのペジル化はウイル
ス感染性の低下または喪失を引き起こし、そのことによりさらなるペジル化を抑
止する。結合用に選択したグリコールポリマー（例えば、ＴＭＰＥＧ対ＭＰＥＧ
）にもよるが、通常には、１０％またはそれ未満のペジル化レベルにおいてはウ
イルス感染性の低下が起こらない。したがって、本発明のカチオン性複合体は、
未修飾（すなわち、ポリマーで修飾されていない）アデノウイルスに匹敵するウ
イルス感染性を維持しつつ、使用ポリマー修飾レベルを有意に増大させることに
より（例えば、２０％またはそれ以上に）この問題を解決する。実際には、後で
実施例に示すように、本発明の複合体は未修飾アデノウイルスおよびポリマー修
飾アデノウイルスよりも有意に高い感染性レベルを提供する。
【００５０】 本発明のアデノウイルス複合体の感染性を標準的な感染アッセイにより評価す
る。例えば、アデノウイルス中に含まれる導入遺伝子（例えば、ｌａｃＺのごと
きリポーター遺伝子）の発現をモニタリングすることによりアデノウイルスの細
胞感染能を評価する。遺伝学的リポーター系は当該分野においてよく知られてお
り、例えば、Short Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausbel et al., e
ds., 3rd edition, Wiley and Sons, Inc.に開示されている。標準的方法により
アデノウイルスベクターを処理して導入遺伝子を含むようにし、複合体化したア
デノウイルスベクターを用いてウイルスに対して許容的な細胞に感染させる。標
準的条件下で感染させた後、導入遺伝子産物、例えばβ−ガラクトシダーゼの存
在に関して細胞溶解物を分析する。例えば、導入遺伝子産物を比色法、化学発光
または蛍光アッセイまたはイムノアッセイにより評価することができる。このよ
うにして、当業者は複合体化したアデノウイルスベクターと複合体化していない
アデノウイルスベクターを比較することができ、感染性を最適に保持するための
グリコール付加およびカチオン性物質との複合体化の最適パーセンテージおよび
条件を決定することができる。
る。例えば、アデノウイルス中に含まれる導入遺伝子（例えば、ｌａｃＺのごと
きリポーター遺伝子）の発現をモニタリングすることによりアデノウイルスの細
胞感染能を評価する。遺伝学的リポーター系は当該分野においてよく知られてお
り、例えば、Short Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausbel et al., e
ds., 3rd edition, Wiley and Sons, Inc.に開示されている。標準的方法により
アデノウイルスベクターを処理して導入遺伝子を含むようにし、複合体化したア
デノウイルスベクターを用いてウイルスに対して許容的な細胞に感染させる。標
準的条件下で感染させた後、導入遺伝子産物、例えばβ−ガラクトシダーゼの存
在に関して細胞溶解物を分析する。例えば、導入遺伝子産物を比色法、化学発光
または蛍光アッセイまたはイムノアッセイにより評価することができる。このよ
うにして、当業者は複合体化したアデノウイルスベクターと複合体化していない
アデノウイルスベクターを比較することができ、感染性を最適に保持するための
グリコール付加およびカチオン性物質との複合体化の最適パーセンテージおよび
条件を決定することができる。
【００５１】 別法として、導入遺伝子がＣＦＴＲをコードしている場合には、Rich et al.
(1990) Nature 347: 358（出典明示により本明細書に一体化させる）により記載
された方法に従って、培養気道上皮において発現されたＣＦＴＲ蛋白のＣｌ−チ
ャンネル欠損修正能力を確認することにより感染性を測定するすることができる
。簡単に説明すると、培養ＣＦ気道上皮細胞を、ＣＦＴＲ蛋白をコードするＤＮ
Ａを含むアデノウイルスベクターに感染させる。ＳＰＱ［６−メトキシ−Ｎ−（
３−スルホプロピル）−キノリニウム，Molecular Probes, Eugene, OR］ハロゲ
ン化物流出アッセイを用いて、ウイルスにより媒介される機能的ＣＦＴＲ蛋白の
発現を評価する。ＳＰＱはハロゲン化物感受性蛍光発色物質であり、その蛍光は
ハロゲン化物により消光される。このアッセイにおいて、細胞がＳＰＱとともに
負荷され、ＣＦＴＲがｃＡＭＰアゴニストにより活性化され、ＣＦＴＲ Ｃｌ−
チャンネルが開き、ハロゲン化物が細胞から出て、細胞中のＳＰＱ蛍光が速やか
に増大する。かくして、ｃＡＭＰに応答した細胞内蛍光の増大により機能的Ｃｌ − チャンネルが測定できる。
(1990) Nature 347: 358（出典明示により本明細書に一体化させる）により記載
された方法に従って、培養気道上皮において発現されたＣＦＴＲ蛋白のＣｌ−チ
ャンネル欠損修正能力を確認することにより感染性を測定するすることができる
。簡単に説明すると、培養ＣＦ気道上皮細胞を、ＣＦＴＲ蛋白をコードするＤＮ
Ａを含むアデノウイルスベクターに感染させる。ＳＰＱ［６−メトキシ−Ｎ−（
３−スルホプロピル）−キノリニウム，Molecular Probes, Eugene, OR］ハロゲ
ン化物流出アッセイを用いて、ウイルスにより媒介される機能的ＣＦＴＲ蛋白の
発現を評価する。ＳＰＱはハロゲン化物感受性蛍光発色物質であり、その蛍光は
ハロゲン化物により消光される。このアッセイにおいて、細胞がＳＰＱとともに
負荷され、ＣＦＴＲがｃＡＭＰアゴニストにより活性化され、ＣＦＴＲ Ｃｌ−
チャンネルが開き、ハロゲン化物が細胞から出て、細胞中のＳＰＱ蛍光が速やか
に増大する。かくして、ｃＡＭＰに応答した細胞内蛍光の増大により機能的Ｃｌ − チャンネルが測定できる。
【００５２】 ウイルス感染性の測定に適したもう１つのアッセイにおいて、ＣＦＴＲ蛋白を
コードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターでＣＦ上皮細胞を感染させ
、ｃＡＭＰ刺激に応答した感染細胞からのＣｌ−分泌を測定する。例えばRich e
t al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461（出典明示により本明細書に一体化さ
せる）により記載されたように、ｃＡＭＰアゴニスト添加に伴う経上皮短絡電流
の増加としてＣｌ−の分泌を測定することができる。パッチクランプ法によって
も機能的ＣＦＴＲ蛋白の発現を評価することができ、パッチクランプ法は、ｃＡ
ＭＰアゴニストの添加に応答して可逆的に活性化された全細胞電流を検出、ある
いはｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼおよびＡＴＰに応答した、膜の切除された無細
胞パッチクランプ中の単一チャンネル電流を検出するものである。パッチクラン
プ法は例えばSheppard et al. (1994) Cell 76: 1091および米国特許第５６３９
６６１号に記載されており、それらの開示を出典明示により本明細書に一体化さ
せる。
コードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターでＣＦ上皮細胞を感染させ
、ｃＡＭＰ刺激に応答した感染細胞からのＣｌ−分泌を測定する。例えばRich e
t al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461（出典明示により本明細書に一体化さ
せる）により記載されたように、ｃＡＭＰアゴニスト添加に伴う経上皮短絡電流
の増加としてＣｌ−の分泌を測定することができる。パッチクランプ法によって
も機能的ＣＦＴＲ蛋白の発現を評価することができ、パッチクランプ法は、ｃＡ
ＭＰアゴニストの添加に応答して可逆的に活性化された全細胞電流を検出、ある
いはｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼおよびＡＴＰに応答した、膜の切除された無細
胞パッチクランプ中の単一チャンネル電流を検出するものである。パッチクラン
プ法は例えばSheppard et al. (1994) Cell 76: 1091および米国特許第５６３９
６６１号に記載されており、それらの開示を出典明示により本明細書に一体化さ
せる。
【００５３】 本明細書において、感染性の保持とは、治療的価値を有するに十分な感染レベ
ルとして定義され、例えば、未修飾ウイルス（複合体化されていない、ポリマー
修飾されていないアデノウイルス）と比較して少なくとも約２０％の感染性であ
る。いくつかの具体例に関して、ウイルス複合体は少なくとも６０％の感染性を
維持している。他の治療具体例において、複合体化修飾ウイルスは少なくとも８
０％の感染性を維持しているのが好ましい。少なくとも５％という低いパーセン
トの感染性はウイルス性腫瘍崩壊のごとき用途がありうる。
ルとして定義され、例えば、未修飾ウイルス（複合体化されていない、ポリマー
修飾されていないアデノウイルス）と比較して少なくとも約２０％の感染性であ
る。いくつかの具体例に関して、ウイルス複合体は少なくとも６０％の感染性を
維持している。他の治療具体例において、複合体化修飾ウイルスは少なくとも８
０％の感染性を維持しているのが好ましい。少なくとも５％という低いパーセン
トの感染性はウイルス性腫瘍崩壊のごとき用途がありうる。
【００５４】 感染性アッセイの特別な実施例において、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ
）リポーター遺伝子（ｌａｃＺ）を含むアデノウイルスベクターを、種々の濃度
のＴＭＰＥＧに接触させることにより共有結合修飾し、次いで、ポリ−Ｌ−リジ
ン以外のカチオン性分子（例えばＤＥＡＥ−デキストラン）と複合体形成させる
。アデノウイルスベクター増殖を支持する細胞系、例えば２９３ヒト胚性腎細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＣ １５７３）を、β−ｇａｌ遺伝子を含む未修飾および修飾／
複合体化アデノウイルスベクターに曝露する。次いで、β−ｇａｌ発現に適した
条件下で細胞をインキュベーションする。標準的な比色法、蛍光または化学発光
アッセイにより、例えばＸ−ｇａｌを用いることにより細胞溶解物中のβ−ｇａ
ｌの存在を測定する。２９３細胞中溶解物のβ−ｇａｌ量は、複合体化され、ペ
ジル化されたアデノウイルスの２９３細胞への感染能の測定値を提供する。未修
飾ウイルスと比較して５０％の感染性を維持している複合体化され、ペジル化さ
れたウイルスは感染性を保持していると考えられる。
）リポーター遺伝子（ｌａｃＺ）を含むアデノウイルスベクターを、種々の濃度
のＴＭＰＥＧに接触させることにより共有結合修飾し、次いで、ポリ−Ｌ−リジ
ン以外のカチオン性分子（例えばＤＥＡＥ−デキストラン）と複合体形成させる
。アデノウイルスベクター増殖を支持する細胞系、例えば２９３ヒト胚性腎細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＣ １５７３）を、β−ｇａｌ遺伝子を含む未修飾および修飾／
複合体化アデノウイルスベクターに曝露する。次いで、β−ｇａｌ発現に適した
条件下で細胞をインキュベーションする。標準的な比色法、蛍光または化学発光
アッセイにより、例えばＸ−ｇａｌを用いることにより細胞溶解物中のβ−ｇａ
ｌの存在を測定する。２９３細胞中溶解物のβ−ｇａｌ量は、複合体化され、ペ
ジル化されたアデノウイルスの２９３細胞への感染能の測定値を提供する。未修
飾ウイルスと比較して５０％の感染性を維持している複合体化され、ペジル化さ
れたウイルスは感染性を保持していると考えられる。
【００５５】 本発明の複合体化され、ポリマー修飾されたアデノウイルスは未修飾ウイルス
よりも低下した抗原性を示す。低下した抗原性は、ウイルスに対する中和抗体へ
のポリマー修飾ウイルスの結合の有意な減少（ｐ＞０．０５）として定義される
。インビトロおよびインビボアッセイを包含する当該分野において知られた方法
により、低下した抗原性が評価される。例えば、リポーター遺伝子を含む修飾お
よび未修飾ウイルスを中和抗体または血清の存在化または不存在下においてイン
キュベーションする。次いで、抗体で処理されたウイルスおよび抗体で処理され
なかった対照ウイルスを用いて上記のように細胞に感染させ、上記のように感染
細胞におけるリポーター遺伝子発現を行う。未修飾ウイルスの場合、中和抗体で
の処理は低レベルの感染を引き起こし、かくして、低レベルの導入遺伝子発現と
なる。本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスは、ポリマーコーテ
ィングにより中和から防御され、かくして、中和抗体に曝露された未修飾ウイル
スと比較して、増加した感染性および増加した導入遺伝子発現を示す。
よりも低下した抗原性を示す。低下した抗原性は、ウイルスに対する中和抗体へ
のポリマー修飾ウイルスの結合の有意な減少（ｐ＞０．０５）として定義される
。インビトロおよびインビボアッセイを包含する当該分野において知られた方法
により、低下した抗原性が評価される。例えば、リポーター遺伝子を含む修飾お
よび未修飾ウイルスを中和抗体または血清の存在化または不存在下においてイン
キュベーションする。次いで、抗体で処理されたウイルスおよび抗体で処理され
なかった対照ウイルスを用いて上記のように細胞に感染させ、上記のように感染
細胞におけるリポーター遺伝子発現を行う。未修飾ウイルスの場合、中和抗体で
の処理は低レベルの感染を引き起こし、かくして、低レベルの導入遺伝子発現と
なる。本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスは、ポリマーコーテ
ィングにより中和から防御され、かくして、中和抗体に曝露された未修飾ウイル
スと比較して、増加した感染性および増加した導入遺伝子発現を示す。
【００５６】 上記アッセイを用いることにより当業者は、感染性を維持し、低下した抗原性
を示す複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスを得るのに必要なグリコール
化およびその後の複合体化のための条件を決定することができる。
を示す複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスを得るのに必要なグリコール
化およびその後の複合体化のための条件を決定することができる。
【００５７】 ポリマー修飾アデノウイルスのカチオン性複合体はそのユニークな特性のため
、治療的および診断的なインビボでの適用に特に有用である。本発明のカチオン
性複合体は、医学的治療および診断、獣医学的プラクティスおよび農業において
有用である。それらは遺伝子治療（例えば、所望遺伝子産物の局所的発現のため
の遺伝子デリバリー）およびウイルス性腫瘍崩壊（これに限らない）のごとき非
遺伝子治療において特に有用である。ウイルスは、例えば遺伝子、トキシンおよ
び／または診断マーカーのデリバリーに有用である。さらなる適用はウイルス抗
原に対する寛容原の生成におけるものである。
、治療的および診断的なインビボでの適用に特に有用である。本発明のカチオン
性複合体は、医学的治療および診断、獣医学的プラクティスおよび農業において
有用である。それらは遺伝子治療（例えば、所望遺伝子産物の局所的発現のため
の遺伝子デリバリー）およびウイルス性腫瘍崩壊（これに限らない）のごとき非
遺伝子治療において特に有用である。ウイルスは、例えば遺伝子、トキシンおよ
び／または診断マーカーのデリバリーに有用である。さらなる適用はウイルス抗
原に対する寛容原の生成におけるものである。
【００５８】 本発明の１の具体例において、導入遺伝子を標的細胞中に導入する方法が提供
される。該方法は、本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスを標的
細胞中に導入することを含み、アデノウイルスは導入遺伝子を含む組み換えアデ
ノウイルスベクターである。複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスは、種
々の疾患、例えば導入遺伝子産物が存在しない、不十分、または機能的でない疾
患の治療のために導入遺伝子を標的細胞にデリバリーすることに特に有用である
。あるいはまた、導入遺伝子の発現は、標的細胞中の望ましくない遺伝子または
遺伝子産物の発現または機能をブロックすることにも役立つ可能性がある。
される。該方法は、本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスを標的
細胞中に導入することを含み、アデノウイルスは導入遺伝子を含む組み換えアデ
ノウイルスベクターである。複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスは、種
々の疾患、例えば導入遺伝子産物が存在しない、不十分、または機能的でない疾
患の治療のために導入遺伝子を標的細胞にデリバリーすることに特に有用である
。あるいはまた、導入遺伝子の発現は、標的細胞中の望ましくない遺伝子または
遺伝子産物の発現または機能をブロックすることにも役立つ可能性がある。
【００５９】 本発明のアデノウイルス複合体の標的細胞は、導入遺伝子の発現が必要とされ
る細胞である。標的細胞はアデノウイルス感染を許容する細胞タイプ（例えば、
２９３細胞およびＡ５４９細胞）およびアデノウイルス感染に耐性のある細胞タ
イプ（例えば、ヒト上皮細胞、ＮＩＨ ３ＴＣ細胞、および９Ｌ神経膠肉腫細胞
）を包含する。実際に、複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスベクターは
導入遺伝子発現のためのアデノウイルス耐性細胞への感染に特に適している。理
論により拘束されることを望まないが、本発明の複合体はインターナリゼーショ
ンのためにコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への結合を必要としな
い。当業者に理解されることであろうが、一般的には、許容細胞タイプにおける
アデノウイルスのインターナリゼーションはＣＡＲ経路に依存する。しかしなが
ら、本発明の複合体はＣＡＲ以外の経路によりインターナリゼーションされ、そ
れゆえ、本発明の複合体はアデノウイルス耐性細胞タイプ（Fasbender et al.,
(1997) J. Biol. Chem. 272: 6479-6489; Kaplan et al., (1988) Hum. Gen. Th
er. 9: 1469-1479）における導入遺伝子発現に特に適したものとなっている。
る細胞である。標的細胞はアデノウイルス感染を許容する細胞タイプ（例えば、
２９３細胞およびＡ５４９細胞）およびアデノウイルス感染に耐性のある細胞タ
イプ（例えば、ヒト上皮細胞、ＮＩＨ ３ＴＣ細胞、および９Ｌ神経膠肉腫細胞
）を包含する。実際に、複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスベクターは
導入遺伝子発現のためのアデノウイルス耐性細胞への感染に特に適している。理
論により拘束されることを望まないが、本発明の複合体はインターナリゼーショ
ンのためにコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への結合を必要としな
い。当業者に理解されることであろうが、一般的には、許容細胞タイプにおける
アデノウイルスのインターナリゼーションはＣＡＲ経路に依存する。しかしなが
ら、本発明の複合体はＣＡＲ以外の経路によりインターナリゼーションされ、そ
れゆえ、本発明の複合体はアデノウイルス耐性細胞タイプ（Fasbender et al.,
(1997) J. Biol. Chem. 272: 6479-6489; Kaplan et al., (1988) Hum. Gen. Th
er. 9: 1469-1479）における導入遺伝子発現に特に適したものとなっている。
【００６０】 例えば感染を包含する当該分野において知られた方法により、複合体化された
ポリマー修飾アデノウイルスを宿主細胞中に導入する。標的細胞をアデノウイル
スに接触させることによりインビボにおける標的細胞の感染を行う。アデノウイ
ルスを、生理学的に許容される担体と混合された組成物としてデリバリーする。
本明細書の用語「生理学的に許容される担体」は、いずれかおよびすべての溶媒
、希釈剤、等張化剤等を包含する。複合体化されたポリマー修飾アデノウイルス
の好ましい具体例は、ＰＥＧの共有結合およびその後のＤＥＡＥ−デキストラン
との複合体化によりポリマー修飾された組み換えアデノウイルスベクターである
。組成物へのかかる媒体および作用剤の使用は当該分野においてよく知られてい
る。本発明のアデノウイルスは、例えば食物摂取、注射、エアロゾル、吸入等を
包含する、細胞に適した方法により標的細胞にデリバリーすることができる。静
脈から、脳または腫瘍のごとき組織に注射することにより、あるいは肋膜または
腹腔のごとき体腔への注射により組成物をデリバリーしてもよい。
ポリマー修飾アデノウイルスを宿主細胞中に導入する。標的細胞をアデノウイル
スに接触させることによりインビボにおける標的細胞の感染を行う。アデノウイ
ルスを、生理学的に許容される担体と混合された組成物としてデリバリーする。
本明細書の用語「生理学的に許容される担体」は、いずれかおよびすべての溶媒
、希釈剤、等張化剤等を包含する。複合体化されたポリマー修飾アデノウイルス
の好ましい具体例は、ＰＥＧの共有結合およびその後のＤＥＡＥ−デキストラン
との複合体化によりポリマー修飾された組み換えアデノウイルスベクターである
。組成物へのかかる媒体および作用剤の使用は当該分野においてよく知られてい
る。本発明のアデノウイルスは、例えば食物摂取、注射、エアロゾル、吸入等を
包含する、細胞に適した方法により標的細胞にデリバリーすることができる。静
脈から、脳または腫瘍のごとき組織に注射することにより、あるいは肋膜または
腹腔のごとき体腔への注射により組成物をデリバリーしてもよい。
【００６１】 一般的には、組成物の処方は当該分野において知られており、慣用的には、Re
mington's Pharmaceutical Sciences,17th ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA.が参照される。本発明の複合体の投与に適した形態は滅菌水溶液および分散
物を包含する。本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスの有効量を
、利便性および効果的な投与のために、適当な生理学的に許容される担体および
／または希釈剤とともに配合する。
mington's Pharmaceutical Sciences,17th ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA.が参照される。本発明の複合体の投与に適した形態は滅菌水溶液および分散
物を包含する。本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウイルスの有効量を
、利便性および効果的な投与のために、適当な生理学的に許容される担体および
／または希釈剤とともに配合する。
【００６２】 ヒトまたは他の哺乳動物に使用される本発明の複合体化されたポリマー修飾ア
デノウイルスの有効量は、当業者が個体の年齢、体重および対象の症状を種々考
慮することにより決定される。
デノウイルスの有効量は、当業者が個体の年齢、体重および対象の症状を種々考
慮することにより決定される。
【００６３】 投与の容易さおよび用量の均一性のためには、非経口組成物を投与単位形態に
処方することが特に有利である。本明細書の投与単位形態とは、治療すべき哺乳
動物に適した単位用量としての物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な担
体と混合されて所望効果を発揮するように計算され前以て決められた量の有効成
分を含有する。本発明の新規投与単位形態の詳細は、ポリマー修飾ウイルスのユ
ニークな特徴および当該分野に固有の配合に関する制限に依存する。補足的な有
効成分を含有する組成物の場合、当該成分の通常の用量および投与方法を参考に
して用量が決定される。
処方することが特に有利である。本明細書の投与単位形態とは、治療すべき哺乳
動物に適した単位用量としての物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な担
体と混合されて所望効果を発揮するように計算され前以て決められた量の有効成
分を含有する。本発明の新規投与単位形態の詳細は、ポリマー修飾ウイルスのユ
ニークな特徴および当該分野に固有の配合に関する制限に依存する。補足的な有
効成分を含有する組成物の場合、当該成分の通常の用量および投与方法を参考に
して用量が決定される。
【００６４】 さらに本発明は、ウイルスを腫瘍にデリバリーする方法を提供し、該方法は、
アデノウイルスが腫瘍に局在化する条件下で本発明の複合体化されたポリマー修
飾アデノウイルスをかかる治療が必要な対象に投与することを含む。感染性を保
持し、中和抗体の衝撃を抑制する本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウ
イルスの能力は、ポリマー修飾ウイルスのこのようなさらなる使用方法の途を開
くものである。１００〜２００ｎｍの範囲のサイズの粒子は、いわゆるＥＰＲ効
果（向上した透過性および保持）に関連して受動的な腫瘍標的化を行う。腫瘍は
漏出性の脈管構造を有し、かくして、長時間循環する粒子は循環系から離れて、
腫瘍血管の孔を通って腫瘍柔組織に侵入する機会を有する。腫瘍は組織由来の高
分子および粒子を除去するための主要系（ＥＰＲにおける保持エレメントの基礎
）であるリンパ系を欠いている。ＰＥＧは、循環時間を延長することにより腫瘍
に対するリポソームの受動的標的化を促進させるために使用されている。しかし
ながら、科学文献中のデータは、このアプローチは、多くの生成物の寿命に関し
て許容できないほど低い血液対腫瘍比（すなわち１未満）のごとき好ましくない
特性を生じさせる。異なった最適化理論を用いて、循環時間以外のペジル化のさ
らなる効果を利用してこの問題を解決し、良好な腫瘍局在化および高い血液対腫
瘍比ならびに高い正常組織対腫瘍比を達成できることが示されている（WO 96/34
598）。かくして、本発明は、ウイルス粒子の腫瘍局在化を改善する手段を提供
する。これは、ウイルスベクターを用いて遺伝子をデリバリーする遺伝子治療な
らびに非遺伝子治療の両方に関して重要である。後者は、ウイルス性腫瘍崩壊に
より腫瘍細胞を殺す能力を有する、ｐ５３欠損腫瘍細胞の感染に対して選択的な
最近発見された系を用いる（Bischoff JR, Kirn DH, Williams A, Heise C, Hor
n S, Muna M, Ng L, Nye JA, Sampson-Johannes A, Fattaey, McCormik F (1996
) Science 274:373-376; Heise et al. (1997) Nature Medicine 3: 369-645;お
よびEP689447A、出典明示によりこれらを本明細書に一体化させる）。
アデノウイルスが腫瘍に局在化する条件下で本発明の複合体化されたポリマー修
飾アデノウイルスをかかる治療が必要な対象に投与することを含む。感染性を保
持し、中和抗体の衝撃を抑制する本発明の複合体化されたポリマー修飾アデノウ
イルスの能力は、ポリマー修飾ウイルスのこのようなさらなる使用方法の途を開
くものである。１００〜２００ｎｍの範囲のサイズの粒子は、いわゆるＥＰＲ効
果（向上した透過性および保持）に関連して受動的な腫瘍標的化を行う。腫瘍は
漏出性の脈管構造を有し、かくして、長時間循環する粒子は循環系から離れて、
腫瘍血管の孔を通って腫瘍柔組織に侵入する機会を有する。腫瘍は組織由来の高
分子および粒子を除去するための主要系（ＥＰＲにおける保持エレメントの基礎
）であるリンパ系を欠いている。ＰＥＧは、循環時間を延長することにより腫瘍
に対するリポソームの受動的標的化を促進させるために使用されている。しかし
ながら、科学文献中のデータは、このアプローチは、多くの生成物の寿命に関し
て許容できないほど低い血液対腫瘍比（すなわち１未満）のごとき好ましくない
特性を生じさせる。異なった最適化理論を用いて、循環時間以外のペジル化のさ
らなる効果を利用してこの問題を解決し、良好な腫瘍局在化および高い血液対腫
瘍比ならびに高い正常組織対腫瘍比を達成できることが示されている（WO 96/34
598）。かくして、本発明は、ウイルス粒子の腫瘍局在化を改善する手段を提供
する。これは、ウイルスベクターを用いて遺伝子をデリバリーする遺伝子治療な
らびに非遺伝子治療の両方に関して重要である。後者は、ウイルス性腫瘍崩壊に
より腫瘍細胞を殺す能力を有する、ｐ５３欠損腫瘍細胞の感染に対して選択的な
最近発見された系を用いる（Bischoff JR, Kirn DH, Williams A, Heise C, Hor
n S, Muna M, Ng L, Nye JA, Sampson-Johannes A, Fattaey, McCormik F (1996
) Science 274:373-376; Heise et al. (1997) Nature Medicine 3: 369-645;お
よびEP689447A、出典明示によりこれらを本明細書に一体化させる）。
【００６５】 さらに本発明を下記の特別な実施例に従って説明するが、実施例は本発明の範
囲を限定するものではない。
囲を限定するものではない。
【００６６】実施例 実施例１ アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合 ＭＰＥＧ５０００を用いてトレシル−モノメトキシポリエチレングリコール（
ＴＭＰＥＧ）を調製した。この実施例およびその後の実施例において、特記しな
いかぎり、ＴＭＰＥＧは、１９９５年６月６日および１９９６年２月２３日にそ
れぞれ出願された米国出願第０８／４７１３４８号および０８／６０１０４０号
に対応するＷＯ９５／０６０５８（出典明示により本明細書に一体化させる）に
示すように調製したものである。
ＴＭＰＥＧ）を調製した。この実施例およびその後の実施例において、特記しな
いかぎり、ＴＭＰＥＧは、１９９５年６月６日および１９９６年２月２３日にそ
れぞれ出願された米国出願第０８／４７１３４８号および０８／６０１０４０号
に対応するＷＯ９５／０６０５８（出典明示により本明細書に一体化させる）に
示すように調製したものである。
【００６７】 米国特許第５６７０４８８号に開示された２型アデノウイルス（β−ｇａｌリ
ポーター遺伝子を担持するように遺伝学的に修飾されている）を、等密度ＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心分離（３ラウンド）によりバンドを形成させることにより調製し
、次いで、５％スクロース含有リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ，ｐＨ７．２
）に対して十分に透析する。使用ストック溶液は１ｍｌあたり６．４ｘ１０１０ 感染単位（４．８ｘ１０１１個の粒子／ｍｌ）を含んでいた。乾ＴＭＰＥＧを添
加することにより、典型的には３．０ｍｇを１００μｌのストックに添加するこ
とにより３％ ｗ／ｖのウイルスストックを作成した。ロータリーミキシングを
行うながら試料を２５℃で２４時間インキュベーションした。
ポーター遺伝子を担持するように遺伝学的に修飾されている）を、等密度ＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心分離（３ラウンド）によりバンドを形成させることにより調製し
、次いで、５％スクロース含有リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ，ｐＨ７．２
）に対して十分に透析する。使用ストック溶液は１ｍｌあたり６．４ｘ１０１０ 感染単位（４．８ｘ１０１１個の粒子／ｍｌ）を含んでいた。乾ＴＭＰＥＧを添
加することにより、典型的には３．０ｍｇを１００μｌのストックに添加するこ
とにより３％ ｗ／ｖのウイルスストックを作成した。ロータリーミキシングを
行うながら試料を２５℃で２４時間インキュベーションした。
【００６８】 内径５０μｍの５７ｃｍの石英細管を装備したBeckman P/ACE 5010システムを
用いる細管式電気泳動（ＣＥ）によりポリマー処理ウイルスをモニターした（入
口＝陽極）。あらかじめ１Ｍ ＮａＯＨで１．５分洗浄し、次いで、ランニング
バッファー（２０ｍＭリン酸塩バッファー，ｐＨ７．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で洗浄した。インキュベーション後、試料をＣＥ装置に移し、圧力注入セッティ
ングを１０Ｓとすることによりオートサンプラーが数ナノリットルを取るように
し、最終電圧を１７ｋｖとする２分間の電圧勾配を用いて分離を行った。
用いる細管式電気泳動（ＣＥ）によりポリマー処理ウイルスをモニターした（入
口＝陽極）。あらかじめ１Ｍ ＮａＯＨで１．５分洗浄し、次いで、ランニング
バッファー（２０ｍＭリン酸塩バッファー，ｐＨ７．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で洗浄した。インキュベーション後、試料をＣＥ装置に移し、圧力注入セッティ
ングを１０Ｓとすることによりオートサンプラーが数ナノリットルを取るように
し、最終電圧を１７ｋｖとする２分間の電圧勾配を用いて分離を行った。
【００６９】 全ウイルスＣＥは、ＰＥＧ処理によるウイルス表面電化の変化をモニターする
ものである。ＰＥＧとのインキュベーションは、ウイルスに対するより中性の移
動度の連続的増加に関連している。中性度の上昇はウイルス表面上のＰＥＧ鎖の
増加と矛盾しない。
ものである。ＰＥＧとのインキュベーションは、ウイルスに対するより中性の移
動度の連続的増加に関連している。中性度の上昇はウイルス表面上のＰＥＧ鎖の
増加と矛盾しない。
【００７０】 図１（上のパネル）は、３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧに曝露され
たアデノウイルスについての細管式電気泳動図を重ねたものである。各プロット
中の欠落部分は中性点における谷間を示す。ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは模擬処理
ＭＰＥＧよりも中性のポイントに有意に近い位置に移動した。これらのペジル化
条件下において、残存未ペジル化ウイルスの証拠は存在しない（すなわち、対照
ウイルスに対応するＴＭＰＥＧトレース上にピークまたは肩がない）。
たアデノウイルスについての細管式電気泳動図を重ねたものである。各プロット
中の欠落部分は中性点における谷間を示す。ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは模擬処理
ＭＰＥＧよりも中性のポイントに有意に近い位置に移動した。これらのペジル化
条件下において、残存未ペジル化ウイルスの証拠は存在しない（すなわち、対照
ウイルスに対応するＴＭＰＥＧトレース上にピークまたは肩がない）。
【００７１】 移動度の変化が人為的なものでないことを確認するために、同体積の２つの試
料の混合物を負荷した（図１、下のパネル）。２つの十分に分離したピークが明
らかであり、上のパネルに示したものに対応していた。
料の混合物を負荷した（図１、下のパネル）。２つの十分に分離したピークが明
らかであり、上のパネルに示したものに対応していた。
【００７２】 図２は、上記のごとく、３００μｌのウイルスストックおよび３％（ｗ／ｖ）
のＴＭＰＥＧを使用した場合の、ＴＭＰＥＧ ３％（ｗ／ｖ）への曝露時間に伴
うウイルスの電気泳動度の変化を示す。移動度％を以下のように計算した： （修飾ウイルスピークの移動度−中性位置の移動度）／（未修飾ウイルスピーク
の移動度−中性位置の移動度）ｘ１００ 反応副生成物はランニングバッファーに影響しうるので、矢印で示した点にお
いてランニングバッファーを更新した。この点まで１００μｌの反応混合物を分
析し（ＣＥ機械の繰り返しサンプリング機能を用いて、すなわち混合せずに）、
その後は新鮮な反応混合物の部分試料１００μｌを使用した。
のＴＭＰＥＧを使用した場合の、ＴＭＰＥＧ ３％（ｗ／ｖ）への曝露時間に伴
うウイルスの電気泳動度の変化を示す。移動度％を以下のように計算した： （修飾ウイルスピークの移動度−中性位置の移動度）／（未修飾ウイルスピーク
の移動度−中性位置の移動度）ｘ１００ 反応副生成物はランニングバッファーに影響しうるので、矢印で示した点にお
いてランニングバッファーを更新した。この点まで１００μｌの反応混合物を分
析し（ＣＥ機械の繰り返しサンプリング機能を用いて、すなわち混合せずに）、
その後は新鮮な反応混合物の部分試料１００μｌを使用した。
【００７３】実施例２ アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合 繰り返しサイズ分析を可能にするためにロータリーミキシングを用いなかった
以外は実施例１と同様にして調製した２型アデノウイルスストック溶液（１ｍｌ
あたり１．３５ｘ１０１０感染単位；１ｍｌあたり粒子９．３ｘ１０１１個）を
、３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧを用いてペジル化した。 Malvern Instrument's ZetaMaster 5光子相関スペクトル分析（ＰＣＳ）を用
いてウイルス粒子サイズをモニターした。
以外は実施例１と同様にして調製した２型アデノウイルスストック溶液（１ｍｌ
あたり１．３５ｘ１０１０感染単位；１ｍｌあたり粒子９．３ｘ１０１１個）を
、３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧを用いてペジル化した。 Malvern Instrument's ZetaMaster 5光子相関スペクトル分析（ＰＣＳ）を用
いてウイルス粒子サイズをモニターした。
【００７４】 図３Ａおよび３Ｂは、それぞれＴＭＰＥＧ処理および未処理ウイルスに関して
、時間に対するウイルス直径を示す。時間ゼロにおける値に対する％として結果
を示す。図３Ｃおよび３Ｄは、長時間にわたるペジル化反応中に測定した結果を
示す。ＴＭＰＥＧとの反応を図３Ｄに示し、ＭＰＥＧでの模擬処理を図３Ｃに示
す。ＴＭＰＥＧでの処理は粒子サイズの増加を引き起こし（図３Ｂおよび３Ｄ）
、そのことは対照未処理ウイルス（図３Ａ）またはＭＰＥＧ処理ウイルス（図３
Ｃ）においては見られなかった。サイズの増加を図３Ｂおよび３Ｄに示す。ＰＣ
Ｓは多くのデータを与えるという利点を有し、かくして、当該方法により試料を
ランク付けすることができる。
、時間に対するウイルス直径を示す。時間ゼロにおける値に対する％として結果
を示す。図３Ｃおよび３Ｄは、長時間にわたるペジル化反応中に測定した結果を
示す。ＴＭＰＥＧとの反応を図３Ｄに示し、ＭＰＥＧでの模擬処理を図３Ｃに示
す。ＴＭＰＥＧでの処理は粒子サイズの増加を引き起こし（図３Ｂおよび３Ｄ）
、そのことは対照未処理ウイルス（図３Ａ）またはＭＰＥＧ処理ウイルス（図３
Ｃ）においては見られなかった。サイズの増加を図３Ｂおよび３Ｄに示す。ＰＣ
Ｓは多くのデータを与えるという利点を有し、かくして、当該方法により試料を
ランク付けすることができる。
【００７５】実施例３ ペジル化および模擬処理ウイルスに関する感染性アッセイ 感染性の保持に関してＰＥＧ処理のいくつかの方法を評価した（実施例４も参
照）。３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧへの曝露に加えて、ステップワイズ添加も用い
た（その目的はさらに完全なペジル化を行うため）。ステップワイズ添加の理論
的根拠は、ウイルス粒子は凝集する傾向にあり、その傾向は特に高濃度のＰＥＧ
により強まるというものである。しかしながら、他の粒子（例えばリポソーム）
の状況において、ペジル化は凝集を防止することが示された。よって、低いポリ
マー濃度における最初のペジル化は、その後の高いポリマー濃度における凝集傾
向を減少させ、それゆえ、高度のペジル化が可能となる。３段のステップワイズ
添加法を用いた：３０分ごとにＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧをストック溶液（実施
例１記載のごとく調製）に添加して、反応混合物中のポリマー濃度を３％、５％
または８％ずつ増加させた。これらの実験に用いたウイルスストックは１ｍｌあ
たり１．３５〜７．６ｘ１０１０感染単位であり、１ｍｌあたり粒子９．３〜２
０ｘ１０１１個であった。各実験において、乾ポリマーを最大で４回添加し、最
終ポリマー濃度を１２％、２０％および３２％とした（ｗ／ｖ、すなわちポリマ
ー体積に関して修正していない）。いくつかの実験において、４回目の添加に係
る試料を３０分後およびさらにインキュベーションした後に取った（５つの反応
条件が得られた）。
照）。３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧへの曝露に加えて、ステップワイズ添加も用い
た（その目的はさらに完全なペジル化を行うため）。ステップワイズ添加の理論
的根拠は、ウイルス粒子は凝集する傾向にあり、その傾向は特に高濃度のＰＥＧ
により強まるというものである。しかしながら、他の粒子（例えばリポソーム）
の状況において、ペジル化は凝集を防止することが示された。よって、低いポリ
マー濃度における最初のペジル化は、その後の高いポリマー濃度における凝集傾
向を減少させ、それゆえ、高度のペジル化が可能となる。３段のステップワイズ
添加法を用いた：３０分ごとにＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧをストック溶液（実施
例１記載のごとく調製）に添加して、反応混合物中のポリマー濃度を３％、５％
または８％ずつ増加させた。これらの実験に用いたウイルスストックは１ｍｌあ
たり１．３５〜７．６ｘ１０１０感染単位であり、１ｍｌあたり粒子９．３〜２
０ｘ１０１１個であった。各実験において、乾ポリマーを最大で４回添加し、最
終ポリマー濃度を１２％、２０％および３２％とした（ｗ／ｖ、すなわちポリマ
ー体積に関して修正していない）。いくつかの実験において、４回目の添加に係
る試料を３０分後およびさらにインキュベーションした後に取った（５つの反応
条件が得られた）。
【００７６】 ２つの方法で感染性を測定した（実施例４も参照）。培養物中のウイルスに曝
露されたヒト２９３細胞（この細胞系はアデノウイルスを許容する）においてβ
−ｇａｌ発現をモニターした（Graham et al., J. Gen.Virol. 36:59-72，1977
）。アッセイの１日前に細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６個／ｍｌの細胞懸
濁液を用いて２４ウェルマイクロタイタープレートのウェル１個あたり１００μ
ｌの割合で撒いた。２４時間までに単層となったので、反応混合物１０μｌを２
９３細胞の入った４系同じウェルのそれぞれに添加した。十分に湿った空気中５
％ ＣＯ２雰囲気下で一晩３７℃で細胞をインキュベーションしてβ−ｇａｌを
発現させた。
露されたヒト２９３細胞（この細胞系はアデノウイルスを許容する）においてβ
−ｇａｌ発現をモニターした（Graham et al., J. Gen.Virol. 36:59-72，1977
）。アッセイの１日前に細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６個／ｍｌの細胞懸
濁液を用いて２４ウェルマイクロタイタープレートのウェル１個あたり１００μ
ｌの割合で撒いた。２４時間までに単層となったので、反応混合物１０μｌを２
９３細胞の入った４系同じウェルのそれぞれに添加した。十分に湿った空気中５
％ ＣＯ２雰囲気下で一晩３７℃で細胞をインキュベーションしてβ−ｇａｌを
発現させた。
【００７７】 細胞単層から培地を取り、次いで、ＰＢＳで洗浄した。その後６０μｌの溶解バ
ッファー(１５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．０）を添加し、オービタルシェーカー中でマイクロタイタープレートを室
温で３０分間インキュベーションした。細胞を３０分間溶解させた後、各試料５
０μｌを新しいマイクロタイタープレートに移した。１セットのβ−ｇａｌ標準
物質（溶解バッファー中５．５単位および溶解バッファーにて２倍希釈したもの
）を同じマイクロタイタープレートに加えた。１５０μｌのＣＰＲＧ基質バッフ
ァー（１．６ｍＭ ＣＰＲＧ，６０ｍＭ リン酸塩バッファー；１ｍＭ ＭｇＳＯ
４；１０ｍＭ ＫＣｌ；５０ｍＭ β−メルカプトエタノール；２５０ｍＭ蒸留水
）を各ウェルに添加した。短時間（４分）混合した後、マイクロタイタープレー
トリーダー（Titertek Multiscan Plus MKII, ICN, flow laboratories, Switze
rland）にて５５５ｎｍにおいてプレートを読んだ。 ＣＰＲＧアッセイを用いて３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧの単一添加を調べた。図
４は、ＴＭＰＥＧ処理ウイルス（白丸）およびＭＰＥＧ模擬処理ウイルス（三角
）および対照ウイルス（黒丸）に関するＣＰＲＧアッセイの結果を示す。いずれ
の処理においても、実験時間において（６時間まで）感染性の低下傾向はみられ
なかった。次の独立した実験はこの結果を確認するものであり、対照ウイルス、
ＴＭＰＥＧ処理ウイルスまたはＭＰＥＧでの模擬処理ウイルスのいずれについて
も、６時間のうちに有意なＯＤの低下は示されなかった（データ示さず）。よっ
て、実施例１および２におけるウイルスのＰＥＧ処理は感染性の低下を示すもの
でない。
ッファー(１５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．０）を添加し、オービタルシェーカー中でマイクロタイタープレートを室
温で３０分間インキュベーションした。細胞を３０分間溶解させた後、各試料５
０μｌを新しいマイクロタイタープレートに移した。１セットのβ−ｇａｌ標準
物質（溶解バッファー中５．５単位および溶解バッファーにて２倍希釈したもの
）を同じマイクロタイタープレートに加えた。１５０μｌのＣＰＲＧ基質バッフ
ァー（１．６ｍＭ ＣＰＲＧ，６０ｍＭ リン酸塩バッファー；１ｍＭ ＭｇＳＯ
４；１０ｍＭ ＫＣｌ；５０ｍＭ β−メルカプトエタノール；２５０ｍＭ蒸留水
）を各ウェルに添加した。短時間（４分）混合した後、マイクロタイタープレー
トリーダー（Titertek Multiscan Plus MKII, ICN, flow laboratories, Switze
rland）にて５５５ｎｍにおいてプレートを読んだ。 ＣＰＲＧアッセイを用いて３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧの単一添加を調べた。図
４は、ＴＭＰＥＧ処理ウイルス（白丸）およびＭＰＥＧ模擬処理ウイルス（三角
）および対照ウイルス（黒丸）に関するＣＰＲＧアッセイの結果を示す。いずれ
の処理においても、実験時間において（６時間まで）感染性の低下傾向はみられ
なかった。次の独立した実験はこの結果を確認するものであり、対照ウイルス、
ＴＭＰＥＧ処理ウイルスまたはＭＰＥＧでの模擬処理ウイルスのいずれについて
も、６時間のうちに有意なＯＤの低下は示されなかった（データ示さず）。よっ
て、実施例１および２におけるウイルスのＰＥＧ処理は感染性の低下を示すもの
でない。
【００７８】 ５％のＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１２０００またはＰＥＧ２００００のステップ
ワイズ添加は感染性に種々の影響を与えた（図５）。パネルＡおよびＢは５％の
ＰＥＧ５０００のステップワイズ添加の影響を示す（それぞれ２系の平均および
４系の平均±標準偏差、いくつかの誤差バーはシンボルに隠れている）。ＴＭＰ
ＥＧ（黒丸）はＭＰＥＧ（白丸）と比較すると感染性を低下させた。ＰＥＧ１２ ０００ に関しては（パネルＣおよびＤ、同じシンボル）、１の実験において、Ｍ
ＰＥＧ処理ウイルスと比較するとＴＭＰＥＧはウイルスの感染性を低下させたが
、他の実験において、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧは有意には異ならなかった（す
なわち、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧは感染性に対して同様の影響を有していた。
）。ＴＭＰＥＧ２００００での処理も同量のＭＰＥＧ２００００よりも有意に大
きな影響を示さなかった（パネルＥ、同じシンボル）。
ワイズ添加は感染性に種々の影響を与えた（図５）。パネルＡおよびＢは５％の
ＰＥＧ５０００のステップワイズ添加の影響を示す（それぞれ２系の平均および
４系の平均±標準偏差、いくつかの誤差バーはシンボルに隠れている）。ＴＭＰ
ＥＧ（黒丸）はＭＰＥＧ（白丸）と比較すると感染性を低下させた。ＰＥＧ１２ ０００ に関しては（パネルＣおよびＤ、同じシンボル）、１の実験において、Ｍ
ＰＥＧ処理ウイルスと比較するとＴＭＰＥＧはウイルスの感染性を低下させたが
、他の実験において、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧは有意には異ならなかった（す
なわち、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧは感染性に対して同様の影響を有していた。
）。ＴＭＰＥＧ２００００での処理も同量のＭＰＥＧ２００００よりも有意に大
きな影響を示さなかった（パネルＥ、同じシンボル）。
【００７９】実施例４ ペジル化および模擬処理ウイルスに関する感染性アッセイ ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧの単一およびステップワイズ添加物を実施例３と同
様にして調製し、ウイルスにコードされているβ−ガラクトシダーゼを検出する
化学発光リポーターアッセイ系（Galacto-LightTM）を用いて感染性について分
析した。このアッセイ系は化学発光物質を用いるものであり、製造者の説明書に
従って行われた。
様にして調製し、ウイルスにコードされているβ−ガラクトシダーゼを検出する
化学発光リポーターアッセイ系（Galacto-LightTM）を用いて感染性について分
析した。このアッセイ系は化学発光物質を用いるものであり、製造者の説明書に
従って行われた。
【００８０】 図６Ａ〜Ｃは、ウイルス感染性に対するＴＭＰＥＧ５０００（黒丸）またはＭ
ＰＥＧ５０００（白丸）の３％、５％または８％きざみの添加の影響を比較した
ものである。図６ＡおよびＢにおいてＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理ウイルス試
料が同様の感染性を示すことに注意。ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧのいずれの処理
によっても感染性の穏やかな低下が観察された。ＰＥＧ処理しない対照を用いる
その後の実験において、これらは同様の感染性の低下を示し、この低下は操作上
の影響であり、ＰＥＧによるものではないことが示唆された。図６ＣにおいてＭ
ＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理ウイルスは同様の挙動を示した。よって、この実験
は、ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧでの処理は感染性を消失させないことを示す。
ＰＥＧ５０００（白丸）の３％、５％または８％きざみの添加の影響を比較した
ものである。図６ＡおよびＢにおいてＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理ウイルス試
料が同様の感染性を示すことに注意。ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧのいずれの処理
によっても感染性の穏やかな低下が観察された。ＰＥＧ処理しない対照を用いる
その後の実験において、これらは同様の感染性の低下を示し、この低下は操作上
の影響であり、ＰＥＧによるものではないことが示唆された。図６ＣにおいてＭ
ＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理ウイルスは同様の挙動を示した。よって、この実験
は、ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧでの処理は感染性を消失させないことを示す。
【００８１】 ＰＥＧ５０００を５％きざみで添加するスキームを用いた実験において、ＰＥ
Ｇ鎖の付加による見かけの感染性の消失がこのアッセイに関して２回見られた（
図７ＡおよびＢ、黒丸はＴＭＰＥＧ、白丸はＭＰＥＧ）。図７Ｂに示す同じ試料
についてその後行ったアッセイは、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理間の有意な差
異を示さず、実際には有意な感染性の消失は起こらなかったことを示した（図７
Ｃ，同じシンボル）。
Ｇ鎖の付加による見かけの感染性の消失がこのアッセイに関して２回見られた（
図７ＡおよびＢ、黒丸はＴＭＰＥＧ、白丸はＭＰＥＧ）。図７Ｂに示す同じ試料
についてその後行ったアッセイは、ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ処理間の有意な差
異を示さず、実際には有意な感染性の消失は起こらなかったことを示した（図７
Ｃ，同じシンボル）。
【００８２】 図８は、ＰＥＧ１２０００（パネルＡおよびＢ、黒丸はＴＭＰＥＧ、白丸はＭ
ＰＥＧ）およびＰＥＧ２００００（パネルＣ、同じシンボル）に関する比較結果
を示す。上と同様に、条件０は未処理ウイルス対照であり、条件１〜４は５％
ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧのステップワイズ添加試料である。ＰＥＧ１２０００ の場合、ＴＭＰＥＧに関してはＴＭＰＥＧの３回目および４回目の添加後の２つ
の実験のうち一方において感染性の穏やかな低下があった（パネルＢ）。ＰＥＧ １２０００ を用いる他方の実験において（パネルＡ）は、ＴＭＰＥＧおよびＭＰ
ＥＧのいずれを用いた場合にも感染性の有意な低下は観察されなかった。ＰＥＧ ２００００ の場合、１回目を含めてすべての添加に関してＴＭＰＥＧ処理はＭＰ
ＥＧよりも感染性を低下させたが、４回目のＴＭＰＥＧ添加後でさえも最初の感
染性の約３分の１の値が維持された。
ＰＥＧ）およびＰＥＧ２００００（パネルＣ、同じシンボル）に関する比較結果
を示す。上と同様に、条件０は未処理ウイルス対照であり、条件１〜４は５％
ＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧのステップワイズ添加試料である。ＰＥＧ１２０００ の場合、ＴＭＰＥＧに関してはＴＭＰＥＧの３回目および４回目の添加後の２つ
の実験のうち一方において感染性の穏やかな低下があった（パネルＢ）。ＰＥＧ １２０００ を用いる他方の実験において（パネルＡ）は、ＴＭＰＥＧおよびＭＰ
ＥＧのいずれを用いた場合にも感染性の有意な低下は観察されなかった。ＰＥＧ ２００００ の場合、１回目を含めてすべての添加に関してＴＭＰＥＧ処理はＭＰ
ＥＧよりも感染性を低下させたが、４回目のＴＭＰＥＧ添加後でさえも最初の感
染性の約３分の１の値が維持された。
【００８３】 ３％ＰＥＧ５０００の単一添加、すなわち実施例３と同様に調製した場合、化
学発光にアッセイに関して感染性の穏やかな低下が観察された（図９）。実験時
間において観察された感染性の低下はＴＭＰＥＧ（黒丸）およびＭＰＥＧ処理ウ
イルス（白丸）の両方ならびに未処理「ハンドリング（handling）」対照（三角
）において見られてことに注目すべきである。
学発光にアッセイに関して感染性の穏やかな低下が観察された（図９）。実験時
間において観察された感染性の低下はＴＭＰＥＧ（黒丸）およびＭＰＥＧ処理ウ
イルス（白丸）の両方ならびに未処理「ハンドリング（handling）」対照（三角
）において見られてことに注目すべきである。
【００８４】実施例５ 中和抗体による感染性の低下に対するペジル化の影響 実施例４に示した感染性アッセイを用い、ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧ処理ウイ
ルスの中和抗体への曝露を用いてポリマー処理による中和からの防御の証拠を探
した。 ヘキソンアフィニティー樹脂を用いてウサギ抗−ヘキソン血清から精製された
ポリクローナル中和抗体の存在下および不存在下において導入遺伝子発現をモニ
ターした。未処理ウイルスを用いてポリクローナル抗体の力価を測定し、中和抗
体存在下において３０〜５０％の感染性が保持される割合を確立した。示した場
合には２種の抗体力価１００００：１（〜３０％）または５００００：１（〜４
０ないし５０％）を用いた。
ルスの中和抗体への曝露を用いてポリマー処理による中和からの防御の証拠を探
した。 ヘキソンアフィニティー樹脂を用いてウサギ抗−ヘキソン血清から精製された
ポリクローナル中和抗体の存在下および不存在下において導入遺伝子発現をモニ
ターした。未処理ウイルスを用いてポリクローナル抗体の力価を測定し、中和抗
体存在下において３０〜５０％の感染性が保持される割合を確立した。示した場
合には２種の抗体力価１００００：１（〜３０％）または５００００：１（〜４
０ないし５０％）を用いた。
【００８５】 図１０〜１２は、ＴＭＰＥＧ５０００（図１０および１１）およびＴＭＰＥＧ １２０００ （図１２）を５％きざみでアデノウイルスに添加した場合の影響（Ｂ
パネル）を、当該ウイルスへのＭＰＥＧの段階的添加の場合（Ａパネル）と比較
して示す。図１０〜１２のＡおよびＢパネルの白丸は抗体非存在下での感染性で
あり；黒丸は抗体存在下での感染性である。
パネル）を、当該ウイルスへのＭＰＥＧの段階的添加の場合（Ａパネル）と比較
して示す。図１０〜１２のＡおよびＢパネルの白丸は抗体非存在下での感染性で
あり；黒丸は抗体存在下での感染性である。
【００８６】 ３つの場合全部において、中和からの有意な防御の証拠ならびに最高／最長の
ＴＭＰＥＧへの曝露にて最適防御を生じる防御改善傾向が存在した。各図のＡお
よびＢパネルは生データを示し、図１０Ｃ、１１Ｃおよび１２Ｃは同量の未抗体
処理対照に対するパーセントとして導入遺伝子発現を示す。各Ｃパネルにおいて
、白棒はＭＰＥＧ処理ウイルスからの導入遺伝子発現を示し、黒棒はＴＭＰＥＧ
ウイルスからの導入遺伝子発現を示す。図１０において、未抗体処理対照の感染
単位数の相違を補償するようにアッセイ系への添加ウイルス量を調節した。図１
１および１２において、同数のウイルス粒子を各条件に関してアッセイした。抗
体力価はそれぞれ１００００：１、５０００：１および１００００：１であった
。
ＴＭＰＥＧへの曝露にて最適防御を生じる防御改善傾向が存在した。各図のＡお
よびＢパネルは生データを示し、図１０Ｃ、１１Ｃおよび１２Ｃは同量の未抗体
処理対照に対するパーセントとして導入遺伝子発現を示す。各Ｃパネルにおいて
、白棒はＭＰＥＧ処理ウイルスからの導入遺伝子発現を示し、黒棒はＴＭＰＥＧ
ウイルスからの導入遺伝子発現を示す。図１０において、未抗体処理対照の感染
単位数の相違を補償するようにアッセイ系への添加ウイルス量を調節した。図１
１および１２において、同数のウイルス粒子を各条件に関してアッセイした。抗
体力価はそれぞれ１００００：１、５０００：１および１００００：１であった
。
【００８７】 これらのデータは免疫認識からの防御を示す。明確にするために、防御とは、
未処理対照において観察される発現と比較した場合に、試験における免疫作用剤
（例えば、抗体または細胞懸濁物）の存在下での導入遺伝子発現の統計学的に有
意な相違があることと定義する。
未処理対照において観察される発現と比較した場合に、試験における免疫作用剤
（例えば、抗体または細胞懸濁物）の存在下での導入遺伝子発現の統計学的に有
意な相違があることと定義する。
【００８８】 ３％ ＴＭＰＥＧ５０００の単一添加は、２つの独立したアッセイにおいて４
時間および６時間インキュベーション後にある程度の防御を示した。総合的に考
えると、上の実施例は、ＰＥＧでの処理が感染性を完全に失わせるのではなく、
抗体による中和からの統計学的に有意な防御を与えるペジル化の「窓」の存在を
示すものである。
時間および６時間インキュベーション後にある程度の防御を示した。総合的に考
えると、上の実施例は、ＰＥＧでの処理が感染性を完全に失わせるのではなく、
抗体による中和からの統計学的に有意な防御を与えるペジル化の「窓」の存在を
示すものである。
【００８９】実施例６ ペジル化アデノウイルスベクターの定量分析 Ａｄ２／β−ｇａｌ２ベクター（米国特許第５６７０４８８号およびZabner e
t al. (1996) J. Virol. 70: 6994に記載）を、０．０１％、０．１％、１．０
％または５．０％ビオチン化ＮＨＳ−ＰＥＧ５０００（Shearwater Polymers）
を用いてＰＥＧ共有結合修飾した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりペジル化ベクター蛋
白を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ヘキソン、ペントンベースおよびファ
イバーがＰＥＧにより共有結合修飾の主な標的であり、ＰＥＧ濃度の増加はさら
なる蛋白の修飾を引き起こすことが示された。
t al. (1996) J. Virol. 70: 6994に記載）を、０．０１％、０．１％、１．０
％または５．０％ビオチン化ＮＨＳ−ＰＥＧ５０００（Shearwater Polymers）
を用いてＰＥＧ共有結合修飾した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりペジル化ベクター蛋
白を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ヘキソン、ペントンベースおよびファ
イバーがＰＥＧにより共有結合修飾の主な標的であり、ＰＥＧ濃度の増加はさら
なる蛋白の修飾を引き起こすことが示された。
【００９０】 アデノウイルスのペジル化も定量的に評価した。ＴＭＰＥＧ−ビオチン５％、
１０％、またはＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン０．０１％、０．１％、１％、５％と
いうように、量を増大させてＡｄ２−β−ｇａｌ２ベクターを処理した。両方の
ＰＥＧ５０００をShearwater Polymersから得た。ＰＥＧのステップワイズ添加
を３分ごとに、ＴＭＰＥＧ−ビオチンの場合には１時間まで、ＮＨＳ−ＰＥＧ−
ビオチンの場合には２時間まで行った。ＰＥＧ処理後、未反応ＰＥＧをＣｓＣｌ
勾配精製によりＰＥＧ−ウイルスから分離し、アビジンＨＲＰ抱合体を受容体と
して用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いてウイルスに結合したＰＥＧ−ビオチン量
を定量した。ＰＥＧ−ビオチン（０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の標準曲線を得て、ウ
イルス粒子１個あたりに結合したＰＥＧ−ビオチン分子数を決定した。結果を表
１に示す。
１０％、またはＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン０．０１％、０．１％、１％、５％と
いうように、量を増大させてＡｄ２−β−ｇａｌ２ベクターを処理した。両方の
ＰＥＧ５０００をShearwater Polymersから得た。ＰＥＧのステップワイズ添加
を３分ごとに、ＴＭＰＥＧ−ビオチンの場合には１時間まで、ＮＨＳ−ＰＥＧ−
ビオチンの場合には２時間まで行った。ＰＥＧ処理後、未反応ＰＥＧをＣｓＣｌ
勾配精製によりＰＥＧ−ウイルスから分離し、アビジンＨＲＰ抱合体を受容体と
して用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いてウイルスに結合したＰＥＧ−ビオチン量
を定量した。ＰＥＧ−ビオチン（０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の標準曲線を得て、ウ
イルス粒子１個あたりに結合したＰＥＧ−ビオチン分子数を決定した。結果を表
１に示す。
【００９１】 表１ 試料 ＰＥＧ−ビオチン分子：ウイルス粒子 ０．１％ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン ６００：１ １％ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン ３０７７：１ ５％ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン ３１９１：１ ５％ ＴＭＰＥＧ−ビオチン １５００：１ １０％ ＴＭＰＥＧ−ビオチン １０００：１
【００９２】 ＴＭＰＥＧ−ビオチンおよびＮＨＳ−ＭＰＥＧ−ビオチンでのアデノウイルス
の処理はいずれもＰＥＧ−ビオチンをウイルス表面に共有結合させた。データは
、トレシルおよびＮＨＳ ＰＥＧ−ビオチンの相当な濃度において、ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧビオチンでの処理後により多くのＰＥＧ−ビオチンがウイルス粒子に共有結
合したことを示し、そのことは、トレシルＭＰＥＧとリジン残基との反応がゆっ
くりと起こる（２〜３時間）ことと比較して、ＮＨＳ−ＰＥＧとリジン残基との
反応はより迅速に起こる（３０〜４５分）ことと矛盾しない。 このデータは、ＰＥＧの共有結合の程度に関する定量的結果を提供する。
の処理はいずれもＰＥＧ−ビオチンをウイルス表面に共有結合させた。データは
、トレシルおよびＮＨＳ ＰＥＧ−ビオチンの相当な濃度において、ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧビオチンでの処理後により多くのＰＥＧ−ビオチンがウイルス粒子に共有結
合したことを示し、そのことは、トレシルＭＰＥＧとリジン残基との反応がゆっ
くりと起こる（２〜３時間）ことと比較して、ＮＨＳ−ＰＥＧとリジン残基との
反応はより迅速に起こる（３０〜４５分）ことと矛盾しない。 このデータは、ＰＥＧの共有結合の程度に関する定量的結果を提供する。
【００９３】実施例７ アデノウイルスへのポリエチレングリコールの共有結合 等密度ＣｓＣｌ遠心分離でバンドを形成させ、次いで、リン酸塩緩衝化セイラ
イン（ＰＢＳ ｐＨ７．２）に対して十分に透析することにより２型アデノウイ
ルス（β−ｇａｌ受容体を担持するように遺伝学的に修飾されている）を調製し
た。アデノウイルスをペジル化する能力について３つの異なるタイプのＭＰＥＧ
、すなわちａ）塩化シアヌル活性化ＭＰＥＧ５０００、ｂ）ＴＭＰＥＧ５０００ およびｃ）アミノ−ＰＥＧ５０００を試験した。Shearwater PolymersからＭＰ
ＥＧを得た。塩化シアヌルでのＭＰＥＧの活性化によりＭＰＥＧ１分子あたり１
個のトリアジン環がカップリングする。この活性化ＭＰＥＧは蛋白のアミノ基と
反応することができる。別法として、塩化トレシル（塩化２，２，２−トリフル
オロエタンスルホニル）を用いてＭＰＥＧを活性化して、蛋白のイプシロンアミ
ノ基と反応して非常に安定なアミン結合を形成するトレシレートＭＰＥＧを得る
こともできる。ＳＰＤＰ−アミノＭＰＥＧはシステイン残基を介して蛋白とカッ
プリングする。ＳＰＤＰの活性化ＮＨＳエステル末端はアミノＰＥＧ上のアミン
基と反応してアミド結合を形成する。他方の末端の２−ピリジルジチオール基は
遊離形であり、スルフヒドリル基と反応してジスルフィド結合を形成する。メタ
ノール存在下においてＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−
サクシンイミジル）をアミノＰＥＧに付加することによりＳＰＤＰ−アミノＰＥ
Ｇを合成した。室温で一晩インキュベーションした後、エーテルで沈殿させるこ
とによりＳＰＤＰ−アミノＰＥＧを集めた。
イン（ＰＢＳ ｐＨ７．２）に対して十分に透析することにより２型アデノウイ
ルス（β−ｇａｌ受容体を担持するように遺伝学的に修飾されている）を調製し
た。アデノウイルスをペジル化する能力について３つの異なるタイプのＭＰＥＧ
、すなわちａ）塩化シアヌル活性化ＭＰＥＧ５０００、ｂ）ＴＭＰＥＧ５０００ およびｃ）アミノ−ＰＥＧ５０００を試験した。Shearwater PolymersからＭＰ
ＥＧを得た。塩化シアヌルでのＭＰＥＧの活性化によりＭＰＥＧ１分子あたり１
個のトリアジン環がカップリングする。この活性化ＭＰＥＧは蛋白のアミノ基と
反応することができる。別法として、塩化トレシル（塩化２，２，２−トリフル
オロエタンスルホニル）を用いてＭＰＥＧを活性化して、蛋白のイプシロンアミ
ノ基と反応して非常に安定なアミン結合を形成するトレシレートＭＰＥＧを得る
こともできる。ＳＰＤＰ−アミノＭＰＥＧはシステイン残基を介して蛋白とカッ
プリングする。ＳＰＤＰの活性化ＮＨＳエステル末端はアミノＰＥＧ上のアミン
基と反応してアミド結合を形成する。他方の末端の２−ピリジルジチオール基は
遊離形であり、スルフヒドリル基と反応してジスルフィド結合を形成する。メタ
ノール存在下においてＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−
サクシンイミジル）をアミノＰＥＧに付加することによりＳＰＤＰ−アミノＰＥ
Ｇを合成した。室温で一晩インキュベーションした後、エーテルで沈殿させるこ
とによりＳＰＤＰ−アミノＰＥＧを集めた。
【００９４】 ＰＥＧ：リジン比を増加させつつ、Ａｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスを、ａ）塩
化シアヌル活性化ＭＰＥＧ、ｂ）ＴＭＰＥＧまたはｃ）アミノＰＥＧのいずれか
とインキュベーションした。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ炭酸ナト
リウムバッファーｐＨ８．５中でＡｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスを透析し、次い
で、塩化シアヌル活性化ＭＰＥＧで、あるいは０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する
０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５で処理し、その後ＴＭＰＥＧで
処理した。すべてのペジル化反応を室温で行った。ロータリープラットホーム上
で試料を混合し、過剰のリジンを添加することによりあるいは温度を低下させる
ことによりペジル化反応を終了させた。ペジル化ウイルスを２９３細胞に感染さ
せることにより、ペジル化ウイルスの感染性を最初に評価し、その後、Ｘ−ｇａ
ｌ染色を用いて導入遺伝子発現（β−ガラクシダーゼ）を測定した。このアッセ
イを用いると、ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは、塩化シアヌル活性化ＰＥＧまたはＳ
ＰＤＰ−ＰＥＧで処理されたウイルスよりも高い感染性を有していた。さらにRi
ch, DP, Couture LA, Cardoza LM, Guiggio, VM, Arnebtano, D., Espino, PC,
Hehir, K., Welsh, MJ, Smith, AE and Gregory, RJ, 1993, Hum. Gen. Ther. 4
: 461-476に記載された蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソ
ン抗体を用いた２９３細胞に対する終点希釈率に関する、より定量的なアッセイ
を用いてＴＭＰＥＧ処理ウイルスの感染性を測定した。
化シアヌル活性化ＭＰＥＧ、ｂ）ＴＭＰＥＧまたはｃ）アミノＰＥＧのいずれか
とインキュベーションした。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ炭酸ナト
リウムバッファーｐＨ８．５中でＡｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスを透析し、次い
で、塩化シアヌル活性化ＭＰＥＧで、あるいは０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する
０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５で処理し、その後ＴＭＰＥＧで
処理した。すべてのペジル化反応を室温で行った。ロータリープラットホーム上
で試料を混合し、過剰のリジンを添加することによりあるいは温度を低下させる
ことによりペジル化反応を終了させた。ペジル化ウイルスを２９３細胞に感染さ
せることにより、ペジル化ウイルスの感染性を最初に評価し、その後、Ｘ−ｇａ
ｌ染色を用いて導入遺伝子発現（β−ガラクシダーゼ）を測定した。このアッセ
イを用いると、ＴＭＰＥＧ処理ウイルスは、塩化シアヌル活性化ＰＥＧまたはＳ
ＰＤＰ−ＰＥＧで処理されたウイルスよりも高い感染性を有していた。さらにRi
ch, DP, Couture LA, Cardoza LM, Guiggio, VM, Arnebtano, D., Espino, PC,
Hehir, K., Welsh, MJ, Smith, AE and Gregory, RJ, 1993, Hum. Gen. Ther. 4
: 461-476に記載された蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソ
ン抗体を用いた２９３細胞に対する終点希釈率に関する、より定量的なアッセイ
を用いてＴＭＰＥＧ処理ウイルスの感染性を測定した。
【００９５】 結果を表２に示し、その結果はＴＭＰＥＧでのペジル化後にウイルスの感染性
が保持されていることを示す（アッセイ誤差は±０．５ｌｏｇ）。
が保持されていることを示す（アッセイ誤差は±０．５ｌｏｇ）。
【００９６】 表２ ＰＥＧ：リジン 感染性 ５：１ ３．８ｅ８ ｉｕ／ｍｌ ２．５：１ １．５ｅ８ ｉｕ／ｍｌ １：１ ２．２ｅ８ ｉｕ／ｍｌ 対照 ５ｅ８ ｉｕ／ｍｌ
【００９７】実施例８ ペジル化ベクターへの中和抗体結合の減少 実施例１１に記載のごとくＡｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスをＴＭＰＥＧでペジ
ル化した。中和ヒト血清の２倍系列希釈物とともにウイルスを３７℃で１時間イ
ンキュベーションし、次いで、２９３細胞を添加した。単独でインキュベーショ
ンされた２９３細胞が集密になった時点でアッセイの測定を行った。血清に曝露
されなかったウイルスとともにインキュベーションされた細胞と比較して、細胞
変性効果からの２９３細胞の検出可能な防御を示した最大希釈率の逆数として中
和力価を定義した。アッセイの前に、試験すべき異なるウイルス調合物の力価を
測定して、１００％の細胞変性効果を引き起こす最小希釈率を確認した。結果を
表３に示す。
ル化した。中和ヒト血清の２倍系列希釈物とともにウイルスを３７℃で１時間イ
ンキュベーションし、次いで、２９３細胞を添加した。単独でインキュベーショ
ンされた２９３細胞が集密になった時点でアッセイの測定を行った。血清に曝露
されなかったウイルスとともにインキュベーションされた細胞と比較して、細胞
変性効果からの２９３細胞の検出可能な防御を示した最大希釈率の逆数として中
和力価を定義した。アッセイの前に、試験すべき異なるウイルス調合物の力価を
測定して、１００％の細胞変性効果を引き起こす最小希釈率を確認した。結果を
表３に示す。
【００９８】 表３ ウイルス 中和力価 ＰＥＧ：リジン比 ５：１ ８００ ２．５：１ ３２００ 対照 ６４００
【００９９】 結果によれば、未処理ウイルス比較すると、ペジル化ウイルスを中和するため
にはより多くの血清が必要であり、ペジル化は中和抗体により認識される部位を
覆うことが示唆される。
にはより多くの血清が必要であり、ペジル化は中和抗体により認識される部位を
覆うことが示唆される。
【０１００】実施例９ ペジル化ウイルス粒子のイオン交換クロマトグラフィー 実施例１１に記載したように、ＰＥＧ：リジン比を５０モルおよび１０モルと
してＴＭＰＥＧ用いてＡｄ２β−ｇａｌウイルスをペジル化した。ＮａＣｌ含有
リン酸塩バッファー中のＤＥＡＥイオン交換樹脂（Millipore, Bedford, MA）に
ウイルスを適用した。塩グラジエントを増加させて結合ウイルスを樹脂から溶出
させ、素通りピークおよび溶出蛋白ピークを、対照ウイルス、ＴＭＰＥＧ処理ウ
イルス（ＰＥＧ：リジン比５０モル）ならびにＰＥＧ処理ウイルス（ＰＥＧ：リ
ジン比１０モル）に関して分析した。クロマトグラフィー前のすべての試料は同
じ蛋白量を有していた。
してＴＭＰＥＧ用いてＡｄ２β−ｇａｌウイルスをペジル化した。ＮａＣｌ含有
リン酸塩バッファー中のＤＥＡＥイオン交換樹脂（Millipore, Bedford, MA）に
ウイルスを適用した。塩グラジエントを増加させて結合ウイルスを樹脂から溶出
させ、素通りピークおよび溶出蛋白ピークを、対照ウイルス、ＴＭＰＥＧ処理ウ
イルス（ＰＥＧ：リジン比５０モル）ならびにＰＥＧ処理ウイルス（ＰＥＧ：リ
ジン比１０モル）に関して分析した。クロマトグラフィー前のすべての試料は同
じ蛋白量を有していた。
【０１０１】 図１３のパネルＡは、対照ウイルスのクロマトグラフィーで得られたＤＥＡＥ
イオン交換樹脂（Millipore, Bedford, MA）からの溶出プロファイルを示す。１
の主要蛋白ピークが樹脂から溶出し、これが感染性ウイルス粒子を含有していた
（データ示さず）。図１３のパネルＢは、ＴＭＰＥＧで処理されたウイルス（１
０：１の比）のクロマトグラフィーにより得られたＤＥＡＥイオン交換樹脂から
の溶出プロファイルを示す。対照ウイルスのプイロファイルとは対照的に、溶出
蛋白ピークのほかに素通りピークが出現し、溶出ウイルスピークのサイズは小さ
くなっていた。素通りピークの出現は、ペジル化によってこれらの条件下ではＤ
ＥＡＥ樹脂にもはや結合できないウイルス粒子が生じ、その結果としてウイルス
粒子は未反応ＰＥＧとともに素通りピーク中に存在することを示唆する。イオン
交換クロマトグラフィーは蛋白とイオン交換樹脂との電荷相互作用に基づくもの
なので、ペジル化により表面電荷が変化した異種ウイルス集団が生じたことが明
らかである。有意な表面電荷の相違を有するウイルス粒子はもはや樹脂に結合で
きず、素通りピーク中に回収される。５０：１の比のＴＭＰＥＧでペジル化され
たウイルスのクロマトグラフィーにより得られたイオン交換樹脂からの溶出プロ
ファイルは同様のプロファイルであった。この試料中の素通りピークは有意に大
きく、対照的に溶出蛋白のピークは小さかった。ＰＥＧ：リジン比を５０：１に
増加させた場合、素通りピーク中に溶出される粒子フラクションが増加し、ウイ
ルス粒子のペジル化レベルが増加した。表４は、ペジル化に用いたＰＥＧ：リジ
ン比に関連した２つのピークのサイズを示す（ピーク面積として示す）。結論と
して、イオン交換クロマトグラフィーを用いてペジル化ウイルス粒子の異種集団
を分離でき、電荷の相違に基づいて、あまりペジル化していない粒子から非常に
ペジル化された粒子を分離できる。
イオン交換樹脂（Millipore, Bedford, MA）からの溶出プロファイルを示す。１
の主要蛋白ピークが樹脂から溶出し、これが感染性ウイルス粒子を含有していた
（データ示さず）。図１３のパネルＢは、ＴＭＰＥＧで処理されたウイルス（１
０：１の比）のクロマトグラフィーにより得られたＤＥＡＥイオン交換樹脂から
の溶出プロファイルを示す。対照ウイルスのプイロファイルとは対照的に、溶出
蛋白ピークのほかに素通りピークが出現し、溶出ウイルスピークのサイズは小さ
くなっていた。素通りピークの出現は、ペジル化によってこれらの条件下ではＤ
ＥＡＥ樹脂にもはや結合できないウイルス粒子が生じ、その結果としてウイルス
粒子は未反応ＰＥＧとともに素通りピーク中に存在することを示唆する。イオン
交換クロマトグラフィーは蛋白とイオン交換樹脂との電荷相互作用に基づくもの
なので、ペジル化により表面電荷が変化した異種ウイルス集団が生じたことが明
らかである。有意な表面電荷の相違を有するウイルス粒子はもはや樹脂に結合で
きず、素通りピーク中に回収される。５０：１の比のＴＭＰＥＧでペジル化され
たウイルスのクロマトグラフィーにより得られたイオン交換樹脂からの溶出プロ
ファイルは同様のプロファイルであった。この試料中の素通りピークは有意に大
きく、対照的に溶出蛋白のピークは小さかった。ＰＥＧ：リジン比を５０：１に
増加させた場合、素通りピーク中に溶出される粒子フラクションが増加し、ウイ
ルス粒子のペジル化レベルが増加した。表４は、ペジル化に用いたＰＥＧ：リジ
ン比に関連した２つのピークのサイズを示す（ピーク面積として示す）。結論と
して、イオン交換クロマトグラフィーを用いてペジル化ウイルス粒子の異種集団
を分離でき、電荷の相違に基づいて、あまりペジル化していない粒子から非常に
ペジル化された粒子を分離できる。
【０１０２】 表４ 素通りピーク面積 溶出ピーク面積 対照 ＮＡ ０．２７２ ＰＥＧ−ウイルス ０．０２２ ０．１３２ １０：１ ＰＥＧ−ウイルス ０．０６３ ０．０３１ ５０：１
【０１０３】実施例１０ 免疫マウスにおけるペジル化Ａｄ２／β−Ｇａｌ２による導入遺伝子発現 実施例１のようにして調製した２型アデノウイルスストック溶液の２つのバッ
チを混合し（１ｍｌあたり５．３８ｘ１０１０感染単位、１ｍｌあたり粒子２．
０５５ｘ１０１２個の２ｍｌのバッチおよび１ｍｌあたり１．３５ｘ１０１０感
染単位、１ｍｌあたり粒子９．３ｘ１０１１個の４ｍｌのバッチ）、実施例３の
ようにして５％ ＴＭＰＥＧのステップワイズ添加法を用いてＰＥＧ処理した。
２回および３回のＴＭＰＥＧ添加により得られた試料（すなわち、それぞれ合計
１０％および１５％）を、ステップグラジエントおよび２回連続した平衡グラジ
エントを用いる標準的なＣｓＣｌ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）遠心分離
法により未反応ＴＭＰＥＧから精製した。次いで、精製されたＰＥＧ処理ベクタ
ーを、５％スクロースを含有するリン酸塩緩衝化セイラインに対して透析し、小
分けして−８０℃で保存した。Rich, DP, Couture LA, Cardoza LM, Guiggio, V
M, Arnebtano, D., Espino, PC, Hehir, K., Welsh, MJ, Smith, AE and Gregor
y, RJ, 1993, Hum. Gen. Ther. 4: 461-476に記載された蛍光イソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソン抗体を用いた２９３細胞に対する終点希釈率
により力価を調べた。合計１０％のＴＭＰＥＧを用いて調製した精製ＰＥＧ処理
ウイルス懸濁液は２．７ｘ１０１１個／ｍｌの粒子を含有し（３ｘ１０９感染単
位／ｍｌ）、合計１５％のＴＭＰＥＧを用いて調製した精製ＰＥＧ処理ウイルス
懸濁液は２．４ｘ１０１１個／ｍｌの粒子を含有していた（６．４ｘ１０８感染
単位／ｍｌ）。
チを混合し（１ｍｌあたり５．３８ｘ１０１０感染単位、１ｍｌあたり粒子２．
０５５ｘ１０１２個の２ｍｌのバッチおよび１ｍｌあたり１．３５ｘ１０１０感
染単位、１ｍｌあたり粒子９．３ｘ１０１１個の４ｍｌのバッチ）、実施例３の
ようにして５％ ＴＭＰＥＧのステップワイズ添加法を用いてＰＥＧ処理した。
２回および３回のＴＭＰＥＧ添加により得られた試料（すなわち、それぞれ合計
１０％および１５％）を、ステップグラジエントおよび２回連続した平衡グラジ
エントを用いる標準的なＣｓＣｌ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）遠心分離
法により未反応ＴＭＰＥＧから精製した。次いで、精製されたＰＥＧ処理ベクタ
ーを、５％スクロースを含有するリン酸塩緩衝化セイラインに対して透析し、小
分けして−８０℃で保存した。Rich, DP, Couture LA, Cardoza LM, Guiggio, V
M, Arnebtano, D., Espino, PC, Hehir, K., Welsh, MJ, Smith, AE and Gregor
y, RJ, 1993, Hum. Gen. Ther. 4: 461-476に記載された蛍光イソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソン抗体を用いた２９３細胞に対する終点希釈率
により力価を調べた。合計１０％のＴＭＰＥＧを用いて調製した精製ＰＥＧ処理
ウイルス懸濁液は２．７ｘ１０１１個／ｍｌの粒子を含有し（３ｘ１０９感染単
位／ｍｌ）、合計１５％のＴＭＰＥＧを用いて調製した精製ＰＥＧ処理ウイルス
懸濁液は２．４ｘ１０１１個／ｍｌの粒子を含有していた（６．４ｘ１０８感染
単位／ｍｌ）。
【０１０４】 未処理および前以て免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボでの遺伝子
導入能に関して、２つのペジル化ウイルス懸濁液を未処理２型アデノウイルス（
１ｍｌあたり３．１９ｘ１０１０感染単位）と比較した。ヒトＣＦＴＲをコード
している１０９感染単位の複製欠損２型アデノウイルス（Ａｄ２／ＣＦＴＲ）を
鼻腔内投与することによりマウスを前以て免疫した。研究用に選択した動物は約
１／２５０００ないし１／５００００の血清抗−アデノウイルス抗体力価を有し
ていた。未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスはアデノウイルスベクターに曝露されていな
いマウスであった。０日目に、ウイルス調合物を以下のように投与した：ａ）体
積１００μｌ中の２ｘ１０８感染単位の未処理ウイルスを未処理群の４匹のマウ
スおよび前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴下、ｂ）体積１００μ
ｌ中の３ｘ１０８感染単位（２．７ｘ１０１０個）の「ペジル化ウイルス１０％
」を未処理および前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴下、ｃ）体積
１００μｌ中の６．４ｘ１０７感染単位（２．４ｘ１０１０個）の「ペジル化ウ
イルス１０％」を未処理および前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴
下。滴下の日に、前以て免疫した群のすべての動物の目から採血し、抗体力価に
関して血液を分析した。滴下から３日後にすべてのマウスを殺し、肺組織、右の
下方の葉および左葉を取った。１つの条件につき４匹の未処理動物および４匹の
免疫動物のすべてから得た右の尾側の葉（未処理、「ペジル化ウイルス１０％」
および「ペジル化ウイルス１５％」）をＡＭＰＧＤアッセイ（Galacto-LightTM
Kit, Tropix, Bedford, MA）におけるβ−ｇａｌの定量用に使用した。BioRad D
C試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネートの蛋白濃度を調べた。
１つの条件につき２匹の未処理動物および２匹の免疫動物から得た左葉をＸ−ｇ
ａｌ染色に使用した。
導入能に関して、２つのペジル化ウイルス懸濁液を未処理２型アデノウイルス（
１ｍｌあたり３．１９ｘ１０１０感染単位）と比較した。ヒトＣＦＴＲをコード
している１０９感染単位の複製欠損２型アデノウイルス（Ａｄ２／ＣＦＴＲ）を
鼻腔内投与することによりマウスを前以て免疫した。研究用に選択した動物は約
１／２５０００ないし１／５００００の血清抗−アデノウイルス抗体力価を有し
ていた。未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスはアデノウイルスベクターに曝露されていな
いマウスであった。０日目に、ウイルス調合物を以下のように投与した：ａ）体
積１００μｌ中の２ｘ１０８感染単位の未処理ウイルスを未処理群の４匹のマウ
スおよび前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴下、ｂ）体積１００μ
ｌ中の３ｘ１０８感染単位（２．７ｘ１０１０個）の「ペジル化ウイルス１０％
」を未処理および前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴下、ｃ）体積
１００μｌ中の６．４ｘ１０７感染単位（２．４ｘ１０１０個）の「ペジル化ウ
イルス１０％」を未処理および前以て免疫された群の４匹のマウスそれぞれに滴
下。滴下の日に、前以て免疫した群のすべての動物の目から採血し、抗体力価に
関して血液を分析した。滴下から３日後にすべてのマウスを殺し、肺組織、右の
下方の葉および左葉を取った。１つの条件につき４匹の未処理動物および４匹の
免疫動物のすべてから得た右の尾側の葉（未処理、「ペジル化ウイルス１０％」
および「ペジル化ウイルス１５％」）をＡＭＰＧＤアッセイ（Galacto-LightTM
Kit, Tropix, Bedford, MA）におけるβ−ｇａｌの定量用に使用した。BioRad D
C試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネートの蛋白濃度を調べた。
１つの条件につき２匹の未処理動物および２匹の免疫動物から得た左葉をＸ−ｇ
ａｌ染色に使用した。
【０１０５】 表５は、未処理および前以て免疫したマウスにおける未処理ウイルス、「ペジ
ル化ウイルス１０％」および「ペジル化ウイルス１５％」に関する蛋白１マイク
ログラムあたりのβ−ガラクトシダーゼ発現を示す（蛋白１マイクログラムあた
りの相対光単位ＲＬＵ）。１つの条件あたり４匹すべてのマウスにおいて、３種
のウイルス調合物すべてについて未処理マウスにおけるβ−ガラクトシダーゼ発
現が観察された。前以て免疫されたマウスにおいて、未処理ベクターは４匹すべ
てのマウスにおいてバックグラウンドレベルのβ−ガラクトシダーゼ発現しか生
じなかった。対照的に、２種のペジル化ウイルス調合物は、「ペジル化ウイルス
１０％」および「ペジル化ウイルス１５％」（表１参照）に関してそれぞれ４匹
中４匹、４匹中３匹において対照動物よりも高いβ−ガラクトシダーゼ発現レベ
ルを生じた。よって、ウイルスのペジル化はインビボにおいて中和からの防御を
生じさせ、インビボにおいて標的組織中のベクターの実質的な発現を生じさせる
。
ル化ウイルス１０％」および「ペジル化ウイルス１５％」に関する蛋白１マイク
ログラムあたりのβ−ガラクトシダーゼ発現を示す（蛋白１マイクログラムあた
りの相対光単位ＲＬＵ）。１つの条件あたり４匹すべてのマウスにおいて、３種
のウイルス調合物すべてについて未処理マウスにおけるβ−ガラクトシダーゼ発
現が観察された。前以て免疫されたマウスにおいて、未処理ベクターは４匹すべ
てのマウスにおいてバックグラウンドレベルのβ−ガラクトシダーゼ発現しか生
じなかった。対照的に、２種のペジル化ウイルス調合物は、「ペジル化ウイルス
１０％」および「ペジル化ウイルス１５％」（表１参照）に関してそれぞれ４匹
中４匹、４匹中３匹において対照動物よりも高いβ−ガラクトシダーゼ発現レベ
ルを生じた。よって、ウイルスのペジル化はインビボにおいて中和からの防御を
生じさせ、インビボにおいて標的組織中のベクターの実質的な発現を生じさせる
。
【０１０６】 表５．蛋白１マイクログラムあたりの相対光単位（ＲＬＵ／μｇ蛋白）として示
された、肺組織におけるβ−ガラクトシダーゼ発現 調合物 マウス番号 ＲＬＵ／μｇ蛋白 ＲＬＵ／μｇ蛋白 （感染単位） 未処理 免疫 対照ウイルス(2x108iu) １ ９５５ ２５ ２ １４５７ ９０ ３ ６４９ ２８ ４ １３８８ ３８ ペジル化１０％(3x108iu) １ ２３４１ ２１８ ２ ２１０８ １２９６ ３ ３６９４ １６４ ４ １７３０ １９６４ ペジル化１５％(6.4x10７iu) １ ７０５ ３４ ２ １７２ ３０５ ３ ７１５ １９８ ４ １１２８ １０８
された、肺組織におけるβ−ガラクトシダーゼ発現 調合物 マウス番号 ＲＬＵ／μｇ蛋白 ＲＬＵ／μｇ蛋白 （感染単位） 未処理 免疫 対照ウイルス(2x108iu) １ ９５５ ２５ ２ １４５７ ９０ ３ ６４９ ２８ ４ １３８８ ３８ ペジル化１０％(3x108iu) １ ２３４１ ２１８ ２ ２１０８ １２９６ ３ ３６９４ １６４ ４ １７３０ １９６４ ペジル化１５％(6.4x10７iu) １ ７０５ ３４ ２ １７２ ３０５ ３ ７１５ １９８ ４ １１２８ １０８
【０１０７】実施例１１ 免疫マウスにおけるペジル化Ａｄ２／β−ｇａｌ４ウイルスの導入遺伝子発現 すでに説明したようにして１０％トレシルＭＰＥＧ（ＴＭＰＥＧ）を用いてＡ
ｄ２／β−ｇａｌ４ウイルス（米国特許第５６７０４８８号）をペジル化した。
塩化セシウムグラジエント上でバンドを形成させること（Rich et al., Human G
ene Therapy 4: 461-476, 1993）によりペジル化ウイルスを未反応ＴＭＰＥＧか
ら精製した。精製ペジル化ウイルスをリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ），５
％スクロース中で透析し、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキ
ソン抗体（Rich et al., 1993）を用いたＨＥＫ２９３細胞に対する終点希釈率
により力価を決定した。ＴＭＰＥＧウイルスに関して説明したようにして対照ま
たは模擬処理ベクターを無反応性ＰＥＧで処理し、精製し、力価を調べた。ペジ
ル化ウイルスおよび模擬処理ウイルスを免疫マウスおよび未処理マウス中に滴下
した。各ベクターの用量は２ｘ１０８ｉｕ／マウス（〜２ｘ１０１０個と同等）
であり、マウス１匹あたりの投与体積は１００μｌであった。免疫マウスには前
以てＡｄ２−ＣＦＴＲ−８ベクター（米国特許第５７０７６１８号）を滴下し、
免疫マウスは２５０００〜５１２００の範囲のアデノウイルスに対する力価を有
していた。
ｄ２／β−ｇａｌ４ウイルス（米国特許第５６７０４８８号）をペジル化した。
塩化セシウムグラジエント上でバンドを形成させること（Rich et al., Human G
ene Therapy 4: 461-476, 1993）によりペジル化ウイルスを未反応ＴＭＰＥＧか
ら精製した。精製ペジル化ウイルスをリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ），５
％スクロース中で透析し、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキ
ソン抗体（Rich et al., 1993）を用いたＨＥＫ２９３細胞に対する終点希釈率
により力価を決定した。ＴＭＰＥＧウイルスに関して説明したようにして対照ま
たは模擬処理ベクターを無反応性ＰＥＧで処理し、精製し、力価を調べた。ペジ
ル化ウイルスおよび模擬処理ウイルスを免疫マウスおよび未処理マウス中に滴下
した。各ベクターの用量は２ｘ１０８ｉｕ／マウス（〜２ｘ１０１０個と同等）
であり、マウス１匹あたりの投与体積は１００μｌであった。免疫マウスには前
以てＡｄ２−ＣＦＴＲ−８ベクター（米国特許第５７０７６１８号）を滴下し、
免疫マウスは２５０００〜５１２００の範囲のアデノウイルスに対する力価を有
していた。
【０１０８】 滴下から３日後に動物を殺し、個々の動物から得た肺組織をホモジナイズし、
市販アッセイキット（GalactolightTM Kit, Tropix, Bedfor,MA）を製造者の説
明書に従って使用してホモジネート中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。
BioRad DC試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネート中の蛋白濃度
を調べ、結果を相対光単位（ＲＬＵ）／μｇ蛋白として示した。
市販アッセイキット（GalactolightTM Kit, Tropix, Bedfor,MA）を製造者の説
明書に従って使用してホモジネート中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。
BioRad DC試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネート中の蛋白濃度
を調べ、結果を相対光単位（ＲＬＵ）／μｇ蛋白として示した。
【０１０９】 図１４は、ペジル化ウイルス（Ａｄ ＴＭＰＥＧ）および模擬処理ウイルス（
Ａｄ ＭＰＥＧ）に関するβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。結果は、個々の動
物に関して得られた値の平均値±標準偏差である。ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ（
Ｎ＝２）ウイルス調合物の両方に関して未処理マウスの肺においてβ−ガラクト
シダーゼ発現を測定した。前以て免疫したマウス（Ｎ＝４）において、模擬処理
ウイルス（Ａｄ ＭＰＥＧ）はβ−ガラクトシダーゼ発現レベルを低下させたが
（未処理マウスにおいて測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の約４７％）、お
そらくアデノウイルス特異的抗体による中和によるものであろう。対照的に、前
以て免疫されたマウス（Ｎ＝３）において、ペジル化ウイルスは、未処理マウス
において測定されたのと同等（未処理マウスにおいて測定された発現の約８９％
）のβ−ガラクトシダーゼ発現を生じさせた。よって、アデノウイルスのペジル
化はウイルスを中和から防御し、免疫応答の存在下における組織中で十分なベク
ターの発現を可能にする。
Ａｄ ＭＰＥＧ）に関するβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。結果は、個々の動
物に関して得られた値の平均値±標準偏差である。ＭＰＥＧおよびＴＭＰＥＧ（
Ｎ＝２）ウイルス調合物の両方に関して未処理マウスの肺においてβ−ガラクト
シダーゼ発現を測定した。前以て免疫したマウス（Ｎ＝４）において、模擬処理
ウイルス（Ａｄ ＭＰＥＧ）はβ−ガラクトシダーゼ発現レベルを低下させたが
（未処理マウスにおいて測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の約４７％）、お
そらくアデノウイルス特異的抗体による中和によるものであろう。対照的に、前
以て免疫されたマウス（Ｎ＝３）において、ペジル化ウイルスは、未処理マウス
において測定されたのと同等（未処理マウスにおいて測定された発現の約８９％
）のβ−ガラクトシダーゼ発現を生じさせた。よって、アデノウイルスのペジル
化はウイルスを中和から防御し、免疫応答の存在下における組織中で十分なベク
ターの発現を可能にする。
【０１１０】実施例１２ 未処理および免疫マウスにおけるペジル化Ａｄ２／β−ｇａｌ２ウイルスのカチ
オン性複合体の導入遺伝子発現 実施例１の方法に準じて、１０％ ＴＭＰＥＧ（Shearwater Polymers, Huntsv
ille, AL）を用いてＡｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスをペジル化した。すでに説明
したようにＣｓＣｌ上でバンドを形成させ、リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ
）に対して透析することにより未反応ＴＭＰＥＧからペジル化ウイルスを精製し
た。Rich et al., (1993) Human Gen. Ther. 4: 461-476に示された蛍光イソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソン抗体を用いた２９３細胞に対する
終点希釈率により力価を決定した。ペジル化ウイルスは７．６ｘ１０８ｉｕ／ｍ
ｌの力価を有しており、粒子：ｉｕ比は８００であった。興味深いことに、ペジ
ル化前のウイルス力価は９．５ｘ１０９ｉｕ／ｍｌで、粒子：ｉｕ比は８０であ
った。よって、ウイルス感染性はペジル化の間に低下した。
オン性複合体の導入遺伝子発現 実施例１の方法に準じて、１０％ ＴＭＰＥＧ（Shearwater Polymers, Huntsv
ille, AL）を用いてＡｄ２−β−ｇａｌ２ウイルスをペジル化した。すでに説明
したようにＣｓＣｌ上でバンドを形成させ、リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ
）に対して透析することにより未反応ＴＭＰＥＧからペジル化ウイルスを精製し
た。Rich et al., (1993) Human Gen. Ther. 4: 461-476に示された蛍光イソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）−抱合抗−ヘキソン抗体を用いた２９３細胞に対する
終点希釈率により力価を決定した。ペジル化ウイルスは７．６ｘ１０８ｉｕ／ｍ
ｌの力価を有しており、粒子：ｉｕ比は８００であった。興味深いことに、ペジ
ル化前のウイルス力価は９．５ｘ１０９ｉｕ／ｍｌで、粒子：ｉｕ比は８０であ
った。よって、ウイルス感染性はペジル化の間に低下した。
【０１１１】 未修飾ウイルス（対照）、ペジル化ウイルス、およびＤＥＡＥ−デキストラン
またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のいずれかと複合体化したペジル化ウイルス
を未処理マウスに滴下した。対照の用量は２ｘ１０８ｉｕ／動物であり、１．０
ｘ１０１０個／マウスと同等の割合であった。ペジル化ウイルスの用量（複合体
化および未複合体化）は７．６ｘ１０７ｉｕ／動物であり、６．４ｘ１０１０個
／マウスと同等であった。ウイルス粒子１個あたり３０００分子のＤＥＡＥ−デ
キストランの割合でペジル化ウイルスをＤＥＡＥ−デキストランと複合体化させ
、その一方で、ウイルス粒子１個あたり５００分子の割合でペジル化ウイルスを
ＰＬＬと複合体化させた。マウス１匹あたりの投与体積は１００μｌであった。
またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のいずれかと複合体化したペジル化ウイルス
を未処理マウスに滴下した。対照の用量は２ｘ１０８ｉｕ／動物であり、１．０
ｘ１０１０個／マウスと同等の割合であった。ペジル化ウイルスの用量（複合体
化および未複合体化）は７．６ｘ１０７ｉｕ／動物であり、６．４ｘ１０１０個
／マウスと同等であった。ウイルス粒子１個あたり３０００分子のＤＥＡＥ−デ
キストランの割合でペジル化ウイルスをＤＥＡＥ−デキストランと複合体化させ
、その一方で、ウイルス粒子１個あたり５００分子の割合でペジル化ウイルスを
ＰＬＬと複合体化させた。マウス１匹あたりの投与体積は１００μｌであった。
【０１１２】 滴下から３日後に動物を殺し、個々の動物から得た肺組織をホモジナイズし、
市販アッセイキット（GalactolightTM Kit, Tropix, Bedfor,MA）を製造者の説
明書に従って使用してホモジネート中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。
BioRad DC試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネート中の蛋白濃度
を調べ、結果を相対光単位（ＲＬＵ）／μｇ蛋白として示した。結果を図１５に
示す。
市販アッセイキット（GalactolightTM Kit, Tropix, Bedfor,MA）を製造者の説
明書に従って使用してホモジネート中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。
BioRad DC試薬（BioRad, Hercules, CA）を用いて肺ホモジネート中の蛋白濃度
を調べ、結果を相対光単位（ＲＬＵ）／μｇ蛋白として示した。結果を図１５に
示す。
【０１１３】 図１５は、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化したペジル化ウイルスが、未複
合体化ペジル化ウイルス、未修飾対照ウイルスおよびＰＬＬ複合体化したペジル
化ウイルスと比較して、増大した感染性を有していたことを示す。示された結果
は、個々の動物に関して得られた値の平均値±標準偏差である。
合体化ペジル化ウイルス、未修飾対照ウイルスおよびＰＬＬ複合体化したペジル
化ウイルスと比較して、増大した感染性を有していたことを示す。示された結果
は、個々の動物に関して得られた値の平均値±標準偏差である。
【０１１４】 上記のＴＭＰＥＧまたはＭＰＥＧのいずれかでペジル化されたアデノウイルス
ならびにＤＥＡＥ−デキストランで複合体化されたペジル化アデノウイルスの感
染性を、上で示した方法に準じて未処理マウスおよび免疫マウスにおいて確認し
たが、異なる供給者（Sigma Chemical, St Louis, MO）からのＴＭＰＥＧを使用
した。Ａｄ２−ＣＦＴＲ−８ベクターを免疫マウスに滴下し、免疫マウスは２５
０００〜５１２００の範囲のアデノウイルスに対する力価を有していた。結果を
図１６に示す。
ならびにＤＥＡＥ−デキストランで複合体化されたペジル化アデノウイルスの感
染性を、上で示した方法に準じて未処理マウスおよび免疫マウスにおいて確認し
たが、異なる供給者（Sigma Chemical, St Louis, MO）からのＴＭＰＥＧを使用
した。Ａｄ２−ＣＦＴＲ−８ベクターを免疫マウスに滴下し、免疫マウスは２５
０００〜５１２００の範囲のアデノウイルスに対する力価を有していた。結果を
図１６に示す。
【０１１５】 図１６は、ペジル化ウイルスは、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化され、未
処理および免疫マウスに投与された場合、増大した感染性を示したことを示す。
そのうえ、ＴＭＰＥＧでペジル化され、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化され
たウイルスを与えられた免疫マウスにおける導入遺伝子発現は、未処理マウスに
関して測定された発現と同等であり、そのことはＤＥＡＥ−デキストランと複合
体化されたペジル化ウイルスの低下した抗原性を示す。対照的に、ＭＰＥＧでペ
ジル化され、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化されたウイルスの導入遺伝子発
現は未処理マウスにおいてのみ増大した。よって、ＴＭＰＥＧでペジル化され、
ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化されたウイルスは、増大した感染性および低
下した抗原性の両方を示した。
処理および免疫マウスに投与された場合、増大した感染性を示したことを示す。
そのうえ、ＴＭＰＥＧでペジル化され、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化され
たウイルスを与えられた免疫マウスにおける導入遺伝子発現は、未処理マウスに
関して測定された発現と同等であり、そのことはＤＥＡＥ−デキストランと複合
体化されたペジル化ウイルスの低下した抗原性を示す。対照的に、ＭＰＥＧでペ
ジル化され、ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化されたウイルスの導入遺伝子発
現は未処理マウスにおいてのみ増大した。よって、ＴＭＰＥＧでペジル化され、
ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化されたウイルスは、増大した感染性および低
下した抗原性の両方を示した。
【図１】 ３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧおよびＭＰＥＧで処理されたアデノウ
イルスの細管式電気泳動図を示す。
イルスの細管式電気泳動図を示す。
【図２】 ３％（ｗ／ｖ）ＴＭＰＥＧで処理されたアデノウイルスの細管式
電気泳動図上の移動度の経時変化を示すグラフである。
電気泳動図上の移動度の経時変化を示すグラフである。
【図３Ａ〜Ｄ】 ペジル化の間のウイルス粒子サイズの変化を示す光子相関
スペクトル分析の結果を示す。
スペクトル分析の結果を示す。
【図４】 ０〜６時間行われた３％ ＴＭＰＥＧ、３％ ＭＰＥＧの単一回添
加および対照ウイルスに関する感染性（ＣＰＲＧ）アッセイの結果を示す。
加および対照ウイルスに関する感染性（ＣＰＲＧ）アッセイの結果を示す。
【図５Ａ〜Ｅ】 ５％のＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１２０００またはＰＥＧ２ ００００ のステップワイズ添加に関する感染性（ＣＰＲＧ）アッセイの結果を示
す。
す。
【図６Ａ〜Ｃ】 ３％、５％または８％のＰＥＧ５０００のステップワイズ
添加に関する感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
添加に関する感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
【図７Ａ〜Ｃ】 ５％のＰＥＧ５０００のステップワイズ添加に関する感染
性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
【図８Ａ〜Ｃ】 ５％のＰＥＧ１２０００およびＰＥＧ２００００のステッ
プワイズ添加に関する感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
プワイズ添加に関する感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
【図９】 ３％のＰＥＧ５０００ステップワイズ添加に関する感染性（化学
発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
【図１０Ａ〜Ｃ】 感染中和に対する５％のＰＥＧ５０００のステップワイ
ズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵアッ
セイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は１００００対１。
ズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵアッ
セイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は１００００対１。
【図１１Ａ〜Ｃ】 感染中和に対する５％のＰＥＧ５０００のステップワイ
ズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵアッ
セイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は５０００対１。
ズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵアッ
セイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は５０００対１。
【図１２Ａ〜Ｃ】 感染中和に対する５％のＰＥＧ１２０００のステップワ
イズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵア
ッセイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は１００００対１。
イズ添加の影響に関する抗体中和アッセイのグラフを示す（化学発光，ＲＬＵア
ッセイ）。ウイルス粒子に対する抗体分子の割合は１００００対１。
【図１３Ａ〜Ｃ】 ＤＥＡＥイオン交換樹脂クロマトグラフィーによる対照
およびＴＭＰＥＧ処理ウイルスの溶出プロファイルを示す。
およびＴＭＰＥＧ処理ウイルスの溶出プロファイルを示す。
【図１４】 未処理マウスおよびペジル化（PEGylated）もしくは模擬処理
アデノウイルスベクター中の導入遺伝子発現により示される感染性（化学発光，
ＲＬＵ）を比較するアッセイの結果を示す。
アデノウイルスベクター中の導入遺伝子発現により示される感染性（化学発光，
ＲＬＵ）を比較するアッセイの結果を示す。
【図１５】 （ｉ）アデノウイルス単独、（ｉｉ）１０％ ＴＭＰＥＧ５０
００処理アデノウイルス、（ｉｉｉ）ポリ−Ｌ−リジンと複合体化したアデノウ
イルス／１０％ ＴＭＰＥＧ５０００、（ｉｖ）ＤＥＡＥ−デキストランと複合
体化したアデノウイルス／１０％ＰＥＧ５０００を用いた場合の未処理マウスに
おける感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
００処理アデノウイルス、（ｉｉｉ）ポリ−Ｌ−リジンと複合体化したアデノウ
イルス／１０％ ＴＭＰＥＧ５０００、（ｉｖ）ＤＥＡＥ−デキストランと複合
体化したアデノウイルス／１０％ＰＥＧ５０００を用いた場合の未処理マウスに
おける感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
【図１６】 （ｉ）１０％ＴＭＰＥＧ５０００処理アデノウイルス、（ｉｉ
）ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化したアデノウイルス／１０％ＴＭＰＥＧ５ ０００ 、（ｉｉｉ）模擬処理アデノウイルス（１０％ＭＰＥＧ５０００）および
（ｉｖ）ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化した模擬処理アデノウイルス（１０
％ＭＰＥＧ５０００）を用いた場合の未処理マウスおよび免疫マウスにおける比
較感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
）ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化したアデノウイルス／１０％ＴＭＰＥＧ５ ０００ 、（ｉｉｉ）模擬処理アデノウイルス（１０％ＭＰＥＧ５０００）および
（ｉｖ）ＤＥＡＥ−デキストランと複合体化した模擬処理アデノウイルス（１０
％ＭＰＥＧ５０００）を用いた場合の未処理マウスおよび免疫マウスにおける比
較感染性（化学発光，ＲＬＵ）アッセイの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 キャサリン・イー・オリオーダン アメリカ合衆国02130マサチューセッツ州 ジャマイカ・プレインズ、ホルブルック・ ストリート16番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 EA02 HA17 4B065 AA95X AA95Y AB01 AC20 BA01 BA14 BA30 CA44 4C076 AA19 BB11 CC27 CC29 CC31 CC41 EE23 FF68 GG21 4C084 AA13 MA56 NA05 NA07 ZC192 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 MA56 NA05 NA07 ZC19
Claims (22)
- 【請求項１】 カチオン性分子および少なくとも１種のポリアルカレングリ
コールポリマーが結合しているアデノウイルスの複合体を含むアデノウイルス複
合体。 - 【請求項２】 該ポリアルカレングリコールポリマーがポリエチレングリコ
ールである請求項１のアデノウイルス複合体。 - 【請求項３】 該ポリアルカレングリコールポリマーがメトキシポリエチレ
ングリコールである請求項１のアデノウイルス複合体。 - 【請求項４】 該ポリマーがポリメチル−エチレングリコール、ポリヒドロ
キシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリメチルプロ
ピレングリコールからなる群より選択されるものである請求項１のアデノウイル
ス複合体。 - 【請求項５】 該ポリエチレングリコールが２００ダルトンないし２０００
０ダルトンの平均分子量を有するものである請求項２のアデノウイルス複合体。 - 【請求項６】 該ポリエチレングリコールが２０００ダルトンないし１２０
００ダルトンの平均分子量を有するものである請求項５のアデノウイルス複合体
。 - 【請求項７】 該ポリエチレングリコールが約５０００ダルトンの平均分子
量を有するものである請求項６のアデノウイルス複合体。 - 【請求項８】 該アデノウイルスが組み換えアデノウイルスベクターである
請求項１のアデノウイルス複合体。 - 【請求項９】 該ウイルスが導入遺伝子を含む組み換えウイルスベクターで
ある請求項８のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１０】 該ポリアルカレングリコールポリマーが該ウイルス粒子に
直接共有結合している請求項１のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１１】 該ポリアルカレングリコールポリマーが介在カップリング
部分を介して該ウイルス粒子に間接的に共有結合している請求項１のアデノウイ
ルス複合体。 - 【請求項１２】 該ポリアルカレングリコールポリマーが該アデノウイルス
粒子に間接的に非共有結合している請求項１のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１３】 該ポリアルカレングリコールポリマーがリガンドによって
該ウイルス粒子に間接的に非共有結合している請求項１２のアデノウイルス複合
体。 - 【請求項１４】 該リガンドがウイルス表面成分に対して特異性を有するも
のである請求項１３のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１５】 該リガンドが抗体である請求項１４のアデノウイルス複合
体。 - 【請求項１６】 該抗体が非中和抗−アデノウイルス抗体である請求項１５
のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１７】 該非中和抗−ウイルス抗体が非中和抗−ヘキソン抗体であ
る請求項１６のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１８】 該アデノウイルスが、メトキシポリエチレングリコール−
トレシレート（ＴＭＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール−アセトアルデ
ヒド、塩化シアヌルで活性化されたメトキシポリエチレングリコール、Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ポリエチレ
ングリコール−Ｎ−サクシンイミドカーボネートならびにそれらの混合物からな
る群より選択される活性化ポリアルキレングリコールポリマーに結合したもので
ある請求項１記載のアデノウイルス複合体。 - 【請求項１９】 該カチオン性分子がカチオン性ポリマーである請求項１の
アデノウイルス複合体。 - 【請求項２０】 該カチオン性ポリマーがＤＥＡＥ−デキストランである請
求項１９のアデノウイルス複合体。 - 【請求項２１】 該カチオン性分子がカチオン性脂質である請求項１のアデ
ノウイルス複合体。 - 【請求項２２】 請求項１のアデノウイルス複合体および担体を含む組成物
。
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