JP2003522183A - ターゲッティングペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ターゲッティングペプチドに関し、更に具体的には、心臓および様々な腫瘍にターゲッティングするペプチド、並びにターゲッティングのためのそれらの使用に関する。本発明によれば、少なくとも１種類の治療薬、および少なくとも１個の本発明によるペプチドまたはこのようなペプチドをコードする核酸分子を含んでなる組成物、並びに遺伝子導入を目的とする薬剤の調製のためのその使用もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、新規ペプチド、更に具体的には、心臓および各種腫瘍細胞を優先的
に標的とすることができるペプチドを提供する。本発明は、このようなペプチド
と治療薬を含んでなる組成物にも関する。本発明は、特にヒトにおいて、遺伝子
治療を実施する上できわめて興味深いものである。

【０００２】 遺伝子治療は、細胞または生体に遺伝子材料を導入し、細胞の欠損または不全
を治療または予防することと定義することができる。ヒトの疾患の遺伝子治療に
よる治療の可能性は、２〜３年の間で理論的考察の段階から臨床的応用の段階へ
と移行した。ヒトに応用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（
ＡＤＡ）をコードする遺伝子に影響を与える突然変異の結果として遺伝的に免疫
不全となっている患者に対し、１９９０年９月にアメリカ合衆国で開始されたが
、この最初の実験の結果が比較的良好であったことにより、様々な先天性および
後天性の疾患に対して技術開発が促進された。

【０００３】 遺伝子治療を成功させるには、治療用遺伝子の生体の細胞への効率的送達およ
び遺伝情報の発現が必要となる。機能性遺伝子を様々な手法によって細胞に導入
することにより、一過性発現(一過性トランスフェクション)または宿主ゲノムへ
の組み込みを伴う宿主細胞の恒久的形質転換が可能となる。剥き出しにした核酸
(すなわち、プラスミドＤＮＡ)の直接注入も考えられるが(Wolff et al., Scien
ce 247 (1990) 1465-1468)、多くのプロトコールでは、目的の遺伝子を運ぶため
のベクターが使用される。これらのベクターは、２種類に分類することができる
。

【０００４】 第一の種類は、ウイルスベクター、特にアデノおよびレトロウイルスベクター
に関するものである。ウイルスは、細胞膜を通る輸送、リソソーム分解の回避、
そのゲノムの核への送達を行うための多様できわめて精巧な機構を備えており、
従って、多くの遺伝子送達用途に用いられている。それらの構造、組織および生
物学的性質は、当業者が入手できる文献に記載されている。

【０００５】 イン・ビボでの遺伝子導入に最も広く用いられているベクターの一つは、複製
欠損組換え型アデノウイルスベクターである。その利点としては、これを高力価
に増殖させることができ、多種多様なヒト細胞型に効率的に形質導入することが
できる点が挙げられる。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完成する
のに必要な約３０個を上回る遺伝子を有する約３６kbの線状二本鎖ＤＮＡ分子か
らなっている。初期遺伝子は、抗ウイルス性宿主免疫応答を調節すると考えられ
ているＥ３領域を除き、ウイルス複製に本質的な４領域(Ｅ１〜Ｅ４）に分けら
れる。後期遺伝子は、その大部分がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク
質をコードする。更に、アデノウイルスゲノムは、両端にシス作用性の５′およ
び３′ＩＴＲ(逆方向末端反復配列)とＤＮＡ複製に必須のパッケージング配列を
有する。遺伝子治療プロトコールに用いられるアデノウイルスベクターはＥ１の
ほとんどを欠いており、それらの複製およびその後の環境および宿主体内での伝
播を回避するようになっている。Ｅ３領域における欠失によって、クローニング
容量も増加する(総説としては、例えば、Yeh et al. FASEB Journal 11 (1997)
615-623を参照されたい)。現在、ＩＴＲとパッケージング配列を保持し、残存す
るウイルス抗原合成の廃止を目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第二世代ベク
ターが、形質導入した細胞での治療用遺伝子の長期発現を改良する目的で構築さ
れている(WO94/28152, Lusky et al. J. Virol 72 (1998) 2022-2032)。

【０００６】 アデノウイルスの感染の特異性は、許容性細胞表面に存在する細胞受容体への
ビリオンの結合によって決定される。これに関して、ウイルスキャプシドの表面
に存在する繊維が細胞への結合に重要な役割を果たしており(Defer et al. J. V
irol. 64 (1990) 3661-3673)、ペントン基部は細胞インテグリンへの結合を介す
るインターナリゼーションを促進する(Mathias et al. J. Virol. 68 (1994) 68
11-6814)。最近の研究は、アデノウイルス２型および５型によるコクサッキーウ
イルス受容体(CAR)の使用を前提としている(Bergelson et al ; Science 275 (1
997) 1320-1323)。しかしながら、他の表面タンパク質は、繊維結合、例えばHon
g et al.によって同定されているクラスＩの組織適合抗原のα２ドメインに関与
することがある(EMBO J. 16 (1997) 2294-2306)。繊維は３つの領域(Chroboczek
et al. Current Top. Microbiol. Immunol. 199 (1995) 165200)、すなわちペ
ントン基部と相互作用し且つキャプシドに確実に固定するタンパク質のＮ−末端
の尾、多数のβシート反復体からなるシャフト、および三量体化シグナル(Hong
et al. J. Virol. 70 (1996) 7071-7078)と受容体結合残基(Henri et al. J. Vi
rol. 68 (1994) 5239-5246 ; Louis et al. J. Virol. 68 (1994) 4104-4106)を
含むノブからなっている。

【０００７】 第二の種類は、合成ベクターに関するものである。脂質およびポリマーから誘
導された多数のものが、容易に入手可能である(総説としては、例えば、Rolland
, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 (1998) 143-198
を参照されたい)。ウイルス送達系よりも効率は劣るが、それらは、大規模生産
、安全性、低免疫原性、およびクローニング容量に関して潜在的な利点を有する
。更に、それらは、所望な成分を単に混合するだけで容易に改変することができ
る。

【０００８】 治療用遺伝子を特定の細胞に送達することができるウイルス性および合成遺伝
子治療ベクターのデザインは、今日の遺伝子治療研究における主要な関心事およ
び目標の一つである。ターゲッティングベクターを用いることによってベクター
の広まりが限定されるので、所望な標的細胞に対する治療効力が増加し、副作用
の可能性が最小限に抑えられる。ターゲッティングは、最初に細胞表面で適当な
アドレスを同定した後、ベクターがこのアドレスを認識することができるやり方
でベクターを修正することによって行うことができる。

【０００９】 細胞型または疾患によって影響を受けた細胞は独特な細胞表面マーカーを発現
することが示されている。例えば、速やかに増殖する腫瘍の内皮細胞は静止期の
内皮細胞には含まれていない細胞表面タンパク質、すなわちαｖインテグリン(B
rooks et al. Science 264 (1994) 569)、およびある種の血管形成増殖因子の受
容体(Hanahan Science 277 (1997) 48)を発現する。ファージ展示ライブラリー
選択法を用いて、これらの特定の細胞表面マーカーと相互作用するペプチド配列
を選択することができる(例えば、米国特許第５，６２２，６９９号明細書、米
国特許第５，２２３，４０９号明細書、および米国特許第５，４０３，４８４号
明細書を参照されたい)。この系では、ランダムペプチドが、相当するコード配
列をファージ表面タンパク質の１個をコードする遺伝子に融合することによって
ファージ表面で発現する。所望なファージは、単離した組織断片(エクス・ビボ
法)または培養細胞(イン・ビトロ法)のようなターゲットへのそれらの結合に基
づいて選択される。ターゲッティングペプチドの同定は、ファージライブラリー
をマウスに注射した後、結合ファージを標的設定した器官から取り戻すことによ
って行うイン・ビボ法によって行うこともできる。選択されたペプチドは、表示
されたペプチドをコードするゲノムファージ領域の配列決定によって同定される
。イン・ビボでの器官スクリーニングを応用して、脳および腎臓(Pasqualini et
al., Nature 380 (1996) 364-366)、肺、皮膚および膵臓の血管系(Rajotte et
al., J. Clin. Invest. 102 (1998) 430-437)、および数種類の腫瘍(Pasqualini
et al., Nature Biotechnology 15 (1997) 542-546)の選択的ファージホーミン
グを行うペプチド配列の単離に成功したことが報告されている。

【００１０】 更に、腫瘍を、血管系のみならず、細胞外マトリックス(ECM)または腫瘍細胞
自身を介しても標的設定することができた。血管は腫瘍では絶えず修正されてい
るので、内皮が局所的に破壊され、遺伝子治療ベクターが管外へ遊出してECMお
よび腫瘍細胞と相互作用する。ECMまたは腫瘍関連細胞表面マーカーと相互作用
するペプチドを、ファージ展示法を用いて選択することもできる(Christiano et
al. Cancer Geen Therapy 3 (1996) 4-10 ; Croce et al. Anticancer Res. 17
(1997) 4287-4292 ; Gottschalk et al. Gene Ther. 1 (1994) 185-191 ; Park
et al. Adv Pharmacol. 40 (1997) 399-435)。例えば、HWGFモチーフは、腫瘍
増殖、腫瘍起因性血管形成および転移に関与するマトリックスメタロプロテイナ
ーゼのリガンドとして同定された。腫瘍を有する動物モデルへペプチドを含んで
なるHWGFを投与すると、腫瘍増殖や侵襲が防止され、動物の生存寿命が長くなる
(Koivunen et al. Nature Biotechnology 17 (1999) 768-774)。

【００１１】 最近、Romanczuk et al. (Human Gene Therapy 10 (1999) 2615-2626)により
、分化した繊毛状気道上皮細胞をターゲッティングするペプチドを単離したこと
が報告されている。最良の結合ペプチドを二価ポリエチレングリコールを介して
組み換えアデノウイルスの表面へカップリングすることにより、組込まれたペプ
チドに依存する代替経路により標的細胞を形質導入することができるベクターが
得られている。

【００１２】 全部あわせても極めて少数の細胞型または疾患特異的表面マーカーしかこれま
でに報告されておらず、極めて少数のリガンドだけがこのようなマーカーと特異
的に相互作用することが知られている。従って、本発明における技術的課題は、
特定の細胞へ治療薬をターゲッティングするための改良された方法および手段を
提供することである。

【００１３】 この技術的課題は、特許請求の範囲に記載の態様を提供することによって解決
される。

【００１４】 従って、本発明は、 X₁THPRFATX₂、 X₁RTPFATYX₂、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂、 X₁QTSSPTPLSHTQX₂、 X₁PQTSTLLX₂、 X₁HLPTSSLFDTTHX₂、 X₁VHHLPRTX₂、 X₁QLHNHLPX₂、 X₁HSFDHLPAAALHX₂、 X₁YPSAPPQWLTNTX₂、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂、 X₁TYPSSTLX₂、 X₁NTLQVRGVYPSVX₂、 X₁YSNRTNTNSHWAX₂、 X₁PATNTSKX₂、 X₁HVNKLHGX₂、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂、 X₁NANKLWTWVSSPX₂、 X₁SGRIPYLX₂、 X₁NEDINDVSGRLSX₂、 X₁LSPQRASQRLYSX₂、 X₁SFSTSPQX₂、 X₁ERMDSPQX₂、 X₁HHGHSPTSPQVRX₂、 X₁GSSTGPQRLHVPX₂、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂、 X₁QRLTTLYX₂、 X₁WSPGQQRLHNSTX₂、 X₁WKSELPVQRARFX₂、 X₁SELPSMRLYTQPX₂、 X₁HSLHVHKGLSELX₂、 X₁SDLPVQLEPERQX₂、 X₁TRYLPVLPSLFPX₂、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂、 X₁WEPPVQSAWQLSX₂、 X₁HFTFPQQQPPRPX₂、 X₁GSTSRPQPPSTVX₂、 X₁NFSQPPSKHTRSX₂、 X₁QYPHKYTLQPPKX₂、 X₁FNQPPSWRVSNSX₂、 X₁SVSVGMKPSPRPX₂、 X₁STPRPPLGIPAQX₂、 X₁TQSPLNYRPALLX₂、 X₁AQSPTIKLTPSWX₂、 X₁HNLLTQSX₂、 X₁TLVQSPMX₂、 X₁NLNTDNYRQLRHX₂、 X₁FRPAVHNMPSLQX₂、 X₁ISRPAPISVDMKX₂、 X₁THRPSLPDSSRAX₂、 X₁ALHPLTHRHYATX₂、 X₁THRGPQSX₂、 X₁SFHMPSRAVSLSX₂、 X₁NQSNFTSRALLYX₂、 X₁SFPTHIDHHVSPX₂、 X₁LNGDPTHX₂、 X₁HMPHHVSNLQLHX₂、 X₁LPSVSPVLQVLGX₂、 X₁DAQQLYLSNWRSX₂、 X₁DSYLSSTLPGQLX₂、 X₁SPTPTSHQQLHSX₂、 X₁APPGNWRNYLMPX₂、 X₁LSNKMSQX₂、 X₁MHNVSDSNDSAIX₂、 X₁DNSNDLMX₂、 X₁TVMEAPRSAILIX₂、 X₁CNDIGWVRCX₂、 X₁CWPYPSHFCX₂、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂、 X₁WPTSPWLEREPAX₂、 X₁WPTSPWSSRDWSX₂、 X₁HEWSYLAPYPWFX₂、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂、 X₁CLPSTRWTCX₂、および X₁CWPMKSX₅FCX₂ (上記式中、それぞれのX₁およびX₂は、互いに独立してn個のアミノ酸からなる任
意のアミノ酸配列を表わし、nは０〜５０であり、nはX₁およびX₂において同一で
あるかまたは異なっており、X₃、X₄およびX₅は同一であるかまたは異なっており
、任意のアミノ酸を表わす) からなる群から選択されるペプチドに関する。好ましくは、X₅はロイシン(L)ま
たはグルタミン(Q)残基である。

【００１５】 これらのペプチドは、例えば、遺伝子治療ベクターを生体中の特定の標的に向
けるのに有用である。

【００１６】 本明細書で用いられる「ペプチド」および「アミノ酸」という用語は、当業者
によって普通に理解されているのと同じ意味を有するものである。好ましい態様
によれば、nはX₁およびX₂において互いに独立して０〜約１０個のアミノ酸であ
り、更に好ましくは、０〜約５個のアミノ酸の範囲である。本発明によるペプチ
ドは、合成的方法によって、または真核並びに原核細胞における組み換えＤＮＡ
技術による適当なＤＮＡ断片の発現によって新たに産生することができる。ある
いは、それらは、融合パートナーへ融合することによって産生することもできる
。融合パートナーがポリペプチドであるときには、融合体を、ペプチドを上記ポ
リペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または２個の残基の間に位置するようにデザ
インすることができる。

【００１７】 本発明によるペプチドは、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除、高性能液体
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニ
ティークロマトグラフィーなどの当技術分野で知られている手法によって精製す
ることができる。本発明の特定のペプチドを精製するのに用いる条件および手法
は、合成方法、および正味の電荷、疎水性、親水性のような因子によって異なる
が、当業者には明白であろう。

【００１８】 場合によっては、本発明のペプチドは、残基の置換または付加(すなわち、グ
リコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、ホスホリル化など)による１
個以上のアミノ酸残基の修飾を含むことがある。本発明の範囲内には、例えば、
アミノ酸の１個以上の類似体(天然に存在しないアミノ酸)を含むペプチド、置換
結合を有するペプチド、並びに天然に存在するおよび天然に存在しない当技術分
野で知られている他の修飾物が包含される。ペプチドは、直鎖状であることも、
またはペプチドの両端にシステインを配置することによって環化することもでき
る。本発明が追求する目的によれば、好ましい態様は、本発明のペプチドの以下
に記載する治療薬へのカップリング(すなわち、スルフヒドリル、アミン基など
の付加)を可能にし、または改良するものである。本発明は、本発明によるペプ
チドの類似体であって、少なくとも１個のアミノ酸が同様な特性を有する別のア
ミノ酸によって置換されているものも包含する。Atlas of Protein Sequence an
d Structure (1978, Vol. 5, ed. M.O. Dayhoff, National Biomedical Researc
h Foundation, Washington, D.C.)の図８４および８５のマトリックスは、互い
に置換し易い化学的に類似したアミノ酸の群、すなわち疎水性基、芳香族基、塩
基性基、酸、酸−アミド基、システイン、および他の親水性残基を示している。
類似体は、レトロまたは逆(inverso)ペプチドであってもよい(ＷＯ９５／２４９
１６号公報)。

【００１９】 本発明は、本発明のペプチドを検出可能にする修飾も考慮している。このため
には、本発明のペプチドを検出可能な残基(すなわち、シンチグラフィー、放射
性、蛍光または色素標識など)で修飾することができる。適当な放射性標識とし
てはＴｃ^９９ｍ、Ｉ^１２３およびＩｎ^１１１が挙げられるが、これらに限定され
ない。このような標識は、例えば、システイン残基を介するなどの既知の方法で
本発明のペプチドに接着することができる。他の手法は、他の場所で説明する。

【００２０】 本発明のペプチドは、様々な目的に用いることができる。

【００２１】 第一の好ましい他の態様(第二の態様)によれば、本発明のペプチドは、ターゲ
ッティングの目的に用いることができる。ターゲッティングは、ターゲッティン
グを行おうとする細胞を優先的に認識して結合する能力として定義される。「優
先的に」とは、本発明のペプチドが、標的細胞と比較して非標的細胞へはあまり
付着しないことを意味する。一般に、本発明の特定のペプチドは、このような細
胞の表面で発現し、または露出しているマーカー(すなわち、細胞表面マーカー
、受容体、組織適合抗原によって提供されるペプチド、腫瘍特異抗原など)を認
識し、結合する。本発明の範囲内では、特に、腫瘍細胞、特定の細胞型または一
種類の細胞をターゲッティングするのが有利なことがある。特定の細胞型の例と
しては、肝および心臓細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞の種類
としては、動脈硬化性プラーク、虚血領域、実質、ＥＣＭ、血管系、冠状動脈の
細胞が挙げられる。

【００２２】 第二の他の態様は、このようなペプチドが特異的に結合する細胞表面マーカー
の研究、単離および精製に関する使用である。もう一つの態様は、例えば、イン
・ビトロ並びにイン・ビボアッセイによりこのようなマーカーを示す標的細胞を
イメージするための診断目的に関するものである。従って、本発明の範囲は、標
的細胞を検出するための診断試薬であって、本発明によるペプチドとキャリヤー
を含んでなる上記試薬も包含する。好ましくは、ペプチドは検出可能な残基で修
飾され、キャリヤーは全身投与のためのものである。

【００２３】 最後に、本発明によるペプチドを、ヒトまたは動物体の治療を目的とする治療
並びに予防目的に用いることができる。本発明によるペプチドは、そのターゲッ
ティング特性の他に単独で治療効果(すなわち、血管形成抑制剤(angiostatic)、
メタロプロテイナーゼの阻害剤、細胞サイクル阻害剤、細胞増殖抑制、細胞傷害
性、エンドソーム減少、膜分解性、増殖誘導特性など)を有することがある(例え
ば、Koivunen et al. Nat. Biotech. 17 (1999) 768-774を参照されたい)。

【００２４】 第三の態様によれば、本発明は、心臓ターゲッティングのためのペプチドも提
供する。本発明による心臓ターゲッティングペプチドは７アミノ酸の最小サイズ
を有する。このようなペプチドは、いくつかの共通のアミノ酸モチーフの存在に
よって定義される様々なファミリーに分類することができる。一つのファミリー
におけるそれぞれのペプチドは、異なるアミノ酸環境においてではあるが、特定
のモチーフを含む。本発明は、特定のペプチドが、連続的であり、残基の伸張ま
たはオーバーラッピングによって分離することができる、１個より多くの選択さ
れたモチーフを含んでなる場合も包含する。X₁、X₂、X₃、X₄およびnは、上記で
定義したとおりである。

【００２５】 このようなペプチドは、心筋への特異的なターゲッティングに用いることがで
き、更に具体的には筋ジストロフィー、心臓病または冠状動脈心疾患に対して用
いることができる。このような心臓に特異的なペプチドを用いてターゲッティン
グされたベクターの全身送達により、侵襲性で煩雑な手術が必要となる冠状動脈
への局所送達が回避されると考えることができる。あるいは、このようなターゲ
ッティングペプチドの使用によって、局所投与後のベクターの広がりが制限され
る。

【００２６】 第一のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＴＨＰもしくは
ＦＡＴ、またはＴＨＰおよびＦＡＴを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＴＨＰおよびＦＡＴモチーフを両方とも含んでなり
、特にＴＨＰおよびＦＡＴモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によって分離さ
れていると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチ
ドは、配列： X₁THPRFATX₂、 X₁RTPFATYX₂、または X₁FHVNPTSPTHPLX₂ を有する。

【００２７】 第二のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフＱＴＳを含んでな
る心臓ターゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による心臓ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁QTSSPTPLSHTOX₂、または X₁ PQTSTLLX₂ を有する。

【００２８】 第三のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＬＰもしくは
ＳＬＦ、またはＨＬＰおよびＳＬＦを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＨＬＰおよびＳＬＦモチーフを両方とも含んでなり
、特にＨＬＰおよびＳＬＦモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によって分離さ
れていると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチ
ドは、配列： X₁HLPTSSLFDTTHX₂、 X₁VHHLPRTX₂、 X₁QLHNHLPX₂、 X₁HSFDHLPAAALHX₂、または X₁TRYLPVLPSLFPX₂ を有する。

【００２９】 第四のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＹＰＳもしくは
ＴＮＴ、またはＹＰＳおよびＴＮＴを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＹＰＳおよびＴＮＴモチーフを両方とも含んでなり
、特にＹＰＳおよびＴＮＴモチーフが３〜８個のアミノ酸によって分離されてい
ると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、
配列： X₁YPSAPPQWLTNTX₂、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂、 X₁TYPSSTLX₂、 X₁NTLQVRGVYPSVX₂、 X₁YSNRTNTNSHWAX₂、または X₁PATNTSKX₂ を有する。

【００３０】 第五のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＶＮもしくは
ＮＫＬ、またはＨＶＮおよびＮＫＬを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＨＶＮおよびＮＫＬモチーフを両方とも含んでなり
、特にＨＶＮおよびＮＫＬモチーフが重複していると有利である。好ましくは、
本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁HVNKLHGX₂、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂、または X₁NANKLWTWVSSPX₂ を有する。

【００３１】 第六のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフＳＧＲを含んでな
る心臓ターゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による心臓ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁SGRIPYLX₂、または X₁NEDINDVSGRLSX₂ を有する。

【００３２】 第七のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＰＱ、ＱＲＡ
、ＱＲＬもしくはＰＱＲ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる心臓ターゲ
ッティングペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフＳＰＱ、ＱＲＡ
およびＱＲＬを含んでなり、特にＳＰＱおよびＱＲＡモチーフが重複しており且
つ少なくとも１個のアミノ酸によってＱＲＬから分離されていると有利である。
好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁LSPQRASQRLYSX₂、 X₁SFSTSPQX₂、 X₁ERMDSPQX₂、 X₁WKSELPVQRARFX₂、 X₁HHGHSPTSPQVRX₂、 X₁GSSTGPQRLHVPX₂、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂、 X₁QRLTTLYX₂、または X₁WSPGQQRLHNSTX₂ を有する。

【００３３】 第八のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＥＬもしくは
ＰＶＱ、またはＳＥＬおよびＰＶＱを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＳＥＬおよびＰＶＱモチーフを両方とも含んでなり
、特に２個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による
心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁WKSELPVQRARFX₂、 X₁SELPSMRLYTQPX₂、 X₁HSLHVHKGLSELX₂、 X₁SDLPVQLEPERQX₂、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂、または X₁WEPPVQSAWQLSX₂ を有する。

【００３４】 第九のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＱＰＰもしくは
ＰＲＰ、またはＱＰＰおよびＰＲＰを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＱＰＰおよびＰＲＰモチーフを両方とも含んでなり
、特に２個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による
心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁HFTFPQQQPPRPX₂、 X₁GSTSRPQPPSTVX₂、 X₁NFSQPPSKHTRSX₂、 X₁QYPHKYTLQPPKX₂、 X₁FNQPPSWRVSNSX₂、 X₁SVSVGMKPSPRPX₂、または X₁STPRPPLGIPAQX₂ を有する。

【００３５】 本発明の心臓ターゲッティングペプチドは、更に、心臓血管系、特に内皮細胞
、および心筋細胞などの任意の心臓細胞へのターゲッティングを目的とするのが
有利である。

【００３６】 第四の態様によれば、本発明は腫瘍ターゲッティングペプチドを提供する。本
発明による腫瘍ターゲッティングペプチドは、最小サイズが７アミノ酸である。
このようなペプチドは、いくつかの共通のアミノ酸モチーフの存在によって定義
される様々なファミリーに分類することができる。一つのファミリーにおけるそ
れぞれのペプチドは、異なるアミノ酸環境においてではあるが、特定のモチーフ
を含む。本発明は、特定のペプチドが連続的であり、残基の伸張またはオーバー
ラッピングによって分離することができる１個より多くの選択されたモチーフを
含んでなる場合も包含する。X₁、X₂、およびnは、上記で定義したとおりである
。

【００３７】 これらのペプチドのプラスミド、ウイルスおよび合成ベクターへの結合により
、全身投与の後に、腫瘍転移または外科的には到達することが困難な腫瘍部位へ
のターゲッティングが可能になる。あるいは、ベクターの広がりを制限するとい
う利点を有する局所投与を考えることもできる。

【００３８】 第一のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＲＰＡ、ＮＹＲ
もしくはＱＳＰ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる腫瘍ターゲッティン
グペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフＲＰＡ、ＮＹＲおよびＱ
ＳＰを含んでなり、特にＱＳＰモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によってＮ
ＹＲモチーフから分離されており、ＮＹＲおよびＲＰＡモチーフが重複している
と有利である。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプチドは、配
列： X₁TQSPLNYRPALLX₂、 X₁AQSPTIKLTPSWX₂、 X₁TLVQSPMX₂、 X₁NLNTDNYRQLRHX₂、 X₁FRPAVHNMPSLQX₂、または X₁1SRPAPISVDMKX₂ を有する。

【００３９】 第二のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＴＨＲもしくは
ＳＲＡ、またはＴＨＲおよびＳＲＡを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、これら２個のモチーフを両方とも含んでなり、特に
ＴＨＲおよびＳＲＡモチーフが４〜８個のアミノ酸によって分離されていると有
利である。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプチドは、配列： X₁THRPSLPDSSRAX₂、 X₁ALHPLTHRHYATX₂、 X₁THRGPQSX₂、 X₁SFHMPSRAVSLSX₂、または X₁NQSNFTSRALLYX₂ を有する。

【００４０】 第三のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＰＴＨ、ＶＳＰ
、もしくは四アミノ酸モチーフＨＨＶＳ、またはそれらの任意の組合せを含んで
なる腫瘍ターゲッティングペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフ
ＰＴＨ、ＨＨＶＳおよびＶＳＰを含んでなり、特にＰＴＨモチーフが少なくとも
１個のアミノ酸によってＨＨＶＳモチーフから分離されており且つＨＨＶＳおよ
びＶＳＰモチーフが重複していると有利である。好ましくは、本発明による腫瘍
ターゲットペプチドは、配列： X₁SFPTHIDHHVSPX₂、 X₁LNGDPTHX₂、 X₁HMPHHVSNLQLHX₂、または X₁LPSVSPVLQVLGX₂ を有する。

【００４１】 第四のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＹＬＳもしくは
ＱＱＬ、またはＹＬＳおよびＱＱＬを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＹＬＳおよびＱＱＬを両方とも含んでなり、特に２
個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による腫瘍ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁DAQQLYLSNWRSX₂、 X₁DSYLSSTLPGQLX₂ または X₁SPTPTSHQQLHSX₂ を有する。

【００４２】 第五のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＮＤもしくは
ＳＡＩ、またはＳＮＤおよびＳＡＩを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、これらのモチーフを両方とも含んでなり、特にＳＮ
ＤおよびＳＡＩモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明によ
る腫瘍ターゲッティングペプチドは、配列： X₁MHNVSDSNDSAIX₂、 X₁DNSNDLMX₂、または X₁TVMEAPRSAILIX₂ を有する。

【００４３】 第六のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＮＤＩ、ＷＰＹ
、ＭＰＬ、ＰＳＨ、ＬＰＱ、ＷＰＶもしくはＷＰＴ、またはそれらの任意の組合
せを含んでなる腫瘍-ターゲッティングペプチドに関する。具体的態様によれば
、上記第六のファミリーは、少なくとも１個のアミノ酸モチーフＷＰＸ_３Ｘ_４Ｐ
Ｗを含んでなる上記ペプチドであって、Ｘ_３およびＸ_４が同一であるかまたは異
なっており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＶまたはＴで
あり、および／またはＸ_４はＲまたはＳであるものに関する。もう一つの具体的
態様では、上記ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸モチーフＷＰＴＳＰＷＸ _３ Ｘ_４ＲＸ_５を含んでなり、Ｘ_３、Ｘ_４およびＸ_５は同一であるかまたは異なっ
ており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＬまたはＳであり
、および／またはＸ_４はＥまたはＳであり、および／またはＸ_５はＥまたはＤで
ある。もう一つの具体的態様では、上記ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸
モチーフＷＰＸ_３Ｘ_４ＳＸ_５を含んでなり、Ｘ_３、Ｘ_４およびＸ_５は同一である
かまたは異なっており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＹ
またはＭであり、および／またはＸ_４はＰまたはＫであり、および／またはＸ_５ はＬ、ＱまたはＨである。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプ
チドは、配列： X₁CNDIGWVRCX₂、 X₁CWPYPSHFCX₂、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂、 X₁WPTSPWLEREPAX₂、または X₁WPTSPWSSRDWSX₂ を有する。

【００４４】 第七のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＥＷ、ＱＩＤ
、ＷＰＭもしくはＣＬＰ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる腫瘍-ター
ゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティン
グペプチドは、配列： X₁HEWSYLAPYPWFX₂、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂、 X₁CLPSTRWTCX₂、または X₁CWPMKSX₅FCX₂ を有し、好ましくは、Ｘ_５はロイシン(L)またはグルタミン(Q)残基である。

【００４５】 本発明の腫瘍ターゲッティングペプチドは、腫瘍細胞、転移または腫瘍血管系
に対する治療薬のターゲッティングに用いることができる点で有利である。

【００４６】 第五の態様によれば、本発明は、本発明による少なくとも１個のペプチドと少
なくとも１種類の治療薬、あるいは本発明によるペプチドをコードする少なくと
も１個の核酸分子と少なくとも１種類の治療薬を含んでなる組成物を提供する。

【００４７】 本明細書で用いられる「治療薬」は、薬剤(すなわち、細胞傷害性薬剤)の様な
有機化学薬剤、変異体、または修飾ペプチドもしくはペプチド様分子などのペプ
チド、タンパク質、抗体もしくはその断片、例えばＦａｂ（ａｂは抗原結合を示
す）、Ｆ（ａｂ′)２、Ｆｃ（ｃは結晶化可能であることを示す）、またはｓｃ
Ｆｖ（ｓｃは一本鎖を示し、ｖは可変を示す）を広義に意味するのに用いられる
。抗体断片は、免疫学マニュアル(例えば、Immunology, 第三版1993, Roitt, Br
ostoff and Male, ed Garnbli, Mosby)に詳細に記載されている。多種多様な起
源の配列に由来するキメラ抗体またはタンパク質を用いることもできる。一例と
しては、ヒト化抗体は、マウス抗体の可変領域の一部とヒト免疫グロブリンの定
常領域が結合している。本発明においては、タンパク質は、更に好ましくはＢ７
．１、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ、ＣＤ４、ＣＤ８などのような免疫刺激タ
ンパク質である。治療薬は、核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、アンチセン
スまたはセンス、オリゴヌクレオチド、二本鎖または一本鎖、環状または線状な
どであることもできる。

【００４８】 好ましい態様では、治療薬は、少なくとも１個の治療用遺伝子または目的の遺
伝子を脊椎動物の標的細胞に送達するためのベクターである。本発明においては
、これはプラスミド、合成(非ウイルス性)ベクター、またはウイルス性ベクター
であることができる。

【００４９】 プラスミドは、所定の細胞で自律複製が可能な染色体外環状ＤＮＡを表す。プ
ラスミドの選択範囲は極めて大きい。これは、好ましくは細菌で増幅され且つ真
核宿主細胞で発現するようにデザインされる。このようなプラスミドは、様々な
製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、pBR322 (Gibc
o BRL)、pUC (Gibco BRL)、pBluescript (Stratagene)、pREP4、pCEP4 (Invitro
gene)、pCI (Promega)、およびpPoly (Lathe et al., Gene 57 (1987), 193-201
)に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。分子生物学の手法(Sa
mbrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor (1989), NY)によって、このようなプラスミドを設計するこ
ともできる。プラスミドは、トランスフェクション細胞(例えば、細胞栄養要求
性、抗生物質の相補性による)、安定化要素(例えば、cer sequence; Summers an
d Sherrat, Cell 36 (1984), 1097-1103)、または組込型要素(例えば、ＬＴＲウ
イルス配列)を選択し、または同定するための選択遺伝子を含んでなることもあ
る。

【００５０】 ベクターはウイルス起源のものでもよく、ヘルペスウイルス、サイトメガロウ
イルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス)
、ポックスウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスのような様々なウ
イルスから誘導することができる。このようなウイルスベクターは、当技術分野
で周知である。本発明に用いられる「ウイルスベクター」という用語は、ベクタ
ーゲノム、ウイルス粒子(すなわち、ウイルスゲノムを含むウイルスキャプシド)
、並びに空のウイルスキャプシドを包含する。

【００５１】 本発明に特に適当なウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである(総
説としては、例えばHitt et al. 薬理学の進歩(Advances in Pharmacology) (19
97) 137-206を参照されたい)。一つの態様では、アデノウイルスベクターは条件
的に複製性となるように設計され(ＣＲＡｄベクター)、Heise and Kirn (2000,
J. Clin. Invest. 105, 847-851)に記載されているように、特定の細胞(例えば
、増殖細胞)で選択的に複製する。第二の好ましい他の態様によれば、これは、
特にそれぞれの領域の完全な、または部分的欠失によりＥ１機能について複製欠
損性である。Ｅ１欠失は、参照番号Ｍ７３２６０でGenebankデーターベースに開
示されているヒトアデノウイルス５型の配列における、ヌクレオチド(nt)４５８
〜３５１０をカバーすると有利である。更に、このベクターのアデノウイルス主
鎖は、１個以上のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異のような、さらな
る修飾を含んでなることができる。Ｅ２修飾の一例は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タン
パク質)コード遺伝子上に配置された感熱性突然変異によって示される(Ensinger
et al., J. Virol. 10 (1972), 328-339)。アデノウイルス配列は、Ｅ３領域の
全部または一部を欠失することもできる。ＯＲＦ３および４またはＯＲＦ３およ
び６／７を保持している部分欠失が有利であることがある(例えば、欧州特許出
願ＥＰ９８４０１７２２．８号明細書を参照されたい)。更に、本発明で用いら
れるアデノウイルスベクターは、Ｅ３領域の全部または一部を欠失することがで
きる。これに関して、ポリペプチドをコードするＥ３配列を保持し、宿主免疫系
を回避することが興味深いことがある(Gooding et al., Critical Review of Im
munology 10 (1990), 53-71)。すべての初期および後期領域に欠損のあるアデノ
ウイルスベクターを考えることもできる。

【００５２】 本発明で用いられるアデノウイルスベクターは、ヒトまたは動物のアデノウイ
ルスゲノム、特にイヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルの
アデノウイルス、あるいはそれらの雑種から誘導することができる。任意の血清
型を用いることができる。特に、イヌＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２アデノウイル
ス(それぞれ、Genbank参照番号CAVlGENOMおよびCAV77082)、トリアデノウイルス
(Genbank参照番号AAVEDSDNA)、マウスアデノウイルス(Genbank参照番号ADRMUSMA
V1)、およびウシＢＡＶ３(Seshidhar Reddy et al. J. Virol. 72 (1998) 1394-
1402)を挙げることができる。しかしながら、サブグループＣのヒトアデノウイ
ルスが好ましく、特にアデノウイルス２(Ａｄ２)および５(Ａｄ５)が好ましい。
一般的に言えば、上記ウイルスはＡＴＣＣのようなコレクションで入手可能であ
り、また、多数の刊行物の主題とされ、それらの配列、構成および生物学的性質
が記載されており、当業者が実施できるようになっている。

【００５３】 組み換えアデノウイルスベクターを包装して、標的細胞に感染し且つ治療用遺
伝子を形質導入することができる感染性ビリオンを構成する。感染性のアデノウ
イルス粒子は、当技術分野の任意の常法に従って調製することができる(例えば
、Graham and Prevect, 分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology), Vo
l 7 (1991), 遺伝子導入および発現プロトコール(Gene Transfer and Expressio
n Protocols); Ed E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJに記載の
２９３細胞株における適当なアデノウイルス断片の同時トランスフェクション;
ＷＯ９６／１７０７０号明細書に記載の騒動組み換え)。欠陥ビリオンは、通常
は相補細胞株中、または非機能性ウイルス遺伝子をイントランス(in trans)で供
給するヘルパーウイルスを介して増殖する。細胞株２９３は、Ｅ１機能を補完す
るのに通常用いられる(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59-72)。他
の細胞株は、二重欠陥ベクターを補完する目的で設計されている(Yeh et al. J.
Virol. 70 (1996), 559-565 ; Krougliak and Graham, Human Gene Ther. 6 (1
995), 1575-1586 ; Wang et al., Gene Ther. 2 (1995), 775-783 ; Lusky et a
l., J. Virol. 72 (1998), 2022-2033; ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷ
Ｏ９７／０４１１９号明細書)。感染性ウイルス粒子は培養上清から回収するこ
とができるが、リーシス後に細胞から回収することもでき、場合によっては標準
的手法(クロマトグラフィー、塩化セシウムグラディエントにおける超遠心など)
によって更に精製することもできる。

【００５４】 更に、アデノウイルスビリオンまたは空のアデノウイルスキャプシドを用いて
、米国特許第５，９２８，９４４号明細書に記載のウイルス依存性同時インター
ナリゼーションによって核酸(すなわち、プラスミドベクター)を導入することも
できる。この方法は、ポリカルベン、または１以上の脂質層を含んでなるリポプ
レックス小胞のような(複数の)カチオン性薬剤の存在下で行うことができる。

【００５５】 レトロウイルスベクターも適当である。文献に記載の多数のベクターを本発明
の範囲内で用いることができ、特にネズミ白血病ウイルス (すなわち、Moloney
またはFriend'sウイルス)由来のものを用いることができる。一般に、レトロウ
イルスベクターはウイルス遺伝子であるgag、polおよびenvの全部または一部を
欠失しており、５′ＬＴＲ、キャプシド化配列、および３′ＬＴＲを含んでなる
。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性
を増加させることができる。治療用遺伝子は、好ましくはキャプシド化配列の下
流に挿入される。このようなベクターの増殖には、先行技術に記載されている相
補ラインを使用する必要がある。

【００５６】 ポックスウイルスベクターは、例えばカナリヤポックス、トリポックスまたは
ワクシニアウイルスのようなトリポックスウイルスから誘導することができ、後
者が好ましい。本発明の範囲内にあると考えることができるすべてのワクシニア
ウイルスの中では、Copenhagen株、Wyeth株および改変Ankara(ＭＶＡ)株が好ま
しく選択される。治療用遺伝子を発現することができるワクシニアウイルスを得
るための一般的条件は、欧州特許第ＥＰ８３２８６号明細書および欧州特許出願
第２０６９２０号明細書に開示されている。ＭＶＡウイルスは、Mayr et al. (I
nfection 3 (1975) 6-14)およびSutter and Moss (Proc. NatI. Acad. Sci. USA
89 (1992) 1084710851)に更に詳細に記載されている。

【００５７】 もう一つの他の態様によれば、治療薬は、例えばリポプレックスのような標的
細胞に治療用遺伝子を送達することができる非ウイルス性(合成)ベクターも指す
。リポプレックスは、核酸に高い親和性を有し且つ細胞膜と相互作用するカチオ
ン性脂質を含むことがある(Feigner et al. Nature 337 (1989) 387-388)。その
結果、核酸と複合体形成し、従って、細胞に入ることができるコンパクトな粒子
を生成することができる。多くの研究室では、様々なリポプレックスをすでに開
示している。例えば、ＤＯＴＭＡ(Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳまたはTransfectam(商品名)(Behr et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲ
ＩＥ(Feigner et al., Methods 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao and Hu
ang, BBRC 179 (1991), 280-285)、ＤＯＴＡＰ(商品名)(McLachlan et al., Gen
e Therapy 2 (1995), 674-622)、Lipofectamine(商品名)およびグリセロ脂質化
合物(ＷＯ９８／３４９１０号明細書およびＷＯ９８／３７９１６号明細書を参
照されたい)。

【００５８】 ポリアミドアミン(Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372-
379)、樹枝状ポリマー(ＷＯ９５２４２２１号明細書)、ポリエチレンイミンまた
はポリプロピレンイミン(ＷＯ９６／０２６５５号明細書)、ポリリシン(ＵＳ−
Ａ−５５９５８９７号明細書またはＦＲ２７１９３１６号明細書)、キトサン(米
国特許第５，７４４，１６６号明細書)、またはＤＥＡＥデキストラン(Lopata e
t al. Nucleic Acid Res. 12 (1984) 5707-5717)のようなカチオン性ポリマーに
基づいた他のウイルス以外の(合成)ベクターが開発されている。

【００５９】 「治療用遺伝子」または「目的の遺伝子」という用語は、核酸(ＤＮＡ、ＲＮ
Ａまたは他のポリヌクレオチド誘導体)を表す。これは、例えば、アンチセンス
ＲＮＡ、リボザイムまたはポリペプチドに翻訳されるメッセンジャー(ｍＲＮＡ)
をコードすることができる。これは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは混合型(ミ
ニ遺伝子)を包含する。これは、成熟ポリペプチド、前駆体(例えば、分泌を行う
ためのシグナル配列を含んでなる前駆体、またはタンパク質分解開裂によって更
に処理される前駆体など)、切頭ポリペプチド、またはキメラポリペプチドをコ
ードすることができる。遺伝子は、分子生物学の常法(ＰＣＲ、適当なプローブ
を用いるクローニング、化学合成)によって任意の生物または細胞から単離する
ことができ、必要な場合には、その配列を突然変異誘発、ＰＣＲまたは任意の他
のプロトコールによって修飾することができる。

【００６０】 下記の遺伝子が特に興味深い。例えば、サイトカイン(α、β、またはγイン
ターフェロン、インターロイキン(ＩＬ)、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０
、またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ）、コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ
、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど)、免疫刺激ポリペプチド(Ｂ７．１、Ｂ７．２、
ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭなど)、細胞または核受容体、受容体リガ
ンド(ｆａｓリガンド)、凝固因子(ＦVIII、ＦIXなど)、増殖因子(トランスフォ
ーミング増殖因子ＴＧＦ、繊維芽増殖因子ＦＧＦなど)、酵素(ウレアーゼ、レニ
ン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼＮＯＳ、ＳＯＤ、
カタラーゼなど)、酵素阻害剤(α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII
、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１
）、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、クラスIまたはIIのＭ
ＨＣ抗原(主要組織適合遺伝子複合体)、または細胞遺伝子の発現を調節／制御す
ることができるポリペプチド、細菌、寄生生物またはウイルス感染、またはその
発達を阻害することができるポリペプチド(抗原ポリペプチド、抗原エピトープ
、競合によって本来のタンパク質の作用を阻害するトランスドミナント(transdo
minant)変異体など)、アポトーシスインデューサーまたは阻害剤(Ｂａｘ、Ｂｃ
ｌ２、ＢｃｌＸなど)、細胞分裂抑制剤(ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂなど)、アポリポ
タンパク質(ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡIV、ＡｐｏＥなど)、血管新生阻害剤(アンギ
オスタチン、エンドスタチンなど)、血管新生ポリペプチド(血管内皮細胞増殖因
子ＶＥＧＦのファミリー、ＦＧＦファミリー、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１およびＮｏ
ｖなどのＣＣＮファミリー）、酸素ラジカルスカベンジャー、抗腫瘍効果を有す
るポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、およびマーカー(β−ガラクトシダー
ゼ、ルシフェラーゼなど)をコードする遺伝子、または臨床症状の治療または予
防に有用であることが当技術分野で確認されている目的とする任意の他の遺伝子
が挙げられる。

【００６１】 遺伝的機能障害を考慮して、欠陥遺伝子の機能的対立遺伝子、例えば、血友病
ＡまたはＢに関して第VIIIまたはIX因子をコードする遺伝子、筋疾患に関してジ
ストロフィン(またはミニジストロフィン)、糖尿病に関してインスリン、嚢胞性
繊維症に関してＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質)を用いることが
できる。適当な抗腫瘍遺伝子としては、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、細胞
傷害性生成物、例えば単純ヘルペス１型ウイルス(ＴＫ−ＨＳＶ−１）、リシン
、細菌毒素、ＵＰＲＴアーゼ(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)、お
よびＣＤアーゼ(シトシンデアミナーゼ)活性を有する酵母遺伝子ＦＣＹ１および
／またはＦＵＲ１の発現生成物、抗体、細胞分裂または形質導入シグナルを阻害
するポリペプチド、腫瘍抑制遺伝子(ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３など)、ポリペプチド
活性化宿主免疫系、腫瘍関連抗原(ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ初期およ
び／または後期抗原(Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２など)をコードするものが、場合に
よってはサイトカイン遺伝子と組み合わせて挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００６２】 治療用遺伝子は、適当なプロモーターを含む機能発現カセットとして設計する
ことができる。後者は、任意のウイルス、原核、例えば細菌、または真核遺伝子
から得ることができ、構成的または調節可能であることができる。場合によって
は、これを修飾して、その転写活性を改良し、ネガティブ配列を欠失し、その調
節を変更し、適当な制限部位などを導入することができる。適当なプロモーター
としては、アデノウイルスＥ１ａ、ＭＬＰ、ＰＧＫ（ホスホグリセロキナーゼ;
Adra et al. Gene 60(1987) 65-74; Hitzman et al. Science 219(1983) 620-62
5)、ＭＴ(メタロチオネイン; Mc Ivor et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 838
-848)、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、界面活性剤、免疫グロブリン、β
−アクチン(Tabin et al., Mol. Cell Biol. 2(1982), 426-436)、ＳＲα(Takeb
e et al., Mol. Cell. Biol. 8(1988), 466-472)、初期ＳＶ４０(サルウイルス)
、ＲＳＶ(ラウス肉腫ウイルス) ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１、ＳＭ２２（ＷＯ９
７／３８９７４号明細書)、デスミン(ＷＯ９６／２６２８４号明細書)、および
初期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス; Boshart et al. Cell 41(1985) 521)が挙
げられるが、これらに限定されない。あるいは、腫瘍細胞で活性なプロモーター
を用いることができる。適当な例としては、乳癌および前立腺癌で過剰発現した
ＭＵＣ−１遺伝子(Chen et al., J. Clin. Invest. 96(1995), 2775-2782)、結
腸癌で過剰発現したＣＥＡ(癌胎児性抗原)(Schrewe et al., Mol. Cell. Biol.
10(1990), 2738-2748)、黒色腫で過剰発現したチロシナーゼ(Vile et al., Canc
er Res. 53(1993), 3860-3864)、乳癌および膵臓癌で過剰発現したＥｒｂＢ−２
(Harris et al., Gene Therapy 1(1994), 170-175)、および肝臓癌で過剰発現し
たα−フェトプロテイン(Kanai et al., Cancer Res. 57(1997), 461-465)から
単離されたプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。初期ＣＭＶプ
ロモーターが、本発明において好ましい。

【００６３】 発現カセットは、更に追加の機能的要素、例えば(複数の)イントロン、分泌シ
グナル、核局在化シグナル、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配列、トリパルタイトリ
ーダー配列、および複製起点を含むこともできる。

【００６４】 本発明で用いられるベクターは、１個以上の目的の遺伝子を含んでなることが
できる。異なる遺伝子が同一カセットまたは異なるカセットに含まれ、従って別
々の制御要素によって制御することができる。カセットは、同一または反対方向
でベクター内の様々な部位に挿入することができる。もう一つの別態様によれば
、異なる遺伝子を異なるベクター上に置くことができる。

【００６５】 場合によっては、本発明で用いられる治療薬を、脂質(すなわち、ＷＯ９８／
４４１４３号明細書に記載されているようなカチオン性脂質、リポソーム)、ヌ
クレアーゼ阻害剤、ポリマー、キレート化剤と関連させて、ヒト／動物体内での
分解を防止することができる。

【００６６】 好ましい態様によれば、本発明のペプチドは治療薬に機能しうる形でカップリ
ングさせる。「機能しうる形でカップリングさせる」とは、上記要素が意図した
やり方(すなわち、ペプチドが、治療薬の所望な細胞へのターゲッティングを促
進する)で機能できる関係にあることを意味する。カップリングは、当業者に周
知であり且つ共有的、非共有的、または遺伝学的手段を含む様々な手段によって
作成することができる。

【００６７】 治療薬の表面へのペプチドの共有接着は、治療薬の反応性官能基を介して、場
合によっては架橋剤または他の活性剤を中間使用することによって行うことがで
きる(例えば、Bioconjugate techniques 1996; G Hermanson監修; Academic Pre
ssを参照されたい)。治療薬の官能基は、ペプチドの特異的アミノ酸基に反応す
るように修飾することができる。特に、カップリングは、(i)ホモ二官能性また
は(ii)ヘテロ二官能性架橋試薬、(iii) カルボジイミドを用いて、(iv)還元的ア
ミノ化によって、または(vi)カルボキシレートの活性化によって行うことができ
る。

【００６８】 グルタルアルデヒドおよびＤＭＳ（ジメチルサブエリミデート)などのホモ二
官能性架橋剤を用いて、ペプチドのアミン基をホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）残基のようなジアシルアミンを含むリポプレックスにカップリングする
ことができる。他の例は、Bioconjugate techniques (1996) 188-228 ; G Herma
nson監修; Academic Press)に記載されている。

【００６９】 多くのヘテロ二官能性架橋剤、特にアミン反応性であり且つスルフヒドリル反
応性基、カルボニル反応性であり且つスルフヒドリル反応性基、およびスルフヒ
ドリル反応性基を有する架橋剤、および光反応性架橋剤を本発明に用いることが
できる。適当なヘテロ二官能性架橋剤は、Bioconjugate techniques (1996) 229
-285; G Hermanson監修; Academic Press)およびＷＯ９９／４０２１４号明細書
に記載されている。第一の範疇の例としては、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル
＝３−（２−ピリジルジチオ)プロピオネート)、ＳＭＢＰ（スクシンイミジル−
４−（ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキ
シカルボニル−α−メチル−（α−２−ピリジルジチオ)トルエン)、ＭＢＳ（ｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、ＳＩＡＢ
（Ｎ−スクシンイミジル＝（４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート)、ＧＭＢ
Ｓ（γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル)、ＳＩＡＸ（スク
シンイミジル−６−ヨードアセチルアミノヘキサノエート、ＳＩＡＣ（スクシン
イミジル−４−ヨードアセチルアミノメチル)、ＮＰＩＡ（ｐ−ニトロフェニル
ヨードアセテート)が挙げられるが、これらに限定されない。第二の範疇は、ス
ルフヒドリル反応性基に炭水化物含有分子をカップリングするのに有用である。
例としては、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジン、
およびＰＤＰＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキ
シル−ヒドラジン(Ｍ２Ｃ２Ｈおよび３−２（２−ピリジルジチオ)プロピオニル
ヒドラジン)が挙げられる。第三の範疇の例としては、ＡＳＩＢ（１−（ｐ−ア
ジドサリチルアミド)−４−（ヨードアセタミド)ブチレート)が挙げられる。も
う一つの代替物としては、Frisch et al. (Bioconjugate Chem. 7(1996) 180-18
6)に記載のチオール反応性試薬が挙げられる。

【００７０】 カップリング(iii)は、例えば、タンパク質上のカルボキシレート基とのカル
ボジイミド反応に関与することができるリポプレックスに含まれる誘導体形成さ
れていないＰＥのアミン基を含む。

【００７１】 カップリング(iv)は、例えば、イミン形成の後、シアノボロハイドレートを用
いて還元することによって行うことができる。

【００７２】 カップリング(vi)は、例えば、リポプレックスとペプチドアミン基のＮＨＳエ
ステル誘導体を含み、安定なアミド結合を生成することができる。

【００７３】 もう一つの例は、スルフヒドリル基とスルフヒドリル反応性基を含むマレイミ
ド−スルフヒドリル結合を用いる。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル＝
Ｓ−アセチルチオアセテート)を用いてスルフヒドリル基を導入することができ
、スルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル＝４−（Ｎ−マレイミドメチル)シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート)を用いて、マレイミド基を導入し、チオ
エーテル共有結合を生じることができる。

【００７４】 もう一つの好ましいリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそ
の誘導体のようなポリマーである。好ましくは、このようなポリマーは平均分子
量が２００〜２００００Ｄａである。例えば、トレシル−ＭＰＥＧを用いて、Ｌ
ｙｓ残基上に存在するεアミノ基をカップリングすることができる(例えば、Ｗ
Ｏ９９／４０２１４号明細書を参照されたい。２個のパートナーをＰＥＧを介し
て接合する他の手段は、文献に記載されている(Bioconjugate Techniques (1996
) 606-618; G Hermanson監修; Academic Press、およびFrisch et al. Bioconju
gate Chem. 7(1996) 180-186)。

【００７５】 非共有カップリングとしては、静電的相互作用、例えば、カチオン性ペプチド
と負に帯電したプラスミドまたはウイルスベクターとの、またはアニオン性ペプ
チドとカチオン性の合成ベクターとの相互作用が挙げられる。もう一つの代替カ
ップリングは、プロテインＡ、ビオチン／アビジン、抗体であって、非共有的に
、または親和性によって、一方では本発明のペプチドと他方では治療薬会合する
ことができるような親和性成分の使用にある。リポプレックスに関して、ビオチ
ン化ＰＥ誘導体を用いて、アビジンペプチド接合体または他のビオチニル化ペプ
チドと、架橋分子としてアビジンを用いて、非共有的に相互作用させることがで
きる(Bioconjugate techniques (1996) 570-591; G Hermanson監修; Academic P
ress)。ウイルスベクターとのカップリングは、キャプシドエピトープに対する
ビオチニル化抗体および本発明のペプチドに対するストレプトアビジンで標識し
た抗体を用いることができる(Roux et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(198
9) 9079)。

【００７６】 プラスミドベクターとの共有カップリングは、アルキル化剤を用いることがで
きる(Sebestyen et al. Nat. Biotechnol. 16(1998) 80-85; Ciolina et al. Bi
oconjug. Chem. 10(1999) 49-55; Zanta et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
6(1999) 91-96)。非共有カップリングは、ＰＮＡ（ペプチド核酸)またはトリプ
ルへリックスを用いて(Neves et al. Cell Biol. Toxicol. 15(1999) 193-202;
Neves et al. FEBS Lett. 453(1999) 41-45)、またはＷＯ９７／０２８４０号明
細書に記載の抗ＤＮＡ免疫グロブリンまたはポリリシンのようなポリカチオン性
化合物などの核酸と相互作用する任意のカップリング剤によって行うことができ
る。カップリングパートナーのそれぞれに対する二官能性抗体も、この目的に適
する。

【００７７】 遺伝子カップリングは、更に詳細には、本発明によるペプチドとウイルスベク
ターをカップリングしようとするものである。好都合には、このようなペプチド
をコードする核酸を、ウイルス表面に露出したポリペプチドをコードする本来の
ウイルス配列に加えてまたはの代わりに挿入し、ウイルス粒子の表面に本発明の
ペプチドを発現させることができる。挿入部位は、ウイルスの完全性には本質的
でない領域を同定するための三次元データーに基づいて選択することができる。
適当な表面に露出したポリペプチドとしては、レトロウイルスベクターのエンベ
ロープタンパク質、およびアデノウイルスキャプシドタンパク質、例えば、繊維
、ヘキソン、およびペントン塩基が挙げられる。本発明に関しては、繊維遺伝子
への挿入が好ましい(Herisse et al; Nucleic Acid Res. 9(1981) 4023-4042に
記載のＡｄ２繊維遺伝子、Chroboczek et al. Virol. 161(1987) 549554に記載
のＡｄ５繊維遺伝子)。好ましくは、適正な三量体化およびペントン塩基複合体
と会合させる配列は保存されるが、ＣＡＲ結合部位をコードする配列は変更され
る(Roelvink et al. Science 286(1999) 1568-1571)。ノブドメインの様々なル
ープ、更に具体的にはＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨおよびＩＪループ、またはＳＴＯ
Ｐコドンのすぐ上流への挿入が考えられる。適当な場所の例は、ＷＯ９４／１０
３２３号明細書、ＷＯ９５／２６４１２号明細書、ＷＯ９５／０５２０１号明細
書、ＷＯ９６／２６２８１号明細書、ＷＯ９８／４４１２１号明細書、およびＦ
Ｒ９９１０８５９号明細書に例示されている。配列をコードするペントン塩基へ
のＤＮＡをコードするペプチドの導入は、ＷＯ９６／０７７３４号明細書および
ＵＳ５，５５９，０９９号明細書に記載の通りに行うことができる。

【００７８】 あるいは、本発明のペプチドと治療薬とのカップリングは、生体中でターゲッ
ティングを行い細胞の部位で行うことができる。このような態様によれば、非共
有カップリングが好ましい。例えば、生体または標的細胞に(i)第一のアフィニ
ティー成分(例えば、ビオチン)と会合した本発明によるペプチド、および(ii)第
一の成分(例えば、ビオチン)を結合することができる第二のアフィニティー成分
と会合した治療薬を導入することが考えられる。好ましくは、(i)を(ii)の前に
導入する。

【００７９】 上記のように、本発明の組成物は、ペプチド自体の代わりに本発明のペプチド
をコードする核酸を含んでなることができる。第一の態様によれば、このような
ペプチドをコードする核酸を治療用遺伝子に融合させることができる。融合配列
は、適当な要素の制御下に置いてそれを発現させ(例えば、プロモーター)、治療
を行う生体に導入することができる通常のベクターに組込み、ターゲッティング
および治療特性を両方とも組み合わせている融合ポリペプチドを局所発現するこ
とができる。好ましい融合配列は、本発明の腫瘍ターゲッティングペプチドをコ
ードする核酸と免疫刺激遺伝子(例えば、Ｂ７．１）を融合することによって得
られ、発現細胞の外側に融合ポリペプチドを分泌する機能要素を含むように設計
される(シグナル配列の存在)。このような融合配列を癌を有する生物に投与する
と、この生物に含まれる腫瘍細胞をターゲッティングすることができる融合ペプ
チドが合成され、分泌され、抗腫瘍応答を増強することができる免疫刺激ポリペ
プチドがイン・シテューで送達される。もう一つの態様は、一方では、本発明に
よるペプチドをコードする核酸を含んでなるｅｎｖ遺伝子と共にレトロウイルス
ヘルパー機能をコードする遺伝子を、他方では、治療用遺伝子を発現するように
設計された通常のレトロウイルスベクターを２個のアデノウイルス粒子に組込む
ことである。２個のアデノウイルス粒子で同時感染した細胞は、ターゲッティン
グペプチドを露出しているエンベロープを有する感染性レトロウイルス粒子を産
生する。腫瘍ターゲッティングペプチドを用いて、腫瘍細胞の局所ターゲッティ
ングを行うことができる。

【００８０】 本発明によって追求されている目的によれば、ペプチドおよび／または治療薬
を修飾して、カップリングを改良または安定化することができる。特に、ペプチ
ドをＮまたはＣ末端でスペーサーによって伸張して、カップリング後の標的細胞
へ接近しやすくすることができる。

【００８１】 更に、本発明による組成物は、融合することができるまたはできない(すなわ
ち、タンデムの)本発明の１個以上のペプチドを含んでなることができる。例え
ば、特異的ターゲットに対する本発明の組成物の特異性を増強することが所望な
場合には、ターゲッティングペプチドの組合せを用いるのが有利なことがある。

【００８２】 本発明による組成物は、通常の方法で局部、全身、経口、直腸または局所投与
用に製造することができる。適当な投与経路としては、胃内、皮下、エアゾール
、点滴、吸入、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻内、肺内
、または気管内経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、単回投与
、または一定時間間隔の後１または数回の反復投与で行うことができる。適当な
投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば個人、治療を行う疾患、
治療薬に従って、または導入する目的の遺伝子に従って変化する。ウイルスベク
ターに関する限り、相当するウイルス粒子は１０^４〜１０^１４iu(感染単位)、有
利には１０^５〜１０^１３iu、好ましくは１０^６〜１０^１２iuの用量の形態で処方
することができる。力価は、常法によって決定することができる(例えば、Lusky
et al., 1998, 上記引用)。プラスミドまたは合成ベクターに基づいた用量は、
ＤＮＡ０．０１〜１００mg、有利には０．０５〜１０mg、好ましくは０．５〜５
mgであることができる。処方物は、薬学上許容可能な希釈剤、アジュバント、キ
ャリヤー、または賦形剤を含むこともできる。更に、本発明による組成物は、緩
衝溶液、安定剤、または投与経路に適合した防腐剤を含むことができる。例えば
、注射溶液は、液体、または使用前に再構成することができる乾燥粉末の形態(
凍結乾燥など)であることができる。局所投与用の組成物は、クリーム、軟膏、
ローション、溶液、またはゲルの形態であることができる。肺内投与用の組成物
は、粉末、スプレー、またはエアゾールの形態であることができる。

【００８３】 本発明による組成物は、任意の通常且つ生理学的に許容可能な投与経路によっ
て、例えば、動脈内注射によって、接近可能な腫瘍に、エアゾールまたは点滴に
よって肺に、適当なカテーテルを用いて血管系などに直接イン・ビボで投与する
ことができる。患者(骨髄細胞、末梢血リンパ球、筋原細胞など)から細胞を採取
し、当技術分野の手法に準じて本発明の組成物を導入し、それらを患者に再投与
することからなるエクス・ビボ法を採用することもできる。上記のように、投与
は、第一の親和性成分と関連させた本発明のペプチドを投与して所望な細胞をタ
ーゲッティングすることからなる第一の段階と、第一の親和性成分を結合するこ
とができる第二の親和性成分と関連させた治療薬を投与することからなる第二段
階の二段階手続きによって行うことができる。

【００８４】 最後に、本発明は、遺伝子導入、好ましくは遺伝子治療によるヒトまたは動物
体の治療を目的とする薬剤を調製するための本発明による組成物の使用も提供す
る。本発明の意味の範囲内では、遺伝子治療は任意の治療用遺伝子を細胞に導入
するための方法と理解しなければならない。従って、潜在的に抗原性のエピトー
プを細胞に導入して、細胞性または体液性または両方であることができる免疫応
答の誘発に関する免疫治療も包含する。本発明による組成物の使用は、この組成
物に含まれるペプチドのターゲッティング特性によって変化する。心臓ターゲッ
ティングペプチドを含んでなる組成物は、好ましくは心臓またはその欠陥に影響
を与える任意の疾患、例えば、冠状心疾患、心不全、心臓肥大、心筋梗塞、心筋
炎、虚血、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、筋などの治療または予防に用いら
れる。腫瘍ターゲッティングペプチドを含んでなる組成物の好ましい用途は、癌
、腫瘍、および望ましくない細胞増殖から生じる疾患の治療または予防にある。
更に具体的には、乳癌、子宮癌(特に、パピローマウイルスによって誘発される
癌)、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、
喉頭癌、中枢神経系の癌、、血液の癌(リンパ腫、白血病など)、黒色腫および肥
満細胞腫を引用することができる。

【００８５】 本発明は、治療上有効量の本発明のペプチドまたは組成物を、治療を必要とす
る患者に投与することを特徴とする治療法にも関する。本明細書で用いる「治療
」は、予防および治療を指す。「治療上有効量のペプチドまたは組成物」は、治
療を行うことが所望な疾患に普通に見られる１以上の症状を緩和するのに十分な
容量である。本発明による方法は、更に上記疾患の治療を目的とする。

【００８６】 本出願明細書に引用されたすべての特許明細書、公表特許出願明細書の開示内
容、および本出願明細書に引用されたデーターベース入力は、それらのここの特
許明細書、公表物およびデーターベース入力のそれぞれが具体的且つ個別的に開
示内容の一部として本明細書に引用する。

【００８７】 下記の例により、本発明を説明する。

【００８８】 本発明のペプチドは、ファージ展示ペプチドライブラリーを用いて同定した。
当技術分野で通常のこの技術は、下記の文献に詳細記載されている(Scott et al
. Science 249(1990) 368; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(199
0) 6378; Devlin et al. Science 249(1990) 404; Romanczuk et al. Hum. Gene
Ther. 10(1999) 2615; Sarnoylova et al. Muscle and Nerve 22(1999) 460)。
ファージ展示ライブラリーに最もよく用いられるファージの一つは、糸状ファー
ジＭ１３である。Ｍ１３ファージは、その表面にコートタンパク質に融合した異
種ペプチドを展示し且つそのゲノム内に融合タンパク質の遺伝子を含むように設
計することができる。Ｍ１３ビリオンのpIIIおよびpVIII表面タンパク質が、フ
ァージ展示に現在用いられている。ｐIllタンパク質は、３〜５コピーが互いに
近接して配置されて含まれている。pVIIIタンパク質は、ファージの表面上に分
布した約２７００個のコピーに含まれている。ランダムペプチド配列を、いずれ
かのタンパク質のＮ末端に組込むことができる。

【００８９】 所望の細胞型を選択的にターゲッティングするファージを選択するのに、様々
な方法を用いることができる。第一のスクリーニング法は、ファージ展示ライブ
ラリーのイン・ビボ注射、ターゲット組織の単離、および保持されたファージに
同一器官に対する２回以上のイン・ビボ選択を施すことによる増幅を含む(Rajot
te et al. J. Clin. Invest. 102(1998) 430-437; Pasqualini et al. Nature 3
80(1996) 364-366; Pasqualini et al. Nature Biotechnology 15(1997) 542-54
6)。イン・ビボ法は、様々な組織(野生型動物での注射)、腫瘍(腫瘍動物モデル
を用いる)、および罹患細胞(様々な動物モデルでの注射、例えば、ＫＯマウスま
たは虚血性四肢におけるアテローム性動脈硬化症プラーク)のターゲッティング
に応用可能である。

【００９０】 第二の方法(エクス・ビボ)では、器官または組織を単離し、小片に切断し、若
干固定した後、ファージライブラリーと共にインキュベーションする。未結合フ
ァージを洗浄によって除去し、結合ファージを低ｐＨでまたは直接宿主細菌を加
えることによって溶出させる。保持されたファージを細菌で増幅した後、ターゲ
ットに再露出することによって更に強化する(Van Ewijk et al. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 94(1 997) 3903; Odermatt et al. J. Am. Soc. Nephr. 10(1 999
) 448)。エクス・ビボ選択では、ヒト試料を選択組織として用いることができ、
例えば、心筋、腫瘍またはアテローム性動脈硬化症プラークからの生験試料を用
いることができる。

【００９１】 最後に、イン・ビトロ選択法は、ファージの培養細胞への吸着に基づくもので
ある(Waters et al. Immunotechnology 3(1997) 21; Barry et al. Nature Mede
cine 2(1996) 299; Samoylava et al. Muscle and Nerve 22(1999) 460)。予備
吸着段階を実現して、強い非特異的結合を示すファージ、例えば、正および負に
帯電したアミノ酸の長い伸張を示すものを除去することができる。このために、
ライブラリーを関連のない細胞株(標的細胞とは異なる)、同一組織由来の未形質
転換細胞、またはプラスチック表面に予備吸着することができる。次に、ファー
ジ展示ライブラリーを、培養で増殖した標的細胞と共にインキュベーションする
。未結合ファージを洗浄によって除き、結合ファージを溶出し、回収して、増幅
する。腫瘍ターゲッティングに関するときには、イン・ビトロ選択を様々な起源
の培養した腫瘍細胞株または主要素式から調製した一次腫瘍細胞で行う。更に、
腫瘍の細胞外マトリックス(ＥＣＭ）には、もう一つのターゲットの可能性があ
る。ＥＣＭを腫瘍(すなわち、マトリゲル(matrigel))から単離し、組織培養皿に
固定し、ファージの選択に用いることができる。また、ファージを、単離した分
子に対して選択することもできる(Burg et al. Cancer Res. 59 (1999) 2869; K
oivuen et al. Nature Biotechn. 17(1999) 768)。

【００９２】 細胞株でのイン・ビトロ選択を拡張して、ある種の細胞表面に露出したタンパ
ク質に特異的なペプチドを選択することができる。数種類の腫瘍特異的細胞表面
抗原が知られており、特異的アドレスとして用いることができる。いくつかの例
を、表１に示す。この方法では、細胞表面受容体は、適当な発現プラスミドが安
定に形質転換した後に細胞株で発現する。ファージを最初に受容体を発現しない
親細胞株に対して予備選択した後、受容体発現細胞で積極的に選択する。これに
より、精製形態では利用することができず且つ細胞膜に関連して受容体を展示す
る利点をも有するターゲットタンパク質に対してペプチドを選択することができ
る。

【００９３】

【表１】

【００９４】 上記選択手続きのいずれかを終了した時点で、限定数の保持されたファージを
個々に単離し、増幅した後、展示ペプチドをコードするＤＮＡインサートの配列
を決定することによって特性決定する。更に、アミノ酸配列を整列させて、所定
の細胞に独特なモチーフを同定する。次に、最も豊富な配列を特異的結合につい
て試験する。

【００９５】 選択したファージの結合特異性をイン・ビボで確認するため、これをマウスに
注射して、様々な臓器を回収する。所定の臓器におけるファージの蓄積に続いて
、様々な臓器から回収されるファージの数の決定またはファージ特異的ゲノム配
列について定量的ＰＣＲを行う。ファージまたはＤＮＡ回収率についてのターゲ
ット／非ターゲット臓器の比率は、その特異性についての尺度を表す。文献には
、２〜３５の比が記載されている(Arap et al. Science 279(1998) 377; Pasqua
lini et al. Nat. Biotech. 15(1997) 542; 米国特許第５，６２２，６９９号明
細書)。この比を、未選択ファージプール、未選択の個々のファージまたは野生
型ファージを用いて得たものと比較する。ファージ蓄積の後に、抗−Ｍ１３抗体
を用いる免疫組織化学を行うこともできる。この様相は、ターゲット組織(血管
系、腫瘍細胞、ＥＣＭ)を一層正確に同定する上で特に適切である。更に、選択
したファージを遊離ペプチドまたはＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ
)融合ペプチドの存在下で注射して、競合分析法での特異的ターゲッティングを
示すことができる。更に、特異性を腫瘍ターゲッティングペプチドを化学療法薬
(すなわち、ドキソルビシン)に結合し、腫瘍細胞を殺す効率および選択性を示す
ことによって試験することができる。

【００９６】例1. ファージ展示ライブラリーのイン・ビボ注射、および臓器およびファー
ジの回収 ファージライブラリーは市販されている。New England Biolabsから発売され
ているものの２つを用いた。ＰｈＤ−１２は、pIIIタンパク質によって展示され
たランダムな１２アミノ酸配列を有するファージを含む。ＰｈＤ−１２ストック
の力価は、１００μl中１．３×１０^１２pfuである。その複雑度は２．７×１０ ^９ である。ＰｈＤ−Ｃ７Ｃライブラリーは、pIIIタンパク質によって展示された
２個のシステインによってフランキングしたランダムな７マーアミノ酸配列を示
す。ＰｈＤ−Ｃ７Ｃストックの力価は１００μl中１．５×１０^１２pfuであり、
複雑度は３．７×１０^９である。従って、両ライブラリーの５μl注入は、それ
ぞれのファージを少なくとも２０コピー含むこととなる。

【００９７】 マウスに投与する前に、ＰｈＤ−１２ファージ５μlをＤＭＥＭ培地(Gibco BR
L)２００μl(１２−Ｄ)またはＰＢＳ(Dulbecco)２００μl(１２−Ｐ)に希釈した
。平行して、ＰｈＤ−Ｃ７Ｃファージ５μlを２００μlＤＭＥＭ（７−Ｄ）また
は２００μlＰＢＳ(Dulbecco)(７−Ｐ)に希釈した。

【００９８】 マウスを麻酔し、ファージ希釈物(12-D, 12-P, 7-D, 7-P)を尾静脈から投与し
た(ｔ＝０分)。次に、マウスに、ＤＭＥＭまたはＰＢＳを心臓灌流した(ｔ＝２
分)。灌流の直後、深麻酔のままマウスを液体窒素で「瞬間凍結」した。

【００９９】 部分的に室温で融解した投与動物から得た臓器試料について、分析を行った。
肝臓、心臓、肺、 脾臓、腎臓、および下肢筋を回収して、氷冷したＤＭＥＭ＋
ＰＩまたはＰＢＳ＋ＰＩ（ＰＩはBoehringer参照番号1697498によって提供され
たプロテアーゼ阻害剤カクテルである)１mlに入れた。心臓および肝臓を、氷／
水槽中でPolytronで軽く粉砕した。組織を、氷冷したＤＭＥＭ＋ＰＩ、１％ＢＳ
Ａ、０．１％Tween-20、またはＰＢＳ＋ＰＩ、１％ＢＳＡ、０．１％Tween-20
５〜１０mlで３〜５回洗浄した。選択したファージを、細菌との競合によって溶
出した。このため、回収した組織を、初期対数期E.coli ER2537 (New England B
iolabs, 参照番号8110)１mlと、室温にて低速で振盪品柄２０分間インキュベー
ションした。ＬＢ培地１０mlを加え、全容積を室温にて振盪しながら２０分間イ
ンキュベーションした。一分量(１０μl)を用いてファージを滴定し(Maniatis,
Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor, Laboratory Press)、残りは
２５０ フラスコのＬＢ培地１０mlに加えた。ＥＲ２５３７を一晩培養したもの
１５０μlを加えた後、培養物を３７℃で激しく振盪しながら４．５時間インキ
ュベーションした。培養物を、１０krpm (SS34)４℃で２回１０分間遠心分離し
た。上清の８０％を回収し、２０％(w/v) PEG-8000、２．５M ＮａＣｌの１／６
容(２．６６ml)に加えた。ファージを４℃で一晩沈澱させ、選択したファージの
濃縮ストックを回収した後、上記の手法に従って力価を測定した。

【０１００】 この選択プロトコールを３回行った後、単一プラークを採取して、ＤＮＡを単
離し、配列決定を行った。

【０１０１】 例１に記載したそれぞれの回の選択から、回収されたファージの総数は、臓器
のそれぞれからの組織１５０mg当たりで計算した。回収ファージを力価測定した
後、増幅工程を行った。ファージを選択回での特異的臓器から回収すると、同一
臓器からの回収率は次の選択回には増加するが、回収率は他の臓器からのものを
増加すべきでない。図１は、Balb/cマウスでの心臓をターゲッティングするイン
・ビボ選択から得た結果を示している。一般に、ターゲット臓器からのファージ
回収率の増加は、それぞれの選択回について観察される。３回の選択の後、５０
のランダムファージを採取して、配列決定した。表２は、ペプチドの選択と、選
択したファージプール内でのそれらの回収頻度を表している。数値は、配列を見
いだした回数／特定の実験において総数で行った配列の数を示す。

【０１０２】

【表２】

【０１０３】例2. 心臓での候補ファージの特異性の分析 ストックをこれらの候補ファージから作成し、特異性を静脈内投与、ターゲッ
トおよびコントロール臓器の回収、および１g組織当たりの回収された全候補フ
ァージの計算によってイン・ビボで試験した。あるいは、候補ファージを、青色
プラークの代わりに白色プラークを生じるネガティブコントロールファージと共
に投与した。次に、候補／コントロール回収率の比を、ターゲットおよびコント
ロール臓器の間で比較する。文献には、２〜３５の比が記載されている(Rajotte
et al. J. Clin. Invest. 102(1998) 430)。図２は、同時に投与したネガティ
ブコントロールを有する候補ファージの特異性のイン・ビボ試験の一例を示す。
展示したペプチドの配列を、図に示す。いずれの場合にも、コントロール臓器よ
りはターゲット臓器(心臓)で、一層高い回収率が見られる。

【０１０４】例３ 差し引いたファージ展示ライブラリーを有する固定臓器のインキュベーシ ョン、およびファージの回収 サブトラクション: ファージを、Hela (ATCC CCL-2)または293 (ATCC CRL-15
73)のような非標的細胞上で予備インキュベーションした。このため、細胞をフ
ラスコ中で集密状態になるまで増殖させた後、ＰＢＳ、０．０５％グルタルアル
デヒドで１０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡで５回洗浄して
、グルタルアルデヒドを除去した。ファージ展示ライブラリー５μlをＰＢＳ、
１％ＢＳＡ（２．４ml、またはプレートを被覆する最小容積)で希釈し、固定細
胞に加え、室温にて低速回転しながら１時間インキュベーションした。差し引い
たファージ懸濁液を含む上清を、１．５krpmで３分間遠心分離することによって
回収した。

【０１０５】 懸濁液中のサブトラクター細胞の調製： 細胞をＰＢＳで洗浄し、２mM ＥＤ
ＴＡ／ＰＢＳでデタッチした(detatched)。遠心分離の後、細胞をＰＢＳ、０．
０５％グルタルアルデヒド、１mMＭｇＣｌ_２中で１０分間再懸濁し、細胞をＰＢ
Ｓ、０．０５％グルタルアルデヒド、１mMＭｇＣｌ_２で５回洗浄し、ＰＢＳ、１
％ＢＳＡ中に保管した(６．３×１０^６個／ml以上)。

【０１０６】 Balb/cマウスを麻酔した後、臓器を、ＰＢＳ、０．０５％グルタルアルデヒド
で１０分間全身灌流することによって緩やかに固定した。肝臓、心臓、肺、脾臓
、腎臓および下肢筋を回収した。肝臓および心臓を鋏で細かく切り刻み、断片を
ポリスチレンチューブ中１mlＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で４℃に保持した。他の臓器
は、−８０℃に冷凍した。６．３×１０^６サブトラクター細胞に混合したファー
ジ希釈物を加え、低速回転しながら４℃で一晩インキュベーションした。

【０１０７】 上清を廃棄し、臓器断片をＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Tween-20 (５回)
で洗浄した。断片を１５mlチューブ中洗浄緩衝溶液３００μlに保持し、選択フ
ァージを低ｐＨで５０mMクエン酸ナトリウム、１４０mMＮａＣｌ、ｐＨ２．０を
４５０μl加えることによって５分間溶出した。中和は、２M Tris（ｐＨ８．７
）５７μlを加えることによって行った。

【０１０８】 滴定は一分量(１〜１０μl)について行い、上清の残りをＬＢ培地２０mlとＥ
Ｒ２５３７の一晩培養物２００μlに加えた後、３７℃で激しく振盪しながら４
．５時間インキュベーションした。１０krpm (SS-34)、４℃で１０分間２回遠心
分離した後、上清の８０％を回収し、これに２０％(w/v) PEG-800、２．５M Ｎ
ａＣｌを１／６容(２．６６ml)加えた。混合物を４℃で一晩沈澱し、選択したフ
ァージの濃縮ストックを回収し、力価を測定した。

【０１０９】 この選択プロトコールを３回行った後、単一プラークを採取して、ＤＮＡを単
離し、配列決定した。

【０１１０】 図３は、Balb/cマウスでのイン・ビボ選択ターゲッティング肝臓および心臓か
ら得た結果を示す。一般に、ターゲット臓器からのファージ回収率の増加は、そ
れぞれの選択回について観察される。

【０１１１】例4 サブトラクテッドファージ展示ライブラリーを有する標的細胞のインキュ
ベーションおよびファージの回収率 サブトラクションは、上記のようにターゲット分子(例えば、ＭＵＣ−１ポリ
ペプチド)を発現しない細胞で行った。しかしながら、差し引かれていない全フ
ァージ展示ライブラリーを用いることもできる。

【０１１２】 ファージ懸濁液を標的細胞(非固定または固定)に加え、低速回転しながら４℃
で(短時間または一晩)インキュベーションした。上清を廃棄し、細胞をＰＢｓ、
１％ＢＳＡ、０．０５％Tweenで５回洗浄した。結合ファージを、低ｐＨで、５
０mMクエン酸ナトリウム、１４０mMＮａＣｌ、ｐＨ２．０を４５０μl加えるこ
とによって５分間溶出した。２M Tris、ｐＨ８．７ ５７μlを加えて、ファー
ジ溶液を中和した。

【０１１３】 滴定は一分量(１〜１０μl)について行い、上清の残りをＬＢ培地２０mlとＥ
Ｒ２５３７の一晩培養物２００μlに加えた。混合物を、３７℃で激しく振盪し
ながら４．５時間インキュベーションした。１０krpm (SS-34)、４℃で１０分間
２回遠心分離した後、上清の８０％を回収し、これに２０％(w/v) PEG-800、２
．５M ＮａＣｌを１／６容(２．６６ml)加え、４℃で一晩沈澱した。選択したフ
ァージは、濃縮ストックとして回収され、力価を測定した。

【０１１４】 この選択プロトコールを３回行った後、単一プラークを採取して、ＤＮＡを単
離し、配列決定した。

【０１１５】4.1 ＭＵＣ−１発現Ｐ８１５腫瘍細胞への特異的結合を示すペプチドの単離 Ｐ８１５腫瘍細胞結合ファージは、最初にＰ８１５ｐＡＧ６０（ネオマイシン
発現カセットでトランスフェクションしたＰ８１５細胞)について３回サブトラ
クションを行うことによって単離した後、Ｐ８１５ＭＵＣ１細胞(ＭＵＣ１およ
びネオマイシン発現カセットでトランスフェクションしたＰ８１５細胞(ATCC TI
B-64))上で３選択−増幅サイクルを行った。Ｐ８１５は、ＡＴＣＣコレクション
(ATCC TIB-64)で入手可能なマウス肥満細胞腫である。Ｐ８１５ｐＡＧ６０細胞
を、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ）、２mMグルタミン、１mMピルビン酸ナトリウ
ム、４０μg/mlゲンタマイシンおよび非必須アミノ酸を補足したＤＭＥＭ中で増
殖させた。Ｐ８１５ＭＵＣ１細胞を、１mg/mlＧ４１８を含む同一培地で増殖さ
せ、ＭＵＣ１遺伝子の発現を保持した。

【０１１６】 ３サブトラクション工程について、１×１０^７個のＰ８１５ｐＡＧ６０細胞を
、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で室温にて若干攪拌しながら１時間NEBファージライブ
ラリーPhD-12またはPhD-C7C (カタログ番号8010および8020; NEB, Beverly, USA
)由来の１．５×１０^１１個のファージと共にインキュベーションした。次に、
細胞を２５００rpmで３分間遠心分離することによって回収した。上清の一分量
を滴定用に取っておき、残りを１×１０^７個のＰ８１５ｐＡＧ６０細胞ともとに
再度インキュベーションし、二回および三回目はファージプールの増幅は見られ
なかった。

【０１１７】 ３選択サイクルについて、３連続サブトラクションからのファージプールを、
ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中若干攪拌しながら４℃で４時間、５×１０^６個のＰ８１５
ＭＵＣ１細胞と共にインキュベーションした。次に、細胞を１mlのＰＢＳ−１％
ＢＳＡ−０．１％Tween 20で５回洗浄し、最初の洗浄中に新しいチューブに移し
た後、溶出した。次に、Ｐ８１５ＭＵＣ１細胞に結合したファージを氷上で０．
１Mグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１００μlで１０分間溶出し、細胞を遠心分
離によってペレット化し、溶出したファージを含む上清を２M Tris-HCl（ｐＨ８
）１０μlで中和した。

【０１１８】 溶出したファージを、ＬＢ２０ml中で、３７℃で激しく振盪しながらＥＲ２５
３７細菌(NEB)の一晩培養物２００μlを用いて増幅した。次に、１００００rpm
で１０分間２回の遠心分離工程によって細菌を除去し、上清１６mlに、２０％PE
G 8000, 2.5M ＮａＣｌを２．３３ml加え、ファージを４℃で一晩沈澱させた。
次に、供給業者のプロトコールを行い、ファージの濃縮ストックを増殖させ、力
価を測定した。Ｐ８１５ＭＵＣ１細胞上で３回目の選択サイクルの後、回収／入
力ファージの比は選択したプールについて濃縮因子５００までによって増加した
。

【０１１９】 ３２個の単一ファージを第三の選択プールから単離して、増幅し、それらのゲ
ノムを配列決定してそれらの展示ペプチドのアミノ酸配列を推定した。結果を表
３に示す。ＰｈＤＣ７Ｃファージの選択から、２つの異なるペプチド配列が濃縮
され、従って複数回を表した。選択したＰｈＤ１２プールでは、５種類の異なる
ファージ配列を同定した。

【０１２０】

【表３】

【０１２１】 ２種類の他のファージを、溶出を抗−ＭＵＣ−１抗体(Keydar et al., 1989,
PNAS, 86, 1362-1366)に記載のＨ２３ハイブリドーマのサブクローンである１２
Ｃ１０）で行ったことを除き、上記手法を用いて単離した。選択したファージの
配列は、CWPMKSLFC (WPM1)、およびCWPMKSQFC (WPM2)である。

【０１２２】4.2 Ｐ８１５細胞への選択ファージの特異結合 次に、選択されたファージ候補の特異性を、個々のファージをＰ８１５細胞と
インキュベーションすることによって試験した。候補の結合を、２種類のネガテ
ィブコントロールファージ、すなわちＰｈＤ１２ライブラリー由来の非選択ファ
ージである空のＭ１３およびＧＨＬと比較した。これらの検討は、Ｐ８１５ｐＡ
Ｇ６０、Ｐ８１５ＭＵＣ１および非形質転換Ｐ８１５細胞について、ファージ滴
定分析法またはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング)による免疫染色を用い
て行った。結果は、上記選択機構により、ネガティブコントロールと比較して、
特異的且つ高親和性でＰ８１５細胞に結合するファージを単離することができる
ことを示している。

【０１２３】 滴定分析法 １×１０^７個の細胞を、選択した候補またはコントロールファージ由来の１．
５×１０^１１個の感染性粒子とインキュベーションした。細胞を洗浄し、結合し
たファージを上記の通りに溶出し、力価測定した。

【０１２４】 図４に示した結果は、すべての候補が、コントロールよりも少なくとも１００
倍高い親和性でＰ８１５ＭＵＣ１およびＰ８１５ｐＡＧ６０に結合したことを示
している。ＷＰＴペプチドはＰ８１５細胞について最良の親和性を示し、次いで
ＮＤＩファージであり、次いで１２アミノ酸ペプチドファージであった。ＷＰＹ
以外のすべての候補は、Ｐ８１５ｐＡＧ６０よりもＰ８１５ＭＵＣ１に少なくと
も３倍高い結合を示した。

【０１２５】 更に、候補ファージを、６種類の他のネズミおよびヒト腫瘍細胞株、すなわち
ネズミ癌細胞株ＲＥＮＣＡ(Murphy et aL, 1973, J. Natl. Cancer Inst. 50, 1
013-1025)、ネズミ黒色腫細胞株Ｂ１６(ATCC CRIL-6322)、ヒト子宮頸部癌細胞
株HeLa (ATCC CCL-2)、ヒト結腸直腸癌細胞株ＷｉＤｒ(ATCC CRL-218)、および
２種類のヒト乳癌細胞株MDA-MB-435 (ATCC HTB-129)およびMDA-MB-231を用いて
同様な実験場けんかでインキュベーションし、それらの結合を滴定法またはＦＡ
ＣＳ分析法によって分析した。これらの細胞株のすべては、１０％ＦＣＳ、２mM
グルタミンおよび４０μg/mlゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭで増殖させた。
Ｍ１３コントロールファージより１００００倍まで高い親和性でＲＥＮＣＡ細胞
に特異的に結合したＷＰＹを除き、すべての他の候補ファージはＭ１３コントロ
ールファージと同じ親和性でこれらの細胞株に結合し、ある種の腫瘍細胞株、特
にリンパ腫瘍について高い特異性を示すことを示唆していた。反対に、ＷＰＹフ
ァージは少なくとも２種類の腫瘍細胞株ＲＥＮＣＡおよびＰ８１５に高い特異性
を示し、これは数種類の異なる腫瘍細胞型に結合することができることを示して
いる。

【０１２６】 ＦＡＣＳ分析法 ５×１０^５個の細胞／ウェルを９６穴プレートに入れ、１０^１１個のファージ
を加え、４℃で振盪しながら２時間インキュベーションした。細胞を、ＦＡＣＳ
緩衝溶液(１％ＢＳＡ、０．１％ヒトγ−グロブリン、５mMＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ）１５０μlで４回洗浄した。１／５００の抗-fdバクテリオファージ抗体(Sig
ma, St Louis, USA; カタログ番号: 137786)１００μlをウェルに加え、４℃で
４５分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝溶液で４回洗浄し、１／
２００のＦＩＴＣ(Biotechnology Associates, Birmingham, USA; カタログ番号
: 4052-02)にカップリングしたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と共に４℃
で４５分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝溶液で４回洗浄し、蛍
光をFACScan (Becton Dickinson, San Jose, USA)で測定した。結果を、Cellque
stソフトウェアで解析した。

【０１２７】 空のＭ１３と比較した上記の候補の特異性を、Ｐ８１５細胞についてＦＡＣＳ
分析によって確かめた。ＷＰＹ、ＭＰＬおよびＬＰＱファージは、Ｐ８１５ＭＵ
Ｃ１細胞並びに元の未形質転換Ｐ８１５細胞株に高い特異的結合を示した。すべ
ての他のクローンはＰ８１５ＭＵＣ１細胞に結合を示したが、トランスフェクシ
ョンしていないＰ８１５細胞に対する結合が異なっていた。

【０１２８】4.3 Ｐ８１５ＭＵＣ１細胞に対するＷＰＹおよびＬＰＱ合成ペプチドの特異的
結合 以前に選択したファージのＷＰＹおよびＬＰＱ配列(表３の第二および第四の
配列)に相当する合成ペプチドを合成した(Neosystem, strasbourg, France)。Ｗ
ＰＹペプチド(０．１、１０および５００μM) およびＬＰＱペプチド(０．１、
１０および１０００μM)、またはコントロールペプチドＧＨＬおよびＳＧＲ（Ｐ
ｈＤ−Ｃ７Ｃライブラリー由来の非選択ファージ)の増加量を、全容積が１mlの
ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で５・１０^６個のＰ８１５ＭＵＣ１細胞で希釈し、緩やか
な攪拌下４℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡ２００μl
中の１・１０^１０個のＷＰＹおよびＬＰＱファージを加え、細胞およびペプチド
と共に緩やかに攪拌しながら４℃で２時間インキュベーションした。次に、細胞
を洗浄し、選択についてと同じプロトコールに従って、結合ファージを溶出し、
力価を測定した。ＷＰＹおよびＬＰＱペプチドは、相当するファージの結合を用
量依存的に阻害することができるが、コントロールペプチドはＷＰＹおよびＬＰ
Ｑファージ結合を有意に阻害せず、合成ペプチドが、同じ配列を示すファージの
結合について効率的に競合することを示している。これらの結果は、ＷＰＹおよ
びＬＰＱ配列を表す合成ペプチドもＰ８１５ＭＵＣ１細胞に特異的結合を示すこ
とを示唆している。

【０１２９】 興味深いことには、ＷＰＹペプチド(濃度５００μM)は、ＬＰＱファージの結
合を有意に阻害せず、これらの２種類のペプチドは異なる分子ターゲットを認識
することを示していた。

【０１３０】例５ ＷｉＤｒ（ヒト結腸直腸癌細胞へ特異的結合を示すファージの単離 総ての細胞はATCCコレクションから得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２
mMグルタミンおよび４０μg/mlゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭ中に保持した
。

【０１３１】 供給したＰｈＤ−１２またはＰｈＤ−Ｃ７Ｃライブラリーを最初にHeLa細胞に
３回予備吸着した後、ＷｉＤｒ細胞上で第一の選択を行った。HeLa細胞を、ＰＢ
Ｓ，１０mMＥＤＴＡ中でインキュベーションすることによって懸濁させた。次に
、細胞を１０mlＰＢＳを加えることによって２回洗浄し、遠心分離(２５００rpm
、３分間)によって回収した。細胞を計数し、１０^７個の細胞当たり１mlＰＢＳ
，１％ＢＳＡに再懸濁した。

【０１３２】 ファージライブラリーからの１．５×１０^１１pfuを細胞１mlに加え、混合物
を低速で振盪しながら室温で１時間インキュベーションした。２５００rpmで３
分間遠心分離した後、上清を１０^７個のHeLa細胞と共に再度インキュベーション
した。このサブトラクションプロトコールを３回繰り返した。次に、最後の上清
(ファージのサブトラクテッドプール)を懸濁液中で５×１０^６個のＷｉＤｒ細胞
と共に低速で振盪しながら４℃で４時間インキュベーションした。細胞を、１ml
の冷ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，０．１％Tween-20中で５回洗浄し、上記のようにして
回収した。結合ファージを、１００μlの０．１Mグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．２
を加えて溶出させ、氷上で１０分間インキュベーションした。２５００rpmで３
分間遠心分離した後、上清を１０μlの２M Tris-ＨＣｌ, ｐＨで中和した。１０
μlの分量を力価測定し、残りを、溶出したファージを２００μlの一晩E. coli
ER2537培養物を含む２０mlＬＢに加えて増幅した。培養物を４時間強力に攪拌し
ながらインキュベーションし、ファージを販売業者のプロトコール (NEB)に従っ
て精製した。

【０１３３】 ＷｉＤｒ細胞での選択を、全部で５回、２回から５回目の選択前はサブトラク
ションを行わず、またはそれぞれの選択の前に２９３細胞について３回サブトラ
クションを行って繰り返した。最終的な選択プールからの２４個の単一ファージ
を増幅して配列決定し、ペプチド配列を同定した。

【０１３４】

【表４】

【０１３５】 選択したファージの特異性を、M１３野生型ファージの結合と比較し、および
様々な腫瘍細胞株への結合と比較したＷｉＤｒ細胞への結合によって試験した。
結合は、選択について上記した通りに行った。

【０１３６】 図５は、結合を、Ｍ１３野生型ファージと比較して様々な細胞で試験したとき
のHEWSYLAPYPWFファージの出力／入力比を示す。ＨＥＷファージは、Ｍ１３野生
型ファージよりもＷｉＤｒ細胞へ１９００倍高い親和性を示し、ＭＤＡ−ＭＢ−
４３５細胞へは２７０倍高い親和性を示すが、２９３およびHeLa細胞への親和性
はＭ１３野生型の親和性と同様である。

【０１３７】 平行実験では、ＷｉＤｒ細胞について５回の選択を行ったが、ライブラリーの
サブトラクションはＷｉＤｒ細胞について最初の選択の前にHeLa細胞について行
っただけであった。５回のＷｉＤｒ細胞選択のそれぞれの後に、選択したファー
ジを回収した(プール１〜プール５)。第五のプールから、２４個の単一プラーク
を増幅し、ペプチドに相当するインサートを配列決定した。QIDRWFDAVQWL配列が
、総てのファージから得られた。精製した「ＱＩＤ」ファージ、および第五のプ
ールは様々な腫瘍細胞株へ親和性を有することがわかったが、反対に未選択プー
ル１は腫瘍細胞株へ親和性を示さなかった。これらの結果は、ＱＩＤファージの
数種類の異なる腫瘍細胞型への親和性を示している。

【０１３８】 「ＨＥＷ」ファージの選択についてと同じプロトコールを、ｐＨＤ−Ｃ７Ｃラ
イブラリーを用いて繰り返した。この選択からの第五のプールは配列CLPSTRWTC
を示すファージを含み、サブトラクター２９３細胞と比較してＷｉＤｒ細胞への
特異的結合を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 様々なファージ展示ライブラリーを用いるイン・ビボ選択の３回について、１
５０mg臓器当たりに計算した回収ファージ(出力pfu (プラーク形成単位))の総数
を示す図である。総ての数は、マウス間で比較することができる投与入力から得
た力価で割っている。

【図２】 同時投与したネガティブコントロールと共に候補ファージの特異性のイン・ビ
ボ試験の一例を示す図である。展示ペプチドの配列を、図中に示す。

【図３】 ２種類の異なるファージ展示ライブラリーを用いる３回のエクス・ビボ選択に
ついて、固定して細かく切り刻んだ臓器(肝臓または心臓)１５０mg当たりで計算
した回収ファージの総数(出力pfu)を示す図である。総ての数は、マウス間で比
較することができるファージの入力量から得た力価で割っている。

【図４】 候補ファージのＰ８１５細胞への結合の特異性のイン・ビトロ試験の一例を示
す図である。展示されたペプチドの配列は、Ｎ末端に含まれる三アミノ酸モチー
フによって示される。Ｍ１３ファージおよび非選択ファージ(ＧＨＬ）をネガテ
ィブコントロールとして用いる。

【図５】 候補ファージのＷｉＤｒ細胞への結合の特異性の他の細胞と比較したイン・ビ
トロ試験の一例を示す図である。展示ペプチドの配列は、Ｎ末端に含まれる三ア
ミノ酸モチーフによって示される。Ｍ１３ファージおよび３個の非特異的ファー
ジ(図示せず）をネガティブコントロールとして用いる。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月２８日（２００２．１０．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００９】 細胞型または疾患によって影響を受けた細胞は独特な細胞表面マーカーを発現
することが示されている。例えば、速やかに増殖する腫瘍の内皮細胞は静止期の
内皮細胞には含まれていない細胞表面タンパク質、すなわちαｖインテグリン(B
rooks et al. Science 264 (1994) 569)、およびある種の血管形成増殖因子の受
容体(Hanahan Science 277 (1997) 48)を発現する。ファージ展示ライブラリー
選択法を用いて、これらの特定の細胞表面マーカーと相互作用するペプチド配列
を選択することができる(例えば、米国特許第５，６２２，６９９号明細書、米
国特許第５，２２３，４０９号明細書、および米国特許第５，４０３，４８４号
明細書を参照されたい)。この系では、ランダムペプチドが、相当するコード配
列をファージ表面タンパク質の１個をコードする遺伝子に融合することによって
ファージ表面で発現する。所望なファージは、単離した組織断片(エクス・ビボ
法：例えば、ＷＯ９８／３９４６９号公報およびＷＯ９９／４５０２０号公報に
例示されている)または培養細胞(イン・ビトロ法)のようなターゲットへのそれ
らの結合に基づいて選択される。ターゲッティングペプチドの同定は、ファージ
ライブラリーをマウスに注射した後、結合ファージを標的設定した器官から取り
戻すことによって行うイン・ビボ法によって行うこともできる。選択されたペプ
チドは、表示されたペプチドをコードするゲノムファージ領域の配列決定によっ
て同定される。イン・ビボでの器官スクリーニングを応用して、脳および腎臓(P
asqualini et al., Nature 380 (1996) 364-366；ＷＯ９７／１０５０７号公報)
、肺、皮膚および膵臓の血管系(Rajotte et al., J. Clin. Invest. 102 (1998)
430-437)、および数種類の腫瘍(Pasqualini et al., Nature Biotechnology 15
(1997) 542-546)の選択的ファージホーミングを行うペプチド配列の単離に成功
したことが報告されている。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１２】 全部あわせても極めて少数の細胞型または疾患特異的表面マーカーしかこれま
でに報告されておらず、極めて少数のリガンドだけがこのようなマーカーと特異
的に相互作用することが知られている。一方で、肺内皮、特に膜ジペプチダーゼ
を選択的に標的とする分子が同定されている（例えば、ＷＯ９９／４６２８４号
公報を参照されたい）。従って、本発明における技術的課題は、特定の細胞へ治
療薬をターゲッティングするための改良された方法および手段を提供することで
ある。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１４】 従って、本発明は、 X₁THPRFATX₂（配列番号１）、 X₁RTPFATYX₂（配列番号２）、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂（配列番号３）、 X₁QTSSPTPLSHTQX₂（配列番号４）、 X₁PQTSTLLX₂（配列番号５）、 X₁HLPTSSLFDTTHX₂（配列番号６）、 X₁VHHLPRTX₂（配列番号７）、 X₁QLHNHLPX₂（配列番号８）、 X₁HSFDHLPAAALHX₂（配列番号９）、 X₁YPSAPPQWLTNTX₂（配列番号１０）、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂（配列番号１１）、 X₁TYPSSTLX₂（配列番号１２）、 X₁NTLQVRGVYPSVX₂（配列番号１３）、 X₁YSNRTNTNSHWAX₂（配列番号１４）、 X₁PATNTSKX₂（配列番号１５）、 X₁HVNKLHGX₂（配列番号１６）、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂（配列番号１７）、 X₁NANKLWTWVSSPX₂（配列番号１８）、 X₁SGRIPYLX₂（配列番号１９）、 X₁NEDINDVSGRLSX₂（配列番号２０）、 X₁LSPQRASQRLYSX₂（配列番号２１）、 X₁SFSTSPQX₂（配列番号２２）、 X₁ERMDSPQX₂（配列番号２３）、 X₁HHGHSPTSPQVRX₂（配列番号２４）、 X₁GSSTGPQRLHVPX₂（配列番号２５）、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂（配列番号２６）、 X₁QRLTTLYX₂（配列番号２７）、 X₁WSPGQQRLHNSTX₂（配列番号２８）、 X₁WKSELPVQRARFX₂（配列番号２９）、 X₁SELPSMRLYTQPX₂（配列番号３０）、 X₁HSLHVHKGLSELX₂（配列番号３１）、 X₁SDLPVQLEPERQX₂（配列番号３２）、 X₁TRYLPVLPSLFPX₂（配列番号３３）、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂（配列番号３４）、 X₁WEPPVQSAWQLSX₂（配列番号３５）、 X₁HFTFPQQQPPRPX₂（配列番号３６）、 X₁GSTSRPQPPSTVX₂（配列番号３７）、 X₁NFSQPPSKHTRSX₂（配列番号３８）、 X₁QYPHKYTLQPPKX₂（配列番号３９）、 X₁FNQPPSWRVSNSX₂（配列番号４０）、 X₁SVSVGMKPSPRPX₂（配列番号４１）、 X₁STPRPPLGIPAQX₂（配列番号４２）、 X₁TQSPLNYRPALLX₂（配列番号４３）、 X₁AQSPTIKLTPSWX₂（配列番号４４）、 X₁HNLLTQSX₂（配列番号４５）、 X₁TLVQSPMX₂（配列番号４６）、 X₁NLNTDNYRQLRHX₂（配列番号４７）、 X₁FRPAVHNMPSLQX₂（配列番号４８）、 X₁ISRPAPISVDMKX₂（配列番号４９）、 X₁THRPSLPDSSRAX₂（配列番号５０）、 X₁ALHPLTHRHYATX₂（配列番号５１）、 X₁THRGPQSX₂（配列番号５２）、 X₁SFHMPSRAVSLSX₂（配列番号５３）、 X₁NQSNFTSRALLYX₂（配列番号５４）、 X₁SFPTHIDHHVSPX₂（配列番号５５）、 X₁LNGDPTHX₂（配列番号５６）、 X₁HMPHHVSNLQLHX₂（配列番号５７）、 X₁LPSVSPVLQVLGX₂（配列番号５８）、 X₁DAQQLYLSNWRSX₂（配列番号５９）、 X₁DSYLSSTLPGQLX₂（配列番号６０）、 X₁SPTPTSHQQLHSX₂（配列番号６１）、 X₁APPGNWRNYLMPX₂（配列番号６２）、 X₁LSNKMSQX₂（配列番号６３）、 X₁MHNVSDSNDSAIX₂（配列番号６４）、 X₁DNSNDLMX₂（配列番号６５）、 X₁TVMEAPRSAILIX₂（配列番号６６）、 X₁CNDIGWVRCX₂（配列番号６７）、 X₁CWPYPSHFCX₂（配列番号６８）、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂（配列番号６９）、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂（配列番号７０）、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂（配列番号７１）、 X₁WPTSPWLEREPAX₂（配列番号７２）、 X₁WPTSPWSSRDWSX₂（配列番号７３）、 X₁HEWSYLAPYPWFX₂（配列番号７４）、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂（配列番号７５）、 X₁CLPSTRWTCX₂（配列番号７６）、および X₁CWPMKSX₅FCX₂（配列番号７７） (上記式中、それぞれのX₁およびX₂は、互いに独立してn個のアミノ酸からなる任
意のアミノ酸配列を表わし、nは０〜５０であり、nはX₁およびX₂において同一で
あるかまたは異なっており、X₃、X₄およびX₅は同一であるかまたは異なっており
、任意のアミノ酸を表わす) からなる群から選択されるペプチドに関する。好ましくは、X₅はロイシン(L)ま
たはグルタミン(Q)残基である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２６】 第一のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＴＨＰもしくは
ＦＡＴ、またはＴＨＰおよびＦＡＴを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＴＨＰおよびＦＡＴモチーフを両方とも含んでなり
、特にＴＨＰおよびＦＡＴモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によって分離さ
れていると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチ
ドは、配列： X₁THPRFATX₂（配列番号１）、 X₁RTPFATYX₂（配列番号２）、または X₁FHVNPTSPTHPLX₂（配列番号３） を有する。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２７】 第二のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフＱＴＳを含んでな
る心臓ターゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による心臓ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁QTSSPTPLSHTOX₂（配列番号４）、または X₁ PQTSTLLX₂（配列番号５） を有する。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２８】 第三のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＬＰもしくは
ＳＬＦ、またはＨＬＰおよびＳＬＦを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＨＬＰおよびＳＬＦモチーフを両方とも含んでなり
、特にＨＬＰおよびＳＬＦモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によって分離さ
れていると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチ
ドは、配列： X₁HLPTSSLFDTTHX₂（配列番号６）、 X₁VHHLPRTX₂（配列番号７）、 X₁QLHNHLPX₂（配列番号８）、 X₁HSFDHLPAAALHX₂（配列番号９）、または X₁TRYLPVLPSLFPX₂（配列番号３３） を有する。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２９】 第四のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＹＰＳもしくは
ＴＮＴ、またはＹＰＳおよびＴＮＴを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＹＰＳおよびＴＮＴモチーフを両方とも含んでなり
、特にＹＰＳおよびＴＮＴモチーフが３〜８個のアミノ酸によって分離されてい
ると有利である。好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、
配列： X₁YPSAPPQWLTNTX₂（配列番号１０）、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂（配列番号１１）、 X₁TYPSSTLX₂（配列番号１２）、 X₁NTLQVRGVYPSVX₂（配列番号１３）、 X₁YSNRTNTNSHWAX₂（配列番号１４）、または X₁PATNTSKX₂（配列番号１５） を有する。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３０】 第五のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＶＮもしくは
ＮＫＬ、またはＨＶＮおよびＮＫＬを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＨＶＮおよびＮＫＬモチーフを両方とも含んでなり
、特にＨＶＮおよびＮＫＬモチーフが重複していると有利である。好ましくは、
本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁HVNKLHGX₂（配列番号１６）、 X₁FHVNPTSPTHPLX₂（配列番号１７）、または X₁NANKLWTWVSSPX₂（配列番号１８） を有する。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３１】 第六のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフＳＧＲを含んでな
る心臓ターゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による心臓ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁SGRIPYLX₂（配列番号１９）、または X₁NEDINDVSGRLSX₂（配列番号２０） を有する。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３２】 第七のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＰＱ、ＱＲＡ
、ＱＲＬもしくはＰＱＲ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる心臓ターゲ
ッティングペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフＳＰＱ、ＱＲＡ
およびＱＲＬを含んでなり、特にＳＰＱおよびＱＲＡモチーフが重複しており且
つ少なくとも１個のアミノ酸によってＱＲＬから分離されていると有利である。
好ましくは、本発明による心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁LSPQRASQRLYSX₂（配列番号２１）、 X₁SFSTSPQX₂（配列番号２２）、 X₁ERMDSPQX₂（配列番号２３）、 X₁WKSELPVQRARFX₂（配列番号２９）、 X₁HHGHSPTSPQVRX₂（配列番号２４）、 X₁GSSTGPQRLHVPX₂（配列番号２５）、 X₁YPSQSQRX₃LSX₄HX₂（配列番号１１）、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂（配列番号２６）、 X₁QRLTTLYX₂（配列番号２７）、または X₁WSPGQQRLHNSTX₂（配列番号２８） を有する。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３３】 第八のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＥＬもしくは
ＰＶＱ、またはＳＥＬおよびＰＶＱを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＳＥＬおよびＰＶＱモチーフを両方とも含んでなり
、特に２個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による
心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁WKSELPVQRARFX₂（配列番号２９）、 X₁SELPSMRLYTQPX₂（配列番号３０）、 X₁HSLHVHKGLSELX₂（配列番号３１）、 X₁SDLPVQLEPERQX₂（配列番号３２）、 X₁TCSLCNPVQPQRX₂（配列番号３４）、または X₁WEPPVQSAWQLSX₂（配列番号３５） を有する。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３４】 第九のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＱＰＰもしくは
ＰＲＰ、またはＱＰＰおよびＰＲＰを含んでなる心臓ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＱＰＰおよびＰＲＰモチーフを両方とも含んでなり
、特に２個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による
心臓ターゲッティングペプチドは、配列： X₁HFTFPQQQPPRPX₂（配列番号３６）、 X₁GSTSRPQPPSTVX₂（配列番号３７）、 X₁NFSQPPSKHTRSX₂（配列番号３８）、 X₁QYPHKYTLQPPKX₂（配列番号３９）、 X₁FNQPPSWRVSNSX₂（配列番号４０）、 X₁SVSVGMKPSPRPX₂（配列番号４１）、または X₁STPRPPLGIPAQX₂（配列番号４２） を有する。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３８】 第一のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＲＰＡ、ＮＹＲ
もしくはＱＳＰ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる腫瘍ターゲッティン
グペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフＲＰＡ、ＮＹＲおよびＱ
ＳＰを含んでなり、特にＱＳＰモチーフが少なくとも１個のアミノ酸によってＮ
ＹＲモチーフから分離されており、ＮＹＲおよびＲＰＡモチーフが重複している
と有利である。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプチドは、配
列： X₁TQSPLNYRPALLX₂（配列番号４３）、 X₁AQSPTIKLTPSWX₂（配列番号４４）、 X₁TLVQSPMX₂（配列番号４６）、 X₁NLNTDNYRQLRHX₂（配列番号４７）、 X₁FRPAVHNMPSLQX₂（配列番号４８）、または X₁1SRPAPISVDMKX₂（配列番号４９） を有する。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３９】 第二のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＴＨＲもしくは
ＳＲＡ、またはＴＨＲおよびＳＲＡを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、これら２個のモチーフを両方とも含んでなり、特に
ＴＨＲおよびＳＲＡモチーフが４〜８個のアミノ酸によって分離されていると有
利である。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプチドは、配列： X₁THRPSLPDSSRAX₂（配列番号５０）、 X₁ALHPLTHRHYATX₂（配列番号５１）、 X₁THRGPQSX₂（配列番号５２）、 X₁SFHMPSRAVSLSX₂（配列番号５３）、または X₁NQSNFTSRALLYX₂（配列番号５４） を有する。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４０】 第三のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＰＴＨ、ＶＳＰ
、もしくは四アミノ酸モチーフＨＨＶＳ、またはそれらの任意の組合せを含んで
なる腫瘍ターゲッティングペプチドに関する。前記ペプチドは、３個のモチーフ
ＰＴＨ、ＨＨＶＳおよびＶＳＰを含んでなり、特にＰＴＨモチーフが少なくとも
１個のアミノ酸によってＨＨＶＳモチーフから分離されており且つＨＨＶＳおよ
びＶＳＰモチーフが重複していると有利である。好ましくは、本発明による腫瘍
ターゲットペプチドは、配列： X₁SFPTHIDHHVSPX₂（配列番号５５）、 X₁LNGDPTHX₂（配列番号５６）、 X₁HMPHHVSNLQLHX₂（配列番号５７）、または X₁LPSVSPVLQVLGX₂（配列番号５８） を有する。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４１】 第四のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＹＬＳもしくは
ＱＱＬ、またはＹＬＳおよびＱＱＬを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、ＹＬＳおよびＱＱＬを両方とも含んでなり、特に２
個のモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明による腫瘍ター
ゲッティングペプチドは、配列： X₁DAQQLYLSNWRSX₂（配列番号５９）、 X₁DSYLSSTLPGQLX₂（配列番号６０）、または X₁SPTPTSHQQLHSX₂（配列番号６１） を有する。

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４２】 第五のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＳＮＤもしくは
ＳＡＩ、またはＳＮＤおよびＳＡＩを含んでなる腫瘍ターゲッティングペプチド
に関する。前記ペプチドは、これらのモチーフを両方とも含んでなり、特にＳＮ
ＤおよびＳＡＩモチーフが連続していると有利である。好ましくは、本発明によ
る腫瘍ターゲッティングペプチドは、配列： X₁MHNVSDSNDSAIX₂（配列番号６４）、 X₁DNSNDLMX₂（配列番号６５）、または X₁TVMEAPRSAILIX₂（配列番号６６） を有する。

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４３】 第六のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＮＤＩ、ＷＰＹ
、ＭＰＬ、ＰＳＨ、ＬＰＱ、ＷＰＶもしくはＷＰＴ、またはそれらの任意の組合
せを含んでなる腫瘍-ターゲッティングペプチドに関する。具体的態様によれば
、上記第六のファミリーは、少なくとも１個のアミノ酸モチーフＷＰＸ_３Ｘ_４Ｐ
Ｗを含んでなる上記ペプチドであって、Ｘ_３およびＸ_４が同一であるかまたは異
なっており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＶまたはＴで
あり、および／またはＸ_４はＲまたはＳであるものに関する。もう一つの具体的
態様では、上記ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸モチーフＷＰＴＳＰＷＸ _３ Ｘ_４ＲＸ_５を含んでなり、Ｘ_３、Ｘ_４およびＸ_５は同一であるかまたは異なっ
ており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＬまたはＳであり
、および／またはＸ_４はＥまたはＳであり、および／またはＸ_５はＥまたはＤで
ある。もう一つの具体的態様では、上記ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸
モチーフＷＰＸ_３Ｘ_４ＳＸ_５を含んでなり、Ｘ_３、Ｘ_４およびＸ_５は同一である
かまたは異なっており、これらは任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ_３はＹ
またはＭであり、および／またはＸ_４はＰまたはＫであり、および／またはＸ_５ はＬ、ＱまたはＨである。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティングペプ
チドは、配列： X₁CNDIGWVRCX₂（配列番号６７）、 X₁CWPYPSHFCX₂（配列番号６８）、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂（配列番号６９）、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂（配列番号７０）、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂（配列番号７１）、 X₁WPTSPWLEREPAX₂（配列番号７２）、または X₁WPTSPWSSRDWSX₂（配列番号７３） を有する。

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４４】 第七のファミリーは、少なくとも１個の三アミノ酸モチーフ、ＨＥＷ、ＱＩＤ
、ＷＰＭもしくはＣＬＰ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる腫瘍-ター
ゲッティングペプチドに関する。好ましくは、本発明による腫瘍ターゲッティン
グペプチドは、配列： X₁HEWSYLAPYPWFX₂（配列番号７４）、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂（配列番号７５）、 X₁CLPSTRWTCX₂（配列番号７６）、または X₁CWPMKSX₅FCX₂（配列番号７７） を有し、好ましくは、Ｘ_５はロイシン(L)またはグルタミン(Q)残基である。

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０２】

【表２】

【手続補正２２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２０】

【表３】

【手続補正２３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３４】

【表４】

【手続補正２４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３６】 図５は、結合を、Ｍ１３野生型ファージと比較して様々な細胞で試験したとき
のHEWSYLAPYPWF（配列番号７４）ファージの出力／入力比を示す。ＨＥＷファー
ジは、Ｍ１３野生型ファージよりもＷｉＤｒ細胞へ１９００倍高い親和性を示し
、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞へは２７０倍高い親和性を示すが、２９３およびHe
La細胞への親和性はＭ１３野生型の親和性と同様である。

【手続補正２５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３７】 平行実験では、ＷｉＤｒ細胞について５回の選択を行ったが、ライブラリーの
サブトラクションはＷｉＤｒ細胞について最初の選択の前にHeLa細胞について行
っただけであった。５回のＷｉＤｒ細胞選択のそれぞれの後に、選択したファー
ジを回収した(プール１〜プール５)。第五のプールから、２４個の単一プラーク
を増幅し、ペプチドに相当するインサートを配列決定した。QIDRWFDAVQWL配列（
配列番号７５）が、総てのファージから得られた。精製した「ＱＩＤ」ファージ
、および第五のプールは様々な腫瘍細胞株へ親和性を有することがわかったが、
反対に未選択プール１は腫瘍細胞株へ親和性を示さなかった。これらの結果は、
ＱＩＤファージの数種類の異なる腫瘍細胞型への親和性を示している。

【手続補正２６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３８】 「ＨＥＷ」ファージの選択についてと同じプロトコールを、ｐＨＤ−Ｃ７Ｃラ
イブラリーを用いて繰り返した。この選択からの第五のプールは配列CLPSTRWTC
（配列番号７６）を示すファージを含み、サブトラクター２９３細胞と比較して
ＷｉＤｒ細胞への特異的結合を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/04 9/04 9/10 9/10 １０１ １０１ 21/00 21/00 35/00 35/00 35/02 35/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ００４４０２２９．３ (32)優先日 平成12年８月21日(2000．8．21) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ６０／２４６，０９１ (32)優先日 平成12年11月７日(2000．11．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＡＵ，Ｃ Ａ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 バレリ、シュレイベ フランス国イルキルク、グラーフェンスタ ーデン、ルート、ド、リヨン、55ア Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA01 CA11 EA02 EA04 EA10 GA11 HA17 HA20 4C076 CC03 CC07 CC11 CC27 EE41 FF70 4C084 AA13 AA17 NA13 ZA362 ZA452 ZA942 ZB262 4C087 BC83 CA12 NA13 ZA36 ZA45 ZA94 ZB26 ZB27 4H045 AA10 AA30 BA16 BA17 EA20

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 X₁LSPQRASQRLYSX₂、 X₁WKSELPVQRARFX₂、 X₁CNDIGWVRCX₂、 X₁CWPYPSHFCX₂、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂、 X₁WPTSPWLEREPAX₂、 X₁WPTSPWSSRDWSX₂、 X₁HEWSYLAPYPWFX₂、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂、 X₁CLPSTRWTCX₂、および X₁CWPMKSX₅FCX₂ (上記式中、それぞれのX₁およびX₂は、互いに独立してn個のアミノ酸からなる任
   意のアミノ酸配列を表し、nは0〜50であり且つnはX₁およびX₂で同一であるかま
   たは異なっており、X₅は任意のアミノ酸を表わす) からなる群から選択される、ペプチド。
2. 【請求項２】 標的細胞にターゲッティングするための、請求項１に記載のペプチドの使用。
3. 【請求項３】 (i) SPQ、QRA、QRLもしくはPQR、またはそれらの任意の組合せ、および (ii) SELもしくはPVQ、またはSELおよびPVQ、 からなる群から選択される少なくとも１個の三アミノ酸モチーフを含んでなる、
   心臓ターゲッティングペプチド。
4. 【請求項４】 X₁LSPQRASQRLYSX₂またはX₁WKSELPVQRARFX₂の配列（それぞれのX₁およびX₂は、
   互いに独立してn個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、nは0〜50で
   あり且つnはX₁およびX₂で同一であるかまたは異なっている）を有する、請求項
   ３に記載の心臓ターゲッティングペプチド。
5. 【請求項５】 (i) NDI、WPY、MPL、PSH、LPQ、WPVもしくはWPT、またはそれらの任意の組合
   せ、および (ii) HEW、QID、WPMもしくはCLP、またはそれらの任意の組合せ、 からなる群から選択される少なくとも１個の三アミノ酸モチーフを含んでなる、
   腫瘍ターゲッティングペプチド。
6. 【請求項６】 下記の配列： (i) X₁CNDIGWVRCX₂、 X₁CWPYPSHFCX₂、 X₁MPLPQPSHLPLLX₂、 X₁LPQRAFWVPPIVX₂、 X₁WPVRPWMPGPVVX₂、 X₁WPTSPWLEREPAX₂、もしくは X₁WPTSPWSSRDWSX₂、または (ii) X₁HEWSYLAPYPWFX₂、 X₁QIDRWFDAVQWLX₂、 X₁CLPSTRWTCX₂、もしくは X₁CWPMKSX₅FCX₂ (上記式中、それぞれのX₁およびX₂は、互いに独立してn個のアミノ酸からなる任
   意のアミノ酸配列を表し、nは0〜50であり且つnはX₁およびX₂で同一であるかま
   たは異なっており、X₅は任意のアミノ酸を表わす) を有する、請求項５に記載のペプチド。
7. 【請求項７】 心臓細胞にターゲッティングするための、請求項３または４に記載のペプチド
   の使用。
8. 【請求項８】 腫瘍細胞、転移または腫瘍脈管構造にターゲッティングするための、請求項５
   または６に記載のペプチドの使用。
9. 【請求項９】 結腸直腸腫瘍細胞にターゲッティングするための、X₁HEWSYLAPYPWFX₂、X₁QIDR
   WFDAVQWLX₂およびX₁CLPSTRWTCX₂からなる群から選択される、請求項６に記載の
   ペプチドの使用。
10. 【請求項１０】 癌腫瘍細胞にターゲッティングするための、請求項６に記載のペプチドX₁CWPY
    PSHFCX₂の使用。
11. 【請求項１１】 請求項１および３〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１個のペプチドと少
    なくとも１種類の治療薬、あるいは請求項１および３〜６のいずれか一項に記載
    のペプチドをコードする少なくとも１種類の核酸分子と少なくとも１種類の治療
    薬を含んでなる、組成物。
12. 【請求項１２】 前記治療薬が、目的とする少なくとも１種類の遺伝子を脊椎動物の標的細胞に
    送達するためのベクターである、請求項１１に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 前記ベクターがプラスミド、合成ベクターまたはウイルスベクターである、請
    求項１２に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 前記ペプチドが、共有結合、非共有結合または遺伝学的手段によって前記治療
    薬に機能しうる形でカップリングされている、請求項１１〜１３のいずれか一項
    に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 遺伝子導入を目的とする薬剤を調製するための、請求項１１〜１４のいずれか
    一項に記載の組成物の使用。