WO2004096289A1 - 遺伝子導入効率増強剤 - Google Patents

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gene transfer
gene therapy
efficiency
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Takashi Okada
Keiya Ozawa
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Fujisawa Pharmaceutical Co
Takashi Okada
Keiya Ozawa
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to an agent capable of enhancing the efficiency of gene transfer into cells using adeno-associated virus vectors (hereinafter also referred to as AAV vectors). More particularly, the present invention relates to an agent for enhancing the efficiency of gene transfer by AAV vector, which contains a compound having a histone deacetylase inhibitory activity.
  • AAV vectors adeno-associated virus vectors
  • Gene therapy is considered to be an effective means for intractable disease treatment, and more than 600 gene therapy protocols have been submitted mainly in Europe and the United States.
  • adenoviruses are known for gene therapy.
  • adenoviruses are known to cause strong inflammation in the liver and brain in clinical trials.
  • retroviruses there are concerns about insertion mutations due to random integration into chromosome DNA and the associated induction of cancer.
  • adeno-associated virus (hereinafter referred to as AAV) vectors are: 1) no pathogenicity, 2) low immunoreactivity, 3) gene transfer efficiency into undifferentiated cells, 4) transgenes Is expressed over a long period of time, and is particularly superior in safety compared to the above-described letovirus vectors and adenovirus vectors.
  • vectors that apply AAV of various serotypes including types 1 to 5 have also been developed. By applying differences in infection targets of each serotype, gene expression in various tissues can be achieved. Is possible. Because of these features, AAV vectors are promising in gene management. For example, AAV vectors have been used mainly for protein replacement therapy by intramuscular administration. However, AAV vectors have low gene transfer efficiency, especially for cancer cells, and AAV vectors have not been of much interest in cancer treatment, which requires introduction of the target gene into all cells.
  • a histone deacetylase inhibitor Inores receptors (integrin and CAR (coxsackievirus adenovirus receptor)) have been reported to increase gene expression.
  • CAR coxsackievirus adenovirus receptor
  • a AV vector it has been reported that gene expression in cells that have been continuously passaged for a long time after infection and have been integrated into a non-expressed genome can be reactivated by a histone deacetylase inhibitor. (See, for example, Chen et al., Proceedings of the National Academy of sciences USA, vol 94, pp. 5798-5803 (1997)).
  • An object of the present invention is to overcome the disadvantage of low gene transfer efficiency that has been conventionally prevented from being applied while maintaining the advantages of the AAV vector. Furthermore, another object of the present invention is to provide an agent for enhancing the efficiency of gene introduction into cells that can be used as a medicine, particularly suitable for gene therapy, particularly cancer gene therapy.
  • the present inventors have derived that the expression is attenuated after integration into the chromosome. Through a mechanism different from the previous report that histone deacetylase inhibitors were reactivated, it was found that histone deacetylase inhibitors enhance the efficiency of gene transfer by AAV vectors.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • An introduction efficiency enhancing agent for gene transfer using an adeno-associated virus vector which contains a histone deacetylase inhibitor as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing the influence of FK228 on the expression of CD51 (integrin) and the relationship with the transgene expression enhancing action of FK228.
  • FIG. 1A is a graph showing the appearance rate (%) of CD 51-positive cells when U 2 51 MG is treated with various concentrations of FK 2 28.
  • FIG. 1B is a graph showing the appearance rate (%) of EGFP (introduced gene) positive cells when FK 2 28 is used at the time of gene transfer using an AAV vector.
  • Figure 2 is a graph examining the effect of F K 2 28 on the copy number of the viral genome incorporated into cells.
  • the vertical axis shows the number of genome copies, and the horizontal axis shows the elapsed time after infection.
  • histone deacetylase inhibitor refers to a compound that competes with and binds to the active site of histone deacetylase, or is different from the active site of histone deacetylase. Intended for compounds that have the action of binding to the site and altering the enzymatic activity of histone deacetylase, including compounds already known for their use as histone deacetylase inhibitors, exhibiting histone deacetylase inhibitory activity Includes all compounds that are reported to have (synthetic or natural) as well as all compounds with this activity that will be reported in the future.
  • a compound having the structure represented by the following formula (I) (hereinafter also simply referred to as Compound A; SEQ ID NO: 1) or a salt thereof or a derivative thereof (for example, acetylated compound A or S— A thiol compound in which the S bond is reduced).
  • Compound A SEQ ID NO: 1
  • a salt thereof or a derivative thereof for example, acetylated compound A or S— A thiol compound in which the S bond is reduced.
  • Compound A may have stereoisomers such as optical isomers or geometric isomers based on asymmetric carbon atoms and double bonds (for example, F K228 represented by the following formula (II)). These isomers and mixtures thereof are also included in the scope of the histone deacetylase inhibitors used in the present invention.
  • solvates of Compound A, FK 228 or salts thereof are also included in the scope of the present invention.
  • the compound ⁇ simply means a compound group regardless of stereoisomerism, including the compound (FK228) represented by the formula (II).
  • Compound A or a salt thereof is a known substance and is available.
  • FK 2 28, which is one of the stereoisomers of compound A is obtained by culturing a strain belonging to the genus Chromopacterium that can produce it under aerobic conditions and recovering the substance from the culture broth.
  • Examples of strains belonging to the genus Chromopacterium that can produce FK 2 28 include chromopacterium 'violaceum WB 9 6 8 (FE RM BP— 1 9 6 8).
  • FK 2 2 8 can be obtained from the producing bacteria as described in Japanese Patent Publication No. 7-6 4 8 7 2 (corresponding US Pat. No. 4,977 7 1 3 8).
  • FK 2 28 is preferably recovered from a strain belonging to the genus Chromopacterium that can produce FK 2 28 in that it can be obtained more easily, but further purification steps are unnecessary or less.
  • synthetic or semi-synthetic FK 2 28 is also advantageous.
  • compound A other than FK 2 28 can be semi-synthesized or fully synthesized by a conventionally known method. More specifically, it can be produced according to the method reported by Khan W. Li, et al. (J. Am. Chem. Soc., Vol. 118, 7237-7238 (1996)).
  • the salt of compound A includes salts with inorganic bases (for example, alkali metal salts such as sodium salt and strong salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, ammonium salt), and organic bases.
  • Salt for example, organic amine salts such as triethylamine salt, diisopropylpropylamine salt, pyridine salt, picoline salt, ethanolamine salt, trietanololamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N, -dibenzylethylenediamine salt
  • inorganic acid Addition salts eg, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.
  • organic carboxylic acids and sulfonic acid addition salts eg, formate, acetate, trifluoroacetate, maleate, tartrate
  • (foreign) gene transfer efficiency is desired to be enhanced as various animals such as humans, mice, rats, puta, inu, horses, tusks, monkeys, and the like.
  • increasing the expression of a transgene means that the expression of a foreign gene introduced by a genetic engineering technique in a host cell is enhanced.
  • the transgene expression enhancement may be performed at the cellular level or at the animal level.
  • enhancement of gene introduction efficiency means that the rate of introduction of foreign genes into cells by the AAV vector increases.
  • genes can be efficiently introduced into cells, particularly tumor cells, using AAV vectors.
  • AAV vectors results in safe and stable expression of such introduced genes.
  • An AAV vector carrying a desired foreign gene is prepared by inserting a gene of interest into a 'wild type AAV. For example, the following procedure is performed. First, a plasmid in which the target gene is inserted between the wild-type AAV V ITRs at the two ends is prepared (AAV vector plasmid). On the other hand, a helper virus-derived helper plasmid is separately prepared to supply virus proteins necessary for virus replication and virus particle formation. Recombinant AAV vectors can be obtained by introducing both plasmids into, for example, 293 cells by transfection and infecting with helper virus. More specifically, for example, it can be performed based on the following references.
  • AA V itself does not have replication capability, so replication requires a helper virus
  • a system that does not require a helper virus is possible by devising a helper plasmid, and such an embodiment is also included in the present invention.
  • the agent for enhancing gene transfer efficiency comprises a histone deacetylase inhibitor such as compound A or a salt thereof as an active ingredient, and an organic or inorganic carrier or excipient suitable for oral or parenteral application.
  • a histone deacetylase inhibitor such as compound A or a salt thereof as an active ingredient
  • an organic or inorganic carrier or excipient suitable for oral or parenteral application.
  • the active ingredients are, for example, conventional powders, tablets, pellets, capsules, suppositories, liquids, emulsions, suspensions, aerosols, sprays and other forms suitable for use. It can be combined with non-toxic, pharmaceutically acceptable carriers. Further, if necessary, auxiliary agents, stabilizers, thickeners and the like may be used.
  • Compound A or a salt thereof may be contained in the enhancer in an amount sufficient to produce a desired effect for a state where enhancement of gene transfer efficiency is required.
  • the administration method of the gene introduction efficiency enhancer containing the histone deacetylase inhibitor of the present invention as an active ingredient is not particularly limited as long as the expression of the gene introduced by the AAV vector is enhanced.
  • parenteral administration i.e. intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, direct administration within tissue, intranasal administration, intradermal administration, intrathecal fluid administration, intrabiliary administration, Vaginal administration is preferred.
  • a therapeutically effective dose of the active ingredient requires the type of histone deacetylase inhibitor used, the age and condition of the individual patient to be treated, the type of transgene, and the enhanced expression of the gene. It depends on the type of disease to be determined, and depends on them.
  • the present invention is characterized by enhancing the efficiency of gene introduction and thus enhancing the expression of the transgene, and this effect is an important factor due to the interaction with the transgene. Therefore, the timing of administration of the foreign gene and the gene transfer efficiency enhancer of the present invention are appropriately determined according to the desired effect.
  • the purpose is to enhance the expression of a transgene
  • the timing of administration is appropriately determined according to the desired effect and its degree, but it does not reactivate the introduced gene, but increases the efficiency of introduction of the foreign gene using the AAV vector and enhances the expression of the introduced gene.
  • the histone deacetylase inhibitor which is an active ingredient, has a tumor effect and gene transfer.
  • the gene introduction efficiency enhancing agent of the present invention can be administered before or after administration of an AAV vector (including a desired foreign gene).
  • any gene can be selected as long as it is desired to be expressed.
  • various genes used for gene therapy can be mentioned, and specifically, cytosine deaminase gene, herpes simplex virus Examples include thymidine kinase (HSV-TK) gene and Bim-S gene (see Gene Ther. 2003 Mar; 10 (5): 375-385).
  • HSV-TK thymidine kinase
  • Bim-S gene see Gene Ther. 2003 Mar; 10 (5): 375-385.
  • gene therapy for cancer includes introduction of suicide genes and DNA vaccines.
  • the introduction of a suicide gene includes the introduction of a cytosine deaminase gene, which is an enzyme that converts the anticancer agent 5-fluorocytosine (5-FC) into 14 anticancer activities, into the cancer cell.
  • cytosine deaminase gene which is an enzyme that converts the anticancer agent 5-fluorocytosine (5-FC) into 14 anticancer activities, into the cancer cell.
  • Expression of cancer can be enhanced by the present invention (inducing anti-tumor effect by converting 5-FC to an active form specifically for cancer cells) )
  • the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene is introduced into cancer cells, and then the antiviral ganciclovir (GCV) is administered.
  • HSV Phosphorylated GCV produced by TK inhibits cancer cell DNA synthesis and exerts an antitumor effect.
  • DNA vaccines include cancer antigen genes that are specifically expressed in cancer cells, and the introduction of these genes into cancer patients or the reactivation of endogenous cancer antigen genes that have been suppressed in expression. In addition, or both, it is possible to enhance cancer immunity of patients by enhancing the functional expression of cancer antigenic genes. .
  • gene therapy for cancer includes p53 gene, cytokine gene (eg IL2, IL12 gene), antisense gene (EGFR antisense, SDF-1 antisense, K-ras antisense), siRNA, etc. Can be used.
  • cytokine gene eg IL2, IL12 gene
  • antisense gene EGFR antisense, SDF-1 antisense, K-ras antisense
  • siRNA etc.
  • CFTR gene can be used as gene therapy for cystic fibrosis
  • coagulation factor gene can be used as gene therapy for hemophilia.
  • the introduction efficiency enhancing agent for gene introduction of the present invention containing a histone deacetylase inhibitor as an active ingredient is useful for gene therapy of cancer. Further, the histone deacetylase inhibitor itself Therefore, it is preferable to use the enhancer of the present invention for cancer treatment.
  • compound A is preferred because its anticancer effect can be further enhanced by gene therapy using an AAV vector.
  • the gene introduction efficiency enhancer of the present invention containing a histone deacetylase inhibitor as an active ingredient can be expected to have an effect in various tissues or organs.
  • the effect of enhancing transgene expression in muscles and nerves can be mentioned.
  • the introduction efficiency of foreign genes in various tissues or organs is enhanced, so that neuromuscular diseases (myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), etc.), heart failure, cardiomyopathy, secretory type Diseases that express protein and are treated with protein replacement therapy (chronic systemic diseases such as arteriosclerosis, hypertension, heart failure, diabetes, hyperlipidemia), cerebral infarction, It is considered useful for gene therapy such as reperfusion injury after cerebral ischemia, Parkinson's disease, various neurodegenerative diseases, mitochondrial encephalomyopathy, epilepsy, schizophrenia (schizophrenia), and alcoholism.
  • the gene to be introduced can be appropriately changed according to the target disease.
  • the agent for enhancing gene transfer efficiency of the present invention enhances the gene transfer efficiency by adeno-associated virus vector, and particularly, it should be used for gene therapy for cancer. May be included in a commercial package.
  • the commercial package may contain other necessary reagents and equipment.
  • FK 2 2 8 isolated and purified according to the description in JP-B-7-6 4 8 7 2 was used as a histone deacetylase inhibitor.
  • F K 2 28 was dissolved in ethanol and stored. During use, the concentration was adjusted with the medium (examined within the range of 0—100,000 n g / m 1).
  • AAV vector genomic plasmid and helper plasmid were introduced into 29 3 cells by the calcium phosphate method, and 1-5 type AAV vector expressing EGFPP (Enhanced Green Fluorescent Protein) with cytomegalovirus (CMV) promoter was prepared. Specifically, it was performed according to the method described in the following literature. Reference 1: Methods 2002; 8: 237-247 (above)
  • U251MG was obtained from JCRB Cell Punk, National Institute of Food and Health, cells. Eagle MEM containing 10% urine fetal serum (FBS)
  • 9 L was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% FBS.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • HEp-2 was obtained from Tohoku University Institute of Aging Medicine and Medical Cell Resource Center. Cells in Eagle's MEM containing 10% FBS, and cultured in 5% C0 2 present under 37 ° C.
  • the cells obtained as surgical specimens are cells that are positive for GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) and vimentin and are considered to be derived from glioma from pathological diagnosis.
  • GFAP Gel Fibrillary Acidic Protein
  • the transgene expression enhancing effect of FK228 was confirmed in glioma cells.
  • human glioma cell line U 251MG 1 x 10 4 genome copies of type 2 AAV vector per cell was cultured with FK228 (0, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 ng / m 1) After 24 hours, the expression of EG FP was observed with a fluorescence microscope. Depending on the dose of FK228, enhanced expression of EGFP was observed, particularly when FK228 was added at a concentration of 1 ng / ml or more.
  • the gene expression enhancing effect was observed within 24 hours because the AAV virus genome was histone-modified at the episomal stage that was not integrated into the chromosome, and the expression was regulated and the expression was enhanced. Suggests the possibility.
  • FK228 could enhance the gene transfer efficiency of AAV vector for HEp-2, a head and neck cancer cell line, and human glioma secondary cultured cells prepared from surgical specimens.
  • the addition of 1 ngZm FK228 was observed to enhance the expression of EGFP, and the effect of enhancing the introduction efficiency of the gene transfer of the present invention was confirmed.
  • Example 2 Relationship between enhancement of gene transfer efficiency by addition of FK228 and integrin expression
  • the gene expression enhancement effect obtained when an adenovirus vector and a histone deacetylase inhibitor are used in combination is thought to be due to the induction of receptors such as integrins by histone deacetylase inhibitors. It was examined whether such a mechanism is also involved in the present invention.
  • FACS buffer PBS supplemented with 5% FBS and 0.05% sodium azide
  • Fluorescence by EGFP, PE and ViaProbe is FL 1, FL 2 and FL 3, respectively. Detected. Via—Probe negative indicates that the cells are alive, and such cells were used to measure EG FP and / or CD51 expression.
  • Example 3 Effect of addition of FK228 on the number of copies of viral genome incorporated into cells
  • U 251MG is supplemented with F K228 (1 ng / m 1) type 2 AAV betater with 1 X 10 4 genome copies per cell in the culture supernatant, and real-time PCR is performed to determine the number of copies of the viral genome incorporated into the cells.
  • F K228 (1 ng / m 1) type 2 AAV betater with 1 X 10 4 genome copies per cell in the culture supernatant
  • real-time PCR is performed to determine the number of copies of the viral genome incorporated into the cells.
  • AB I Pri sm 7700
  • QI AGEN SYBR Green PGR kit Qu ant ct
  • Intracellular copy numbers were compared over time (0, 2, 4, 12 and 24 hours) after infection of type 2 AAV vectors in U251MG cells.
  • the FK228 treatment group showed a slight increase after 24 hours, but no significant difference was observed. The result is shown in figure 2.
  • Histone deacetylase inhibitors particularly histone deacetylase inhibitory activity compound A or a salt thereof, which has a low activity of introducing a gene, is conventionally introduced. It has excellent gene transfer efficiency for gene transfer using a vector associated with an adeno-associated virus into tumor cells. Therefore, it is used for clinical use, especially gene therapy, and also for cancer gene therapy. It can be preferably used.
  • Sequence listing free text 'SEQ ID NO: 1 Xaa is an amino acid represented by the formula NH 2 C (CHCH 3 ) CO OH.

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Abstract

本発明の、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（特に化合物Ａ）を有効成分として含有する、アデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤はアデノ随伴ウイルスベクターの有する利点を維持しつつ、遺伝子導入効率を増強させることが可能である。

Description

明細書
遺伝子導入効率増強剤
本発明は、 アデノ随伴ウィルスベクター （以下 AAVベクターともいう） によ る細胞への遺伝子導入において、 その導入効率を増強させることが可能な剤に関 する。 より詳しくはヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性を有する化合物を含有する、 AAVベクターによる遺伝子導入の導入効率の增強剤に関する。
背景技術
遺伝子治療は、 難病治療に有効な手段であると考えられ、 欧米を中心に既に 6 0 0以上の遺伝子治療プロトコールが提出されている。
現在、 遺伝子治療に用いられるベクターにはアデノウイルスやレトロウイルス を利用したものなどが知られている。 しかしながら、 アデノウイルスは臨床試験 において肝臓や脳において強い炎症を起こすことが知られており、 またレトロゥ ィルスでは、 染色体 D NAへのランダムな組込みによる挿入変異、 それに伴う癌 の誘発が懸念される。
一方、 アデノ随伴ウィルス （以下 AAV) ベクターは、 1 ) 病原性がないこと、 2 ) 免疫反応性が低いこと、 3 ) 非分 ¾細胞への遺伝子導入効率が可能であるこ と、 4 ) 導入遺伝子が長期間発現すること、 といった特長を備えており、 特に上 記レト口ウィルスベクターやアデノウィルスベクターなどに比べて安全面で優れ ている。 また、 近年は 1〜 5型をはじめとする各種血清型の AAVを応用したベ クタ一も開発されており、 各血清型の感染標的の違いを応用して、 様々な組織で の遺伝子発現が可能である。 これらの特長がゆえに、 AAVベクターは遺伝子治 寧において有望視されている。 例えば、 AAVベクターは従来筋肉内投与による 蛋白質補充療法などを中心に用いられてきた。 しかしながら、 AAVベクターは 特に癌細胞について遺伝子導入効率が低く、 全ての細胞に目的遺伝子を導入する ことが求められる癌治療において AAVベクターはあまり関心が持たれていなか つたのが現状である。
アデノウイルスベクターの場合には、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤によりゥ イノレスの受容体 (インテグリンや C A R (coxsackievirus adenovirus receptor) ) が増加し、 遺伝子発現が増強されることが報告されている。 一方 A AVベクターについては、 感染後に長期間継代を続けてゲノムがインテグレート されゲノムが非発現状態となつた細胞における遺伝子発現をヒストンデァセチラ —ゼ阻害剤により再活性化させることが報告されている （例えば Chen et al. , Proceedings of the National Academy of sciences USA, vol 94, pp. 5798 - 5803 (1997)参照）。
しかし、 AAVベクタ一を用いた遺伝子治療においては、 非発現状態となった 細胞の再活性化ではなく、 AAVによる遺伝子導入後の （非発現状態ではない） 細胞に対する導入効率が重要であるのに対して、 これらに関する検討は従来報告 されていない。
発明の開示
本発明の目的は、 AAV.ベクターの有する利点を維持しつつ、 従来その適用を 阻んできた遺伝子導入効率の低さという欠点を克服することにある。 さらに本発 明の別の目的は、 医薬として使用できる、 特に遺伝子治療、 とりわけ癌の遺伝子 治療に好適に使用できる細胞への遺伝子導入の導入効率増強剤を提供することに ある。
通常、 AAVベクターの場合には細胞内へのウィルスの取り込みよりも、 発現 型への変換がその遺伝子発現において重要であり、 ヒストンデァセチラーゼ阻害 剤による受容体発現の増強のみでは、 遺伝子発現に及ぼす効果はあまり期待でき ないと考えられてきた。 しかしながら驚くべきことに、 本発明者らは、 AAVベ クタ一により細胞に遺伝子を導入する際、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤を併用 することによって、 顕著にその遺伝子導入効率が上昇することを見出した。 この 際、 インテグリン発現にも増加現象は認められたが、 その変化は遺伝子導入効率 の変化に比べて小さいものであり、 また、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤処 群 と未処理群との間で導入遺伝子のコピー数に差は認められなかった。
かかる知見から、 本発明者らは、 染色体に組み込まれた後に発現が減弱した導 入遺伝子をヒストンデァセチラーゼ阻害剤が再活性化したという従来の報告とは 異なる機序によって、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤が A A Vベクターによる遺 伝子導入の導入効率を増強させることを見出して本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) ヒストンデァセチラーゼ阻害剤を有効成分として含有する、 アデノ随伴ゥ ィルスべクタ一による遺伝子導入の導入効率増強剤。
(2) ヒストンデァセチラーゼ阻害剤が、
式 （I)
Figure imgf000005_0001
で表される化合物またはその塩である、 上記 （1) に記載の増強剤。
(3) 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 上記 （1) または (2) に記載の増強剤。 '
(4) 医薬である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載の増強剤。
(5) 医薬が遺伝子治療用である上記 （4) 記載の増強剤。
(6) 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 上記 （5) 記載の増強剤。 (7) アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入における導入効率の増強が 所望される対象に、 有効量のヒストンデァセチラーゼ阻害剤を投与することを含 む、 アデノ随伴ウイルスべクタ一による遺伝子導入の導入効率を増強する方法。 (8) ヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤が、 式 （I) で表される化合物またはその 塩である、 上記 （7) 記載の方法。
(9) 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 上記 （7) または (8) に記載の方法。
(10) 遺伝子治療において実施されることを特徴とする、 上記 （7) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の方法。
(1 1) 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 上記 （10) 記載の方 法。
(12) アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤を製造 する為のヒストンデァセチラーゼ阻害剤の使用。
(13) ヒストンデァセチラーゼ阻害剤が、 式 （I) で表される化合物またはそ の塩である、 上記 （12) 記載の使用。
(14) 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 上記 （12) また は （13) に記載の使用。
(15) アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤が医薬 である、 上記 （12) 〜 （14) のいずれか 1項に^載の使用。
(16) 医薬が遺伝子治療用である、、上記 （15) 記載の使用。
(17) 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 上記 （16) 記載の使 用。
(18) 上記 （1) 〜 （6) のいずれか 1項に記載の増強剤と、 当該増強剤を遺 伝子治療に使用し得る力使用すべきであることを記載した記載物とを含む商業的 パッケージ。
(19) 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 上記 （18) 記載のパ
、ソケ ン。
図面の簡単な説明
図 1は、 CD 51 (インテグリン） の発現に及ぼす FK 228の影響なら ぴに FK228の導入遺伝子の発現増強作用との関係を示すグラフである。 図 1 Aは、 種々の濃度の F K 2 2 8で U 2 5 1 MGを処理した場合の C D 5 1陽性細胞の出現率 （％) を示すグラフである。 図 1 Bは、 AA Vベクター を用いた遺伝子導入の際に、 F K 2 2 8を併用した場合の E G F P (導入遺 伝子） 陽性細胞の出現率 （％) を示すグラフである。
図 2は、 細胞内に取り込まれたウィルスゲノムのコピー数に及ぼす F K 2 2 8 の影響を調べたグラフである。 縦軸はゲノムコピー数を、 横軸は感染後の経過時 間を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中、 「ヒストンデァセチラーゼ阻害剤」 とは、 ヒストンデァセチラ一 ゼの活性部位に基質と競合して結合する化合物、 またはヒストンデァセチラーゼ の活性部位とは別の部位に結合してヒストンデァセチラーゼの酵素活性を変える 作用を有する化合物を意図し、 既にヒストンデァセチラーゼ阻害剤として、 その 用途が公知の化合物を含め、 ヒストンデァセチラーゼ阻害活性を有することが報 告されている全ての化合物 （合成、 天然を問わない） ならびに今後報告されるで あろう当該活性を有する全ての化合物を含む。 具体的には、 下記式 （I ) で示さ れる構造を有する化合物 （以下、 単に化合物 Aともいう ；配列番号 1 ) またはそ の塩やその誘導体 （例えば、 化合物 Aをァセチル化したものや S— S結合を還元 したチオール体など） が挙げられる。 さらにトリコスタチン A、 酪酸ナトリウム、 suDeroylanilide hydroxamic acid A S AHA)、 M S— 2 7 5、 Cyclic hydroxamic— acid - containing peptide、 Apicidin、 Trapoxinなどもヒス卜ンデ -ァセチラーゼ阻害活性を有することが報告されている化合物である。
Figure imgf000008_0001
化合物 Aは、 不斉炭素原子および二重結合に基づく光学異性体または幾何異性 体などの立体異性体を有することがあるが （例えば下記式 （I I) で示される F K228)、 これらすベての異性体及ぴそれらの混合物もこの発明において用い られるヒストンデァセチラーゼ阻害剤の範囲に含まれる。
Figure imgf000008_0002
さらに、 化合物 A、 FK 228またはそれらの塩の溶媒和化合物 （例えば包接 化合物 （例えば水和物など)） もこの発明の範囲に含まれる。
本明細書中、 特に断りのない限り、 単に化合物 Αという場合には式 （I I) で 表される化合物 （FK228) も含む、 立体異性を問わない化合物群を意味する。 化合物 Aまたはその塩は、 公知の物質であり、 入手可能である。 例えば、 化合 物 Aの立体異性体の一つである F K 2 2 8は、 それを生産しうるクロモパクテリ ゥム属に属する菌株を好気性条件下に培養、 当該培養ブロスから当該物質を回収 することによって得ることができる。 F K 2 2 8を生産しうるクロモパクテリゥ ム属に属する菌株としては、 例えばクロモパクテリゥム 'ビオラセゥム WB 9 6 8 ( F E RM B P— 1 9 6 8 ) が挙げられる。 F K 2 2 8はより具体的には特 公平 7— 6 4 8 7 2号 （対応米国特許 4 9 7 7 1 3 8号） 公報に記載のとおりに して当該生産菌から得ることができる。 F K 2 2 8は、 より容易に入手できると いう点で、 F K 2 2 8を生産しうるクロモパクテリゥム属に属する菌株からの回 収が好ましいが、 さらなる精製工程が不要あるいは少なくてすむという点で、 合 成あるいは半合成の F K 2 2 8もまた有利である。 同様に F K 2 2 8以外の化合 物 Aについても、 従来公知の方法により半合成、 全合成することができる。 より 具体的には Khan W. Li，らによって報告されている方法 （J. Am. Chem. Soc.， vol. 118， 7237-7238 (1996) ) に準じて製造することができる。
化合物 Aの塩としては、 無機塩基との塩 （例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩な どのアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 アンモ-ゥム塩）、 有機塩基との塩 （例えばトリェチルァミン塩、 ジイソプロピ ルェチルァミン塩、 ピリジン塩、 ピコリン塩、 エタノールアミン塩、 トリエタノ ールァミン塩、 ジシクロへキシルァミン塩、 N, N， ージベンジルエチレンジァ ミン塩などの有機アミン塩)、 無機酸付加塩 （例えば塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫 酸塩、 リン酸塩など）、 有機カルボン酸 ·スルホン酸付加塩 （例えばギ酸塩、 酢 酸塩、 トリフルォロ酢酸塩、 マレイン酸塩、 酒石酸塩、 フマル酸塩、 メタンスル ホン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 トルエンスルホン酸塩など）、 塩基性あるい は酸性アミノ酸 （例えばアルギニン、 .ァスパラギン酸、 グルタミン酸など） との 塩などの、 塩基との塩または酸付加塩が挙げられる。
本発明において、 （外来） 遺伝子導入効率の増強が所望される対象としては、 ヒトをはじめ、 マウス、 ラット、 プタ、 ィヌ、 ゥマ、 ゥシ、 サルなど各種の動物 およびそれらの細胞であって、 「導入遺伝子の発現増強」 とは、 遺伝子工学的手 法により導入される外来遺伝子の宿主細胞中での発現を増強することを意味する。 当該導入遺伝子の発現増強は、 細胞レベルで行われるものであっても、 動物レべ ルで行われるものであってもよい。 本発明において 「遺伝子導入の導入効率の増 強」 とは、 AAVベクターによって外来遺伝子が細胞内に導入される割合が上昇 することを意味する。
本発明によれば AAVベクターを用いて、 細胞、 特に腫瘍細胞に遺伝子を効率 よく導入することができる。 AAVベクターを用いることにより、 そのように導 入した遺伝子の安全で安定な発現がもたらされる。
所望する外来遺伝子を保持する AA Vベクターは'野生型 AA Vに目的の遺伝子 を挿入することによって調製される。 例えば以下の手順で行われる。 まず、 野生 型 AA Vの两端の I T Rを残し、 その間に目的の遺伝子を揷入したプラスミドを 作製する （AAVベクタープラスミ ド）。 一方で、 ウィルス複製やウィルス粒子 形成に必要なウイルス蛋白質を供給する為に別にヘルパーウィルス由来のへルパ 一プラスミドを準備する。 両プラスミドを例えば 2 9 3細胞にトランスフエクシ ョンにより導入し、 ヘルパーウィルスを感染させることにより組換え AAVべク ターが得られる。 より詳細には例えば以下の参考文献に基づいて行うことができ る。
参考文献 1 ： Okada T， Nomoto T， Shimazaki Κ, Wang L, Lu Y, Matsushita T， Mizukami H, Urabe M， Hanazono Y， Kume A, Muramatsu S， Nakano I, Ozawa K. "Advances in AAV vectors for gene transfer to the brain. " Methods 2002； 8 :237-247.
参考文献 2 ： Okada T, Shimazaki K, Nomoto T， Matsushita T， Mizukami H, Urabe M， Hanazono Y, Kume A, Tobita K, Ozawa K， Kawai N. "Adeno - associated viral vector-mediated gene therapy of ischemia-induced neuronal death. " Methods Enzymol 2002； 346： 378-393.
AA V自身は複製能を有さないので、 複製にはヘルパーウィルスを必要とする I ヘルパープラスミドを工夫するなどして、 最近ではヘルパーウィルスを必要 としない系も可能であって、 本発明ではそのような態様も包含される。
本発明の遺伝子導入効率の増強剤は、 活性成分としてのヒストンデァセチラ一 ゼ阻害剤、 例えば化合物 Aまたはその塩を、 経口または非経口適用に適した有機 または無機の担体または賦形剤との混合物として含有する固体、 半固体または液 体形態の医薬製剤の形で使用できる。 該活性成分は、 例えば、 散剤、 錠剤、 ペレ ット剤、 カプセル剤、 坐剤、 液剤、 乳濁液、 懸濁液、 エアロゾル剤、 スプレー剤、 その他の使用に適した形態用の、 通常の、 無毒性で、 医薬として許容しうる担体 と混ぜ合わせることができる。 更に、 必要ならば、 助剤、 安定剤、 増粘剤などを 使用してもよい。 これらの担体、 賦形剤は必要に応じて無菌化処理を施したもの を使用してもよく、 また製剤化した後に無菌化処理を行うこともできる。 化合物 Aまたはその塩は、 遺伝子導入効率の増強が必要とされる状態に対して所望の効 果を生じるのに十分な量を当該増強剤に含ませればよい。
本発明のヒストンデァセチラーゼ阻害剤を有効成分として含有する遺伝子導入 効率の増強剤の投与方法は、 AAVベクターにより導入された遺伝子の発現が增 強されれば、 特に限定されない。
医薬製剤の形で使用する場合には、 経口、 非経口的に 1日 1回から数回にわた つて投与することができる。 特に遺伝子治療に使用する場合には、 非経口的投与、 即ち静脈内投与、 動脈内投与、 筋肉内投与、 組織内直接投与、 鼻腔内投与、 皮内 投与、 髄液内投与、 胆管内投与、 膣内投与などが好ましい。
活性成分の治療上有効な用量は、 使用するヒストンデァセチラーゼ阻害剤の種 類、 処置すべき個々の患者の年齢および状態、 ならびに導入遺伝子の種類や、 当 該遺伝子の発現増強を必要とする疾患の種類によっても相違し、 またそれらに依 存して決定される。
例えば、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤として化合物 Aを用いて持続静脈内投 与を行う場合、 成人 1日 1回、 l m g Zm2〜5 O m g /m2が好ましく、 更に 3 m g /m2〜 3 0 m g Zm2がより好ましい。 本発明は、 遺伝子の導入効率の増強、 ひいては導入遺伝子の発現を増強させる ことを特徴とするものであり、 当該効果は、 導入遺伝子との相互作用が重要な要 因となる。 したがって、 外来遺伝子の投与と、 本発明の遺伝子導入効率増強剤を 投与する時期は、 所望の効果に応じて適宜決定される。 例えば導入遺伝子の発現 増強を目的とする場合には、 導入、 発現増強を所望する外来遺伝子の投与と同時 に、 あるいは投与前または投与後に本発明の増強剤を投与することが好ましい。 投与時期は、 所望とする,効果やその程度に応じて適宜決定されるが、 導入され た遺伝子の再活性化ではなく、 A A Vベクターによる外来遺伝子導入の導入効率 を上げ、 導入遺伝子の発現を増強するという本発明の増強剤の目的 ·効果に鑑み れば、 本発明の増強剤は、 AAVベクターによる遺伝子導入と同時か、 直前又は 直後に投与することが好ましい。
また、 本発明の一態様として、 本発明の遺伝子導入効率増強剤を癌の遺伝子治 療に使用する場合には、 有効成分であるヒストンデァセチラーゼ阻害剤が有する ^腫瘍作用と遺伝子導入の導入効率増強作用との両作用を期待して、 AAVべク ター （所望の外来遺伝子を含む） の投与前または投与後に本発明の遺伝子導入効 率増強剤を投与することもできる。
外来遺伝子としては、 発現を所望する遺伝子であれば任意のものが選択できる 力 例えば遺伝子治療に使用されている種々の遺伝子が挙げられ、 具体的にはシ トシンデアミナーゼ遺伝子、 ヘルぺス単純ウィルスのチミジンキナーゼ （H S V - T K) 遺伝子や B i m—S遺伝子 （Gene Ther. 2003 Mar; 10 (5) : 375- 385参 照） などが例示される。
本発明は特に遺伝子治療に好適に使用することができる。 例えば癌に対する遺 伝子治療としては、 自殺遺伝子の導入や D NAワクチンなどが挙げられる。 自殺 遺伝子の導入としては、 抗癌剤 5—フルォロシトシン （5— F C) の抗癌活 14体 への変換酵素であるシトシンデァミナーゼ遺伝子の癌細胞への導入が挙げられ、 当該遺伝子の癌細胞内での発現を本発明により増強させることができる （癌細胞 特異的に 5— F Cを効率的に活性体に変換することにより抗腫瘍効果を誘導す る）。 或いは、 ヘルぺス単純ウィルスのチミジンキナーゼ （HSV— TK) 遺伝 子を癌細胞に導入し、 その後、 抗ウィルス剤であるガンシクロビル （GCV) を 投与する。 HSV— TKにより生じたリン酸化型 GCVが癌細胞の DNA合成を 阻害し、 抗腫瘍効果を発揮する。
DNAワクチンとしては、 癌細胞で特異的に発現している癌抗原遺伝子が挙げ られ、 当該遺伝子を癌患者に導入することにより、 あるいは発現抑制されている 内因性癌抗原遺伝子の再活' 14化により、 また、 あるいはその両方により、 癌抗原 性遺伝子の機能発現を増強させることによって患者の癌免疫を高めることができ る。 .
癌に対する遺伝子治療においては、 他に p53遺伝子や、 サイトカイン遺伝子 (例えば I L2、 I L12遺伝子）、 アンチセンス遺伝子 （EGFRアンチセン ス、 SDF— 1アンチセンス、 K— r a sアンチセンス） や s i RNAなどを用 いることができる。 また、 嚢胞性線維症の遺伝子治療としては C FT R遺伝子を、 血友病の遺伝子治療としては凝固因子遺伝子を使用することができる。
ヒストンデァセチラーゼ阻害剤を有効成分として含有する本発明の遺伝子導入 の導入効率増強剤が、 癌の遺伝子治療に有用であることは上記した通りである力 さらにヒストンデァセチラーゼ阻害剤自身の抗癌作用が期待できるので、 本発明 の増強剤を癌治療に用いることはいつそう好ましい。 特に化合物 Aにおいてはそ の抗癌作用としての効果を AAVベクターを用いた遺伝子治療でさらに増強させ ることができ好ましい。
更に、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤を有効成分として含有する本発明の遺伝 子導入効率増強剤は種々の組織あるいは器官において、 その効果が期待できる。 例えば筋肉や神経での導入遺伝子発現増強効果が挙げられる。 このように種々の 組織あるいは器官で外来遺伝子の導入効率を増強させることから、 神経筋疾患 (筋緊張性ジストロフィー、 筋萎縮性側索硬化症 （ALS) など）、 心不全、 心 筋症、 分泌型蛋白質を発現させて蛋白質補充療法により治療される疾患 （動脈硬 化症、 高血圧症、 心不全、 糖尿病、 高脂血症などの慢性全身性疾患）、 脳梗塞、 脳虚血後再灌流障害、 パーキンソン病、 各種の神経変性疾患、 ミトコンドリア脳 筋症、 てんかん、 統合失調症 （精神分裂病）、 アルコール依存症などの遺伝子治 療に有用と考えられる。
また E S細胞や造血幹細胞に対する遺伝子の導入にも有用である。
上記対象となる疾患に応じて導入すべき遺伝子は適宜変更することができる。 また、 本発明の遺伝子導入効率増強剤は、 それがアデノ随伴ウィルスベクター による遺伝子導入の導入効率を増強させるものであること、 特に癌に対する遺伝 子治療に用いるべきであることを記載した記載物とともに商業的パッケージに含 められてもよい。 当該商業的パッケージには他に必要な試薬や器具を含めておく ことができる。
実施例
以下、 本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、 本発明はこれらに何 ら限定されるものではない。 尚、 特に断りのない限り、 本実施例で使用する実験 材料は以下の通りである。 ·
実験材料
( 1 ) 薬剤
特公平 7— 6 4 8 7 2号公報の記載に準じて単離、 精製された F K 2 2 8をヒ ストンデァセチラ一ゼ阻害剤として用いた。 F K 2 2 8はエタノールで溶解し保 存した。 使用時は培地で濃度を調整して用いた （0— 1 0 0 n g /m 1の範囲で 検討)。
( 2 ) ベクター
A A Vベクターゲノムプラスミドとヘルパープラスミドをリン酸カルシウム法 にて 2 9 3細胞に導入し、 サイトメガロウィルス （CMV) プロモーターにて E G F P (Enhanced Green Fluorescent Protein) を発現する 1— 5型 AAVベタ ターを調製した。 具体的には以下の文献に記載されている方法に準じて行った。 参考文献 1 ： Methods 2002； 8 : 237-247 (上述）
参考文献 2 ： Methods Enzymol 2002； 346： 378 - 393 (上述) (3) 細胞および細胞培養
①ヒト神経膠腫細胞株； U251MG, U87MG
" U251MGは、 国立医薬品食品衛生研究所、 J CRB細胞パンクより入手し た。 細胞は、 10%ゥシ胎児血清 （FBS) を含有したイーグル MEM
(Eag丄 e s minimal essential medium) 中、 5 % C O2存在下 37 °Cで培養した。 U87MGは、 財団法人発酵研究所より入手した。 細胞は、 10%FBSを含有 したイーグル MEM中、 50/oC02存在下 37 °Cで培養した。
②ラット神経膠腫細胞株； 9 L
9 Lは、 アメリカンタイプカルチャーコレクション （ATCC) より入手した。 細胞は、 10%FB Sを含有した DMEM (Dulbecco' s modified Eagle' s medium) 中、 5 % C O 2存在下 37 °Cで培養した。
③ヒト頭頸部癌細胞株； HE p-2
HEp- 2は、 東北大学加齢医学研究所、 医用細胞資源センターより入手した。 細胞は、 10%F B Sを含有したイーグル MEM中、 5 %C02存在下 37°Cで 培養した。
④ヒト神経膠腫二次培養細胞 （手術標本）
手術標本として得られた当該細胞は、 GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) 及ぴビメンチン陽性であり、 病理診断から神経膠腫由来であると考え られた細胞である。
実施例 1 ： AAVベクターによる遺伝子導入効率に FK228が及ぼす影響
FK228の導入遺伝子の発現増強作用を、 神経膠腫細胞において確認した。 ヒト神経膠腫細胞株 U 251MGにおいて、 細胞当たり 1 X 104ゲノムコピー の 2型 AAVベクターを FK228 (0， 0. 01， 0. 1, 1， 10または 1 00 n g/m 1) と共に培養上清に添カ卩し、 24時間後に蛍光顕微鏡にて EG F Pの発現を観察した。 FK228の投与量に依存して EG FPの発現増強が観察 され、 特に 1 n g/ml以上の濃度の FK228を添加した場合にその効果は顕 著であった。 導入後 （感染後） 24時間以内で本発明に遺伝子発現増強作用が認められたこ とは、 染色体に組み込まれていない episomalな段階で AAVウィルスゲノムが ヒストン修飾を受け発現調節され発現が増強された可能性を示唆している。
頭頸部癌細胞株である H E p - 2、 手術標本より調製したヒト神経膠腫二次培 養細胞についても同様に AAVベクターの遺伝子導入効率を FK 228が増強し 得るのか否かを調べた。 いずれも、 1 n gZm lの FK228の添加により、 E GF Pの発現増強が観察され、 本発明の遺伝子導入の導入効率増強作用が確認さ れた。
実施例 2 ： FK228の添加による遺伝子導入効率の増強作用とインテグリン発 現との関係
アデノウィルスベクターとヒストンデァセチラーゼ阻害剤とを併用した場合に 得られる遺伝子発現の増強効果はインテグリンなどの受容体の発現がヒストンデ ァゼチラーゼ阻害剤によって誘導されることによると考えられているが、 このよ うな機序が、 本発明においても関与しているのか否かを検討した。
U251MGに細胞当たり 1 X 104ゲノムコピーの 2型 AAVベクターを F K228 (0, 0. 01， 0. 1または l n gZm l ) と共に培養上清に添加し、 24時間後に CD 51 (インテグリン） 及ぴ EGFPの陽性率を FACS解析に より検討した。 F ACS解析は、 FACSCa n (Becton Dickinson, San Jose, CA) を用い、 常法に従い、 Ce 1 1 Qu e s tソフトウェア （Becton
Dickinson, San Jose, CA) を用いて行った。
PE標識した抗 CD 51モノクローナル抗体： 13 C 2を Cymbus
Biotechnology Ltd. , Chandlers Ford, UKより入手した。 死細胞の検出には 7 —アミノーアクチノマイシン D (V i a— P r o b e ； P armingen, San Diego, CA) を用いた。
細胞を FACSバッファー （5%FB Sと 0. 05 %アジ化ナトリウムとが添 加された PB S) で洗浄し、 抗体で氷上 30分間インキュベートした。 EGFP、 PE及ぴ V i a-P r o b eによる蛍光をそれぞれ F L 1、 FL 2及ぴ FL 3で 検出した。 V i a— P r o b e陰性であれば細胞は生存していることを示し、 そ のような細胞を EG FP及び/又は CD 51発現の測定に用いた。
EGF Pの陽性率は 1 n g/m 1の FK228によって急激に増加したが、 ィ ンテグリン陽性率の変化はそれに比べて緩やかであった。 結果を図 1に示す。 これらの結果から、 FK228による遺伝子導入の導入効率の増強作用は、 F K228が細胞表面の受容体の数を増加させることによるものではないことがわ かる。
実施例 3 ： FK228の添加による、 細胞内に取り込まれたウィルスゲノムのコ ピー数に及ぼす影響
U 251MGに細胞当たり 1 X 104ゲノムコピーの 2型 AAVベタターを F K228 (1 n g/m 1 ) と共に培養上清に添カ卩し、 細胞内に取り込まれたウイ ルスゲノムのコピー数をリアルタイム PCR (AB I , P r i sm 7700 ; Q I AGEN, SYBR Gr e e n PGR k i t Qu a n t i Te c t) にて半定量した （Mol. Ther. 2002 Aug; 6(2) :272- 278に準じた方法で実 施）。 2型 AAVベクターを U 251MG細胞に感染後、 経時的 （0， 2, 4, 12及ぴ 24時間） に細胞内コピー数を比較した。 対照群 （溶媒のみ） と比較す ると、 FK228処理群では 24時間後には若干の増加が認められるものの有意 差は観察されなかった。 結果を図 2に示す。
これらの結果から、 FK228による導入遺伝子の発現増強作用は、 細胞内で のゲノムコピー数の増加によるものではないことがわかる。
産業上の利用分野
ヒストンデァセチラーゼ阻害剤、 特にヒストンデァセチラーゼ阻害活^~生を有す る化合物 Aまたはその塩からなる、 本発明の遺伝子導入の導入効率增強剤は従来 導入効率が低レ、とされてきた腫瘍細胞へのァデノ随伴ウィルスベクタ一による遺 伝子導入に対して、 優れた遺伝子導入効率を有しており、 したがって、 臨床での 使用、 特に遺伝子治療、 さらには癌の遺伝子治療に好適に使用し得る。
配列表フリーテキスト '配列番号 1 : Xa aは式 NH2C (CHCH3) C O OHで表されるアミノ酸であ る。
式 COOHCH2CH (CHCHC2H4SH) OHのカルボキシル基が 1番目 のアミノ酸である Va 1のァミノ基と結合し、 水酸基が 4番目のアミノ酸である V a 1のカルボキシル基と結合し、 SH基が 2番目のアミノ酸である Cy sの S H基とジスルフィド結合している。 本出願は、 日本で出願された特願 2003-122968を基礎としておりそ れらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1 . ヒストンデァセチラーゼ阻害剤を有効成分として含有する、 アデノ随伴ウイ ルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤。
2. ヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤が、
式 （I )
Figure imgf000019_0001
で表される化合物またはその塩である、 請求の範囲 1に記載の増強剤。
3 . 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 請求の範囲 1または 2 に記載の増強剤。
4. 医薬である請求の範囲 1〜3のいずれか 1項に記載の増強剤。
5 . 医薬が遺伝子治療用である請求の範囲 4記載の増強剤。
6 . 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 請求の範囲 5記載の増強剤。 7. アデノ随伴ウィルスべクターによる遺伝子導入における導入効率の増強が所 望される対象に、 有効量のヒストンデァセチラーゼ阻害剤を投与することを含む、 アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入の導入効率を増強する方法。
8. ヒストンデァセチラーゼ阻害剤が、 式 （I)
Figure imgf000020_0001
で表される化合物またはその塩である、 請求の範囲 7記載の方法。
9. 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 請求の範囲 7または 8 に記載の方法。
10. 遺伝子治療において実施されることを特徴とする、 請求の範囲 7〜9のい ずれか 1項に記載の方法。
1 1. 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 請求の範囲 10記載の方 法。
1 2. アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤を製造す る為のヒストンデァセチラーゼ阻害剤の使用。
3. ヒストンデァセチラーゼ阻害剤が、 式 （I)
CH3
CH CH3
Figure imgf000021_0001
で表される化合物またはその塩である、 請求の範囲 12記載の使用。
14. 遺伝子導入が腫瘍細胞に対して行われるものである、 請求の範囲 12また は 13に記載の使用。
15. アデノ随伴ウィルスベクターによる遺伝子導入の導入効率増強剤が医薬で ある、 請求の範囲 12〜14のいずれか 1項に記載の使用。
16. 医薬が遺伝子治療用である、 請求の範囲 15記載の使用。
17. 遺伝子治療が癌に対して実施されるものである、 請求の範囲 16記載の使 用。
18. 請求の範囲 1〜6のいずれか 1項に記載の増強剤と、 当該増強剤を遺伝子 治療に使用し得る力、使用すべきであることを記載した記載物とを含む商業的パッ ケージ。
19. 遺伝子治療が癌に対-して実施されるものである、 請求の範囲 18記載のパ ッケージ。
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