KR20190098215A

KR20190098215A - 무장된 복제-가능 종양 분해 아데노바이러스

Info

Publication number: KR20190098215A
Application number: KR1020197021313A
Authority: KR
Inventors: 마크 제이. 칸트웰; 위니 엠. 찬; 브렛 에왈드; 조안 엠. 로빈스
Original assignee: 멤젠 엘엘씨; 디엔에이트릭스
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-08-21
Also published as: WO2018118967A1; CN110650745A; CA3048185A1; AU2017379835A1; EP3565578A1; US20180169271A1; JP2020504767A

Abstract

본원에서는 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제-가능 종양 분해 아데노바이러스가 개시된다. 종양 분해 아데노바이러스는 복제 가능일 수 있다. 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 MEM40일 수 있다. 또한, 본원에서는 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드, 예를 들어, MEM40로 무장된(armed) 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스를 암을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는 방법이 개시된다.

Description

무장된 복제-가능 종양 분해 아데노바이러스

본 출원은 2016년 12월 21일자 출원된 미국가특허 출원 제62/437,474호 및 2017년 11월 9일자 출원된 미국가특허 출원 제62/584,008호의 우선권을 주장하며, 본원에서는 이들 둘 모두를 참조로 통합한다.

본 발명은 일반적으로는 바이러스학, 면역학 및 의학의 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 암의 치료를 위한 종양 분해 아데노바이러스 벡터(oncolytic adenovirus vector)의 조성물에 관한 것이다.

종양 분해 바이러스(oncolytic virus)는 이중 작용 메커니즘: 1) 직접적인 종양 용해를 생성시키는 종양 세포에서의 선택적 바이러스 복제를 통한 종양 세포 치사 및 2) 파괴된 종양 세포로부터 항원을 방출시킴으로써 전신 항-종양 면역성의 유도를 나타내는 일정한 부류의 암 치료제이다. 본래의 및 유전적으로 변형된 바이러스 둘 모두가 개발 중에 있다. US FDA는 2015년에 첫번째 종양 분해 바이러스, 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec)(IMLYGIC®, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), 문헌[Kohlhapp et. al. 2016 Clinical 암 Research]에 기재된 바와 같은 흑색종(melanoma)의 국소 치료를 위한 과립구-대식구 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)를 인코딩하는 유전적으로 변형된 헤르페스 바이러스를 승인하였다. 그러나, 흑색종은 많은 유형의 암 중 단지 하나이다. 또한, GM-CSF는 암 치료법에서 사용하기 위해서 조사 중인 많은 화합물 중 단지 하나이다. 추가로, 헤르페스바이러스는 이들의 종양 분해 특성과 관련하여 조사 중인 많은 바이러스 중 단지 하나이다.

따라서, 암의 치료를 위한 종양 분해 바이러스 벡터에 대한 요구가 여전하다.

배경 기술에서 논의된 주제 모두는 반드시 종래 기술은 아니며 단지 배경 기술에서의 이의 논의의 결과로서 종래기술인 것으로 추정되지 않아야 한다. 이러한 관점에 따라서, 배경 기술에서 논의되거나 그러한 주제와 연관된 종래 기술에서의 문제점에 대한 어떠한 인식은, 달리 명확하게 종래 기술인 것으로 언급되지 않는 한, 종래 기술로서 처리되지 않아야 한다. 그 대신, 배경 기술에서의 어떠한 주제의 논의는, 그 자체로 독창적일 수 있는, 특정의 문제에 대한 발명자의 접근 방법의 일부로서 처리되어야 한다.

이하 요약은 발명의 개시내용의 일부 양태의 기본적인 이해를 제공하기 위한 발명의 개시내용의 간략화된 요약을 나타낸다. 이러한 요약은 개시내용의 완전한 개관이 아니다. 이하 요약은 개시내용의 주요 또는 중요 요소를 확인하도록 의도되지 않거나 개시내용의 범위를 묘사하도록 의도되지 않는다. 이하 요약의 유일한 목적은 뒤에서 논의되는 더욱 구체적인 설명에 대한 서막(prelude)으로서 간략화된 형태로 일부 개념을 제시하기 위한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명 개시내용은 키메라 인간/마우스 CD40 리간드(chimeric human/mouse CD40 ligand)를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스에 관한 것이다. 종양 분해 아데노바이러스는 복제 가능할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명 개시내용은 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스를 포함하는 조성물을 종양을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는 방법에 관한 것이다.

어느 하나의 구체예에서, 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 ISF30-ISF41로부터 선택될 수 있고, 이들 중 MEM40(ISF35)가 구성원이다.

MEM40(ISF35)를 포함하는 ISF30-ISF41로부터 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 형질전환 유전자(transgene)가 이전에 비-종양 분해, 비-복제 아데노바이러스 내로 삽입되었다. 그러나, 그러한 혈질전환 유전자는, 특히, 종양 분해 및/또는 복제-가능 아데노바이러스 내로 결코 유전 조작되지 않았다.

이러한 요약은 간략화된 형태로 특정의 개념을 도입하기 위해서 제공되었으며, 이는 이하 상세한 설명에서 상세하게 추가로 기재된다. 달리 명확하게 언급된 곳을 제외하고, 이러한 요약은 청구된 주제의 주요 또는 기본적인 특징을 확인하는 것으로 의도되지 않을 뿐만 아니라, 청구된 주제의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

하나 이상의 구체예의 상세사항이 이하 설명에서 기재된다. 한 예시적인 구체예와 연관되어 예시 또는 설명된 특징은 다른 구체예의 특징과 조합될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 구체예들 중 어떠한 것은 조합되어 추가의 구체예를 제공할 수 있다. 구체예들의 양태는, 필요한 경우에, 변형되어 본원에서 확인된 바와 같은 다양한 특허, 특허출원 및 공보의 개념을 사용하여 또 다른 추가의 구체예를 제공할 수 있다. 다른 특징, 목적 및 이점이 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명확할 것이다.

개시내용은 첨부된 도면과 결부된 하기 설명을 참조로 하여 이해될 수 있다.
도 1은 델타-24-RGD-MEM40(DNX-MEM40), 즉, MEM40을 발현하는 신규한 복제 가능 아데노바이러스의 구성을 개략적으로 나타내고 있다.
도 2는 델타-24-MEM40, 즉, MEM40을 발현하는 신규한 복제 가능 아데노바이러스의 구성을 개략적으로 나타내고 있다.

개시내용의 다양한 예시적인 구체예가 이하 기재된다. 명확하게 하기 위해서, 실제 실행의 모든 특징이 본 명세서에 기재되지 않는다. 물론, 어떠한 그러한 실제 구체예의 개발에서, 개발자의 특수 목적, 예컨대, 하나의 실행으로부터 또 다른 실행으로 변화되는 시스템-관련된 및 비스니스-관련된 제약의 준수를 달성하기 위한 많은 실행-특이적 결정이 이루어져야 함이 인식될 것이다. 더욱이, 그러한 개발 노력은 복잡하고 시간 소모적일 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본 발명 개시내용의 이익을 갖는 본 기술분야에서의 통상의 기술자를 위한 일상의 착수일 수 있음이 인식될 것이다.

본 발명의 주제가 첨부된 도면을 참조로 하여 이하 기재될 것이다. 다양한 구조가 통상의 기술자에게 잘 공지된 상세사항과 함께 단지 예시 목적으로 그리고 본 발명 개시내용을 모호하게 하지 않기 위해서 도면에 개략적으로 도시된다. 그럼에도 불구하고, 첨부된 도면은 본 발명 개시내용의 예시적인 예를 기재하고 설명하기 위해서 포함된다. 본원에서 기재된 단어 및 구절은 관련 분야에서의 기술자에 의한 그러한 단어 및 구절의 이해와 일치하는 의미를 지니는 것으로 이해되고 해석되어야 한다. 용어 또는 구절에 대한 전문적이지 않은 정의, 즉, 본 분야에서의 기술자에 의해서 이해되는 바와 같은 일반적이고 통상적인 의미와 상이한 정의는 본원에서의 용어 또는 구절의 일관된 사용에 의해서 암시되는 것으로 의도된다. 용어 또는 구절이 특별한 의미, 즉, 통상의 기술자에 의해서 이해되는 것과 다른 의미를 갖는 것으로 의도되는 범위로, 그러한 특별한 정의는 용어 또는 구절에 대한 특별한 정의를 직접적으로 그리고 명백하게 제공하는 명확한 방식으로 명세서에 명시적으로 기재될 것이다.

본원에서 개시된 주제는 다양한 변형 및 대안적인 형태에 영향을 받기 쉽지만, 이의 특정의 구체예가 도면에서 예를 들어 도시되어 있고 본원에서 상세히 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예의 본원에서의 설명은 개시내용을 개시된 특정의 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않지만, 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 바와 같은 개시내용의 사상 및 범위 내에 있는 모든 변형, 등가물 및 대안을 포괄하는 것으로 의도된다.

암에 대한 개관

"암"은 신체 내의 세포의 비조절된 성장이 특징인 큰 범위의 질환을 나타낸다. 암의 대표적인 형태는 암종, 육종, 골수종(myeloma), 백혈병, 림프종 및 이들의 혼합된 유형을 포함한다. 추가의 예는 이하 상세한 설명에서 논의된 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

아데노바이러스에 대한 개관

"아데노바이러스(adenovirus)"(Ad)는 인간을 감염시키지만, 또한 광범위한 숙주 범위를 나타내는 큰(대략 36 kb) DNA 바이러스이다. 물리적으로는, 아데노바이러스는 이중-가닥의 선형 DNA 게놈을 함유하는 20면체 바이러스이다. 인간 아데노바이러스의 대략 50 가지의 혈청형(serotype)이 존재하며, 이는 분자 기준, 면역학적 기준 및 기능적 기준을 기반으로 하여 6 가지의 패밀리로 구분된다. 성인이 되면, 사실상 모든 인간이 더욱 일반적인 아데노바이러스 혈청형으로 감염되고, 주요 영향은 감기-유사 증상이다.

숙주 세포의 아데노바이러스 감염증은 아데노바이러스 DNA를 에피솜으로(episomally) 유지되게 하고, 이는 통합 벡터(integrating vector)와 연관된 잠재적 유전독성(genotoxicity)을 감소시킨다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고, 대규모 증폭 후에 게놈 재배열이 검출되지 않는다. 아데노바이러스는 대부분의 상피 세포를 이들의 세포 주기 단계와 무관하게 감염시킬 수 있다. 지금까지, 아데노바이러스 감염증은 인간에서의 급성 호흡기 질환(acute respiratory disease)과 같은 단지 가벼운 질환과 연관되는 듯하다.

아데노바이러스의 감염 주기는 2 단계로 수행된다: 아데노바이러스 게놈의 복제의 개시를 진행하고, 조절 단백질 및 바이러스성 DNA의 복제 및 전사에 연루된 단백질의 생산을 허용하는 초기 상(early phase), 및 구조 단백질의 합성을 유도하는 후기 상(late phase). 초기 유전자는, E1 내지 E4 ("E"는 "초기"를 의미함)로 지정되는, 아데노바이러스 게놈에 분산된 4 개의 영역(region)에 분포된다. 초기 영역은 적어도 6개의 전사 단위를 포함하고, 이의 각각은 그 자신의 프로모터를 보유한다. 초기 유전자의 발현은 자체적으로 조절되며, 일부 유전자가 다른 것들 전에 발현된다. 3개의 영역, E1, E2, 및 E4가 바이러스의 복제에 필수적이다. 따라서, 아데노바이러스가 이들 기능 중 하나에 결함이 있는 경우에는, 이러한 단백질은 트랜스(trans)로 공급되어야 할 것이거나, 바이러스가 복제될 수 없다.

E1 초기 영역은 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 자리하며, 2 개의 바이러스 전사 단위, E1A 및 E1B를 함유한다. 이러한 영역은 바이러스 주기에서 매우 추기에 관여하고 아데노바이러스의 거의 모든 다른 유전자의 발현에 필수적인 단백질을 인코딩한다. 특히, E1A 전사 단위는, E1B, E2A, E2B, E3, 및 E4 영역 및 후기 유전자의 프로모터로부터의 전사를 포함한, 다른 바이러스성 유전자의 전사를 전사촉진하는 단백질을 암호화한다.

아데노바이러스는 세포 표면 수용체를 통해서 허용하는 숙주 세포(permissive host cell) 내로 진입하고, 이어서, 그것은 내재화된다. 복제 주기의 첫 번째 단계에 필요한 특정의 바이러스성 단백질과 연관된 바이러스성 DNA는 감염된 세포의 핵에 진입하고, 그곳에서 전사가 개시된다. 아데노바이러스성 DNA의 복제는 감염된 세포의 핵에서 수행되며 세포 복제를 요구하지 않는다. 새로운 바이러스 입자 또는 비리온(virion)이 조립되고, 그 후에, 이들은 감염된 세포로부터 방출되고 다른 허용하는 세포를 감염시킬 수 있다.

아데노바이러스는 매력적인 전달 시스템이다. 본 발명 개시내용의 구체예는 세포 당 1 x 10⁵ 바이러스성 입자의 최대 수율로 제조 공정을 이용할 수 있다. 그러한 공정은 단백질, 혈청, 및 동물 유래된 성분이 없거나 기본적으로 없어서, 그것이 광범위한 범위의 예방용 및 치료용 백신 제품 둘 모두에 적합하게 할 수 있다.

아데노바이러스가 돌연변이되어 조건부로 복제 가능하게 하면(특정의 조건 하에 복제-가능), 헬퍼 세포(helper cell)가 바이러스 복제를 위해서 요구될 수 있다. 요구되는 경우, 헬퍼 세포주는 인간 세포, 예컨대, 인간 배아 신장 세포(human embryonic kidney cell), 근육 세포, 조혈 세포(hematopoietic cell) 또는 다른 인간 배아 중간엽 또는 상피 세포(human embryonic mesenchymal or epithelial cell)로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대해서 허용성인 다른 포유동물 종의 세포로부터 유래될 수 있다. 그러한 세포는, 예를 들어, 베로 세포(Vero cell) 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포를 포함한다. 특정의 양태에서, 헬퍼 세포주는 293이다. 숙주 및 헬퍼 세포를 배양하는 다양한 방법이 본 기술분야에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Racher, A.J., Fooks, A.R. & Griffiths, J.B. Biotechnol Tech (1995) 9: 169].

아데노바이러스는 다른 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 가장 흔히, Ad 게놈의 형질 감염 후에, 아데노바이러스 플라크(adenoviral plaque)가 아가로로우스 오버레이드 세포(agarose overlaid cell)부터 단리되고, 바이러스성 입자가 분석을 위해서 팽창된다. 상세한 원안을 위해서, 통상의 기술자는 문헌[Graham, F.L., and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. Methods Mol Biol 7, 109-128.]을 참고할 수 있다.

아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 대안적인 기술은 벡테리아성 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 시스템, 상보성 아데노바이러스 서열을 함유하는 두 플라스미드를 이용한 recA+ 박테리아 균주에서의 생체내 박테리아성 제조합, 및 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC) 시스템의 사용을 포함한다(본원에서 참조로 통합되는 PCT 공개 제95/27071호 및 제96/33280).

본 발명 개시내용 내에서의 사용에 적합한 아데노바이러스 벡터의 대표적인 예는 본원에서 그 전체 내용이 참조로 통합되는 미국 공보 제2009/0175830호, 제 2014/0377221호, 제2014/0377294호, 제2015/0306160호, 제2016/0289645호, 및 제2016/0143967호, 및 미국특허 제6,210,946호, 제6,284,742호, 제6,312,699호, 제6,555,368호, 제6,649,396호, 제6,815,200호, 제6,824,771호, 제6,841,540호, 제6,955,808호, 제7,045,348호, 제7,297,542호, 제8,168,168호 및 제9,061,055호에 기재된 것들을 포함한다.

종양 분해 바이러스 개관

아데노바이러스를 포함한, 항암제로서의 개발에서 광범위한 범위의 종양 분해 바이러스 유형이 있다[참조, Russell et al., 2014 Nature Biotechnology and Lawler et al., 2017 JAMA Oncology].

복수의 생물학적 특성이, 세포 표면 단백질의 천연 굴성을 통해서 또는 암 세포를 직접적으로 표적하도록 아데노바이러스를 조작함으로써 감염을 위한 암 세포의 선택적 표적화; 암 세포에서의 선택적 복제; 바이러스성 발병의 감쇠; 용해 활성의 향상; 아데노바이러스의 신속한 제거를 유도할 수 있는 항바이러스성 면역 반응의 변형; 시토카인, 면역 효능제, 또는 면역관문 억제제(immune checkpoint blocker)를 통합시키기 위한 아데노바이러스의 유전자 변형을 통한 전신 항-종양 면역성의 변형을 포함한, 요망되는 치료학적 활성을 위한 치료학적 종양 분해 아데노바이러스의 선택 또는 설계에서 고려될 수 있다.

복제 가능 종양 분해 아데노바이러스 벡터는 광범위한 범위의 세포 및 종양 유형의 감염성, 비-분열 세포(non-dividing cell)의 감염, 게놈성 통합(genomic integration)의 결여, 높은 역가, 형질전환 유전자를 담지하는 용량, 시험관내 및 생체내 안정성, 및 형질전환 유전자의 높은 발현 수준을 포함한, 치료학적 적용에 이상적이게 하는 몇 가지 특성을 갖는다. 아데노바이러스 발현 벡터는 (a) 구성물의 패키징을 지지하고, (b) 안에 클론형성된 재조합 유전자 구성물을 궁극적으로 발현시키기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구성물을 포함한다.

종양 분해 아데노바이러스의 생물학적 특성의 조절은 암 치료 효과에 유익하거나 해로울 수 있는 일정 범위의 면역 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 상호작용은 특이적 종양, 질환의 부위 및 범위, 면역억제 종양 미세환경, 종양 분해 바이러스 플랫폼(oncolytic virus platform), 투여량, 시간, 및 전달 조건뿐만 아니라, 개별적인 환자의 반응에 좌우된다[일반적으로 참조, Aurelian L. "Oncolytic viruses as immunotherapy: progress and remaining challenges" Onco. Targets Ther. 2016; 9:2627-2637]. 예를 들어, 아데노바이러스 E3 유전자의 존재는 시험관내 및 생체내에서 아데노바이러스를 조건부로 복제하는 종양 분해 효능을 증가시키는 것으로 보고되었다[참조, Suzuki K, Alemany R, Yamamoto M, and Curiel DT "The presence of the adenovirus E3 region improves the oncolytic potency of conditionally replicative adenoviruses" Clin. Cancer Res. 2002 Nov;8(11):3348-59]. 특히, E3-11.6 kDa 아데노 바이러스 사망 단백질(Adenovirus Death Protein: ADP)는 효율적인 세포 사망에 요구되는 것으로 교시되어 있다[참조, Tollefson A, Ryerse J, and Scaria A, et al., "The E3-11.6-kDa Adenovirus Death Protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants," Virology 1996; 220:152-162]. 그러나, 암의 치료에 대한 면역치료 접근방법의 경우에, 항암 면역 반응의 최적의 유도를 위해서 신속한 세포 사망을 면역 조절 단백질의 충분한 발현과 균형되게 하는 것이 중요할 수 있다. 본 발명 개시내용은 그러한 종양 분해 아데노바이러스를 제공한다.

57 인간 아데노바이러스 혈청형(HAdV-1 내지 57) 중 어떠한 것의 구성원이 본 발명 개시내용에 따른 면역 세포 자극 수용체 효능제(immune cell stimulatory receptor agonist)를 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 인간 Ad5는 유전적으로 그리고 생화학적으로 잘 특성화되어 있다(GenBank M73260; AC 000008). 따라서, 특정의 구체예에서, 종양 분해 아데노바이러스는 Ad5 성분을 포함하는 복제 가능 Ad5 혈청형 또는 하이브리드 혈청형이다. 아데노바이러스는 야생형 균주일 수 있지만, 예를 들어, 종양 세포에서 복제하는 바이러스의 능력에 영향을 주지 않으면서, 일반적인 휴지 세포(quiescent cell) 내에서 복제하는 바이러스의 능력을 감쇠시킴으로써, 종양 선택성을 향상시키기 위해서 유전적으로 변형될 수 있다. 본 발명 개시내용에 의해서 포함되는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스의 비-제한 예는 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAd1, H101 및 AD5/3-D24-GMCSF를 포함한다. Onyx-015는 암 선택성을 향상시키기 위해서 E1B-55K 및 E3B 영역에서 삭제가 있는 바이러스 혈청형 Ad2 및 Ad5의 하이브리드이다. H101은 Onyx-015의 변형된 버젼(version)이다. ICOVIR-5 및 ICOVIR-7은 E1A의 Rb-결합 부위 삭제 및 E2F 프로모터에 의한 E1A 프로모터의 대체를 포함한다. ColoAd1은 키메라 Add11p/Ad3 혈청형이다. AD5/3-D24-GMCSF(CGTG-102)은 GM-CSF(Ad5 캡시드 단백질 노브는 혈청형 3으로부터 노브 도메인으로 대체된다)를 인코딩하는 혈청형 5/3 캡시드-변형된 아데노바이러스다.

종양 내로 주입된 종양 분해 아데노바이러스는 세포 사멸을 유도하며, 인접 세포를 감염시켜, 정지되지 않는 경우, 종양의 전체 파괴로 이어질 수 있는 치료 파동(treatment wave)를 발생시키는 새로운 아데노바이러스 자손(adenovirus progeny)을 방출한다. 델타-24의 중요한 항-종양 효과는 세포 배양 시스템 및 악성 신경교종 이종 이식 모델에서 나타났다. 델타-24-RGD은 임상 I 시험에서 항-종양 효과를 보였고 현재 추가 임상 시험의 대상이다. 비록, 종양 세포의 용해가 델타-24-RGD 종양 분해 아데노바이러스로 제안된 주요 항암 메커니즘이지만, 재발성 신경교종을 앓고 있는 환자에서의 임상 I 시험으로부터의 데이터 및 또 다른 관찰은 직접적인 종양 분해 효과가 항-종양 면역 반응의 아데노바이러스-매개된 트리거(adenovirus-mediated trigger)에 의해 향상될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명 개시내용의 일부 구체예 내에서, 하나 이상의 이종 서열이 아데노바이러스의 비필수 영역 내로 통합될 수 있다. 본 발명 개시내용의 특정 구체예 내에서, 하나 이상의 이종 서열이 E3 영역의 모두 또는 일부를 대신하여 통합될 수 있다. 대표적인 예는 시토카인, 케모카인 및 관문 억제제(checkpoint inhibitor)를 포함한다. 일부 구체예 내에서, 이종 서열은 OX40 효능제(예, OX40L), GITRL, 항-PD-1, 및/또는 항-CTLA-4를 암호화한다. 또 다른 구체예 내에서, 이종 핵산 서열은 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 및/또는 BTLA로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 관문 단백질의 억제제를 인코딩한다. 또 다른 구체예 내에서, 이종 핵산 서열은 CD28, OX40 (CD134), 글루코코르티코이드-유도된 TNF-수용체(GITR), CD137 (4-1BB), 헤르페스 바이러스 진입 매개인자 A(HVEM), 유도 가능한 T-세포 공동자극인자(costimulator)(ICOS 또는 CD278), CD27, CD40, 및/또는 CD226으로부터 선택된 면역 공동-자극 수용체의 효능제를 인코딩한다. 대표적인 예는 PCT/US2014/066920호 및 2016년 5월 27일자 출원된 미국가출원 제62/342482호에 더욱 상세히 개시되어 있으며, 이들 둘 모두는 그 전체내용이 참조로 통합된다.

DNX-2401

일부 구체예에서, 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스는 델타-24 또는 델타-24-RGD(DNX-2401)이다. 델타-24는 미국특허출원 공보 제20030138405호, 및 제20060147420호에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 본원에서 참조로 통합된다. 델타-24 아데노바이러스는 아데노바이러스 유형 5(Ad-5)로부터 유도되며, 인코딩된 E1A 단백질 내의 아미노산 122 내지 129에 상응하는 Rb 단백질(뉴클레오티드 923-946)의 결합에 원인이 되는 영역을 포함하는 E1A 유전자의 CR2 부분 내의 24-염기쌍 삭제를 함유한다[Fueyo J et al., Oncogene, 19:2-12 (2000)]. 델타-24-RGD는 섬유 노브 단백질(fiber knob protein)의 HI 루프 내로의 RGD-4C 서열(αvß3 및 αvß5 인테그린에 강하게 결합함)의 삽입을 추가로 포함한다[Pasqualini R. et al., Nat Biotechnol, 15:542-546 (1997)]. E1A 삭제는 암 세포에 대한 바이러스의 선택성을 증가시키고; RGD-4C 서열은 신경교종에 대한 및 낮은 수준의 아데노바이러스 수용체를 발현하는 여러 다른 종양에 대한 감염성을 증가시킨다.

CD40 효능제(CD40 Agonist) 개관

이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 암 면역요법의 성공은 종양-특이적 CD8+ T 세포 면역성을 향상시키는 것에 좌우될 수 있는데, 그 이유는 CD8+ T 세포가 직접적인 종양 치사 및 환자 생존과 강하게 연관되어 있기 때문이다. 따라서, CD8+ T 세포 반응을 촉진하는 치료학적 양상이 암 면역요법 약물 개발에서의 목표이다.

CD40 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 구성원이고, B 세포, 전문적 항원-제시 세포(professional antigen-presenting cell), 및 비-면역 세포 및 종양에 의해서 발현된다(van Kooten et. al. 2000 Journal of Leukocyte Biology). 종양-특이적 T 세포 반응의 활성화는 항원 제시 세포에 대한 CD40 수용체의 활성화를 필요로 한다. CD4+ T 세포는 CD40-CD154 상호작용을 통해서 수지상 세포(dendritic cell: DC)를 라이센싱(licensing)함으로써 CD8+ T 세포 프라이밍을 향상시킨다. 또한, CD40-CD154 상호작용은 CD8+ T 세포 반응이 조기에 약화되는 것을 방지한다. 따라서, CD154를 통한 CD40 활성화는 병원체 및 종양에 대항한 효과적인 항원-특이적 CD8 T 세포 면역성을 유도하기 위한 필수 단계이다(Singh et. al. 2017 Nature Communications). 이와 관련하여, CD40-효능제 요법, 예컨대, 항체 또는 동족 CD40 리간드 (CD40L) 단백질이 암 면역요법을 위한 유망한 전략인 듯하다.

ISF35 개관

ISF35(본원에서 또한 "MEM40"로 일컬어질 수 있음)는 인간 CD40L과 92% 아미노산 서열 상동성인 키메라 인간/마우스 CD40 리간드이다(본원에서 참고로 통합되는 미국특허 제7,495,090호 참조). ("CD40 리간드" 및 "CD40L"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 "CD154"로 일컬어질 수 있음). 특히, 도메인 I, II 및 III은 - 이러한 분자의 세포내, 막내(intra-membrane) 및 근위 세포외 도메인을 각각 함유하는 영역들은 - 완전히 인간화되었다. 분자의 CD40 결합 부분을 함유하는 도메인 IV에서, 세포 내의 최적 CD40 리간드 발현에 필요한 그들 쥐 도메인만이 유지된다. ISF35(MEM40)은, 인간에게 투여되는 때에, 항체 결합이 쥐 CD154 (CD40 리간드)의 활성을 중화시키는 곳인, 분자의 3' 말단에서 완전히 인간화된다.

MEM40 외에, 일정한 범위의 키메라 CD40 리간드 구성물(ISF30 내지 ISF41)이 있으며, MEM40은 대부분의 전임상 및 임상 연구의 패널에서 특이적 키메라 CD40 리간드이다.

예시적인 구체예

일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드(chimeric human/mouse CD40 ligand)를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 유전적으로 변형되어 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 형질전환 유전자를 통합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명 개시내용은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 및 하나 이상의 추가의 면역조절 또는 치료학적 유전자, 예컨대, 시토카인(예, GM-CSF, TNFα), 인터류킨(예, IL-2, IL-12), 케모카인(chemokine)(예, RANTES), 대식구 염증성 단백질(예, MIP-3), 관문 억제제(예, 항-PD-1, 항-CDTA4, 및 항-PD-L1), 또는 또 다른 면역중재 단백질(예, OX40 리간드) 둘 모두를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스에 관한 것이다.

종양 분해 아데노바이러스의 게놈 영역은 바람직한 치료학적 특성을 부여하기 위해서 복수의 목적으로 변경될 수 있다. 치료학적 특성의 비-제한 예는 향상된 바이러스 복제 및 확산, 향상된 종양 분해, 정상 세포에 비한 종양 세포의 우선적 표적화, 향상된 면역 활성화, 및 숙주 면역계로부터 아데노바이러스의 보호를 포함할 수 있다. 상기 기재된 목적을 위한 바이러스성 영역은 제거(완전히 또는 부분적으로 삭제)되거나, 비-기능성이 되거나, 기능을 감쇠시키기 위해서 변형되거나, 다른 서열에 의해서 치환될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 종양 세포의 면역-매개된 및 바이랄리틱(viralytic) 파괴 둘 모두를 위한 개선된 용량을 갖는 아데노바이러스를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스를 포함한 조성물을 종양을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는 방법에 관한 것이다.

종양 분해 아데노바이러스 균주는 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 형질전환 유전자의 통합을 위해서 출발점으로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 분해 아데노바이러스는 복제 가능 인간 타입 5 아데노바이러스이다.

키메라 인간/마우스 CD40 리간드 형질전환 유전자를 통합시키기 위한 종양 분해 아데노바이러스의 유전자 변형은 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지된 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 종양 분해 아데노바이러스는 감염된 세포에서의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 폴리펩티드의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 유전자 전사 및 발현을 가능하게 하기 위해서 필요한 조절 요소(사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 또는 대안적인 프로모터; 폴리아데닐화 도메인)를 갖는 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 형질전환 유전자를 함유할 수 있다.

일부 구체예에서, 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 ISF30(SEQ ID NO:1), ISF31(SEQ ID NO:2), ISF32(SEQ ID NO:3), ISF33(SEQ ID NO:4), ISF34(SEQ ID NO:5), ISF35 (MEM40)(SEQ ID NO:6), ISF36(SEQ ID NO:7), ISF37(SEQ ID NO:8), ISF38(SEQ ID NO:9), ISF39(SEQ ID NO:10), ISF40(SEQ ID NO:11), 및 ISF41(SEQ ID NO:12)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

ISF30, ISF32, ISF34, ISF36, ISF38, 및 ISF40의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 참고로 통합되는 미국특허 제7,928,213호에 개시되어 있다. ISF31, ISF33, ISF35, ISF37, ISF39, 및 ISF41의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 참고로 통합되는 미국특허 제7,495,090호에 개시되어 있다.

특정의 구체예에서, 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스 내로 통합되는 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 ISF35(MEM40)(SEQ ID NO:6)일 수 있다.

이종 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 종양 분해 아데노바이러스 내의 어떠한 비필수 자리에 삽입될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 분해 아데노바이러스는 복제 가능성을 유지한다. 특정의 구체예에서, 이종 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 핵산은 복제-가능 아데노바이러스 골격의 E3 영역에서 삽입된다. E3 영역은 바이러스 복제에 비필수적이다. 복제-가능 아데노바이러스는 전체 또는 일부의 E3 삭제를 포함할 수 있다. 관련된 양태에서, 전체 E3 영역은 복제-가능 아데노바이러스 골격으로부터 삭제되며, 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 핵산은 전체 E3 삭제를 함유하는 위치 내로 삽입된다.

종양 분해 아데노바이러스는 유전적으로 추가로 변형되어 암 세포에서의 선택적 복제; 바이러스성 발병(viral pathogenesis)의 감쇠; 용해 활성의 향상; 아데노바이러스의 신속한 제거를 유도할 수 있는 항바이러스성 면역 반응의 변형; 및 바이러스-유도된 전신 항종양 면역성의 변형을 포함한 암의 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 특성을 개선시킬 수 있다.

특정의 구체예에서, 본 발명 개시내용은 부분적으로 또는 완전히 삭제된 E3 영역 대신에 삽입된 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 핵산을 포함하는 델타-24 또는 델타-24-RGD 아데노바이러스로서, 이종 핵산이 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 형질전환 유전자를 인코딩하는 서열을 포함하는, 델타-24 또는 델타-24-RGD 아데노바이러스를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용은 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스를 포함한 조성물을 종양을 앓고 있는 포유동물에게 투여함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 종양 분해 아데노바이러스 및 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

일부 구체예에서, 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스는 델타-24-MEM40 복제 가능 아데노바이러스일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스는 델타-24-RGD-MEM40 복제 가능 아데노바이러스일 수 있다.

선택된 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스 및 키메라 인간/마우스 CD40 리간드(들)와는 무관하게, 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 암의 치료에 사용될 수 있어서, 그러한 아데노바이러스는 종양내 주사에 의해서 투여된다. 그러나, 정맥내, 복강내, 기관내(intratracheally), 근육내, 두개내(intracranially), 내시경적으로(endoscopically), 병변내(intralesionally), 경피, 피하, 국소, 또는 직접적인 주사 또는 주입에 의함을 포함한 다른 전달 경로가 또한 고려될 수 있다.

이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스는 이중 작용 메커니즘: 1) 암세포에서의 종양 분해 아데노바이러스의 선택적 바이러스 복제를 통한 종양 세포 치사 및 2) 바이러스성 면역 유도 및 CD40 리간드 면역 활성화 둘 모두에 의해서 생성된 전신 항종양 면역성의 유도를 가질 수 있다.

조절 요소

본 발명의 개시내용에 유용한 벡터에 포함되는 발현 카세트는 (5'-투(to)-3' 방향으로) 단백질-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호(splice signal) 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 프로모터 및 진핵 세포 내의 단백질 인코딩 유전자의 전사를 조절하는 인핸서가 복수의 유전적 요소로 구성된다. 세포 기계(cellular machinery)는 각각의 요소에 의해서 수송된 조절 정보를 모으고 통합시켜서, 상이한 유전자가 독특하고, 흔히 복잡한 전사 조절 패턴들에 관여하게 한다. 본 발명의 개시내용의 문맥에서 사용된 프로모터는 구성적, 유도 가능한 및 조직-특이적 프로모터를 포함한다.

프로모터/인핸서

키메라 인간/마우스 CD40 리간드 핵산 발현은 포유동물 세포, 바람직하게는, 인간 종양 세포에서 기능하는 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 핵산 발현은 비-아데노바이러스성 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 일 구체예에서, 키메라 인간/마우스 CD40 리간드의 발현을 유도하는 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터이다.

본원에서 제공된 발현 구성물은 프로그래밍 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로는 RNA 합성을 위한 출발 부위를 정위시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 최상의 예는 TATA 박스(TATA box)이지만, TATA 박스가 결여된 일부 프로모터, 예컨대, 포유동물 말단 데옥시뉴레오티딜 트랜스페라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터에서, 출발 부위 자체와 중첩되는 이산 요소(discrete element)가 개시의 위치를 고정하는 것을 돕는다. 추가의 프로모터 요소가 전사 개시의 빈도를 조절한다. 비록, 프로모터가 출발 부위 하류의 기능적 요소(functional element)들을 또한 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 전형적으로는 출발 부위의 상류의 영역 30 내지 110 bp에 있다. 프로모터의 "조절 하에" 있는 코팅 서열을 가져오기 위해서, 선택된 프로모터의 "하류"(즉, 3-프라임)의 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위의 5-프라임 말단을 위치시킨다. "상류" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 인코딩된 RNA의 발현을 촉진한다.

프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 유연적이어서, 요소들이 서로에 대해서 역전되거나 이동되는 때에 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모토 요소들 사이의 거리는 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라서, 개별적인 요소들이 협동적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성시킬 수 있는 듯하다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 연루되는 시스-작용 조절 서열을 나타내는 "인핸서"와 함께 사용되거나 그렇지 않을 수 있다.

프로모터는 자연적으로 핵산 서열과 연관될 수 있으며, 코딩 절편 및/또는 엑손의 상류에 위치하는 5-프라임 비-코딩 서열을 분리함으로써 얻어질 수 있다. 그러한 프로모터는 "내인성"으로 일컬어질 수 있다. 유사하게, 인핸서가 핵산 서열과 자연적으로 연관되고, 그 서열의 하류 또는 상류에 위치될 수 있다. 대안적으로, 특정의 이점이 코딩 핵산 절편를 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 위치시킴으로써 얻어질 것이며, 이는 그것의 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 연관되지 않는 프로모터를 나타낸다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 그것의 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 연관되지 않는 인핸서를 나타낸다. 그러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 어떠한 다른 아데노바이러스, 또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연"이 아닌, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.

발현을 위해서 선택된 세포 기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 수 있다. 분자 생물학 분야에서의 전문가는 일반적으로는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형의 조합의 사용을 알고 있다. 사용된 프로모터는 도입된 DNA 절편의 고수준 발현을 유도하기 위한 적절한 조건 하에 구성적, 조직-특이적, 유도 가능 및/또는 유용할 수 있고, 예컨대, 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리하다. 프로모터는 이종이거나 내인성일 수 있다.

프로모터의 비-제한 예는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예컨대, SV40 조기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 전초기(immediate early) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 초기 프로모터, 및 진핵 세포 프로모터를 포함한다.

개시 신호 및 관련 발현

특이적 개시 신호가 또한 코딩 서열의 효율적인 번역을 위한 본 발명 개시내용에 제공된 발현 구성물에서 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 본 기술분야에서의 전문가는 필요한 신호를 용이하게 제공할 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해서 요구되는 코딩 서열의 리딩 프레임과 "인-프레임(in-frame)"에 있어야 한다는 것이 잘 공지되어 있다. 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해서 향상될 수 있다.

특정의 구체예에서, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry sites: IRES) 요소의 사용이 다유전자(multigene), 또는 폴리시스트론 메시지(polycistronic, message)를 생성시키기 위해서 사용된다. IRES 요소는 5-프라임 메틸화된 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델(ribosome scanning model)을 우회할 수 있고, 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier et. al. 1988 Molecular and Cellular Biology). 피코르나바이러스 패밀리의 두 구성원으로부터의 IRES 요소(회색질 및 외심장근육염(polio and encephalomyocarditis))(Pelletier et. al. 1988 Molecular and Cellular Biology) 뿐만 아니라, 포유동물 메시지(mammalian message)로부터의 IRES(Macejak et. al. 1991 Nature)가 기재되어 있다. IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 복수의 오픈 리딩 프레임이 함께 전사되고, 각각 IRES에 의해서 분리되어, 폴리시스트론 메시지를 생성시킬 수 있다. IRES 요소는 각각의 오픈 리딩 프레임을 효율적인 번역을 위한 리보솜에 접근 가능하게 할 수 있다. 복수의 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메시지를 전사할 수 있다(본원에서 참고로 통합되는 미국특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호).

바이러스성 변형 방법

언급된 다양한 유전자는 유전자 삭제(들), 치환(들) 또는 삽입(들)을 포함한 본 기술분야에서 잘 공지된 여러 기술에 의해서 기능적으로 불활성화될 수 있다. 유사하게, MEM40를 포함한 면역중재 유전자가 본 기술분야의 전문가에게는 잘 공지된 방법에 의해서 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 아데노바이러스 내의 이들 변형 유형은 상동 재조합 방법에 의해서 제조된다. 예를 들어, 아데노바이러스 게놈 DNA는 상동 아데노바이러스 서열에 의해서 플랭킹된(flanked) 돌연변이 서열을 포함하는 플라스미드 벡터와 함께 형질 감염되어, 새로운 돌연변이된 서열 영역을 갖는 모체 아데노바이러스 게놈 DNA 영역의 DNA 재조합 및 치환을 생성시킬 수 있다.

키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스의 예시적인 구성은 도 1 내지 도 2에 도시되어 있다.

도 1은 델타-24-RGD-MEM40(DNX-MEM40), 즉, MEM40을 발현하는 신규한 복제 가능 아데노바이러스의 구성을 개략적으로 나타내고 있다. DNX-MEM40가 도시되어 있다. 요약하면, 24 뉴클레오티드 서열이 E1 영역으로부터 삭제되었다. 또한, E3 영역이 삭제되었다. RGD 펩티드를 암호화하는 27 뉴클레오티드 서열, CDCRGDCFC이 또한 아데노바이러스 섬유 서열의 H1 노브 도메인에서 삽입되었다. 마지막으로, CMV 프로모터에 의해서 상류에서 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호에 의해서 하류에서 플랭킹된(flanked) MEM40 cDNA를 포함하는 MEM40 발현 카세트가 삭제된 E3 영역 내로 삽입되었다.

도 2는 델타-24-MEM40, 즉, MEM40을 발현하는 신규한 복제 가능 아데노바이러스의 구성을 개략적으로 나타내고 있다. 델타-24-MEM40이 도시되어 있다. 구성은, 그것이 RGD 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 삽입 없이 야생형 아데노바이러스 섬유를 사용함을 제외하고는, DNX-MEM40(도 1)와 유사하다.

치료학적 이용성에 대한 아데노바이러스의 스크리닝 방법

본 발명의 개시내용의 종양 분해 아데노바이러스, 또는 이의 변형 또는 유도체는 종양 세포에서의 이들의 용해 효능의 검사에 의해서 이들의 치료학적 이용성에 대해서 평가될 수 있다. 종양 세포는 환자 생검 또는 외과적 절제로부터 유래된 일차 종양 세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 종양 세포는 종양 세포주를 포함할 수 있다. 본 발명의 개시내용의 아데노바이러스의 세포 용해 활성은 아데노바이러스의 일련의 희석액으로 세포를 감염시키고 세포 용해 효능을 측정함으로써 시험관내의 종양 세포주에서 측정될 수 있다(예, IC50). 세포 용해 활성을 측정하는 특정의 방법은 MTS, MTT, 및 ATP 비색 분석법을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.

치료학적 지수, 즉, 본 발명의 개시내용의 종양 분해 아데노바이러스의 독성을 유발시키는 양에 대한 치료 효과를 유발시키는 치료제의 양의 비교가 종양 세포주에서의 아데노바이러스의 세포 용해 효능을 매칭된 정상 세포에서의 세포 용해 효능과 비교함으로써 계산될 수 있다.

본 발명의 개시내용의 종양 분해 아데노바이러스는 종양 세포 및/또는 정상 세포를 감염시키고 종양 분해 아데노바이러스에 의해서 인코딩된 기능성 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 폴리펩티드를 발현시키는 이들의 능력의 평가에 의해서 치료학적 이용성에 대해서 추가로 평가될 수 있다. 감염된 세포의 세포 표면상에서 발현된 키메라 인간/마우스 CD40 리간드는 인간 또는 마우스 CD40 항체 결합 영역을 특별히 인식하는 항체를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry)에 의해서 평가될 수 있다. 키메라 인간/마우스 CD40 리간드 기능적 활성이 또한 시험관내 생검을 이용하여 검사될 수 있으며, 그러한 생검에서, 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 종양 분해 아데노바이러스로 감염된 종양 또는 정상 세포가 하류 루시페라제 반응 요소(downstream luciferase response element)와 융합된 CD40 수용체를 안정적으로 발현하고 유도된 루시페라제 발현을 측정하는 이펙터 세포(effector cell)와 혼합된다.

본 발명의 개시내용의 종양 분해 아데노바이러스는 종양 세포 성장을 표적하는 이들의 능력 및 마우스 내의 동계 또는 이종 종양 모델(syngeneic or xenogeneic tumor model)에서의 자연적으로 유도된 또는 이식된 종양을 지닌 마우스에 부과된 종양 발생 또는 종양 세포를 감소시키는 능력에 대해서 추가로 평가될 수 있다. 종양 크기, 종양 재도전(tumor rechallenge)으로부터의 면역 보호(immune protection), 및 동물 생존에 의해서 측정되는 바와 같은 종양 부담(tumor burden)이 치료학적 이용성 및 동물 종양 모델의 모든 가능한 척도이다.

약제학적 조성물

상기 주지된 바와 같이, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 아데노바이러스(본원에서 기재된 바와 같음)를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명 개시내용의 일부 구체예 내에서, 아데노바이러스는 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스이다. 추가의 구체예 내에서, 아데노바이러스는 델타-24-MEM40 또는 델타-24-RGD-MEM40이다.

본 발명 개시내용의 특정의 구체예 내에서, 본원에서 제공된 조성물은 약제학적으로 허용되는 농도의 완충제, 염, 보존제 뿐만 아니라, 다른 상용성 희석제 또는 담체를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제의 비율 및 정체(identity)는 생리학적으로 상용성이도록 및 특정의 구체예 내에서, 아데노바이러스의 생존을 유지시키도록 선택된다. 특정의 약제학적 조성물은 적합한 pH로 완충될 수 있고 생리학적 유체와 등삼투성(iso-osmotic)일 수 있다.

본원에서 제공된 약제학적 조성물은, 유효량의 활성 물질이 약제학적으로 허용되는 비히클과 혼합물로 조합되도록, 환자에게 투여하기에 적합한 조성물을 생성시키기 위한 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 적합한 비히클은, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985]에 기재되어 있다.

바이러스의 용액은 생리학적으로 적합한 완충액으로 제조될 수 있다. 대표적인 완충제는, 예를 들어, 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 그 밖의 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

적합한 제형의 선택 및 제조를 위한 대표적인 절차 및 성분은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005 and in The United States PharmacopE1A: The National Formulary (USP 40 - NF 35 and Supplements)]에 기재되어 있다.

다른 구체예에서, 조성물은 질환 부위, 예컨대, 종양 부위에 직접 주사(피하, 정맥내, 근육내 등)에 의해서 또는 경구 투여에 의해서, 대안적으로는 경피 투여에 의해서 투여될 수 있다.

주사 사용에 적합한 약제학적 조성물의 형태는 무균의 수용액 또는 분산액을 포함하며, 여기에서, 용어 "무균"은 아데노바이러스가 죽었음을 암시하는 것을 의미하지 않으며, 사실, 상기 언급된 바와 같은 특정의 구체예 내에서, 아데노바이러스는 복제 가능하다. 모든 경우에, 형태는 무균이어야 하며, 그것이 주사기 또는 카테테르(catheter)를 통해서 배치되어야 하는 범위로 유체이어야 한다.

또한, 약제학적 조성물은 특정의 보존제를 함유할 수 있는데, 그들 보존제가 바이러스의 작용을 방해하지 않는 범위로, 함유할 수 있다. 보존제의 대표적인 예는, 예를 들어, 벤조알코늄 클로라이드, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 및 소듐 벤조에이트를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전체 조성물의 약 0.0001 내지 약 2 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 조성물은 투여를 위한 단일 바이알 또는 패키지(package)로서 패키징될 수 있다. 바이러스 또는 약제학적 조성물을 함유하는 키트는 또한 바이러스 또는 약제학적 조성물을 제조하고 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

치료 및 투여 방법

본 발명 개시내용의 다양한 구체예 내에서, 본원에서 기재된 바와 같은 아데노바이러스를 암을 앓고 있는 대상체에 투여함을 포함하여 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 추가의 구체예 내에서, 아데노바이러스는 델타-24-MEM40 또는 델타-24-RGD-MEM40이다. 선택된 종양 분해 아데노바이러스 및 키메라 인간/마우스 CD40 리간드(들)와 무관하게, 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스는 암의 치료를 위해서 사용될 수 있어서, 바이러스가 종양내 주사에 의해서 투여된다. 그러나, 정맥내, 복강내, 기관내(intratracheally), 근육내, 두개내(intracranially), 내시경적으로(endoscopically), 병변내(intralesionally), 경피, 피하, 국소, 또는 직접적인 주사 또는 주입에 의함을 포함한 다른 전달 경로가 또한 고려될 수 있다.

특정의 구체예 내에서, 본원에서 기재된 바와 같은 조성물(예, 약제학적 조성물)을 사용하여 암이 치료된다. 상기 주지된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "암"은 신체 내의 세포의 비조절된 성장을 특징으로 하는 큰 범위의 질환을 나타낸다. 암의 대표적인 형태는 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 및 이들의 혼합된 유형을 포함한다. 추가의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 담도암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 예컨대, 교모세포종(glioblastoma), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), CNS 종양(예컨대, 교모세포종, 별아교세포종(astrocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyogioma), 뇌실상의종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경 종양(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 메난지오마(menangioma), 신경아세포(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastomas)), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 백혈병과 림프종을 포함한 조혈세포암(hematopoietic cell cancer), 간세포 암(hepatocellular cancer), 신장암(kidney cancer), 후두암(laryngeal cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 구강암(oral cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 및 갑상선암(thyroid cancer)을 포함한다. 암은 미만성(diffuse)일 수 있으며(예, 백혈병), 고형 종양(예, 육종, 예컨대, 섬유육종(fibrosarcoma), 점액 육종(myxosarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma) 및 골육종(osteogenic sarcoma)), 또는 이들의 일부 조합(예, 고형 종양 및 파종 또는 미만성 암 세포(disseminated or diffuse cancer cell) 둘 모두를 갖는 전이성 암)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자가 또는 동종이형 줄기세포 이식체를 수용하기에 적격인 어떠한 암 환자가 이러한 치료에 대한 후보인 것으로 고려될 수 있다.

일부 구체예에서, 투여는 종양에 대한, 또는 이전 종양 부위(예, 수술적 절제 또는 제거 요법 후)에 대한 직접적인 투여에 의해서 달성될 수 있다. 투여는 직접적인 주사에 의해서, 또는 선택된 기간에 걸친 주입에 의해서 이루어질 수 있다. 종양 내로의 직접적인 주사(종양내 주사)는 미세한 카테테르 또는 캐눌라(cannula)에 의해서 달성될 수 있다. 특정의 구체예 내에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 MR 절차내 안내(MR intra-procedural guidance) 하에 미세 전자 기계(microelectromechanical: MEMS) 시스템에 의해서 전달될 수 있다. 특히, 뇌 내로의 종양내 주사는 Alcyone Lifesciences' Alcyone MEMS Cannula(AMC)와 같은 캐눌라를 사용함으로써 유의미한 환류 또는 역류 없이 달성된다. 장치의 대표적인 예는 미국특허 제8,992,458호 및 미국특허공보 제2013/0035660호, 제2013/0035574호 및 제2013/0035560호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 이들 전체 내용이 본원에서 참조로 통합된다.

대상체에게 투여되는 경우에, 본원에서 기재된 조성물의 효과적인 양이 암을 치료(예, 완화, 향상, 경감, 개선, 안정화, 확산을 방지, 진행을 완화 또는 지연 또는 치유)하기 위해서 투여된다. 예를 들어, 그러한 양은 암성 세포 또는 신생 세포의 수를 감소시키거나 이를 파괴하거나 그러한 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 효과를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 임상적으로 효과적이게 하기 위해서, 본원에서 제공되는 조성물(들)은 치료 섭생에 따라서 한번 또는 복수의 횟수로 투여될 수 있다.

적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스를 사용한 치료 요법은 단일 투여 또는 복수의 투여를 포함할 수 있다. 복수의 투여는 반복 스케줄로, 및/또는 본 발명의 개시내용의 이점을 갖는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 자명할 수 있는 다른 것들 중에서도, 하나 이상의 앞선 투여의 효능, 또는 하나 이상의 앞선 투여의 부작용 중의 하나 이상의 지표에 대응하여 수행될 수 있다.

본원에서 제공되는 조성물은 다양한 농도로 제공될 수 있다. 예를 들어, 약 109 플라크 형성 단위(plaque forming unit("pfu")) 초과, 약 102 내지 약 109 pfu, 약 102 내지 약 107 pfu, 약 103 내지 약 106 pfu, 또는 약 104 내지 약 105 pfu의 투여량 범위인 아데노바이러스의 용량형(dosage)이 제공될 수 있다.

일부 구체예에서, 종야 분해 아데노바이러스는 106-1013 플라크 형성 단위(pfu)의 투여량으로 투여된다.

사용되어야 하는 약제학적 조성물의 투여량은 치료되는 특정의 병태, 병태의 중증도, 연령, 물질적인 상태, 크기 및 체중을 포함한 개별적인 환자 파라미터, 치료 기간, 동시 요법의 본질(존재하는 경우), 특이적 투여 경로 및 건강 실무자의 지식 및 경험 내에 있는 다른 유사한 인자에 좌우될 수 있다. 또한, 용량형은 제품의 이용성에 좌우될 수 있다.

이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 하나 이상의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 포함하는 종양 분해 아데노바이러스는 이중 작용 메커니즘: 1) 암세포에서의 종양 분해 아데노바이러스의 선택적 바이러스 복제를 통한 종양 세포 치사 및 2) 바이러스성 면역 유도 및 CD40 리간드 면역 활성화 둘 모두에 의해서 생성된 전신 항종양 면역성의 유도를 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 담체가 환자에의 투여에 의도된 의약에 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 투여 경로, 특정의 종양 분해 아데노바이러스 균주에 요구되는 저장 조건, 및 본 발명의 개시내용의 이점을 갖는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 자명할 수 있는 다른 고려사항에 따라서 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수일 수 있다.

일부 구체예에서, 조성물은 추가로 애주번트(adjuvant), 예컨대, 종양 세포의 바이러스 침입의 인핸서, 또는 구성물 중의 적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 유전자의 전사를 유도하기 위한 유도인자 분자 등을 포함할 수 있고, 여기에서, 유전자가 유도인자 분자에 의해서 활성화된 프로모터의 조절 하에 있다.

추가의 요법

일부 구체예에서, 방법은 추가로 하나 이상의 추가의 요법과 함께 키메라 인간/마우스 CD40를 인코딩하는 종양 분해 아데노바이러스에 의한 치료를 포함할 수 있다. 추가의 요법은 방사선 요법, 수술(예, 종양절제술(lumpectomy) 또는 유방절제술(mastectomy)), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 생물요법(biotherapy), 골수이식, 나노요법(nanotherapy), 모노클로날 항체 요법, 또는 상기 요법의 조합일 수 있다. 추가의 요법은 애주번트 또는 네오애주번트 요법(neoadjuvant therapy)의 형태일 수 있다.

조성물이 대상체(예, 인간)에게 투여되면, 조성물의 생물학적 활성이 다양한 방법에 의해서 측정될 수 있다. 분석될 수 있는 대표적인 파라미터는, 예를 들어, 영상화(imaging), 및/또는 예를 들어, 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), and Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 분석을 포함한다. 특정의 구체예에서, 본원에 제공된 조성물의 생물학적 활성은 또한 특정의 시토카인, 예컨대, 감마-IFN, IL-2, 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 본 발명 개시내용의 또 다른 구체예에서, 생물학적 활성은 부과된 종양 또는 부하(load)의 감소와 같은 임상 결과를 분석함으로써 측정될 수 있다.

하나 이상의 추가의 치료요법 중 어떠한 하나 또는 모두가 종양 분해 아데노바이러스의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다.

키트 제품

키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 종양 분해 아데노바이러스를 포함하는 제품 또는 키트가 또한 본 발명에서 제공된다. 제품 또는 키트는 추가로 개체에서의 암을 치료하거나 그 진행을 지연시키거나, 암을 앓고 있는 개체의 면역 기능을 향상시키기 위해서 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 종양 분해 아데노바이러스를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 인서트(package insert)를 포함할 수 있다. 본원에서 기재된 키메라 인간/마우스 CD40 리간드를 인코딩하는 어떠한 종양 분해 아데노바이러스 균주가 제품 또는 키드에 포함될 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백(bag), 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예커대, 유리, 플라스틱(예컨대, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금(예컨대, 스테인리스 스틸)로부터 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 제형을 보유하고, 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 제품 또는 키트는 추가로, 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 인서트를 포함한, 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제품은 추가로 또 다른 작용제(화학치료제 및 항-신생물제(anti-neoplastic agent) 중 하나 이상을 포함한다. 하나 이상의 작용제를 위한 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백(bag), 및 주사기를 포함한다.

실시예

실시예 1

pShuttlE3.2-MEM40의 구성 및 특성화

아데노바이러스-ISF35(Lot No. MEM-ADV-FP-009)의 DNA를 제조자의 지시에 따라서 QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 사이토메갈로바이러스 프로모터, MEM40 암호화 서열, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 함유하는 1.86 kb PCR 단편을 PCR에 의해서 증폭시켰다. 분리된 DNA를 주형으로서 사용하였고, 5' 및 3' 말단에서 BglII 및 MfeI 제한 효소 부위를 각각 함유하는 프라이머 쌍을 사용하였다. 생성되는 PCR 생성물을 BglII 및 MfeI로 소화시키고, BamHI 및 EcoRI에 의해서 소화된 pShuttlE3.2 내로 결찰시켜 반시계 반향으로 E3 대신에 MEM40 발현 카세트를 삽입시켰다. DH5 세포(Life Technologies)를 결찰 반응에 의해서 형질전화시켜서 MEM40 발현 카세트를 함유하는 셔틀 벡터(shuttle vector)를 생성시켰다(pShuttlE3.2-MEM40). pShuttlE3.2-MEM40 클론을 서열화시켜 삽입된 MEM40 발현 카세트의 일체성을 확인하였다.

실시예 2

델타-24-RGD-MEM40의 구성

pShuttlE3.2-MEM40을 NaeI로 소화시켜서 재조합을 위한 좌우 플랭킹 영역과 함께 MEM40 카세트 및 카나마이신(Kanamycin) 저항 유전자를 함유하는 전달 단편을 생성시켰다. 재조합 델타-24-RGD-MEM40을 구성시키기 위해서, BJ5138 세포(Agilent Technologies)를 전달 단편, 및 델타-24-RGD 아데노바이러스 골격을 함유하는 플라스미드 pVK526로 공동-형질전환시켜서, pVK526-MEM40/Kan을 생성시켰다. DH10B 세포(Life Technologies)를 생성되는 pVK526-MEM40/Kan으로 형질 전환시켜 더욱 농축된 플라스미드 DNA를 분리하였다. DH10B 세포로부터 분리된 pVK526-MEM40/Kan을 HindIII 제한 효소 소화에 가한 다음에 1% 아가로스 겔 상에서 분석하여 델타-24-RGD-MEM40 게놈의 일체성을 확인하였다. 이어서, pVK526-MEM40/Kan을 SwaI로 소화시켜 카나마이신 저항 유전자를 제거하고, 결찰에 의해서 재-원형화시켜 pVK526-MEM40를 생성시켰다.

델타-24-RGD-MEM40 바이러스를 구조하기 위해서, pVK526-MEM40를 PacI로 소화시키고, 재조자의 지시에 따라서 Lipofectamine 3000 (Life Technologies)을 사용하여 A549 세포 내로 형질 감염시켰다. 세포병변 효과가 관찰되었을 때에 형질 감염된 A549 세포 단층을 수확하였고, 세포 용해물을 사용하여 신선한 A549 세포를 감염시켜서 바이러스를 팽창시켰다. 생성되는 바이러스를 E1A 유전자 내의 24 bp 삭제, 섬유 유전자 내의 RGD 삽입, 및 E3 유전자 대신 MEM40 발현 카세트 삽입의 존재에 대해서 입증하였다.

실시예 3

델타-24-RGD-MEM40의 특성화

Delta-24-RGD-MEM40을 특성화시키기 위해서, A549 세포를 델타-24-RGD-MEM40으로 24 시간 동안 감염시키고, 분석하여 마우스 CD154(Clone No. MR-1)에 특이적인 PE-표지된 항체로 유세포 분석에 의해서 MEM40의 세포 표면 발현을 확인하였다. 또한, MEM40의 생체 활성을 CD40 Bioassay Kit(Promega Corporation)를 사용하여 확인한다.

상기 개시된 특정의 구체예는 단지 예시적인데, 그 이유는 본 발명의 개시내용이 본원에서의 교시의 이점을 갖는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 자명한 다른 그러나 등가의 방식으로 변형되거거나 실행될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 상기 기재된 공정 단계는 다른 순서로 수행될 수 있다. 더욱이, 이하 청구범위에 기재된 것 외에도, 본원에서의 구성 또는 설계로 제한하고자 의도되지 않는다. 따라서, 상기 개시된 특정의 구체예는 변경되거나 변형될 수 있으며, 모든 그러한 변형이 본 발명의 개시내용의 범위 및 사상 내에 있는 것으로 여겨진다는 것이 명확하다.

따라서, 본원에서 청구하고자 하는 보호범위는 이하 청구범위에 기재된 바와 같다.

참고문헌

이하 참조문헌은, 이들이 본원에서 기재된 것들을 보충하는 예시적인 절차 또는 다른 상세사항을 제공하는 한, 본원에서 특별히 참조로 통합된다.

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DNAtrix <120> ARMED REPLICATION-COMPETENT ONCOLYTIC ADENOVIRUSES <130> 2176.000700 <150> US 62/584,008 <151> 2017-11-09 <150> US 62/437,474 <151> 2016-12-21 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 1 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 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gtcaagcccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 <210> 6 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 6 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca 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ctctaatcgg 540 gaggcttcga gtcaagcccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttccg ccaagccttg cgggcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcgtgttt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 <210> 8 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 8 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac 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ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 <210> 10 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 10 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttcctccca gctttgcgag cagcagtcta ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759 <210> 11 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 11 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttccg ccaagccttg cgggcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 <210> 12 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric human/mouse CD40 ligand <400> 12 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttccgccaa gccttgcggg cagcagtcta ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

Claims

아데노바이러스 게놈의 비필수 영역 내로 삽입된 이종 핵산을 함유하는 복제-가능 종양 분해 아데노바이러스(replication-competent oncolytic adenovirus)를 포함하는 조성물로서, 상기 핵산이 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제(CD40 agonist)를 인코딩(encoding)하는 서열을 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 E3 유전자 영역의 일부 또는 전부에서의 삭제를 포함하는 조성물.
청구항 2에 있어서,
전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 E3 삭제된 유전자 영역에 삽입되는 조성물.
청구항 3에 있어서,
전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 본래의 E3 유전자에 역 배향으로 삽입되는 조성물.
청구항 1에 있어서,
CD40 효능제가 적어도 하나의 CD40 리간드(CD40L)인 조성물.
청구항 5에 있어서,
적어도 하나의 CD40L이 키메라 인간/마우스 CD40 리간드인 조성물.
청구항 6에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 ISF30 (SEQ ID NO:1), ISF31 (SEQ ID NO:2), ISF32 (SEQ ID NO:3), ISF33 (SEQ ID NO:4), ISF34 (SEQ ID NO:5), ISF35 (MEM40) (SEQ ID NO:6), ISF36 (SEQ ID NO:7), ISF37 (SEQ ID NO:8), ISF38 (SEQ ID NO:9), ISF39 (SEQ ID NO:10), ISF40 (SEQ ID NO:11), 및 ISF41 (SEQ ID NO:12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
청구항 7에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 MEM40인 조성물.
청구항 6에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 ISF30 (SEQ ID NO:1), ISF31 (SEQ ID NO:2), ISF32 (SEQ ID NO:3), ISF33 (SEQ ID NO:4), ISF34 (SEQ ID NO:5), ISF35 (MEM40) (SEQ ID NO:6), ISF36 (SEQ ID NO:7), ISF37 (SEQ ID NO:8), ISF38 (SEQ ID NO:9), ISF39 (SEQ ID NO:10), ISF40 (SEQ ID NO:11), 및 ISF41 (SEQ ID NO:12)으로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드와 적어도 90% 상동성을 갖는 조성물.
청구항 1에 있어서,
CD40 효능제에 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소가 전사 프로모터(transcriptional promoter)인 조성물.
청구항 10에 있어서,
전사 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(cytomegalovirus (CMV) promoter)인 조성물.
청구항 1에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 인간 타입 5 아데노바이러스인 조성물.
청구항 12에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 델타 24 아데노바이러스 또는 델타-24-RGD 아데노바이러스인 조성물.
청구항 1에 있어서,
약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
아데노바이러스 게놈의 비필수 영역 내로 삽입된 이종 핵산을 함유하는 복제-가능 종양 분해 아데노바이러스를 암을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는 방법으로서, 상기 핵산이 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 방법.
청구항 15에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 E3 유전자 영역의 일부 또는 전부에서의 삭제를 포함하는 방법.
청구항 16에 있어서,
전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 E3 삭제된 유전자 영역에 삽입되는 방법.
청구항 17에 있어서,
전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 CD40 효능제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 본래의 E3 유전자에 역 배향으로 삽입되는 방법.
청구항 15에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 델타 24 아데노바이러스 또는 델타-24-RGD 아데노바이러스인 방법.
청구항 15에 있어서,
CD40 효능제가 적어도 하나의 CD40 리간드(CD40L)인 방법.
청구항 20에 있어서,
적어도 하나의 CD40L이 키메라 인간/마우스 CD40 리간드인 방법.
청구항 21에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 ISF30 (SEQ ID NO:1), ISF31 (SEQ ID NO:2), ISF32 (SEQ ID NO:3), ISF33 (SEQ ID NO:4), ISF34 (SEQ ID NO:5), ISF35 (MEM40) (SEQ ID NO:6), ISF36 (SEQ ID NO:7), ISF37 (SEQ ID NO:8), ISF38 (SEQ ID NO:9), ISF39 (SEQ ID NO:10), ISF40 (SEQ ID NO:11), 및 ISF41 (SEQ ID NO:12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
청구항 22에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 MEM40인 방법.
청구항 21에 있어서,
적어도 하나의 키메라 인간/마우스 CD40 리간드가 ISF30 (SEQ ID NO:1), ISF31 (SEQ ID NO:2), ISF32 (SEQ ID NO:3), ISF33 (SEQ ID NO:4), ISF34 (SEQ ID NO:5), ISF35 (MEM40) (SEQ ID NO:6), ISF36 (SEQ ID NO:7), ISF37 (SEQ ID NO:8), ISF38 (SEQ ID NO:9), ISF39 (SEQ ID NO:10), ISF40 (SEQ ID NO:11), 및 ISF41 (SEQ ID NO:12)으로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드와 적어도 90% 상동성을 갖는 방법.
청구항 15에 있어서,
CD40 효능제에 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소가 전사 프로모터인 방법.
청구항 25에 있어서,
전사 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터인 방법.
청구항 15에 있어서,
종양 분해 아데노바이러스가 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물로 투여되는 방법.
청구항 15에 있어서,
환자가 원발성 암 또는 전이성 암으로부터 선택된 암을 앓고 있는 방법.
청구항 15에 있어서,
환자가 뇌암(brain cancer) 또는 방광암(bladder cancer)을 앓고 있는 방법.
청구항 15에 있어서,
종양 분해 아데노바이러스가 종양내, 정맥내, 복강내, 기관내(intratracheally), 근육내, 두개내(intracranially), 내시경적으로(endoscopically), 병변내(intralesionally), 경피, 피하, 국소, 또는 직접적인 주사 또는 주입에 의해서 투여되는 방법.
청구항 15에 있어서,
종양 분해 아데노바이러스가 한번 또는 복수의 횟수로 투여되는 방법.
청구항 31에 있어서,
복제 가능 종양 분해 아데노바이러스가 10⁶-10¹³ 플라크 형성 단위(plaque forming unit(pfu))의 투여량으로 투여되는 방법.
청구항 15에 있어서,
적어도 하나의 추가의 치료제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
청구항 33에 있어서,
적어도 하나의 추가의 치료제가 화학요법, 면역요법, 수술, 방사선요법, 바이러스 요법 또는 생물요법(biotherapy)인 방법.
청구항 34에 있어서,
적어도 하나의 추가의 치료제가 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스의 투여 전에 환자에게 투여되는 방법.
청구항 34에 있어서,
적어도 하나의 추가의 치료제가 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스의 투여와 동시에 환자에게 투여되는 방법.
청구항 34에 있어서,
적어도 하나의 추가의 치료제가 복제 가능 종양 분해 아데노바이러스의 투여 후에 환자에게 투여되는 방법.
청구항 15에 있어서,
환자가 인간인 방법.