JP7280244B2 - 二重特異性t細胞アクチベーターを搭載したアデノウイルス - Google Patents
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- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Description
1.
式(I)の配列を含むアデノウイルスであって、
5’ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR(I)
式中、
B1は結合であるか、E1A、E1BまたはE1A-E1Bを含み;
BAは-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4を含み;
B2は結合であるか、E3を含み;
BXは結合であるか、制限酵素認識部位、1もしくは複数の導入遺伝子、またはその両方を含むDNA配列であり;
BBはL5を含み;
BYは、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター、CXL10、CXL9、およびIFNをそれぞれコードする4つの導入遺伝子を含有する導入遺伝子カセットを含み;
B3は結合であるか、E4を含む、
前記アデノウイルス。
2.
前記コードされたFAB-二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号5、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号5など)、に示される抗CD3を含む、項目1に記載のアデノウイルス。
3.
前記FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号9、またはそれ対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号9など)、に示される抗FAPを含む、項目1または項目2に記載のアデノウイルス。
4.
前記コードされたFAB-二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号75、配列番号76、またはそのうちのいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する配列、から選択される配列を含む、項目1に記載のアデノウイルス。
5.
前記導入遺伝子カセットが、配列番号100、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号100など)、に示されるCXL10をコードする、項目1~4のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
6.
前記導入遺伝子カセットが、配列番号99、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号99など)、に示されるCXCL9をコードする、項目1~5のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
7.
前記導入遺伝子カセットが、配列番号98、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号98など)、に示されるIFNαをコードする、項目1~6のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
8.
各前記導入遺伝子が機能的に連結されている、項目1~7のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
9.
各前記導入遺伝子が3つの異なる高効率自己開裂型ペプチドで隔てられている、項目1~8のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
10.
前記各自己開裂型ペプチドが独立してE2A、F2A、P2A、およびT2Aから選択される、項目9に記載のアデノウイルス。
11.
L5からE4までの各前記導入遺伝子の相対的順序が、例えば図1のNG-641に示すように、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター、CXL10、CXL9、およびIFNαである、項目1~10のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
12.
前記導入遺伝子カセットが、配列番号95に示されるポリヌクレオチド配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号95、を有する、項目1~11のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
13.
配列番号84を含む、項目1~12のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
14.
複製適格性である、項目1~13のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
15.
腫瘍溶解性である、項目1~14のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
16.
Ad11由来のヘキソンおよびファイバーを有する、項目1~15のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
17.
項目1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルス、および賦形剤、希釈剤、または担体、を含む医薬組成物。
18.
治療用、例えばがん治療用の、項目1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または項目17に記載の医薬組成物。
19.
項目1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは項目17に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者を治療する方法。
20.
がん治療用の医薬の製造のための、項目1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または項目17に記載の医薬組成物、の使用。
アデノウイルスの構造は通常似通っているため、下記の各エレメントは、当業者に公知の構造エレメントおよび一般的に使用されるその呼称に関して説明がなされる。エレメントが本明細書で言及されている場合、そのエレメントをコードしているDNA配列、またはアデノウイルスにおけるそのエレメントの同一構造タンパク質をコードしているDNA配列のことを指している。DNAコードには冗長性があるため、後者は関連性がある。最適な結果を得るために、そのウイルスのコドン使用頻度の優先度を考慮する必要がある場合がある。
「遺伝子発現の調節因子」(または調節因子/調節エレメント)とは、本明細書で用いられる場合、通例転写または翻訳を惹起または増強することによって遺伝子発現で役割を果たす、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはスプライスアクセプター配列などの、遺伝的機構を指す。
本開示は本明細書に記載のウイルスの医薬製剤も包含する。
さらなる態様において、本開示は、治療、特にがん治療で使用される、本明細書に記載のウイルスまたはウイルス製剤を包含する。
配列番号1:N末端にシグナル配列、C末端に10Hisアフィニティータグを有する、抗FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターのDNAコード配列
配列番号2:N末端にシグナル配列、C末端に10Hisアフィニティータグを有する、抗FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターのアミノ酸配列
配列番号3:N末端にシグナル配列、C末端に10Hisアフィニティータグを有する、対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーターのDNAコード配列
配列番号4:N末端にシグナル配列、C末端に10Hisアフィニティータグを有する、対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーターのアミノ酸配列
配列番号5:抗CD3 ScFvのアミノ酸配列
配列番号6:抗CD3 VH
配列番号7:抗CD3 VL
配列番号8:抗CD3 ScFvリンカー配列
配列番号9:抗FAP ScFv
配列番号10:抗FAP VLドメイン
配列番号11:抗FAP VHドメイン
配列番号12:抗FAPおよび抗EpCAMのリンカー配列
配列番号13:二重特異性T細胞アクチベーターリーダー配列
配列番号14:対照二重特異性T細胞アクチベーター(抗FHA)
配列番号15:対照(抗FHA)ScFv
配列番号16:対照(抗FHA)VL
配列番号17:対照(抗FHA)VH
配列番号18:対照(抗FHA)ScFvリンカー配列
配列番号19:10Hisタグ配列
配列番号20:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター-P2A-RFP(イタリック体=リーダー、太字=フーリン切断部位、下線=P2A配列、小文字=RFP)
配列番号21:対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーター-P2A-RFP(イタリック体=リーダー、太字=フーリン切断部位、下線=P2A配列、小文字=RFP)
配列番号22:ヒトFAPのDNAコード配列
配列番号23:ヒトFAPのアミノ酸配列
配列番号24:CMVプロモーター配列
配列番号25:SV40 lateポリアデニル化配列
配列番号26:NG-605(EnAd-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベーター)
配列番号27:NG-606(EnAd-SA-FAP二重特異性T細胞アクチベーター)
配列番号28:EnAdゲノム
配列番号29:EnAdゲノムの28166bp~28366bpに対応し、それを含む、BXのDNA配列
配列番号30:ENADゲノムの29345~29379BPに対応し、それを含む、BYのDNA配列
配列番号31:HISタグ
配列番号32:スプライスアクセプター配列
配列番号33:SV40ポリアデニル化配列
配列番号34:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター核酸配列(OKT3)
配列番号35:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター核酸配列(aCD3)
配列番号36:NG-611導入遺伝子カセット
配列番号37:NG-612導入遺伝子カセット
配列番号38:NG-613導入遺伝子カセット
配列番号39:制限酵素認識部位インサート(BX)
配列番号40:制限酵素認識部位インサート(BY)
配列番号41:CMVプロモーター配列
配列番号42:PGKプロモーター配列
配列番号43:CBAプロモーター配列
配列番号44:短スプライスアクセプター(SSA)DNA配列
配列番号45:スプライスアクセプター(SA)DNA配列
配列番号46:分岐状スプライスアクセプター(bSA)DNA配列
配列番号47:コザック配列(ヌル配列)
配列番号48:開始コドンの例
配列番号49:内部リボソーム進入配列(Internal Ribosome Entry Sequence)(IRES)
配列番号50:P2Aペプチド
配列番号51:F2Aペプチド
配列番号52:E2Aペプチド
配列番号53:T2Aペプチド
配列番号54:ポリアデニル化(ポリA)配列
配列番号55:リーダー配列
配列番号56:リーダー配列
配列番号57:IFNγアミノ酸配列
配列番号58:IFNαアミノ酸配列
配列番号59:TNFαアミノ酸配列
配列番号60:EnAdゲノムのE2B領域(bp10355~5068)に対応するDNA配列
配列番号61:N末端にシグナル配列を持ち、C末端に10Hisアフィニティータグを持たない、抗FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターのDNAコード配列
配列番号62:N末端にシグナル配列を持ち、C末端に10Hisアフィニティータグを持たない、抗FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターのアミノ酸配列
配列番号63:N末端にシグナル配列を持ち、C末端に10Hisアフィニティータグを持たない、対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーターのDNAコード配列
配列番号64:N末端にシグナル配列を持ち、C末端に10Hisアフィニティータグを持たない、対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーターのアミノ酸配列
配列番号65:C末端に10Hisアフィニティータグを持たない、対照二重特異性T細胞アクチベーター(抗FHA)
配列番号(Q ID NO:)66:10Hisアフィニティータグを持たない、NG-605(EnAd-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベーター)
配列番号67:10Hisアフィニティータグを持たない、NG-606(EnAd-SA-FAP二重特異性T細胞アクチベーター)
配列番号68:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター核酸配列(OKT3)
配列番号69:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター核酸配列(aCD3)
配列番号70:NG-611導入遺伝子カセット
配列番号71:NG-612導入遺伝子カセット
配列番号72:NG-613導入遺伝子カセット
配列番号73:NG-614導入遺伝子カセット
配列番号74:NG-617導入遺伝子カセット
配列番号75:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターアミノ酸配列(OKT3)
配列番号76:FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターアミノ酸配列(aCD3)
配列番号77:NG-611ゲノム
配列番号78:NG-612ゲノム
配列番号79:NG-613ゲノム
配列番号80:NG-614ゲノム
配列番号81:NG-617ゲノム
配列番号82:NG-615ゲノム
配列番号83:NG-640ゲノム
配列番号84:NG-641ゲノム
配列番号85:ヌル配列
配列番号86:Flt3L核酸配列
配列番号87:ヌル配列
配列番号88:MIP1α核酸配列
配列番号89:可動性リンカー配列
配列番号90:IFNα核酸配列
配列番号91:CXCL10核酸配列
配列番号92:CXCL9核酸配列
配列番号93:NG-615導入遺伝子カセット
配列番号94:NG-640導入遺伝子カセット
配列番号95:NG-641導入遺伝子カセット
配列番号96:FLT3Lアミノ酸配列
配列番号97:MIP1αアミノ酸配列
配列番号98:IFNαアミノ酸配列
配列番号99:CXCL9アミノ酸配列
配列番号100:CXCL10アミノ酸配列
配列番号101:NG-618ゲノム
配列番号102:NG-618 FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター核酸配列
配列番号103:NG-618導入遺伝子カセット
配列番号104~277:リンカー配列
配列番号278:NG-616ゲノム
配列番号279~281:プライマー
本実施例に記載の通りに、組換え二重特異性T細胞アクチベーターを設計し、タンパク質を生産した。
二重特異性T細胞アクチベーターは、特異性が異なる2つの一本鎖抗体フラグメント(ScFv)を可動性Gly4Serリンカーで連結することにより作製される。ScFvは、親モノクローナル抗体由来のVHドメインおよびVLドメインをリンカーで連結することにより作製される。各二重特異性T細胞アクチベーターは、N末端には哺乳類における分泌用のシグナル配列を、C末端には検出および精製用のデカヒスチジンアフィニティータグを有するように設計した。二重特異性T細胞アクチベーターは、標準的なDNAクローン技術で操作し、タンパク質発現ベクターに挿入した(図1)。
組換え二重特異性T細胞アクチベータータンパク質は、タンパク質発現を駆動するためのCMVプロモーター(配列番号24)を用いて、各配列をpSF-CMVベクターにクローニングすることにより生産した(図1)。pSF-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベータープラスミドおよびpSF-CMV-Control二重特異性T細胞アクチベータープラスミドのプラスミドDNA濃度(表2)は、NanoDropで測定した。空pSF-CMVベクターは陰性対照として含まれている。54.7μgの各々を4mLのOptiMEMで希釈した。109.2μgのPEI(直鎖状、分子量25000、ポリサイエンス社(Polysciences)、米国)を4mLのOptiMEM培地で希釈し、4mlの希釈DNAと混合して、DNA-PEI複合体(1:2のDNA:PEI比(w/w))を得た。室温で20分間インキュベートした後、この混合物にOptiMEMを18mLになるまで加え、このトランスフェクション用混合物を、90%コンフルエントのAd293細胞を含有するT175フラスコに添加した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、30mLの細胞培地(グルタミン添加、フェノールレッド非含有のDMEM(高グルコース))を細胞に添加し、37℃、5%CO2で48時間フラスコをインキュベートした。並行して、別のフラスコの細胞をpSF-CMV-GFPでトランスフェクトして、トランスフェクションが効率的であることを確認した。分泌タンパク質を回収するため、トランスフェクト細胞の上清を回収し、350g、4℃で5分間遠心して細胞成分を除去した(Allegra X-15R、ベックマン・コールター社)。上清を10k MWCO Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(ミリポア社)に移した。4750rpm、4℃でスピン後、この濃縮液の体積をフロースルーで調整して、50倍高い濃度を得た。濃縮タンパク質の一定分量を-80℃で保存した。
FAPを標的とする二重特異性T細胞アクチベーター分子および2または3種類の免疫調節性タンパク質をコードする、3種のウイルス(NG-640、NG-641、およびNG-615)を作製した(表1)。NG-640は、3種類の導入遺伝子タンパク質、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター分子と、ケモカインであるCXCL9およびCXCL10とをコードする。NG-641およびNG-615は共に4種類の導入遺伝子タンパク質をコードする。NG-641はFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターと、ケモカインであるCXCL9およびCXCL10と、サイトカインであるIFNαとをコードし、NG-615はFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターと、ケモカインであるMIP1αと、サイトカインであるFLT3リガンドおよびIFNαとをコードする。FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター分子のみをコードするウイルスも作製する(NG-617)。
プラスミドpEnAd2.4を用いて、合成された導入遺伝子カセット(それぞれ、配列番号93、94、および95)を直接挿入することで、プラスミドpNG-615、pNG-640、およびpNG-641を作製した。NG-615は、FAPを標的とする二重特異性T細胞アクチベーター(配列番号102)、Flt3L(配列番号86)、MIP1α(配列番号88)、およびIFNα(配列番号90)をコードする4種類の導入遺伝子を含有する。NG-640およびNG-641はFAPを標的とする二重特異性T細胞アクチベーター(配列番号102)、CXCL9(配列番号92)、およびCXCL10(配列番号91)をコードし、NG-641はIFNαをコードする4つ目の導入遺伝子(配列番号90)も含有する。導入遺伝子カセットの模式図を図1に示す。プラスミドDNAの構築を制限酵素的分析およびDNAシーケンスで確認した。
ウイルス複製
肺癌細胞株(A549)、乳房癌細胞株(MDA-MB-453)または膀胱癌細胞株(RT4)に、1ppcのNG-615、NG-640、NG-641、NG-617、Enadenotucirev(EnAd)を72時間接種させるか、または未感染のままとし、これらをqPCRによるウイルスDNAの定量化に用いた。細胞上清を回収し、1200rpmで5分間遠心することにより清澄化した。50μLの上清をDNA解析に用いた。
100ppcのNG-615、NG-640、NG-641、NG-617、EnAdを接種させた、または未感染のままの肺(A549)癌細胞を、xCELLigence Real Time Cell Analyzer(RTCA)を用いてモニターした。細胞増殖を60分毎に最長96時間モニターした。これらの細胞の腫瘍溶解を、50%の溶解が達成された時点である半殺滅時間(Killing Time 50)(KT50)を算出することにより評価した(図3)。これらのデータは、親EnAdウイルスを含む全ての試験ウイルスの間で、同等のKT50を示した。未処理細胞に対しては、腫瘍溶解作用は確認されなかった。
二重特異性T細胞アクチベーターを検出するために、ウェスタンブロッティングの手法を用いて、抗His抗体で、C末端のデカヒスチジンアフィニティータグをプローブすることができる。タンパク質試料を、溶解緩衝液で、β-メルカプトエタノールおよびSDSを含有する、2.5μLの6×Laemmli SDS Sample Bufferを含む最終体積15μLに調整した。試料を95℃で5分間インキュベートすることでタンパク質を変性させ、15ウェルの10%プレキャストポリアクリルアミドゲル(Mini-PROTEAN TGX Precast Gels、バイオラド社、英国)に添加した。Mini-PROTEAN Tetra System(バイオラド社、英国)内の、1×泳動用緩衝液中、180Vで45分間、ゲルを泳動した。Mini Trans-Blot Cell(バイオラド社、英国)内の、1×転写用緩衝液中、300mA、4℃、90分間のウェット式エレクトロブロッティングにより、タンパク質をSDSゲルからニトロセルロースメンブレンに転写した。転写は、熱を制限するために、アイスパック(ice pack)の存在下で実行した。次に、ニトロセルロースメンブレンを振盪機上、PBS-T中5%ミルクで、室温で1時間ブロッキングし、PBS/5%ミルクで1:5000希釈した抗His(C末端)抗体(マウス抗6×His、クローン3D5、インビトロジェン社、英国、製品番号46-0693)でプローブした。振盪機上で4℃で一晩インキュベートした後、メンブレンを洗浄し、HRP標識ポリクローナル抗マウス免疫グロブリン二次抗体(PBS/5%ミルクで1:10.000、ダコ社、製品番号P0161)で室温で1時間プローブした。可視化のため、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、英国)を製造業者の取扱説明書に従って適用し、X線フィルムに露光して、自動フィルム現像機で現像した。結果から、二重特異性T細胞アクチベータータンパク質が、二重特異性T細胞アクチベーター発現プラスミドでトランスフェクトされたAd293細胞からは発現および分泌されたが、親ベクターでトランスフェクトされたAd293細胞からは発現および分泌されなかったことが示された。
組み換え二重特異性T細胞アクチベータータンパク質の量を測定するため、ドットブロットの手法を用いて、二重特異性T細胞アクチベーターシグナルを、Hisタグ付(C末端10His)タンパク質標準(10×Hisタグ付ヒトカテプシンD、バイオレジェンド社、製品番号556704)と比較した。二重特異性T細胞アクチベーター試料およびタンパク質標準の2倍連続希釈系列を用意し、それぞれ1.5μLをニトロセルロースメンブレンに直接アプライし、20分間風乾した。次に、ウェスタンブロッティング用の上記のブロッキング/染色プロトコルを実施した。タンパク質標準のモル濃度は、250μg/mLの二重特異性T細胞アクチベーター濃度を示すように調整した。結果(図13A)から、二重特異性T細胞アクチベーター発現プラスミドでトランスフェクトされたAd293細胞からの二重特異性T細胞アクチベータータンパク質の発現および分泌が示された。
pSF-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベーターまたはpSF-CMV-Control二重特異性T細胞アクチベーターでトランスフェクトされた細胞から分泌された、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターおよび対照(抗FHA)二重特異性T細胞アクチベーター(配列番号2および4)のFAP結合活性を、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)で評価した。空pSF-CMVベクター上清は陰性対照として用いた。ELISA用プレート(Nunc Immuno MaxiSorp 96ウェルマイクロプレート)を、PBS緩衝液中、ヒトFAP/セプラーゼタンパク質(100ng/ウェル、シノ・バイオロジカル社(Sino Biological Inc)、10464-H07H-10)で、4℃で一晩コーティングすることで準備した。その後の全ての結合工程間で、PBS+0.05%Tween20でプレートを洗浄した。プレートを5%BSA/PBS+0.05%Tween20で室温で1時間ブロッキングした。一定分量の二重特異性T細胞アクチベータータンパク質、または空pSF-CMVベクタートランスフェクションのウェルから回収されたタンパク質を、5%BSA/PBS+0.05%Tween20で10倍希釈した。全試料をFAPコートプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。検出用抗体である、抗His(C末端)抗体(マウス抗6xHis、クローン3D5、インビトロジェン社、英国、製品番号46-0693)を1:1000希釈し、室温で1時間アプライした。次に、HRP結合型抗マウスFc(PBS+5%ミルク中1:1000、ダコ社)を室温で1時間アプライし、その後、HRP基質溶液3.3.5.5’-テトラ(tera)メチルエチレンジアミン(TMB、サーモフィッシャー社)を用いてHRP検出を実施した。反応を止めるために停止液を使用し、プレートリーダーにより450nmで発色を測定した。FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター上清、対照二重特異性T細胞アクチベーター上清、および空ベクター上清について、450nmの吸光度をプロットしたところ、FAPタンパク質に対するFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの特異的結合が示された。結果(図13B)から、組換えFAPタンパク質に対して、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターは特異的に結合するが、対照二重特異性T細胞アクチベーターは特異的に結合しないことが分かる。
ケモカインまたはサイトカインの導入遺伝子、IFNα、MIP1α、FLT3L、CXCL10、およびCXCL9、の発現を、ELISAを用いて評価した。A549癌細胞株およびRT4癌細胞株に、最長7日間、1ppcのNG-615、NG-640、NG-641、NG-617、EnAdを接種させるか、未感染のままとした。接種の4日後および7日後に、細胞上清を清澄化し、ELISAで導入遺伝子発現を評価した。
Jurkat-Dualレポーター細胞株(インビボジェン社(Invivogen))を用いたアッセイで、機能的なFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター導入遺伝子およびIFNα導入遺伝子の発現を評価した。これは、2つの誘導性レポーターコンストラクトの安定な組込みによって形質転換したヒト不死化Tリンパ球細胞株(ジャーカット)である。これらの誘導性レポーターコンストラクトのうちの1つにより、インターフェロン調節因子(IRF)経路のIFN-α活性化の、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)の分泌および活性を通じた研究が可能となり、2つ目は、T細胞受容体を通じたシグナル伝達によって活性となる、NF-kBに応答して分泌されるルシフェラーゼレポーターである。SEAPの活性は上清中に存在するIFN-αのレベルに比例し、Quanti-Blue(商標)基質のSEAP誘導性分解を検出することにより測定することができる。機能的なMIP1αの発現は、CCR5レポーター細胞株(CHO-K1 CCR5 β-arrestin、インビボジェン社)を用いて評価した。A549癌細胞株に、1ppcのNG-615、NG-640、NG-641、NG-617、EnAdを接種させるか、未感染のままとした。接種の2日後、3日後、または4日後に、解析用に、細胞上清を回収して清澄化した。
二重特異性T細胞アクチベーター導入遺伝子を保有するEnAdウイルスの構築に先立ち、いくつかの異なるアッセイで組み換え二重特異性T細胞アクチベータータンパク質の機能活性を評価した。
ヒトPBMCを、NHS Blood and Transplant(英国、オックスフォード)から入手した、健常ドナーの新鮮ヒト血液試料から、または全血白血球コーン(cone)から、密度勾配遠心により単離した。どちらの場合でも、試料をPBSで1:2希釈し、25mLのこの混合物を、50mLファルコンチューブ内で、13mLのフィコール(1.079g/mL、Ficoll-Paque Plus、GEヘルスケア社)の上に積層した。試料を1600rpm、30分間、22℃の遠心(Allegra X-15R、ベックマン・コールター社)にかけ、減速設定は最も遅くして相分離を保存した。遠心分離後、4つの層が確認でき、最上層には血漿層、次に、PBMCを含有する界面、フィコール層、底には赤血球および顆粒球の層が含まれていた。PBMCをパスツールピペットで回収し、PBSで2回洗浄し(1200rpm、10分間、室温)、10%FBSを添加したRPMI培地で再懸濁した。
Pan T Cell Isolation Kit(ミルテニーバイオテク社(Miltenyi Biotec)、製品番号130-096-535)を製造業者のプロトコルに従って用いて、CD3陽性(CD3+)T細胞を非CD3細胞の枯渇によりPBMCから抽出した。
卵巣がん、膵がん、乳房がん、および胃がんを含むがこれらに限定はされない複数の適応症を有する患者から得られた初代ヒト腹水試料を、チャーチル病院(オックスフォード大学病院)の腫瘍病棟から入手した。入手後、細胞画分および体液画分を分離し、一定分量の体液を保存およびさらなる解析のために-20℃で凍結した。細胞画分を、製造業者の取扱説明書に従って赤血球溶解緩衝液(ロシュ社、製品番号11814389001)で処理することで、赤血球を除去した。各試料中に存在する細胞型を、EpCAM、EGFR、FAP、CD45、CD11b、CD56、CD3、CD4、CD8、PD1、およびCTLA4の染色によって決定し、フローサイトメトリーで解析した。次に、各細胞を、エキソビボでのT細胞活性化および標的細胞溶解実験に新たに用いた。いくつかの場合では、後の実験で使用するために、細胞は10%FBS添加DMEM中で継代した。
全ての細胞株は、特に記載がない限り、37℃、5%CO2の加湿恒温器(MCO-17AIC、サンヨー社)内で、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS、ギブコ社(商標))および1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(10mg/mL、シグマ・アルドリッチ社、英国)を添加した、表3で指定される通りのDMEM培地(シグマ・アルドリッチ社、英国)またはRPMI培地(シグマ・アルドリッチ社、英国)中で維持した。細胞は、コンフルエントに達する2~3日前に毎回、トリプシン/EDTA(0.05%トリプシン、0.02%EDTA、シグマ・アルドリッチ社、英国)を用いた酵素的剥離により、継代した。この処理では、培地を吸引し、細胞を15mlのPBSで洗浄した後、細胞を2mLのトリプシン/EDTAで37℃で2~10分間処理した。トリプシンを10mLの10%FBS含有DMEMで中和し、細胞の一部を新鮮な培地を含んだ新たなフラスコに移した。通例の細胞培養用には、培地には10%FBSを添加し、感染およびウイルスプラスミドトランスフェクション用には2%FBSを添加し、組み換え二重特異性T細胞アクチベータープラスミドトランスフェクション用にはFBSは添加しなかった。
2つの条件が比較されている場合、t検定を用いて統計解析を実施した。他の全ての場合では、一元配置分散分析を用いて統計解析を実施した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)の存在下または非存在下の、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの、T細胞の活性化を誘導する能力を比較した。ヒトCD3+T細胞(96ウェルU字底プレート内で70,000細胞/ウェル)を、培地単独、または300ng/mL FAP二重特異性T細胞アクチベーターもしくは対照二重特異性T細胞アクチベーターの存在下で、単独でまたはNHDF細胞(10:1 T:NHDF)と共培養した。細胞を37℃で24時間共培養した後、酵素非含有細胞剥離緩衝液(サーモ社、製品番号13151014)で回収した。次に、CD45+T細胞上のCD69(図14A)およびCD25(図14B)の発現レベルを、抗体染色およびフローサイトメトリーによって解析し、幾何平均蛍光(gMFI)値として表した。T細胞活性化の陽性対照としては、プレートに固定された抗CD3抗体(7.5μg/mL)を用いた。FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターはT細胞上の活性化マーカーCD69およびCD25の発現を選択的に誘導し、このことは、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターがT細胞を活性化できたことを示している。
NG-641内の導入遺伝子から産生されたIFNαの機能性をさらに評価するため、Jurkat-Dual(商標)細胞を、未感染、または10粒子/細胞(particles per cell)(ppc)のEnadenotucirev(EnAd)もしくはNG-641を3日間感染させたA549腫瘍細胞から得られた上清で処理した。SEAPの分泌がIFNα特異的であることを示すために、Jurkat-Dualレポーター細胞株の処理の30分間前に、IFNα特異的抗体をA549上清とインキュベートすることで、IFNαを遮断した。アイソタイプ対照抗体は陰性対照として用いた。データ(図8A)から分かるように、NG-641で処理された腫瘍細胞上清の、Jurkat-Dualレポーターアッセイにおける活性は、抗IFNα抗体によって阻害されるが、アイソタイプ対照では阻害されず、すなわちIFNα介在性である。異なるレポーターアッセイシステムを用いて、NG-641内のCXCL9およびCXL10ケモカイン導入遺伝子の機能性を評価した。このアッセイでは、両ケモカインに対する受容体であるCXCR3を発現するPathHunter β-Arrestinレポーター細胞株(ユーロフィン社(Eurofins))を用いた。GPCRの活性化の後、これらの細胞に発現されたCXCR3にCXCL9/10が結合することで、β-アレスチンが当該受容体にリクルートされ、これは、EFC(Enzyme Fragment Complementation)技術に基づいたゲイン・オブ・シグナルアッセイ(gain-of-signal assay)を用いて測定される。PathHunter β-Arrestin CXCR3レポーター細胞を、未感染の、または10粒子/細胞(ppc)のEnAdもしくはNG-641を3日間させたA549腫瘍細胞から得られた上清で処理した。このアッセイでは、上清中のCXCL9/10の濃度は発光に比例する。GPCR活性化がCXCL9/10特異的であることを示すために、PathHunter β-Arrestin細胞の処理の30分前に、CXCL9/10特異的抗体をA549上清とインキュベートすることで、CXCL9およびCXCL10を遮断した。図8Bに示されるデータから分かるように、EnAd対照または未感染対照と比較して、NG-641処理腫瘍細胞から得られた上清の存在下ではCXCR3レポーター細胞の活性が増加しており、この増加はCXCL9/10に対する抗体によって遮断されている。
完全な倫理的承認の下でバイオバンクを介して提供された、計画外科的切除から得られた、新鮮切除ヒト腫瘍の試料を、まず鋏およびスカルペルで刻み、その後GentleMACs組織分散機(ミルテニーバイオテク社)を用いて単細胞浮遊液を作製した。これらの未分離の細胞調製物は、腫瘍細胞と、線維芽細胞と、T細胞をはじめとする様々な免疫細胞とを含むことが分かったため、これらを用いて、初代腫瘍細胞に感染し、コードされた導入遺伝子を生産し、培養物中に同様に存在する腫瘍浸潤性T細胞を活性化する、ウイルスの能力を評価した。細胞を、Ham’s F-12 Nutrient Mix、GlutaMAX(商標)Supplement(ギブコ社)、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine(ITS-X)(ギブコ社)、2.5mg/mLのアムホテリシンB(ギブコ社(商標))、100ユニット/mLのペニシリン、100mg/mLのストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、および10%FBSからなる培地で再懸濁し、約1×106細胞/mlで96ウェルプレート(0.25ml最終体積)または24ウェルプレート(0.5ml最終体積)に播種した。細胞は、1000ppcのEnAd、NG-615、NG-617、NG-640、もしくはNG-641を接種するか、未処理(UIC)のままとした。T細胞活性化の陽性対照として、いくつかのウェルを、各2μg/mlの抗CD3抗体および抗CD28抗体でも刺激した。細胞を2連ウェルで72時間培養した後、上清を回収し、産生された各種サイトカインのレベルをマルチサイトカイン蛍光ビーズベースのキット(LEGENDplex(商標))およびフローサイトメーターを用いて測定した。3種類の非小細胞肺癌(NSCLC)試料(T016、T017、T024)、1種類の腎細胞癌(RCC)、および1種類の結腸直腸(CRC)肝転移試料を試験した。図4~6の導入遺伝子発現データと一致して、IFNαは、NG-615で処理された培養物およびNG-641で処理された培養物で選択的に産生された(図10A)。Flt3リガンド(FLT3L)はNG-615処理後に検出されやすかったが、他のウイルスでは非常に低いレベルしか検出されず、またこれらのレベルは抗CD3/28でT細胞を活性化させることにより誘導されるレベルと同様であったことから、NG-615培養物中のFlt3Lが導入遺伝子産物であることが示された。他のサイトカインの結果からは、実施例3に記載の腫瘍細胞株接種試験と同様(図7)、図10BのIFNγ、TNFα、IL-17、グランザイムB、およびIL-13で示されるように、NG-615接種が、他のFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターコードウイルスNG-617、NG-640、および他の4導入遺伝子保有ウイルスNG-641よりも、かなり低いT細胞活性化レベルをもたらすことが示された。
本実施例では、組換えFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターにより活性化されたT細胞の、線維芽細胞標的細胞の死を誘導する能力を評価した。
NHDF(7,000個の細胞)を、培地単独、または300ng/mLの対照二重特異性T細胞アクチベーターもしくはFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの存在下、U字底96ウェルプレートのウェル内で、70,000個のT細胞と共培養した。24時間の共培養の後、上清を回収し、製造業者の取扱説明書に従ったLDHアッセイにより細胞傷害性を測定した。図15Aの結果から分かるように、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターはNHDF細胞の溶解を顕著に誘導した。
親未トランスフェクト細胞との比較によりFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターのFAP抗原特異性を示すための手段として、安定にFAPを発現するCHO細胞株およびAd293細胞株を作製した。
FAP遺伝子のタンパク質配列をNCBIデータベースから入手して(配列番号23)、逆転写によりDNAコード配列を作製し、オックスフォード・ジェネティクス社(Oxford Genetics Ltd)(オックスフォード、英国)により合成させた。FAP遺伝子を標準的なクローン技術でpSF-Lentiベクターにクローニングすることで、pSF-Lenti-FAPベクターを得た。HEK293T細胞を、このレンチウイルス型FAP発現ベクターでトランスフェクトし、同様にpSF-CMV-HIV-Gag-Pol、pSF-CMV-VSV-G、pSF-CMV-HIV-Revでも実施した。Lipofectamine 2000をトランスフェクション試薬として用い、DNA:Lipofectamine比が1:2となるようにベクターDNAに添加し、37℃で細胞とインキュベートした。48時間後、レンチウイルスを含有する上清を回収し、ポリブレンと混合した(最終濃度、8μg/mL)。このレンチウイルス/ポリブレン混合物を、播種されたAd293細胞またはCHO細胞に添加し、37℃でインキュベートした。4日目、上清をピューロマイシン(Ad293の場合は2μg/mL、CHOの場合は7.5μg/mL)を含有する培地と交換した。次に、安定な変異株をクローニングによるセレクションにかけ、親細胞株または安定トランスフェクト変異株のFAP発現を、FAPまたは同位体対照抗体を用いた染色により決定し、フローサイトメトリーで解析した(図18A)。
CHO細胞またはCHO-FAP細胞(7,000個の細胞)を、U字底96ウェルプレートのウェル内で、培地単独、または2μg/mLの対照二重特異性T細胞アクチベーターもしくはFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの存在下、単独、またはヒトT細胞(70,000個)と共培養した。24時間のインキュベーションの後、上清を回収し、実施例4に記載されたようなLDH細胞傷害性アッセイにより標的細胞傷害性を測定した(図18B)。フローサイトメトリーによるCD69およびCD25の発現レベルの解析によって、T細胞活性化も測定した(図19)。細胞傷害性は、CHO-FAP細胞がT細胞およびFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターと共に培養された場合にのみ確認された。このことは、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターを介したT細胞の活性化および標的細胞の溶解が、FAP発現細胞に対して高度に特異的且つ限定的であるが、FAP陰性の親細胞株に対してはそうではないことを示している。
さらなる実験において、組換えFAP特異的二重特異性T細胞アクチベータータンパク質の、CD4 T細胞またはCD8 T細胞を活性化する能力、および、これらのT細胞サブセットの各々の、NHDF細胞を溶解する能力を評価した。CD3+T細胞(35,000個)を、U字底96ウェルプレートのウェル内で、300ng/mLの対照二重特異性T細胞アクチベーターまたはFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの存在下、7,000個のNHDF細胞と共培養し、37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収し、抗CD4抗体または抗CD8抗体と、抗CD69抗体および抗CD25抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで解析した。結果(図20A)に示されるとおり、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターは、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方において、活性化マーカーであるCD69およびCD25の増加を誘導した。
初代悪性腹水から得られた自家腫瘍関連リンパ球のFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター介在性活性化の特性評価
がん患者由来細胞を用いて二重特異性T細胞アクチベータータンパク質の活性を評価するために、CD3+T細胞およびFAP+細胞の両方を含有する初代悪性腹水(ascetic fluid)の試料を、試験用に入手した。未純化腹水細胞(すなわち採取時から未変化)を、500ng/mLの対照二重特異性T細胞アクチベーターまたはFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターの存在下、100%腹水または1%ヒト血清添加培地中、U字底96ウェルプレートの1ウェル当たり250,000個の細胞を播種した。未処理ウェルを陰性対照として用いた。37℃で5日間インキュベーションした後、総細胞集団を回収し、CD3+T細胞の数(図21A)およびCD3+T細胞上のCD25の発現レベル(図21B)を測定した。1ウェル当たりの総細胞数はPrecision Counting Beadsを用いて求めた。その結果、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターが、がん患者由来の腫瘍関連T細胞のT細胞活性化を顕著に増加させたことが示された。
下記の方法を用いて、組換え二重特異性T細胞アクチベーター発現EnAdウイルスの操作、生成、および精製を行った。
EnAdは、E2B領域におけるAd3のAd11pへの高頻度非相同ヌクレオチド置換と、ほぼ完全なE3欠失と、E4orf4に位置付けられるより小さなE4欠失と、を含有する、複製適格性のキメラアデノウイルスB群である(Kuhn et al, Directed evolution generates a novel oncolytic virus for the treatment of colon cancer, PLoS One, 2008 Jun 18; 3(6): e2409)。
プラスミドであるEnAd2.4-CMV-EpCAM二重特異性T細胞アクチベーター、pEnAd2.4-SA-EpCAM二重特異性T細胞アクチベーター、pEnAd2.4-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベーター、pEnAd2.4-SA-FAP二重特異性T細胞アクチベーター、pEnAd2.4-CMV-Control二重特異性T細胞アクチベーター、pEnAd2.4-SA-Control二重特異性T細胞アクチベーターを、AscI酵素を用いて制限酵素消化で直線化し、直鎖状(liner)ウイルスゲノムを得た。消化後のDNAを、イソプロパノール抽出で精製し、300μlの95%超分子生物学グレードエタノールおよび10μlの3M酢酸ナトリウム中、16時間、-20℃の沈殿を行った。沈殿したDNAを14000rpm、5分間の遠心でペレット化し、500μlの70%エタノールで洗浄後、再度14000rpmで5分間遠心した。このクリーンなDNAペレットを風乾して100μLの水に再懸濁した。6.25μgのDNAを、OptiMEM中の15.6μLのLipofectamineトランスフェクション試薬と混合し、室温で20分間インキュベートした。次に、このトランスフェクション用混合物を、80%コンフルエントまで増殖させたAd293細胞を含有するT-25フラスコに添加した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、4mlの細胞培地(グルタミンおよび10%FBSを添加した、DMEM(高グルコース))を細胞に添加し、37℃、5%CO2でフラスコをインキュベートした。トランスフェクトしたAd293細胞を24時間毎にモニターし、48~72時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における顕著な細胞変性効果(CPE)の確認によって、ウイルスの生産をモニターした。広範なCPEが確認されたら、3回の凍結融解サイクルにより、ウイルスをAd293細胞から回収した。回収されたライセートを連続希釈してAd293細胞に再感染させ、単プラークを含むウェルを回収することにより、単一ウイルスクローンを選択した。感染により完全なCPEが達成されたら、ウイルス株を増幅するために、Ad293細胞の連続的な感染を実施した。細胞単層における顕著なCPEの観察により、増幅時の生存ウイルスの生産を確認した。
強力なウイルス株が増幅されたら、二重塩化セシウム密度勾配遠心(バンド形成)によってそのウイルスを精製し、NG-603ウイルス株、NG-604ウイルス株、NG-605ウイルス株、およびNG-606ウイルス株を得た。これらの株の力価を、製造業者の取扱説明書に従ったmicoBCAアッセイ(ライフテクノロジーズ社)により測定した(表5)。
NG-601ウイルス、NG-602ウイルス、NG-603ウイルス、NG-604ウイルス、NG-605ウイルス、およびNG-606ウイルスの活性を、下記の方法を用いて特性評価した。
NG-601、NG-602、NG-603、NG-604、NG-605、NG-606、またはEnAdの複製能をA549肺癌細胞の感染によって解析し、qPCRで評価した。A549細胞を2×105細胞/ウェルの細胞密度で24ウェルプレートのウェル内に播種した。プレートを、37℃、5%CO2で18時間インキュベートした後、細胞を100粒子/細胞(ppc)のウイルスに感染させるか、未感染のままとした。感染の24時間後、48時間後、または72時間後にウェル回収を行い、PureLink Genomic DNA Mini Kit(インビトロジェン社)を製造業者のプロトコルに従って用いてDNAを精製した。表6に詳細に記載された反応ミックス中のEnAdヘキソン遺伝子特異的プライマー-プローブセットを使用する、抽出された各試料または標準を用いたqPCRで、全ウイルスゲノムを定量化した。qPCRは表7のプログラムに従って実行した。
NG-601ウイルス、NG-602ウイルス、NG-605ウイルス、NG-606ウイルスが機能的な二重特異性T細胞アクチベーターを生産するかどうかを確認するために、標的細胞としてCHO細胞株、CHO-EpCAM細胞株、およびCHO-FAP細胞株を用いるT細胞活性化アッセイを実施した。10,000個の標的細胞を、培地で100倍希釈されたAd293ウイルス上清と共に、U字底96ウェルプレートのウェル内で、50,000個のCD3+T細胞と共培養し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。細胞を回収し、抗CD25抗体および抗CD69抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで解析した。その結果(図23Aおよび図23B)、NG-601ウイルスおよびNG-602ウイルスが、CHO-EpCAM細胞と共培養された場合にT細胞を活性化する機能的な二重特異性T細胞アクチベーター導入遺伝子を発現し、NG-605およびNG-606が、CHO-FAP細胞と共培養された場合にT細胞を活性化するが、CHO細胞と共培養された場合はT細胞を活性化しない、機能的な二重特異性T細胞アクチベーター導入遺伝子を発現することが示された。
ヒト結腸癌細胞株DLDのNG-601、NG-602、NG-605、NG-606の感染による二重特異性T細胞アクチベーター発現量を評価した。DLD細胞を1.2×106細胞/ウェルの密度で6ウェル培養プレートに播種した。播種の18時間後、DLD細胞を、100ppcのEnAd、NG-601、NG-602、NG-603、NG-604、NG-605、NG-606に感染させた。細胞を72時間培養した後、上清をウェルから回収し、1200rpmで5分間遠心して細胞片を除去した。次に、この清澄化された上清を殺滅アッセイに用いて、細胞傷害性を既知濃度の組み換え二重特異性T細胞アクチベーターを用いて作成された検量線と比較することで、ウイルス上清中の二重特異性T細胞アクチベーターの量の測定を可能にした。
FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターまたは対照二重特異性T細胞アクチベーターをコードしていることに加え、NG-607ウイルス、NG-608ウイルス、NG-609ウイルス、NG-610ウイルスは、蛍光顕微鏡法を用いた感染細胞の可視化のための赤色蛍光タンパク質(RFP)導入遺伝子(配列番号20および配列番号21、表4)も保有している。これらのウイルスの機能活性を、下記の方法を用いて特性評価した。
NG-607ウイルス、NG-608ウイルス、NG-609ウイルス、およびNG-610ウイルスの、自身の二重特異性T細胞アクチベーター導入遺伝子を生産する能力を、Ad293細胞の感染により評価した。Ad293細胞を1×106細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種した。プレートを、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした後、細胞を100ppcのウイルスに感染させるか、未感染のままとした。感染の48時間後、プラークに蛍光水銀ランプを照射し、写真を撮影した(図18)。その結果、NG-607ウイルス、NG-608ウイルス、NG-609ウイルス、およびNG-610ウイルスはRFP導入遺伝子を発現することが示された。
次の一連の実験では、EnAdウイルスおよびFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターウイルスまたは対照二重特異性T細胞アクチベーターウイルスであるNG-603、NG-604、NG-605、NG-606、NG-607、NG-608、NG-609、NG-610の、腫瘍細胞および線維芽細胞を含む標的細胞を殺滅する能力を、評価した。
本実施例では、EnAd、NG-603、NG-604、NG-605、およびNG-606による、がん患者のFAP+初代悪性腹水由来の自家腫瘍関連リンパ球の活性化を評価した。CD3+T細胞およびFAP+細胞を含有する患者試料を、さらなる解析に好適と見なした。
腫瘍溶解性ウイルスは、単一の標的化された自己複製する媒介物の中で、いくつかの治療モダリティを組み合わせる興味深い新たな戦略を提供する(Keller & Bell, 2016; Seymour & Fisher, 2016)。腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞内で選択的に複製し、細胞から細胞へと拡散するため、いくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、死につつある細胞からウイルス粒子を脱出させるプロセスの一部として、非アポトーシス性細胞死経路による細胞死を媒介すると考えられている(Ingemarsdotter et al, 2010; Li et al, 2013)。EnAdは特に、オンコーシス(oncosis)または虚血性細胞死として知られている炎症誘発性プロセスによって細胞を殺滅する(Dyer, 2017)。この非アポトーシス性細胞死機構が、ATP、HMGB1、およびカルレティキュリンの暴露など、いくつかの炎症誘導性細胞成分の放出を引き起こし(損傷関連分子パターン(DAMP)として知られている)(Weerasinghe & Buja, 2012)、効果的な抗がん免疫応答を促進するウイルスの能力にとって極めて重要である可能性がある。しかし、直接的な溶解の影響の他にも、ウイルスは他の抗がん性生物学的製剤をコードおよび発現させるのに有望であり、送達上の課題を取り除いて、確実に、生物学的製剤に腫瘍微小環境内でその最高濃度を達成させる。ImlygicはGM‐CSFをコードしているが、ウイルス武装の可能性は実質的に無限であり、相加的または相乗的な抗がん作用を示す多様式の治療方針を設計する、多くの刺激的な機会を提供する(de Gruijl et al, 2015; Hermiston & Kuhn, 2002)。
患者の悪性滲出液によるヒトT細胞活性化および標的細胞傷害性の免疫抑制
悪性滲出液とは、後期転移性がん患者によく見られる、免疫応答が抑制された、免疫寛容の可能性がある環境を意味する。IL-10は、抗炎症性サイトカインであると考えられているが、Human IL-10 ELISA MAXキット(バイオレジェンド社、430604)を用いて、正常血清または患者悪性滲出液(A、腹腔腹水;P、胸水)中のその含量を測定した。滲出液中のIL-10レベル(88.1~633.4pg/mL)は、正常血清中で測定されたレベル(7.2~10pg/mL)を大きく超えていた。
FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターはT細胞の活性化と、種々のドナーT細胞によるFAP+細胞の殺滅を媒介する
他の実験で、実施例2に記載の方法を用いて、NHDF細胞およびT細胞の共培養において試験された組換えFAP特異的二重特異性T細胞アクチベータータンパク質のT細胞活性化特性のさらなる評価を行い、対照二重特異性T細胞アクチベーター、および抗CD3/CD28 Dynabeadsを用いたポリクローナルT細胞活性化と比較した。
様々ながん(ancer)患者由来の初代悪性腹水試料中の細胞に対するFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターウイルスおよびEnAd-FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターウイルスの作用
実施例16に記載された研究の続きとして、さらなるがん患者由来の新鮮初代悪性腹腔腹水をEnAd FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターウイルス活性の研究用に入手した。EpCAM+腫瘍細胞およびFAP+線維芽細胞の両方を含有する3つの患者試料をエキソビボで増殖させ、その混合(接着)細胞集団を、PBMC由来T細胞と、未改変または二重特異性T細胞アクチベーター発現型のEnAdウイルスと共に培養した。72時間後、全細胞を回収し、FAP+細胞(図38A)およびEpCAM+細胞(図38B)の数をフローサイトメトリーで測定した。さらに、T細胞の(CD25発現による)活性化状態を測定した(図38C)。EnAd-CMV-FAP二重特異性T細胞アクチベーター感染およびEnAd-SA-FAP二重特異性T細胞アクチベーター感染の両方が、全ての患者試料において、T細胞活性化およびFAP+細胞枯渇を誘導し、EpCAM+腫瘍細胞のレベルには有意な変化を生じなかった。親EnAdまたは対照ウイルスは観察可能なT細胞活性化を誘導せず、FAP+細胞数は未感染対照と同様の数を維持した。
EnAd-FAP二重特異性T細胞アクチベーターを介した腫瘍崩壊およびT細胞刺激は、患者腹水中のCD11b+TAMを、より活性型の表現型へと極性化させる
FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターを介したT細胞の活性化と、その後のFAP+線維芽細胞の除去(および付随するTGFβ1の減少)による、IFNγ、TNFα、およびIL-2を含むTh1サイトカインの産生が、腫瘍微小環境における、免疫抑制性且つ発癌促進性から抗腫瘍活性へと向けた他の変化と関連しているかどうかを調べるため、未分離の腹水細胞試料中の腫瘍関連マクロファージ(TAM)に対する影響を評価した。未純化の全患者腹水細胞を50%腹水に播種し、遊離型の対照二重特異性T細胞アクチベーターもしくはFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターで処理するか、またはEnAd-SA-対照二重特異性T細胞アクチベーターウイルスもしくはEnAd-SA-FAP二重特異性T細胞アクチベーターウイルス(100vp/細胞)に感染させた。並行して、一部の細胞をIFNγで処理して、活性化型のCD11b骨髄性細胞表現型を誘導した。3日のインキュベーションの後、T細胞の活性化状態を測定してから;フローサイトメトリーによるCD25+細胞の測定およびELISAによるIFNγ分泌の測定を行った。
EnAd-FAP二重特異性T細胞アクチベーターはエキソビボの固形前立腺腫瘍生検において腫瘍浸潤性リンパ球を活性化し細胞傷害性を誘導する
組織スライスの培養物は、多様な組織、臓器、および腫瘍の最も現実的な前臨床モデルの1つを提供する。この臨床的にかなりの意義がある状況でFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター発現ウイルスの活性を評価するために、切除されたヒト前立腺から得られた悪性前立腺組織および良性前立腺組織のパンチ生検対をいくつか調べた。最初のスクリーニングでは、前立腺組織が、再現性よく、円環状のEpCAM+腫瘍細胞(図44A)を、CD8 T細胞(図44B)が散らばった大きな間質領域の中に、散在させていることが示された。FAPの染色は腫瘍領域と隣接した線維芽細胞上に見られた(図44C)。
1つの二重特異性T細胞アクチベーターをコードする5種のウイルス(NG-611、NG-612、NG-613、NG-614、NG-617)を作製した(表8)。
プラスミドpEnAd2.4を用いて、合成された導入遺伝子カセット(それぞれ、配列番号70~74)を直接挿入することで、プラスミドpNG-611、pNG-612、pNG-613、pNG-614、およびpNG-617を作製した。pNG-612、pNG-613、およびpNG-617導入遺伝子カセットは、配列番号75のFAP標的二重特異性T細胞アクチベーターをコードしており、pNG-614導入遺伝子カセットは、配列番号76のFAP標的二重特異性T細胞アクチベーターをコードしている。導入遺伝子カセットの模式図を図45A~図45Cに示す。制限酵素分析およびDNAシーケンスによりプラスミドDNAの構築を確認した。
1ppcのNG-611、NG-612、NG-617、Enadenotucirevに72時間感染させた、または未感染のままの、A549細胞をqPCRによるウイルスDNAの定量化に用いた。細胞上清を回収し、1200rpmで5分間遠心することにより清澄化した。キアゲン社製DNeasyキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、45μLの上清からDNAを抽出した。Enadenotucirevウイルス粒子(2.5×1010~2.5×105個のウイルス粒子)を用いた検量線も作成し、DNeasyキットを用いて抽出を行った。抽出された試料または標準のそれぞれを、初期遺伝子E3に対するウイルス遺伝子特異的プライマー/プローブセットを用いるqPCRで解析した。
癌細胞感染
A549細胞を2.5×105細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播種した。プレートを、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、細胞を1ppcのNG-611、NG-612、Enadenotucirevに感染させるか、未感染のままとした。感染の24時間後、48時間後、または72時間後に、この細胞から上清を回収し、1200rpmで5分間遠心して清澄化し、急速凍結した。
FAPを発現する肺線維芽細胞株MRC-5、またはEpCamを発現する卵巣癌細胞SKOV3を、それぞれ5.7×104細胞/ウェルおよび1.2×105細胞/ウェルの密度で48ウェルプレートに播種した。プレートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、150μL/ウェルの、A549プレートから回収した解凍上清で培地を交換した。次に、ヒトPBMCドナーから単離した純化CD3 T細胞もプレートに加え、T細胞とMRC-5またはSKOV3の比を2:1とした。この共培養物を37℃、5%CO2で16時間インキュベートした後、ELISA分析用に細胞上清を回収し、フローサイトメトリー分析用にT細胞を回収した。非接着細胞を含有する培地を共培養ウェルから取り出し、遠心した(300×g)。上澄みを慎重に取り出し、5%BSA含有PBSで2倍希釈し、ELISA分析用に保存した。接着細胞単層をPBSで1回洗浄した後、トリプシンを用いて剥がした。10%FBS RPMI培地を用いてトリプシンを失活させ、この細胞を培養上清から回収していた細胞ペレットに加えた。細胞を遠心し(300×g)、上澄みを捨て、細胞ペレットを200μLのPBSで洗浄した。細胞をもう一度遠心した後、Live/Dead Aqua(ライフ・テクノロジーズ社(Life tech))を含有する50μLのPBSに室温で15分間再懸濁した。細胞をFACS用緩衝液で1回洗浄した後、以下の直接結合型の抗体パネルで染色した:AF700結合型抗CD3、BV421結合型抗CD25、PE/CY5結合型抗HLA-DR、BV605結合型抗CD40L、PE結合型抗CD69、およびFITC結合型抗CD107a。また、各共培養条件の細胞試料を、関連アイソタイプ対照抗体で染色した。染色は全て、総体積50μL/ウェルのFACS用緩衝液中、4℃で15分間実行した。次に、細胞をFACS用緩衝液(200μL)で2回洗浄した後、200μLのFACS用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー(Attune)による分析にかけた。
T細胞活性化のフローサイトメトリー分析では、単一生細胞上の、T細胞活性化マーカーのCD25、CD69、HLA-DR、およびCD40L、またはT細胞脱顆粒マーカーのCD107aの発現による評価を行った。これらのデータからは、EpCam+ SKOV3細胞との共培養下で、CD25、CD69、HLA-DR、CD40L、または細胞表面CD107aを発現するT細胞の数は、細胞にNG-611上清が添加された場合に、NG-612上清、Enadenotucirev上清、または無処理対照上清が添加された場合と比較して、顕著に増加することが示された(図47)。これら全てのマーカーにおいて、感染24時間後のA549細胞の上清はT細胞活性化をほとんど惹起しなかったが、感染48時間後の上清は全てのマーカーにおいて顕著なT細胞活性化を惹起した。感染後72時間にもこれが当てはまった。
CD34+造血幹細胞ヒト化NSGマウス(ジャクソン研究所から入手)に、移植の18週間後に、HCT116腫瘍細胞を両側腹部に皮下移植した。腫瘍が80~400mm3に達したら、各処置群の腫瘍体積分布が同等となるようにマウスをグループ化し、1群あたり7匹のマウスとした。マウスの腫瘍内に、生理食塩水、Enadenotucirev、またはNG-611を5×109粒子/注射で注射し、1腫瘍につき2回の注射を行った。両側腹部の腫瘍に処置を行った。腫瘍体積を週に3~4回測定したところ、Enadenotucirevまたは無処置対照と比較して、NG-611処置が投与の20日後まで顕著な抗腫瘍応答をもたらすことが示された(図51a)。投与の20日後、各群4匹のマウスから、一方の腫瘍をフローサイトメトリー用に処理し、残りの腫瘍はドライアイス上で凍結した。
腫瘍試料を、摘出直後に少量のRPMI培地中で機械的にばらばらにした。次に、ばらばらにした腫瘍を70μmセルストレーナーに通し、300gで10分間遠心した。細胞ペレットを、Live/Dead Aqua(ライフ・テクノロジーズ社)を含有する100μLのPBSに氷上で15分間再懸濁した。細胞をFACS用緩衝液(5%BSA/PBS)で1回洗浄した後、以下の直接結合型の抗体パネルで染色した:抗CD8(RPA-T8、AF700);抗CD4(RPA-T4、PE);抗CD45(2D1、APC-Fire750);抗CD3(OKT3、PerCP-Cy5.5);抗CD25(M-A251、PE-Dazzle594);抗CD69(FN50、APC);抗HLA-DR(L243、BV605);抗CD107a(H4A3、FITC)。また、浮遊腫瘍細胞プールを関連アイソタイプ対照抗体で染色した。染色は全て、総体積50μL/ウェルのFACS用緩衝液中、4℃で20分間実行した。細胞をFACS用緩衝液(200μL)で3回洗浄した後、200μLのFACS用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー(Attune)による分析にかけた。FACS解析では、腫瘍内のCD4 T細胞に対するCD8 T細胞の比率が、Enadenotucirev処置または無処置対照と比較して、NG-611処置腫瘍において、顕著に増加することが示された(図51b)。
FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターおよび免疫調節性タンパク質をコードする、3種のウイルス(NG-615、NG-640、およびNG-641)を作製した(表9)。
プラスミドpEnAd2.4を用いて、合成された導入遺伝子カセット(それぞれ、配列番号93~95)を直接挿入することで、プラスミドpNG-615、pNG-616、pNG-640、およびpNG-641を作製した。NG-615およびNG-616は、FAPを標的とする二重特異性T細胞アクチベーター(配列番号75)、Flt3L(配列番号96)、MIP1α(配列番号97)、およびIFNα(配列番号98)をコードする4種類の導入遺伝子を含有する。NG-640およびNG-641はFAPを標的とする二重特異性T細胞アクチベーター(配列番号75)、CXCL9(配列番号99)、およびCXCL10(配列番号100)をコードし、NG-641はIFNαをコードする4つ目の導入遺伝子(配列番号98)も含有する。プラスミドDNAの構築を制限酵素的分析およびDNAシーケンスで確認した。
癌細胞感染
1ppcのNG-615、Enadenotucirevに72時間感染させた、または未感染のままの、A549細胞を、qPCRによるウイルスDNAの定量化、およびELISAによる導入遺伝子発現の分析に用いた。細胞上清を回収し、1200rpmで5分間遠心することにより清澄化した。45μLの上澄みをDNA解析に用いて、残りの上澄みはELISAに用いた。
キアゲン社製DNeasyキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、この上清試料からDNAを抽出した。Enadenotucirevウイルス粒子(2.5×1010~2.5×105個のウイルス粒子)を用いた検量線も作成し、DNeasyキットを用いて抽出を行った。抽出された試料または標準のそれぞれを、初期遺伝子E3に対するウイルス遺伝子特異的プライマー/プローブセットを用いるqPCRで解析した。1細胞当たりに検出されたウイルスゲノムの数の定量化によって、NG-615が、A549細胞株において、親ウイルスEnadenotucirevと同レベルの顕著なゲノム複製を示すことが明らかになった(図52)。これらのデータから、二重特異性T細胞アクチベーターおよび3種の免疫調節性導入遺伝子の使用はウイルスの複製活性に有意な影響を与えないことが示された。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出できなかった。
IFNα ELISAはVerikine Human IFN alpha Kit(PBL・アッセイ・サイエンス社)を用いて実施し、MIP1α ELISAはHuman CCL3 Quantikine ELISA kit(R&Dシステムズ社)を用いて実施し、Flt3L ELISAはFlt3L human ELISA kit(アブカム社)を用いて実施した。アッセイは全て、製造業者のプロトコルに従って実施した。
癌細胞感染
A549細胞を2.5×105細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播種した。プレートを、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、細胞を1ppcのNG-612、NG-615、Enadenotucirevに感染させるか、未感染のままとした。感染の24時間後、48時間後、または72時間後に、この細胞から上清を回収し、1200rpmで5分間遠心して清澄化し、急速凍結した。
FAP発現肺線維芽細胞株のMRC-5を5.7×104細胞/ウェルの密度で48ウェルプレートに播種した。プレートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、150μL/ウェルの、A549プレートから回収した解凍上清で培地を交換した。次に、ヒトPBMCドナーから単離した純化CD3 T細胞もプレートに加え、T細胞とMRC-5の比を2:1とした。この共培養物を37℃、5%CO2で16時間インキュベートした後、実施例29に詳述した方法に従って、ELISA分析用に細胞上清を回収し、フローサイトメトリー分析用にT細胞を回収した。
T細胞活性化のフローサイトメトリー分析では、CD3+単一生細胞上の、T細胞活性化マーカーのCD25、CD69、HLA-DR、およびCD40L、またはT細胞脱顆粒マーカーのCD107aの発現による評価を行った。これらのデータからは、FAP+MRC-5細胞との共培養下で、CD25、CD69、HLA-DR、CD40L、またはCD107aを発現するT細胞の数は、細胞にNG-615上清またはNG-612上清が添加された場合に、Enadenotucirev上清、または無処理対照上清が添加された場合と比較して、顕著に増加することが示された(図54)。
IFNγ発現の検出のために、共培養上清を、アッセイ用緩衝液の5%BSA/PBSで希釈し(1:10~1:1000の範囲)、Human IFN gamma Quantikine kit(R&Dシステムズ社)を製造業者のプロトコルに従って用いてELISAを実施した。分泌されたIFNγの濃度を、検量線からの内挿によって求めた。IFNγの発現は、NG-612感染またはNG-615感染A549上清を用いた共培養物の上清中にのみ検出できた(図55)。
CAGGCCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCTTGTTCCTGGTCGCAACTGCTACCGGAGTCCATTCGGACATCGTCATGACCCAAAGCCCTGACTCGCTCGCTGTGTCACTGGGAGAGCGGGCGACTATCAACTGCAAATCATCCCAGAGCCTGCTGTATTCACGCAATCAGAAAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCGGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTTCTGGGCCTCCACCCGCGAAAGCGGCGTGCCGGACCGCTTCAGCGGAAGCGGATTCGGAACTGACTTTACTCTGACCATTAGCTCCTTGCAGGCGGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTATTTCTCCTATCCGCTCACCTTTGGGCAAGGCACCAAGGTGGAGATTAAGGGAGGGGGCGGCAGCGGGGGAGGCGGCAGCGGCGGCGGGGGATCGCAGGTCCAGCTCGTCCAATCCGGAGCCGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCGTCGGTCAAGGTCAGCTGCAAAACTTCGCGCTACACCTTCACTGAGTACACGATCCACTGGGTCCGCCAGGCGCCCGGCCAGCGGCTGGAGTGGATCGGCGGGATCAACCCAAACAACGGAATCCCAAATTACAATCAGAAATTTAAAGGGCGGGTGACTATCACCGTGGATACCTCGGCCTCCACGGCGTACATGGAGCTCTCATCACTCAGATCGGAGGACACCGCGGTCTATTACTGCGCCCGCCGCCGGATCGCTTATGGATACGATGAAGGACATGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACGGTGTCGTCAGGAGGCGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTAATCAAACTGCCATTCTGATTTGCTGCCTTATCTTTCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCTCTCTCTAGAACTGTACGCTGTACCTGCATCAGCATTAGTAATCAACCTGTTAATCCAAGGTCTTTAGAAAAACTTGAAATTATTCCTGCAAGCCAATTTTGTCCACGTGTTGAGATCATTGCTACAATGAAAAAGAAGGGTGAGAAGAGATGTCTGAATCCAGAATCGAAGGCCATCAAGAATTTACTGAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGTCTAAAAGATCTCCTGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTAAGAAAAGTGGTGTTCTTTTCCTCTTGGGCATCATCTTGCTGGTTCTGATTGGAGTGCAAGGAACCCCAGTAGTGAGAAAGGGTCGCTGTTCCTGCATCAGCACCAACCAAGGGACTATCCACCTACAATCCTTGAAAGACCTTAAACAATTTGCCCCAAGCCCTTCCTGCGAGAAAATTGAAATCATTGCTACACTGAAGAATGGAGTTCAAACATGTCTAAACCCAGATTCAGCAGATGTGAAGGAACTGATTAAAAAGTGGGAGAAACAGGTCAGCCAAAAGAAAAAGCAAAAGAATGGGAAAAAACATCAAAAAAAGAAAGTTCTGAAAGTTCGAAAATCTCAACGTTCTCGTCAAAAGAAGACTACAGGAAGCGGACAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCTGGACCTGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATAAGCTAGCTTGACTGACTGAGATACAGCGTACCTTCAGCTCACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAGTCGTCAGCTAT
Claims (19)
- 式(I)の配列を含むアデノウイルスであって、
5’ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR(I)
式中、
B1は結合であるか、E1A、E1BまたはE1A-E1Bを含み;
BAは-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4を含み;
B2は結合であるか、E3を含み;
BXは結合であるか、制限酵素認識部位、1もしくは複数の導入遺伝子、またはその両方を含むDNA配列であり;
BBはL5を含み;
BYは、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター、CXCL10、CXCL9、およびIFNαをそれぞれコードする4つの導入遺伝子を含有する導入遺伝子カセットを含み;
B3は結合であるか、E4を含む、
前記アデノウイルス。 - 前記コードされたFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号5、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号5など)、に示される抗CD3結合領域を含む、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号9、またはそれ対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号9など)、に示される抗FAP結合領域を含む、請求項1または請求項2に記載のアデノウイルス。
- 前記コードされたFAP特異的二重特異性T細胞アクチベーターが、配列番号75、配列番号76、またはそのうちのいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する配列、から選択される配列を含む、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記CXCL10の配列が、配列番号100、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号100など)、に示される、請求項1~4のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 前記CXCL9の配列が、配列番号99、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列(配列番号99など)、に示される、請求項1~5のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 前記IFNαの配列が、配列番号98、またはそれに対して少なくとも95%の同一性を有する配列に示される、請求項1~6のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 各前記導入遺伝子が機能的に連結されている、請求項1~7のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 各前記導入遺伝子が3つの異なる高効率自己開裂型ペプチドで隔てられている、請求項1~8のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 前記各自己開裂型ペプチドが独立してE2A、F2A、P2A、およびT2Aから選択される、請求項9に記載のアデノウイルス。
- L5からE4までの各前記導入遺伝子の相対的順序が、FAP特異的二重特異性T細胞アクチベーター、CXCL10、CXCL9、およびIFNαである、請求項1~10のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 前記導入遺伝子カセットが、配列番号95に示されるポリヌクレオチド配列、または配列番号95に示されるポリヌクレオチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する、請求項1~11のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 配列番号84を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 複製適格性である、請求項1~13のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 腫瘍溶解性である、請求項1~14のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- Ad11由来のヘキソンおよびファイバーを有する、請求項1~15のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
- 請求項1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルス、および賦形剤、希釈剤、または担体、を含む医薬組成物。
- 請求項1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または請求項17に記載の医薬組成物を含む治療剤。
- 請求項1~16のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは請求項17に記載の医薬組成物を含むがん治療剤。
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