ES2286902T3 - Vector recombinante que expresa multiples moleculas coestimulantes y aplicaciones de las mismas. - Google Patents

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Abstract

Vector recombinante que comprende las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes distintas, una de la familia B7 que comprende la B7-1 y la B7-2 u homólogos humanos o una parte funcional de las mismas, y dos seleccionadas de entre el grupo que comprende: ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, OX-40L, VCAM-1 u homólogos humanos o partes funcionales de las mismas.

Description

Vector recombinante que expresa múltiples moléculas coestimulantes y aplicaciones de las mismas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes y opcionalmente un gen exógeno que codifica un antígeno seleccionado. La presente invención se refiere también a un virus recombinante que comprende genes exógenos que codifican por lo menos tres moléculas coestimulantes y opcionalmente un gen que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo. Más específicamente, la presente invención se refiere a un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos que codifican por lo menos las moléculas coestimulantes: una molécula de la familia B7, LFA-3 e ICAM-I, y opcionalmente un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo y las aplicaciones de los mismos como antígenos y vacunas. La presente invención se refiere, además, a células que presentan un antígeno y que se han sometido a transfección, infección o transducción mediante un vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes y opcionalmente un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Antecedentes de la invención
El alcance de la respuesta primaria de los linfocitos T, que implica su activación, expansión y diferenciación, es esencialmente una respuesta inmunitaria satisfactoria a un antígeno. La iniciación de una respuesta inmunitaria requiere por lo menos dos señales para la activación de los linfocitos T indiferenciados por parte de células que presentan antígenos (APC) (1-5). La primera señal es específica del antígeno, se transmite a través de los receptores de los linfocitos T mediante el péptido/complejo principal de histocompatibilidad, y provoca que el linfocito T inicie el ciclo celular. La segunda señal, o "coestimulante", se requiere en la producción y proliferación de citocinas. Se ha propuesto que por lo menos tres moléculas distintas que se encuentran habitualmente en la superficie de las APC clínicas pueden provocar la segunda señal crítica en la activación de las células T: B7.1 (CD80), la molécula 1 de adherencia intercelular (ICAM-1; CD54), el antígeno 3 asociado al funcionamiento de los leucocitos (LFA-3; CD58 humano; CD48 murino) (2, 6, 7). Los ligandos de los linfocitos T para dichas moléculas coestimulantes son distintos. El B7-1 interactúa con las moléculas CD28 y CTLA-4, el ICAM-1 interactúa con el complejo CD11a/CD18 (LFA-1/integrina \Box2), y el LFA-3 interactúa con las moléculas CD2 (LFA-2). Se desconoce si dichas moléculas coestimulantes realizan unas funciones equivalentes o llevan a cabo funciones especializadas en etapas específicas de una respuesta inmunitaria provocada (2). Se ha demostrado que dichas moléculas individualmente coestimulan la multiplicación de los linfocitos T in vitro (6). Sin embargo, debido a que se pueden expresar simultáneamente en las APC, ha resultado difícil examinar la potencia relativa de las moléculas coestimulantes individuales durante la provocación de la multiplicación de los linfocitos T (2).
Debido a que se ha propuesto que tanto el antígeno como las moléculas coestimulantes se han de expresar próximas entre sí para coactivar adecuadamente las células T y los receptores coestimulantes (8,9), se podría utilizar una mezcla de diversos virus recombinantes para explorar la cooperación potencial entre las moléculas coestimulantes. La desventaja de dicho enfoque, sin embargo, consiste en que la mezcla de tres o más virus presentan una probabilidad estadísticamente disminuida de coinfectar la misma célula, haciendo que resulte mucho más aconsejable un constructo multigénico para utilizarlo con tres genes moleculares coestimulantes.
El documento WO 91/02805, publicado el 7 de marzo de 1991, da a conocer un constructo de un vector de un retrovirus recombinante que dirige la expresión de un antígeno seleccionado, una proteína MHC (complejo principal de histocompatibilidad) y otras proteínas implicadas en interacciones inmunitarias ausentes o que se encuentran insuficientemente representadas en un dianocito.
Akagi, et al., 1997, J. Immunotherapy Vol. 20 (1): 38-47 dan a conocer una mezcla de virus recombinantes de la variolovacuna que comprenden un gen MUC1 modificado (rV-MUC1), y un virus recombinante de la variolovacuna que comprende el gen de la molécula coestimulante murina B7 (rv-B7).
Cavallo, P. et al., 1995, Eur. J. Immunol., 25: 1154-1162 dan a conocer que la transfección del ADNc del B7-1 en tres estirpes celulares tumorales ICAM-1^{+} resulta suficiente para provocar el rechazo en ratones singénicos.
Chen, L. et al., 1994, J. Exp. Med., 179:523-532 dan a conocer un vector de un virus recombinante que comprende ADNc del B7 murino y la utilización del vector en la transducción de diversos tumores.
Damle, N. K. et al., 1992, J. Immunol. Vol. 148 (nº 7): 1985-1992 dan a conocer la utilización de un sistema de cultivo in vitro independiente de células que presentan antígenos (APC) que comprende combinaciones inmovilizadas de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el complejo TRC/CD3 y quimeras solubles de Ig (RG) de cuatro moléculas distintas coestimulantes asociadas a las APC par comparar la capacidad de dichas moléculas para coestimular la multiplicación de los linfocitos T.
Dubey, C. et al. 1995, J. Immunol. 155: 45-57 dan a conocer un estudio de la contribución de las rutas coestimulantes ICAM-1: LFA-1 y B7: CD28/CTLA-4 en la activación de linfocitos T indiferenciados, utilizando tanto anticuerpos anti-CD28 como estirpes celulares de fibroblastos a los que se ha realizado una transfección con I-E^{k}, que expresa moléculas no coestimulantes, ICAM-1 solo, B7-1 solo o ICAM-1 y B7-1 juntos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Fenton, R. G. et al., 1998 Vol. 21, nº 2, pág. 95-108, dan a conocer la transfección del gen de la molécula coestimulante B7-1 en tres estirpes celulares de melanoma humano que expresan el HLA-A2, y su capacidad para estimular los linfocitos T primarios humanos. Las tres estirpes de melanoma expresaron asimismo niveles detectables de las moléculas coestimulantes ICAM-1 (CD54) y LFA-3 (CD58).
Gjorloff Wingren, A. et al., 1995, Critical Reviews in Immunol. 15 (3 & 4): 235-253 dan a conocer que con la transfección de HLA-DR, B7 y LFA-3 en células CHO, dichas moléculas cooperan en la activación tanto de los linfocitos T indiferenciados como de los linfocitos T de memoria y permiten respuestas a concentraciones picomolares del antígeno, la enterotoxina estafilocócica B (SEB).
Goldbach-Mansky, R. et al., 1992, International Immunol. 4 (nº 12): 1351-1360 dan a conocer que los linfocitos T CD4^{+} responden a la enterotoxina estafilocócica B (SEB) en presencia de la estirpe celular eritroleucémica K562 positiva al LFA-3, ICAM-1 y B7, de células L murinas, y de células L humanas transinfectadas con B7.
Hodge, J. W. et al., 1994, Cancer Research 54: 5552-5555 dan a conocer la construcción y la caracterización de virus de la variolovacuna recombinantes que comprenden los genes murinos B7.1 y B7.2.
Hodge, J. W. et al., 1995, Cancer Research 55: 3598-3603, Cancer Research 55: 3598-3603 dan a conocer una mezcla de variolovacuna recombinante murina B7.1 (rV-B7) y variolovacuna recombinante que expresa el gen del antígeno carcinoembrionario humano (rV-CEA) y la utilización de dicha mezcla para la actividad antitumoral.
Parra, et al., 1993, Scand. J. Immunol., 38: 508-514, Parra, E. et al., 1994, J. Immunol., 153: 2479-2487, y Parra, et al., 1997, J. Immunol., 458: 637-642 dan a conocer células CHO transinfectadas con la molécula HLA-DR4 humana (CHO-DR4); genes HLA-DR4 y B7 (CHO-DR4/B7), HLA-DR4 y LFA-3 (CHO-DR4/LFA3); HLA-DR4 y ICAM-1 (CHO-DR4/ICAM-1); o DR4, B7 y LFA-3 (CHO-DR4B7/LFA-3).
Thomas, R. et al., 1993 J. Immunol. 151: 6840-6852 dan a conocer que células dendríticas (DC) recién obtenidas expresan unas densidades similares de HLA-DR y de las moléculas secundarias LFA-3, ICAM-1 y B7 como monocitos.
Uzendoski, K. et al., mayo de 1997, Human Gene Therapy 8:851-860 dan a conocer la construcción, caracterización y consecuencias inmunitarias de un virus de la variolovacuna recombinante que expresa la molécula coestimulante murina ICAM-1.
El documento WO 96/10419, publicado el 11 de abril de 1996, de PCT/US95/12624 se refiere a un único vector vírico recombinante que ha incorporado uno o más genes o parte de los mismos que codifican una molécula inmunoestimulante y uno o más genes o parte de los mismos que codifican un antígeno de un estado patológico.
Robinson et al., en la patente US nº 5.738.852 dan a conocer un vector retrovírico que comprende una secuencia polinucleótida que codifica un antígeno seleccionado de un agente infeccioso y una secuencia polinucleótida que codifica una molécula B7 coestimulante.
La presente invención es un vector que comprende ADN exógeno que codifica por lo menos tres moléculas coestimulantes, independientes o en combinación con ADN exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo que permite la expresión funcional de cada ADN exógeno en una célula anfitriona infectada.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un vector recombinante que comprende genes exógenos o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes. Los genes de la presente invención o las partes funcionales de los mismos que codifican moléculas coestimulantes que resultan útiles comprenden, pero sin limitarse a las mismas, un elemento de la familia B7, las moléculas ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L, partes funcionales y homólogos humanos de las mismas. El vector de la presente invención puede comprender, además, un gen exógeno que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo en combinación con los genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes. El gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo se puede obtener a partir de células, tejidos u organismos tales como virus, bacterias, protozoos, parásitos, levaduras, células tumorales, células preneoplásicas, células hiperplásicas, células de tejidos específicos, o antígenos sintéticos. El vector puede proporcionar, además, un gen exógeno que codifique por lo menos una o una combinación de citocinas, quimiocinas, y Flt-3L.
El vector recombinante para utilizar en la presente invención comprende vectores bacterianos, vectores víricos, vectores basados en ácidos nucleicos y similares. Los vectores víricos recombinantes comprenden, pero no se limitan a los mismos, los poxvirus, los adenovirus, los virus del herpes, los alfavirus, los retrovirus, los picornavirus, los iridovirus y similares. Los poxvirus comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los virus de la familia orthopox, la viruela aviar, la viruela porcina y la viruela de las cabras y de las ovejas.
La presente invención proporciona un virus recombinante que comprende genes exógenos o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes para proporcionar una mayor respuesta inmunitaria para un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo que es superior a la respuesta que proporciona un virus recombinante que comprende un gen o genes exógenos que codifican moléculas coestimulantes dobles o simples. El virus recombinante de la presente invención puede proporcionar además un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo en combinación con los genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes. El virus recombinante puede proporcionar un gen exógeno que codifique otras clases de moléculas inmunoestimulantes tales como las citocinas que comprenden, sin limitarse a las mismas, las IL-2, IL-12, GM-CSF y similares, quimiocinas tales como las MIP1, MIP2, RANTES y similares y la Flt-3L que estimula la multiplicación de las DC.
La presente invención proporciona, además, un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes para proporcionar una mayor respuesta inmunitaria para un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo que es superior a la respuesta que proporciona un poxvirus recombinante que comprende un gen o genes exógenos que codifican moléculas coestimulantes dobles o simples. El poxvirus recombinante de la presente invención puede proporcionar un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo en combinación con los genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes.
La presente invención proporciona también un poxvirus recombinante que comprende una secuencia en su ácido nucleico que codifica y expresa tres moléculas coestimulantes y dicha secuencia del ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de la familia B7 de moléculas coestimulantes, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula coestimulante ICAM-1, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula coestimulante LFA-3. El virus recombinante proporciona, además, múltiples activadores de los poxvirus que regulan la expresión de cada uno de los genes exógenos.
La presente invención proporciona un virus recombinante producido al realizar la recombinación de un vector plasmídico, que comprende ADN exógeno que codifica las moléculas coestimulantes, con un genoma vírico original para producir un virus recombinante que presenta en su genoma el ADN exógeno insertado. El virus recombinante producido por recombinación puede comprender, además, un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo proporcionado por el vector plasmídico.
La presente invención proporciona, además, un poxvirus recombinante producido al realizar la recombinación de un vector plasmídico, que comprende ADN exógeno que codifica las moléculas coestimulantes LFA-3, ICAM-1 y por lo menos una molécula de la familia B7, con un genoma poxvírico original para producir un poxvirus recombinante que presenta insertado en su genoma el ADN exógeno y múltiples activadores poxvíricos que pueden controlar la expresión del ADN exógeno. Los poxvirus recombinantes producidos por recombinación pueden comprender, además, un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo proporcionado por el vector plasmídico.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un antígeno para aumentar las respuestas inmunitarias contra dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos que comprende un vector recombinante que presenta secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes. El vector puede comprender, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica tres moléculas coestimulantes. El vector puede comprender, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un antígeno para aumentar las respuestas inmunitarias contra dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos que comprende un vector vírico recombinante que presenta secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes. El vector vírico puede comprender, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica tres moléculas coestimulantes. El vector vírico puede comprender, además, secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican por lo menos uno o más antígenos seleccionado o epítopos inmunitarios de los mismos.
Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un antígeno para aumentar las respuestas inmunitarias contra dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos que comprende un vector poxvírico recombinante que presenta secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican las moléculas coestimulantes LFA-3, ICAM-1 y una molécula de la familia B7 y una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
El vector de la presente invención proporciona una vacuna destinada a provoca y aumentar las respuestas inmunitarias contra dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos para la protección y/o tratamiento de estados patológicos. La vacuna que contiene el vector comprende secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes. La vacuna que contiene el vector puede comprender también secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos para producir una vacuna monovalente o polivalente contra una patología.
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La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vector que comprende secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes y un excipiente farmacéuticamente aceptable. El vector puede comprender además una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. El vector puede comprender asimismo una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique una citocina, quimiocina, Ftl-3L o una combinación de las mismas.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector vírico que comprende genes exógenos o partes funcionales de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes, un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes y un excipiente farmacéuticamente aceptable. El poxvirus recombinante puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico exógeno que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes y que puede comprender, además un gen exógeno o parte del mismo que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable o epítopo inmunitario del mismo.
La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende un primer vector que comprende genes exógenos o partes funcionales de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes y un segundo vector que comprende genes exógenos que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable o epítopo inmunitario del mismo.
La presente invención células anfitrionas sometidas a infección, transfección o transducción con un primer vector que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes y provocan la expresión de tres moléculas coestimulantes en las células anfitrionas. El primer vector o el segundo vector pueden proporcionar, además, un gen exógeno que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo para la célula anfitriona.
La presente invención proporciona células que presentan antígenos (APC) o células tumorales sometidas a infección, transfección o transducción con un primer vector que comprende genes exógenos o genes proporcionados por vía exógena que codifican tres moléculas coestimulantes y provocan la expresión o la hiperexpresión de tres moléculas coestimulantes en las células anfitrionas. El primer vector o el segundo vector pueden proporcionar, además, un gen exógeno que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo para la célula anfitriona.
La presente invención proporciona, además, células anfitrionas infectadas con un poxvirus recombinante que provoca la expresión de tres moléculas coestimulantes y, opcionalmente, provoca la expresión de un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Otro aspecto de la presente invención es una célula dendrítica (DC) y una precursora de la misma que se ha sometido a infección, transfección o ingeniería genética para hiperexpresar genes que codifican tres moléculas exógenas coestimulantes. Las DC y las precursoras de las mismas se pueden, además, genomanipular para expresar genes exógenos que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Otro aspecto adicional de la presente invención es una DC y precursoras de la misma genomanipuladas para hiperexpresar genes que codifican tres moléculas exógenas coestimulantes. Las DC y las precursoras de las mismas se pueden, además, genomanipular para expresar genes exógenos que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
La presente invención proporciona además una DC y precursoras de la misma genomanipuladas para hiperexpresar genes que codifican una molécula B7, ICAM-1 y LFA-3. Las DC y las precursoras de las mismas se pueden, además, genomanipular para expresar genes exógenos que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
La presente invención proporciona procedimientos y un vector plasmídico para la recombinación con un virus original diseñados para producir un virus recombinante que pueda expresar secuencias exógenas de ácido nucleico que codifiquen tres moléculas coestimulantes que comprenden (a) una pluralidad de activadores víricos, (b) las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican las tres moléculas coestimulantes, (c) secuencias de ADN flanqueadoras de los constructos de los elementos (a) y (b), siendo las secuencias flanqueadoras tanto del extremo 5' como del extremo 3' homólogas a una región del genoma vírico original en la que se insertarán los elementos (a) y (b). El vector plasmídico puede proporcionar, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. El vector plasmídico puede proporcionar también un gen que codifique un marcador elegible.
La presente invención proporciona procedimientos y un vector plasmídico para la recombinación con un poxvirus original diseñados para producir un poxvirus recombinante que pueda expresar secuencias exógenas de ácido nucleico que codifiquen las moléculas coestimulantes LFA-3, ICAM-1 y una molécula B7 que comprenden (a) una pluralidad de activadores víricos, (b) las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican las moléculas LFA-3, ICAM-1 y una molécula B7, (c) secuencias de ADN flanqueadoras de los constructos de los elementos (a) y (b), siendo las secuencias flanqueadoras tanto del extremo 5' como del extremo 3' homólogas a una región del genoma poxvírico original en la que se insertarán los elementos (a) y (b). El vector plasmídico puede proporcionar, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. El vector plasmídico puede proporcionar también un gen que codifique un marcador elegible.
Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para aumentar las respuestas inmunitarias de un mamífero contra por lo menos un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo que comprende la administración de un primer vector que comprende secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes, cada una de las moléculas coestimulantes expresadas en las células del mamífero en una cantidad eficaz para aumentar por lo menos una respuesta inmunitaria del mamífero. Los genes o las partes funcionales de los mismos que codifican las moléculas coestimulantes que resultan útiles en la presente invención comprende, pero sin limitarse a las mismas, un elemento de la familia B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L y homólogos y partes de las mismas. En el procedimiento se puede proporcionar, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo mediante el primer vector o el segundo vector.
Además de los genes o partes de los mismos que codifican tres moléculas coestimulantes, se puede proporcionar también una secuencia exógena de ácido nucleico o partes funcionales de la misma que codifique por lo menos una o una combinación de otras clases de moléculas inmunoestimulantes mediante el primer vector, mediante el segundo vector o mediante un tercer vector. Las otras clases de moléculas inmunoestimulantes comprenden citocinas tales como
las IL-2, IL-12, GM-CSF y similares, quimiocinas tales como las MIP1, MIP2, RANTES y similares y la Flt-3L.
Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para aumentar la respuesta inmunitaria específica de un antígeno de los linfocitos T de un mamífero contra un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo que comprende la administración de un poxvirus exógeno recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes LFA-3, ICAM-1 y una molécula B7, cada una de las moléculas coestimulantes expresadas en las células del mamífero en una cantidad eficaz para aumentar por lo menos una respuesta inmunitaria de los linfocitos T en la que el aumento es superior a la adición de aumentos proporcionada mediante la administración de moléculas coestimulantes individuales o dobles.
En otro procedimiento para aumentar las respuestas inmunitarias, se proporcionan APC o células tumorales que expresan genes exógenos proporcionados que codifican tres moléculas coestimulantes a un mamífero en una cantidad eficaz para aumentar las respuestas inmunitarias. Las APC o las células tumorales pueden expresar, además, genes exógenos que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo para aumentar las respuestas inmunitarias. Se puede administrar un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo a un mamífero antes de, al mismo tiempo que, o tras la administración de las APC o células tumorales. Además, las APC o las células tumorales se activan con por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo antes de su administración al mamífero.
La presente invención proporciona procedimientos para aumentar las respuestas humorales de un mamífero contra un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo que comprende la administración de un vector recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes a un mamífero en una cantidad eficaz para aumentar una respuesta humoral. El vector puede comprender, además secuencias de ácido nucleico que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. La invención proporciona además un anticuerpo aislado o parte funcional del mismo contra un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo producido mediante el procedimiento.
La presente invención proporciona también un anticuerpo específico contra un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo producido como respuesta a la administración de un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos que codifican las moléculas B7, ICAM-1 y LFA-3 y los genes que codifican uno o más antígenos seleccionados o epítopos de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros objetivos, características y diversas ventajas adicionales de la presente invención se comprenderán mejor a partir de la lectura detallada de la descripción de la presente invención.
Figura 1. Estructura genómica del plásmido pT5032 que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican las LFA-3, ICAM-1 y B7.1 murinas flanqueadas por partes de la región Hind III M del genoma de la variolovacuna.
Figura 2. Estructura genómica del plásmido pT5047 que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican las LFA-3, ICAM-1 y B7.1 murinas, y el gen lacZ, flanqueados por partes de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna.
Figura 3. Estructura genómica del plásmido pT5031 que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican las LFA-3, ICAM-1 y B7.1 murinas y una secuencia de ácido nucleico que codifica el CEA, flanqueadas por partes de la región Hind III M del genoma de la variolovacuna.
Figuras 4A a 4C. Estructura genómica de virus de la variolovacuna recombinantes que expresan tres moléculas coestimulantes con (Figura 4C) o sin (Figuras 4A y B) un antígeno asociado a un tumor. La Figura 4A ilustra la estructura genómica de la variolovacuna recombinante, VT171. La Figura 4B ilustra la estructura genómica de la variolovacuna recombinante, VT199. La Figura 4C ilustra la estructura genómica de la variolovacuna recombinante, VT172. Las regiones Hind III M y Hind III J son las zonas de inserción de los genes exógenos en los genomas de los poxvirus. Los activadores 30K, 13; sE/L, 7.5K, 40K y C1 son activadores poxvíricos. Se ilustran las zonas de restricción Bam HI y Hind III en las secuencias insertadas, con la distancia de cada zona (indicada en pares de kilobases) desde el extremo 5' de la inserción (0) listada encima de cada zona entre paréntesis (no se representa a escala).
Figura 5. Estructura genómica del plásmido pT8001 que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican las B7.1, LFA-3, ICAM-1 murinas, y el gen lacZ, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 6. Estructura genómica del plásmido pT5049 que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a los tumores, el CEA, las B7.1, LFA-3, ICAM-1 murinas, en combinación con el gen lacZ, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figuras 7A a 7D. Estructura genómica de virus de la viruela aviar recombinantes que expresan tres moléculas coestimulantes con (Figuras 7B, 7C y 7D) o sin (Figura 7A) un antígeno asociado a un tumor (TAA). La Figura 7A ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT222. La Figura 7B ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT194. La Figura 7C ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante que expresa las moléculas MUC-1, B7.1, ICAM-1 y LFA-3. La Figura 7D ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante que expresa un antígeno asociado a un tumor, las moléculas B7.1, ICAM-1 y LFA-3. La región Bam HI J es la zona de inserción de los genes exógenos en los genomas de los virus de la viruela aviar. Los activadores sE/L, I3, 7.5K, C1, 40K y 30K son activadores poxvíricos. P1 a P5 indican 5 activadores poxvíricos distintos. Se ilustran las zonas de restricción Bam HI y Hind III en las secuencias insertadas, con la distancia de cada zona (indicada en pares de kilobases) desde el extremo 5' de la inserción (0) listada encima de cada zona entre paréntesis (no se representa a escala).
Figura 8. Estructura genómica del plásmido pT5064 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas LFA-3 humana, ICAM-1 humana, B7.1 humana, y el gen lacZ, flanqueados por partes de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna.
Figura 9A a 9C. Estructura genómica del poxvirus recombinante que expresa tres moléculas recombinantes LFA-3, ICAM-1 y B7.1, junto con el gen lacZ, con (Figuras 9B, C) o sin (Figura 9A) un antígeno asociado a un tumor. La región Hind III J es la zona de inserción de los genes exógenos en el genoma del virus de la viruela aviar. Los activadores 30K, I3, sE/L, 40K y CI son activadores poxvíricos. Se ilustran las zonas de restricción Bg III y Hind III en las secuencias insertadas, con la distancia de cada zona (indicada en pares de kilobases) desde el extremo 5' de la inserción (0) listada encima de cada zona entre paréntesis (no se representa a escala).
Figura 10. Estructura genómica del plásmido pT8016 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican el CEA (6D), las moléculas LFA-3, ICAM-1 y B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Hind HI J del genoma de la variolovacuna.
Figura 11. Estructura genómica del virus de la variolovacuna vT238 que expresa el CEA (6D) y tres moléculas coestimulantes humanas. La región Hind III J es la zona de inserción de los genes exógenos en el genoma del poxvirus. 40K, 30K, 13, sE/L, y Cl son activadores poxvíricos.
Figura 12. Estructura genómica del plásmido pT8019 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas LFA-3, ICAM-1 y B7.1 murinas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 13A y 13B. Estructura genómica de virus de la viruela aviar recombinantes que expresan moléculas coestimulantes murinas o humanas. La Figura 13A ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT251. La Figura 13B ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT232. La región Bam HI J es la zona de inserción de los genes exógenos en el genoma del poxvirus. 30K, 13, sE/L, y C1 son activadores poxvíricos.
Figura 14. Estructura genómica del plásmido pT5072 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
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Figura 15. Estructura genómica del plásmido pT8020 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican la molécula MUC-1, las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 murinas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 16A a 16D. Estructura genómica de virus de la viruela aviar recombinantes que expresan moléculas coestimulantes murinas o humanas. La Figura 16A ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT250. La Figura 16B ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT242. La Figura 16C ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT236. La Figura 16D ilustra la estructura genómica del virus de la viruela aviar recombinante vT257. La región Bam HI J es la zona de inserción de los genes exógenos en el genoma del poxvirus. 40K, 7.5K 30K, 13, sE/L, y C1 son activadores poxvíricos.
Figura 17. Estructura genómica del plásmido pT2186 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican la molécula MUC-1, las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 18. Estructura genómica del plásmido pT2187 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican el CEA (6D), las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 19. Estructura genómica del plásmido pT5080 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican PSA, PSMA, las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma de la viruela aviar.
Figura 20. Estructura genómica del plásmido pT5085 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región Bam HI J del genoma del MVA.
Figuras 21A y 21B. Estructura genómica de virus MVA que expresan moléculas coestimulantes murinas o humanas con o sin antígenos asociados a tumores. La Figura 21A ilustra la estructura genómica del MVA vT264. La Figura 21B ilustra la estructura genómica del MVA vT260. La región de eliminación III (Deletion III) es la zona de inserción de los genes exógenos en el genoma del MVA. 40K, 7.5K, 30K, I3, sE/L, y C1 son activadores poxvíricos.
Figura 22. Estructura genómica del plásmido pT5084 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican PSA, PSMA, las moléculas LFA-3, ICAM-1, B7.1 humanas, y el gen lacZ de E. coli, flanqueados por partes de la región de eliminación III del genoma del MVA.
Figura 23. Expresión superficial de una molécula coestimulante tras la infección con virus recombinantes. Células tumorales MC38 se infectaron durante 5 horas a una MOI (multiplicidad de infección; pfu/célula) de 5 con el virus indicado. Tras la infección, se procedió a la inmunotinción con anticuerpos monoclonales marcados con FITC (MAb) específicos de la molécula coestimulante. Las áreas sombreadas representan la intensidad de fluorescencia de los MAb específicos mientras que las áreas sin sombrear representan la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos de control del isotipo apropiados (véase Materiales y Métodos).
Figuras 24A y 24B. Efecto de múltiples moléculas coestimulantes en la multiplicación de los linfocitos T. Se cultivaron linfocitos T murinos indiferenciados, en presencia de concentraciones variantes de Con A para proporcionar la primera señal, conjuntamente con células estimulantes MC38 infectadas con vectores de tanto la variolovacuna recombinante (Figura 24A) como de la viruela aviar recombinante (Figura 24B). Los vectores recombinantes eran naturales (es decir, V-Wyeth o WT-FP [cuadrados blancos]), rV-LFA-3 (triángulo oscuro), rV-ICAM-1 o rF-ICAM-1 (círculos oscuros), rV-B7-1 o rF-B7-1 (rombos oscuros), y rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 o rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (cuadrados oscuros). Las células MC38 sin infectar se representan con círculos blancos. El análisis de la multiplicación se realiza tal como se describe en Materiales y Métodos.
Figuras 25A a 25D. Especificidad de la coestimulación transmitida mediante virus de la variolovacuna recombinantes. Se cultivaron linfocitos T, en presencia de Con A, conjuntamente con células estimulantes MC38 infectadas con V-Wyeth (Figura 25A), rV-B7-1 (Figura 25B), rV-ICAM-1 (Figura 25C) y rV-LFA-3 (Figura 25D), tal como se indica mediante círculos claros. Las células estimulantes infectadas en presencia de los MAb específicos de la molécula coestimulante se indican mediante círculos oscuros y el anticuerpo de control del isotipo se indican mediante triángulos oscuros.
Figura 26. Capacidad relativa de las moléculas B7-1, ICAM-1, LFA-3 y la coexpresión de las tres moléculas coestimulantes para transmitir la segunda señal de multiplicación de los linfocitos T. En presencia de Con A (2,5 \mug/ml), se cultivaron 100.000 linfocitos T conjuntamente con 10.000 células MC38. Las células MC38 estimulantes que expresan no o todas las moléculas coestimulantes se añadieron a los pocillos en diversas proporciones en combinación con células estimulantes infectadas con V-Wyeth hasta un total de 10^{4} células MC38/pocillo. Las células MC38 se infectaron con V-Wyeth (cuadrado blanco), rV-LFA-3 (triángulos oscuros), rV-ICAM-1 (círculos oscuros), rV-B7-1 (rombos oscuros) o rV-B7-1-ICAM-1-LFA-3 (cuadrados oscuros). Las células se cultivaron conjuntamente durante 48 horas. Durante las 18 horas finales se añadió ^{3}H-timidina para determinar la multiplicación de los linfocitos T. El cuadro interior ilustra los valores de la multiplicación obtenidos a partir de un cultivo en el que se infectó el 3% de las células estimulantes MC38 con los vectores que indicados. Por lo tanto, en el presente experimento, la proporción final de células estimulantes respecto a los linfocitos T resultó de 0,003. Obsérvese el efecto relativamente débil de rV-B7.1/ICAM bajo dichas condiciones si se compara con rV-B7/ICAM/LFA-3.
Figuras 27A a 27D. Efecto de la coestimulación en poblaciones de linfocitos T específicos. Se cultivaron linfocitos T murinos CD4^{+} (Figura 27A) o CD8^{+} (Figura 27B) conjuntamente con células MC38 sin infectar (círculo blanco), o células infectadas con V-Wyeth (cuadrados blancos), rV-LFA-3 (triángulos oscuros), rV-ICAM-1 (círculos oscuros), rV-B7-1 (rombos oscuros) o rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (cuadrados oscuros) en una proporción de 10:1 durante 48 horas en presencia de diversas concentraciones de Con. A. Durante las 18 horas finales se añadió ^{3}H-timidina para determinar la multiplicación de los linfocitos T. Las Figuras 27C y 27D ilustran las respuestas proliferativas de las células CD4^{+} y CD8^{+} purificadas, respectivamente, cuando se cultivan conjuntamente en presencia de células estimulantes MC38 infectadas con el vector con una concentración baja de Con A (0,625 \mug/ml).
Figuras 28A a 28D. Efecto de la coestimulación en la producción de citocinas. Se purificaron linfocitos T murinos CD4^{+} (Figuras 28A y 28C) o CD8^{+} (Figuras 28B o 28D) tal como se describe en Materiales y Métodos y se cultivaron conjuntamente con las células estimulantes indicadas MC38 infectadas con el vector durante 24 horas en presencia de 2,5 \mug/ml de Con A. Se analizaron los fluidos sobrenadantes en relación con la producción de IL-2 (Figuras 28A y 28B) e IFN-\gamma (Figuras 28C y 28D) mediante una prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA).
Figuras 29A a 29C. Efecto de la coestimulación en la expresión del ARN de las citocinas. Figura 29 A: Se cultivaron linfocitos T murinos CD4^{+} o CD8^{+} conjuntamente con células estimulantes MC38 infectadas con V-Wyeth (carril A), rV-B7-1 (carril B), rV-ICAM-1 (carril C), rV-LFA-3 (carril D), o rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (carril E) en una proporción de linfocitos T respecto a las células estimulantes de 10:1 1 durante 24 horas en presencia de 2,5 \mug/ml de Con A. Tras realizar el cultivo, se analizó el ARN de los linfocitos T mediante un análisis de protección con ribonucleasas con sonda múltiple. La representación cuantitativa de los resultados de la autorradiografía se normaliza para la expresión del gen de mantenimiento L32 de la Figura 29B (células CD4^{+}) y de la Figura 29C (células CD8^{+}). El orden de las barras del histograma, de izquierda a derecha, es MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1, MC38/LFA-3, y MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3.
Figura 30. A unos ratones C57BL/6 (5/grupo) se administró HBSS (cuadrados oscuros) o se vacunaron con 10^{7} pfu de rV-CEA (triángulos oscuros) o rV-CEA/TRICOM (círculo oscuro). Cien días más tarde, se inocularon los ratones con 1 x 10^{6} células malignas MC38 que expresan el CEA y se realizó el seguimiento de la supervivencia de los mismos. Todos los ratones salvo los del grupo V-CEA/TRICOM desarrollaron tumores y se sacrificaron cuando los tumores sobrepasaron los 20 mm de longitud o de anchura, o cuando los ratones agonizaban. Figura 30: En un segundo experimento, se vacunaron unos ratones C57BL/6 (5/grupo) con 10^{7} pfu de rV-CEA, rV-CEAB7.1 o rV-CEA/TRICOM o disolución amortiguadora de HBSS. Se analizaron las respuestas linfoproliferativas de los linfocitos T esplénicos agrupados 22 días tras la vacunación. Los valores representan el índice de estimulación de la media de recuentos por minuto (cpm) de sus triplicados comparada con la media. La desviación típica nunca superó el 10%. Los antígenos utilizados fueron Con A (5 \mug/ml), CEA (100 \mug/ml) y ovoalbúmina (100 \mug/ml).
La Figura 31 ilustra un esquema de un análisis de coestimulación in vitro de células dendríticas.
Las Figuras 32A y 32B ilustran la respuesta proliferativa de linfocitos T indiferenciados CD4^{+} (Figura 32A) o CD8^{+} indiferenciados (Figura 32B) estimulados con DC precursoras infectadas con rV-B7/ICAM-1/LFA-3 o DC (sin infectar, es decir, células CD 34^{+} tratadas con GM-CSF + IL-4 durante 6 días) en presencia de Con A.
Las Figuras 33A y 33B ilustran la respuesta proliferativa de linfocitos T indiferenciados CD4^{+} (Figura 33A) o CD8^{+} indiferenciados (Figura 33B) estimulados con DC precursoras infectadas con rV-B7/ICAM-1/LFA-3 o DC infectadas con rV-B7/ICAM-1/LFA-3 o V-Wyeth (control).
La Figura 34 ilustra la reacción de linfocitos mixtos (MLR) de esplenocitos Balb/C comparados con células dendríticas C57bl/6 irradiadas infectadas a una MOI de 25 de V-Wyeth o rV-TRICOM. La activación con ^{3}H-timidina en el día 3, recolección en el día 4, \Box DC (sin infectar), \sqbullet DC (infectadas con V-Wyeth), \Box DC (infectadas con rV-TRICOM).
La Figura 35 ilustra la respuesta proliferativa de los linfocitos T que responden (estirpe celular CAP-M8 específica del péptido 8 CEA) con diversas proporciones de APC recogidos en el día 5 tras la estimulación con DV activadas con el péptido e infectadas con rV-TRICOM y se dejaron reposar durante 2 días con 10 \mug/ml de IL2 (sin APC o péptido). Péptido 8 - (EAQNTTYL) en análisis a 1 \mug/ml de concentración final. La ^{3}H-timidina se añadió en el día 2, las células se recogieron en el día 3. Los resultados de O = DC (v-Wyeth) - pép. y \Delta = DC (rV-TRICOM) - pép se encuentran en los valores iniciales.
Figuras 36A y 36B. Eficacia de la infección poxvírica de células dendríticas (DC) murinas. Las DC se infectaron a una MOI de 25 con rV-TRICOM o a una MOI de 50 con rF CEA/TRICOM durante 5 h. Las DC infectadas con vectores TRICOM presentaron una capacidad superior para estimular linfocitos T indiferenciados. Todas las poblaciones de DC se cultivaron conjuntamente durante 48 h con linfocitos T en una proporción de 10:1 en presencia de distintas concentraciones de Con A para proporcionar la señal 1. Se añadió la ^{3}H-timidina durante las 18 h finales. Figura 36A: DC sin infectar (cuadrados oscuros), DC en las que se simuló la infección (rombos oscuros), o DC infectadas con V-WT (triángulos invertidos oscuros), rV-B7.1 (triángulos claros) o rV-TRICOM (círculos claros). Figura 36B: DC (cuadrados oscuros), DC en las que se simuló la infección (rombos oscuros), o DC infectadas con WT-FP (triángulos invertidos oscuros), rV-B7.1 (triángulos claros) o rF-TRICOM (círculos claros).
Figuras 37A a 37F. Actividad aloestimulante aumentada mediante DC infectadas con los vectores de la variolovacuna (Figuras 37 A, C, E) o de la viruela aviar (Figuras 37 B, D, F). Las DC sin infectar (cuadrados oscuros), DC en las que se simuló la infección (rombos oscuros); o DC infectadas con vectores poxvíricos (V-WT o F-WT, triángulos invertidos oscuros) rV-B7.2 o rF-B7.1 (triángulos claros), o rV-TRICOM o rF-TRICOM (círculos claros) se cultivaron conjuntamente con linfocitos T alógenos (Figuras 37 A a D) o singénicos (Figuras 37 E a F) durante 5 días. Se añadió la ^{3}H-timidina durante las 18 horas finales.
Figuras 38A a 38F. Efecto de la infección de las DC con variolovacuna en la multiplicación de los linfocitos T de especificidad peptídica. Las DC sin infectar (cuadrados oscuros), o DC infectadas con V-WT (triángulos invertidos oscuros) rV-B7.1 (triángulos claros), o rV-TRICOM (círculos claros) se cultivaron conjuntamente con linfocitos T específicos del péptido OVA (Figuras 38 A, C, E) o con linfocitos T específicos del péptido CAP-M8 (Figuras 38 B, D, F). Las condiciones experimentales comprendían una proporción celular efector:estimulante de 10:1 en presencia de diversas concentraciones de los péptidos apropiados (Figura 38 A a D), péptidos negativos de control (cuadrados blanco), tanto VSVN (Figura 38A) como FLU-NP (Figura 38B), o una concentración fija de 1 \muM en presencia de diversas proporciones celulares efector:estimulante (Figuras 38 E y F).
Figuras 39A a 39F. Efecto de la infección de las DC con rV-TRICOM maduradas con TNF-\alpha o CD40. Se utilizaron DC (cuadrados oscuros), o DC cultivadas con tanto 100 ng/ml de TNF-\alpha (triángulos claros), como con 5 \mug/ml de CD40 mAb (círculos claros) durante las 24 h finales de cultivo para estimular los linfocitos T efectores específicos del CAP-M8 (Figura 39A). La multiplicación de los linfocitos T específicos del CAP-M8 como respuesta a dichas poblaciones de DC tras la infección con rV-TRICOM a una MOI de 25 (Figura 39B). En todos los diagramas la proporción linfocitos T: DC fue de 10:1, mientras que la concentración del péptido CAP-M8 fue de 1 \mug/ml. Los círculos oscuros indican la multiplicación de los linfocitos T específicos del CAP-M8 estimulados con todas las poblaciones de DC en presencia de 1 \mug/ml del péptido VSVN.
Figuras 40A a 40H. Efecto de la infección de las DC con variolovacuna en la inducción de la actividad de los CTL. Se activaron las DC (Figura 40B) o las DC infectadas con V-WT (Figura 40C), o rV-TRICOM (Figura 40D) con 10 \muM del péptido OVA durante 2 h. Las poblaciones de DC se administraron por vía intravenosa a ratones (1 x 10^{5} células por ratón). Los ratones de control se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mug del péptido OVA en un aditivo Ribi/Detox (Figura 40A). Se extrajeron los bazos catorce días más tarde, se estimularon de nuevo durante 6 días con el péptido correspondiente y se analizaron en relación con su capacidad lítica contra las células EL-4 activadas tanto con el péptido OVA (cuadrados oscuros) como con el péptido VSVN (cuadrado blanco). Los números intercalados indican la actividad de los CTL expresada en unidades líticas. Se ilustra también el efecto de la infección de las DC con variolovacuna en la inducción de la actividad de los CTL. Se activaron las DC (Figura 40F) o las DC infectadas con V-WT (Figura 40G), o rV-TRICOM (Figura 40H) con 10 \muM del péptido CAP-M8 durante 2 h. Las poblaciones de DC se administraron por vía intravenosa a ratones (1 x 10^{5} células por ratón). Los ratones de control se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mug del péptido CAP-M8 en un aditivo Ribi/Detox (Figura 40E). Se extrajeron los bazos catorce días más tarde, se estimularon de nuevo durante 6 días con el péptido correspondiente y se analizaron en relación con su capacidad lítica contra las células EL-4 activadas tanto con el péptido CAP-M8 (cuadrados oscuros) como con los péptidos FLU-NP (cuadrados blancos). Los números intercalados indican la actividad de los CTL expresada en unidades líticas.
Figuras 41A a 41C. Efecto de múltiples inmunizaciones con DC infectadas con variolovacuna en la provocación de la actividad de los CTL. Se activaron DC (cuadrados oscuros), o DC infectadas con V-WT (triángulos invertidos oscuros) o con rV-TRICOM (círculos claros), con 10 \muM del péptido CAP-M8 durante 2 h. Las poblaciones de DC se administraron por vía intravenosa a ratones (1 x 10^{5} células por ratón) 1, 2 ó 3 veces a intervalos de 7 días. Los ratones de control se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mug del péptido CAP-M8 en un aditivo Ribi/Detox (cruces). Se extrajeron los bazos catorce días tras la inmunización final, se estimularon de nuevo durante 6 días con CAP-M8 y se analizaron en relación con su capacidad lítica contra las células EL-4 activadas con el péptido CAP-M8 o con el péptido de control VSVN (no se representan).
Figuras 42A y 42B. Efecto de los esplenocitos infectados con TRICOM de la variolovacuna y de la viruela aviar en la multiplicación de los linfocitos T. Se cultivaron linfocitos T murinos indiferenciados conjuntamente con esplenocitos autógenos con vectores tanto de la variolovacuna recombinante como de la viruela aviar recombinante. Se realizó el cultivo conjunto en diversas concentraciones de Con A como señal 1. Los vectores recombinantes eran naturales (es decir, V-WT, FP-WT, rombos blancos), rV-B7-1 o rF-B7-1, (círculos blancos) o rV-TRICOM o rF-TRICOM (cuadrados oscuros). Los esplenocitos sin infectar se ilustran como triángulos blancos.
Figuras 43A a 43D. Efecto de los esplenocitos infectados con el vector TRICOM en los linfocitos T alógenos. Se cultivaron linfocitos T Balb/C indiferenciados conjuntamente con esplenocitos C57B 1/6 infectados con vectores recombinantes de la variolovacuna (Figuras 43 A y C) o de la viruela aviar (Figuras 43 B y D) durante 2 días (Figuras 43 A y B) o 5 días (Figuras 43 C y 43D). Los vectores recombinantes eran V-WT o FP-WT (rombos blancos), rV-B7-1 o rF-B7-1, (círculos blancos) o rV-TRICOM o rF-TRICOM (cuadrados oscuros). Los esplenocitos sin infectar se indican como triángulos blancos. La multiplicación provocada por las DC se indican como cuadrados oscuros.
Figuras 44A a 44F. Efecto de los esplenocitos infectados con rV-TRICOM en poblaciones específicas de linfocitos T. Se fraccionaron linfocitos T murinos indiferenciados en las subpoblaciones CD3^{+}, CD4^{+} y CD8^{+}. Se cultivaron los linfocitos T conjuntamente tanto con BMDC autógenas sin infectar como con esplenocitos infectados con vectores recombinantes de la variolovacuna. Distintas concentraciones de Con A (Figuras 44 A a C) o distintos números de células estimulantes (Figuras 44 D a F) proporcionaron la primera señal. La multiplicación de los linfocitos T como respuesta a las BMDC maduras se indica mediante cuadrados blancos, y como respuesta a los esplenocitos sin infectar mediante triángulos blancos. Los vectores recombinantes eran (V-WT, rombos blancos), o rV-TRICOM (cuadrados oscuros).
Figuras 45A a 45F. Efecto de las células de médula ósea infectadas con rV-TRICOM en poblaciones específicas de linfocitos T. Se fraccionaron linfocitos T murinos indiferenciados en las subpoblaciones CD3^{+}, CD4^{+} y CD8^{+}. Se cultivaron los linfocitos T conjuntamente tanto con BMDC autógenas sin infectar como con esplenocitos infectados con vectores recombinantes de la variolovacuna. Distintas concentraciones de Con A (Figuras 45 A a C) o distintos números de células estimulantes (Figuras 45 D a F) proporcionaron la primera señal. La multiplicación de los linfocitos T como respuesta a las BMDC maduras se indica mediante cuadrados blancos, y como respuesta a los esplenocitos sin infectar mediante triángulos blancos. Los vectores recombinantes eran (V-WT, rombos blancos), o rV-TRICOM (cuadrados oscuros).
Figuras 46A a 46D. Efecto de los esplenocitos o de las células de la médula ósea (BM) infectados con rV-TRICOM en los linfocitos T de memoria de especificidad peptídica CD8^{+}. Se cultivaron linfocitos T específicos del CAP-M8 conjuntamente con esplenocitos autógenos (Figuras 46 A y B) o células de la médula ósea (Figuras 46 C y D) infectadas con vectores recombinantes de la variolovacuna. Se realizó el análisis utilizando dos conjuntos de condiciones: a) se cultivaron células que responden: estimulantes en una proporción fija de 10:1 en presencia de diversas concentraciones del péptido CAP-M8 (Figuras 46A y 46C), o b) con una concentración fija del péptido (1 \muM) con diversas proporciones de células que responden: estimulantes (Figuras 46B y 46D). Los vectores recombinantes eran naturales (V-WT, rombos blancos), o rV-TRICOM (cuadrados oscuros). Los esplenocitos sin infectar se ilustran como triángulos blancos. Las BM se ilustran como cuadrados blancos.
Figura 47. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos aislados a partir de células del sistema reticuloendotelial de la circulación general (PBMC) utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM activadas con los péptidos CEA, CAP-1 o CAP1, 6D.
Figura 48. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM activadas con los péptidos PSA y PSA-3.
Figura 49. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos aislados a partir de PBMC utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM activadas con los péptidos Flu 58-66.
Figura 50. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos aislados a partir de PBMC utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM o con rF-B7.1 activadas con los péptidos Flu 58-66 con diversas proporciones efector:APC.
Figura 51. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos obtenidas a partir del donante 868 utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM activadas con el péptido HPV (11-20) tras una o dos estimulaciones in vitro (IVS).
Figura 52. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM o con rF-B7.1 activadas con diversas concentraciones del péptido HPV (11-20).
Figura 53. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM o con rF-B7.1 activadas con el péptido HPV (11-20).
Figura 54. Ilustra la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T humanos utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM o con rF-B7.1 activadas con el péptido HPV E7 11-20 con diversas proporciones efector:APC.
Descripción detallada de la invención
La presente invención es un vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes, en combinación, o las partes funcionalmente activas de cada una de las moléculas coestimulantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria una parte funcionalmente activa es aquella parte de la molécula responsable de enlazarse con su ligando respectivo, desencadenando una señal coestimulante apropiada para activación celular inmunitaria. Un procedimiento para determinar la actividad funcional es conseguir la provocación de la multiplicación de los linfocitos T indiferenciados administrando la molécula coestimulante a un dianocito in vitro tal como se describe en la presente memoria. Una parte funcional de una molécula coestimulante estimula la multiplicación de los linfocitos T con un incremento de por lo menos el 20%.
El término gen exógeno o secuencia exógena de ácido nucleico o parte funcional de la misma se utiliza en la presente memoria como un gen, una secuencia de ácido nucleico o parte funcional de la misma de origen exógeno proporcionado por un vector recombinante a una célula u organismo anfitrión. El gen exógeno o parte del mismo que se proporciona a la célula u organismo anfitrión puede ser uno que no sea endógena de la célula u organismo anfitrión o puede ser endógena y funcional o no funcional. En el caso en que un gen endógeno funcional se encuentre en la célula u organismo anfitrión, el gen exógeno o de origen exógeno o parte funcional del mismo produce la hiperexpresión del producto genético.
Los vectores recombinantes de la presente invención resultan útiles para provocar respuestas inmunitarias aumentadas a células del sistema inmunitario que comprenden, pero sin limitarse a las mismas, los linfocitos T, los linfocitos B, los linfocitos citolíticos naturales (NK), las células que presentan antígenos (APC) y similares. El aumento de la respuesta inmunitaria al utilizar los vectores recombinantes que expresan tres moléculas coestimulantes es sinérgico en comparación con la utilización de una única molécula coestimulante o la utilización de dos moléculas coestimulantes para aumentar las respuestas inmunitarias. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular y/o humoral y se puede dirigir a un antígeno específico seleccionado o a un epítopo del mismo o puede ser un aumento inmunitario o un efecto de sobrerregulación generalizados tal como se demuestra pos el aumento en la liberación de citocinas, el aumento en la multiplicación por parte de las células inmunitarias, el mayor grado de reacción mitógena, etcétera. El aumento de una respuesta inmunitaria comprende preferentemente la hiperestimulación o la estimulación de alta intensidad de los linfocitos T (HITS) como resultado de la estimulación utilizando los vectores recombinantes de la presente invención o células sometidas a transfección, transducción o inducción por parte del vector recombinante de la presente invención.
Los genes exógenos que codifican las moléculas coestimulantes se pueden obtener a partir de diversas fuentes. La selección de la fuente de genes exógenos que codifican las moléculas coestimulantes puede depender de la especie a inmunizar o tratar utilizando el vector recombinante.
Los genes exógenos que codifican las moléculas coestimulantes se pueden obtener a partir de ratones, humanos y simios, y se pueden sintetizar químicamente basándose en genes de mamíferos. Los genes exógenos que codifican las moléculas coestimulantes pueden obtenerse asimismo de aves o sintetizarse químicamente a partir de genes de moléculas coestimulantes aviares. Los vectores recombinantes de la presente invención resultan útiles como antígenos y como vacunas al estimular un aumento de las respuestas inmunitarias para los dianocitos, antígenos seleccionados y epítopos inmunitarios de los mismos. Dicho nivel de aumento de una respuesta inmunitaria al utilizar los presentes vectores recombinantes que comprenden los genes que codifican tres moléculas coestimulantes no se puede alcanzar utilizando una molécula simple o doble coestimulante.
Los genes o parte funcionales de los mismos que codifican moléculas coestimulantes que resultan útiles en la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L, homólogos de mamíferos y similares. El vector recombinante de la presente invención comprende genes que codifican tres moléculas coestimulantes para un aumento sinérgico de las respuestas inmunitarias que no se puede obtener utilizando una molécula coestimulante simple o doble. Los genes que codifican diversas combinaciones de moléculas coestimulantes constituyen un campo de la presente invención para utilizar en el vector recombinante y pueden comprender combinaciones tales como B7.1, o B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1, o B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1, o B7.2, ICAM-1, 4-1BBL; B7.1, o B7.2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL; CD59, VCAM-1; y B7.1, o B7.2; CD59, CD40, 4-1BBL, CD70 y VCAM-1, B7.1, o B7.2; OX-40L, 4-1BBL; y similares en función de la respuesta inmunitaria que se pretenda y de la enfermedad o trastorno a tratar. Basándose en respuestas inmunitarias sinérgicas drásticas alcanzadas al utilizar un vector recombinante que codifica las tres moléculas coestimulantes en comparación con la utilización de un vector que codifica una o dos moléculas coestimulantes, un vector recombinante que codifique cuatro, cinco o más moléculas coestimulantes producirá una respuesta inmunitaria sinérgica o una respuesta inmunitaria equivalente a/o superior a la utilización de un vector recombinante que codifica tres moléculas coestimulantes.
B7 representa una familia de moléculas coestimulantes que son elementos de la superfamilia genética de las Ig. Los elementos comprenden B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86). B7.1 y B7.2 son los ligandos naturales de CD28/CTLA-4 (CD152). La secuencia genética de la B7.1 murina se describe en Freeman et al., (J. Immunol. 143: 2714-2722, 1989) y en GENBANK con el nº de registro X60958. La secuencia genética de la B7.2 murina se describe en Azuma et al., (Nature 366: 76-79, 1993) y en GENBANK con el nº de registro L25606 y MUSB72X.
Los homólogos humanos de las moléculas coestimulantes B7 murinas y partes funcionales de las mismas constituyen un campo de la presente invención y presentan una utilidad particular en vectores recombinantes de uso clínico en humanos. El homólogo humano de las moléculas coestimulantes B7 murinas comprenden el CD80, el homóloga de la B7.1 murina, y el CD86, el homólogo de la B7.2. La secuencia genética de la B7.1 humana (CD80) se describe GENBANK con el nº de registro M27533, y la secuencia genética de la B7.2 humana (CD86) se describe con el nº de registro U04343 y AF099105. Se puede requerir una autorización para poner en práctica la presente invención.
Para utilizarse en la presente invención, un vector recombinante puede comprender una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique una molécula de la familia de moléculas coestimulantes B7 o una combinación de moléculas coestimulantes B7 o partes funcionales de las mismas además de otras moléculas coestimulantes. La combinación de moléculas coestimulantes B7 comprende, pero no se limita a, dos o más moléculas B7.1, dos o más moléculas B7.2, B7.1 y B7.2 y similares. En una forma de realización, el vector recombinante comprende una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica la molécula B7.1 en combinación con secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican las LFA-3 y ICAM-1.
La molécula 1 de adherencia intracelular (ICAM-1 murino. CD54) y el homólogo humano, CD54, actúa también como molécula coestimulante. Su ligando es el antígeno 1 asociado a la función leucocítica (LFA-1, CD11a/CD18) que se expresa en la superficie de los linfocitos y de los granulocitos. El gen del ICAM-1 murino se describe en GenBank con el nº de registro X52264 y el gen del homólogo ICAM-1 humano, (CD54), se describe con el nº de registro J03132. En una forma de realización, el vector recombinante de la presente invención comprende una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula ICAM-1 murina, un homólogo humano, un homólogo de otro mamífero o parte funcional del mismo además de las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican dos o más moléculas coestimulantes adicionales.
La molécula coestimulante del antígeno 3 asociado al funcionamiento de los leucocitos, la LFA-3 murina y su homóloga humana LFA-3 (CD58), una glucoproteína unida al glucosilfosfatidilinositol, es un elemento de la familia CD2 dentro de la superfamilia genética de las inmunoglobulinas. El ligando natural de la LFA-3 es el CD2 LFA-2) que se expresa en los timocitos, en los linfocitos B, en los linfocitos NK. El gen de la LFA-3 murina se describe en GenBank con el nº de registro X53526 y el gen del homólogo humano se describe en con el nº de registro Y00636.
El antígeno 4-BBL de los linfocitos T es una molécula coestimulante que transmite las señales coestimulantes en los cultivos de linfocitos T primarios estimulados por antígenos y en la activación de los timocitos provocada por la lectina (Hurtado, J. C. et al., J. Immunol. 158(6): 2600-2609, 1997). El 4-1BBL pertenece a la superfamilia de receptores de factores de la necrosis tumoral, un grupo de moléculas de la superficie celular ricas en cisteína (Vinay, D. S. et al., Seminars in Immunology, 1998, vol. 10, pág. 481 a 489). El gen del 4-1BBL murino se describe en GenBank con el nº de registro U02567. El gen del homólogo humano, hu4-1BBL, se describe en GenBank con el nº de registro U03397.
La OX-40L es una proteína de membrana de tipo II que presenta una homología limitada con el factor de la necrosis tumoral (TNF) y que resulta estimulante para los linfocitos T OX-40^{+} in vitro. Los ADNc de la OX-40L murina y humana presentan una homología del 68% al nivel de la secuencia de nucleótidos y del 46% al nivel de la secuencia de aminoácidos. La OX-40L humana estimula exclusivamente linfocitos T humanos, mientras que la OX-40L murina estimula los linfocitos T tanto humanos como murinos. Las APC expresan la OX-40L y pueden transmitir la señal OX-40L: OX40R durante la exposición del antígeno a los linfocitos T CD4^{+}. La señal de la OX-40L resulta importante en la diferenciación de las células dendríticas humanas y provoca un aumento en la producción de IL-12, TNF-\alpha, IL-1B, y IL-6. (Weinberg, A. D. et al., 1998 Seminars in Immunology, vol. 10: 471-480). La OX-40L es una potente molécula coestimulante el mantenimiento de las respuestas primarias de los linfocitos T CD4^{+}, utilizada en combinación con la B7-1 (Gramaglia, I. et al., 1998 J. Immunology, vol. 161: 6510-7).
Los vectores útiles de la presente invención pueden provocar la expresión de por lo menos tres o más genes exógenos, preferentemente cinco o más genes exógenos. Los vectores útiles de la presente invención comprenden cualquier vector que pueda provocar la expresión funcional de los productos genéticos de tres moléculas exógenas coestimulantes en una célula anfitriona. Además de los genes que codifican tres moléculas estimulantes, el vector puede también provocar la expresión de por lo menos un gen exógeno que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo así como un marcador elegible.
Los vectores de la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, vectores bacterianos tales como la Salmonella, vectores víricos, vectores basados en ácidos nucleicos y similares. Los vectores víricos comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los poxvirus, el virus del herpes, los adenovirus, los alfavirus, los retrovirus, los picornavirus, los iridovirus y similares. Los poxvirus útiles de la presente invención comprenden vectores replicantes y no replicantes. Dichos poxvirus comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los virus de la familia orthopox tales como la variolovacuna, la viruela del mapache, la viruela del conejo y similares, la viruela aviar, la viruela porcina, la viruela de las cabras y de las ovejas, y similares. Los poxvirus se pueden seleccionar de entre el grupo que comprende la cepa Copenhague de la variolovacuna, la cepa Wyeth de la variolovacuna, la cepa MVA de la variolovacuna, la NYVAC, la viruela aviar, la TROVAC, la viruela del canario, la ALVAC, la viruela porcina, y similares. En una forma de realización, el vector recombinante es un virus de la variolovacuna. En otra forma de realización, el vector recombinante es la viruela aviar.
Un vector preferido de la presente invención es un virus recombinante, preferentemente un poxvirus. Los poxvirus recombinantes útiles de la presente invención presentan un cierto número de atributos, que comprenden (i) la transferencia eficaz de los genes a los tres tipos celulares, comprendiendo las APC y las células tumorales; (ii) unos niveles elevados de expresión proteica; (iii) una exposición óptima de los antígenos al sistema inmunitario; (iv) la capacidad de provocar respuestas inmunitarias en las que intervienen células así como respuestas de anticuerpos; (v) una modificación genética transitoria, y no permanente, de las células; y (vi) la capacidad de utilizar combinaciones de poxvirus de géneros distintos, sin que se produzcan, por lo tanto, reacciones inmunitarias cruzadas. Los poxvirus originales útiles al construir los poxvirus recombinantes de la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, virus de la familia orthopox tales como virus de la variolovacuna replicante (Perkus et al., Science 229: 981-984, 1985; Kaufman et al., Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991, Moss Science 252: 1662, 1991), virus de la variolovacuna muy atenuados tales como el virus de la variolovacuna modificado de la cepa Ankara (MVA) (Sutter y Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 89: 10847-10851; Sutter et al., Virology 1994), el virus de la variolovacuna de la cepa Copenhague y NYVAC: poxvirus aviares (15) tales como el virus de la viruela aviar (15), poxvirus del canario, tales como ALVAC y similares (Baxby y Paoletti, Vaccine 10: 8-9, 1992; Rinns, M. M. et al., (Editores) Recombinant Poxviruses CRC Press, Inc, Boca Raton, 1992; Paoletti, E. Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 93: 11349-11353, 1996), y virus de la viruela porcina, virus de la viruela de las cabras y de las ovejas, y similares.
En una forma de realización, el poxvirus original es un virus de la variolovacuna. En una forma de realización particular, el virus de la variolovacuna es de la cepa Wyeth o un derivado de la misma. El derivado de la cepa Wyeth comprende, pero sin limitarse al mismo, el vTBC33 que carece del gen funcional K1L y similares. En otra forma de realización adicional, el virus se encuentra disponible como Dry-vax, vacuna antivariólica del Center for Disease Control, Atlanta ("Centro de control de enfermedades de Atlanta"), GA. En otra forma de realización, el poxvirus original es una cepa de viruela aviar, por ejemplo la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation), y similares.
El vector recombinante de la presente invención puede realizar la infección, transfección o transducción de células anfitrionas en un organismo anfitrión. El organismo anfitrión comprende, pero sin limitarse a los mismos, mamíferos, aves, peces, etcétera. Las células anfitrionas son cualquier célula susceptible de infección, transfección o transducción por parte del vector recombinante y que pueda expresar los genes exógenos del vector recombinante en unos niveles funcionales. Las células anfitrionas comprenden, pero sin limitarse a las mismas, APC clínicas y células precursoras que presentan antígenos tales como los monocitos, los macrófagos, las DC, las células de Langerhans y similares. El vector recombinante de la presente invención puede infectar también células tumorales u otros tipos celulares tales como los fibroblastos o las células musculares. La infección de las células anfitrionas permite la expresión de cada molécula exógena coestimulante y la expresión de la secuencia exógena de ácido nucleico que codifica el/los antígeno(s) seleccionado(s), si se encuentran presentes, del vector recombinante. Las células anfitrionas expresan, o están genomanipuladas para expresar las moléculas apropiadas MHC (HLA) de la Clase I o II para una exposición antigénica adecuada a los linfocitos T CD4^{+} y/o CD8^{+}. Como consecuencia de ello, cualquier célula de un mamífero se puede genomanipular para que se vuelva una célula apropiada que presenta un antígeno y que exprese tres moléculas coestimulantes.
El vector recombinante de la presente invención comprende por lo menos un elemento de control de la expresión vinculado en su función a la secuencia del ácido nucleico. Los elementos de control de la expresión se introducen en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia del ácido nucleico (Ausubel et al., 1987, in Current Protocols in Molecular Biology ("Protocolos actuales en biología molecular", John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York). Los elementos de control de la expresión resultan conocidos en la técnica y comprenden los activadores. Los activadores útiles de la presente invención son activadores poxvíricos tal como se conocen en la técnica que comprenden, pero sin limitarse a los mismos, 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K, C1 y similares. La secuencia del ácido nucleico del activador 30K se describe en GenBank con el nº de registro M35027 con los números de bases 28.012 a 28.423 (cadena complementaria). La secuencia del ácido nucleico del activador I3 se describe en GenBank con el nº de registro J03399 con los números de bases 1100 a 1301 (cadena complementaria). La secuencia del ácido nucleico del activador 7.5K se describe en GenBank con el número de registro M35027 con los números de bases 186550 a 186680. La secuencia del ácido nucleico del activador indica su período y nivel de expresión. Se prefieren los activadores prematuros o prematuros/tardíos. En una forma de realización preferida, el activador o combinación de activadores utilizados permiten la expresión óptima de cada una de las moléculas coestimulantes en un organismo anfitrión infectado para proporcionar una respuesta inmunitaria sinérgica. En una forma de realización preferida, cada uno de los genes exógenos que codifican una molécula coestimulante se controla mediante un activador separado y distinto.
En el caso de los vectores basados en el ácido nucleico, los constructos pueden ser tanto de ácido nucleico (ADN o ARN) o asociados a/o encapsulados en un excipiente lipídico. Opcionalmente, la molécula del excipiente lipídico y/o del constructo pueden proporcionar la selección y/o la expresión de un tipo o tipos de dianocito en particular. Se pueden preparar los vectores desnudos de ADN mediante los métodos descritos en la patente US nº 5.827.703. Se puede utilizar cualquier región como región de iniciación de la transcripción, o elemento activador, siempre que proporcione el nivel pretendido de transcripción de la secuencia de ADN de interés. La región de iniciación de la transcripción puede ser natural u homóloga para la célula anfitriona y/o para el ADN a transcribir, o exógena o heteróloga para la célula anfitriona y/o la secuencia de ADN a transcribir. Los elementos activadas eficaces en la iniciación de la transcripción del ADN desnudo comprenden, pero sin limitarse a los mismos, el activador prematuro del SV40 (virus símico 40), el activador del RSV (virus del sarcoma de Rous), el activador tardío principal de los adenovirus, el activador I prematuro inmediato del CMV (citomegalovirus) humano, y similares. Los vectores basados en los ácidos nucleicos se pueden administrar a un paciente utilizando una jeringuilla, un catéter o un dispositivo de inyección sin aguja tal como una pistola génica.
En una forma de realización de la presente invención, se proporciona un vector recombinante que comprende una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica una primera molécula coestimulante o parte funcional de la misma bajo el control de un primer activador, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica una segunda molécula coestimulante o parte funcional de la misma bajo el control de un segundo activador, y una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica una tercera molécula coestimulante o parte funcional de la misma bajo el control de un tercer activador. El vector recombinante puede proporcionar, además, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifique un antígeno o una parte inmunitaria del mismo bajo el control de un cuarto activador.
\newpage
En una forma de realización de la presente invención, se proporciona un poxvirus recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 o una parte funcional de la misma bajo el control del activador poxvírico 30K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico I3, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7.1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico sE/L. Un ejemplo de dicho constructo poxvírico recombinante es el vT171 de la variolovacuna tal como se representa en la Figura 11A. El poxvirus recombinante puede proporcionar, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor o una parte inmunitaria del mismo. Una forma de realización de la presente invención es el vT172 recombinante de la variolovacuna tal como se representa en la Figura 4C.
En otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un poxvirus recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7.1 bajo el control del activador poxvírico sE/L, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico I3, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 7.5K. Opcionalmente, el constructo comprende, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador elegible. Una forma de realización de dicho constructo poxvírico recombinante es el vT199 de la variolovacuna tal como se representa en la Figura 4B que comprende un gen lacZ como marcador elegible.
En una forma de realización de la presente invención un virus recombinante de la viruela aviar comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7.1 bajo el control del activador poxvírico sE/L, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 13, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 7.5K. Un ejemplo de dicha forma de realización es el vT222 del virus de la viruela aviar tal como se representa en la Figura 4A. Un virus recombinante de la viruela aviar puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno seleccionado, el CEA, bajo el control del activador poxvírico 40K y una secuencia de ácido nucleico que codifica el marcador elegible lacZ bajo el control del activador poxvírico C1. Un ejemplo de dicha forma de realización es el vT194 del virus de la viruela aviar tal como se representa en la Figura 4B.
En una forma de realización, un virus recombinante de la viruela aviar comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una antígeno MUC-1 asociado a un tumor o una parte del mismo bajo el control del activador poxvírico 40K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 30K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 13, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7.1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico sE/L, tal como se representa en la Figura 14C. El virus recombinante de la viruela aviar puede comprender un ácido nucleico.
En otra forma de realización, un virus recombinante de la viruela aviar comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno MUC-1 asociado a un tumor o una parte del mismo bajo el control del activador poxvírico 40K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 30K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico 13, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7.1 o una parte de la misma bajo el control del activador poxvírico sE/L, tal como se representa en la Figura 14C. El virus recombinante de la viruela aviar puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier antígeno asociado a un tumor o parte del mismo y secuencias de ácido nucleico que codifiquen LFA-3, ICAM-1 y B7.1, bajo el control de múltiples activadores, tal como se representa en la Figura 4D.
Otra forma de realización de la presente invención es un vector recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican los homólogos humanos de las moléculas coestimulantes LFA-3, B7 y ICAM-1. El vector recombinante puede proporcionar, además, los activadores apropiados para permitir la expresión de cada secuencia en una célula anfitriona infectada. Una forma de realización del vector recombinante es el vT224 representado en la Figura 9.
La presente invención proporciona vectores plasmídicos que comprenden una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica tres moléculas coestimulantes. En una forma de realización, las secuencias exógenas de ácido nucleico se seleccionan de modo que codifiquen tres moléculas coestimulantes seleccionadas de entre el grupo que comprende las B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L y similares. En una forma de realización de la presente invención, se proporcionan los vectores plasmídicos que comprenden una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica la molécula coestimulante B7, una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica la molécula coestimulante ICAM-1 y una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica la molécula coestimulante LFA-3. Los vectores plasmídicos de la presente invención proporcionan, además, por lo menos una secuencia activadora para controlar la expresión de las moléculas coestimulantes. En una forma de realización preferida cada secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula coestimulante se encuentra controlada por una secuencia activadora discreta independiente. Para utilizar en la realización de un poxvirus recombinante, los vectores plasmídicos de la presente invención proporcionan, además, secuencias flanqueadoras de ácido nucleico vírico de una región no esencial del genoma poxvírico. Las secuencias flanqueadoras de ácido nucleico vírico dirigen la inserción de las secuencias exógenas en el genoma poxvírico original mediante recombinación homóloga. Los vectores plasmídicos de la presente invención pueden comprender, además, uno o más marcadores elegibles para seleccionar e identificar la descendencia recombinante que comprende el ADN exógeno insertado tal como resulta conocido en la técnica comprendiendo, pero sin limitarse a los mismos, la gama de genes anfitriones K1L de la variolovacuna, el gen lacZ de E. coli, genes de resistencia a antibióticos, el gen que codifica la \beta-glucuronidasa y similares.
En una forma de realización, el vector plasmídico de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 bajo el control del activador 30K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 bajo el control del activador 13 y una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7 bajo el control del activador sE/L, flanqueadas por partes de la región Hind III M del genoma de la variolovacuna. En una forma de realización, el vector plasmídico es el representado en la Figura 1 como pT5032.
Otra forma de realización, el vector plasmídico de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7 bajo el control del activador sE/L, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 bajo el control del activador 13 y una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1 bajo el control del activador 7.5K. El vector plasmídico puede comprender además el gen lacZ o una parte del mismo activado por una secuencia activadora distinta. Dichas secuencias se encuentran flanqueadas por partes de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. Una forma de realización particular del vector plasmídico se representa como pT5047 en la Figura 2.
En otra forma de realización, el vector plasmídico comprende en combinación secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas B7, ICAM-1, y LFA-3, una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. Se proporciona un activador para controlar la expresión del antígeno seleccionado. Una forma de realización particular del vector plasmídico se representa como pT5031 en la Figura 3 y comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno seleccionado CEA.
En otra forma de realización particular, el vector plasmídico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a los tumores, CEA, bajo el control del activador 40K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la B7 bajo el control del activador sE/L, una secuencia de ácido nucleico que codifica la LFA-3 bajo el control del activador 13 y una secuencia de ácido nucleico que codifica la ICAM-1. El vector plasmídico puede comprender además el gen lacZ bajo el control del activador C1 tal como se representa en la Figura 6 como pT5049. El plásmido pT5049, se depositó en la American Type Culture Collection ("Colección americana de tipos de cultivo"), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 el 13 de noviembre de 1998 con el nº de registro ATCC 203481 bajo las condiciones del Tratado de Budapest.
En otra forma de realización adicional del vector plasmídico, dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula huLFA-3 bajo el control del activador 30K, una secuencia de ácido nucleico que codifica la huICAM-1 bajo el control del activador 13 y una secuencia de ácido nucleico que codifica la huB7 bajo el control del activador sE/L. Una forma de realización particular del vector plasmídico se representa como pT5064 en la Figura 8 y se depositó en la ATCC el 13 de noviembre de 1998 con el nº de registro ATCC 203482 bajo las condiciones del Tratado de Budapest.
El vector plasmídico de la presente invención se puede proporcionar en forma de kit para utilizar en procedimientos de generación de vectores recombinantes. El kit puede proporcionar, además, un virus original y otros reactivos utilizados en el proceso de recombinación.
La presente invención proporciona, además, procedimientos para generar poxvirus recombinantes que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican tres moléculas coestimulantes. Otro procedimiento para generar poxvirus recombinantes se alcanza mediante la recombinación homóloga in vivo entre el ADN del genoma poxvírico original y un vector plasmídico que comprende las secuencias heterólogas a incorporar tal como se describe en la patente US nº 5.093.258. Los vectores plasmídicos utilizados para incorporar secuencias exógenas en poxvirus se construyen mediante procedimientos estándar de tecnología de recombinación de ADN (36). Los vectores plasmídicos comprenden uno o más genes exógenos quiméricos, comprendiendo cada un activador poxvírico enlazado a una secuencia que codifica una proteína, flanqueada por secuencias víricas de una región no esencial del genoma poxvírico. Se realiza la transfección del plásmido a células infectadas con el poxvirus original utilizando procedimientos de transfección habituales en la técnica, y la recombinación entre las secuencias poxvíricas del plásmido y el ADN correspondiente del genoma vírico original producen la incorporación en el genoma vírico de los genes exógenos quiméricos del plásmido. Los virus recombinantes se seleccionan y se purifican utilizando cualquiera de una pluralidad de sistemas de selección o de identificación sistemática, tal como resulta conocido en la técnica (14). La incorporación de genes exógenos en el genoma de la variolovacuna se confirma mediante el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La expresión de los genes exógenos se demuestra mediante un análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Un procedimiento alternativo de generación de poxvirus recombinantes se alcanza mediante la ligación directa (Pleiderer et al., J. Gen. Virol. 76: 2957-2962, 1995; Merchlinsky et al., Virol. 238: 444-451, 1997).
La utilización del vector recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes en combinación con una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo del mismo, y aumenta la respuesta inmunitaria contra las células que expresan el antígeno seleccionado o epítopo del mismo. La magnitud de la respuesta inmunitaria contra el antígeno seleccionado, epítopo o células que expresan el antígeno seleccionado obtenidas utilizando el vector recombinante de la presente invención resulta significativamente superior a la conseguida utilizando sistemas que emplean una molécula coestimulante simple o doble.
El vector recombinante codifica tres moléculas coestimulantes en combinación con una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno seleccionado o un epítopo del mismo para proporcionar una respuesta inmunitaria sinérgica contra el antígeno seleccionado o epítopo del mismo. En una forma de realización, un poxvirus recombinante proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas B7, ICAM-1 y LFA-3, junto con una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. En algunos casos puede resultar beneficioso proporcionar más de una secuencia de ácido nucleico para proporcionar tres antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos con el propósito de obtener una vacuna polivalente.
El antígeno seleccionado, tal como se utiliza en la presente memoria, es un antígeno o epítopo inmunitario del antígeno que resulta crucial en el reconocimiento inmunitario y la eliminación final o control del agente que provoca el trastorno o la condición patológica de un mamífero. El reconocimiento inmunitario puede ser celular y/o humoral. En el caso de los patógenos intracelulares y del cáncer, el reconocimiento inmunitario es preferentemente una respuesta de los linfocitos T.
El antígeno seleccionado se puede obtener o aislar a partir de un microorganismo patógeno tal como los virus que comprenden el VIH (Korber et al., editores, HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1977), la gripe, el herpes común, el papilomavirus humano (patente US nº 5.719.054), la hepatitis B (patente US nº 5.780.036), la hepatitis C (patente US nº 5.709.995), el EBV, el citomegalovirus (CMV) y similares. El antígeno seleccionado se puede obtener o aislar a partir de bacterias patógenas tales como Chlamydia (patente US nº 5.869.608), Mycobacterium, Legionella, meningococos, estreptococos del grupo A, Salmonella, Listeria, Hemophilus influenzae (patente US nº 5.955.596) y similares. Dicho antígeno seleccionado puede ser un antígeno específico de tumores, un antígeno asociado a tumores (TAA) o un antígeno con especificidad tisular, un epítopo de los mismos, y un epítopo agonista de los mismos. Dichos antígenos seleccionados comprenden, pero sin limitarse a los mismos, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y epítopos del mismo tales como los CAP-1, CAP-1-6D (46) y similares (nº de registro en GenBank M29540), MART-1 (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347-352, 1994), MAGE-1 (patente US nº 5.750.395), MAGE-3, GAGE (patente US nº 5.648.226), GP-100 (Kawakami et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 91: 6458-6462, 1992), MLTC-1, MUC-2, el oncogén ras con mutaciones puntuales, oncogenes p53 normales y con mutaciones puntuales (Hollstein et al., Nucleic Acids Res. 22: 3551-3555, 1994), PSMA (Israeli et al., Cancer Res. 53: 227-230, 1993), la tirosinasa (Kwon et al., PNAS 84: 7473-7477, 1987, TRP-1 (gp75) (Cohen et al., Nucleic Acid Res. 18: 2807-2808, 1990; patente US nº 5.840.839), NY-ESO-1 (Chen et al., PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2 (Jackson et al., EMBOJ, 11: 527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erbB2 (patente US nº 5.550.214), BRC-I, BRC-II, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, modificaciones de los TAA y de antígenos con especificidad tisular, variantes de empalme de los TAA, epítopos agonistas, y similares. Se pueden identificar, aislar y clonar otros TAA mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en la patente US nº 4.514.506. El antígeno seleccionado puede comprender también uno o más factores de crecimiento y variantes de empalme de los mismos.
Los posibles antígenos de tumores humanos y antígenos con especificidad tisular así como los epítopos inmunitarios de los mismos para un uso selectivo en la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los ilustrados a título de ejemplo en la Tabla 1.
TABLA 1 Antígenos y epítopos reconocidos por los linfocitos T
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En el caso de los organismos que comprenden un genoma de ADN, a partir del ADN genómico se aísla un gen que codifica un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo de interés. En el caso de los organismos que comprenden un genoma de ARN, el gen que se pretende se puede aislar a partir de copias del genoma en forma de ADNc. Si se encuentra disponible la cartografía de restricción del genoma, el fragmento de ADN que comprende el gen de interés se procede a la escisión mediante la digestión con una endonucleasa de restricción siguiendo procedimientos habituales en la técnica. En aquellos casos en los que el gen que se pretende ha sido clonado previamente, los genes se pueden obtener fácilmente a partir de los clones disponibles. Alternativamente, si se conoce la secuencia de ADN del gen, dicho gen se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas convencionales de síntesis de ácidos desoxirribonucleicos.
Los genes que codifican un antígeno de interés se pueden amplificar al clonar el gen en una bacteria anfitriona. Con este propósito se pueden utilizar diversos vectores de clonación procariotas. A título de ejemplo se pueden mencionar el pBR322, el pUC y el pEMBL.
Los genes que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo se pueden preparar para su inserción en los vectores plasmídicos diseñados para la recombinación con un virus mediante técnicas estándar. En general, los genes clonados se pueden escindir del vector de clonación procariota mediante la digestión con enzimas de restricción. En la mayoría de los casos, el fragmento escindido comprenderá la región entera que codifica el gen. El fragmento de ADN que comprende el gen clonado se puede modificar según se necesite, por ejemplo, para hacer que los extremos del fragmento sean compatibles con las zonas de inserción de los vectores de ADN utilizados en la recombinación con un virus, a continuación se purifica antes de su inserción en los vectores en las zonas de escisión de la endonucleasa de restricción (zonas de clonación) tal como se describe en la presente memoria.
Se pueden tratar o prevenir diversas enfermedades utilizando la presente invención y comprenden enfermedades provocadas por virus, bacterias, levaduras, parásitos, protozoos, células cancerosas y similares. El vector recombinante que comprende tres moléculas coestimulantes se puede utilizar como un potenciador inmunitario generalizado y resulta útil en el tratamiento de enfermedades con una etiología desconocida.
Los trastornos preneoplásicos o hiperplásicos que se pueden tratar o prevenir utilizando un vector recombinante de la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, trastornos preneoplásicos o hiperplásicos tales como los pólipos del colon, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, las lesiones mamarias y similares.
Los cánceres que se pueden tratar utilizando el vector recombinante de la presente invención comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los melanomas primarios o metastásicos, los adenocarcinomas, los carcinomas espinocelulares, los carcinomas adenoescamosos, los timomas, los linfomas, los sarcomas, el cáncer de pulmón, el cáncer de hígado, los linfomas que no son linfomas de Hodgkin, los linfomas de Hodgkin, las leucemias, el cáncer de útero, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de ovarios, el cáncer de páncreas, el cáncer de colon, los mielomas triples, los neuroblastomas, el carcinoma nasofaríngeo (NPC), el cáncer de vejiga, el cáncer de cuello uterino y similares.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los tres genes que codifican una molécula coestimulante forman parte del vector recombinante y se pueden seleccionar de entre el grupo que codifica las moléculas B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L y similares. El vector recombinante puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo. En otra forma de realización, la composición farmacéutica comprende un primer vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes, un segundo vector recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La administración de la composición proporciona unas células anfitrionas con los genes exógenos que codifican las tres moléculas coestimulantes.
En una forma de realización, una composición farmacéutica comprende un poxvirus recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes en un excipiente farmacéuticamente aceptable. El poxvirus recombinante pueden comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo o, alternativamente, se puede proporcionar un segundo poxvirus recombinante que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un poxvirus recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas B7.1 a B7.2, una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula ICAM-1 y una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula LFA-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptables. Aparte del constructo de las moléculas B7, ICAM-1 y LFA-3, el poxvirus recombinante de la composición farmacéutica puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo o se puede proporcionar mediante un segundo poxvirus recombinante una secuencia de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo.
La composición farmacéutica puede comprender también moléculas inmunoestimulantes de origen exógeno que resultan conocidas en la técnica y que comprenden las moléculas coestimulantes B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L y similares y/o citocinas y quimiocinas que comprenden, pero sin limitarse a las mismas, las moléculas IL2, GM-CSF, TNF\alpha, IFN\gamma, IL-12, RANTES, MIP-1\alpha, Flt-3L (patentes US nº 5.554.512; 5.843.423) y similares para una sinergia adicional o un aumento de la respuesta inmunitaria. En la composición se pueden proporcionar las citocinas y las quimiocinas directamente o, alternativamente, las citocinas y las quimiocinas se pueden proporcionar mediante un vector vírico recombinante que codifique la citocina o la quimiocina.
La presente invención comprende también procedimientos de tratamiento o prevención de una enfermedad causada por microorganismos patógenos o por el cáncer descritos en la presente memoria.
En el procedimiento o tratamiento, la administración del vector recombinante de la presente invención se puede realizar tanto como con un propósito "preventivo" como "terapéutico". Cuando se administra preventivamente, el vector recombinante de la presente invención se proporcionas antes de que se presente cualquier síntoma. La administración preventiva del vector recombinante sirve para prevenir o mejorar cualquier infección o enfermedad posteriores. Cuando se administra terapéuticamente, el vector recombinante se proporciona cuando se presentan los síntomas de infección o enfermedad, o posteriormente. Por lo tanto, la presente invención se puede proporcionar antes de la exposición prevista al agente que provoca la enfermedad o estado patológico o tras el inicio de la infección o enfermedad.
El término "envase personalizado" correspondiente al inóculo se refiere a unidades físicas discretas adecuadas como dosis unitarias para mamíferos, comprendiendo cada unidad una cantidad predeterminada de vector recombinante calculada para producir el efecto inmunitario pretendido junto con el diluyente requerido. Las especificaciones del nuevo envase personalizado de un inóculo de la presente invención vienen estipuladas por y depende de las características específicas del virus recombinante y del efecto inmunitario particular a alcanzar.
El inóculo se prepara habitualmente en una disolución en un diluyente tolerable (aceptable) tal como una disolución salina, una disolución salina amortiguadora de fosfato u otro diluyente fisiológicamente tolerable y similares para formar una composición farmacéutica acuosa.
La vía de inoculación puede ser la escarificación, la intravenosa (I.V.), la intramuscular (I.M.), la subcutánea (S.C.), la intradérmica (I.D.), la intraperitoneal (I.P.), la intratumoral y similares, que tiene como resultado la provocación de una respuesta protectora contra el agente que causa la enfermedad. La dosis se administra por lo menos una vez. Las dosis posteriores se pueden administrar según indicación.
En una forma de realización, se utilizan las estrategias de aumento de la sensibilidad (prime-boost). En un ejemplo, el anfitrión se inmuniza por lo menos una vez con un primer vector tal como un vector basado en los ácidos nucleicos. Se realizan posteriores inmunizaciones con un vector poxvírico. En otro ejemplo, en primer lugar se inmuniza el anfitrión con un primer vector poxvírico y a continuación con un segundo vector poxvírico de un género distinto.
Al proporcionar un vector recombinante de la presente invención a un mamífero, preferentemente un ser humano, la dosis administrada del vector recombinante variará en función de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado clínico general, el historial médico previo, el progreso de la enfermedad, la masa tumoral y similares del mamífero.
En general, se pretende proporcionar al receptor una dosis del virus recombinante comprendida entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de calvas, aunque se puede administrar una dosis inferior o superior.
La definición genética de asociado antígenos asociados a un tumor o específicos de un tumor permite el desarrollo de vacunas específicas de un antígeno seleccionado en el tratamiento del cáncer. La incorporación del gen de un antígeno tumoral en el genoma de poxvirus recombinantes en combinación con genes que codifican tres moléculas coestimulantes constituye un sistema potente para provocar una respuesta inmunitaria específica con respecto a la prevención en pacientes con un mayor riesgo de desarrollo de un cáncer (inmunización preventiva), para reducir tumores antes de una intervención quirúrgica, para prevenir recaídas en enfermedades tras una intervención quirúrgica primaria (vacunación antimetastásica), o para aumentar el número de linfocitos citotóxicos (CTL) in vivo, aumentando de este modo su eficacia en la eliminación de tumores difusos (tratamiento de una enfermedad confirmada). Los virus recombinantes de la presente invención pueden provocar una respuesta inmunitaria ex vivo en linfocitos autógenos (CD8^{+}), linfocitos T citotóxicos y/o linfocitos T auxiliares (CD4^{+}) o linfocitos NK antes de transferirlo al paciente que presenta el tumor (inmunoterapia adoptiva).
En los tratamientos contra el cáncer, los vectores recombinantes se pueden administrar a un mamífero tanto antes de cualquier indicio de cáncer tal como un adenocarcinoma como intervenir en la remisión de la enfermedad de un mamífero afectado de un cáncer tal como un adenocarcinoma.
En función de la enfermedad o trastorno a tratar y del procedimiento de tratamiento, el vector recombinante puede comprender o no una secuencia de ácido nucleico que codifique un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo además de los genes que codifican tres moléculas coestimulantes. El antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo puede proporcionarse de un modo endógeno por parte de la célula anfitriona infectada por el vector recombinante tal como, por ejemplo, una célula tumoral puede expresar de un modo endógeno un antígeno asociado a un tumor o un epítopo del mismo y puede no requerir la adición de un gen exógeno que codifique un antígeno asociado a un gen exógeno. En el caso en el que no se encuentre presente un antígeno asociado a un tumor, no se exprese o se exprese en unos niveles bajos en una célula anfitriona, se puede proporcionar un gen exógeno que codifique un antígeno exógeno asociado a un tumor. Además, se pueden proporcionar genes que codifican distintos antígenos asociados a tumores. El gen exógeno que codifica un antígeno exógeno asociado a un tumor se puede proporcionar mediante el mismo vector recombinante que comprende los genes que codifican tres moléculas coestimulantes o se puede proporcionar mediante un segundo vector recombinante mezclado con el primer vector
recombinante.
Los ejemplos de procedimientos para administrar el vector recombinante en mamíferos comprende, pero sin limitarse a los mismos, la exposición de las células tumorales al virus recombinante ex vivo o la inyección del vector recombinante en el anfitrión afectado mediante la administración S.C., I.D. o I.M. del virus. Alternativamente, el vector recombinante o combinación de vectores recombinantes se pueden administrar localmente mediante la inyección directa en la lesión cancerosa o tumor o mediante la aplicación tópica en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La cantidad de vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de uno o más antígenos asociados a tumores (TAA) en combinación con las secuencias de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes a administrar se basa en la valoración cuantitativa (titulación) de las partículas víricas. Se prefiere una administración del inmunógeno comprendida entre 10^{5} y 10^{10} partículas víricas por mamífero, preferentemente un ser humano. Si el mamífero a inmunizar se encuentra ya afectado por un cáncer o un cáncer metastásico, se puede administrar la vacuna junto con otros tratamientos terapéuticos.
En un procedimiento, se pueden obtener linfocitos citotóxicos autógenos o linfocitos tumor-infiltrantes a partir de la sangre, ganglios linfáticos, tumores o similares de un paciente con cáncer. Los linfocitos se hacen proliferar en un cultivo y se aumenta el número de linfocitos específicos de un antígeno seleccionado al realizar el cultivo en presencia de un antígeno seleccionado específico y tanto las células que presentan el antígeno que expresan tres moléculas exógenas coestimulantes como las APC activadas con el antígeno seleccionado de la presente invención. Los linfocitos específicos del antígeno seleccionado se administran de nuevo al paciente mediante venoclisis.
Tras la inmunización, la eficacia de la vacuna se puede determinar por la producción de anticuerpos o de células inmunitarias que reconocen el antígeno, valorándose mediante la actividad lítica específica o la producción de citocinas específicas o por la remisión tumoral. Los expertos en la materia conocen los procedimientos convencionales de determinación de los parámetros mencionados anteriormente.
La presente invención comprende procedimientos para aumentar las respuestas de los linfocitos T específicas de un antígeno mediante la administración de una cantidad eficaz de un vector recombinante que codifica tres moléculas recombinantes y un antígeno seleccionado en un mamífero individual, o infectar una célula seleccionada con el vector, un antígeno seleccionado o u epítopo inmunitario del mismo. En una forma de realización del procedimiento, un vector recombinante que codifica la molécula de la familia B7, ICAM-1 y LFA-3 se administra solo o mezclado con un dianocito, un antígeno seleccionado o u epítopo inmunitario del mismo. El sistema de inmunización aumenta o mejora las respuestas inmunitarias generadas mediante el antígeno seleccionado, proporcionando una respuesta sinérgica en comparación con la utilización de moléculas coestimulantes simples o dobles. El procedimiento de administrar un vector recombinante que comprende genes que codifican tres moléculas coestimulantes tiene como resultado una mayor multiplicación de los linfocitos específicos de un antígeno, una mayor actividad citolítica, una mayor secreción de citocinas y una inmunidad de mayor duración contra el antígeno seleccionado si se compara con la utilización de un vector recombinante que codifique una molécula coestimulante simple o doble. El vector recombinante puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifique por lo menos un antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo para un aumento sinérgico de las respuestas inmunitarias específicas de un antígeno seleccionado. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo la proporciona un segundo vector recombinante, distinto del vector que codifica las tres moléculas inmunitarias. En una forma de realización del procedimiento de aumento de las respuestas de los linfocitos T específicas de un antígeno, los mamíferos, preferentemente seres humanos, se inmunizan con un constructo del epítopo rV-VIH-1//B7-l/ICAM-l/LFA-3. Se puede realizar el seguimiento de la eficacia del tratamiento in vitro y/o in vivo determinando la multiplicación de los linfocitos específicos del antígeno seleccionado, la respuesta citolítica específica del antígeno seleccionado, las respuestas clínicas, etcétera.
El procedimiento de aumento de las respuestas de los linfocitos T específicos de un antígeno se puede utilizar para cualquier antígeno seleccionado o epítopo inmunitario del mismo. Resultan de particular interés los antígenos asociados a tumores, los antígenos con especificidad tisular y los antígenos de agentes infecciosos.
Adicionalmente a la administración del vector recombinante al paciente, se pueden administrar otros agentes exógenos de ajuste de la respuesta inmunitaria o moléculas immunoestimulantes, fármacos de quimioterapia, antibióticos, fármacos antifúngicos, fármacos antivíricos y similares, solos o combinados entre sí, en función del trastorno a tratar. Los ejemplos de otros agentes de origen exógeno comprenden las IL-2, IL-6 exógenas, el \alpha, \beta y \gamma interferón, el GM-CSF, el factor de necrosis tumoral, la Flt-3L, la ciclofosfamida, el cisplatino, el ganciclovir, la amfotericina B, el fluorouracilo 5 y similares.
La presente invención proporciona células anfitrionas que expresan tres moléculas exógenas coestimulantes en las que las moléculas las proporciona un vector recombinante que presenta secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes. Las células anfitrionas expresan también uno o más antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos o se pueden genomanipular para expresar uno o más antígenos exógenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos que han sido proporcionados también por el vector recombinante que codifica las tres moléculas coestimulantes o por un segundo vector recombinante.
Las células anfitrionas de la presente invención, útiles en la estimulación de una respuesta inmunitaria específica de un antígeno, pueden ser cualquier célula con capacidad de infección al utilizar el virus recombinante de la presente invención y con capacidad de expresar tres moléculas exógenas coestimulantes y que se puedan genomanipular para expresar uno o más antígenos exógenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos. Dichas células anfitrionas comprenden, pero sin limitarse a las mismas, las células tumorales, las células que presentan antígenos, tales como las PBMC, las células dendríticas, las células de la piel o musculares, y similares. Las células que presentan antígenos comprenden, pero sin limitarse a las mismas, los monocitos, los macrófagos, las células dendríticas, las células precursoras de las células dendríticas, las células de Langerhans, los esplenocitos, los linfocitos B, las células tumorales, las células musculares, las células epiteliales y similares.
En una forma de realización, las células anfitrionas son células tumorales en las que dichas células tumorales se exponen al vector recombinante in situ o in vivo para provocar la expresión de tres moléculas extrañas o exógenas coestimulantes en las células tumorales. Las células tumorales pueden expresar un antígeno seleccionado endógeno o las células tumorales se pueden genomanipular además para expresar un antígeno seleccionado tal como un TAA o un epítopo inmunitario del mismo. Las células tumorales que expresan los TAA junto con tres moléculas inmunoestimulantes se administran a un mamífero en una cantidad eficaz para provocar la remisión o eliminación tumoral en el mamífero afectado de cáncer.
La presente invención proporciona también células precursoras de las células dendríticas, células dendríticas (DC), subpoblaciones de DC y derivados de las mismas que hiperexpresan tres moléculas coestimulantes en las que tres moléculas coestimulantes se proporcionan de un modo exógeno por parte de un vector recombinante que presenta secuencias de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes, las células precursoras de las DC y las DC de la presente invención expresan unos niveles superiores de moléculas coestimulantes a los niveles expresados de un modo endógeno por células precursoras de las DC y por las DC sin tratar. Las APC tales como las células precursoras de las células dendríticas y las células dendríticas pueden expresar también uno o más antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos o un antígeno exógeno seleccionado se puede proporcionar por parte de un vector recombinante que codifique tres moléculas coestimulantes o por parte de un segundo vector recombinante. La presente invención proporciona, además, procedimientos de utilización de las APC que hiperexpresan las tres moléculas coestimulantes y la células dendríticas que hiperexpresan las tres moléculas coestimulantes en la activación de los linfocitos T in vivo o in vitro para la vacunación y las respuestas inmunoterápicas contra uno o más dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos.
Las APC tales como las células precursoras de las células dendríticas, las células dendríticas, subpoblaciones de DC y derivados de las mismas obtenidas a partir de una fuente se someten a infección, transfección o transducción con un vector recombinante que comprende genes exógenos que codifican tres moléculas coestimulantes durante un período de tiempo suficiente para permitir la hiperexpresión funcional de las tres moléculas coestimulantes. Dicho antígeno que hiperexpresa múltiples moléculas coestimulantes que presentan las células precursoras de las células dendríticas y las células dendríticas puede activarse o incubarse asimismo con por lo menos un dianocito, un lisado de dianocitos, membranas de dianocitos, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo, o con ARN o ADN de por lo menos un dianocito, y administrarse a una especia en una cantidad suficiente para activar respuestas significativas de los linfocitos T in vivo. En otra forma de realización, el antígeno que presentan las células precursoras de las células dendríticas y las células dendríticas expresan, además, por lo menos un antígeno exógeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
Las células anfitrionas que expresan tres moléculas exógenas coestimulantes se pueden proporcionar en una dosis comprendida entre 10^{3} células y 10^{9} células. Las vías de administración que se pueden utilizar comprenden la intravenosa, la subcutánea, la intralinfática, la intratumoral, la intradérmica, la intramuscular, la intraperitoneal, la intrarrectal, la intravaginal, la intranasal, la oral, mediante la instilación de la vejiga, mediante escarificación, etcétera.
En una forma de realización, el antígeno que hiperexpresa las tres moléculas coestimulantes que presentan las células precursoras de las células dendríticas o las células dendríticas se exponen a un dianocito, un lisado de dianocitos, membranas de dianocitos, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo, o con ARN o ADN de por lo menos un dianocito in vitro e incubarse con linfocitos sensibilizados o sin sensibilizar para activar las respuestas significativas de los linfocitos T in vitro. Los linfocitos T activados solos o en combinación con las células precursoras de las DC o con las DC se administran a continuación a una especia tal como el ser humano para su vacunación o inmunoterapia contra un dianocito, un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo. En un procedimiento de utilización, las células precursoras de las células dendríticas o las células dendríticas se utilizan ventajosamente para provocar una respuesta inmunoterápica de inhibición del crecimiento contra las células cancerosas.
En otra forma de realización, las células que presentan el antígeno que hiperexpresa las tres moléculas coestimulantes, preferentemente células precursoras de las DC o DC se fusiona con un dianocito que expresa un antígeno seleccionado apropiado o un epítopo inmunitario del mismo para formar una heterocariota de una APC y un dianocito mediante procedimientos conocidos en la técnica (Gong, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 6279-6283, 1998). Dicha célula de fusión o célula quimérica APC/célula del antígeno seleccionado expresa tanto las tres moléculas coestimulantes como el antígeno seleccionado o epítopos inmunitarios del mismo. En una forma de realización preferida, el dianocito es una célula hiperplásica, precancerosa o cancerosa. La célula quimérica APC/célula del antígeno seleccionado se puede utilizar tanto in vivo como in vitro para aumentar las respuestas inmunitarias de los linfocitos T y B.
Las células precursoras de las células dendríticas se obtienen a partir de la médula ósea, de la sangre de la circulación general y de los ganglios linfáticos de un paciente. El paciente se puede haber vacunado o tratado previamente con un compuesto tal como el Ftl-3L para aumentar el número de ganglios linfáticos que presentan el antígeno, el timo así como el aparato circulatorio que comprende la sangre y la linfa (células ocultas). La sangre del cordón umbilical constituye otra fuente de células dendríticas.
Las células dendríticas se pueden reforzar o aislar para utilizar en la presente invención utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en la patente US nº 5.788.936. Una vez se han obtenido las células precursoras de las células dendríticas, las células dendríticas y las derivadas de las mismas, se cultivan bajo unas condiciones de cultivo apropiadas para multiplicar la población celular y/o mantener las células en un estado óptimo para su infección, transfección o transducción mediante un vector recombinante y para la asimilación, proceso y exposición óptimos de un antígeno seleccionado. Resulta particularmente ventajoso para mantener el estado de madurez adecuado de las células dendríticas cultivadas in vitro es la presencia de tanto el factor estimulante del crecimiento de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) como de la interleucina 4 (IL-4). Las subpoblaciones de células dendríticas se pueden aislar en función de la adherencia y/o el grado de madurez basándose en marcadores de la superficie celular. El fenotipo de las células precursoras de las DC, las DC y las subpoblaciones de las mismas se describen en Banchereau y Steinman Nature 392: 245-252, 1998.
En una forma de realización, se proporcionan el GM-CSF y la IL-4 en una concentración de aproximadamente 500 unidades/ml durante un período de aproximadamente 6 días (41, 42). En otra forma de realización, las moléculas TNF\alpha y/o CD40 se utilizan para provocar la maduración de las células precursoras de las DC o de las DC.
Las células precursoras de las células dendríticas o las células dendríticas se pueden obtener a partir de pacientes a tratar y que resultan autógenos en términos de antígenos HLA relacionados o las células se pueden obtener a partir de pacientes cuyos antígenos HLA relacionados (tanto de la clase I como de la II, por ejemplo, HLA-A, B, C y DR) corresponden con los del paciente a tratar, Alternativamente, las células precursoras de las células dendríticas se genomanipulan para expresar los antígenos HLA relacionados apropiados del paciente que se somete al tratamiento.
Las células precursoras de las células dendríticas se pueden manipular genéticamente aún más para aumentar su esperanza de vida mediante procedimientos tales como la transformación con EBV tal como se describe en la patente US 5.788.963.
Las células dendríticas y las precursoras de las mismas se pueden proporcionar en forma de cuna composición farmacéutica en un medio farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender, además, un dianocito, lisados de dianocitos, membranas de dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos. La composición puede comprender citocinas y/o quimiocinas tales como la IL-4 y GM-CSF para un aumento sinérgico adicional de una respuesta inmunitaria.
En otra forma de realización, las APC de la presente invención que hiperexpresan tres moléculas coestimulantes resulta útiles en procedimientos de análisis de la eficacia de una vacuna mediante la determinación de la multiplicación y la función de los linfocitos específicos de un antígeno. En dicho procedimiento, se obtienen los linfocitos a partir de un paciente que se ha vacunado con un lisado de dianocitos, membranas de dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos. Se cultivan in vitro los linfocitos con APC de la presente invención en presencia del dianocito, un lisado de dianocitos, membranas de dianocitos, antígenos seleccionados o epítopos inmunitarios de los mismos y se determina el aumento de los valores y las funciones de los linfocitos específicos de un antígeno mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un aumento de los valores y/o funciones indica la eficacia de la vacuna. El procedimiento resulta particularmente útil para determinar la eficacia de vacunas peptídicas en la estimulación de una respuesta inmunitaria apropiada.
En otra forma de realización, las APC de la presente invención que expresan tres moléculas exógenas coestimulante resultan útiles en un procedimiento de detección sistemática de nuevos péptidos inmunógenos a partir de una pluralidad de péptidos. En el procedimiento de detección sistemática, las células que presentan el antígeno infectadas con un vector recombinante que codifica tres moléculas coestimulantes o partes funcionales de las mismas se activan con una pluralidad de péptidos para formar células que presentan el antígeno activadas con un péptido. Las células que presentan el antígeno activadas con un péptido se incuban con células linfáticas y se determina la respuesta inmunitaria de las células linfáticas. Un incremento de la respuesta inmunitaria de las células linfáticas en presencia de las APC activadas con un péptido indica una respuesta específica antigénica contra el péptido. El péptido que provoca la respuesta incrementada se puede identificar mediante elución a partir del tumor, mediante análisis de enlace HLA, etc. La fuente de la pluralidad de péptidos puede ser una genoteca combinatoria que exprese una pluralidad de péptidos aleatorios. La respuesta inmunitaria incrementada puede ser humoral o una respuesta inmunitaria en la que intervienen células y se puede determinar utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica tales como la multiplicación provocada por un antígeno, la citotoxicidad, la secreción de anticuerpos, la transducción de señales, y similares. Los péptidos nuevos identificados se pueden utilizar como antígenos, vacunas o agentes de diagnóstico. Las proteínas que comprenden los péptidos se pueden identificar mediante genotecas de sustracción y técnicas genéticas de visualización diferencial.
Los vectores recombinantes de la presente invención, así como las células anfitrionas sometidas a infección, transfección o inducción mediante el vector recombinante de la presente invención resultan útiles en procedimientos de estimulación y de aumento de la respuesta humoral tanto in vivo como in vitro. Dicho aumento de la respuesta humoral puede ser de naturaleza monoclonal o policlonal. El aumento de las respuestas humorales utilizando tres moléculas coestimulantes es sinérgico en comparación con una respuesta humoral utilizando una molécula coestimulante simple o doble. El aumento sinérgico de una respuesta humoral se puede determinar mediante una mayor multiplicación y/o secreción de citocinas por parte de los linfocitos T CD4^{+}, una mayor multiplicación o producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B, una mayor toxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC), una mayor lisis en la que interviene el complemento, etcétera. Los anticuerpos producidos utilizando los vectores recombinantes de la presente invención o utilizando células sometidas a infección, transfección o inducción por parte del vector recombinante de la presente invención se espera que presenten una afinidad y/o avidez superiores y una valoración cuantitativa superior a los anticuerpos producidos mediante procedimientos estándar. Los anticuerpos producidos mediante procedimientos que utilizan el vector recombinante pueden reconocer epítopos seleccionados inmunodominantes o epítopos seleccionados no dominantes.
La presente invención comprende, además, un anticuerpo o anticuerpos obtenidos mediante la inmunización con el vector recombinante de la presente invención. El anticuerpo presenta especificidad y reacciona o se enlace con el antígeno seleccionado o epítopo inmunitario de interés. En esta forma de realización de la presente invención los anticuerpos son de origen monoclonal o policlonal.
Las moléculas de los anticuerpos de ejemplo son moléculas íntegras de inmunoglobulinas, moléculas de inmunoglobulinas sustancialmente íntegras o aquellas partes de una molécula de inmunoglobulina que comprende la zona de enlace con el antígeno, comprendiendo aquellas partes de las moléculas de inmunoglobulinas conocidas en la técnica como F(ab), F(ab'), F(ab')_{2} y F(v). Los anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica. (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas ["Tecnología de anticuerpos monoclonales, la producción y caracterización de hibridomas de roedores y humanos"] en Burdon et al., (editores) (1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ["Técnicas de laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular"], Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Los anticuerpos o fragmentos de enlace con los antígenos se pueden producir también por ingeniería genética. La tecnología de expresión de tanto los genes de las cadenas pesadas como los de las cadenas ligeras de E. coli constituyen el objeto de las solicitudes de patente PCT: números de publicación WO 901443, WO 901443 y WO 9014424 y en Huse et al., (1989) Science 246: 1275-
1281.
En una forma de realización, los anticuerpos de la presente invención se utilizan en inmunoanálisis para detectar el nuevo antígeno de interés en muestras biológicas.
En una forma de realización, los anticuerpos de la presente invención obtenido mediante inmunización con un virus de la variolovacuna recombinante que expresa un TAA y que expresa las moléculas B7-1, ICAM-1 y LFA-3 se utilizan para valorar la presencia de un TAA a partir de una biopsia tisular de un mamífero afectado de cáncer que expresa el TAA utilizando inmunocitoquímica. Dicha valoración de la presencia de un TAA en un tejido enfermo se puede utilizar en el pronóstico del progreso de la enfermedad afectado con la enfermedad o de la eficacia de la inmunoterapia. En esta forma de realización, los ejemplos de TAA comprenden, pero sin limitarse a los mismos, los antígenos CEA, PSA y MUC-1. Los procedimientos convencionales de inmunohistoquímica se describen en Harlow y Lane (editores) (1988) en Antibodies A Laboratory Manual ["Anticuerpos, manual de laboratorio"], Cold Spinning Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel et al., (editores) (1987), en Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (Nueva York, Nueva York).
En otra forma de realización, los anticuerpos de la presente invención se utilizan en inmunoterapia. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en inmunoterapia pasiva.
Al administrar a un paciente los anticuerpos o fragmentos de enlace con un antígeno para un mamífero receptor, preferentemente un ser humano, la dosis administrada de anticuerpos o de fragmentos de enlace con un antígeno variará en función de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado clínico general, el historial médico previo y similares del mamífero.
Se pretende administrar los anticuerpos o fragmentos de enlace con un antígeno de la presente invención a un paciente receptor en una cantidad suficiente para prevenir, reducir o paliar la gravedad, alcance o duración de la enfermedad o infección.
Los anticuerpos antidiotípicos se desarrollan habitualmente durante la evolución de las respuestas inmunitarias, y una parte del anticuerpo antidiotípico se parece al epítopo que provoca la respuesta inmunitaria original. En la presente invención, el gen de la inmunoglobulina o parte del mismo de un anticuerpo cuya zona de enlace indica un antígeno seleccionado de una condición patológica, se incorpora en el genoma o parte del mismo de un genoma vírico, solo o en combinación con un gen o parte del mismo de tres moléculas inmunoestimulantes, pudiendo el virus recombinante resultante provocar la respuesta inmunitaria celular y humoral contra el antígeno.
La descripción de las formas de realización específicas pondrán más claramente de manifiesto la naturaleza de la presente invención, que otras personas podrán modificar y/o adoptar fácilmente dichas formas de realización con diversos propósitos sin apartarse del concepto general y, por lo tanto, se entiende que dichas adaptaciones y modificaciones se encuentran dentro de un propósito y alcance equivalentes de las formas de realización descritas.
Todas las citas y patentes a las que se hace referencia se incorporan en la presente memoria como referencia.
Ejemplo 1 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-TRICOM(mu1) nº vT171
El origen del virus original de la variolovacuna es la cepa del New York City Board of Health ("Consejo de Sanidad de Nueva York") y la obtuvo Wyeth del New York City Board of Health y realizó pases en calvas para crear el cultivo de la variolovacuna. Los laboratorios Flow recibieron un frasco liofilizado del cultivo de la variolovacuna, lote 3197, pase 28, de los doctores Chanock y Moss (National Institutes of Health). Dicho virus cultivado se trató con éter y se purificaron las calvas tres veces.
Para la generación del rV-TRICOM(mul), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5032, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el gen M2L (30K), que se encuentra en la región Hind III M del genoma de la variolovacuna. El gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control transcripcional del activador 30K (M2L) de la variolovacuna (34), el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 13 de la variolovacuna (18), y el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L) (32). Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III M del genoma de la variolovacuna (véase la Figura 1). Dichas secuencias flanqueadoras comprenden los genes del anfitrión de la gama K1L de la variolovacuna (33). Se utilizó un derivado de la cepa Wyeth de la variolovacuna como virus original en la construcción del virus de la variolovacuna recombinante. Dicho virus original, denominado vTBC33, carece de un gen K1L funcional y, por lo tanto, no se consiguió eficazmente el virus mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna en el genoma del vTBC33 de la variolovacuna y las secuencias correspondientes del pT5032 de las células RK_{13} infectadas con la variolovacuna sometidas a transfección con el pT5032. El virus recombinante, denominado vT171, se seleccionó mediante el crecimiento en células RK_{13} (ATCC, CCL 37). Las calvas se seleccionaron de la monocapa celular y se hizo multiplicar aún más su descendencia. Dos series de aislamiento de calvas y de siembra en células RK13 permitieron la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT171 se ilustra en la Figura 4A.
Ejemplo 2 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-TRICOM(mu2) nº vT199
Para la generación del rV-TRICOM(mu2), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5047 para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el gen de la timidina cinasa (TK), que se encuentra en la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. El gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, el gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control transcripcional del activador 13, y el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 7.5K de la variolovacuna (39). Además, el gen lacZ de E. coli, bajo el control del activador C1 del virus de la viruela aviar (15) se incorpora como identificación de la descendencia recombinante. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna (véase la Figura 2). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de Wyeth (New York City Board of Health) de la variolovacuna como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la variolovacuna se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna de Wyeth y las secuencias correspondientes del pT5047 en células Hu143TK infectadas con la variolovacuna (Bacchetti y Graham, 1977) sometidas a transfección con el pT5047. Se identificó el virus recombinante utilizando la selección del virus TK en presencia de bromodesoxiuridina (BudR) en combinación con un análisis cromogénico, realizado en calvas víricas in situ, que detecta la expresión del producto del gen lacZ en presencia del indoíl-\beta-D-galactósido halogenado (Bluo-gal), tal como ha sido descrito previamente (31). Las calvas víricas que expresan el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT199, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. En otros virus recombinantes seleccionados y purificados de este modo, las únicas calvas que se presentaron bajo dichas condiciones selectivas fueron azules, y dichas calvas azules se aislaron y purificaron fácilmente. Sin embargo, en el caso del vT199, únicamente se observaron calvas blancas en el segundo ciclo de purificación de las calvas; no se presentaron calvas azules. Se seleccionó y se volvió a sembrar un nuevo conjunto de calvas azules; de nuevo, únicamente se observaron calvas blancas en el segundo ciclo de purificación de calvas. En un último intento utilizando aún otro conjunto de calvas azules, se produjeron tanto calvas azules como blancas tras el segundo ciclo de purificación de las calvas. Se seleccionaron las calvas azules y se volvieron a sembrar. Dos ciclos adicionales de purificación de las calvas (un total de cuatro ciclos) produjeron virus recombinantes que eran un 100% azules. La estructura génica del vT199 se ilustra en la Figura 4B.
Ejemplo 3 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-TAA/TRICOM(mu)
Para la generación del rV-TAA/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el genoma de la variolovacuna. El gen TAA, el gen LFA-3 murino, el gen ICAM-1 murino y el gen B7.1 murino se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN del genoma de la variolovacuna, en el que se incorporarán las secuencias exógenas. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna y las secuencias correspondientes del vector plasmídico en células infectadas con la variolovacuna sometidas a transfección con el vector plasmídico. Se seleccionaron las calvas recombinantes a partir de la monocapa celular bajo condiciones selectivas y se hizo multiplicar aún más su descendencia. Los ciclos adicionales de aislamiento de calvas y de nuevas siembras permitieron la purificación del virus recombinante pretendido.
Ejemplo 4 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-MUC-1/TRICOM(mu)
Para la generación del rV-MUC-1/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el genoma de la variolovacuna. El gen MUC-1, el gen LFA-3 murino, el gen ICAM-1 murino y el gen B7.1 murino se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN del genoma de la variolovacuna, en el que se incorporarán las secuencias exógenas. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna y las secuencias correspondientes del vector plasmídico en células infectadas con la variolovacuna sometidas a transfección con el vector plasmídico. Se seleccionaron las calvas recombinantes a partir de la monocapa celular bajo condiciones selectivas y se hizo multiplicar aún más su descendencia. Los ciclos adicionales de aislamiento de calvas y de nuevas siembras permitieron la purificación del virus recombinante pretendido.
Ejemplo 5 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-CEA/TRICOM(mu) nº vT172
Para la generación del rV-CEA/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5031, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el gen M2L (30K), que se encuentra en la región Hind III M del genoma de la variolovacuna (véase la Figura 3). El gen CEA se encuentra bajo el control del activador 40K (13), el gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 13, y el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III M del genoma de la variolovacuna y comprenden los genes del anfitrión de la gama K1L de la variolovacuna. Se utilizó el vTBC33, descrito anteriormente, como virus original en la construcción de un virus de la variolovacuna recombinante. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna en el genoma del vTBC33 de la variolovacuna y las secuencias correspondientes del pT5031 de las células RK_{13} infectadas con la variolovacuna sometidas a transfección con el pT5031. El virus recombinante, denominado vT172, se seleccionó mediante el crecimiento en células RK_{13} tal como se ha descrito anteriormente. Las calvas se seleccionaron de la monocapa celular y se hizo multiplicar aún más su descendencia. Dos series de aislamiento de calvas y de nueva siembra en células RK13 permitieron la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT172 se ilustra en la Figura 4C.
Ejemplo 6 Generación del virus recombinante de la viruela aviar, rF-TRICOM(mu) nº vT222
El origen del virus de la viruela aviar utilizado en la generación de recombinantes fue la purificación de calvas de un frasco de una vacuna de gallináceas con licencia del USDA (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos), la POXVAC-TC, que se fabrica en la Schering-Plough Corporation. El material inicial en la producción de la POXVAC-TC era un frasco de vacuna de viruela aviar procedente de embrión de gallina de los Vineland Laboratories, obtenida por Schering-Plough. Se realizaron dos pases del virus en membrana corioalantoidea de huevos de gallina para producir una cepa madre del virus. Se realizaron 27 pases adicionales de la cepa madre en fibroblastos de embrión de gallina para preparar la cepa madre de la POXVAC-TC. Para preparar las reservas víricas para la generación de los lotes del producto POXVAC-TC, se realizó el pase de la cepa madre de la POXVAC-TC dos veces en fibroblastos de embrión de gallina. Un frasco de la POXVAC-TC, con el nº de serie 96125, se purificó tres veces a partir de las placas en células dérmicas primarias de embrión de gallina.
Para la generación del rF-TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT8001, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, el gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador 13, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 7.5K y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase la Figura 5). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT8001 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT8001. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT222, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron seis ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT222 se ilustra en la
Figura 7A.
Ejemplo 7 Generación de la viruela aviar recombinante, rF-TAA/TRICOM(mu)
Para la generación del rF-TAA/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen TAA, el gen LFA-3 murino, el gen ICAM-1 murino y el gen B7.1 murino se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores. Además, el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del vector plasmídico de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el vector plasmídico. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron ciclos adicionales de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido.
Ejemplo 8 Generación de la viruela aviar recombinante, rF-MUC-1/TRICOM(mu)
Para la generación del rF-MUC-1/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen MUC-1, el gen LFA-3 murino, el gen ICAM-1 murino y el gen B7.1 murino se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores. Además, el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del vector plasmídico de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el vector plasmídico. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron ciclos adicionales de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido.
Ejemplo 9 Generación de la viruela aviar recombinante, rF-CEA/TRICOM(mu) nº vT194
Para la generación del rF-CEA/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5049, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen CEA se encuentra bajo el control del activador 40K de la variolovacuna, el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, el gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador I3, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 7.5K, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase la Figura 6). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT5049 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT5049. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT194, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cinco ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido. La estructura génica de la viruela aviar recombinante vT194 se ilustra en la Figura 7B.
Ejemplo 10 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-TRICOM (hu) nº vT224
Para la generación del rV-TRICOM (hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5064, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en el gen de la timidina cinasa (TK), que se encuentra en la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador 13 y el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L. Además, el gen lacZ de E. coli, bajo el control del activador C1, se incorpora como identificación de la descendencia recombinante. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna (véase la Figura 8). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de Wyeth (New York City Board of Health) de la variolovacuna como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna de Wyeth y las secuencias correspondientes del pT5064 en células CV-1 infectadas con la variolovacuna (ATTC, CCL 70) sometidas a transfección con el pT5064. Se identificó el virus recombinante utilizando un análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresan el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT224, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cinco ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido. La estructura génica del recombinante vT224 se ilustra en la Figura 9A.
Ejemplo 11 Generación de la variolovacuna recombinante, rV-TAA/TRICOM (hu)
Para la generación del rV-TAA/TRICOM (hu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas el gen de la timidina cinasa (TK), que se encuentra en la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. El gen TAA, el gen LFA-3 humano, el gen ICAM-1 humano, el gen B7.1 humano y el gen lacZ de E. coli se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores poxvíricos. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de Wyeth (New York City Board of Health) de la variolovacuna como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna de Wyeth y las secuencias correspondientes del vector plasmídico en células CV-1 infectadas con la variolovacuna (ATTC, CCL 70) sometidas a transfección con el plásmido. Se identificó el virus recombinante utilizando un análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresan el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron ciclos adicionales de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido.
Ejemplo 12 Generación de la viruela aviar recombinante, rF-TAA/TRICOM(hu)
Para la generación del rF-TAA/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen TAA, el gen LFA-3 humano, el gen ICAM-1 humano, el gen B7.1 humano y el gen lacZ de E. coli se encuentran bajo el control de una pluralidad de activadores poxvíricos. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del vector plasmídico de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el vector plasmídico. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron ciclos adicionales de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido.
Ejemplo 13 Generación del virus de la variolovacuna recombinante, rV-CEA (6D)/TRICOM(hu) nº vT238
Para la generación del rV-CEA(6D)/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT8016, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas el gen de la timidina cinasa (TK), que se encuentra en la región Hind III J del genoma de la variolovacuna. El gen CEA se alteró mediante mutagenia in vitro para expresar la proteína completa que comprende un epítopo modificado. Dicha mutación cambió el aminoácido codificado en la posición 576 de una asparagina a un ácido aspártico. El gen modificado, denominado CEA(6D), se diseñó para aumentar la capacidad inmunógena del CEA (Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57: 4570-4577). El gen CEA(6D) se encuentra bajo el control del activador 40K. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador I3 y el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L. Además, el gen lacZ de E. coli, bajo el control del activador C 1, se incorpora como identificación de la descendencia recombinante. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región Hind III J del genoma de la variolovacuna (véase la Figura 10). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de Wyeth (New York City Board of Health) de la variolovacuna como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la variolovacuna recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de la variolovacuna del genoma de la variolovacuna de Wyeth y las secuencias correspondientes del pT8016 en células CV-1 infectadas con la variolovacuna (American Type Culture Collection [ATCC], Rockville, MD, CCL 70) sometidas a transfección con el pT8016. Se identificó el virus recombinante utilizando un análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresan el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT238, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron seis ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del virus pretendido. La estructura génica del recombinante vT238 se ilustra en la Figura 11.
Ejemplo 14 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-TRICOM (mu) nº vT251
Para la generación del rF-/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT8019, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador I3, el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase la Figura 12). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT8019 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT8019. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT251, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron tres ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT251 se ilustra en la Figura 13A.
Ejemplo 15 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-TRICOM(hu) nº vT232
Para la generación del rF-/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5072, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador 13, el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase la Figura 14). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT5072 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT5072. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT232, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cuatro ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT232 se ilustra en la Figura 13B.
Ejemplo 16 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-MUC-1/TRICOM(mu) nº vT250
Para la generación del rF-MUC-1/TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT8020, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. Se utilizó una versión truncada del gen MUC-1, que comprende la señal de secuencia, diez copias de la secuencia de repetición en tándem y una secuencia particular codificante 3' (SEC ID nº 41). La secuencia de nucleótidos de la región de repetición en tándem se alteró para minimizar la homología entre las repeticiones sin cambiar la secuencia de aminoácidos. El gen se encontraba comprendido en un fragmento de 1881 pares de bases que comprendía la secuencia codificante truncada, 6 nucleótidos de la región 5' sin traducir, y 186 nucleótidos de la región 3' sin traducir (Gendler et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 15286-15293). El gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 13, el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C 1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase la Figura 15). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT8020 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT8020. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT250, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cuatro ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT250 se ilustra en la Figura 16A.
Ejemplo 17 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-MUC-1/TRICOM(hu) nº vT242
Para la generación del rF-MUC-1/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT2186, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. Se utilizó una versión truncada del gen MUC-1, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 16. El gen MUC-1 se encuentra bajo el control del activador 40K. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador I3, el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase Figura 17). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT2186 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT2186. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT242, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cuatro ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT242 se ilustra en la Figura 16B.
Ejemplo 18 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-CEA(6D)/TRICOM(hu) nº vT236
Para la generación del rF-CEA(6D)/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT2187, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen CEA(6D) se encuentra bajo el control del activador 40K. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador 13, el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase Figura 18). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT2187 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT2187. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT236, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron ocho ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT236 se ilustra en la Figura 16C.
Ejemplo 19 Generación del virus de la viruela aviar recombinante, rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu) nº vT257
Para la generación del rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5080, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la viruela aviar. El gen que codifica el PSA se aisló por amplificación del ADNc obtenido a partir del ARN de la estirpe celular LNCaP (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El gen se encontraba comprendido en un fragmento de 1346 pares de bases que comprende la secuencia codificante completa del PSA, 41 nucleótidos de la región 5' sin traducir, y 552 nucleótidos de la región 3' sin traducir (Lundwall y Lilja, 1987, FEBS Lett. 214: 317-322). El gen que codifica el PSMA se aisló por amplificación del ADNc obtenido a partir del ARN de la estirpe celular LNCaP mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El gen se encontraba comprendido en un fragmento de 2298 pares de bases que comprende la secuencia codificante completa del PSMA, 26 nucleótidos de la región 5' sin traducir, y 19 nucleótidos de la región 3' sin traducir (Israeli et al., 1993 Cancer Res. 53: 227-230). El gen PSA se encuentra bajo el control del activador 40K. El gen PSMA se encuentra bajo el control del activador 7.5K. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador 13, el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región BamHI J del genoma de la viruela aviar (véase Figura 19). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las calvas de la POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) de la viruela aviar como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del virus de la viruela aviar recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de viruela aviar del genoma de la viruela aviar y las secuencias correspondientes del pT5080 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con la viruela aviar sometidas a transfección con el pT5080. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT257, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cinco ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT257 se ilustra en la Figura
16D.
Ejemplo 20 Generación del virus MVA recombinante, rMVA-TRICOM(mu) nº vT264
El virus de la variolovacuna modificado de la cepa Ankara (MVA) es un derivado atenuado de la cepa Ankara del virus de la variolovacuna (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031-10381. Las reservas de cultivo de la vacuna MVA utilizada como vacuna de la viruela en seres humanos se obtuvo del Dr. Anton Mayr (Institute for Medical Microbiology, Munich). Las reservas de cultivo se purificó dos veces a partir de las calvas en células dérmicas primarias de embrión de gallina.
Para la generación del rMVA-TRICOM(mu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5085, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región III de eliminación del genoma del MVA (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031-1038). El gen LFA-3 murino se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 13, el gen B7.1 murino se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región III de eliminación del genoma del MVA (véase Figura 20). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las reservas de cultivo de la vacuna MVA como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del MVA recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de MVA del genoma del MVA y las secuencias correspondientes del pT5085 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con el MVA sometidas a transfección con el pT5085. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT264, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cuatro ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT264 se ilustra en la Figura 21ª.
Ejemplo 21 Generación del virus MVA recombinante, rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu) nº vT260
Para la generación del rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu), se construyó un vector plasmídico, denominado pT5084, para dirigir la inserción de las secuencias exógenas en la región III de eliminación del genoma del MVA. El gen PSA se encuentra bajo el control del activador 40K. El gen PSMA se encuentra bajo el control del activador 7.5K. El gen LFA-3 humano se encuentra bajo el control del activador 30K, el gen ICAM-1 humano se encuentra bajo el control del activador I3, el gen B7.1 humano se encuentra bajo el control del activador sE/L, y el gen lacZ se encuentra bajo el control del activador C1. Dichas secuencias exógenas se encuentran flanqueadas por secuencias de ADN de la región III de eliminación del genoma del MVA (véase Figura 22). Se utilizó una cepa vírica aislada purificada a partir de las reservas de cultivo de la vacuna MVA como virus original para dicha vacuna recombinante. La generación del MVA recombinante se consiguió mediante la recombinación homóloga entre las secuencias de MVA del genoma del MVA y las secuencias correspondientes del pT5084 de células dérmicas primarias de embrión de gallina infectadas con el MVA sometidas a transfección con el pT5084. El virus recombinante se identificó utilizando el análisis cromogénico para el producto del gen lacZ descrito anteriormente. Las calvas víricas que expresaban el lacZ se presentaron de color azul en un fondo claro. Las calvas positivas, denominadas vT260, se seleccionaron de la monocapa celular y se sembró de nuevo su descendencia. Se realizaron cuatro ciclos de aislamiento de las calvas y de siembra de nuevo en presencia de Bluo-Gal, produciéndose la purificación del recombinante pretendido. La estructura génica del recombinante vT260 se ilustra en la Figura 21B.
Ejemplo 22 Poxvirus recombinantes
Se han descrito (10, 11) los virus recombinantes particulares de la variolovacuna que comprenden tanto la molécula coestimulante murina B7-1 (denominada rV-B7-1) como el gen que codifica la molécula 1 de adhesión intercelular murina (denominado rV-ICAM-1). El virus recombinante de la variolovacuna que comprende el gen del CD48 murino [denominado rV-LFA-3; el CD48 murino es el homólogo del LFA-3 humano (CD58) (6)] se construyó de un modo similar al rV-B7-1 y al rV-ICAM-1 y se ha descrito previamente (12). En cada uno de dichos virus recombinantes simples de la variolovacuna, el gen que codifica la molécula coestimulante se puso bajo el control del activador prematuro/tardío 40K del virus de la variolovacuna (15), y el transgén se incorporó a la región Hind III M del genoma de la cepa Wyeth del virus de la variolovacuna tal como ya se ha descrito previamente (13). Los virus recombinantes de la viruela aviar se construyeron mediante la inserción de secuencias exógenas en la región BamHI J del genoma de la cepa POXVAC-TC (Schering Corporation) de la viruela aviar tal como se ha descrito previamente (14). En los virus recombinantes que comprenden un gen exógeno simple, el gen se encuentra bajo el control del activador 40K de la variolovacuna. El rV-B7-1/ICAM-1 es un virus recombinante de la variolovacuna que comprende el gen B7-1 murino bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L) (16) y el gen del ICAM-1 murino se encuentra bajo el control del activador 40K. El rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 es un virus recombinante de la variolovacuna que comprende el gen LFA-3 murino bajo el control del activador de la variolovacuna 30K (M2L) (17), el gen ICAM-1 murino bajo el control del activador de la variolovacuna 13 (18), y el gen B7-1 murino bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L). El rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 es un virus recombinante de la viruela aviar que comprende el antígeno carcinoembrionario humano (CEA) bajo el control del activador 40K, el gen B7-1 murino bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L), el gen LFA-3 murino bajo el control del activador I3, y el gen ICAM-1 murino bajo el control del activador de la variolovacuna 7.5K (19). El virus no recombinante de la variolovacuna se denominó V-Wyeth, mientras que el virus no recombinante de la viruela aviar se denominó
WT-FP.
Ejemplo 23 Expresión de las moléculas recombinantes coestimulantes
Para confirmar que cada uno de los vectores recombinantes puede expresar el/los transgén/enes apropiado(s), se infectó la estirpe celular murina de adenocarcinoma MC38 con diversos constructos recombinantes de la variolovacuna o de la viruela aviar, y se demostró la expresión en la superficie celular del/de los transgén/enes por citometría de flujo (Figura 23). Las células sin infectar (no se ilustran los datos) y las células infectadas con la variolovacuna natural no consiguieron expresar ninguna de las tres moléculas coestimulantes. Dicha observación se confirmó mediante PCR (no se ilustran los datos). En cambio, las células infectadas con el rV-B7-1 se volvieron intensamente positivas para la proteína B7-1; las células infectadas con rV-ICAM-1 se volvieron positivas para la ICAM-1; y las células infectadas con rV-LFA-3 se volvieron positivas para la proteína LFA-3. Un análisis similar de un constructo que comprendía dos moléculas coestimulantes (rV-B7-1/ICAM-1) demostró la expresión de la B7-1 (78% de positivas con una intensidad media de fluorescencia (MFI) de 1012) y de la ICAM-1 (70% de positivas con una MFI de 690). Además, las células infectadas con el constructo genético múltiple de la variolovacuna rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 coexpresaron las tres moléculas coestimulantes. Para determinar si los virus recombinantes de la viruela aviar expresaron sus proteínas recombinantes, se infectaron células MC38 con constructos de la viruela aviar de un modo similar (Figura 23). De nuevo, las células infectadas con virus naturales de la viruela aviar WT-FP no consiguieron expresar molécula coestimulante alguna. Las células infectadas con el rF-B7-1 se volvieron positivas para la proteína B7-1, y las células infectadas con el rF-ICAM-1 se volvieron positivas para la proteína ICAM-1. No se construyó un vector rF-LFA-3. Sin embargo, las células infectadas con el constructo genético múltiple de la viruela aviar rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 coexpresaron las tres moléculas coestimulantes.
Caracterización de virus recombinantes: Análisis por fluorescencia de la expresión de las proteínas en superficie
Se ha descrito previamente (20) la estirpe celular murina de adenocarcinoma de colon MC38. Se infectaron células MC38 confluentes con constructos de variolovacuna (V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1, rV-LFA-3, rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) o constructos de viruela aviar (WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEAB7-1/ICAM-1/LFA-3) con una MOI de 5 (multiplicidad de infección; PFU/célula) durante 5 horas. Se utilizó el CEA en un constructo rF únicamente como marcador genético. Tras la infección, se sembraron las células y se realizó una inmunotinción con anticuerpos monoclonales (MAb) conjugados FITC específicos de las moléculas murinas CD80 (B7-1), CD54 (ICAM-1), o CD48 (LFA-3; PharMingen, San Diego, CA). Se analizó la fluorescencia celular con un citómetro FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA) con el software Lysis II instalado.
Análisis de la coestimulación in vitro
Las hembras de ratón C57BL/6 (6 a 8 semanas de edad) se obtuvieron en Taconic Farms (Germantown, NY). Los linfocitos T indiferenciados se aislaron a partir de bazos dispersados mecánicamente a través de un filtro celular 70 m (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para aislar suspensiones celulares simples y se extrajeron los eritrocitos y las células muertas por centrifugación sobre gradientes Ficoll-Hypaque (densidad = 1,119 g/ml) (Sigma, St. Louis, MO). Se obtuvieron poblaciones que comprendían aproximadamente un 95% de linfocitos T mediante el pase secuencial de células mononucleares esplénicas sobre dos columnas de tela de nailon (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA). En determinados experimentos, los linfocitos T se fraccionaron aún más en poblaciones CD4+ y CD8+ por selección negativa utilizando microsferas paramagnéticas anti-CD4 o anti-CD8 (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Se añadieron los linfocitos T en placas de fondo plano de 96 pocillos a una razón de 10^{5} por pocillo (Costar, Cambridge, MA). Las células estimulantes comprendían células MC38 sin infectar o células infectadas durante 5 horas con una MOI de 5 con constructos de la variolovacuna (V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1, rV-LFA-3, rVB7-1/ICAM-1/LFA-3) o con constructos de la viruela aviar (WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3) fijados con paraformaldehído al 2% y se añadieron a una razón de 10^{4} por pocillo. Se cultivaron las células de todos los pocillos en un volumen total de 200 \mul de medio de cultivo completo (CM) [RPMI 1640 con suero fetal de ternera (10%), glutamina (2 mM), piruvato sódico (1 mM), Hepes (7 mM), gentamicina (50 \mug/ml), 2-mercaptoetanol (50 \muM), y aminoácidos no esenciales (0,1 mM), (Biofluids, Rockville, MD)] en presencia de diversas diluciones (5 a 0,625 \mug/ml durante 2 días) de concanavalina-A (Con A, Sigma). En los pocillos de control se introdujeron únicamente linfocitos T, células estimulantes y medio de cultivo. En los experimentos indicados, los anti-CD3 de las placas (1,5 \mug/pocillo - 0,012 \mug/pocillo) se sustituyeron con Con A. Las células se marcaron para las 12 a 18 h finales de incubación con 1 Ci/pocillo ^{3}H-Timidina (New England Nuclear, Wilmington, DE) y se sembraron con un cultivador celular Tomtec (Wallac Incorporated, Gaithersburg, MD). La radiactividad incorporada se determinó mediante el recuento del centelleo en líquido (Wallac 1205 Betaplate, Wallac, Inc.). Se obtuvo la media de los resultados triplicados de los pocillos y se presentaron como de recuentos por minuto \pm error típico de la media (CPM \pm SEM). En los experimentos indicados, se realizó el análisis de coestimulación in vitro en presencia de tanto un MAb específico de la molécula coestimulante expresada como del anticuerpo de control con el isotipo compatible (IgG de hámster de Armenia, policlonal). Los anticuerpos utilizados para bloquear la multiplicación de los linfocitos T fueron el CD80 antimurino de hámster (B7-1; clon 16-10A1), el CD54 antimurino de hámster (ICAM-1; clon 3E2), o el CD48 antimurino de hámster (BCM-1; clon HM48-1), todos obtenidos en PharMingen. Todos los anticuerpos se utilizaron en una concentración final de 25 \mug/ml.
Determinación de la capacidad de la molécula coestimulante
Se prepararon los linfocitos T y las células estimulantes tal como se ha descrito anteriormente. Las células estimulantes fijadas que expresaban una o más moléculas coestimulantes se añadieron a los pocillos en diversas proporciones en combinación con células estimulantes infectadas con V-Wyeth/fijadas hasta un total de 10^{4} por pocillo. A continuación se añadieron los linfocitos T (10^{45} por pocillo) y se cultivaron las células en un volumen total de 200 \mul de CM en presencia de 2,5 \mug/ml de Con A durante 2 días y se marcaron para las 12 a 18 horas finales de la incubación con 1 \muCi/pocillo ^{3}H-Timidina. Se determinó la radiactividad incorporada mediante el recuento del centelleo en líquido tal como se ha descrito anteriormente.
Análisis de las citocinas
Se prepararon poblaciones de linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} tal como se ha descrito anteriormente y se añadieron a una razón de 2,5 x 10^{6}/pocillo en una placa de 6 pocillos (Costar). Las poblaciones de células estimulantes se prepararon tal como se ha indicado anteriormente y se añadieron a una razón de 2,5 x 10^{5}/pocillo. Se cultivaron las células en un volumen total de 5 ml de CM en presencia de 2,5 \mug/ml de Con A durante 24 horas. Se recogieron los fluidos sobrenadantes y se analizaron para las moléculas murinas IL-2, IFN\gamma, TNF-\alpha, GM-CSF, y IL-4 mediante captura por ELISA tal como ha sido descrito previamente (21). La sensibilidad de detección fue de 30, 100, 20, 20 y 20 pg/ml, respectivamente.
Se analizaron también poblaciones de ARN de células estimuladas mediante análisis con sonda múltiple de protección con ribonucleasa (mpRPA). Se adquirieron ribosondas definidas para citocinas murinas en PharMingen. Se realizaron análisis tal como se ha descrito previamente (22). Se separaron cadenas dobles protegidas marcadas con las sondas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 6%. Se expusieron los geles deshidratados a una película Biomax (Kodak) a -70ºC durante 24 a 72 horas. Se realizó la determinación cuantitativa de la radiactividad que comprendían las bandas utilizando un sistema de tratamiento de imágenes fosforescentes Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Se calculó la CPM neta para una banda determinada mediante la fórmula siguiente [cpm del gen de la citocina menos cpm de fondo] y se expreso como porcentaje de transcripción del gen de mantenimiento
L32.
Ejemplo 24 Las moléculas B7-1, ICAM-1, y LFA-3 Cooperan sinérgicamente para aumentar la multiplicación de los linfocitos T
Se ha demostrado que las moléculas B7-1, ICAM-1 y LFA-3 coestimulan individualmente la multiplicación de los linfocitos T. Sin embargo, debido a se pueden expresar simultáneamente en las APC, ha resultado difícil examinar las funciones relativas de las moléculas coestimulantes individuales durante la provocación de la multiplicación de los linfocitos T (2). Para analizar la contribución de las moléculas B7-1, ICAM-1 y/o LFA-3 en la provocación de la multiplicación de los linfocitos T indiferenciados, se utilizó un modelo in vitro modificado (23, 24) en el que la primera señal de activación de los linfocitos T se transmitió mediante un reactivo farmacéutico (Con A). Se creó un grupo de células estimulantes que diferían únicamente en las moléculas coestimulantes utilizando la estirpe celular MC38 infectada con diversos virus recombinantes de la variolovacuna (Figura 24A) o de la viruela aviar (Figura 24B) genomanimpulados para expresar las moléculas coestimulantes. La segunda señal, o "coestimulante", se transmitió a los linfocitos T mediante una o más moléculas coestimulantes expresadas en la superficie de dichas células MC38 "estimulantes". Tal como se ilustra en la Figure 24A, tanto las células MC38 sin infectar como las MC38/V-Wyeth provocaron la multiplicación marginal de los linfocitos T con todos los niveles de Con A examinados. Las MC38/LFA-3 provocaron un pequeño (2,1 veces) pero significativo (P < 0,05) incremento en la multiplicación de los linfocitos T. La transmisión de la señal 2 mediante las MC38/ICAM-1 provocó un incremento de 3,5 veces en la multiplicación de los linfocitos T a 2,5 \mug/ml de Con A. Las MC38/B7-1 provocaron un incremento de 7,8 veces y de 16 veces en la multiplicación a 2,5 y 1,25 \mug/ml de Con A respectivamente. Sin embargo, las células MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 (células MC38 que coexpresan las tres moléculas coestimulantes) provocaron un incremento de 17,5 veces en la multiplicación de los linfocitos T a 2.5 \mug/ml de Con A, y un incremento de 34 veces a 1,25 \mug/ml de Con A. Además, con unos niveles bajos de Con A (0,625 \mug/ml), la expresión de la ICAM-1 y de la LFA-3 no provocó la multiplicación de los linfocitos T. Mientras que la molécula B7-1 provoca una multiplicación cuantificable (20.000 CPM) a 0,625 \mug/ml de Con A, la coexpresión de las tres moléculas coestimulantes provocó un nivel de multiplicación incluso superior (100.000 CPM) (Figura 24A). Dichos experimentos se repitieron cuatro veces obteniendo unos resultados similares.
\newpage
Se prepararon también células estimulantes MC38 mediante la infección con vectores recombinantes de la viruela aviar (Figura 24B). De nuevo, las células MC38 o MC38/WT-FP provocaron la multiplicación marginal de los linfocitos T con todos los niveles examinados de Con A. Las células MC38/rFICAM-1 provocaron un incremento de 2 veces, las células MC38/rF-B7-1 provocaron un incremento de 3,2 veces, y las célula MC38/rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3 provocaron un incremento de 6 veces en la multiplicación de los linfocitos T a 2,5 \mug/ml de Con A. Se obtuvieron unos resultados similares cuando se repitió dicho experimento dos veces más. Se observaron también unos resultados similares cuando se transmitió la primera señal mediante anti-CD3 inmovilizados (no se ilustran los datos). Las diferencias observadas en la multiplicación provocada por las células MC38/rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (17,5 veces comparado con 6 veces) se deben muy probablemente los niveles de proteína(s) recombinante(s) expresada(s) a continuación de un período de infección de 5 horas (Figura 23). Específicamente, aproximadamente el 70% de las células infectadas con rVB7-1/ICAM-1/LFA-3 expresan las moléculas coestimulantes, mientras que aproximadamente el 40% de las células infectadas con rFCEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 son positivas. Las células positivas infectadas con los vectores rF expresan las moléculas recombinantes B7-1 y ICAM-1 a unos niveles del 50% de las infectadas con rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 bajo las condiciones utilizadas.
Ejemplo 25 Especificidad de la contribución de las moléculas coestimulantes en la multiplicación de los linfocitos T
Para confirmar aún más la especificidad de la contribución en la multiplicación por parte de las moléculas B7-1, ICAM-1, o LFA-3, se prepararon de nuevo células estimulantes MC38 mediante la infección con V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1, o rV-LFA-3 y se cultivaron conjuntamente con linfocitos T murinos indiferenciados y Con A en presencia o ausencia de MAb específicos contra la molécula coestimulante particular. Tal como se ilustra en la Figura 3B, la MC38B7-1 incrementó la multiplicación de los linfocitos T 4,5 veces más que la MC38N-Wyeth (Figura 25A). Dicho incremento en la multiplicación se inhibió en un 83% mediante la adición de MAb bloqueadores contra la B7-1 murina. De un modo similar, la MC38/ICAM-1 (Figura 25C) incrementó la multiplicación 2,25 veces, que se vio reducida a continuación en un 88% en presencia del MAb anti-ICAM-1 murina. Finalmente, la MC38/LFA-3 (Figura 25D) incrementó la multiplicación 2,1 veces, que se vio reducida a continuación en un 98% en presencia del MAb anti-CD48 murino. En cada grupo, la incubación con el anticuerpo de control con el isotipo apropiado (tal como se especifica en Materiales y Métodos) no consiguió bloquear la multiplicación indicada. Dicho experimento se repitió des veces más con unos resultados similares.
Ejemplo 26 Determinación de la capacidad coestimulante de las moléculas
La modificación del análisis de coestimulación in vitro permitió realizar una estimación cuantitativa de la capacidad relativa de las moléculas B7-1, ICAM-1, y/o LFA-3 para transmitir la segunda señal para la multiplicación de los linfocitos T. Con este propósito se realizó la valoración de células estimulantes (células MC38 infectadas con diversos virus recombinantes de la variolovacuna) con cantidades variables de células MC38 infectadas con V-Wyeth y cultivadas conjuntamente con un número constante de linfocitos T en presencia de 2.5 \mug/ml de Con A. La proporción entre las células MC38 y los linfocitos T en dichos experimentos se mantuvo constante a 1:10. Tal como se puede observar en la Figura 4, la molécula MC38/LFA-3 (triángulos oscuros) provocó un aumento de la multiplicación de los linfocitos T superior a la molécula MC38/V-Wyeth (cuadrado blanco) con una concentración del 40% (es decir, de las células estimulantes del pocillo, el 40% se infectaron con rV-LFA-3 y el 60% restante se infectaron con V-Wyeth). Las moléculas MC38/ICAM-1 (círculos oscuros) o MC38B7-1 (rombos oscuros) permitieron un aumento en la multiplicación a una concentración del 13% y el 6%, respectivamente. En cambió, las moléculas MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 aumentaron la multiplicación cuando menos del 3% de las células comprendían el vector tríada (extrapolado a menos del 1% mediante el análisis lineal de mínimos cuadrados). Considerando las curvas de valoración de dichas moléculas coestimulantes individuales, se puso de manifiesto que el grado de multiplicación de los linfocitos T en la que intervienen las moléculas ICAM-1 y B7-1 es 3 veces y 6 veces, respectivamente, más potente que en la que únicamente interviene la molécula LFA-3. Claramente la mayor proliferación, sin embargo, se produce cuando intervienen las moléculas B7-1/ICAM-1/LFA-3. Se ha de señalar (Figura 26) que a unas concentraciones de células estimulantes relativamente bajas (es decir, cuando del 3% al 6% de las células MC38 actúan como células estimulantes) la expresión de las moléculas LFA-3, ICAM-1, e incluso la B7-1 por sí solas no aumentan la activación de los linfocitos T, mientras que las células estimulantes que expresan las tres moléculas coestimulantes aumentan sustancialmente la activación de los linfocitos T. Los datos de la Figura 26 (inserto) ilustran los resultados de la multiplicación obtenidos cuando el 3% de las células estimulantes MC38 se infectaron con los vectores indicados. Debido a que cada pocillo comprendía un total de 10^{4} células MC38 y de 10^{5} linfocitos T indiferenciados, la proporción real de estimulantes respecto los linfocitos T en dichos cultivos era de 0,003. Obsérvese que las células MC38 infectadas con el constructo de dos genes (rV-B7-1/ICAM-1) provocó una multiplicación de los linfocitos T escasa, si se produjo alguna, con dichas condiciones, mientras que las moléculas MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 incrementaron sustancialmente la multiplicación (p < 0,0001).
Ejemplo 27 Coestimulación de los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}
Para caracterizar aún más la respuesta de los linfocitos T a las moléculas coestimulantes expresadas por separado o en combinación, se analizó la capacidad de las moléculas B7-1, ICAM-1, y LFA-3 para coestimular los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}. La Figura 5 ilustra la multiplicación de células CD4^{+} (Figura 27A) y CD8^{+} (Figura 27B) purificadas activadas con concentraciones inferiores a las óptimas de Con A. La estratificación de los efectos de las células estimulantes en la multiplicación resulto similar tanto en los linfocitos T CD4^{+} como en los CD8^{+}: las células MC38/LFA-3 realizaron la multiplicación más pobre, seguido por las células MC38/ICAM-1 y las MC38/B7-1. Las células MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 resultaron las células estimulantes más potentes para los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+}. Se repitieron dichos experimentos tres veces más con unos resultados similares. Se ha de señalar que a unas concentraciones muy bajas de Con A (0,625 \mug/ml, Figura 5, cuadros C y D), no se produjo un aumento significativo en la activación de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} cuando se utilizaron las moléculas ICAM-1, LFA-3, B7-1, como la combinación B7-1/ICAM-1 para proporcionar la segunda señal. Sin embargo, se observó una activación sustancial de ambos subconjuntos de linfocitos T cuando se utilizó el virus de la variolovacuna que coexpresaba la tríada de moléculas coestimulantes. Se observaron unos resultados similares cuando se transmitió la primera señal mediante los anti-CD3 inmovilizados (no se ilustran los datos).
Se ha descrito que la coestimulación de la molécula B7-1 prolonga la semivida del ARNm de la IL-2 y la sobrerregulación de la transcripción de la IL-2, teniendo como resultado la producción de cantidades considerables de IL-2 secretada (4, 25). Además, se ha descrito que la coestimulación de linfocitos T con LFA-3 tiene efecto sobre varias citocinas, en particular la IL-2 y la IFN-\gamma (6). Para realizar la determinación cualitativa y cuantitativa de los efectos de la coestimulación mediante moléculas coestimulantes simples o múltiples en la producción de citocinas, se cultivaron linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} de nuevo conjuntamente con diversas células coestimulantes que expresaban las moléculas B7-1, ICAM-1, y LFA-3 por sí solas o en combinación en presencia de 2,5 \mug/ml de Con A. Se analizaron los fluidos sobrenadantes en relación con las moléculas IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, GM-CSF, y IL-4 al cabo de 24 horas. Las células MC38 sin infectar (no se ilustran los datos y MC38N-Wyeth provocaron una cantidad marginal de IL-2 de las células CD4^{+} (Figura 28A), mientras que las células MC38/B7-1 provocaron 3.979 pg/ml. Sin embargo, la estimulación de los linfocitos T con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 provocó una cantidad 10 veces superior de IL-2. De un modo similar, las células MC38B7-1 provocaron una cantidad marginal de IL-2 de las células CD8^{+} (Figura 28B), mientras que las células MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 provocaron una cantidad 20 veces superior (6.182 pg/ml). Se examinó asimismo la producción de IFN-\gamma por parte de linfocitos T estimulados. Las células MC38B7-1 y MC38/LFA-3 provocaron únicamente cantidades moderadas de IFN-\gamma de las células CD4^{+} (Figura 28C). En cambio, la estimulación de las células CD4^{+} con las MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 provocó 4 veces más de IFN-\gamma que la estimulación con cualquier otro constructo. La estimulación de las células CD8^{+} con las MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 provocó una cantidad de IFN-\gamma superior a 6 veces más que las células CD8^{+} estimuladas con cualquiera de los otros constructos (Figura 28D). La estimulación de cualquier tipo celular con cualquier constructo no pudo producir cambios significativos (p > 0,05) en los niveles de TNF-\alpha GM-CSF, o IL-4 secretadas (no se ilustran los datos). Parece que la culminación predominante de la estimulación mediante el constructo de la tríada (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) fue la secreción IL-2 de las células CD4^{+} y la secreción de IFN-\gamma de los linfocitos T CD8^{+}. Se repitieron dichos experimentos tres veces más con unos resultados similares. Se llevaron a cabo unos estudios de comparación entre células estimulantes infectadas con el constructo de dos genes (rV-B7-1/ICAM-1) frente al constructo multigénico (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) en relación con su capacidad para aumentar la producción de citocinas por parte de los linfocitos T. Únicamente se observaron pequeñas diferencias entre los dos en la producción de IFN-\gamma por parte de tanto las células CD4^{+} como de las CD8^{+}, o en la producción de IL-2 por parte de las células CD8^{+}. Pero se observó una diferencia sustancial en la estimulación de la producción de IL-2 por parte de las células CD4^{+} (5.000 pg/ml al utilizar MC38/B7-1/ICAM-1 comparado con 39.600 pg/ml al utilizar MC38/B7-1/ICAM-IALFA-3).
Se analizó asimismo la expresión de las citocinas por parte de los linfocitos CD4^{+} y CD8^{+} estimulados con moléculas coestimulantes simples o múltiples en el nivel del ARN utilizando el análisis de protección con ribonucleasas con sonda múltiple (mRPA). Se ilustran un perfil radiográfico representativo y un análisis cuantitativo a partir de dos experimentos independientes (Figura 29). Los niveles de IL-4, IL-5, IL-10, IL-15 e IL-6 resultaron similares en los linfocitos T CD4^{+} estimulados con MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1, MC38/LFA-3, o MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Figura 29, histograma del cuadro B). Los niveles superiores de expresión de las moléculas IL-2 e IFN-\gamma se obtuvieron en los linfocitos T CD4^{+} estimulados con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 cuando se comparan las células CD4^{+} estimuladas con células MC38 que expresan cualquier molécula coestimulante simple (Figura 29B). Se observaron también unos niveles ligeramente superiores de IL-13, IL-9 e IL-6 en células CD4^{+} estimuladas con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3. Se analizó también la expresión de los genes de las citocinas en linfocitos T CD8^{+} estimulados. De los ARN de las citocinas analizados, los niveles de IL-2 y particularmente de IFN-\gamma resultaron significativamente superiores cuando dichas células se estimularon con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3, en comparación con los linfocitos T estimulados con células MC38 que expresaban cualquier molécula coestimulante simple. Por lo tanto, el efecto sinérgico predominante de la tríada de moléculas coestimulantes en la producción de las citocinas se produjo en la IL-2 en los linfocitos T CD4^{+} y en la IFN-\gamma en los linfocitos T CD8^{+}.
Ejemplo 28 Efecto de la coestimulación con TRICOM en la apoptosis de los linfocitos T estimulados Estudio de la apoptosis
Para determinar si la estimulación de los linfocitos T con la señal 1 y rV-TRICOM provocaba la supervivencia de las células o la muerte celular programada (PCD), se activaron los linfocitos T CD8^{+} con Con A para la señal 1, se cultivaron con células MC38 infectadas con V-WT, rV-B7-1 o rV-TRICOM durante 48 horas y se volvieron a sembrar durante 24 horas en medio de cultivo para determinar la apoptosis. Se analizó la apoptosis utilizando un ensayo TUNEL, tal como lo describen Gavrieli, Y. et al., J. Cell. Biol. 119: 493-501, 1992. Los linfocitos T activados con la combinación de las células MC38 y las moléculas Con A o MC38/V-WT y Con A en ausencia de señales coestimulantes presentaron unos niveles elevados de apoptosis espontánea (82,9 \pm 1, respectivamente). Los linfocitos T activados con Con A y MC38/B7-1 o con Con A y MC38/TRICOM presentaron una apoptosis espontánea sustancialmente inferior (31,3 \pm 3,8 y 30,7 \pm 1, respectivamente).
Los resultados demuestran claramente la apoptosis de los linfocitos T estimulados con células MC38 en presencia de Con A con o sin infección con V-WT (es decir, en ausencia de la señal 2). Mientras que la molécula Con A con las células MC38/TRICOM estimularon claramente las células CD8^{+} muy superior que la molécula Con A con las células MC38B7-1 y tuvo como resultado la producción de unos niveles superiores de IFN-\gamma e IL-2, ello no significó un nivel superior de apoptosis.
Ejemplo 29 Efecto antineoplásico del rV-CEA/TRICOM in vivo
Se realizaron unas investigaciones para determinar si la respuesta inmunitaria específica de un antígeno se podía aumentar utilizando un vector TRICOM. Se construyó una variolovacuna recombinante de cuatro genes que comprendía el gen del CEA y los genes de las moléculas B7-1, ICAM-1 y LFA-3, denominado rV-CEA/TRICOM, tal como se ha descrito en la presente memoria. Se vacunaron unas hembras de ratones de seis a 8 semanas de edad del tipo C57 BL/6 (Taconic Farms) o C57BL/6 transgénicas del gen CEA (Kass, E. et al., Cancer Res. 59: 676-683, 1999) mediante escarificación de la cola tanto con disolución salina equilibrada de Hank (HBSS) como una vez con 10^{7} pfu de rV-CEA, rV-CEA/B7-1 o rV-CEA/TRICOM, y se extrajeron los bazos 22 días más tarde. Se analizó la actividad linfoproliferativa de los bazos tal como ha sido descrito previamente (5).
Tal como se puede observar en la Figura 30 (inserto), los linfocitos T esplénicos de los ratones vacunados con rV-TRICOM presentaron unos niveles superiores de estimulación específica con el CEA en comparación con los linfocitos T obtenidos a partir de los ratones vacunados con rV-CEA. Se utilizaron ovoalbúmina y Con A como controles. A continuación se realizó une experimento para determinar si el rV-CEA/TRICOM podía provocar inmunidad prolongada. Se vacunaron ratones (5/grupo) una vez con V-WT, rV-CEA, o rV-CEA/TRICOM. Cien días más tarde, se realizó a los ratones una prueba de provocación con una dosis elevada (1x10^{6}) de células de carcinoma de colon MC38 que expresaban el CEA (5). Todos los ratones que recibieron V-WT y rV-CEA perecieron con los tumores, mientras que todos lo ratones vacunados con rV-TRICOM se mantenían vivos 50 días tras la prueba de provocación (Fig. 30).
Unos ratones transgénicos del CEA (Kass 1999, ibid; Thompson, J.A. et al., J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366, 1999) en los que el gen del CEA humano se expresa en los tejidos gastrointestinales normales de los adultos, y cuyo suero es CEA-positivo, se utilizaron para determinar si el vector rV-CEA/TRICOM podía aumentar las respuestas de los linfocitos T contra un autoantígeno. Unos ratones transgénicos del CEA se separaron grupos de 5 ratones/grupo. Se vacunaron dos ratones una vez con 10^{7} pfu de rV-CEA, rV-CEAB7-1, rV-CEA/TRICOM o disolución amortiguador y se sacrificaron el trigésimo día para analizar las respuestas de los linfocitos T específicas del CEA. Las respuestas de los linfocitos T obtenidas tras la vacunación con rV-CEA/TRICOM resultaron sustancialmente superiores a las obtenidas con el rV-CEA (Tabla 2). Se utilizaron las respuestas a la ovoalbúmina y a la Con A como controles. Los 3 ratones restantes transgénicos al CEA de cada grupo se utilizaron para determinar si se podían aumentar las respuestas antineoplásicas de contra tumores que expresaban el CEA utilizando un vector TRICOM. En primer lugar se inocularon a dichos ratones por vía s.c. 4x10^{5} células de carcinoma MC38 que expresaban el gen CEA (5). Cuatro días más tarde se vacunaron los ratones una vez en una zona distal con 10^{7} pfu del virus recombinante o de disolución amortiguadora. No crecieron tumores en los ratones vacunados con rV-CEA/TRICOM, mientras que los tumores continuaron creciendo en los ratones vacunados con disolución amortiguadora, rV-CEA y rV-CEAB7-1 (Tabla 2). Dichos resultados confirman la actividad in vivo de los vectores TRICOM.
TABLA 2 Respuesta inmunitaria y respuesta antineoplásica aumentadas del rV-CEA/TRICOM en ratones transgénicos CEA
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Ejemplo 30 Coestimulación de los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} mediante células precursoras de las células dendríticas y células dendríticas infectadas con rV-B7/ICAM-1/LFA-3
Se obtuvieron células nuevas de médula ósea CD34^{+} (precursoras de las células dendríticas) a partir de ratones C57BL/6 mediante el procedimiento de Inaba et al., (41). Dichas células precursoras se utilizaron inmediatamente o se cultivaron durante 6 días en GM-CSF y IL-4 (42) para producir células dendríticas maduras (DC). Las células precursoras CD34^{+} y las DC se infectaron durante 18 horas con el virus recombinante de la variolovacuna que codificaba múltiples moléculas coestimulante rV-B7/ICAM-1/LFA-3 (rV-TRICOM), a 10 MOI. Tras 5 horas de infección, se recogió una muestra de células y se realizó un análisis fenotípico. Se consideran, en la especialidad, las células dendríticas como las APC "finales", que expresan un importante conjunto de moléculas coestimulantes un unos niveles elevados. La tabla 3 demuestra que las DC murinas expresan verdaderamente las moléculas coestimulantes B7-1, B7-2, ICAM-1, y LFA-3 con unos niveles relativamente elevados (la intensidad media de fluorescencia, MFI, representada entre paréntesis). Sin embargo, cuando las DC se infectaron con rV-B7/ICAM-1/LFA-3, se produjo un incremento significativo tanto en el nivel de la expresión molecular coestimulante como en el porcentaje de células que expresaban las múltiples moléculas coestimulantes. El porcentaje de células que expresaban la molécula B7-1 aumentó del 65% al 86%, mientras que la MFI aumentó 4 veces; el porcentaje de células que expresaban la molécula ICAM-1 aumentó del 32% al 68%, mientras que la MFI aumentó 2,5 veces, el porcentaje de células que expresaban la molécula LFA-3 aumentó del 44% al 75%.
TABLA 3
3
Para utilizarlas como células estimulantes, las células precursoras infectadas CD34^{+} y DC se irradiaron (2000 rad) y se utilizaron para estimular linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} indiferenciados en presencia de Con A tal como se indica en la Figura 31.
Las células precursoras de las células dendríticas infectadas con poxvirus recombinantes que codificaban las moléculas B7.1, ICAM-1, y LFA-3 pudieron estimular tanto los linfocitos T CD4^{+} como los CD8^{+}. La estimulación de los linfocitos CD8^{+} por parte de las células precursoras de las células dendríticas que expresaban las moléculas B7.1, ICAM-1, LFA-3 fue superior a la conseguida utilizando células dendríticas maduras CD34^{+} sin infectar (Figura 32). Además, la infección y la expresión de las tres moléculas coestimulantes en las células dendríticas maduras CD34^{+} (tratadas previamente con IL-4 y GM-CSF) tuvieron como resultado un incremento considerable de la estimulación de tanto los linfocitos CD4^{+} como los CD8^{+} (Figura 33).
Los expertos en la materia pueden determinar asimismo la calidad de una población de células dendríticas mediante su capacidad para soportar una respuesta alorreactiva (reacción de linfocitos mixtos, MLR) (43). La Figura 34 ilustra los resultados de un cultivo de linfocitos mixtos utilizando células dendríticas infectadas con rV-TRICOM. La reacción de linfocitos mixtos utiliza DC de ratones C57BL/6 que son linfocitos T estimulantes de Balb/c, (es decir, una reacción antialotipo).
Dichos datos demuestran que el grado de multiplicación en una reacción de linfocitos mixtos es considerablemente superior en una reacción de linfocitos mixtos utilizando DC infectadas con rV-TRICOM en comparación con DC sin infectar o DC infectadas con variolovacuna natural.
La Figura 35 demuestra que las DC infectadas con rV-TRICOM resultan muy superiores a las DC estándar en la estimulación de la estirpe de linfocitos T murinos específicos del péptido CEA. Dicha estirpe de linfocitos T es CD8^{+} y es específica del epítopo restringido de Clase I CEA D^{b} EAQNTTYL (CAP-M8). La combinación de DC activadas con el péptido CEA (1 \mug/ml) e infectadas previamente con rV-TRICOM resulta claramente superior en la estimulación de respuestas de los linfocitos T específicos del CEA, especialmente con unas proporciones bajas de linfocitos T en relación con las DC.
Ejemplo 31 Estimulación in vivo e in vitro de linfocitos T murinos utilizando células dendríticas obtenidas a partir de médula ósea murina infectadas con rV- o rF-TRICOM Protocolo experimental Péptidos
Los péptidos restringidos H-2k^{b} OVA (ovoalbúmina_{257-264}, SIINFEKL)^{41} y VSVN (virus de la estomatitis vesicular N_{52-59}, RGYVYQGL)^{42}, y los péptidos restringidos H-2D^{b} CAP-M8 (CEA_{526-533}, EAQNTTYL) y FLU-NP (NP_{366-374}, ASNEN-MDAM)^{43} se adquirieron (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) o fueron sintetizados en el laboratorio (Applied Biosystems 432A Synergy Peptide Synthesizer, Foster City, CA).
Estirpes celulares y cultivos celulares
Las estirpes celulares de linfocitos T citotóxicos OVA y Cap-M8 CD8^{+} se crearon en el laboratorio a partir de ratones C57BL/6 y reconocen los péptidos OVA y Cap-M8 respectivamente. Las estirpes CTL se mantuvieron en ciclos semanales de estimulación in vitro con esplenocitos indiferenciados irradiados en un medio de cultivo completo (CM) [RPMI 1640 con suero fetal de ternera (10%); glutamina (2 mM), piruvato sódico (1 mM), Hepes (7 mM), gentamicina (50 \mug/ml), 2-mercaptoetanol (50 \muM), y aminoácidos no esenciales (0,1 mM), (Biofluids, Rockville, MD)], enriquecido con 1 \mug/ml del péptido específico y 10 U/ml de IL-2 murina (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Veinticuatro horas antes de utilizar dichas células como células que responden en análisis de la multiplicación específica del antígeno, las células se purificaron por centrifugación en un gradiente Ficoll-Hypaque (densidad = 1,119 g/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se sembraron de nuevo en placas de cultivo de 6 pocillos (10^{6} células/ml, 5 ml/pocillo) en CM enriquecido con únicamente 10 U/ml de IL-2. En los análisis de citotoxicidad, la estirpe celular del tumor seleccionado que se utilizó fue la EL-4 (C57BL/6, H-2^{b}, timoma, ATCC TIB-39).
Preparación de las DC
Se obtuvo la médula ósea a partir de hembras de ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, NY). El procedimiento utilizado en el presente estudio consistió en una versión ligeramente modificada del descrito por Inaba et al., ^{41}. Resumidamente, se obtuvo la médula ósea a partir de los huesos largos de las extremidades y se pasó por un gradiente Ficoll-Hypaque. Se disminuyó el número de linfocitos T y de células Ia^{+} de las células de la médula ósea utilizando una mezcla de microsferas magnéticas específicas de las CD4, CD8, y anti-MHC Clase-II (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Se sembraron las células en placas de cultivo de seis pocillos (10^{6} células/ml, 5 ml/pocillo) en CM enriquecido con 10 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Se volvieron a sembrar las células en medio de cultivo recién preparado enriquecido con citocinas en los días 2 y 4. Al cabo de 6 días de cultivo se recogieron las células para su infección, análisis e inmunizaciones. En los experimentos específicos, las DC se trataron con TNF-\alpha murina (100 ng/ml, Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) o CD40 mAb (5 \mug/ml, PharMingen, San Diego, CA) durante las 24 h finales de cultivo.
Poxvirus recombinantes
Se han descrito en la presente memoria los virus rV que comprenden el gen que codifica la molécula coestimulante murina B7-1 (CD80) bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L) (denominado rV-B7-1). El virus rV que comprenden el gen LFA-3 murino (CD48) bajo el control del activador de la variolovacuna 30K (M2L), el gen ICAM-1 murino (CD54) bajo el control del activador de la variolovacuna I3, y el gen B7-1 murino bajo el control del activador prematuro/tardío sintético (sE/L) se ha denominado rV-TRICOM. Los vectores rF-B7-1 y rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (denominado rF-TRICOM) son virus rF que se construyeron de un modo similar a los rV-B7-1 y rV-TRICOM, respectivamente. Se utilizó en determinados experimentos un constructo de virus de la viruela aviar - TRICOM que comprendía un gen indicador, el CEA humano. El virus de la variolovacuna natural no recombinante (Wyeth strain) se denominó V-WT, mientras que el virus de la viruela aviar natural se denominó FP-WT.
Infección de las DC
Se cultivaron las DC en el día 6 y se lavaron con Opti-Mem (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Las células, a continuación se infectaron de un modo simulado con HBSS; o se infectaron con V-WT, rV-B7, o rV-TRICOM a 25 MOI (multiplicidad de infección; PFU/pocillo); o se infectaron con FP-WT, rF-B7-1, o rF-TRICOM a 50 MOI en Opti-Mem durante 5h. Se añadió CM caliente tras la infección y se incubaron las células a 37ºC durante la noche. Tras la infección, se sembraron las células para su inmunotinción, análisis de coestimulación in vitro, y administración in vivo.
Análisis por citometría de flujo
Para realizar la tinción de la superficie celular se utilizó inmunofluorescencia de tres colores. La tinción se realizó con los anticuerpos primarios marcados con FITC CD11c, CD11b, H-2K^{b}, H-2D^{b}, CD19, Pan-NK; los anticuerpos primarios marcados con PE IA^{b}, CD48 (mLFA-3), CD86 (B7-2), CD3, CD14; y los anticuerpos marcados con biotina CD80 (B7-1), CD57 (ICAM-1), CD40. Los anticuerpos marcados con biotina se marcaron posteriormente con estreptavidina CyChrome. Todos los anticuerpos se adquirieron en PharMingen. Se analizó la fluorescencia celular y se comparó con el los controles correspondientes de los isotipos apropiados (PharMingen) con un citómetro FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA) utilizando el software Lysis II.
Análisis de la coestimulación in vitro: señal farmacológica 1
Se obtuvieron hembras de ratón C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, NY), y se aislaron linfocitos T tal como se ha descrito previamente ^{5}. Los linfocitos T se añadieron a razón de 10^{5}/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Las células estimulantes comprendían DC sin infectar, DC infectadas de un modo simulado o DC infectadas con vectores de la variolovacuna (V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM) o vectores de la viruela aviar (FP-WT, rF-B7-1 o rF-TRICOM) irradiados (20 Gy) y se añadieron a una razón de 10^{4}/pocillo. Se cultivaron las células de todos los pocillos en un volumen total de 200 \mul de CM en presencia de diversas concentraciones (2,5 a 0,9 \mug/ml) de Con A (Sigma) durante 2 días. Se marcaron las células para las 12 a 18 horas finales de incubación con 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-Timidina (New England Nuclear, Wilmington, DE) y se sembraron con un cultivador celular Tomtec (Wallac Incorporated, Gaithersburg, MD). La radiactividad incorporada se determinó mediante el recuento del centelleo en líquido (Wallac 1205 Betaplate, Wallac, Inc.). Se obtuvo la media de los resultados triplicados de los pocillos y se presentaron como de recuentos por minuto \pm error típico de la media (CPM \pm SEM).
Reacción de los linfocitos mixtos
Se utilizó la MLR para evaluar la función estimulante de las DC para los linfocitos T indiferenciados alógenos y singénicos. Se aislaron los linfocitos T a partir de ratones Balb/C o C57BL/6 tal como se ha descrito anteriormente. Las células estimulantes comprendían DC que no se habían sometido a infección; infectadas de un modo simulado; o infectadas con V-WT, rV-137-1, rV-TRICOM, FP-WT, rF-B7-1 o rF-TRICOM y se irradiaron (20 Gy). Los linfocitos T (5x10^{4}/pocillo) se cultivaron conjuntamente con un número gradual de células estimulantes en CM en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC, con el 5% de CO_{2} durante 4 días, se marcaron para las 12-18 horas finales de incubación con 1 \muCi/pocillo de ^{3}H-Timidina, se recogieron y se analizaron tal como se ha descrito anteriormente.
Análisis de la coestimulación in vitro: señal específica del péptido
Se añadieron linfocitos T (que responden) OVA o CAP-M8 reposadas a unas placas de fondo plano de 96 pocillos a razón de 5 x 10^{4}/pocillo. Las células estimulantes comprendían DC que no se habían sometido a infección o infectadas con V-WT, rV-137-1, o rV-TRICOM y se irradiaron (20 Gy). Se cultivaron las células de todos los pocillos en un volumen total de 200 \mul de CM. El análisis de coestimulación se realizó utilizando dos grupos de condiciones: (1) un proporción fija de células que responden: estimulantes de 10:1 que se cultivaron en presencia de diversas concentraciones del péptido específico o del péptido de control apropiado, o (2) una concentración fija del péptido específico o del péptido de control apropiado realizándose al cultivo con diversas proporciones de células que responden: estimulantes. Las células se cultivaron durante 72 h, se marcaron para las 12 a 18 h finales de incubación con 1 \muCi/pocillo con ^{3}H-Timidina, se recogieron y se analizaron tal como se ha descrito anteriormente.
Provocación in vivo de los CTL y análisis citotóxico
Las DC (1 x 10^{6}) que se encontraban sin infectar o las infectadas con V-WT o rV-TRICOM se lavaron dos veces en Opti-Mem y se volvieron a suspender en 1 ml del mismo medio que comprendía 10 \muM tanto de péptidos OVA como de péptidos CAP-M8. Tras 2 h de incubación a 37ºC, se lavaron las células dos veces en HBSS y se volvieron a suspender en HBSS para las inyecciones. Se inyectaron DC activadas con el péptido (1 x 10^{5} células/ratón) de 1 a 3 veces por vía intravenosa a intervalos de 7 días. Los ratones de control fueron inmunizados por vía subcutánea con 100 \mug del péptido indicado en aditivo Ribi/Detox (Ribi ImmunoChem Research, Hamilton, MT). Catorce días tras la inoculación final, se extrajeron los bazos de dos animales por grupo, se dispersaron en suspensiones de células individuales, se agruparon y se incubaron conjuntamente con 10 \mug/ml del péptido apropiado durante 6 días. Se recuperó la mayor parte de los linfocitos por centrifugación a través de un gradiente de densidad (LSM, Organon Teknika, West Chester, PA). Las células EL-4 se prepararon para utilizarlas como dianocitos en un análisis estándar de la citólisis utilizando ^{111}In, tal como se ha descrito previamente ^{45}. Se activaron los dianocitos con 10 \muM del péptido específico durante 1 hora a 37ºC, mientras que un segundo grupo de dianocitos se activo con el péptido de control. Los linfocitos seleccionados y los dianocitos activados con el péptido (5 x 10^{3} células/pocillo) se volvieron a suspender en CM, con unas proporciones combinadas de efector: dianocito de 80:1 a 10:1 en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos (Costar) y se incubaron durante 5 h a 37ºC con 5% CO_{2}. Tras la incubación, se recogieron los sobrenadantes utilizando un Supernatant Collection System ("sistema de extracción del sobrenadante") (Skantron, Sterling, VA), y se cuantificó la radiactividad utilizando un contador gamma (Cobra Autogamma, Packard, Downers Grove, 1L). El porcentaje de liberación específica de ^{111}In se determinó mediante la ecuación estándar: % de lisis específica = [(experimental - espontáneo)/(máximo - espontáneo)] x 100. Allí donde se indica, la actividad de los CTL se convirtió a unidades líticas (LU) tal como describen Wunderlich et al., 1994.
Análisis de los anticuerpos contra la variolovacuna
Se añadieron V-WT a una razón de 5 x 10^{5}/pocillo a placas de cloruro de polivinilo (Dynatech, Chantilly, VA), se secaron durante la noche a 37ºC y se bloquearon con un 5% de BSA. Se añadieron disoluciones graduales de sueros, obtenidos a partir de ratones inmunizados, por triplicado y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Se lavaron la placas y se incubaron con IgG antimurina de cabra marcada con peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) durante una hora adicional. Se hicieron desarrollar los pocillos con dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma, St. Louis, MO) y H_{2}O_{2}. Se detuvieron las reacciones con H_{2}SO_{4}. Se determinó la absorbancia de cada pocillo a 405 nm utilizando un lector de ELISA para microplacas Bio-Tek EL312e (Winooski, VT).
Resultados Expresión aumentada de las moléculas coestimulantes en las DC
Para determinar la eficacia de la infección de las DC con los poxvirus, dichas células se infectaron tanto con un virus rV que codificaba las moléculas B7-1, ICAM-1 y LFA-3 (denominado rV-TRICOM) o un virus rF que codificaba las moléculas B7-1, ICAM-1, LFA-3 y el antígeno carcinoembrionario (CEA) humano (denominado rF-CEA/TRICOM). En este último caso, se utilizó el CEA como gen indicado ya que las proteínas estructurales de la viruela aviar no se expresan en células infectadas. Tras 18 h, se analizaron las células con relación a la expresión de loa marcadores de la superficie celular asociados a la infección vírica particular. Las DC de control sin infectar expresaron el CD11b (97%) y resultaron negativas en la expresión de proteínas de la variolovacuna. Tras la infección con rV-TRICOM, el 94% de las DC expresaron conjuntamente tanto el CD11b como el CEA (87%). Dichas DC no consiguieron expresar las proteínas de la viruela aviar tal como se detectaron con sueros policlonales de conejo contra la viruela aviar (no se ilustran los datos), lo que concuerda con estudios que indican que la viruela aviar no se replica en las células de los mamíferos, Observados en conjunto, dichos datos indican que las DC se infectan eficazmente por los vectores rV y rF.
Las características fundamentales de las DC son los elevados niveles de expresión tanto de los antígenos de histocompatibilidad como de las moléculas coestimulantes. Para caracterizar aún más el fenotipo de las DC tras la infección vírica, se infectaron las células con el virus de la variolovacuna natural (V-WT), rV-B7-1, rV-TRICOM, el virus de la viruela aviar natural (FP-WT) o rF-TRICOM y se analizaron con relación a los marcadores de la superficie celular asociados al fenotipo de las DC (Tabla 4). Tal como era de esperar, las DC sin infectar o sometidas a una infección simulada expresaron unos niveles elevados de las moléculas MHC de Clase I y II, CD11b, B7-2 y CD40, así como unos niveles elevados de B7-1, ICAM-1, y LFA-3. Las DC infectadas con V-WT expresaron unas densidades inferiores en la superficie celular (tal como se determinó mediante la MFI) de diversas moléculas, mientras que las DC infectadas con rV-B7-1 expresaron 5 veces más B7-1 que las DC sin infectar (la MFI pasó de 329 a 1689). La infección de las DC con rV-TRICOM incrementó sustancialmente la MFI y el porcentaje de células positivas para las moléculas B7-1, ICAM-1, y LFA-3. Las DC infectadas con FP-WT presentaron un perfil fenotípico similar al de las DC sin infectar. La infección de las DC con rF-TRICOM aumentó también sustancialmente la MFI y el porcentaje de células positivas para las moléculas B7-1, ICAM-1, y LFA-3. Todas las poblaciones de DC permanecieron negativas para marcadores de los linfocitos T (CD3), los linfocitos B (CD19), los monocitos/neutrófilos (CD 14), y los linfocitos citolíticos naturales (Pan NK) tanto antes de como tras la infección con los vectores rF o N (Tabla 4).
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Las DC infectadas con vectores TRICOM presentan una capacidad aumentada para estimular a los linfocitos T indiferenciados
Se utilizó un modelo in vitro para analizar cómo los niveles aumentados de la expresión de las moléculas B7-l, ICAM-1 y LFA-3 ayudan a la multiplicación de los linfocitos T indiferenciados. En dicho modelo, la primera señal para la activación de los linfocitos T se transmite mediante un reactivo farmacéutico (Con A) y la señal adicional, o coestimulante, se transmite a los linfocitos T mediante las DC o las DC que expresan unos niveles elevados de TRICOM como consecuencia de una infección con poxvirus recombinantes. En dichos estudios y en todos los posteriores descritos en la presente memoria, se utilizaron también V-WT y FP-WT para descartar los efectos debidos al vector por sí solo. Tal como se ilustra en la Figura 36A, tanto las DC sin infectar como las infectadas de un modo simulado provocaron la multiplicación de los linfocitos T. Las DC infectadas con V-WT (denominadas DC/V-TRICOM) provocan una menor multiplicación de los linfocitos T que las DC sin infectar. La transmisión de señales coestimulantes adicionales mediante las DC infectadas con rV-B7-1 (denominadas DC/rV-B7-1) incrementó la multiplicación en comparación con las DC sin infectar. Sin embargo, las DC infectadas con rV-TRICOM (denominadas DC/rV-TRICOM) provocaron un mayor aumento den la multiplicación de los linfocitos T con todas las concentraciones de Con A. Además, cuando los linfocitos T se estimularon con DC/rV-TRICOM, se necesitaron 28 veces menos de Con A para provocar la multiplicación a unos niveles comparables con los de las DC sin infectar. Cuando se repitieron dichos experimentos, utilizando vectores de la viruela aviar, las DC/rF-TRICOM provocaron aumentos en la multiplicación de los linfocitos T con todas las concentraciones de Con A, a diferencia de las DC o las DC/rF-B7-1 (Figura 36B). Dichos experimentos se repitieron 4 veces con unos resultados similares.
Actividad aloestimulante aumentada mediante DC infectadas con vectores TRICOM
Se analizó el efecto de la infección con rV-TRICOM (Figuras 37A, C, E) o con rF-TRICOM (Figuras 37B, D, E) en la capacidad estimulante de las DC en una reacción aloespecífica de linfocitos mixtos. Tanto los DC sin infectar como las poblaciones de DC sometidas a una infección simulada provocaron una multiplicación considerable (78,000 CPM) de linfocitos T alógenos (Figuras 37A, B). La capacidad estimulante de las DC aumentó tras la infección con rV-B7-1 (Figura 37C). La infección de las DC con rV-TRICOM aumentó la capacidad estimulante sobre las DC y las DC/rV-B7-1 con todas las proporciones de DC/células que responden (Figura 37C). Se ha de destacar que las poblaciones de DC infectadas con los vectores rV-TRICOM no consiguieron estimular los linfocitos T singénicos (Figura 37E). Cuando se repitieron dichos experimentos utilizando vectores del virus de la viruela aviar (Figuras 37B, D), las DC/rF-TRICOM provocaron unos aumentos superiores en la multiplicación de los linfocitos T alógenos que las DC y las DC/rF-B7-1, DC/rF-TRICOM, sin embargo, no consiguieron la estimulación singénica de los linfocitos T (Figura 37F). Dichos experimentos se repitieron 3 veces con unos resultados similares.
Análisis de la coestimulación in vitro: exposición de péptidos a linfocitos T efectores
Se realizaron unos estudios para determinar si la capacidad estimulante de los DC activados por péptidos se podía aumentar al infectar los DC con rV-TRICOM. Con esta finalidad, se utilizó el péptido OVA restringido H-2K^{b} (ovoalbúmina_{257-264}, SIINFEKL) y una estirpe de linfocitos T efectores CD8^{+} específicos del péptido OVA. Se expusieron los DC a distintas concentraciones del péptido OVA y se incubaron en presencia de la estirpe de linfocitos T OVA (Figuras 38A a 38F). Las DC convencionales (es decir, sin infectar) provocaron una multiplicación considerable de los linfocitos T específicos del péptido OVA cuando se incubaron con dicho péptido OVA (Figura 38A). Dichos DC no provocaron la multiplicación de los linfocitos T específicos del péptido OVA cuando se incubaron con el péptido de control VSVN (virus de la estomatitis vesicular N_{52-59} RGYVYQGL) (Figura 38A, cuadrados blancos). Las DC/rV-B7-1 aumentaron la multiplicación global específica del péptido de dichas células 1,8 veces (Figura 38C). Además, las DC/rV-B7-1 provocaron una multiplicación similar a la de las DC sin infectar o sometidas a una infección simulada en presencia de una cantidad 4 veces inferior del péptido. En cambio, las DC/rV-TRICOM aumentaron la multiplicación global de dichos linfocitos T varias veces y, en presencia de una cantidad del péptido OVA 32 veces menor, provocaron una multiplicación comparable a la de las DC sin infectar (Figura 38C). Para analizar aún más la capacidad de las DC infectadas con la variolovacuna para el presente péptido, las DC se activaron con una concentración simple del péptido OVA (1 \muM) y se incubaron en presencia de diversas proporciones de linfocitos T (Figura 38E). Basándose en el número de células, se requirió un número 4 veces menor de DC/rV-B7-1 para provocar la multiplicación en unos niveles comparables a los de las DC (triángulos blancos frente a cuadrados oscuros). El mayor efecto coestimulante fue el de las DC/rV-TRICOM, que provocaron unos niveles de multiplicación comparables a los de las DC con un número 32 veces menor de células (círculos blancos frente a cuadrados oscuros).
Se utilizó un segundo sistema peptídico empleando DC activadas por un péptido y una estirpe conocida de linfocitos T para determinar si se podían obtener unos resultados similares a los obtenidos con el péptido OVA. Se realizaron dichos experimentos utilizando el péptido CAP-M8 restringido H-2D^{b} (CEA_{526-533}, EAQNTTYL) y una estirpe de linfocitos T efectores CD8^{+} específica del CAP-M8; se obtuvieron unos resultados similares (Figuras 38B, D, F). Dichos experimentos se repitieron 5 veces más con los mismos resultados.
Efecto de la infección con rV-TRICOM en DC maduradas con TNF-\alpha o CD40
Debido a que se supone que la maduración de las DC se encuentra correlacionada con la sobrerregulación de las moléculas coestimulantes de los linfocitos T, se realizaron unos experimentos para examinar el efecto de la infección con rV-TRICOM en las DC maduradas mediante el cultivo conjunto con tanto TNF-\alpha como el mAb CD40. El tratamiento de los DC con TNF-\alpha durante las 24 h finales del cultivo tuvieron como resultado una cierta sobrerregulación de las moléculas MHC-II, B7-2 y ICAM-1, tal como se pudo determinar mediante un análisis de citometría de flujo (Tabla 5), mientras que el tratamiento de las DC con mAb CD40 tuvo como resultado la sobrerregulación de la expresión de la ICAM-1 y una ligera sobrerregulación del MHC-II. Desde un punto de vista funcional, el tratamiento de los DC con TNF-\alpha o mAb CD40 finalizó con un aumento del 28% y el 16% respectivamente, en la multiplicación específica del péptido en relación con las DC sin manipular (Figura 39A). Se obtuvieron también unos datos similares tras tratar las DC con lipopolisacáridos (LPS). La infección de las DC sin tratar con rV-TRICOM tuvo como resultado un aumento sustancial en la multiplicación de los linfocitos T (Figura 39A comparado con la 39B). El tratamiento previo con TNF-\alpha o mAb CD40 seguido por la infección con rV-TRICOM, sin embargo, proporcionó únicamente una capacidad estimulante ligeramente superior a la observada con la infección con rV-TRICOM por sí solo (Figura 39B).
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Las DC infectadas con W-TRICOM resultan más eficaces en las respuestas de sensibilización previa de los CTL in vivo
Se realizaron unos experimentos para determinar si la capacidad estimulante aumentada de las DC/rV-TRICOM observada in vitro utilizando Con A (Figuras 36E-F), las reacciones de linfocitos mixtos (Figura 37) y los dos modelos de linfocitos T efectores (Figura 38) se traduciría en una mayor eficacia en las respuestas de sensibilización de los linfocitos T indiferenciados in vivo. Con esta finalidad, las DC, DC/V-WT, y DC/rV-TRICOM se activaron con 10 \muM de péptido OVA y se administraron por vía intravenosa a ratones C57BL/6. Se inmunizaron los ratones de control con el péptido OVA en aditivo Ribi/Detox por vía subcutánea. Se recogieron los esplenocitos 14 días tras la vacunación, se volvieron a estimular in vitro durante 6 días y se determinó su capacidad lítica específica del péptido contra las células EL-4 activadas con OVA. Las células EL-4 activadas con el péptido VSVN se utilizaron como dianocitos de control. Tal como se puede observar en la Figura 40A, los CTL obtenidos a partir de ratones inmunizados con el péptido/aditivo presentaron unos niveles moderados de actividad de los CTL (Figura 40A). Los ratones inmunizados con DC activadas con el péptido presentaron una respuesta superior de los CTL específicos del péptido (Figura 40B). La respuesta provocada de los CTL se vio de algún modo truncada en los ratones inmunizados con DC/v-WT (Figura 40C, < 2,5 unidades líticas (LU) comparado con 5,2 LU). En cambio, los ratones inmunizados con DC/rV-TRICOM activadas con el péptido (Figura 40D) presentaron una respuesta de los CTL significativamente superior a la de las DC (LU = 14,3, p = 0,001). A continuación se realizaron unos experimentos similares utilizando un segundo modelo peptídico, el péptido CEA CAP-M8 (Figuras 40E-H). De nuevo, las DC activadas con el péptido provocaron una actividad de los CTL muy superior a la producida mediante el péptido/aditivo (5,7 LU comparado con < 2,5 LU). Además, los ratones inmunizados con DC/rV-TRICOM activadas con el péptido (Figura 40H) presentaron una respuesta considerable de los CTL (> 20 LU) en comparación con la provocada por las DC activadas con el péptido (5,7 LU, p \leq 0,001; Figura 40F).
Eficacia de las vacunaciones con DC infectadas con vectores múltiples
En general, se considera que la generación de anticuerpos contra la variolovacuna puede impedir la utilización repetida de los virus de la variolovacuna como antígeno. Sin embargo, poco se sabe acerca de la utilización repetida de células infectadas con la variolovacuna como antígenos. Para tratar dicha cuestión, se realizó un esquema de inmunización en el que los antígenos DC activadas con el péptido CAP-M8 se administraron una, dos o tres veces, a intervalos de 7 días. Del mismo modo descrito anteriormente, se recogieron los esplenocitos 14 días tras la inmunización final, se volvieron a estimular in vitro durante 6 días y se determinó su capacidad lítica específica del péptido contra las células EL-4 activadas con CAP-M8. Tal como se pude observar en la Figura 41A, las DC/rV-TRICOM activadas con el péptido provocaron unos niveles superiores de actividad de los CTL en comparación con las DC activadas con el péptido. Dichos datos resultan similares a los observados en la Figuras 40E-H. Dicha única administración de DC/V-WT o DC/rV-TRICOM provocó unos valores significativos de anticuerpos IgG contra la variolovacuna, comprendidos entre 1:4.000 y 1:9.000 tal como se determinó mediante ELISA cualitativa. Dichos valores, sin embargo, no tuvieron efecto alguno en la capacidad de dichos antígenos para aumentar la actividad de los CTL con inmunizaciones posteriores (Figuras 41 B y 41 C). A pesar de que los valores de los virus contra la variolovacuna tras la segunda vacunación se encontraban comprendidos entre 1:12.000 y 1:50.000, se observó un aumento en la provocación de CTL específicos de los péptidos en todos los grupos. De nuevo, se observó que la actividad de los CTL utilizando células activadas por DC/rV-TRICOM era superior a la observada con las DC activadas por el péptido.
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Ejemplo 32 Las células precursoras de esplenocitos o de la médula ósea infectadas con vectores TRICOM provocan una activación de los linfocitos T comparable a las células dendríticas Materiales y Métodos Generación de células precursoras de la médula ósea y cultivos de células dendríticas
El procedimiento utilizado en la generación de DC obtenidas a partir de médula ósea fue el descrito por Inaba et al., con pequeñas modificaciones. Concretamente, se obtuvieron los fémures de hembras de ratón C57BL/6 (Taconic Farms, Germantown, NY) de 6 a 8 semanas de edad y se extrajo su médula ósea y se pasó por un gradiente Ficoll-Hypaque. Se disminuyó el número de linfocitos T y de células Ia^{+} de las células de la médula ósea utilizando una mezcla de microsferas magnéticas específicas de las CD4, CD8, y anti-MHC Clase-II (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Denominadas como células precursoras de las células dendríticas, dichas células depuradas de médula ósea se prepararon para la infección, o para cultivos de células dendríticas, se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos (10^{6} células/pocillo, 5 ml/pocillo) en CM enriquecido con 10 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Se volvieron a sembrar los cultivos de DC en CM enriquecido con citocinas recién preparadas en los días 2 y 4, y se separaron en nuevas placas en el día 4. En el día 7 de cultivo, se recogieron las células para proceder a su análisis, ensayos in vitro e inmunizaciones in vivo.
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Generación de células estimulantes de los esplenocitos
Se extrajeron los bazos de hembras de ratones C57BL/6 que no se habían sometido previamente a experimentación, se trituraron hasta conseguir una suspensión celular simple y se pasaron por un gradiente Ficoll-Hypaque. Se disminuyó el número de linfocitos T y de células Ia^{+} de los esplenocitos utilizando una mezcla de microsferas magnéticas específicas de las CD90 y el MHC Clase-II. A continuación se lavaron dos veces los esplenocitos purificados con Opti-Mem (Gibco-BRL) y se prepararon para la infección con los poxvirus recombinantes.
Infección de las células estimulantes
Las células precursoras de las células dendríticas obtenidas de la médula ósea y los esplenocitos se lavaron dos veces con Opti-Mem y se infectaron de un modo simulado o se infectaron con 25 MOI de V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM, o 50 de MOI FP-WT, rF-B7-1 o rF-TRICOM a 25 MOI (multiplicidad de infección, PFU/célula) en 1 ml del volumen final de Opti-Mem durante 5 horas. Tras la infección, se añadió medio de cultivo caliente (37 grados) y se incubaron las células a 37ºC durante la noche. Tras la infección, se recogieron las células para su inmunotinción, el análisis de coestimulación in vitro y su administración in vivo.
Análisis de coestimulación
Los linfocitos T CAP-M8 (que responden) se añadieron a una razón de 5 x 10^{4}/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Las células estimulante comprendían BMDC, esplenocitos o células precursoras de médula ósea, infectadas, sometidas a una infección simulada o infectadas con V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM, FP-WT, o rF-TRICOM y se irradiaron (20 Gy). Se cultivaron las células de los pocillos en un volumen total de 200 ml de CM. Se realizó el análisis de coestimulación utilizando dos conjuntos de condiciones: a) una proporción fija de células que responden: estimulantes de 2,5:1 para estimulantes no BMDC, y de 10:1 para las BMDC, cultivadas en presencia de diversas concentraciones de Con-A como señal uno, o el péptido de control apropiado, o b) una concentraciones fija de Con-A como señal 1, el péptido específico, o el péptido de control, cultivados a distintas proporciones de células que responden: estimulantes. Se cultivaron las células durante 48 ó 72 horas para los análisis de Con-A y específicos del péptido, respectivamente, y se marcaron para las 12 a 18 horas finales de incubación con 1 mCi/pocillo ^{3}H-Timidina, se recogieron y se analizaron tal como se ha descrito anteriormente.
La Tabla 6 ilustra la expresión de la superficie celular en los esplenocitos y la médula ósea (BM) de las moléculas coestimulantes tras la infección con vectores recombinantes. Los esplenocitos o las células de la médula ósea se infectaron durante 5 horas con 5 MOI de vectores de la variolovacuna o 50 MOI de vectores de la vacuna aviar. El fenotipo celular se comparó con el de las DC. Se realizó la inmunotinción de todas las células con mAbs específicos de las moléculas coestimulantes marcados con isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina o biotina/estreptavidina-CyChrome. El control isotípico resultó negativo (no se ilustran los datos). Los números indican el porcentaje de células positivas y la intensidad media de fluorescencia entre paréntesis.
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Las Figuras 42A a 46 demuestran que las respuestas de los esplenocitos infectados con TRICOM resultan comparables a las células de la médula ósea infectadas con TRICOM en relación con la estimulación de los linfocitos T.
Ejemplo 33 Estimulación de los linfocitos T humanos utilizando células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM alógeno activadas con péptidos
Se aislaron células dendríticas humanas de un paciente normal sano por leucoforesis. Las células dendríticas humanas se cultivaron durante 6 a 9 días en presencia de GM-CSF y a continuación se procedió a la adición de rF-TRICOM o rF-Controles para la infección de las células dendríticas. Las células dendríticas infectadas con rF-TRICOM se activaron con un péptido CEA (CAP-1 o CAP I, 6D) (Figura 47); un péptido PSA (PSA-3) (Figura 48); un péptido de la gripe (péptido Flu 58-66) (Figuras 49 y 50); o un péptido HPV (11-20) (Figuras 51-45) durante 1 hora. Los linfocitos T humanos aislados a partir de células mononucleares de la sangre de la circulación general (PBMC) se cultivaron en presencia de células dendríticas infectadas con rF-TRICOM activadas con el péptido y se determinó la producción de IFN-\alpha por parte de los linfocitos T. Las Figuras 47-54 demuestran que las células dendríticas humanas infectadas con rF-TRICOM estimularon los linfocitos T en un grado superior que los controles. Las Figuras 47-54, así como la Tabla 7 demuestran que las células dendríticas humanas alógenas infectadas con rF-TRICOM pueden exponer eficazmente cualquier péptido antigénico a los linfocitos T para aumentar una respuesta inmunitaria.
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TABLA 7
7
Los resultados que se ilustran en la Tabla 7 demuestran que las DC infectadas con rF-TRICOM (A) resultan superiores como APC para generar los CTL que las DC estándar (B) cuando ambos tipos se activan con péptidos.
Ejemplo 34 Ensayos clínicos con seres humanos de con una vacuna rV-huTRICOM, rV-CEA huTRICOM, y rF-CEA TRICOM
El objetivo del ensayo clínico con seres humanos es determinar la dosis óptima tolerada (OTD) de la vacuna recombinante rV-huTRICOM y rV-CEA-huTRICOM que provoca una respuesta inmunitaria antitumoral en el anfitrión y que se encuentra asociada a una toxicidad aceptable en los pacientes con adenocarcinomas avanzados que expresan el CEA.
Las vacunas rV-huTRICOM y rV-CEA-huTRICOM se producen en unas condiciones adecuadas para la Fase I y la Fase II del ensayo clínico en seres humanos.
En un ensayo inicial, se proporcionan dosis crecientes de vacunas atenuadas de virus recombinantes rV o rF CEA-huTRICOM o de vacuna rV-huTRICOM más rV-CEA con una dosis inicial de 10^{6} pfu de virus, por vía I.M., seguido por una dosis de 10^{7} pfu del virus, por vía I.M., y posteriormente seguida por una dosis de 10^{8} pfu de virus, o de 10^{9}, por vía S.C. o mediante escarificación.
La respuesta antitumoral de cada vacuna recombinante se determina utilizando datos clínicos, de laboratorio y radiológicos del tamaño, alcance y crecimiento del tumor utilizando criterios estándar aceptados en la determinación de respuestas de tumores a nuevas formas de tratamiento tal como resulta conocido en la técnica.
La respuesta inmunitaria del paciente a la vacuna recombinante se evalúa utilizando diversos análisis inmunitarios que comprenden el análisis de anticuerpos contra el CE, análisis de anticuerpos contra los poxvirus, análisis del inmunocomplejo, análisis linfoproliferativo específico del CEA, análisis de los linfocitos T citotóxicos específicos del CEA, frecuencia de precursores de los linfocitos T reactivos al CEA en análisis de liberación de \gamma-interferón por parte de los linfocitos T, análisis ELISPOT, Fast Immune y Tetramere para las respuestas de los linfocitos T (Scheibenhogen et al., Int. J. Cancer 71:932-936, 1997), análisis de HLA y similares. Se realiza la comparación entre muestras obtenidas antes del tratamiento y tras el tratamiento para comprobar el desarrollo de las respuestas inmunitarias humorales y celulares dirigidas contra el antígeno tumoral CEA.
Ejemplo 35 Ensayos clínicos en seres humanos de la viruela aviar recombinante CEA-huTRICOM
En un ensayo inicial, se inyectaron dosis crecientes de la vacuna de la viruela aviar CEA huTRICOM de 10^{6} pfu de virus, 10^{7} pfu de virus y 10^{8} pfu de virus directamente en una masa tumoral de un paciente con adenocarcinomas avanzados que expresaban el CEA.
La respuesta específica antitumoral e inmunitaria a la vacuna recombinante se determina tal como se ha descrito en el Ejemplo 34.
Ejemplo 36 Ensayos clínicos en seres humanos de linfocitos T activados con células dendríticas que hiperexpresan la molécula coestimulante múltiples
Se obtuvieron linfocitos de la sangre de la circulación general y células dendríticas a partir de un paciente con un cáncer de próstata avanzado. Los linfocitos de la sangre de la circulación general se enriquecieron con linfocitos CD8^{+}. Las células dendríticas se infectaron con el epítopo rV-PSA QVHPQKVTK/B7.1/ICAM-1/LFA-3 durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del epítopo PSA y la hiperexpresión de las moléculas coestimulantes múltiples. Los linfocitos CD8^{+} específicos del epítopo PSA se activaron y se expandieron en presencia de dichas células dendríticas tratadas. Los linfocitos T autógenos CD8^{+} específicos del epítopo PSA activados se inyectaron al paciente solos o en combinación con el epítopo PSA. La respuesta inmunitaria antitumoral y específica del PSA para el tratamiento se determina mediante procedimientos comparables a los descritos en el Ejemplo 34.
Se pueden realizar unos ensayos clínicos similares en seres humanos para el tratamiento de pacientes con otros tipos de cáncer que expresan un antígeno asociado a un tumor (TAA) mediante la sustitución del gen que codifica el CE con un gen que codifica otro TAA en el vector recombinante de la presente invención.
Ejemplo 37 Detección de péptidos inmunógenos y/o de linfocitos T humanos inmunoreactivos con un péptido específico utilizando DC infectadas con rF-TRICOM
La presente invención comprende tratamientos contra el cáncer que utilizan la manipulación genética ex vivo de DC con vectores víricos que incluyen un gen antigénico asociado a un tumor para activar los CTL específicos del tumor. Los DC infectados con rF-CEA en combinación con las moléculas coestimulantes TRICOM se utilizan para aumentar las respuestas inmunitarias específicas del CEA. Se analiza la capacidad de provocación de los CTL por parte de las DC infectadas con rF-CEA/TRICOM y rF-TRICOM. Se utiliza el complejo tetramérico MHC de clase I CAP-1 para visualizar los CTL específicos del CAP-1. Dicho protocolo no se limita al antígeno asociado al tumor, CEA, sino que se puede modificar para provocar respuestas inmunitarias especificas del antígeno para cualquier péptido antigénico o epítopo inmunógeno del mismo para inmunoterapia contra el cáncer, bacterias patógenas, virus, protozoos, levaduras y similares. Además, el procedimiento se puede modificar para detectar e identificar péptidos inmunógenos obtenidos a partir de una fuente tal como proteínas naturales, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas, o fragmentos de cada una de ellas, genotecas combinatorias, y similares.
Materiales y Métodos Cultivos celulares
Se adquirieron estirpes celulares de carcinoma colorrectal SW1463 (HLA-A1,2), LS174T (HLA-A2,-) en la American Type Culture Collection (Manassas, MD). Los cultivos carecían de micoplasmas y se mantuvieron en un medio de cultivo completo [DMEM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) enriquecido con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina (Life Technologies, Inc.)]. La estirpe celular C1R es una estirpe celular de leucemia humana de células plasmáticas que no expresa los antígenos endógenos HLA-A o B (Storkus, W.J. et al., J. Immunol. 138(6): 1657-1659, 1987). Las células C1R-A2 son células C1R que expresan un clon génico por transfección del HLA-A2.1 (Hogan, K. T. et al., J. Exp. Med. 168(2): 725-736, 1988). Dichas células se obtuvieron del Dr. William E. Biddison (National Institute of Neurological Disorders and Stroke ["Instituto nacional de trastornos neurológicos y accidentes vasculares"], NIH, Bethesda, MD). El cultivo de C1R-A2 carecía de micoplasmas y se mantuvo en medio de cultivo completo RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.). La estirpe celular V8T, una estirpe de CTL dirigida contra el epítopo CAP-1, se obtuvo de un paciente con carcinoma metastásico de colon que participó en un ensayo en la Fase I utilizando rV-CEA (Tsang, K. Y. et al., Clin. Cancer Res. 3(12): 2439-2449, 1997). Se cultivaron las células V8T en medio de cultivo completo RPMI 1640 que comprendía un 10% de suero AB humano y IL-2 (proporcionado por el National Cancer Institute, Surgery Branch ["Instituto Nacional del Cáncer, rama quirúrgica"], 20 unidades/ml). Se volvieron a estimular las células V8T con el péptido CAP-1 (25 \mug/ml) en el día 16 tras la nueva estimulación previa con una proporción entre las células efectoras y las APC de 1:3. Se utilizaron linfocitos B transformados EBV autógenos irradiados (23.000 rades) como APC.
Cultivo de DC a partir de células mononucleares de la sangre de la circulación general
Se obtuvieron células mononucleares de la sangre de la circulación general (PBMC) a partir de la sangre heparinizada de un paciente (#15) con un carcinoma pélvico que participó en un ensayo en la Fase I utilizando una combinación de rV-CEA y ALVAC-CEA. Todos los experimentos en los que se utilizaron materiales obtenidos a partir de pacientes se realizaron según las directrices de la NIH ("Instituto Nacional de la Salud"), y se obtuvo el consentimiento con conocimiento de causa por escrito de todos los pacientes. Se separaron las PBMC utilizando un gradiente de medio de cultivo de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC) tal como ha sido descrito previamente (Boyum, A. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:51-76, 1968). Se prepararon las DC utilizando una modificación del procedimiento descrito por Sallusto et al. (Sallusto, F. et al., J. Exp. Med. 179(4): 1109-1118, 1994). Las PBMC (1,5 x 10^{8}) se suspendieron de nuevo en medio de cultivo AIM-V que comprendía 2 mM de glutamina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 10 \mug/ml de gentamicina (Life Technologies, Inc.) y se dejaron adherir a un matraz T-150 (Corning Costar Corp., Cambridge, MA). Tras 2 horas a 37ºC, las células que no se adhirieron se separaron aclarando con cuidado. Las células que se adhirieron se cultivaron durante 6 a 7 días en medio de cultivo AIM-V que comprendía 50 ng/ml el recombinante humano GM-CSF (rhGM-CSF) y 0,5 ng/ml del recombinante humano IL-4 (rhIL-4). Se repuso el medio de cultivo cada tres días.
Virus recombinante en infección de DC con el virus de la viruela aviar que comprende CEA, CEA/TRICOM y TRICOM
Se obtuvo un fragmento de 2109 pares de bases que codificaba el marco de lectura abierto completo del CEA tal como describen Kaufman et al. (Kaufman, F. et al., Int. J. Cancer 48(6): 900-907, 1991). Los virus recombinantes de la viruela aviar CEA (fowlpox CEA; vCP248) los proporcionaron en Therion Corp utilizando los procedimientos descritos por Taylor et al. (Taylor, J. et al., Virology 187(1): 321-328, 1992), Cox et al. (Cox, W. I. et al., Virology 187(1): 321-328, 1992) y Perkus et al. (Perkus, M. E. et al., J. Virol. 63(9): 3829-3836). Los virus recombinantes de la viruela aviar que codifican el CEA y el gen Tricom humano (denominados rF-CEA-Tricom) y el virus de la viruela aviar - TRICOM humano (rF-Tricom) se realizaron tal como se describe en la presente memoria. El virus de la viruela aviar natural (FP-WT) se utilizó como control negativo en experimentos seleccionados. Las DC (1 x 10^{6}) se incubaron en 1 ml de medio de cultivo Optim-MEM (Life Technologies, Inc.) a 37ºC con rF TRICOM, rF-CEA, rF-CEA/TRICOM, FP-WT. Los experimentos de valoración indicaron que 2 x 10^{7} unidades formadoras de placas/ml, equivalentes a una multiplicidad de infección (MOI) de 40:1 durante 2 horas, pudieron provocar sistemáticamente la expresión del CEA en aproximadamente el 75% de las DC infectadas. Se suspendieron las DC infectadas en 10 ml de medio de cultivo completo RPMI-1640 caliente y reciente que comprendían 50 ng/ml de rhGM-CSF y 0,5 ng/ml de rhIL-4 cultivadas durante 24 horas, y posteriormente se utilizaron como estimulantes.
Péptido
El CAP-1 (Tsang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer. Inst. 87(13): 982-990, 1995), las posiciones de la secuencia de aminoácidos 571 - 579 del CEA YLSGANLNL, el CAP1-6D (Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57(20): 4570-4577, 1997) YLSGADLNL y el péptido Flu, el péptido 68-66 de la proteína matricial GILGFVTL con una pureza superior al 96%, se realizaron en Multiple Peptide System (San Diego, CA).
Generación de estirpes de linfocitos T
La modificación del protocolo descrito por Tsang et al. (Tsang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. 87(13): 982-990, 1995) se utilizó para generar los CTL específicos del CEA. Las DC sin infectar y las DC infectadas con rF-TRICOM, rF-CEA, o rF-CEA/TRICOM se utilizaron como APC. El péptido CAP-1 se añadió a las DC sin infectar o infectadas con rF-TRICOM a una concentración final de 25 \mug/ml. Las células no adherentes autógenas se añadieron a continuación a las APC en una proporción entre las APC y las efectoras de 1:10. A continuación se incubaron los cultivos durante 3 días a 37ºC en una atmósfera húmeda que comprendía el 5% de CO_{2}. Tras separar el medio de cultivo que comprendía el péptido, se enriquecieron los cultivos con la IL-2 recombinante humana a una concentración de 20 unidades/ml durante días, reponiéndose el medio de cultivo que comprendía la IL-2 cada 3 días. La incubación de 3 días con el péptido y 7 días con el complemento de IL-2 constituyó un ciclo IVS. Los cultivos primarios se estimularon de nuevo con el péptido CAP-1 (25 \mug/ml) en el día 11 para empezar un nuevo ciclo IVS. Se utilizaron linfocitos B transformados EBV autógenos irradiados (23.000 rades) como APC. Se utilizó un procedimiento similar en la generación de CTL cuando se utilizaron DC infectadas con rF-CEA o rF-CEA/TRICOM como APC, con la excepción de que no se utilizó el péptido CAP-1 en la estimulación.
Construcción de tetrámeros peptídicos del MHC
Se sintetizaron los complejos peptídicos MHC tal como describen Altman et al. (Altman, J. D. et al. Science 274(5284): 94-95, 1996). De una forma sucinta, el clon de la microglobulina \beta2 (\beta2M) clone se obtuvo del Dr. Garboczi (Harvard University, Cambridge, MA) (Garboczi, D. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89(8): 3429-3433, 1992) y el constructo HLA-A2 se obtuvo en Immunotech (Beckman-Coulter, Marsella, Francia). Las moléculas solubles HLA-A2 que comprendían el sustrato peptídico de 15 aminoácidos para la biotinilación dependiente del BirA del extremo COOH de la cadena pesada del HLA-A2 y el \beta2M se hicieron crecer por separado en E. coli y se aislaron como cuerpos de inclusión. Se solubilizaron el HLA-A2 y el \beta2M y se volvieron a naturalizar en presencia del CAP-1 o del péptido Flu-M1 58-66. Se purificó el complejo mediante FPLC en Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se procedió a la biotinilación del complejo peptídico MHC purificado utilizando el enzima BirA (Avidity, Denver, CO). Se produjeron los tetrámeros la mezclar el complejo peptídico MHC biotinilado con UltraAvidin marcada con ficoeritrina (Leinco Technologies, Inc. Ballwin, MO) en una proporción molar de 4:1.
Citometría de flujo
Tinción y clasificación de los linfocitos T: Se utilizó el tetrámero peptídico CAP-1-MHC para el análisis por citometría de flujo y la clasificación de los linfocitos T. Se empleó un procedimiento similar al descrito anteriormente para la tinción del tetrámero. El tetrámero peptídico CAP-1-MHC se utilizó a una concentración de 0,33 \mug/2 x 10^{5} células. Se tiñeron las células con el tetrámero peptídico CAP-1 MHC durante 1 hora a 4ºC y a continuación se tiñeron con FITC anti-CD8 durante una hora adicional. Se lavaron y analizaron las células en un clasificador Vantage Cell (Becton Dickinson) o un FACScan (Becton Dickinson) utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson). Se cultivaron y multiplicaron las células clasificadas tal como se ha descrito previamente. Las células teñidas con UltrAvidin-PE y el tetrámero Flu-MHC se utilizaron como controles negativos.
Análisis de la citotoxicidad
Se marcaron los dianocitos con 50 \muCi de oxiquinolina marcada con ^{111}Indio (Medi-Physics Inc., Arlington, IL) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron los dianocitos (0,3 x 10^{4}) in 100 \mul de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada uno de los 96 pocillos de placas de análisis de fondo plano (Corning Costar, Corp.). Los dianocitos se incubaron con péptidos durante 60 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5% antes de añadir las células efectoras. No se utilizó péptido alguno cuando se usaron estirpes celulares de carcinomas como dianocitos. Las células efectoras se suspendieron en 100 \mul de medio de cultivo completo RPMI-1640 enriquecido con un 10% de mezcla de suero humano AB y se añadieron a los dianocitos. A continuación se incubaron las placas a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 ó 16 horas. Se recogió el sobrenadante para realizar el recuento gamma utilizando estructuras de recogida (Skatron, Inc., Sterling, VA). Las determinaciones se realizaron por triplicado y se calcularon las desviaciones típicas. La lisis específica se calculó utilizando la fórmula siguiente(todos los valores en cpm):
% \ Lisis = \frac{\text{Liberación observada - Liberación espontánea x 100}}{\text{Liberación total - Liberación espontánea}}
La liberación espontánea se determinó a partir de los pocillos en los que se añadieron 100 \mul de medio de cultivo completo RPMI-1640. La radiactividad liberable total se obtuvo tras el tratamiento de los dianocitos con Triton x-100 al 2,5%.
Tipificación antigénica de los linfocitos humanos (HLA)
La fenotipificación HLA la realizó el Blood Bank of the National Institutes of Health ("Banco de sangre del Instituto Nacional de la Salud") utilizando un análisis estándar de la microcitotoxicidad dependiente de los anticuerpos y un grupo definido de antisueros anti-HLA. Los fenotipos de la clase I de la estirpe celular V8T y el paciente #15 fueron HLA-A2, -; B 18 (W6), 44 (12, W4) y HLA-A2, 28; B 13 (BW4), B51 (BW4); CW6, respectivamente.
Detección de citocinas
El sobrenadante de los linfocitos T expuestos durante 24 horas a las DC infectadas con rF-CEA, rF-CEA/TRICOM o a las DC sin infectar activadas con el péptido y las infectadas con rF-TRICOM DC en un medio de cultivo sin IL-2 a diversas proporciones de células que responden: estimulantes se analizó en relación con la secreción de IFN\gamma utilizando un equipo de ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados se expresaron en pg/ml.
Análisis ELISPOT
Se utilizó una modificación del procedimiento descrito por Scheibenbogen et al. (Scheibenbogen, C. et al., Clin. Cancer Res. 3(2): 221-226, 1997) para medir la producción de IFN\gamma y determinar los linfocitos T específicos del CAP-1. De forma sucinta, las placas de 96 pocillos Milliliter HA (Millipore Corporation, Bedford, MA) se recubrieron con 100 \mul del anticuerpo de captura contra la IFN\gamma a una concentración de 10 \mug/ml. Tras 24 horas de incubación a temperatura ambiente, se bloquearon las placas durante 30 minutos con un medio de cultivo completo RPMI-1640 que comprendía un 10% de mezcla de suero humano AB. Se añadieron 1 x 10^{5} células para analizar a cada pocillo. Las células C1R-A2 activadas con CAP-1-6D se añadieron a cada pocillo como APC con una proporción de efectoras:APC de 1:3. Las células C1R-A2 sin activar se utilizaron como control negativo. El péptido matricial Flu de enlace con el HLA-A2 58-66 (GILGFVFTL) se utilizó también como control. Las células que responden se determinaron mediante la utilización de un Domino Image Analyzer (Otpomax, Hollis, NH).
Análisis estadístico
El análisis estadístico de las diferencias entre las medias se realizo mediante una prueba t bilateral.
Discusión
Cuando un linfocito T indiferenciado se encuentra con un antígeno, resultan posibles diversas respuestas que comprenden la multiplicación, la secreción de citocinas y la diferenciación en células efectoras, así como la inactivación, la muerte y la ausencia de respuesta (anergia). La respuesta predominante en condiciones fisiológica se puede determinar mediante el hecho de que las señales coestimulantes apropiadas se transmiten a los linfocitos T que responden (26). Se ha considerado que por lo menos tres moléculas distintas encontradas habitualmente en la superficie de las APC clínicas pueden proporcionar las señales críticas para la activación de los linfocitos T: B7-1, ICAM-1 y LFA-3. En la presente memoria, el papel que desempeñan las moléculas coestimulantes en la activación de los linfocitos T indiferenciados se examinó mediante la utilización de vectores genomanipulados para expresar las moléculas B7-1, ICAM-1, LFA-3, o una combinación de las tres moléculas.
Diversos grupos han investigado la cooperación de dos de dichas moléculas en la coestimulación de los linfocitos T. Dubey et al. han descrito que la estimulación de tanto la B7-1 como la ICAM-1 constituye un requisito previo para la activación de los linfocitos T indiferenciados (26), mientras que Cavallo et al. determinaron que la B7-1 y la ICAM-1 se han de expresar conjuntamente por parte de las células tumorales para provocar una respuesta de memoria antitumoral (27). Además, se ha demostrado que la coestimulación por parte de las moléculas B7-1 y LFA-3 actúa acumulativamente tanto en la multiplicación de los linfocitos T como en la producción de citocinas (6, 23, 24). Dichos estudios previos se llevaron a cabo utilizando dos moléculas coestimulantes y vectores retrovíricos. Se realizó la transducción un gen en la estirpe de los dianocitos, se seleccionó el fármaco y a continuación se realizó de nuevo la transducción con un segundo constructo retrovírico recombinante seguido por la selección de un agente distinto. Dicho procedimiento requiere a menudo semanas o meses. Al utilizar vectores poxvíricos recombinantes, resulta posible alcanzar la expresión conjunta de tres moléculas coestimulantes 5 horas tras la infección. Se demostró que las células MC38 infectadas in vitro con rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 o rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 aumentaban la multiplicación de los linfocitos T en un grado muy superior que las células MC38 infectadas con vectores que comprendían el gen de cualquier molécula coestimulante simple. Además, la fuerza relativa de la segunda señal transmitida a los linfocitos T mediante la combinación de moléculas coestimulantes parece ser varias veces superior (>6) a la transmitida por las células MC38 que expresan cualquier molécula coestimulante simple. Dubey et al. han demostrado que con proporciones bajas entre estimulantes y linfocitos T se observa una sinergia considerable con las moléculas B7-1 y ICAM-1 (26). Nuestros estudios confirman dichos descubrimientos. Sin embargo, con unas proporciones muy bajas entre células estimulantes y linfocitos T o una señal 1 débil (0,625 \mug/ml de Con A), el constructo de dos genes (rV-B7-1/ICAM-1) ejercía muy poco efecto, si alguno, en la multiplicación; en cambio, la estimulación mediante el constructo de la tríada (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) presentaba un efecto sustancial y estadísticamente significativo en la multiplicación. El efecto predominante de la estimulación mediante el constructo multigénico (rV-B7-1, ICAM-1, LFA-3) fue la producción de IL-2 a partir de las células CD4^{+} y la producción de IFN-\gamma a partir de los linfocitos T CD8^{+}, mientras que pocas, si alguna, citocinas del tipo 2 se produjeron. El análisis de la expresión de las citocinas mediante la protección con ribonucleasas proporcionó un perfil compatible con el análisis de las citocinas in vitro, puesto de manifiesto mediante una expresión significativamente superior de la IL-2 y la IFN-\gamma tanto en los linfocitos CD4^{+} como en los CD8^{+} estimulados con las tres moléculas coestimulantes, en comparación con la estimulación con cualquier molécula coestimulante simple. Dichos datos concuerdan con los estudios previos que demostraron que en el contexto de una baja coestimulante de las CD28, los linfocitos T producían unos niveles bajos de IL-1, mientras que una coestimulación importante de las CD28 provocaba la producción de IL-2, IFN-g e IL-13 (28). Además, se ha descrito que la IL-13 actúa en sinergia con la IL-2 en la regulación de la síntesis de IFN-\gamma en los linfocitos T (29). De un modo interesante, nuestros resultados apoyan aún más dicha observación de que la estimulación de los linfocitos T CD4^{+} con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3 tiene como resultado un nivel elevado de expresión de IL-2 y IFN-\gamma, con un cierto aumento en la expresión de la IL-13. Además, se observó que la expresión de la IL-9 aumentaba aún más en los linfocitos T CD4^{+} mediante la estimulación con MC38B7-1/ICAM-1/LFA-3. expresión aumentada de la IL-9 junto con la sobrerregulación de la IL-2 observada en nuestros estudios concuerda con los estudios previos que demostraron que la producción óptima de IL-9 se regula mediante la IL-2 (30). Tomados en conjunto, dichos estudios sugieren que las respuestas óptimas de los linfocitos T indiferenciados requieren un nivel superior de coestimulación del que se creía previamente y que ello se puede conseguir mediante la acción combinada de tres moléculas coestimulantes.
Quizás la molécula coestimulante de los linfocitos T más estudiada es la B7-1. Está bien demostrada la capacidad de dicha molécula para aumentar la activación de los linfocitos T al utilizar vectores retrovíricos, anticuerpos contra el CTLA-4 y vectores poxvíricos. Los estudios descritos en la presente memoria clasifican en orden de importancia la estimulación de los linfocitos mediante una molécula coestimulante simple del siguiente modo: B7-1 > ICAM-1> LFA-3. Sin embargo, la utilización de tres moléculas coestimulantes resultó muy superior a la B7-1 por sí sola o a la B7 en combinación con una segunda molécula coestimulante tanto en la multiplicación de los linfocitos T como en la producción de citocinas.
A pesar de que en teoría no se encuentran enlazadas, existen diversos mecanismos posibles para conseguir una cooperación eficaz entre las moléculas B7-1, ICAM-1 y LFA-3. Se ha descrito que la interacción ICAM-I/LFA-3 coestimula la activación de los linfocitos T en la que interviene la TCR manteniendo el aumento en los mismos segundos mensajeros intracelulares que se generan con el enlace con la TCR. Dicha observación sugiere que la ligación de la molécula LFA-1 por parte de la ICAM-1 coestimula los linfocitos T al aumentar la señal transmitida mediante el complejo CD3/TCR (6). La interacción ICAM-1/LFA-1 resulta necesaria para sobrerregular la expresión de la cadena IL-2R-\alpha y de las CD28 en los linfocitos T, que se requiere para que se vuelvan capaces de responder a la coestimulación de la IL-2 y la B7-1. Por otro lado, la interacción B7-1/CD28 transmite una señal coestimulante independiente de la TCR que aumenta tanto la expresión durante la transcripción y posterior a la transcripción de la IL-2 y de otras linfocinas inmunoreguladoras. La interacción LFA-3/CD2 provoca la fosforilación de la tirosina de diversos segundos mensajeros intracelulares, la movilización del Ca^{2+}, y la producción de AMPc, teniendo como resultado la producción de diversas citocinas, particularmente la IL-2 y la IFN-\gamma (6). De este modo, parece ser que las tres moléculas coestimulantes pueden encontrarse cooperando al aumentar la activación de los linfocitos T dependiente del antígeno, así como su producción de y respuesta a los factores de crecimiento autocrinos y paracrinos.
Para concluir, la presente invención demuestra por primera vez la capacidad de vectores para introducir tres o más moléculas coestimulantes en una célula y activar rápida y eficazmente las poblaciones de linfocitos T tanto CD4^{+} como CD8^{+} con unos niveles muy superiores a los alcanzados cuando se utilizan una o dos di dichas moléculas coestimulantes. Dicho nuevo nivel de activación de los linfocitos T supone grandes implicaciones en el diseño y desarrollo de las vacunas.
El efecto de la tríada de moléculas coestimulantes en las DC era completamente inesperado. Los expertos en la materia conocen que las DC constituyen las APC más potentes. Los datos presentados en la presente invención demuestran que cuando las DC se infectan con el vector "Tricom", su capacidad para activar los linfocitos T aumenta enormemente. Dichos estudios demuestran por primera vez que una DC no es la APC más potente.
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 22
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\sa{Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu}
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<210> 23
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 23
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\sa{Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu}
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 24
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\sa{Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu}
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<210> 25
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 25
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\sa{Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe}
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<210> 26
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 26
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\sa{Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe}
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<210> 27
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 27
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\sa{Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val}
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<210> 28
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 28
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\sa{Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu}
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<210> 29
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 29
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\sa{Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu}
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<210> 30
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 30
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\sa{Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr}
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<210> 31
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 31
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\sa{Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly}
\sac{Val Thr Ser Ala}
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<210> 32
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<211> 30
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 32
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\sa{Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser}
\sac{Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 33
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\sa{Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val}
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<210> 34
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 34
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\sa{Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val}
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<210> 35
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 35
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\sa{Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val}
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<210> 36
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 36
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\sa{Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys}
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<210> 37
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 37
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\sa{Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr Leu}
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<210> 38
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 38
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\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
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<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
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<400> 39
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\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
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<210> 40
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<400> 40
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\sa{Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met}
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<210> 41
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<211> 2297
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
9

Claims (60)

1. Vector recombinante que comprende las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes distintas, una de la familia B7 que comprende la B7-1 y la B7-2 u homólogos humanos o una parte funcional de las mismas, y dos seleccionadas de entre el grupo que comprende: ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, OX-40L, VCAM-1 u homólogos humanos o partes funcionales de las mismas.
2. Vector recombinante según la reivindicación 1, en el que dichas tres moléculas coestimulantes son la B7-1, la ICAM-1 y la LFA-3.
3. Vector recombinante según la reivindicación 2, en el que dichas moléculas coestimulantes se obtienen a partir de seres humanos, a partir de simios o a partir de ratones.
4. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos una citocina, quimiocina, Ftl-3L, o combinación de las mismas.
5. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un marcador elegible.
6. Vector recombinante según la reivindicación 5, en el que el marcador elegible se selecciona de entre el grupo que comprende el gen lacZ, la timidina cinasa, gpt, GUS y un gen de la gama de genes anfitriones K1L de la variolovacuna.
7. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además por lo menos un activador obtenido a partir de una fuente eucariota, una fuente procariota o una fuente vírica.
8. Vector recombinante según la reivindicación 7, en el que el activador se selecciona de entre el grupo que comprende un activador prematuro SV40, una activador RSV, un activador tardío principal de los adenovirus, un activador I prematuro inmediato del CMV humano, un activador poxvírico, un activador 30K, un activador 13; un activador sE/L, un activador 7.5K, un activador 40K y un activador C1.
9. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, seleccionado de entre el grupo que comprende los vectores basados en bacterias, virus y ácidos nucleicos.
10. Vector recombinante según la reivindicación 9, en el que el dicho vector vírico se selecciona de entre el grupo que comprende los poxvirus, los adenovirus, los virus del herpes, los alfavirus, los retrovirus, los picornavirus, y los iridovirus.
11. Vector recombinante según la reivindicación 10, caracterizado porque es un poxvirus recombinante.
12. Vector recombinante según la reivindicación 11, en el que el poxvirus recombinante es un orthopox, la viruela aviar, la viruela de las cabras y de las ovejas o la viruela porcina.
13. Vector recombinante según la reivindicación 12, en el que la viruela aviar es una viruela aviar del tipo fowlpox, la viruela del canario o derivados de las mismas.
14. Vector recombinante según la reivindicación 12, en el orthopox es la variolovacuna, la variolovacuna de la cepa de Copenhague, la variolovacuna de la cepa Wyeth, la NYVAC, la variolovacuna de la cepa MVA, la viruela del mapache o la viruela del conejo.
15. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende además por lo menos un activador poxvírico que puede controlar la expresión del ADN exógeno.
16. Vector recombinante según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho vector bacteriano es un vector plasmídico.
17. Vector recombinante según la reivindicación 16, que comprende (a) por lo menos un activador poxvírico, (b) las secuencias de ácido nucleico exógenas que codifican las moléculas LFA-3, ICAM-1 y por lo menos una molécula B7, (c) secuencias de ADN flanqueadoras del constructo de los elementos (a) y (b), siendo las secuencias flanqueadoras tanto del extremo 5' como del extremo 3' homólogas a una región del genoma vírico original en la que se insertarán los elementos (a) y (b) para la recombinación con un poxvirus diseñado para producir un poxvirus recombinante que puede expresar las secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican tres moléculas coestimulantes, LFA-3, ICAM-1 y por lo menos una molécula B7.
18. Vector recombinante según la reivindicación 16, denominado pT5064, depositado en la ATCC con el nº de registro 203482.
\newpage
19. Vector recombinante según la reivindicación 16, denominado pT5049, depositado en la ATCC con el nº de registro 203481.
20. Vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
21. Vector recombinante según la reivindicación 20, en el que el antígeno seleccionado presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende la SEC. ID. Nº 2 a la SEC. ID. Nº 40.
22. Vector recombinante según la reivindicación 20, en el que el antígeno seleccionado se selecciona de entre el grupo que comprende un antígeno específico de un tumor, un antígeno asociado a un tumor (TAA), un antígeno con especificidad tisular, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno de levaduras, un antígeno fúngico, un antígeno de protozoos y un antígeno de parásitos y un mitógeno.
23. Vector recombinante según la reivindicación 22, en el que el antígeno bacteriano se obtiene a partir de una bacteria seleccionada de entre el grupo que comprende Chlamydia, Mycobacteria, Legionella, Meningiococcus, Streptococcus del grupo A, Hemophilus influenzae, Salmonella y Listeria.
24. Vector recombinante según la reivindicación 22, en el que el antígeno vírico se obtiene a partir de un virus seleccionado de entre el grupo que comprende lentivirus, virus del herpes, virus de la hepatitis, ortomixovirus y papilomavirus.
25. Vector recombinante según la reivindicación 24, en el que el lentivirus es el VIH-1 o el VIH-2.
26. Vector recombinante según la reivindicación 24, en el que el virus del herpes es el HSV o el CMV.
27. Vector recombinante según la reivindicación 24, en el que el virus de la hepatitis es el virus de la hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D o hepatitis E.
28. Vector recombinante según la reivindicación 24, en el que el ortomixovirus es el virus de la gripe.
29. Vector recombinante según la reivindicación 22, en el que el antígeno asociado a un tumor, el antígeno específico de un tumor, el antígeno con especificidad tisular se selecciona de entre el grupo que comprende el CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, el oncogén ras con mutaciones puntuales, oncogenes p53 normales y con mutaciones puntuales, el p53 hiperexpresado, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ewsfli-1, TAA modificados, variantes de empalme de los TAA, epítopos funcionales y epítopos agonistas.
30. Vector recombinante según la reivindicación 29, en el que el antígeno es el CEA (6D) que presenta un aminoácido de ácido aspártico en la posición 576 de la cadena de aminoácidos.
31. Vector recombinante según la reivindicación 29, en el que el antígeno es PSA o PSMA.
32. Vector recombinante según la reivindicación 29, en el que el antígeno es el MUC-1 o una parte del mismo.
33. Vector recombinante según la reivindicación 22, en el que el antígeno de levadura o fúngico se obtiene a partir de una levadura o de un hongo seleccionado de entre el grupo que comprende Aspergillus, Nocardia, histoplasmosis, Candida y Cryptosporidia.
34. Vector recombinante según la reivindicación 22, en el que el antígeno de parásitos se obtiene de una especie de Plasmodium, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, una especie de Trypasosoma, una especie de Leishmania.
35. Célula anfitriona aislada que comprende el vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.
36. Célula anfitriona según la reivindicación 35, que comprende además una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
37. Célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36 caracterizado porque dicha célula es una célula que presenta antígenos o una precursora de la misma, una célula precancerosa, una célula hiperplásica o una célula tumoral.
38. Célula anfitriona según la reivindicación 37, en la que dicha célula que presenta antígenos es una célula dendrítica o una precursora o una obtenida de la misma, un monocito, un macrófago, un linfocito B, un fibroblasto o una célula muscular.
39. Célula anfitriona según la reivindicación 37, en la que dicha célula que presenta antígenos se obtiene a partir de la médula ósea, el bazo, la piel, la sangre de la circulación general, un tumor, un ganglio linfático o un músculo.
40. Célula anfitriona según la reivindicación 37, en la que dicha célula que presenta antígenos es una célula precursora de una que presenta antígenos, una célula que presenta antígenos o una célula genomanipulada que presenta antígenos.
41. Célula anfitriona según la reivindicación 38, en la que dicha célula obtenida de una célula dendrítica es una célula dendrítica tratada con TNF-\alpha, una célula dendrítica tratada con CD40 o una subpoblación de células
adherentes.
42. Célula anfitriona según la reivindicación 36, en la que la secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo se proporciona mediante un vector recombinante, ARN o ADN de un lisado celular tumoral, o mediante la fusión con una célula tumoral que comprende dicha secuencia.
43. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
44. Composición farmacéutica según la reivindicación 43 que comprende un poxvirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 y opcionalmente como segundo vector recombinante un poxvirus que comprende por lo menos una secuencia exógena de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
45. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 44 que comprende además una citocina, una quimiocina o Flt-3L.
46. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 44 apta para administrar por vía intravenosa, subcutánea, intralinfática, intratumoral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, o por vía oral, mediante la instilación de la vejiga o mediante escarificación.
47. Composición farmacéutica que comprende las células dendríticas y derivados de las mismas según la reivindicación 38 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
48. Procedimiento in vitro para aumentar la respuesta inmunitaria específica de un antígeno en una célula aislada del sistema inmunitario caracterizado porque se utiliza el vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 o las células anfitrionas según las reivindicaciones 35 a 42.
49. Procedimiento según la reivindicación 48, en el que se utilizan las células anfitrionas según las reivindicaciones 35 a 42 y que opcionalmente comprende además una etapa de activación de dichas células con un antígeno seleccionado o un epítopo del mismo.
50. Procedimiento según la reivindicación 48, en el que las células aisladas del sistema inmunitario son linfocitos T y caracterizado porque comprende la etapa de exponer un linfocito T aislado a una célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 42 por sí sola o en combinación con un antígeno seleccionado o un epítopo inmunitario del mismo.
51. Procedimiento según la reivindicación 50, en el que dichos linfocitos T son autógenos de un paciente.
52. Utilización del vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir el cáncer o trastornos provocados por un microorganismo patógeno.
53. Utilización del vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir estados preneoplásicos o hiperplásicos.
54. Utilización del vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en la preparación de un medicamento destinado a aumentar la respuesta inmunitaria.
55. Utilización de una célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42 por sí sola o en combinación con un antígeno seleccionado para preparar un medicamento destinado a inmunoterapia o vacunación.
56. Procedimiento de producción de un poxvirus recombinante que comprende dejar que el vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 experimente una recombinación con el genoma de un poxvirus original.
57. Kit para la producción de un poxvirus recombinante que comprende el vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 y opcionalmente un poxvirus original.
58. Procedimiento de evaluación de la eficacia in vitro de una vacuna contra un antígeno seleccionado que comprende determinar el número y la función de los linfocitos específicos del antígeno seleccionado en presencia de las células según la reivindicación 37 que presentan antígenos en el que el aumento del número, la función o la combinación de los mismos de los linfocitos específicos del antígeno seleccionado constituye un indicador de la eficacia de la vacuna contra el antígeno seleccionado.
59. Procedimiento de detección sistemática de péptidos inmunógenos de una pluralidad de péptidos que comprende:
(a) activar las células que presentan antígenos infectadas con un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 con una pluralidad de péptidos para formar células que presentan antígenos activadas con péptidos;
(b) determinar la respuesta inmunitaria linfoide en presencia de las células que presentan antígenos activadas con péptidos, siendo el aumento de la respuesta inmunitaria un indicador de un péptido inmunógeno de la célula que presenta antígenos activada con péptidos.
60. Procedimiento según la reivindicación 59, en el que la fuente de la pluralidad de péptidos es una genoteca peptídica combinatoria.
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