JP2002531133A - 複数の共刺激分子を発現する組換えベクターおよびその利用 - Google Patents

複数の共刺激分子を発現する組換えベクターおよびその利用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも三つあるいはそれ以上の共刺激分子をコードし、また発現する、組換えベクターである。さらに、組換えベクターは、一つあるいはそれ以上の標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子を含む。T細胞の活性化を増強することに対するこれら共刺激分子の相乗効果が証明される。三つの共刺激分子をコードする遺伝子を含む組換えベクターを使用する、T細胞活性化の程度は、一つの共刺激分子を含む組換えベクター構築物の和よりもはるかに大きく、また、二つの共刺激分子の使用よりも大きかった。三つの共刺激ベクターを使用した結果は、低レベルの第一のシグナル、あるいは、低量の刺激細胞対T細胞の比の、どちらかの条件下において、最も劇的だった。この現象は、単離されたCD4+およびCD8+T細胞の両方において見られた。本発明の組換えベクターは、癌、および、病原性微生物に対する免疫原、および、ワクチンとして有用であり、また、樹状細胞および脾細胞を含む、宿主細胞に、増強された抗原提示機能を提供するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する分野 本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、
標的抗原をコードする外来遺伝子を含む、組換えベクターに関連する。本発明は
さらに、少なくとも三つの共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合に
より、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする
外来遺伝子を含む、組換えウイルスに関連する。さらに具体的には、本発明は、
少なくともB7ファミリー、LFA-3、および、ICAM-1の中の一つの分子である共刺
激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、少なくとも一つの標的抗
原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む、組換えポッ
クスウイルス、および、免疫原およびワクチンとしてのその使用に関連する。本
発明はさらに、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により
、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来
遺伝子を含む、組換えベクターによって、トランスフェクション、感染、あるい
は、形質導入された抗原提示細胞に関連する。
【０００２】 発明の背景 T細胞の活性化、拡大、および、分化に関わる、T細胞の初期応答の程度は、抗
原に対する好結果の免疫応答に最も重要である。免疫応答の開始には、ナイーブ
T細胞を活性化するために、抗原提示細胞（APC）による少なくとも二つのシグナ
ルが必要である。第一のシグナルは抗原特異的であり、ペプチド／主要組織適合
遺伝子複合体経由でT細胞受容体を通して伝えられ、また、T細胞を細胞周期に入
らせる。第二の、あるいは“共刺激の”シグナルは、サイトカイン産生および増
殖のために必要とされる。プロフェッショナルAPCの表面に通常見い出される、
少なくとも3つの異なる分子、B7.1（CD80）、細胞内接着分子1（ICAM-1；CD54）
、およびリンパ球機能関連抗原3（LFA-3；ヒトCD58；マウスCD48）が、T細胞活
性化に重要な第二のシグナルを提供可能であることが提唱されている。これらの
共刺激分子に対するT細胞リガンドは異なる。B7-1はCD28およびCTLA-4分子と相
互作用し、ICAM-1はCDlla/CDIS（LFA-1/2インテグリン）複合体と相互作用し、
また、LFA-3はCD2（LFA-2）分子と相互作用する。これらの共刺激分子が等しい
機能を果たすのか、あるいは、免疫応答の特異的な段階において特異的な機能を
果たすのかは、知られていない（2）。これらの分子はin vitroにおいて個々にT
細胞増殖を共刺激することが示された（6）。
【０００３】 しかしながら、それらはAPC上に同時に発現されうるため、T細胞増殖誘導にお
ける個々の共刺激分子の有効性の比を調べることは困難だった（2）。 T細胞および共刺激受容体に適切にco-engageするためには抗原および共刺激分
子の両方がお互いに近接して発現しなければならないと提唱されたので（8、9）
、共刺激分子の可能性のある協同作用を調べるために、いくつかの組換えウイル
スの混合物を利用することが可能だった。しかしながら、この方法の不都合な点
は、三つあるいはそれ以上のウイルスの混合は、統計的に、同じ細胞に共感染す
る可能性を減少させることで、そのため、複数の共刺激分子を使用するためには
多遺伝子構築物の作成がさらにより望ましかった。
【０００４】 1991年3月7日に発行されたWO 91/02805は、標的抗原、MHC蛋白質、および、標
的細胞に欠損している、もしくは、十分に発現していない、免疫相互作用に関わ
る他の蛋白質を発現させる組換えレトロウイルスベクター構築物を開示する。
【０００５】 Akagiら、1997, J. Immunotherapy Vol. 20 (1): 38-47は、改変したMUC 1遺
伝子を含む組換えワクシニアウイルス（rV-MUC1）、および、マウス共刺激分子B
7の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（rV-B7）の混合を開示する。
【０００６】 Cavallo, P.ら、1995, Eur. J. Immunol, 25: 1154-1162は、B7-1 cDNAの三つ
のICAM-1+腫瘍細胞株へのトランスフェクションが、同系マウスの拒絶を誘導す
るために十分であることを開示する。
【０００７】 Chen, L.ら、1994, J. Exp. Med., 179: 523-532は、マウスB7のcDNAを含む組
換えレトロウイルスベクター、および、種々の腫瘍にそのベクターを導入する利
用法を開示する。
【０００８】 Damle, N. K.ら、1992, J. Immunol Vol 148 (No. 7): 1985-1992は、異なる4
つのAPC関連共刺激分子がT細胞増殖を刺激する能力を比較するため、不動化した
TCR/CD3複合体に対する（directed at）モノクローナル抗体、および、これらの
分子の可溶性Igキメラ（RG）の組み合わせを含む、抗原提示細胞（APC）非依存
的なin vitroにおける培養系の利用を開示する。
【０００９】 Dubey, C.ら、1995、J Immunol 155: 45-57は、抗CD28抗体を用いて、あるい
は、I-Ekをトランスフェクションした、共刺激分子はなく、ICAM-1のみ、B7-1の
み、または、ICAM-1およびB7-1を同時に発現する線維芽細胞株を用いて、ナイー
ブT細胞の活性化におけるICAM-1:LFA-1およびB7:CD28/CTLA-4共刺激経路の寄与
の比率についての研究を開示する。
【００１０】 Fenton, R. G.ら、1998 Vol. 21, No. 2, pp 95-108は、共刺激分子B7-1遺伝
子の三つのHLA-A2発現ヒトメラノーマ細胞株へのトランスフェクション、および
、それらが初代ヒトT細胞を刺激する能力を開示する。その三つのメラノーマ細
胞株もまた、検出可能なレベルの共刺激分子であるICAM-1（CD54）およびLFA-3
（CD58）を発現した。
【００１１】 GjorloffWingren, A.ら、Critical Reviews in Immunol 15 (3 & 4): 235-253
は、HLA-DR、B7、および、LFA-3のCHO細胞へのコトランスフェクションにより、
これらの分子がナイーブT細胞およびメモリーT細胞の両方の活性化に協同作用し
、また、抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）にpM濃度において応答
を示すことを開示する。
【００１２】 Goldbach-Mansky, R. ら、1992, International Immunol. 4 (No. 12): 1351-
1360は、LFA-3、ICAM-1、および、B7陽性赤白血病細胞株K562、マウスL 細胞、
および、B7をトランスフェクションしたL細胞の存在下、CD4+ T細胞がブドウ球
菌エンテロトキシンB（SEB）に応答することを開示する。
【００１３】 Hodge, J. W. ら、1994, Cancer Research 54: 5552-5555は、マウスB7.1およ
びB7.2遺伝子を含む、組換えワクシニアウイルスの構築、および、特徴付けを開
示する。
【００１４】 Hodge, J. W.ら、1995, Cancer Research 55: 3598-3603 Cancer Research 55
: 3598-3603は、マウスB7.1組換えワクシニア（rV-B7）にヒト癌胎児性抗原遺伝
子を発現する組換えワクシニア（rV-CEA）を加えた混合物、および、この抗腫瘍
活性のための混合物の利用を開示する。
【００１５】 Parra,ら、1993, Scand J. Immunol 38: 508-514、Parra, E. ら、1994, J. I
mmunol 153: 2479-2487、および、Parraら、1997, J. Immunol., 458: 637-642
は、ヒトHLA-DR4分子（CHO-DR4）、HLA-DR4およびB7（CHO-DR4/B7）、HLA-DR4お
よびLFA-3（CHO-DR4/LFA3）、HLA-DR4およびICAM-1（CHO-DR4/ICAM-I）、あるい
は、DR4、B7、および、LFA-3（CHO-DR4/B7/LFA-3）遺伝子をトランスフェクショ
ンしたCHO細胞を開示する。
【００１６】 Thomas, R. ら、1993 J. Immunol. 151: 6840-6852は、フレッシュに得られた
樹状細胞（DC）が、HLA-DR、および、アクセサリー分子であるLFA-3、ICAM-1、
および、B7を、単球と同密度に発現することを開示する。
【００１７】 Uzendoski, Kら、May 1997, Human Gene Therapy 8: 851-860は、マウス共刺
激分子であるICAM-1を発現する組換えワクシニアウイルスの構築、特徴付け、お
よび、免疫学的結果を開示する。
【００１８】 1996年4月11日に発行されたPCT/US95/12624のWO 96/10419は、一つあるいはそ
れ以上の、免疫刺激分子をコードする遺伝子もしくはその一部、および、一つあ
るいはそれ以上の、疾患状態の抗原をコードする遺伝子もしくはその一部を取り
込ませた、一つの組換えウイルスベクターに関連する内容を開示する。
【００１９】 Robinsonら、アメリカ合衆国特許番号5,738,852は、感染病原体の標的抗原を
コードするポリヌクレオチド配列、および、B7共刺激分子をコードするポリヌク
レオチド配列を含む、レトロウイルスベクターを開示する。 本発明は、感染させた宿主細胞においてそれぞれの外来DNAを機能的に発現させ
る、少なくとも三つの共刺激分子それのみ、あるいは、少なくとも一つの標的抗
原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来DNAとの組み合わせをコー
ドする、外来DNAを含むベクターである。
【００２０】 発明の概要 本発明は、複数の共刺激分子をコードする、外来または外因性遺伝子、あるい
はその一部を含む、組換えベクターを提供する。本発明において有用性をもつ、
共刺激分子をコードする遺伝子もしくはその機能的な一部分は、B7ファミリーメ
ンバー、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40L、それら
の機能的な部分、および、ホモログを含むが、これらには限定はしない。本発明
のベクターは、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子との組み合わせて、少
なくとも一つの標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープをコードする外来
遺伝子を、さらに提供し得る。少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的
エピトープをコードする外来遺伝子は、ウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、酵
母、腫瘍細胞、前新生物の細胞、過形成の細胞、組織特異的な細胞といった、細
胞、組織、あるいは、生物体、あるいは合成抗原に由来することが可能である。
そのベクターはさらに、少なくとも一つのサイトカイン、ケモカイン、および、
flt-3L、あるいはサイトカイン、ケモカイン、および、flt-3Lの組み合わせをコ
ードする外来遺伝子を提供し得る。
【００２１】 本発明群で使用する組換えベクターは、バクテリアベクター、ウイルスベクタ
ー、核酸を基にした（based）ベクター、および、その類似物からなる。組換え
ウイルスベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、
アルファウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、イリドウイルス、およ
び、その類似物を含むが、これらには限定されない。ポックスウイルスは、オル
トポックス、鳥類のポックス、suipox、および、カプリポックスを含むが、これ
らには限定されない。
【００２２】 本発明は、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する
増強された免疫応答を提供する、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子ある
いはその一部を含む、組換えウイルスを提供し、それは、一つあるいは二つの共
刺激分子をコードする1または複数の遺伝子を含む組換えウイルスにより提供さ
れる応答より強い。本発明の組換えウイルスは、複数の共刺激分子をコードする
外来遺伝子と組み合わせた、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エ
ピトープをコードする外来遺伝子をさらに提供し得る。その組換えウイルスは、
IL-2、IL-12、GM-CSF、および、その類似物を含むが、これらには限定されない
、サイトカイン；MIP1、MIP2、RANTES、および、その類似物といったケモカイン
；および、DC増殖を刺激するFlt-3L；といった、他のクラスの免疫刺激分子をコ
ードする外来遺伝子をさらに提供し得る。
【００２３】 本発明は、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する
増強された免疫応答を提供する、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子ある
いはその一部を含む組換えポックスウイルスをさらに提供し、それは一つあるい
は二つの共刺激分子をコードする1または複数の遺伝子を含む組換えポックスウ
イルスにより提供される応答より強い。本発明の組換えポックスウイルスは、複
数の共刺激分子をコードする外来遺伝子と組み合わせた、少なくとも一つの標的
抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子をさらに提供し得
る。
【００２４】 本発明はまた、複数の共刺激分子をコードしそして発現する核酸配列を含む組
換えポックスウイルスを提供し、前記核酸配列は、共刺激分子のB7ファミリーに
由来する少なくとも一つの分子をコードする核酸配列、ICAM-1共刺激分子をコー
ドする核酸配列、および、LFA-3共刺激分子をコードする核酸配列を含む。その
組換えウイルスは、さらに、それぞれの外来遺伝子の発現を制御する、ポックス
ウイルスプロモーターの多様性を提供する。
【００２５】 本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来DNAを含むプラスミドベクター
を、親となるウイルスゲノムへ組換えを行なって、そのゲノムに外来DNAを挿入
された組換えウイルスを作成することにより、産生される組換えウイルスを提供
する。組換えによって産生される組換えウイルスは、さらに、プラスミドベクタ
ーにより提供される、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトー
プをコードする外来遺伝子を含み得る。
【００２６】 本発明はまた、共刺激分子LFA-3、ICAM-1および、B7ファミリーに由来する少
なくとも一分子をコードする外来DNAを含むプラスミドベクターを、親となるポ
ックスウイルスゲノムへ組換えを行なって、そのゲノムに外来DNAを挿入された
組換えウイルスを作成することにより産生される組換えポックスウイルスを提供
し、また、外来DNAの発現を制御可能にするポックスウイルスプロモーターの多
様性を提供する。組換えによって産生される組換えポックスウイルスは、さらに
、プラスミドベクターにより提供される、少なくとも一つの標的抗原あるいはそ
の免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含み得る。
【００２７】 本発明の目的は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列をもつ組換えベ
クターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対す
る免疫応答を増強する免疫原を提供することである。そのベクターは、さらに、
少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核
酸配列を含み得る。
【００２８】 本発明の別の目的は、三つあるいはそれ以上の共刺激分子をコードする外来核
酸配列をもつ組換えウイルスベクターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、
その免疫学的エピトープに対する免疫応答を増強する免疫原を提供することであ
る。その組換えウイルスベクターは、さらに、少なくとも一つまたはそれ以上の
標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る
。
【００２９】 さらに本発明の別の目的は、共刺激分子LFA-3、ICAM-1、および、B7ファミリ
ー由来の少なくとも一分子、をコードする外来核酸配列、および、少なくとも一
つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含む
、組換えポックスウイルスベクターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、そ
の免疫学的エピトープに対する免疫応答を増強する免疫原を提供することである
。
【００３０】 本発明のベクターは、標的細胞、標的抗原、あるいは、そのエピトープに対す
る免疫応答の誘導、および、増強により、疾患状態の保護および／または治療の
ための、ワクチンを提供する。そのベクターワクチンは、複数の共刺激分子をコ
ードする外来核酸配列を含む。そのベクターワクチンは、疾患に対する一価ある
いは多価のワクチンを産生するために、一つまたはそれ以上の標的抗原あるいは
その免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列もまた、含み得る。
【００３１】 本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列をもつベクター、およ
び、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。そのベクターは、
さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードす
る外来核酸配列を含み得る。そのベクターは、さらに、サイトカイン、ケモカイ
ン、flt-3L、あるいは、それらの組み合わせをコードする、核酸配列を含み得る
。
【００３２】 本発明は、三つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする、外来または外因性
の遺伝子、あるいは、その機能的な一部を含む組換えウイルスベクター、少なく
とも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子、
および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。
【００３３】 本発明はまた、複数の共刺激分子をコードする、外来遺伝子あるいはその一部
を含む組換えポックスウイルス、および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤
組成物を提供する。その組換えポックスウイルスは、さらに、少なくとも一つの
標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る
。
【００３４】 本発明の別の観点は、三つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする、外来遺
伝子あるいはその一部を含む、組換えポックスウイルスを含む薬剤組成物であり
、また、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープを
コードする外来遺伝子あるいはその一部、および、薬剤的に許容できる担体ある
いはその免疫学的エピトープを含み得る。
【００３５】 本発明はまた、複数の共刺激分子をコードする、外来遺伝子あるいはその機能
的な一部を含む第一のベクター、および、少なくとも一つの標的抗原あるいはそ
の免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む第二のベクター、および、
薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。
【００３６】 本発明は、宿主細胞内で複数の共刺激分子の発現をひき起こす、複数の共刺激
分子をコードする外来遺伝子を含む第一のベクターを、感染、トランスフェクシ
ョン、あるいは、形質導入した宿主細胞を提供する。第一のベクターあるいは第
二のベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピ
トープをコードする外来遺伝子を、宿主細胞に提供し得る。
【００３７】 本発明は、複数の共刺激分子の発現あるいは過剰発現をひき起こす、複数の共
刺激分子をコードする、外来あるいは外因的に提供された遺伝子を含む第一のベ
クターを、感染、トランスフェクション、あるいは、形質導入した、抗原提示細
胞（APC）、あるいは、腫瘍細胞を提供する。第一のベクターあるいは第二のベ
クターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープ
をコードする外来遺伝子を、宿主細胞に提供し得る。
【００３８】 本発明はさらに、複数の共刺激分子の発現を引き起こす、また、場合により標
的抗原あるいはその免疫学的エピトープの発現を引き起こす、組換えポックスウ
イルスを感染させた宿主細胞を提供する。
【００３９】 本発明の別の観点は、感染、トランスフェクション、あるいは、遺伝子的操作
をして、複数の外因性共刺激分子をコードする遺伝子を過剰発現させた樹状細胞
（DC）およびその前駆細胞である。DCおよびその前駆細胞は、さらに操作して、
少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺
伝子を発現させ得る。
【００４０】 さらに本発明の別の観点は、遺伝子的に操作して、少なくとも三つの外因性共
刺激分子をコードする遺伝子を過剰発現させた、DCおよびその前駆細胞である。
DCおよびその前駆細胞は、さらに操作して、少なくとも一つの標的抗原あるいは
その免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を発現させ得る。
【００４１】 本発明は、遺伝子的に操作して、少なくとも一つのB7分子、ICAM-1、および、
LFA-3をコードする遺伝子を過剰発現させた、DCおよびその前駆細胞を提供する
。DCおよびその前駆細胞は、さらに操作して、少なくとも一つの標的抗原あるい
はその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を発現させ得る。
【００４２】 本発明は、（a）様々なウイルスプロモーター、（b）複数の共刺激分子をコー
ドする外来核酸配列、（c）エレメント（a）および（b）の構築物に隣接するDNA
配列を含む、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を発現することができ
る組換えウイルスを産生するように計画した、親となるウイルスの組換えの方法
およびプラスミドベクターを提供し、ここで隣接配列はその5'端、および、3'端
の両方で、エレメント（a）と（b）が挿入されている、親となるウイルスゲノム
の領域と相同性を有する。プラスミドベクターは、さらに、少なくとも一つの標
的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を提供し得る
。プラスミドベクターはまた、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を提供し
得る。
【００４３】 本発明はまた、（a）様々なポックスウイルスプロモーター、（b）LFA-3、ICA
M-1、および、少なくとも一つのB7分子をコードする外来核酸配列、（c）エレメ
ント（a）および（b）の構築物に隣接するDNA配列を含む、共刺激分子LFA-3、IC
AM-1、および、少なくとも一つのB7分子をコードする外来核酸配列を発現するこ
とができる組換えポックスウイルスを産生するように計画した、親となるポック
スウイルスの組換えの方法、および、プラスミドベクターを提供し、ここで隣接
配列はその5'端、および、3'端の両方で、エレメント（a）と（b）が挿入されて
いる、親となるウイルスゲノムの領域と相同性を有する。プラスミドベクターは
、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコード
する外来核酸配列を提供し得る。プラスミドベクターはまた、選択可能なマーカ
ーをコードする遺伝子を提供し得る。
【００４４】 本発明の一つの観点は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む、
第一のベクターの投与を含む、少なくとも一つの標的細胞、標的抗原、あるいは
、その免疫学的エピトープに対する、哺乳動物における免疫学的応答を増強する
方法であり、各共刺激分子は、哺乳動物において少なくとも一つの免疫学的応答
を増強するのに効果的な量で、哺乳動物の細胞に発現される。本発明において有
用性をもつ、共刺激分子をコードする遺伝子あるいはその機能的な部分は、B7フ
ァミリーメンバー、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40
Lおよびそのホモログ、および、その一部を含むが、これらには限定されない。
少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核
酸配列は、第一のベクター、あるいは、第二のベクターによる方法において、さ
らに、提供され得る。
【００４５】 複数の共刺激分子をコードする遺伝子あるいはその部分に加えて、他のクラス
の免疫刺激分子の少なくとも一つあるいは組み合わせをコードする外来または外
因性核酸配列、あるいは、その機能的な部分もまた、第一のベクター、第二のベ
クター、あるいは、第三のベクターにより、提供され得る。他のクラスの免疫刺
激分子は、IL-2、IL-12、GM-CSF、および、その類似物といったサイトカイン；M
IP1、MIP2、RANTES、および、その類似物といったケモカイン；および、Flt-3L
；を含む。
【００４６】 本発明の観点は、複数の共刺激分子LFA-3、ICAM-1、および、少なくとも一つ
のB7分子をコードする核酸配列を含む、外来組換えポックスウイルスの投与を含
む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する、哺乳動
物における抗原特異的T細胞の免疫学的応答を増強する方法であり、各共刺激分
子は、一つ、あるいは、その増強が二つの共刺激分子の投与により提供される増
強の和よりも大きい、少なくとも一つのT細胞免疫応答を増強するのに効果的な
量で、哺乳動物において細胞に発現される。
【００４７】 免疫学的応答を増強させる他の方法では、外来あるいは外因性に提供される複
数の共刺激分子を発現するAPCあるいは腫瘍細胞は、免疫学的応答の増強に効果
的な量で哺乳動物に提供される。APCあるいは腫瘍細胞は、免疫応答の増強のた
めに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする
外来遺伝子をさらに発現し得る。標的抗原あるいはその免疫学的エピトープはAP
Cあるいは腫瘍細胞の投与より先行して、または同時に、または続いて哺乳動物
に投与することができる。加えて、または、二者択一的に、APCあるいは腫瘍細
胞を、哺乳動物に投与する前に、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学
的エピトープで、パルスする。
【００４８】 本発明は、哺乳動物において、体液性応答の増強に効果的な量で、複数の共刺
激分子をコードする外来核酸配列を含む組換えベクターをほ乳動物に対して投与
することを含む、標的細胞、標的抗原あるいはその免疫学的エピトープに対する
体液性の応答を増強する方法を提供する。そのベクターは、さらに、少なくとも
一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする核酸配列を含み得
る。本発明は、さらに、本方法により産生された、標的細胞、標的抗原あるいは
その免疫学的エピトープに対する、単離された抗体あるいはその機能的な部分を
提供する。
【００４９】 本発明はまた、B7、ICAM-1、および、LFA-3をコードする外来遺伝子、および
、一つまたはそれ以上の標的抗原あるいはそのエピトープをコードする遺伝子を
含む、組換えポックスウイルスの投与に応答して産生される、標的抗原もしくは
その免疫学的エピトープに特異的な抗体を提供する。
【００５０】 発明の詳細な記述 本発明は、複数の共刺激分子を組み合わせたものまたは共刺激分子それぞれの
機能性活性部分をコードする外来遺伝子を含む組換えベクターである。本明細書
中で用いる複数の共刺激分子は、少なくとも3つ以上の共刺激分子である。本明
細書中で用いる機能性活性部分は、それの各リガンドに結合して免疫細胞活性化
に適した共刺激信号をトリガーするのに関与する分子部分である。機能性活性を
測定するための1方法は、本明細書に記載するようにin vitroで共刺激分子をタ
ーゲット細胞へ運搬することによる天然T細胞増殖の誘発を利用するものである
。共刺激分子の機能性部分は、T細胞増殖を少なくとも20％高める。
【００５１】 本明細書中で用いる外来遺伝子もしくは外来核酸配列またはその機能性部分と
いう用語は、宿主細胞または宿主生物に組換えベクターにより外から供給された
遺伝子、核酸配列またはその機能性部分である。宿主細胞または宿主生物に供給
される外因性遺伝子またはその部分は、宿主細胞または宿主生物に内在しないも
のであってもよく、あるいは内在し、機能性または非機能性であってもよい。機
能性内因性遺伝子が宿主細胞または宿主生物中に存在する場合、外来の、すなわ
ち外から供給される遺伝子またはその機能性部分はその遺伝子の生成物を過剰発
現する。
【００５２】 本発明の組換えベクターは、Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、抗原提示細胞（
APC）など（これらに限定されない）を含めた免疫系細胞に増強した免疫応答を
与えるのに有用である。複数の共刺激分子を発現する組換えベクターによる免疫
応答増強は、免疫応答の増強に単一の共刺激分子を用いる場合または2つの共刺
激分子を用いる場合と比較して、相乗的である。免疫応答は、細胞性および／ま
たは体液性免疫応答であってもよく、特定のターゲット抗原またはそのエピトー
プに向けられてもよく、あるいはサイトカイン放出増加、免疫細胞増殖の増大、
マイトジェン応答性増大などにより証明されるような、全般的免疫増強作用また
はアップレギュレーション作用であってもよい。好ましくは、免疫応答の増強に
は、本発明の組換えベクターを用いて、または本発明の組換えベクターによりト
ランスフェクション、トランスダクションまたは誘発された細胞を用いて刺激し
た結果としての過剰刺激または高力T細胞刺激（high intensity T cell stimula
tion, HITS）が含まれる。
【００５３】 共刺激分子をコードする外来遺伝子は、多様な供給源から得ることができる。
共刺激分子をコードする外来遺伝子の供給源の選択は、その組換えベクターを用
いて免疫化または処理する種に依存するであろう。
【００５４】 共刺激分子をコードする外来遺伝子は、ネズミ由来、ヒト由来、サル由来、他
の哺乳動物の相同体であってもよく、哺乳動物遺伝子に基づいて化学的に合成で
きる。共刺激分子をコードする外来遺伝子は、鳥類由来であってもよく、または
鳥類の共刺激分子遺伝子に基づいて化学的に合成されてもよい。本発明の組換え
ベクターは、免疫原として、またターゲット細胞、ターゲット抗原およびその免
疫エピトープに対する免疫応答の増強を刺激するワクチンとして有用である。複
数の共刺激分子をコードする遺伝子を含む本発明の組換えベクターを用いたその
ようなレベルの免疫応答増強は、単一または2つの共刺激分子を用いては得られ
なかった。
【００５５】 本発明に有用な共刺激分子をコードする遺伝子またはその機能性部分には、B7
.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40L、哺乳
動物相同体などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組換えベクター
は、単一または2つの共刺激分子を用いては得られない相乗的な免疫応答増強を
得るために、少なくとも3つの共刺激分子をコードする遺伝子を含む。組換えベ
クターに用いるための種々の組合わせの共刺激分子をコードする遺伝子は本発明
の範囲に含まれ、目的とする免疫応答および処置すべき疾患または状態に応じて
下記の組合わせを含むことができる：B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3；B7.1、B7.2
、ICAM-1、LFA-3；B7.1、B7.2、ICAM-1、4-1BBL；B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、
4-1BBL；CD59、VCAM-1；およびB7.1、B7.2；CD59、CD40、4-1BBL、CD70およびVC
AM-1、B7.1、B7.2；OX-40L、4-1BBLなど。1つまたは2つの共刺激分子をコードす
る組換えベクターの使用と比較して3つの共刺激分子をコードする組換えベクタ
ーを用いて達成される著しい相乗的免疫応答に基づけば、4、5またはそれ以上の
共刺激分子をコードする組換えベクターは、相乗的免疫応答、または3つの共刺
激分子をコードする組換えベクターを用いた場合と同等またはより大きな免疫応
答を生じるであろう。
【００５６】 B7はIg遺伝子スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子ファミリーを表
す。このメンバーには、ネズミB7.1（CD80）およびB7.2（CD86）が含まれる。B7
.1およびB7.2はCD28／CTLA-4（CD152）の天然リガンドである。ネズミB7.1の遺
伝子配列は、Freeman et al.（J. Immunol., 143：2714-2722, 1989）中に、お
よびGENEBANKに寄託No. X60958で開示されている。ネズミB7.2の遺伝子配列は、
Azuma et al.（Nature, 366, 76-79, 1993）、ならびにGENEBANKに寄託No. L256
06およびMUSB72Xで開示されている。
【００５７】 ネズミB7共刺激分子のヒト相同体およびその機能性部分は本発明の範囲に含ま
れ、ヒトの臨床用組換えベクターに特に有用である。ネズミB7共刺激分子のヒト
相同体には、CD80、すなわちネズミB7.1の相同体、CD86、すなわちB7.2の相同体
が含まれる。ヒトB7.1（CD80）の遺伝子配列はGENEBANKに寄託No. M27533で開示
され、ヒトB7.2（CD86）の遺伝子配列は寄託No. U04343およびAF099105で開示さ
れている。本発明を実施するにはライセンスが要求されるであろう。
【００５８】 本発明に用いるためには、組換えベクターは、他の共刺激分子のほかにB7共刺
激分子ファミリーのうちの少なくとも1つの分子またはB7共刺激分子もしくはそ
の機能性部分の組合わせをコードする外来核酸配列を含むことができる。B7共刺
激分子の組合わせには、2以上のB7.1分子、2以上のB7.2分子、B7.1とB7.2などが
含まれるが、これらに限定されない。1態様において、組換えベクターは、B7.1
分子をコードする外来核酸配列を、LFA-3およびICAM-1をコードする外来核酸配
列と共に含む。
【００５９】 細胞間接着分子（ネズミICAM-1、CD54）およびヒト相同体CD54も共刺激分子と
して作用する。そのリガンドは、リンパ球および顆粒球の表面に発現する白血球
機能関連抗原-1（leucocyte function-associated antigen-1, LFA-1、CD11a／C
D18）である。ネズミICAM-1の遺伝子はGenBankに寄託No. X52264で開示され、ヒ
トICAM-1相同体（CD54）の遺伝子は寄託No. J03132で開示されている。1態様に
おいて、本発明の組換えベクターは、2以上の他の共刺激分子をコードする外来
核酸配列のほかに、少なくとも1つのネズミICAM-1分子、ヒト相同体、他の哺乳
動物相同体またはその機能性部分をコードする外来核酸配列を含む。
【００６０】 共刺激分子白血球機能抗原3であるネズミLFA-3（CD48）およびそのヒト相同体
LFA-3（CD58）、すなわちグリコシル-ホスファチジルイノシトール結合糖タンパ
ク質は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー内のCD2ファミリーのメンバ
ーである。LFA-3の天然リガンドは、胸腺細胞、T細胞、B細胞およびNK細胞上に
発現するCD2（LFA-2）である。ネズミLFA-3の遺伝子はGenBankに寄託No. X53526
で開示され、ヒト相同体の遺伝子は寄託No. Y00636で開示されている。
【００６１】 T細胞抗原4-1BBLは、抗原刺激した一次T細胞培養物およびレクチン駆動による
胸腺細胞活性化において共刺激信号を中継する共刺激分子である（Hurtado, J.
C. et al., J. Immunol., 158（6）：2600-2609, 1997）。4-1BBLは腫瘍壊死因
子受容体スーパーファミリー、すなわちサイトカインに富む一群の細胞表面分子
に属する（Vinay, D. S. et al., Seminars in Immunol., 1998, Vol. 10, pp.
481-489）。ネズミ4-1BBLに対する遺伝子はGenBankに寄託No. U02567で開示され
ている。ヒト相同体hu4-1BBLの遺伝子はGenBankに寄託No. U03397で開示されて
いる。
【００６２】 OX-40Lは、TNFとの相同体が限られたII型膜タンパク質であり、in vitroでOX-
40+T細胞に対し刺激性である。ネズミとヒトのOX-40L cDNAはヌクレオチドレベ
ルで68％、アミノ酸レベルで46％の相同性をもつ。ヒトOX-40LはヒトT細胞のみ
を刺激するが、ネズミOX-40Lはヒトとマウスの両方の細胞を刺激する。APCはOX-
40Lを発現し、CD+T細胞に抗原を提示する際、OX-40L：OX-40R信号を伝達するこ
とができる。OX-40L信号伝達はヒト樹状細胞の分化にとって重要であり、またIL
-12、TNF-α、IL-1BおよびIL-6の産生を増加させる（Weinberg, A. D. et al.,
1998, Seminars in Immunol., Vol. 10：471-480）。OX-40Lは一次CD4+T細胞応
答の持続に有効な共刺激分子であり、B7-1と組み合わせて用いられる（Gramagli
a, I. et al., 1989, J. Immunology, Vol. 161：6510-7）。
【００６３】 本発明に有用なベクターは、少なくとも3またはそれより多い外来遺伝子、好
ましくは5以上の外来遺伝子を発現させることができる。本発明に有用なベクタ
ーには、宿主細胞において少なくとも3つの外来共刺激分子遺伝子生成物を機能
性発現しうる任意のベクターが含まれる。このベクターは、少なくとも3つの外
来共刺激分子をコードする遺伝子のほかに、少なくとも1つのターゲット抗原ま
たはその免疫エピトープ、ならびに選択性マーカーをコードする少なくとも1つ
の外来遺伝子を発現させることができる。
【００６４】 本発明のベクターには、細菌（たとえばSalmonella）ベクター、ウイルスベク
ター、核酸ベースベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス
ベクターには、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルフ
ァウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、イリドウイルスなどが含まれ
るが、これらに限定されない。本発明に有用なポックスウイルスには、複製性お
よび非複製性ベクターが含まれる。そのようなポックスウイルスには、オルトポ
ックス、たとえばワクシニア、アライグマ（raccoon）ポックス、ウサギポック
スなど、アビポックス、スイポックス、カプリポックスなどが含まれるが、これ
らに限定されない。ポックスウイルスは、ワクシニア-コペンハーゲン、ワクシ
ニア-Wyeth株、ワクシニア-MVA株、NYVAC、ニワトリポックス（fowlpox）、TROV
AC、カナリアポックス、ALVAC、ブタポックスよりなる群から選択できる。1態様
において、組換えベクターはワクシニアウイルスである。他の態様において、組
換えベクターはニワトリポックスである。
【００６５】 本発明の好ましいベクターは、組換えウイルス、好ましくはポックスウイルス
である。本発明に有用な組換えポックスウイルスは、下記を含めた多数の利点を
もつ：（i）APCおよび腫瘍細胞を含めた多数の細胞タイプへの効率的な遺伝子運
搬；（ii）高レベルのタンパク質発現；（iii）免疫系への最適な抗原提示；（i
v）細胞仲介による免疫応答および抗体応答を誘発する能力；（v）永久的ではな
く一過性の細胞遺伝子修飾、ならびに（vi）異なる属に由来するポックスウイル
スの併用が可能であること（それらは免疫学的に交差反応性ではないので）。本
発明の組換えポックスウイルスの構築に有用な親ポックスウイルスには下記のも
のが含まれるが、これらに限定されない：オルトポックスウイルス、たとえば複
製性ワクシニアウイルス（Perkus et al., Science, 229：981-984, 1985；Kauf
man et al., Int. J. Cancer, 48：900-907, 1991；Moss, Science, 252：1662,
1991）、高弱毒化ワクシニアウイルス、たとえばMVA、修飾ワクシニア-アンカ
ラ（Sutter and Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 89：10847-10851；Sut
ter et al., Virology, 1994）、ワクシニア-コペンハーゲンおよびNYVAC；アビ
ポックスウイルス（15）、たとえばニワトリポックスウイルス（15）、カナリア
ポックスウイルス、たとえばALVACなど（Baxby and Paoletti, Vaccine, 10：8-
9, 1992；Rinns, M. M. et al.（編）, Recombinant Poxviruses, CRC Press社,
Boca Raton, 1992；Paoletti, E., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93：11349-1
1353, 1996）、ならびにスイポックスウイルス、カプリポックスウイルスなど。
【００６６】 1態様において、親ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。具体的な
態様において、ワクシニアウイルスはWyeth株またはそれに由来する株である。W
yeth株に由来する株には、機能性K1L遺伝子を欠如するvTBC33などが含まれるが
、これらに限定されない。さらに他の態様において、ウイルスは天然痘ワクチン
としてCenters for Disease Control（ジョージア州アトランタ）から入手でき
るDry-Vaxである。他の態様において、親ウイルスはニワトリポックスの株、た
とえばPOXVAC-TC（Schering-Plough社）などである。
【００６７】 本発明の組換えベクターは、宿主において宿主細胞を感染、トランスフェクシ
ョンまたはトランスダクションさせることができる。宿主には哺乳動物、鳥類、
魚類などが含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞は、組換えベクターに
より感染、トランスフェクションまたはトランスダクションされやすく、かつ組
換えベクターからの外来遺伝子を機能的レベルで発現できる任意の細胞である。
宿主細胞には、プロフェッショナルAPC、および抗原提示前駆細胞、たとえば単
球、マクロファージ、DC、ランゲルハンス細胞などが含まれるが、これらに限定
されない。本発明の組換えベクターは、腫瘍細胞、または他の細胞タイプ、たと
えば線維芽細胞もしくは筋細胞を感染させることもできる。宿主細胞の感染によ
り外来の外因性共刺激分子それぞれが発現し、またターゲット抗原（1以上）が
組換えベクター中にある場合にはターゲット抗原をコードする外来核酸配列が発
現することができる。宿主細胞は、CD4+および／またはCD8+T細胞に適切に抗原
を提示するのに適したMHC（HLA）クラスIまたはII分子を発現するか、あるいは
発現するように工学的に処理される。したがって、実質的にいかなる哺乳動物細
胞も、複数の共刺激分子を発現する適切な抗原提示細胞になるように工学的に処
理することができる。
【００６８】 本発明の組換えベクターは、機能可能な状態で核酸配列に結合した少なくとも
1つの発現制御要素を含む。発現制御要素は、核酸配列の発現を制御および調節
するためにベクターに挿入される（Ausubel et al., 1987, ”Current Protocol
s in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, ニューヨーク州ニューヨー
ク）。発現制御要素は当技術分野で既知であり、プロモーターがこれに含まれる
。本発明に有用なプロモーターは当技術分野で既知のポックスウイルスプロモー
ターであり、30K、I3、sE／L、7.5K、40K、C1などが含まれるが、これらに限定
されない。30Kプロモーターの核酸配列は、GenBank寄託No. M35027の塩基番号28
,012〜28,423（アンチセンス）に開示されている。I3の核酸配列は、GenBank寄
託NoJ03399の塩基番号1100〜1301（アンチセンス）に開示されている。7.5Kプロ
モーターの核酸配列は、GenBank寄託No. M35027の塩基番号186550〜186680に開
示されている。40Kプロモーターの核酸配列は、GenBank寄託No. M13209の塩基番
号9700〜9858（アンチセンス）に開示されている。C1プロモーターの核酸配列は
、GenBank寄託No. M59027の塩基番号1〜242、およびUSP 5,093,258に開示されて
いる。sE／Lプロモーターの配列は、参考文献16に開示されている。他のポック
スウイルスプロモーター、たとえばDavison and Mos（J. Mol. Biol., 210：749
-769（1989））により記載されるものを使用できる。これらのプロモーターはい
ずれも当技術分野の標準法により合成できる。適切なプロモーターの選択は、そ
れの発現のタイミングおよびレベルに基づく。初期または初期／後期プロモータ
ーが好ましい。好ましい態様においては、用いるプロモーターまたは組合わせプ
ロモーターにより、感染宿主中でそれぞれの共刺激分子を相乗的免疫応答を得る
のに最適な状態で発現させることができる。好ましい態様においては、共刺激分
子をコードする外来遺伝子それぞれを、離れた別個のプロモーターにより制御す
る。
【００６９】 核酸ベースベクターの場合、構築体は脂質キャリヤーと結合した／またはそれ
に封入された核酸（DNAまたはRNA）であってよい。所望により、脂質キャリヤー
分子および／または構築体を特定のターゲット細胞タイプ（1以上）にターゲテ
ィングさせ、および／またはそこで発現させることができる。裸のDNAベクター
は、USP 5,827,703に記載の方法で調製できる。転写開始領域またはプロモータ
ー要素については、そのDNA配列を目的レベルで転写するものであればいかなる
領域も使用できる。転写開始領域は、宿主細胞および／または転写されるDNAに
対して天然または相同であってもよく、あるいは宿主細胞および／または転写さ
れるDNA配列に対して外来または異種であってもよい。裸のDNAの転写開始に効果
的なプロモーター要素には、SV40（シミアンウイルス40）初期プロモーター、RS
V（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター
、ヒトCMV（サイトメガロウイルス）極初期Iプロモーターなどが含まれるが、こ
れらに限定されない。核酸ベースベクターは、注射器、カテーテル、または注射
針を用いない注入、たとえば遺伝子銃により宿主に運搬できる。
【００７０】 本発明の1態様においては、第1共刺激分子またはその機能性部分をコードする
第1プロモーター制御下の外来核酸配列、第2共刺激分子またはその機能性部分を
コードする第2プロモーター制御下の外来核酸配列、および第3共刺激分子または
その機能性部分をコードする第3プロモーター制御下の外来核酸配列を含む組換
えベクターが提供される。この組換えベクターはさらに、ターゲット抗原または
その免疫性部分をコードする第4プロモーター制御下の外来核酸配列を備えてい
てもよい。
【００７１】 本発明の1態様においては、LFA-3またはその機能性部分をコードする30Kポッ
クスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、ICAM-1またはその部分をコードす
るI3ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、およびB7.1またはその部
分をコードするsE／Lポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む組
換えポックスウイルスが提供される。そのような組換えポックスウイルス構築体
の一例は、図11Aに示すワクシニアvT171である。この組換えポックスウイルスは
、さらに腫瘍関連抗原またはその免疫性部分をコードする核酸配列を備えていて
もよい。この本発明の1態様は、図4Cに示す組換えワクシニアvT172である。
【００７２】 本発明の1態様においては、B7.1をコードするsE／Lポックスウイルスプロモー
ター制御下の核酸配列、LFA-3またはその部分をコードするI3ポックスウイルス
プロモーター制御下の核酸配列、およびICAM-1またはその部分をコードする7.5K
ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む組換えポックスウイルス
が提供される。この構築体は、さらに少なくとも1つのターゲット抗原またはそ
の免疫エピトープをコードする核酸配列、および／または選択性マーカーをコー
ドする核酸配列を備えていてもよい。そのような組換えポックスウイルス構築体
の1態様は、選択性マーカーとしてlacZ遺伝子を含む、図4Bに示すワクシニアvT1
99である。
【００７３】 本発明の1態様において、組換えニワトリポックスウイルスは、B7.1またはそ
の部分をコードするsE／Lポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、LFA
-3またはその部分をコードするI3ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配
列、およびICAM-1またはその部分をコードする7.5Kポックスウイルスプロモータ
ー制御下の核酸配列を含む。この態様の一例は、図4Aに示すニワトリポックスvT
222である。組換えニワトリポックスウイルスはさらに、ターゲット抗原CEAをコ
ードする40Kポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、および選択性マ
ーカーlacZをコードするC1ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含
むことができる。この態様の一例は、図4Bに示すニワトリポックスvT194である
。
【００７４】 他の態様において、組換えニワトリポックスウイルスは、腫瘍関連抗原MUC-1
またはその部分をコードする40Kプロモーター制御下の核酸配列、LFA-3またはそ
の部分をコードする30Kプロモーター制御下の核酸配列、ICAM-1またはその部分
をコードするI3プロモーター制御下の核酸配列、およびB7.1またはその部分をコ
ードするsE／Lポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む（図14Cに
示す）。この組換えニワトリポックスウイルスは、いずれかの腫瘍関連抗原また
はその部分をコードする核酸配列、ならびにLFA-3、ICAM-1およびB7.1をコード
する、多数のプロモーターの制御下にある核酸配列を含むことができる（図4Dに
示す）。
【００７５】 本発明の他の態様は、共刺激分子LFA-3、B7およびICAM-1のヒト相同体をコー
ドする核酸配列を含む組換えベクターである。この組換えベクターはさらに、感
染した宿主細胞中で各配列を発現させるのに適したプロモーターを備えていても
よい。この組換えベクターの1態様は、図9に示すvT224である。
【００７６】 本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含むプラスミドベク
ターを提供する。1態様において外来核酸配列は、B7、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、
CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40Lなどよりなる群から選択される少なくとも3
つ、またはそれより多い共刺激分子をコードするように選択される。本発明の1
態様においては、少なくとも1つのB7共刺激分子をコードする外来核酸配列、ICA
M-1共刺激分子をコードする外来核酸配列、およびLFA-3共刺激分子をコードする
外来核酸配列を含むプラスミドベクターが提供される。本発明のプラスミドベク
ターはさらに、共刺激分子の発現を制御するための少なくとも1つのプロモータ
ー配列を備えている。好ましい態様において、共刺激分子をコードするそれぞれ
の核酸配列は、離れた別個のプロモーター配列により制御される。組換えポック
スウイルスの作成に用いるには、本発明のプラスミドベクターはさらに、ポック
スウイルスゲノムの非必須領域に由来するフランキングウイルス核酸配列を備え
ている。フランキングウイルス核酸配列は、相同組換えによる、外来配列への親
ポックスウイルスゲノムの挿入を指令する。本発明のプラスミドベクターはさら
に、当技術分野で既知のように、挿入された外来DNAを含む組換え子孫の選択お
よび同定のための1以上の選択性マーカーを含んでもよい。これにはワクシニアK
1L宿主域遺伝子、大腸菌（E. coli）lacZ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、β-グル
クロニダーゼをコードする遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】 1態様において本発明のプラスミドベクターは、LFA-3をコードする30Kプロモ
ーター制御下の核酸配列、ICAM-1をコードするI3プロモーター制御下の核酸配列
、およびB7をコードするsE／Lプロモーター制御下の核酸配列を、ワクシニアゲ
ノムのHind III M領域の各部分によりフランキングされた状態で含む。1態様に
おいて、このプラスミドベクターは図1にpT5032として示される。
【００７８】 他の態様において本発明のプラスミドベクターは、B7をコードするsE／Lプロ
モーター制御下の核酸配列、LFA-3をコードするI3プロモーター制御下の核酸配
列、およびICAM-1をコードする7.5Kプロモーター制御下の核酸配列を含む。この
プラスミドベクターはさらに、別個のプロモーター配列により駆動されるlacZ遺
伝子またはその部分を含むことができる。これらの配列は、ワクシニアゲノムの
Hind III J領域の各部分によりフランキングされている。このプラスミドベクタ
ーの具体的態様を、図2にpT5047として示す。
【００７９】 他の態様において本発明のプラスミドベクターは、B7、ICAM-1およびLFA-3を
コードする核酸配列と組み合わせて、少なくとも1つのターゲット抗原またはそ
の免疫エピトープをコードする核酸配列を含む。ターゲット抗原の発現を制御す
るためのプロモーターが備えられている。このプラスミドベクターの具体的態様
は図3にpT5031として示され、ターゲット抗原CEAをコードする核酸配列を含む。
【００８０】 他の態様において本発明のプラスミドベクターは、腫瘍関連抗原CEAをコード
する40Kプロモーター制御下の核酸配列、B7をコードするsE／Lプロモーター制御
下の核酸配列、LFA-3をコードするI3プロモーター制御下の核酸配列、およびICA
M-1をコードする核酸配列を含む。図6にpT5049として示すように、このプラスミ
ドベクターはさらにlacZ遺伝子をC1プロモーター制御下に含むことができる。プ
ラスミドpT5049は、1998年11月13日、ブダペスト条約の協定に基づいてAmerican
Type Culture Collection（10801 University Boulevard, Manassa, VA20110）
にATCC寄託No. 203481として寄託された。
【００８１】 さらに他の態様において本発明のプラスミドベクターは、huLFA-3をコードす
る30Kプロモーター制御下の核酸配列、huICAM-1をコードするI3Kプロモーター制
御下の核酸配列、およびhuB7.1をコードするsE／Lプロモーター制御下の核酸配
列を含む。このプラスミドベクターの具体的態様を図8にpT5064として示す。こ
れは、1998年11月13日、ブダペスト条約の協定に基づいてATCCにATCC寄託No. 20
3482として寄託された。
【００８２】 本発明のプラスミドベクターは、組換えベクター作成方法に用いるためのキッ
トの形で提供することができる。このキットはさらに、親ウイルス、および組換
え法に用いる他の試薬を備えていてもよい。
【００８３】 本発明はさらに、複数の共刺激分子をコードする核酸配列を含む組換えポック
スウイルスの作成方法を提供する。組換えポックスウイルスを作成するための1
方法は、USP 5,093,258に開示されるように、親ポックスウイルスゲノムDNAと挿
入すべき異種配列を保有するプラスミドベクターとの間でのin vivo相同組換え
により達成される。外来配列をポックスウイルスに挿入するためのプラスミドベ
クターは、組換えDNA技術の標準法により構築される（36）。プラスミドベクタ
ーは、それぞれタンパク質コード配列に結合したポックスウイルスプロモーター
を含む1以上のキメラ外来遺伝子を、ポックスウイルスゲノムの非必須領域に由
来するウイルス配列によりフランキングされた状態で含む。親ポックスウイルス
に感染させた細胞内へ、受け入れられているトランスフェクション法によりこの
プラスミドをトランスフェクションすると、プラスミド上のポックスウイルス配
列と親ウイルスゲノム中の対応するDNAとの間の組換えにより、ウイルスゲノム
中へプラスミドからのキメラ外来遺伝子が挿入される。組換えウイルスは、当技
術分野で既知の任意の多様な選択系およびスクリーニング系を用いて選択および
精製される（14）。ワクシニアゲノム中への外来遺伝子の挿入は、ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）分析により確認される。外来遺伝子の発現は、ウェスタンブロ
ット分析により証明される。組換えポックスウイルスを作成するための別法は、
直接ライゲーションにより達成される（Pleiderer et al., J. Gen. Virol., 76
：2957-2962, 1995；Merchlinsky et al., Virol., 238：444-451, 1997）。
【００８４】 複数の共刺激分子をコードする核酸配列を、少なくとも1つのターゲット抗原
またはそのエピトープをコードする核酸配列と組み合わせて含む組換えベクター
の使用は、このターゲット抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を増強し
、かつこのターゲット抗原またはそのエピトープを発現する細胞に対する免疫応
答を増強するのに有用である。本発明の組換えベクターを用いて得られる、ター
ゲット抗原、エピトープ、またはターゲット抗原を発現する細胞に対する免疫応
答の程度は、単一または2つの共刺激分子を用いる系により達成されるものより
著しく大きい。
【００８５】 本発明の組換えベクターは、ターゲット抗原またはそのエピトープに対する相
乗的免疫応答を得るために、ターゲット抗原またはその免疫エピトープをコード
する核酸配列と共に、少なくとも3つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする
。1態様において組換えポックスウイルスは、B7、ICAM-1およびLFA-3をコードす
る核酸配列を、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコ
ードする核酸配列と共に備えている。場合により、多価ワクチンを得るために、
1以上の核酸配列を用いて複数のターゲット抗原またはその免疫エピトープを生
成することが有益であろう。
【００８６】 本明細書中で用いるターゲット抗原は、哺乳動物における病原性物質または疾
病状態の免疫認識および最終的排除または制御に際して重要な抗原またはその抗
原上の免疫エピトープである。免疫認識は細胞性および／または体液性であって
よい。細胞内病原体および癌の場合、免疫認識は好ましくはTリンパ球応答であ
る。
【００８７】 ターゲット抗原は、たとえば下記のウイルスのような病原性微生物から誘導ま
たは単離することができる：HIV（Korber et al. 編, HIV Molecular Immunolog
y Database, Los Alamos National Laboratory, ニューメキシコ州ロスアラモス
, 1977）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウ
イルス（USP 5,719,054）、B型肝炎ウイルス（USP 5,780,036）、C型肝炎ウイル
ス（USP 5,709,995）、EBV、サイトメガロウイルス（CMV）など。ターゲット抗
原は、微生物細菌、たとえばChlamydia（USP 5,869,608）、Mycobacteria、Legi
onella、Meningiococcus、A群Streptococcus、Salmonella、Listeria、Hemophil
us influenzae（USP 5,955,596）などから誘導または単離することができる。
【００８８】 ターゲット抗原は、Aspergillus、侵襲性Candida（USP 5,645,992）、Nocardi
a、Histoplasmosis、Cryptosporidiaなどを含めた病原性酵母から誘導または単
離することができる。
【００８９】 ターゲット抗原は、病原性原虫および病原性寄生虫から誘導または単離するこ
とができ、これにはPneumocystis carinii、Trypanosoma、Leishmania（USP 5,9
65,242）、Plasmodium（USP 5,589,343）およびToxoplasma gondiiが含まれるが
、これらに限定されない。
【００９０】 ターゲット抗原には、前新生物状態または過形成状態に関連する抗原が含まれ
る。ターゲット抗原は、癌関連または癌原性であってもよい。そのようなターゲ
ット抗原は、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原（TAA）または組織特異性抗原、そ
のエピトープ、およびそのエピトープアゴニストであってもよい。そのようなタ
ーゲット抗原には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：癌胎児性抗
原（CEA）およびそのエピトープ、たとえばCAP-1、CAP-1-6D（46）など（GenBan
k寄託No. M29540）、MART-1（Kawakami et al., J. Exp. Med., 180：347-352,
1994）、MAGE-1（USP 5,750,395）、MAGE-3、GAGE（USP 5,648,226）、GP-100（
Kawakami et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 91：6458-6462, 1992）、MUC-
1、MUC-2、点変異ラット癌遺伝子、正常および点変異p53癌遺伝子（Hollstein e
t al., Nucleic Acids Res., 22：3551-3555, 1994）、PSMA（Israeli et al., Cancer Res., 53：227-230, 1993）、チロシナーゼ（Kwon et al., PNAS, 84：7
473-7477, 1987）、TRP-1（gp75）（Cohen et al., Nucleic Acids Res., 18：2
807-2808, 1990；USP 5,840,839）、NY-ESO-1（Chen et al., PNAS, 94：1914-1
918, 1997）、TRP-2（Jackson et al., EMBO J, 11：527-535, 1992）、TAG72、
KSA、CA-125、PSA、HER-2／neu／C-erb／B2（USP 5,550,214）、BRC-I、BRC-II
、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、TAA類および組織特異性抗原の修飾体、TAA
類のスプライス変異体、エピトープアゴニストなど。他のTAA類は、当技術分野
で既知の方法、たとえばUSP 4,514,506に開示された方法により同定、単離およ
びクローン化することができる。ターゲット抗原には、1以上の成長因子および
それぞれのスプライス変異体も含まれる。
【００９１】 本発明を用いてターゲティングできるヒト腫瘍抗原および組織特異性抗原なら
びにその免疫エピトープには表1に例示したものが含まれるが、これらに限定さ
れない。
【００９２】
【表１】
【００９３】 DNAゲノムを含む生物については、目的とするターゲット抗原またはその免疫
エピトープをコードする遺伝子をゲノムDNAから単離する。RNAゲノムをもつ生物
については、ゲノムのcDNAコピーから目的遺伝子を単離できる。ゲノムの制限地
図が得られれば、当技術分野でルーティンな方法で制限エンドヌクレアーゼ消化
により目的遺伝子を含むDNAフラグメントを開裂させる。目的遺伝子が既にクロ
ーン化されている場合、それらの入手可能なクローンから遺伝子を容易に得るこ
とができる。あるいは、遺伝子のDNA配列が分かっている場合、デオキシリボ核
酸の合成に慣用される任意の方法で遺伝子を合成できる。
【００９４】 目的抗原をコードする遺伝子は、その遺伝子を細菌性宿主にクローニングする
ことにより増幅できる。この目的に種々の原核細胞クローニングベクターを使用
できる。その例はプラスミドpBR322、pUCおよびpEMBLである。
【００９５】 少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする遺伝
子を、標準法によりウイルスと組み換えるために設計したプラスミドベクターへ
の挿入用に調製できる。一般にクローン化遺伝子を制限酵素消化により原核細胞
性クローニングベクターから切り取ることができる。大部分の場合、切り取った
フラグメントは遺伝子の全コード領域を含むであろう。クローン化遺伝子を保有
するDNAを、必要に応じて、たとえばウイルスとの組換えに用いるDNAベクターの
挿入部位と適合するフラグメント末端を形成するために修飾し、次いで精製した
後、本明細書に記載するように制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（クローニング
部位）に挿入することができる。
【００９６】 本発明により疾病を治療または予防することができ、これらの疾病にはウイル
ス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、癌細胞などにより引き起こされる疾病が含まれ
る。複数の共刺激分子を含む組換えベクターは普遍的免疫エンハンサーとして使
用でき、したがって病因が未知である疾病の処置に有用である。
【００９７】 本発明の組換えベクターを用いて治療または予防できる前新生物状態または過
形成状態には結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、胸部病変などの前新生
物状態または過形成状態が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】 本発明の組換えベクターを用いて治療または予防できる癌には、原発性または
転移性の黒色腫、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、
肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌
、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、大腸癌、多発骨髄腫、神経芽細胞腫、NPC、膀胱癌
、子宮頚癌などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】 本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む組換えベクターを
医薬的に許容できるキャリヤー中に含む医薬組成物を提供する。共刺激分子をコ
ードする少なくとも3つの遺伝子が組換えベクターの一部を構成し、これらはB7
、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40Lなどをコードす
る遺伝子群から選択できる。組換えベクターはさらに、少なくとも1つのターゲ
ット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。
他の態様において医薬組成物は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含
む第1組換えベクター、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトー
プをコードする核酸配列を含む第2組換えベクター、ならびに医薬的に許容でき
るキャリヤーを含む。本発明の医薬組成物を投与すると、複数の共刺激分子をコ
ードする外来遺伝子が宿主細胞に供給される。
【０１００】 1態様において医薬組成物は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含
む組換えポックスウイルスを、医薬的に許容できるキャリヤー中に含む。この組
換えポックスウイルスはさらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免
疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、少なくとも
1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする第2組換えポックス
ウイルスを供給してもよい。
【０１０１】 本発明は、B7.1〜B7.2をコードする核酸配列、ICAM-1をコードする核酸配列、
およびLFA-3をコードする核酸配列をコードする組換えポックスウイルス、なら
びに医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物を提供する。このB7、IC
AM-1、LFA-3構築体のほかに、本発明の医薬組成物の組換えポックスウイルスは
さらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードす
る核酸配列を含むことができる。あるいは、少なくとも1つのターゲット抗原ま
たはその免疫エピトープをコードするこの核酸配列は、第2組換えポックスウイ
ルスにより組成物中に供給されてもよい。
【０１０２】 本発明の医薬組成物は、外から添加した当技術分野で既知の免疫刺激分子、た
とえば共刺激分子B7、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-
40Lなど、ならびに／あるいはサイトカインおよびケモカイン、たとえばIL2、GM
-CSF、TNFα、IFNγ、IL-12、RANTES、MIP-1α、Flt-3L（USP 5,554,512；5,843
,423）など（これらに限定されない）を、免疫応答の相乗効果または増強の追加
のために含むことができる。サイトカインおよびケモカイン自体を組成物に供給
してもよく、あるいはサイトカインまたはケモカインをコードする組換えウイル
スベクターによりサイトカインおよびケモカインを供給してもよい。
【０１０３】 本発明には、病原性微生物または本明細書に示す癌により引き起こされる疾病
の治療または予防のための方法も含まれる。 この処置方法では、本発明の組換えベクターの投与は”予防”または”療法”
のいずれのためであってもよい。予防的に供給する場合、何らかの症状が出る前
に本発明の組換えベクターを投与する。予防のための組換えベクター投与は、そ
の後の感染症または疾病を阻止または軽減するために役立つ。治療のために投与
する場合、感染症または疾患の症状が発症したとき、または発症後に、組換えベ
クターを供給する。このように本発明は、予想される病因物質への曝露もしくは
疾病状態の前に、または感染症もしくは疾病の発症後に供給することができる。
【０１０４】 接種物に関して”1回量”という用語は、哺乳動物に1回の投与量として適切な
物理的に独立した単位を表し、各1回量は目的とする免疫原効果を生じるように
計算された予め定めた量の組換えベクターを必要な希釈剤と共に含有する。本発
明の新規な接種物の1回量の詳細は、組換えウイルス独自の特性および達成すべ
き個々の免疫効果により支配され、それらに依存する。
【０１０５】 接種物は一般に、水性医薬組成物を形成するための許容できる（受容できる）
希釈剤、たとえば食塩水、リン酸緩衝食塩水、または生理学的に許容できる他の
希釈剤中の溶液として調製される。
【０１０６】 接種経路は、乱刺法、静脈内（I.V.）、筋肉内（I.M.）、皮下（S.C.）、皮内
（I.D.）、腹腔内（I.P.）、腫瘍内など、病因物質に対する保護応答を誘導する
ものであってよい。この用量を少なくとも1回投与する。後続量は指示に従って
投与することができる。
【０１０７】 1態様においては、異種の初回免疫-追加免疫方式を用いる。一例では、核酸ベ
ースベクターなどの第1ベクターで少なくとも1回、宿主を免疫化する。後続免疫
化をポックスウイルスベクターにより行う。他の例では、宿主をまず第1ポック
スウイルスベクターで免疫化し、次いで異なる属の第2ポックスウイルスベクタ
ーで免疫化する。
【０１０８】 哺乳動物（好ましくはヒト）に本発明の組換えベクターを投与する場合、投与
する組換えベクターの量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学
的状態、医学的前歴、疾病の進行、腫瘍発症などの要因に応じて異なるであろう
。
【０１０９】 一般に、約105〜約1010プラーク形成単位の量の組換えウイルスをレシピエン
トに投与することが望ましい。ただし、これより低い用量または高い量も投与で
きる。
【０１１０】 腫瘍関連抗原および腫瘍特異性抗原の遺伝子決定により、癌療法のためのター
ゲティングした抗原特異的ワクチンを開発できる。組換えポックスウイルスのゲ
ノムに、複数の共刺激分子をコードする遺伝子と共に腫瘍抗原遺伝子を挿入する
と、癌発症のリスクが高い個体における予防として特異的免疫応答を誘導するた
めに（予防免疫化）、外科処置前に腫瘍を縮小させるために、初回外科処置後の
疾病再発を防止するために（抗転移ワクチン接種）、またはin vivoで細胞毒性
リンパ球（CTL）数を増加させ、これにより散在性腫瘍の根絶におけるそれらの
有効性を改善するために（樹立疾病の治療）、有効な系が得られる。本発明の組
換えウイルスは、オートロガスリンパ球（CD8+）、細胞毒性Tリンパ球および／
またはCD4+ヘルパーT細胞、あるいはNK細胞において、腫瘍患者に戻す前にex vi
voで免疫応答を誘導することができる（適応免疫療法）。
【０１１１】 癌の処置においては、腺癌などの癌の徴候前に、または腺癌などの癌に冒され
た哺乳動物において疾病の退縮を仲介するために、組換えベクターを哺乳動物に
導入することができる。
【０１１２】 処置すべき疾病または状態および処置方法に応じて、組換えベクターは複数の
共刺激分子をコードする遺伝子のほかにターゲット抗原またはその免疫エピトー
プをコードする核酸配列を含んでもよく、含まなくてもよい。ターゲット抗原ま
たはその免疫エピトープは、組換えベクターを感染させる宿主細胞により内因性
供給されてもよい。たとえば腫瘍細胞は腫瘍関連抗原またはそのエピトープを内
因性発現する可能性があり、外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子を添加
する必要はないかもしれない。宿主に腫瘍関連抗原が存在しない場合、発現しな
いかまたは発現レベルが低い場合、外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子
を供給してもよい。さらに、数種類の異なる腫瘍関連抗原をコードする遺伝子を
供給してもよい。外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子は、複数の共刺激
分子をコードする遺伝子を含む同じ組換えベクターにより供給するか、あるいは
第1組換えベクターと混合した第2組換えベクターにより供給することができる。
【０１１３】 組換えベクターを哺乳動物に投与する方法の例には、ex vivoでの組換えベク
ターへの腫瘍細胞の曝露、または静脈内、S.C.、I.D.もしくはI.M.ウイルス投与
による罹患宿主への組換えベクターの注射が含まれるが、これらに限定されない
。あるいは、組換えベクターもしくは組み合わせた組換えベクターを癌病変部も
しくは腫瘍に直接注射するか、または医薬的に許容できるキャリヤー中で局所適
用することにより、局部的に投与できる。1以上の腫瘍関連抗原（TAA）の配列を
、投与すべき複数の共刺激分子をコードする核酸配列と組み合わせて保有する組
換えベクターの量は、ウイルス粒子の力価に基づく。好ましい免疫原投与範囲は
、哺乳動物（好ましくはヒト）当たり105〜1010ウイルス粒子である。免疫化す
べき哺乳動物が既に癌または転移癌に冒されている場合、本発明のワクチンを他
の療法処置と併用してもよい。
【０１１４】 ある処置方法においては、オートロガス細胞毒性リンパ球または腫瘍浸潤性リ
ンパ球を、癌患者由来の血液、リンパ節、腫瘍などから得ることができる。特異
的ターゲット抗原、および複数の外来共刺激分子を発現する抗原提示細胞または
ターゲット抗原パルス処理した本発明のAPCの存在下で培養することにより、リ
ンパ球を増殖させ、抗原特異性リンパ球を増加させる。次いでこの抗原特異性リ
ンパ球を患者に再注入する。
【０１１５】 免疫化の後、その抗原を認識する抗体または免疫細胞の産生によりワクチンの
効力を評価することができる（特異的な細胞溶解活性または特異的なサイトカイ
ン産生により、あるいは腫瘍の退縮により評価）。当業者には前記パラメーター
を評価するための慣用法が既知である。
【０１１６】 本発明は、複数の共刺激分子およびターゲット抗原をコードする有効量の組換
えベクターを哺乳動物に単独で投与することにより、あるいはターゲット細胞に
ベクター、ターゲット抗原またはその免疫エピトープを感染させることにより、
抗原特異性T細胞応答を増強する方法を含む。この方法の1態様においては、B7フ
ァミリーからの少なくとも1分子、ICAM-1およびLFA-3をコードする組換えベクタ
ーを単独で、またはターゲット細胞、ターゲット抗原またはその免疫エピトープ
と混合して投与する。この免疫化法は、ターゲット抗原により生じる免疫応答を
補足または増強して、単一または2つの共刺激分子の使用と比較して相乗的な応
答をもたらす。複数の共刺激分子をコードする遺伝子を含む組換えベクターを投
与する方法により、単一または2つの共刺激分子の使用と比較してターゲット抗
原特異性リンパ球増殖が増大し、細胞溶解活性が増大し、サイトカイン分泌が増
加し、ターゲット抗原に対する免疫性がより長期間持続する。組換えベクターは
さらに、ターゲット抗原特異性免疫応答を相乗的に増強させるために、少なくと
も1つの抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができ
る。あるいは、少なくとも1つの抗原またはその免疫エピトープをコードする核
酸配列は、複数の共刺激分子をコードするベクターとは別個の第2組換えベクタ
ーにより供給される。抗原特異性T細胞応答を増強する方法の1態様においては、
哺乳動物、好ましくはヒトを、rV-HIV-1エピトープ／B7-1／ICAM-1／LFA-3構築
体で免疫化する。処置の有効性は、in vitroおよび／またはin vivoで、ターゲ
ット抗原特異性リンパ球増殖、ターゲット抗原特異性細胞溶解応答、臨床応答な
どの測定により監視できる。
【０１１７】 抗原特異性T細胞応答を増強する本発明方法は、いかなるターゲットまたはそ
の免疫エピトープについても利用できる。特に重要なものは、腫瘍関連抗原、組
織特異性抗原および感染性物質の抗原である。
【０１１８】 患者に組換えベクターを投与するほか、処置すべき状態に応じて、他の外因性
免疫調節薬または免疫刺激分子、化学療法薬、抗体、抗真菌薬、抗ウイルス薬な
どを単独で、または組み合わせて投与することができる。外から添加する他の薬
剤の例には、外因性IL-2、IL-6、α-、β-またはγ-インターフェロン、GM-CSF
、腫瘍壊死因子、Flt-3L、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル
、アンホテリシンB、5-フルオロウラシルなどが含まれる。
【０１１９】 本発明は、複数の外因性外来共刺激分子を発現する宿主細胞であって、それら
の分子が複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む組換えベクターによ
り供給される宿主細胞を提供する。宿主細胞は1以上の内因性ターゲット抗原ま
たはその免疫エピトープをも発現してもよい。あるいは宿主細胞は1以上の外因
性外来ターゲット抗原またはその免疫エピトープを発現するように工学的に処理
されてもよく、これらは同様に複数の共刺激分子をコードする組換えベクターに
より供給されてもよく、または第2組換えベクターにより供給されてもよい。
【０１２０】 抗原特異性免疫応答を刺激するのに使用できる本発明の宿主細胞は、本発明の
組換えウイルスにより感染させることができ、かつ複数の外因性共刺激分子を発
現でき、さらに、1以上の外因性ターゲット抗原またはその免疫エピトープを発
現するように遺伝子工学的に処理することができるいかなる細胞であってもよい
。そのような宿主細胞には、腫瘍細胞、抗原提示細胞、たとえばPBMC、樹状細胞
、皮膚または筋肉の細胞などが含まれるが、これらに限定されない。抗原提示細
胞には、単球、マクロファージ、樹状細胞、樹状細胞前駆体、ランゲルハンス細
胞、脾細胞、B細胞、腫瘍細胞、筋細胞、上皮細胞などが含まれるが、これらに
限定されない。
【０１２１】 1態様において、宿主細胞は腫瘍細胞であり、腫瘍細胞をin situまたはin vit
roで組換えベクターに曝露して、腫瘍細胞において複数の外来または外因性共刺
激分子を発現させる。腫瘍細胞は内因性ターゲット抗原を発現してもよく、腫瘍
細胞はさらに、ターゲット抗原（たとえばTAA）またはその免疫エピトープを発
現するように遺伝子工学的に処理されてもよい。TAAおよび複数の免疫刺激分子
の両方を発現する腫瘍細胞を、癌に冒された哺乳動物において腫瘍を軽減または
排除するのに有効な量で哺乳動物に投与する。
【０１２２】 本発明は、複数の共刺激分子を過剰発現する樹状細胞前駆体、樹状細胞（DC）
、DCサブポピュレーション、およびその誘導体をも提供し、その際、複数の共刺
激分子は複数の共刺激分子をコードする核酸配列をもつ組換えベクターにより外
から供給される。本発明のDC前駆体およびDCは、未処理のDC前駆体またはDCが内
因性発現するレベルより高いレベルの共刺激分子を発現する。APC、たとえば樹
状細胞前駆体および樹状細胞は、1以上の内因性ターゲット抗原またはその免疫
エピトープを発現してもよく、あるいは外因性ターゲット抗原は複数の共刺激分
子をコードする組換えベクターまたは第2組換えベクターにより供給されてもよ
い。本発明はさらに、複数の共刺激分子を過剰発現するAPC、たとえば複数の共
刺激分子を過剰発現する樹状細胞前駆体、および複数の共刺激分子を過剰発現す
る樹状細胞を、1以上のターゲット細胞、ターゲット抗原またはその免疫エピト
ープに対するワクチン接種および免疫療法応答のために、in vivoまたはin vitr
oでT細胞を活性化するのに使用する方法を提供する。
【０１２３】 供給源から単離したAPC、たとえば樹状細胞前駆体、樹状細胞、DCサブポピュ
レーション、およびその誘導体を、少なくとも3つの共刺激分子をコードする外
因性遺伝子を含む組換えベクターで、複数の共刺激分子が機能性発現するのに十
分な期間、感染、トランスフェクションまたはトランスダクションする。複数の
共刺激分子を過剰発現するそのような抗原提示性の樹状細胞前駆体および樹状細
胞を、少なくとも1つのターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細
胞膜、ターゲット抗原もしくはその免疫エピトープ、または少なくとも1つのタ
ーゲット細胞のRNAもしくはDNAでパルス処理するか、あるいはそれらと共にイン
キュベートし、そしてある種にin vivoでの関連T細胞応答の活性化に十分な量で
投与することもできる。他の態様において、抗原提示性の樹状細胞前駆体および
樹状細胞はさらに、少なくとも1つの外来ターゲット抗原もしくはその免疫エピ
トープを過剰発現する。
【０１２４】 複数の外因性共刺激分子を発現する宿主細胞を、103〜109個の用量で投与でき
る。採用できる投与経路には、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内
、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、膀胱点滴注入、または乱刺法が含まれる
。
【０１２５】 1態様においては、複数の共刺激分子を過剰発現する抗原提示性の樹状細胞前
駆体または樹状細胞を、ターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細
胞膜、ターゲット抗原もしくはその免疫エピトープ、または少なくとも1つのタ
ーゲット細胞に由来するDNAもしくはRNAにin vitroで曝露し、そして初回免疫化
した、または初回免疫化していないT細胞と共にin vitroでインキュベートして
関連T細胞応答を活性化する。次いで活性化T細胞を単独で、またはDC前駆体また
はDCと組み合わせて、ヒトなどの種に、ターゲット細胞、ターゲット抗原または
その免疫エピトープに対するワクチン接種および免疫療法応答のために投与する
。1使用方法においてこれらの樹状細胞前駆体または樹状細胞は、癌細胞に対し
免疫療法による増殖阻害応答を誘導するために有利に用いられる。
【０１２６】 他の態様においては、複数の共刺激分子を過剰発現する抗原提示細胞、好まし
くはDC前駆体またはDCと、関連のターゲット抗原またはその免疫エピトープを発
現するターゲット細胞を、当技術分野で既知の方法により融合させて、APCとタ
ーゲット細胞のヘテロカリオンを形成する（Gong, J. et al., Proc. Nat'l Aca d. Sci. USA , 95：6279-6283, 1998）。そのような融合細胞、すなわちキメラAP
C／ターゲット抗原細胞は、複数の共刺激分子とターゲット抗原またはその免疫
エピトープの両方を発現する。好ましい態様において、ターゲット細胞は過形成
細胞、悪性前細胞または悪性細胞である。キメラAPC／ターゲット抗原細胞は、i
n vivoおよびin vitroの両方で、TおよびBリンパ球の免疫応答を増強するのに使
用できる。
【０１２７】 樹状細胞前駆体は、患者の骨髄、末梢血およびリンパ節から得られる。患者を
予めワクチン接種するか、あるいはFlt-3Lなどの化合物で処理して、抗原提示細
胞数を増加させてもよい。樹状細胞は、任意の組織、たとえば皮膚の上皮（ラン
ゲルハンス細胞）から、ならびにリンパ組織、たとえば脾臓、骨髄、リンパ節お
よび胸腺にみられるものから、ならびに血液およびリンパを含めた循環系から（
ベール細胞）得られる。臍帯血はもうひとつの樹状細胞源である。
【０１２８】 樹状細胞を本発明に使用するために、当技術分野で既知の方法、たとえばUSP
5,788,963に記載の方法で富化または単離することができる。樹状細胞前駆体、
樹状細胞、およびその誘導体が得られると、それらを適切な培養条件下で培養し
て、細胞集団を拡張し、および／または細胞を組換えベクターによる最適な感染
、トランスフェクションまたはトランスダクションのための、また最適なターゲ
ット抗原取込み、プロセシングおよび提示のための状態に維持する。in vitro培
養において樹状細胞の適正な成熟状態を維持するのに特に有利なことは、顆粒球
／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4
）が両方とも存在することである。樹状細胞のサブポピュレーションを、付着性
および／または細胞表面マーカーに基づく成熟度により単離することができる。
DC前駆体、DCおよびそのサブポピュレーションの表現型は、Banchereau and Ste
inman, Nature, 392：245-252, 1998に開示されている。
【０１２９】 1態様においては、GM-CSFおよびIL-4をそれぞれ約500単位／mlの濃度で約6日
間供給する（41, 42）。他の態様においては、DC前駆体またはDCを成熟させるた
めにTNFαおよび／またはCD40を用いる。
【０１３０】 樹状細胞前駆体または樹状細胞は処置すべき個体から得ることができるので、
関連HLA抗原に関してオートロガスである。あるいは、関連HLA抗原（I群およびI
I群の両方、たとえばHLA-A、B、CおよびDR）が処置すべき個体と一致する個体か
ら細胞を得ることができる。あるいは、処置を受ける個体に適した関連HLA抗原
を発現するように樹状細胞前駆体を工学的に処理する。
【０１３１】 樹状細胞前駆体または樹状細胞を、USP 5,788,963に開示されるEBV形質転換な
どの方法でさらに遺伝子修飾して、それらの寿命を延長することができる。 樹状細胞前駆体または樹状細胞を、生理学的に許容できる媒質中の組成物の形
で供給してもよい。この組成物はさらに、ターゲット細胞、ターゲット細胞溶解
物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原またはその免疫エピトープを含むことが
できる。この組成物はさらに、免疫応答をさらに相乗的に増強するためにサイト
カインおよび／またはケモカイン、たとえばIL-4およびGM-CSFを含むことができ
る。
【０１３２】 他の態様において、複数の共刺激分子を過剰発現する本発明のAPCは、抗原特
異性リンパ球の増殖および機能の測定によりワクチンの効力を評価する方法に有
用である。そのような方法では、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、タ
ーゲット抗原またはその免疫エピトープを接種した個体からリンパ球を回収する
。これらのリンパ球をin vitroで本発明のAPCと共に、ターゲット細胞、ターゲ
ット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原またはその免疫エピトープ
の存在下で培養し、抗原特異性リンパ球の数および機能を当技術分野で既知の方
法により測定する。数および／または機能の増大は、そのワクチンが有効である
ことを示す。この方法は、ペプチドワクチンが適切な免疫応答を刺激する効力を
測定するのに特に有用である。
【０１３３】 他の態様において、複数の外因性共刺激分子を発現する本発明のAPCは、多数
のペプチドから新規な免疫原ペプチドをスクリーニングする方法に有用である。
このスクリーニング法においては、複数の共刺激分子またはその機能性部分をコ
ードする組換えベクターに感染させた抗原提示細胞を多数のペプチドでパルス処
理して、ペプチドパルス処理した抗原提示細胞を形成する。このペプチドパルス
処理した抗原提示細胞をリンパ球と共にインキュベートし、リンパ球の免疫反応
性を測定する。ペプチドパルス処理APCの存在下でのリンパ球の免疫反応性増強
は、そのペプチドに対する抗原特異性応答を示すものである。応答増強を誘導す
るペプチドは、腫瘍からの溶出、HLA結合の分析などにより同定できる。多数の
ペプチドの供給源は、多数のランダムペプチドを発現するコンビナトリアルライ
ブラリーであってもよい。免疫反応性の増強は体液性または細胞仲介性応答であ
ってよく、当技術分野で既知の標準法、たとえば抗原誘発性の増殖、細胞毒性、
抗体分泌、信号伝達などにより測定できる。同定された新規ペプチドを免疫原、
ワクチンまたは診断薬として使用できる。それらのペプチドを含むタンパク質を
サブトラクションライブラリーおよびディファレンシャルディスプレー遺伝子法
により同定できる。
【０１３４】 本発明の組換えベクター、および本発明の組換えベクターで感染、トランスフ
ェクションまたは誘発した宿主細胞は、in vivoおよびin vitroの両方において
体液性応答の増強を刺激する方法に有用である。そのような増強した体液性応答
は、モノクローナル性またはポリクローナル性であってよい。複数の共刺激分子
による体液性応答の増強は、単一または2つの共刺激分子による体液性応答と比
較して相乗的である。体液性応答の相乗的増強は、CD4+T細胞の増殖および／ま
たはサイトカイン分泌の増大、B細胞の増殖または抗体産生の増大、抗体依存性
細胞毒性（ADCC）の増大、相補体仲介による細胞溶解の増大などにより判定でき
る。本発明の組換えベクターにより、または本発明の組換えベクターで感染、ト
ランスフェクションまたは誘発した宿主細胞により誘導される抗体は、標準法に
より誘導される抗体より高いアフィニティーおよび／またはアビディティーなら
びに高い力価をもつと期待される。本発明の組換えベクターを用いる方法により
誘導される抗体は、免疫優性ターゲットエピトープまたは非優性ターゲットエピ
トープを認識できる。
【０１３５】 本発明はさらに、本発明の組換えベクターで免疫化することにより誘導された
抗体（1以上）を含む。この抗体は、目的とするターゲット抗原またはその免疫
エピトープに対する特異性をもち、それと反応または結合する。本発明のこの態
様において、抗体の由来はモノクローナル性またはポリクローナル性であってよ
い。
【０１３６】 抗体分子の例は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン
分子、または当技術分野でF（ab）、F（ab'）、F（ab'）2およびF（v）として知
られる免疫グロブリン分子部分を含めた抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子
部分である。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当技術分野で既
知の方法により産生させることができる（Kohler and Milstein（1975）, Natur e , 256, 495-497；Campbell”モノクローナル抗体技術、齧歯類とヒトのハイブ
リドーマの産生と解明”, Burdon et al.（編）（1985）”Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology”, Vol. 13, Elsevier Science Pu
blishers, アムステルダム）。抗体または抗原結合性フラグメントは、遺伝子工
学的に製造することもできる。大腸菌においてH鎖およびL鎖を発現させる方法は
いずれも、国際特許出願：WO901443、WO901443、およびWO9014424、ならびにHus
e et al.（1989）, Science, 246：1275-1281の対象である。
【０１３７】 1態様において、本発明の抗体は生物学的試料中の新規な目的抗原を検出する
ための免疫アッセイに用いられる。 1態様において、TAAを発現し、かつB7-1、ICAM-1およびLFA-3を発現する組換
えワクシニアウイルスを用いる免疫化により産生される本発明の抗体は、TAAを
発現する癌に冒された哺乳動物の組織生検体からTAAの存在を免疫細胞化学によ
り評価するために使用される。罹患組織におけるこのようなTAA抗原デリニエー
ション（delineation）の評価を利用して、その疾病に冒された哺乳動物におけ
る疾病の進行または免疫療法の有効性を予後判定することができる。この態様に
おいて、TAAの例にはCEA、PSAおよびMUC-1が含まれるが、これらに限定されない
。慣用される免疫組織化学的方法は、Harlow and Lane（編）（1988）, ”Antib
odies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, ニューヨーク州コ
ールド・スプリング・ハーバー；Ausubel et al.（編）（1987）, Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons（ニューヨーク州ニューヨ
ーク）に記載されている。
【０１３８】 他の態様において、本発明の抗体は免疫療法に用いられる。本発明の抗体は、
受動免疫療法に使用できる。 抗体または抗原結合フラグメントをレシピエント哺乳動物（好ましくはヒト）
に供給する際、投与される抗体または抗原結合フラグメントの量は、哺乳動物の
年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、過去の医学的状態などの要因に
応じて異なるであろう。
【０１３９】 本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、疾病または感染症を予防し、程
度、範囲または期間を縮小または減退させるのに十分な量でレシピエント対象に
供給されるものとする。
【０１４０】 抗イディオタイプ抗体は普通は免疫応答中に生成し、抗イディオタイプ抗体の
一部は元の免疫応答を誘発したエピトープに類似する。本発明において、その結
合部位が疾病状態のターゲット抗原を反映する抗体の免疫グロブリン遺伝子また
はその部分を単独で、また複数の免疫刺激分子の遺伝子またはその部分と組み合
わせてウイルスゲノムのゲノムまたはその部分に取り込ませると、得られる組換
えウイルスはその抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を誘導することがで
きる。
【０１４１】 具体的態様の記載は本発明の全般性を十分に明らかにするものであり、全般性
概念から逸脱することなくそのような具体的態様を種々の目的で改変および／ま
たは適合させることができる。したがってそのような適合および改変は開示した
態様の均等物の意味および範囲に含まれるものとする。
【０１４２】 引用したすべての参考文献および特許を参考として本明細書に援用する。
【０１４３】
【実施例】
実施例1 組換えワクシニア、rV-TRICOM（mu1）No．vT171の生成 ワクシニア親ウイルスの起源は、ニューヨーク市衛生委員会（New York City
Board of Health）株であり、そしてニューヨーク市衛生委員会のWyethより得て
、そして子ウシ中で継代し、痘瘡（smallpox）ワクチン種を生成した。Flow研究
室は、ChanockおよびMoss両博士（米国国立衛生研究所）から痘瘡ワクチン種、
ロット3197、継代数28の凍結乾燥バイアルを得た。本種ウイルスをエーテル処理
し、そして3回プラーク精製した。
【０１４４】 rV-TRICOM（mu1）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII M領域に位置す
るM2L（30K）遺伝子への外来（foreign）配列の挿入を指示する、pT5032と称さ
れるプラスミドベクターを構築した。ネズミLFA-3遺伝子は、ワクシニア30K（M2
L）プロモーター（34）の転写調節下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、ワクシニ
アI3（18）プロモーターの調節下にあり、そしてネズミB7.1遺伝子は、合成初期
／後期（sE／L）プロモーター（32）の調節下にある。これらの外来配列に、ワ
クシニアゲノムのHindIII M領域由来のDNA配列が隣接する（図1を参照されたい
）。これらの隣接配列は、ワクシニアK1L宿主範囲遺伝子（33）を含む。組換え
ワクシニアウイルスの構築において、ワクシニアのWyeth株の誘導体を親ウイル
スとして用いた。本親ウイルスはvTBC33と称され、機能するK1L遺伝子を欠き、
そしてしたがってウサギ腎臓RK13細胞上で効率的に複製することが不可能である
（38）。組換えワクシニアウイルスの生成は、vTBC33ワクシニアゲノム中のワク
シニア配列およびpT5032でトランスフェクションされているワクシニア感染RK13 細胞におけるpT5032中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換
えウイルスはvT171と称され、RK13細胞（ATCC、CCL 37）上の増殖により選択し
た。プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに増殖させた。プ
ラーク単離およびRK13細胞上での再プレーティングを2回繰り返し、望ましい組
換え体を精製した。組換えvT171のゲノム構造は、図4Aに示される。
【０１４５】 実施例2 組換えワクシニア、rV-TRICOM（mu2）No．vT199の生成 rV-TRICOM（mu2）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII J領域に位置す
るチミジンキナーゼ（TK）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、pT5047と称さ
れるプラスミドベクターを構築した。ネズミB7.1遺伝子はsE／Lプロモーターの
調節下にあり、ネズミLFA-3遺伝子は、I3プロモーターの転写調節下にあり、そ
してネズミICAM-1遺伝子は、ワクシニア7.5Kプロモーター（39）の調節下にある
。さらに、鶏痘（fowlpox）ウイルスC1プロモーター（15）の調節下にある大腸
菌（E． coli）lacZ遺伝子を組換え子孫のスクリーニングとして含む。これらの
外来配列に、ワクシニアゲノムのHindIII J領域由来のDNA配列が隣接する（図2
を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアのWyeth（ニューヨーク
市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え
ワクシニアウイルスの生成は、Wyethワクシニアゲノム中のワクシニア配列およ
びpT5047でトランスフェクションされているワクシニア感染Hu143TK-細胞（Bacc
hettiおよびGraham 1977）におけるpT5047中の対応する配列の間の相同組換えを
介して達成した。組換えウイルスは、以前記載されるように（31）、ブロモデオ
キシウリジン（BudR）の存在下でのTK-ウイルスの選択を、ハロゲン化インドリ
ル-ベータ-D-ガラクトシド（Bluo-gal）の存在下でlacZ遺伝子産物の発現を検出
する、in situのウイルスプラーク上で行う色原体アッセイと組み合わせて行い
、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見え
た。vT199と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を
上述の選択条件下で再度プレーティングした。本方式で選択されそして精製され
た他の組換えウイルスのうち、これらの選択条件下で出現したプラークは青のみ
であり、そしてこれらの青いプラークは、容易に単離し、そして精製された。し
かし、vT199の場合、プラーク精製の第二の周期で、白いプラークのみが観察さ
れ；青いプラークは現れなかった。青いプラークの新たな組を摘み取りそして再
度プレーティングし；再び、プラーク精製の第二の周期で白いプラークのみが観
察された。最後の試みとして、青いプラークのさらに別の組を用い、プラーク精
製の第二の周期後、青と白両方のプラークを得た。青いプラークを選択し、そし
て再度プレーティングした。プラーク精製をさらに2回（総数4回）行い、100％
青い組換えウイルスを得た。組換えvT199のゲノム構造は、図4Bに示される。
【０１４６】 実施例3 組換えワクシニア、rV-TAA／TRICOM（mu）の生成 rV-TAA／TRICOM（mu）の生成のため、ワクシニアゲノムへの外来配列の挿入を
指示する、プラスミドベクターを構築する。TAA遺伝子、ネズミLFA-3遺伝子、ネ
ズミICAM-1遺伝子、およびネズミB7.1遺伝子は、多数のプロモーターの調節下に
ある。これらの外来配列に、外来配列を挿入しようとする、ワクシニアゲノムの
DNA配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの生成は、ワクシニアゲノム中
のワクシニア配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされている
ワクシニア感染細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同
組換えを介して達成する。組換えプラークを選択条件下で細胞単層から摘み取り
、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレーティングを
さらに繰り返し、望ましい組換えウイルスを精製する。
【０１４７】 実施例4 組換えワクシニア、rV-MUC-1／TRICOM（mu）の生成 rV-MUC-1／TRICOM（mu）の生成のため、ワクシニアゲノムへの外来配列の挿入
を指示する、プラスミドベクターを構築する。MUC-1遺伝子、ネズミLFA-3遺伝子
、ネズミICAM-1遺伝子、およびネズミB7.1遺伝子は、多数のプロモーターの調節
下にある。これらの外来配列に、外来配列を挿入しようとする、ワクシニアゲノ
ムのDNA配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの生成は、ワクシニアゲノ
ム中のワクシニア配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされて
いるワクシニア感染細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の
相同組換えを介して達成する。組換えプラークを選択条件下で細胞単層から摘み
取り、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレーティン
グをさらに繰り返し、望ましい組換えウイルスを精製する。
【０１４８】 実施例5 組換えワクシニア、rV-CEA／TRICOM（mu）No．vT172の生成 rV-CEA／TRICOM（mu）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII M領域に位
置するM2L（30K）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、pT5031と称されるプラ
スミドベクターを構築した（図3を参照されたい）。CEA遺伝子は、40Kプロモー
ター（13）の調節下にあり、ネズミLFA-3遺伝子は、30Kプロモーターの転写調節
下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、そしてネズ
ミB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ワ
クシニアK1L宿主範囲遺伝子を含む、ワクシニアゲノムのHindIII M領域由来のDN
A配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの構築において、上述のvTBC33を
親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、vTBC33ワクシニ
アゲノム中のワクシニア配列およびpT5031でトランスフェクションされているワ
クシニア感染RK13細胞におけるpT5031中の対応する配列の間の相同組換えを介し
て達成した。組換えウイルスはvT172と称され、上述のように、RK13細胞上の増
殖により選択した。プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに
増殖させた。プラーク単離およびRK13細胞上での再プレーティングを2回繰り返
し、望ましい組換え体を精製した。組換えvT172のゲノム構造は、図4Cに示され
る。
【０１４９】 実施例6 組換え鶏痘、rF-TRICOM（mu）No．vT222の生成 組換え体の生成に用いた親鶏痘ウイルスの起源は、Schering-Plough Corporat
ionにより製造される、USDA認可家禽ワクチン、POXVAC-TCのバイアルからプラー
ク精製した。POXVAC-TC産生のための出発物質は、Schering-Ploughから得た、Vi
neland研究室のニワトリ胚起源鶏痘ワクチンのバイアルであった。鶏卵の漿尿膜
上でウイルスを2回継代し、マスター種ウイルスを生じた。ニワトリ胚線維芽細
胞中でマスター種ウイルスをさらに27回継代し、POXVAC-TCマスター種を調製し
た。POXVAC-TC製品ロットの生成のためのウイルスストックを調製するため、ニ
ワトリ胚線維芽細胞上で、POXVAC-TCマスター種を2回継代した。POXVAC-TCの1つ
のバイアル、連続番号96125を、初代ニワトリ胚皮膚細胞上で3回精製した。
【０１５０】 rF-TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列の挿入
を指示する、pT8001と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミB7.1遺伝
子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、ネズミLFA-3遺伝子は、I3プロモータ
ーの調節下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、7.5Kプロモーターの調節下にあり、
そしてlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏
痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する（図5を参照されたい）。本組
換えワクチンは、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプ
ラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏
痘ゲノム中の鶏痘配列およびpT8001でトランスフェクションされている鶏痘感染
初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT8001中の対応する配列の間の相同組換えを介
して達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原
体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景
に対し、青く見えた。vT222と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、
そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離お
よび再プレーティングを6回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えvT2
22のゲノム構造は、図7Aに示される。
【０１５１】 実施例7 組換え鶏痘rF-TAA／TRICOM（mu）の生成 rF-TAA／TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列
の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。TAA遺伝子、ネズミLFA-3遺
伝子、ネズミICAM-1遺伝子、およびネズミB7.1遺伝子は、多数のプロモーターの
調節下にある。さらに、lacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。これら
の外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する。本組換えワ
クチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプラー
ク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成には、鶏痘
ゲノム中の鶏痘配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされてい
る鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における該プラスミドベクター中の対応する
配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、la
cZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。lacZを発現するウイル
スプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘
み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Bluo-Galの存在下でプラー
ク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する
。
【０１５２】 実施例8 組換え鶏痘rF-MUC-1／TRICOM（mu）の生成 rF-MUC-1／TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配
列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。MUC-1遺伝子、ネズミLFA
-3遺伝子、ネズミICAM-1遺伝子、およびネズミB7.1遺伝子は、多数のプロモータ
ーの調節下にある。さらに、lacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。こ
れらの外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する。本組換
えワクチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプ
ラーク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏
痘ゲノム中の鶏痘配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされて
いる鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における該プラスミドベクター中の対応す
る配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、
lacZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。lacZを発現するウイ
ルスプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から
摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Bluo-Galの存在下でプラ
ーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製す
る。
【０１５３】 実施例9 組換え鶏痘、rF-CEA／TRICOM（mu）No．vT194の生成 rF-CEA／TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列
の挿入を指示する、pT5049と称されるプラスミドベクターを構築した。CEA遺伝
子は、ワクシニア40Kプロモーターの調節下にあり、ネズミB7.1遺伝子は、sE／L
プロモーターの調節下にあり、ネズミLFA-3遺伝子は、I3プロモーターの転写調
節下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、ワクシニア7.5Kプロモーターの転写調節下
にあり、そしてlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配
列に、鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する（図6を参照されたい
）。本組換えワクチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）
株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの
生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびpT5049でトランスフェクションされてい
る鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT5049中の対応する配列の間の相同
組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に
関する色原体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、
透明な背景に対し、青く見えた。vT194と称される陽性プラークを細胞単層から
摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラ
ーク単離および再プレーティングを5回繰り返し、望ましい組換え体を精製した
。組換え鶏痘vT194のゲノム構造は、図7Bに示される。
【０１５４】 実施例10 組換えワクシニア、rV-TRICOM（hu）No．vT224の生成 rV-TRICOM（hu）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII J領域に位置する
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、pT5064と称され
るプラスミドベクターを構築した。ヒトLFA-3遺伝子は、30Kプロモーターの調節
下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、そしてヒトB7
.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にある。さらに、C1プロモーターの調
節下にある大腸菌lacZ遺伝子を組換え子孫のスクリーニングとして含む。これら
の外来配列に、ワクシニアゲノムのHindIII J領域由来のDNA配列が隣接する（図
8を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアのWyeth（ニューヨーク
市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え
ワクシニアウイルスの生成は、Wyethワクシニアゲノム中のワクシニア配列およ
びpT5064でトランスフェクションされているワクシニア感染CV-1細胞（ATCC、CC
L 70）におけるpT5064中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組
換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い
、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見え
た。vT224と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を
再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再プレーティ
ングを5回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えvT224のゲノム構造は
、図9Aに示される。
【０１５５】 実施例11 組換えワクシニア、rV-TAA／TRICOM（hu）の生成 rV-TAA／TRICOM（hu）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII J領域に位
置するチミジンキナーゼ（TK）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、プラスミ
ドベクターを構築する。TAA遺伝子、ヒトLFA-3遺伝子、ヒトICAM-1遺伝子、ヒト
B7.1遺伝子、および大腸菌lacZ遺伝子は、多数のポックスウイルス（poxvirus）
プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのHindII
I J領域由来のDNA配列が隣接する。本組換えワクチンには、ワクシニアのWyeth
（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして
用いる。組換えワクシニアウイルスの生成は、Wyethワクシニアゲノム中のワク
シニア配列およびプラスミドでトランスフェクションされているワクシニア感染
CV-1細胞（ATCC、CCL 70）における該プラスミドベクター中の対応する配列の間
の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子
産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。lacZを発現するウイルスプラー
クは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、
そしてその子孫を再度プレーティングする。Bluo-Galの存在下でプラーク単離お
よび再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１５６】 実施例12 組換え鶏痘rV-TAA／TRICOM（hu）の生成 rV-TAA／TRICOM（hu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列
の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。TAA遺伝子、ヒトLFA-3遺伝
子、ヒトICAM-1遺伝子、ヒトB7.1遺伝子、および大腸菌lacZ遺伝子は、多数のポ
ックスウイルスプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノム
のBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する。本組換えワクチンには、鶏痘のPOXVAC
-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルス
として用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびプ
ラスミドベクターでトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮
膚細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介し
て達成する。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体
アッセイを用い、同定する。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に
対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再
度プレーティングする。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再プレーティン
グをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１５７】 実施例13 組換えワクシニアウイルス、rV-CEA（6D）／TRICOM（hu）No．vT238の生成 rV-CEA（6D）／TRICOM（hu）の生成のため、ワクシニアゲノムのHindIII J領
域に位置するチミジンキナーゼ（TK）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、pT
8016と称されるプラスミドベクターを構築した。CEA遺伝子は、1つの修飾エピト
ープを含む全長タンパク質を発現するように、in vitro突然変異誘発により改変
した。本突然変異は、576位にコードされるアミノ酸をアスパラギンからアスパ
ラギン酸に変化させた。CEA（6D）と称される修飾遺伝子は、CEAの免疫原性を亢
進するよう設計された（Zarembaら， 1997， Cancer Res． 57：4570-4577）。C
ED（6D）遺伝子は、40Kプロモーターの調節下にある。ヒトLFA-3遺伝子は、30K
プロモーターの調節下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下に
あり、そしてヒトB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にある。さらに、C
1プロモーターの調節下にある大腸菌lacZ遺伝子を組換え子孫のスクリーニング
として含む。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのHindIII J領域由来のDNA
配列が隣接する（図10を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアの
Wyeth（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルス
として用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、Wyethワクシニアゲノム中
のワクシニア配列およびpT8016でトランスフェクションされているワクシニア感
染CV-1細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、メリー
ランド州ロックビル、CCL 70）におけるpT8016中の対応する配列の間の相同組換
えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関す
る色原体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明
な背景に対し、青く見えた。vT238と称される陽性プラークを細胞単層から摘み
取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク
単離および再プレーティングを6回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組
換えワクシニアウイルスvT238のゲノム構造は、図11に示される。
【０１５８】 実施例14 組換え鶏痘ウイルス、rF-TRICOM（mu）No．vT251の生成 rF-TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列の挿入
を指示する、pT8019と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミLFA-3遺
伝子は、30Kプロモーターの調節下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、I3プロモー
ターの調節下にあり、ネズミB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり
、そしてlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、
鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する（図12を参照されたい）。本
組換えワクチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来
のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は
、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびpT8019でトランスフェクションされている鶏痘
感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT8019中の対応する配列の間の相同組換え
を介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する
色原体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な
背景に対し、青く見えた。vT251と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取
り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単
離および再プレーティングを3回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換
えワクシニアウイルスvT251のゲノム構造は、図13Aに示される。
【０１５９】 実施例15 組換え鶏痘ウイルス、rF-TRICOM（hu）No．vT232の生成 rF-TRICOM（hu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配列の挿入
を指示する、pT5072と称されるプラスミドベクターを構築した。ヒトLFA-3遺伝
子は、30Kプロモーターの調節下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーター
の調節下にあり、ヒトB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、そし
てlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲ
ノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する（図14を参照されたい）。本組換え
ワクチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプラ
ーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘
ゲノム中の鶏痘配列およびpT5072でトランスフェクションされている鶏痘感染初
代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT5072中の対応する配列の間の相同組換えを介し
て達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体
アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に
対し、青く見えた。vT232と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そ
してその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離およ
び再プレーティングを4回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワク
シニアウイルスvT232のゲノム構造は、図13Bに示される。
【０１６０】 実施例16 組換え鶏痘ウイルス、rF-MUC-1／TRICOM（mu）No．vT250の生成 rF-MUC-1／TRICOM（mu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配
列の挿入を指示する、pT8020と称されるプラスミドベクターを構築した。シグナ
ル配列、10コピーのタンデム反復配列、および3’特有コード配列からなる、一
部切除（truncated）型MUC-1遺伝子を用いた（配列番号41）。タンデム反復領域
のヌクレオチド配列は、アミノ酸配列を変化させることなく、反復間の相同性を
最小限にするように、改変した。該遺伝子は、一部切除コード配列、6ヌクレオ
チドの5’非翻訳領域、および186ヌクレオチドの3’非翻訳領域を含む、1881 bp
断片上に含まれた（Gendlerら， 1990， J． Biol． Chem． 265：15286-15293
）。ネズミLFA-3遺伝子は、30Kプロモーターの転写調節下にあり、ネズミICAM-1
遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、ネズミB7.1遺伝子は、sE／Lプロモ
ーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下にある。
これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配列が隣接する（図15
を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough
Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え
鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびpT8020でトランスフェク
ションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT8020中の対応する
配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、la
cZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイル
スプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。vT250と称される陽性プラーク
を細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Gal
の存在下でプラーク単離および再プレーティングを4回繰り返し、望ましい組換
え体を精製した。組換えワクシニアウイルスvT250のゲノム構造は、図16Aに示さ
れる。
【０１６１】 実施例17 組換え鶏痘ウイルス、rF-MUC-1／TRICOM（hu）No．vT242の生成 rF-MUC-1／TRICOM（hu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外来配
列の挿入を指示する、pT2186と称されるプラスミドベクターを構築した。上の実
施例16に記載されるような、一部切除型MUC-1遺伝子を用いた。MUC-1遺伝子は、
40Kプロモーターの調節下にある。ヒトLFA-3遺伝子は、30Kプロモーターの調節
下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、ヒトB7.1遺伝
子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子は、C1プロモータ
ーの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI J領域由来のDNA配
列が隣接する（図17を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のPOXVAC-T
C（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスと
して用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびpT21
86でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における
pT2186中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは
、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。la
cZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。vT242と称
される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティ
ングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再プレーティングを4回繰り
返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスvT242のゲノム
構造は、図16Bに示される。
【０１６２】 実施例18 組換え鶏痘ウイルス、rF-CEA（6D）／TRICOM（hu）No．vT236の生成 rF-CEA（6D）／TRICOM（hu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外
来配列の挿入を指示する、pT2187と称されるプラスミドベクターを構築した。CE
A（6D）遺伝子は、40Kプロモーターの調節下にある。ヒトLFA-3遺伝子は、30Kプ
ロモーターの調節下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあ
り、ヒトB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子
は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI
J領域由来のDNA配列が隣接する（図18を参照されたい）。本組換えワクチンには
、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離
体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏
痘配列およびpT2187でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚
皮膚細胞におけるpT2187中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。
組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用
い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見
えた。vT236と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫
を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再プレーテ
ィングを8回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイル
スvT236のゲノム構造は、図16Cに示される。
【０１６３】 実施例19 組換え鶏痘ウイルス、rF-PSA／PSMA／TRICOM（hu）No．vT257の生成 rF-PSA／PSMA／TRICOM（hu）の生成のため、鶏痘ゲノムのBamHI J領域への外
来配列の挿入を指示する、pT5080と称されるプラスミドベクターを構築した。PS
Aをコードする遺伝子は、ヒトLNCaP細胞株（CRL 1740、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ATCC）、メリーランド州ロックビル）由来のRNAから
得たcDNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅により、単離した。該遺伝子は、PSAの全
コード配列、41ヌクレオチドの5’非翻訳領域、および552ヌクレオチドの3’非
翻訳領域を含む、1346 bp断片上に含まれた（LundwallおよびLilja， 1987， FE BS Lett． 214：217-322）。PSMAをコードする遺伝子は、ヒトLNCaP細胞株由来
のRNAから得たcDNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅により、単離した。該遺伝子は
、PSMAの全コード配列、26ヌクレオチドの5’非翻訳領域、および19ヌクレオチ
ドの3’非翻訳領域を含む、2298 bp断片上に含まれた（Israeliら， 1993，Canc er Res． 53：227-230）。PSA遺伝子は、40Kプロモーターの調節下にあり、そし
てPSMA遺伝子は、7.5Kプロモーターの調節下にある。ヒトLFA-3遺伝子は、30Kプ
ロモーターの調節下にあり、ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあ
り、ヒトB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子
は、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのBamHI
J領域由来のDNA配列が隣接する（図19を参照されたい）。本組換えワクチンには
、鶏痘のPOXVAC-TC（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離
体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏
痘配列およびpT5080でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚
皮膚細胞におけるpT5080中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。
組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用
い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見
えた。vT257と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫
を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再プレーテ
ィングを5回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイル
スvT257のゲノム構造は、図16Dに示される。
【０１６４】 実施例20 組換えMVAウイルス、rMVA／TRICOM（mu）No．vT264の生成 修飾ワクシニアAnkara（MVA）は、ワクシニアウイルスのAnkara株の弱毒化誘
導体である（Meyerら， 1991， J． Gen． Virol． 72：1031-1038）。ヒトにお
いて痘瘡ワクチンとして使用されるMVAワクチン由来の種ストックを、Anton May
r博士（Instisute for Medical Microbiology、ミュンヘン）から得た。種スト
ックを、初代ニワトリ胚皮膚細胞上で、2回プラーク精製した。
【０１６５】 rMVA-TRICOM（mu）の生成のため、MVAゲノムの欠失III領域（Meyerら， 1991
， J． Gen． Virol． 72：1031-1038）への外来配列の挿入を指示する、pT5085
と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミLFA-3遺伝子は、30Kプロモー
ターの調節下にあり、ネズミICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、
ネズミB7.1遺伝子は、sE／Lプロモーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子は
、C1プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、MVAゲノムの欠失III領
域由来のDNA配列が隣接する（図20を参照されたい）。本組換えワクチンには、M
VAワクチン種ストック由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組
換えMVAの生成は、MVAゲノム中のMVA配列およびpT5085でトランスフェクション
されているMVA感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるpT5085中の対応する配列の
間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝
子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラ
ークは、透明な背景に対し、青く見えた。vT264と称される陽性プラークを細胞
単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在
下でプラーク単離および再プレーティングを4回繰り返し、望ましい組換え体を
精製した。組換え体MVA vT264のゲノム構造は、図21Aに示される。
【０１６６】 実施例21 組換えMVAウイルス、rMVA-PSA／PSMA／TRICOM（hu）No．vT260の生成 rMVA-PSA／PSMA／TRICOM（hu）の生成のため、MVAゲノムの欠失III領域への外
来配列の挿入を指示する、pT5084と称されるプラスミドベクターを構築した。PS
A遺伝子は、40Kプロモーターの調節下にあり、そしてPSMA遺伝子は、7.5Kプロモ
ーターの調節下にある。ヒトLFA-3遺伝子は、30Kプロモーターの調節下にあり、
ヒトICAM-1遺伝子は、I3プロモーターの調節下にあり、ヒトB7.1遺伝子は、sE／
Lプロモーターの調節下にあり、そしてlacZ遺伝子は、C1プロモーターの調節下
にある。これらの外来配列に、MVAゲノムの欠失III領域由来のDNA配列が隣接す
る（図22を参照されたい）。本組換えワクチンには、MVAワクチン種ストック由
来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えMVAの生成は、MVAゲ
ノム中のMVA配列およびpT5084でトランスフェクションされているMVA感染初代ニ
ワトリ胚皮膚細胞におけるpT5084中の対応する配列の間の相同組換えを介して達
成した。組換えウイルスは、上述のように、lacZ遺伝子産物に関する色原体アッ
セイを用い、同定した。lacZを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し
、青く見えた。vT260と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そして
その子孫を再度プレーティングした。Bluo-Galの存在下でプラーク単離および再
プレーティングを4回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換え体MVA vT2
60のゲノム構造は、図21Bに示される。
【０１６７】 実施例22 組換えポックスウイルス ネズミ補助的刺激分子B7-1をコードする遺伝子（rV-B7-1と称される）または
ネズミ細胞間接着分子-1をコードする遺伝子（rV-ICAM-1と称される）いずれか
を含む、個々の組換えワクシニアウイルスが記載されてきている（10、11）。ネ
ズミCD48の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（rV-LFA-3と称される；ネズ
ミCD48は、ヒトLFA-3（CD58）の相同体（6））は、rV-B7-1およびrV-ICAM-1と同
様の方式で構築され、そして記載されてきている（12）。これらの単一の組換え
ワクシニアウイルスの各々で、補助的刺激分子をコードする遺伝子を、ワクシニ
アウイルス初期／後期40Kプロモーター（15）の調節下に置き、そして導入遺伝
子を、記載されるような（13）、ワクシニアウイルスWyeth株のゲノムのHindIII
M領域に挿入した。組換え鶏痘ウイルスは、記載されるような（14）、鶏痘ウイ
ルスのPOXVAC-TC（Schering Corporation）株のゲノムのBamHI J領域に、外来遺
伝子を挿入することにより、構築した。単一の外来遺伝子を含む組換えウイルス
では、該遺伝子は、ワクシニア40Kプロモーターの調節下にある。rV-B7-1／ICAM
-1は、合成初期／後期（sE／L）プロモーター（16）の調節下にあるネズミB7.1
遺伝子および40Kプロモーターの調節下にあるネズミICAM-1遺伝子を含む、組換
えワクシニアウイルスである。rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3は、ワクシニア30L（M2L
）プロモーター（17）の調節下にあるネズミLFA遺伝子、ワクシニアI3プロモー
ター（18）の調節下にあるネズミICAM-1遺伝子、および合成初期／後期（sE／L
）プロモーターの調節下にあるネズミB7.1遺伝子を含む、組換えワクシニアウイ
ルスである。rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3は、40Kプロモーターの調節下にある
ヒト癌胎児性抗原（CEA）遺伝子、sE／Lプロモーターの調節下にあるネズミB7-1
遺伝子、I3プロモーターの調節下にあるネズミLFA-3遺伝子、およびワクシニア7
.5Kプロモーター（19）の調節下にあるネズミICAM-1遺伝子を含む、組換え鶏痘
ウイルスである。非組換えワクシニアウイルスは、V-Wyethと称し、一方、非組
換え鶏痘ウイルスは、WT-FPと称した。
【０１６８】 実施例23 組換え補助的刺激分子の発現 各組換えベクターが、単数または複数の適切な導入遺伝子を発現することが可
能であることを確認するため、ネズミ腺癌細胞株MC38を、多様な組換えワクシニ
アまたは鶏痘構築物に感染させ、そして単数または複数の導入遺伝子の細胞表面
発現を、フローサイトメトリーにより明示した（図23）。未感染細胞（データ未
提示）および野生型ワクシニアに感染した細胞は、3つの補助的刺激分子のいず
れも発現しなかった。この観察はPCRにより確認した（データ未提示）。対照的
に、rV-B7-1に感染した細胞は、B7-1タンパク質に関し、非常に陽性になり；rV-
ICAM-1に感染した細胞は、ICAM-1に関し、非常に陽性になり；そしてrV-LFA-3に
感染した細胞は、LFA-3タンパク質に関し、非常に陽性になった。2つの補助的刺
激分子を含む構築物（rV-B7-1／ICAM-1）の同様の解析により、B7-1（78％陽性
で1012の平均蛍光強度（MFI））およびICAM-1（70％陽性で690のMFI）の発現が
示された。さらに、ワクシニア多遺伝子構築物rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3に感染し
た細胞は、3つすべての補助的刺激分子を同時発現した。組換え鶏痘ウイルスが
その組換えタンパク質を発現したかどうか決定するため、MC38細胞を同様の方式
で鶏痘構築物に感染させた（図23）。再び、野生型鶏痘ウイルスWT-FPに感染し
た細胞は、いかなる補助的刺激分子も発現しなかった。rF-B7-1に感染した細胞
は、B7-1タンパク質に関し、陽性になり、そしてrF-ICAM-1に感染した細胞は、I
CAM-1タンパク質に関し、陽性になった。rF-LFA-3ベクターは構築しなかった。
しかし、鶏痘多遺伝子構築物rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3に感染した細胞は、3
つすべての補助的刺激分子を同時発現した。
【０１６９】 組換えウイルスの性質決定：タンパク質表面発現の蛍光解析 MC38ネズミクローン性腺癌細胞株が記載されてきている（20）。集密な（conf
luent）MC38細胞を、ワクシニア構築物（V-Wyeth、rV-B7-1、rV-ICAM-1、rV-LFA
-3、rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3）または鶏痘構築物（WT-FP、rF-B7-1、rF-ICAM-1
、rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3）に、5 MOI（感染多重度；PFU／細胞）で、5時
間、感染させた。CEAは、1つのrF構築物で、マーカー遺伝子としてのみ、用いた
。感染後、細胞を採取し、そしてネズミCD80（B7-1）、CD54（ICAM-1）、または
CD48（LFA-3；PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）に特異的なFITC結
合モノクローナル抗体（MAb）で免疫染色した。Lysis IIソフトウェアを用い、F
ACSCAN血球計算装置（cytometer）（Becton Dickinson、カリフォルニア州マウ
ンテンビュー）で、細胞蛍光を解析した。
【０１７０】 in vitro補助的刺激解析 雌C57BL／6マウス（6-8週齢）は、Taconic Farms（ニューヨーク州ジャーマン
タウン）から得た。単細胞懸濁物を単離するため、70 m細胞ろ過器（Falcon、Be
cton Dickinson、ニュージャージー州フランクリンレークス）を通じて機械的に
分散させた脾臓から未処理T細胞を単離し、そしてFicoll-Hypaque勾配（密度＝1
．119 g／ml）（Sigma、ミズーリ州セントルイス）上の遠心分離により、赤血球
および死んだ細胞を除去した。およそ95％ T細胞からなる集団は、2つのナイロ
ンウールカラム（Robbins Scientific Corp．、カリフォルニア州サニーベール
）上に、連続して脾臓単核細胞を通過させることにより、得た。特定の実験には
、抗CD4または抗CD8常磁性ビーズ（MiniMACS、Miltenyi Biotec、カリフォルニ
ア州オーバーン）を利用した陰性選択により、T細胞をさらにCD4+およびCD8+集
団に分画した。T細胞を、96ウェル平底プレート（Costar、マサチューセッツ州
ケンブリッジ）中に105／ウェルで添加した。未感染MC38細胞、あるいはワクシ
ニア構築物（V-Wyeth、rV-B7-1、rV-ICAM-1、rV-LFA-3、rV-B7-1／ICAM-1／LFA-
3）または鶏痘構築物（WT-FP、rF-B7-1、rF-ICAM-1、rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LF
A-3）に、5 MOI（感染多重度；PFU／細胞）で、5時間、感染させた細胞からなる
刺激細胞を、2％パラホルムアルデヒドで固定し、そして104／ウェルで添加した
。すべてのウェル中の細胞は、いくつかの希釈（5ないし0．625μg／mlで2日間
）のコンカナバリン-A（Con A、Sigma）の存在下で、総体積200μlの完全培地（
CM）（ウシ胎児血清（10％）、グルタミン（2 mM）、ピルビン酸ナトリウム（1
mM）、Hepes（7 mM）、ゲンタマイシン（50μg／ml）、2-メルカプトエタノール
（50μM）、および非必須アミノ酸（0．1 mM）（Biofluids、メリーランド州ロ
ックビル））中で培養した。コントロールウェルには、T細胞、刺激細胞および
培地のみを与えた。示される実験では、プレート結合抗CD3（1．5μg／ウェル-0
．012μg／ウェル）をCon Aに代用した。細胞は、インキュベーションの最後の1
2-18時間、1 Ci／ウェルの3H-チミジン（New England Nuclear、デラウェア州ウ
ィルミントン）で標識し、そしてTomtec細胞採取装置（Wallac Incorporated、
メリーランド州ガイザーズバーグ）で採取した。取り込み放射能は、液体シンチ
レーション計測（Wallac 1205 Betaplate、Wallac， Inc．）で測定した。3つ組
ウェルの結果を平均し、そして平均CPM±SEMとして報告する。示される実験では
、発現される補助的刺激分子に特異的なMAbまたは一致アイソタイプコントロー
ル抗体（アルメニアハムスター（Armenian hamster）IgG、ポリクローナル）の
いずれかの存在下で、in vitro補助的刺激解析を行った。T細胞増殖を遮断する
のに用いた抗体は、すべてPharMingenからの、ハムスター抗ネズミCD80（B7-1；
クローン16-10A1）、ハムスター抗ネズミCD54（ICAM-1；クローン3E2）、または
ハムスター抗ネズミCD48（BCM-1；クローンHM48-1）であった。すべての抗体は
、25μg／mlの最終濃度で用いた。
【０１７１】 補助的刺激分子能力の測定 T細胞および刺激細胞は、上述のように調製した。1つまたはそれ以上の補助的
刺激分子を発現する固定刺激細胞を、総数104／細胞まで、V-Wyeth感染／固定刺
激細胞と組み合わせ、多様な比でウェルに添加した。その後、T細胞（105／ウェ
ル）を添加し、そして細胞を、2．5μg／ml Con Aの存在下で、総体積200μlのC
M中で2日間培養し、そしてインキュベーションの最後の12-18時間、1μCi／ウェ
ルの3H-チミジンで標識した。取り込み放射能は、先のように、液体シンチレー
ション計測により、測定した。
【０１７２】 サイトカイン解析 CD4+およびCD8+ T細胞集団を上述のように調製し、そして6ウェルプレート（C
ostar）中に2．5×106／ウェルで添加した。刺激細胞集団を上述のように調製し
、そして2．5×105／ウェルで添加した。細胞を、2．5μg／ml Con Aの存在下で
、総体積5 mlのCM中で24時間培養した。上清流体を収集し、そしてネズミIL-2、
IFNγ、TNF-α、GM-CSF、およびIL-4に関し、以前記載されたような捕捉ELISA（
21）により、解析した。検出感度は、それぞれ、30、100、20、20、および20 pg
／mlであった。
【０１７３】 刺激細胞由来のRNA集団もまた、多プローブRNアーゼ保護アッセイ（mpRPA）に
より、解析した。ネズミサイトカインの明示されたリボプローブは、PharMingen
より購入した。アッセイは、以前記載されたように行った（22）。保護プローブ
タグ付加二重鎖は、6％ポリアクリルアミド上の電気泳動により、分離した。乾
燥ゲルは、-70℃で24-72時間、Biomaxフィルム（Kodak）に曝露した。Storm系ホ
スホイメージャー（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）を用
い、バンドに含まれる放射能を定量化した。既定のバンドの純CPMは、以下の式
（サイトカイン遺伝子のcpm・マイナス・バックグラウンドのcpm）により計算し
、そしてハウスキーピング遺伝子転写物L32のパーセントとして表した。
【０１７４】 実施例24 B7-1、ICAM-1、およびLFA-3は相乗的に働き、T細胞増殖を亢進する B7-1、ICAM-1、およびLFA分子は、個々にT細胞増殖を補助的刺激することが示
されてきている。しかし、これらは同時にAPC上に発現される可能性があるため
、T細胞増殖誘導中の個々の補助的刺激分子の相対的役割を調べることは困難で
あった（2）。B7-1、ICAM-1および／またはLFA-3分子の未処理T細胞増殖の誘導
への寄与を解析するため、T細胞活性化の第一のシグナルが、薬理学的試薬（Con
A）を介し搬送される、修飾in vitroモデル（23、24）を使用した。補助的刺激
分子を発現するよう設計された多様な組換えワクシニア（図24A）または鶏痘（
図24B）ウイルスに感染したMC38細胞株を用い、補助的刺激分子のみが異なる一
団の刺激細胞を生成した。第二の、または「補助的刺激」シグナルを、これらの
「刺激」MC38細胞の表面上に発現される1つまたはそれ以上の補助的刺激分子を
介し、T細胞に搬送した。図24Aに示されるように、未感染MC38細胞およびMC38／
V-Wyeth両方が、Con Aの調べたレベルすべてで、T細胞の最小限の増殖を誘導し
た。MC38／LFA-3は、T細胞増殖において、小さい（2．1倍）しかし有意な（P＜0
．05）増加を誘導した。MC38／ICAM-1を介したシグナル-2搬送は、2．5μg／ml
Con AでのT細胞増殖において、3．5倍の増加を誘導した。MC38／B7-1は、2．5お
よび1．25μg／ml Con Aでの増殖において、それぞれ、7.8倍および16倍の増加
を誘導した。しかし、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3（3つの補助的刺激分子すべて
を同時発現するMC38細胞）は、2．5μg／ml Con AでのT細胞増殖において、17.5
倍の増加、および1．25μg／ml Con Aで34倍の増加を誘導した。さらに、低いCo
n Aレベル（0．625μg／ml）では、ICAM-1およびLFA-3の発現は、T細胞増殖を誘
導しなかった。B7-1は、0．625μg／ml Con Aで測定可能な増殖（20，000 CPM）
を誘導したが、3つの補助的刺激分子すべての同時発現は、さらにより高いレベ
ルの増殖（100，000 CPM）を誘導した（図24A）。これらの実験を4回繰り返し、
同様の結果を得た。
【０１７５】 MC38刺激細胞はまた、組換え鶏痘ウイルスでの感染によっても調製した（図24
B）。再び、未感染MC38またはMC38／WT-FPは、Con Aの調べたレベルすべてで、T
細胞の最小限の増殖を誘導した。2．5μg／ml Con AでのT細胞増殖において、MC
38／rF-ICAM-1は2倍の増加を支持し、MC38／rF-B7-1は3．2倍の増加を支持し、
そしてMC38／rF-B7-1／ICAM-1／LFA-3は6倍の増加を支持した。本実験をさらに2
回繰り返し、同様の結果を得た。第一のシグナルが固定抗CD3を介して搬送され
る場合もまた、同様の結果が観察された（データ未提示）。MC38／rV-B7-1／ICA
M-1／LFA-3およびMC38／rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3により支持される増殖で
注目される相違（17.5倍対6倍）は、5時間の感染期間後に発現される単数または
複数の組換えタンパク質のレベルのためである可能性が最も高い（図23）。特に
、rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3に感染した細胞のおよそ70％が、補助的刺激分子を発
現し、一方、rF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3に感染した細胞のおよそ40％が陽性
である。使用した条件で、rFベクターに感染した陽性細胞は、rV-B7-1／ICAM-1
／LFA-3に感染したものの50％のレベルで、組換えB7-1およびICAM-1を発現する
。
【０１７６】 実施例25 T細胞増殖に対する補助的刺激分子の寄与の特異性 B7-1、ICAM-1、またはLFA-3の増殖寄与の特異性をさらに確認するため、V-Wye
th、rV-B7-1、rV-ICAM-1、またはrV-LFA-3での感染により、MC38刺激細胞を再び
調製し、そして既定の補助的刺激分子に特異的なMAbの存在下または非存在下で
、未処理ネズミT細胞およびCon Aと同時培養した。図3Bに示されるように、MC38
／B7-1は、MC38／V-Wyethのものより4．5倍、T細胞増殖を亢進した（図25A）。
この増殖増加は、ネズミB7-1の遮断抗体を添加することにより、83％阻害された
。同様に、MC38／ICAM-1（図25C）は、増殖を2．25倍増加させ、これはその後、
抗ネズミICAM-1 MAbの存在下で、88％減少した。最後に、MC38／LFA-3（図25D）
は、増殖を2．1倍増加させ、これはその後、抗ネズミCD48 MAbの存在下で98％減
少した。各群に関し、（材料および方法に明記されるような）適切なアイソタイ
プコントロール抗体を用いたインキュベーションは、注目される増殖を遮断しな
かった。本実験をさらに2回繰り返し、同様の結果を得た。
【０１７７】 実施例26 補助的刺激分子能力の測定 in vitro補助的刺激アッセイの修飾法により、T細胞増殖の第二のシグナルを
搬送する、B7-1、ICAM-1、および／またはLFA-3の相対的能力の定量的概算が可
能になった。本目的のため、刺激細胞（多様な組換えワクシニアウイルスに感染
したMC38細胞）を、V-Wyethに感染した多様な量のMC38細胞での希釈により力価
測定し（titered out）、そして2．5μg／ml Con Aの存在下で、一定数のT細胞
と同時培養した。これらの実験において、MC38対T細胞比は、1：10で一定のまま
であった。図4に見られるように、MC38／LFA-3（黒い三角形）は、濃度40％まで
、MC38／V-Wyeth（白い正方形）のものより、T細胞増殖を亢進させた（すなわち
ウェル中の刺激細胞のうち、40％がrV-LFA-3に感染し、そして残った60％がV-Wy
ethに感染した）。MC38／ICAM-1（黒い円）またはMC38／B7-1（黒いひし形）は
、それぞれ濃度13％および6％まで、増殖増加を支持した。対照的に、MC38／B7-
1／ICAM-1／LFA-3は、3％未満の刺激細胞が3つ組ベクターを含む場合、増殖を亢
進した（直線最小二乗解析を介し、1％未満と推定される）。これらの個々の補
助的刺激分子の力価測定（titration）曲線を得ると、ICAM-1およびB7-1により
仲介されるT細胞増殖の度合いは、それぞれ、3倍および6倍であり、LFA-3単独で
仲介されるものより強力であるようであった。しかし、明らかに、最も強い増殖
は、B7-1／ICAM-1／LFA-3により仲介される。比較的低い刺激細胞濃度では（す
なわち、MC38細胞の3％-6％が刺激細胞として作用する場合）、LFA-3、ICAM-1、
およびB7-1でさえ、単独の発現ではT細胞活性化を亢進しないが、3つの補助的刺
激分子を発現する刺激細胞は、実質的にT細胞活性化を亢進する。図26（挿入図
）のデータは、3％のMC38刺激細胞が、示されるベクターに感染している場合に
得た結果である。各ウェルは、104の総MC38細胞および105未処理T細胞を含むた
め、これらの培養において、実際の刺激細胞対T細胞比は、0．003である。2遺伝
子構築物に感染したMC38細胞（rV-B7-1／ICAM-1）は、これらの条件下で、ある
としてもわずかのT細胞増殖しか誘導しない一方、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3は
、実質的に増殖を増加させた（p＜0．0001）ことに注目されたい。
【０１７８】 実施例27 CD4+およびCD8+ T細胞の補助的刺激 単一でまたは組み合わせて発現される補助的刺激分子に対するT細胞反応をさ
らに性質決定するため、B7-1、ICAM-1、およびLFA-3が精製CD4+およびCD8+ T細
胞を補助的刺激する能力を試験した。図5は、最適以下の濃度のCon Aで活性化し
た精製CD4+（図27A）およびCD8+（図27B）細胞の増殖を示す。増殖に対する刺激
細胞効果の層別化は、CD4+およびCD8+細胞両方に関し、同様であった：MC38／LF
A-3は、最も弱い増殖を刺激し、MC38／ICAM-1およびMC38／B7-1が続いた。MC38
／B7-1／ICAM-1／LFA-3がCD4+およびCD8+ T細胞の最も強力な刺激細胞であった
。これらの実験をさらに3回繰り返し、同様の結果を得た。非常に低い濃度のCon
A（0．625μg／ml、図5、パネルCおよびD）では、第二のシグナルを提供するの
に、ICAM-1、LFA-3、B7-1、またはB7-1／ICAM-1の組み合わせのいずれを用いて
も、CD4+またはCD8+ T細胞活性化において、有意な亢進はなかったことに注目す
べきである。しかし、3つ組の補助的刺激分子を同時発現するワクシニアウイル
スを使用した場合、両T細胞サブセットの実質的な活性化が観察された。第一の
シグナルが固定抗CD3を介し搬送された場合、同様の結果が見られた（データ未
提示）。
【０１７９】 B7-1補助的刺激がIL-2 mRNA半減期を延長させ、そしてIL-2転写を上方制御し
、かなりの量の分泌IL-2産生を生じることが報告されてきている（4、25）。さ
らに、LFA-3でのT細胞補助的刺激は、多様なサイトカイン、特にIL-2およびIFN-
γに対する影響を有することが報告されてきている（6）。サイトカイン産生に
対する、単一のまたは多数の補助的刺激分子による補助的刺激の定性的および定
量的影響を決定するため、精製CD4+およびCD8+ T細胞を再び、2．5μg／ml Con
Aの存在下で、単独でまたは組み合わせてB7-1、ICAM-1、およびLFA-3を発現する
多様な刺激細胞と同時培養した。24時間後、上清流体を、IL-2、IFN-γ、TNF-α
、GM-CSF、およびIL-4に関し、解析した。未感染MC38（データ未提示）およびMC
38／V-Wyethは、CD4+細胞から、最小限の量のIL-2を誘導し（図28A）、一方、MC
38／B7-1は3，979 pg／mlを誘導した。しかし、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3での
T細胞刺激は、10倍多い量のIL-2を誘導した。同様に、MC38／B7-1は、CD8+細胞
から、最小限の量のIL-2を誘導した（図28B）が、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3は
、20倍多い量（6，182 pg／ml）のIL-2を誘導した。刺激したT細胞によるIFN-γ
産生もまた調べた。MC38／B7-1およびMC38／LFA-3は、CD4+細胞から、中程度の
量のIFN-γしか誘導しなかった（図28C）。対照的に、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA
-3でのCD4+細胞の刺激は、他の構築物のいずれでの刺激より、4倍多いIFN-γを
誘導した。MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3でのCD8+細胞の刺激は、他の構築物のい
ずれで刺激したCD8+細胞より6倍以上多い、最大量のIFN-γを誘導した（図28D）
。いかなる構築物でのいずれかの細胞種の刺激も、分泌されるTNF-α、GM-CSF、
またはIL-4のレベルにおいて、有意な変化を仲介しなかった（p＞0．05）（デー
タ未提示）。3つ組構築物（rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3）を介した刺激の主な頂点
は、CD4+細胞からのIL-2分泌およびCD8+ T細胞からのIFN-γ分泌であるようであ
る。これらの実験をさらに3回繰り返し、同様の結果を得た。T細胞によるサイト
カイン産生を亢進する能力に関し、2遺伝子構築物（rV-B7-1／ICAM-1）対多遺伝
子構築物（rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3）に感染させた刺激細胞を比較した研究もま
た、行った。CD4+またはCD8+細胞いずれかによるIFN-γ産生、あるいはCD8+細胞
によるIL-2産生では、2つの間の小さい相違しか観察されなかった。しかし、CD4 + 細胞によるIL-2産生の刺激では、実質的な相違が見られた（MC38／B7-1／ICAM-
1を使用した5000 pg／ml対MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3を使用した39，600 pg／m
l）。
【０１８０】 単一のまたは多数の補助的刺激分子で刺激したCD4+およびCD8+ T細胞からのサ
イトカイン発現もまた、多プローブRNアーゼ保護アッセイ（mRPA）を利用し、RN
Aレベルで解析した。2つの別個の実験のそれぞれの放射線写真プロフィールおよ
び定量的解析を示す（図29）。IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、およびIL-6は、MC38
／V-Wyeth、MC38／B7-1、MC38／ICAM-1、MC38／LFA-3、またはMC38／B7-1／ICAM
-1／LFA-3で刺激したCD4+ T細胞で同様であった（図29、パネルB柱状図）。IL-2
およびIFN-γ発現レベルは、いかなる単一の補助的刺激分子を発現するMC38細胞
で刺激したCD4+ 細胞と比較した場合も、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3で刺激した
CD4+ T細胞で最も高かった（図29B）。わずかにより高いレベルのIL-13、IL-9、
およびIL-6もまた、MC38／B7-1／ICAM-1／LFA-3で刺激したCD4+細胞で見られた
。サイトカイン遺伝子の発現はまた、刺激したCD8+ T細胞でも解析した。解析し
たサイトカインRNAのうち、IL-2および特にIFN-γレベルは、これらの細胞をMC3
8／B7-1／ICAM-1／LFA-3で刺激した場合、いかなる単一の補助的刺激分子を発現
するMC38細胞で刺激したT細胞に比較しても、有意に高かった。したがって、サ
イトカイン産生における補助的刺激分子の3つ組の主な相乗効果は、CD4+細胞に
おけるIL-2およびCD8+ T細胞におけるIFN-γであった。
【０１８１】 実施例28 刺激したT細胞のアポトーシスに対するTRICOM補助的刺激の影響 アポトーシス研究 シグナル1およびrV-TRICOMでのT細胞の刺激が、細胞生存またはプログラム細
胞死（PCD）を導くかどうか決定するため、CD8+ T細胞を、シグナル1としてCon
Aで活性化し、V-WT、rV-B7-1またはrV-TRICOM感染MC38細胞と48時間培養し、そ
して培地中に24時間再プレーティングし、アポトーシスを測定した。アポトーシ
スは、Gavrieli， Yら， J．Cell Biol 119：493-501， 1992に記載されるよう
に、TUNELアッセイを用いて評価した。MC38およびCon AまたはMC38／V-WTおよび
Con Aの組み合わせにより、補助的刺激シグナルの非存在下で活性化されたT細胞
は、高レベルの自発的アポトーシスを示した（それぞれ82．9±1）。Con Aおよ
びMC38／B7-1またはCon AおよびMC38／TRICOMにより活性化されたT細胞は、実質
的により少ない自発的アポトーシスを示した（それぞれ31．3±3．8および30．7
±1）。
【０１８２】 結果は、明らかに、V-WT感染を伴いまたは伴わず、Con Aの存在下で（すなわ
ち、シグナル2の非存在下で）刺激したT細胞におけるアポトーシスを示した。MC
38／TRICOMを伴うCon Aは、明らかにMC38／B7-1を伴うCon Aより、はるかに高い
レベルまで、CD8+細胞を刺激し、そしてより高いレベルのIFN-γおよびIL-2の産
生を生じ、これはいかなるより高い度合いのアポトーシスも生じなかった。
【０１８３】 実施例29 in vivoのrV-CEA／TRICOMの抗腫瘍効果 TRICOMベクターを用い、抗原特異的免疫反応を亢進することが可能であるか決
定する研究を行った。本明細書に開示されるように、ヒトCEA遺伝子およびB7-1
、ICAM-1およびLFA-3遺伝子を含み、rV-CEA／TRICOMと称される、4遺伝子ワクシ
ニア組換え体を構築した。6ないし8週齢の雌C57BL／6マウス（Taconic Farms）
またはヒトCEAのトランスジェニックC57BL／6マウス（Kass， Eら， Cancer Res ． 59：676-683， 1999）を、Hank’s平衡化塩溶液（HBSS）あるいは一度107 pf
u rV-CEA，rV-CEA／B7-1またはrV-CEA／TRICOMいずれかで尾乱切（scarificatio
n）によりワクチン接種し、そして22日後、脾臓を採取した。脾臓細胞のリンパ
球増殖活性を、先に記載されるように解析した（5）。
【０１８４】 図30（挿入図）に見られるように、rV-TRICOMをワクチン接種したマウスの脾
臓T細胞は、rV-CEAをワクチン接種したマウスから得たT細胞と比較し、より高い
レベルのCEA特異的刺激を示した；オボアルブミンおよびCon Aをコントロールと
して用いた。その後、rV-CEA／TRICOMが長期免疫を誘導することが可能であるか
どうか決定する実験を行った。マウス（5匹／群）に一度、V-WT、rV-CEA、また
はrV-CEA／TRICOMのいずれかをワクチン接種した。100日後、CEAを発現している
高用量（1×106）のMC38結腸癌細胞（5）にマウスを曝露した。V-WTおよびrV-CE
Aを受けたすべてのマウスは腫瘍で死亡し、一方、rV-TRICOMをワクチン接種した
すべてのマウスは、曝露50日後、生存していた（図30）。
【０１８５】 ヒトCEA遺伝子が正常成獣胃腸組織で発現され、そして血清がCEA陽性である、
CEAトランスジェニックマウス（Kass 1999、同；Thompson， J．A．ら， J． Cl in． Lab． Anal． 5：344-366， 1999）を使用し、rV-CEA／TRICOMベクターが
自己抗原に対するT細胞反応を亢進することが可能であるかどうか決定した。CEA
トランスジェニックマウスを5マウス／群に分けた。2匹のマウスに一度、107 pf
u rV-CEA、rV-CEA／B7-1、rV-CEA／TRICOMまたは緩衝液をワクチン接種し、そし
て第30日に安楽死させ、CEA特異的T細胞反応を解析した。rV-CEA／TRICOMをワク
チン接種した後に得られたT細胞反応は、rV-CEAで得られたものより、実質的に
大きかった（表2）。オボアルブミンおよびCon Aに対する反応をコントロールと
して用いた。各群の残った3匹のCEAトランスジェニックマウスを用い、TRICOMベ
クターを使用し、CEA発現腫瘍に対する抗腫瘍反応を亢進することが可能である
か決定した。これらのマウスに最初に、s．c．で、CEA遺伝子を発現しているMC3
8癌細胞（5）4×105を接種した。4日後、マウスに一度、107 pfuウイルス組換え
体または緩衝液を、末梢部位に、ワクチン接種した。rV-CEA／TRICOMをワクチン
接種したマウスでは、腫瘍は増殖しなかったが、一方、緩衝液、rV-CEAおよびrV
-CEA／B7-1をワクチン接種したマウスでは腫瘍が増殖しつづけた（表2）。これ
らの結果は、TRICOMベクターのin vivo活性を支持する。
【０１８６】 表2．CEAトランスジェニックマウスにおけるrV-CEA／TRICMONの亢進した免疫
反応および抗腫瘍反応
【０１８７】
【表２】
【０１８８】 C57BL／6トランスジェニックマウス（群当たり5匹）に、皮膚乱切を介し、緩
衝液またはワクシニア組換え体（107 pfu）を、第0日に一度、ワクチン接種した
。第30日、2匹のマウスを殺し、そしてT細胞増殖反応に関し、脾臓T細胞を解析
した。各値は、培地に対する、3つ組試料の平均CPMのSIを示す。標準偏差は10％
を越えることはなかった。第4日、群当たり3匹のマウスに、CEAを発現しているM
C38結腸癌細胞4×105を投与した。腫瘍体積はワクチン接種後、第14日および35
日に得る。
【０１８９】 実施例30 rV-B7／ICAM-1／LFA-3に感染した先駆樹状細胞および樹状細胞によるCD4+およ びCD8+ T細胞の補助的刺激 Inabaら（41）の方法により、新鮮なCD34+骨髄細胞（樹状細胞先駆体）をC57B
L／6マウスから得た。これらの先駆細胞は、直ちに用い、またはGM-CSFおよびIL
-4（42）中で6日間培養し、成熟樹状細胞（DC）を生成した。CD34+先駆細胞およ
びDCを、多数の補助的刺激分子をコードする組換えワクシニアウイルスrV-B7／I
CAM-1／LFA-3（rV-Tricom）、10 MOIに18時間感染させた。感染5時間後、細胞試
料を採取し、そして表現型解析を行った。樹状細胞は当業では「究極の」APCで
あると考えられ、多数の補助的刺激分子を高レベルで発現している。表3は、ネ
ズミDCが実際に補助的刺激分子B7-1、B7-2、ICAM-1、およびLFA-3を、比較的高
レベルで発現することを示す（平均蛍光強度、MFI；括弧内に示される）。しか
し、DCがrV-B7／ICAM-1／LFA-3に感染している場合、補助的刺激分子発現レベル
と共に、多数の補助的刺激分子を発現している細胞のパーセンテージも両方、有
意に増加した。B7-1を発現している細胞のパーセンテージは、65％から86％に増
加し、一方、MFIは4倍増加し；ICAM-1を発現している細胞のパーセンテージは32
％から68％に増加し、一方、MFIは2．5倍増加し；LFA-3を発現している細胞のパ
ーセンテージは44％から75％に増加した。
【０１９０】 表3 rV-COS2での感染前および感染後1の先駆DCの表現型解析
【０１９１】
【表３】
【０１９２】 110 MOIで5時間の感染 2rV-COS＝外来補助的刺激分子をコードする組換えワクシニア 3＝％マーカー発現細胞 4＝平均蛍光強度 刺激細胞として使用するため、感染CD34+先駆細胞およびDCに放射線照射し（2
000 rad）、そして図31に略述されるように、Con Aの存在下で、未処理CD4+およ
びCD8+ T細胞を刺激するのに用いた。
【０１９３】 B7.1、ICAM-1、およびLFA-3をコードする組換えポックスウイルスに感染して
いる先駆樹状細胞は、CD4+およびCD8+ T細胞を両方、刺激することが可能であっ
た。B7.1、ICAM-1、LFA-3発現先駆樹状細胞によるCD8+ T細胞の刺激は、未感染
成熟CD34+樹状細胞を用いて達成されるものより大きかった（図32）。さらに、
成熟CD34+樹状細胞（IL-4およびGM-CSFで前処理されているもの）における、3つ
の補助的刺激分子の感染および発現は、CD4+およびCD8+ T細胞両方の刺激の劇的
な増加を生じた（図33）。
【０１９４】 当業者はまた、アロ反応性反応（混合リンパ球反応、MLR）を支持する能力に
より、樹状細胞集団の特性を測定することが可能である（43）。図34は、rV-TRI
COMに感染した樹状細胞を用いた、混合リンパ球培養の結果を示す。混合リンパ
球反応は、Balb／c由来のTリンパ球を刺激するC57BL／6由来のDCを用いる（すな
わち抗アロタイプ反応）。
【０１９５】 これらのデータは、混合リンパ球反応における増殖の度合いが、未感染DCまた
は野生型ワクシニアに感染しているDCに比較し、rV-TRICOMに感染しているDCを
用いると、劇的により高いことを示す。
【０１９６】 図35は、rV-TRICOMに感染しているDCは、CEAペプチド特異的ネズミT細胞株の
刺激において、標準的DCより、はるかに優れていることを示す。本T細胞株はCD8 + であり、そしてCEA DbクラスI制限エピトープEAQNTTYL（CAP-M8）に特異的であ
る。CEAペプチド（1μg／ml）でパルス処理し、そして先にrV-TRICOMに感染させ
た組み合わせのDCは、特に、低いT細胞対DC比で、CEA特異的T細胞反応を刺激す
る際、明らかに優れている。
【０１９７】 実施例31 rV-またはrF-TRICOM感染ネズミ骨髄由来樹状細胞を用いた、in vitroおよびin vivoのネズミT細胞刺激 実験プロトコル ペプチド H-2kb制限ペプチドOVA（オボアルブミン257-264、SIINFEKL）41およびVSVN（
水疱性口内炎ウイルスN52-59、RGYVYQGL）42、およびH-2Db制限ペプチドCAP-M8
（CEA526-533、EAQNTTYL）およびFLU-NP（NP366-374、ASNENMDAM）43は、購入す
る（Multiple Peptide Systems、カリフォルニア州サンディエゴ）か、または社
内で合成した（Applied Biosystems 432A Synergy Peptide Synthesizer、カリ
フォルニア州フォスターシティー）。
【０１９８】 細胞株および細胞培養 OVAおよびCap-M8 CD8+細胞傷害性T細胞株は、社内で、C57BL／6マウスから生
成し、そしてそれぞれOVAおよびCap-M8ペプチドを認識した。CTL株は、1μg／ml
の特異的ペプチドおよび10 U／mlのネズミIL-2（Boehringer Mannheim、インデ
ィアナ州インディアナポリス）を補った完全培地（CM）（ウシ胎児血清（10％）
、グルタミン（2 mM）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）、Hepes（7 mM）、ゲン
タマイシン（50μg／ml）、2-メルカプトエタノール（50μM）、および非必須ア
ミノ酸（0．1 mM）（Biofluids、メリーランド州ロックビル））中の放射線照射
未処理脾臓細胞を用い、毎週のin vitro刺激周期により維持した。抗原特異的増
殖アッセイにおいて、これらの細胞を反応因子として使用する24時間前に、細胞
をFicoll-Hypaque勾配（密度＝1．119 g／ml、Sigma Chemical Co．、ミズーリ
州セントルイス）上の遠心分離により精製し、そして10 U／mlネズミIL-2のみを
補ったCM中で、6ウェル培養プレート（106細胞／ml、5 ml／ウェル）に再プレー
ティングした。細胞傷害性アッセイでは、使用した標的腫瘍細胞株は、EL-4（C5
7BL／6、H-2b、胸腺腫、ATCC TIB-39）であった。
【０１９９】 DC調製 骨髄は、6ないし8週齢の雌C57BL／6マウス（Taconic Farms、ニューヨーク州
ジャーマンタウン）から得た。本研究に用いた方法は、Inabaら41に記載される
ものをわずかに修飾したものであった。簡潔には、骨髄を肢の長骨から洗い出し
、そしてFicoll-Hypaque勾配上を通過させた。CD4、CD8、および抗MHCクラスII
に特異的な磁気ビーズカクテル（MiniMACS、Miltenyi Biotec、カリフォルニア
州オーバーン）を用い、骨髄細胞のリンパ球およびIa+細胞を枯渇させた。細胞
は、10 ng／ml GM-CSFおよび10 ng／ml IL-4（R＆D Systems、ミネソタ州ミネア
ポリス）を補ったCM中で、6ウェル培養プレート（106細胞／ml、5 ml／ウェル）
にプレーティングした。第2および4日に、細胞を新鮮なサイトカインを補った培
地中で再プレーティングした。培養6日目、感染、解析および免疫感作のため、
細胞を採取した。明記された実験には、培養の最後の24時間に、DCをネズミTNF-
α（100 ng／ml、Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）
またはCD40 mAb（5μg／ml、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）で処
理した。
【０２００】 組換えポックスウイルス 合成初期／後期（sE／L）プロモーターの調節下のネズミ補助的刺激分子B7-1
（CD80）をコードする遺伝子を含むrVウイルス（rV-B7-1と称される）が、本明
細書に記載されてきている。ワクシニア30K（M2L）プロモーターの調節下のネズ
ミLFA-3遺伝子（CD48）、ワクシニアI3プロモーターの調節下のネズミICAM-1（C
D54）、および合成初期／後期（sE／L）プロモーターの調節下のネズミB7-1遺伝
子を含むrVウイルスは、rV-TRICOMと名づけられている。ベクターrF-B7-1および
rF-B7-1／ICAM-1／LFA-3（rF-TRICOMと称される）は、それぞれrV-B7-1およびrV
-TRICOMと同様に構築されたrFウイルスである。レポーター遺伝子、ヒトCEAを含
む鶏痘-TRICOM構築物を特定の実験に用いた。非組換え野生型ワクシニアウイル
ス（Wyeth株）はV-WTと称され、一方、野生型鶏痘ウイルスはFP-WTと称された。
【０２０１】 DC感染 DCは第6日に採取し、そしてOpti-Mem（Gibco-BRL、メリーランド州ガイザーズ
バーグ）で洗浄した。その後、細胞をHBSSにニセ（mock）感染させ；Opti-Mem中
で、5時間、25 MOI（感染多重度；PFU／細胞）で、V-WT、rV-B7-1、またはrV-TR
ICOMに感染させ；あるいは50 MOIで、FP-WT、rF-B7-1、またはrF-TRICOMに感染
させた。感染後、温CMを添加し、そして細胞を37℃で一晩インキュベーションし
た。感染後、免疫染色、in vitro補助的刺激解析、およびin vivo投与のため、
細胞を採取した。
【０２０２】 フローサイトメトリー解析 細胞表面染色は3色免疫蛍光を利用した。染色は、一次FITC標識抗体、CD11c、
CD11b、H-2Kb、H-2Db、CD19、Pan-NK；一次PE標識抗体、IAb、CD48（mLFA-3）、
CD86（B7-2）、CD3、CD14；およびビオチン標識抗体、CD80（B7-1）、CD57（ICA
M-1）、CD40で行った。ビオチン標識抗体は、続いて、シトクロム・ストレプト
アビジンで標識した。すべての抗体は、PharMingenより購入した。Lysis IIソフ
トウェアを用いたFACSCAN血球計算装置（Becton Dickinson、カリフォルニア州
マウンテンビュー）で、細胞蛍光を解析し、そして適切なアイソタイプ一致コン
トロール（PharMingen）と比較した。
【０２０３】 in vitro補助的刺激解析：薬理学的シグナル-1 雌の6ないし8週齢のC57BL／6マウスを得て（Taconic Farms、ニューヨーク州
ジャーマンタウン）、そして先に記載されるように5、未処理T細胞を単離した。
T細胞は、96ウェル平底プレート（Costar、マサチューセッツ州ケンブリッジ）
中に、105／ウェルで添加した。未感染DC、ニセ感染DC、あるいはワクシニアベ
クター（V-WT、rV-B7-1、rV-TRICOM）または鶏痘ベクター（FP-WT、rF-B7-1また
は、rF-TRICOM）に感染したDCのいずれかからなる刺激細胞に放射線照射（20 Gy
）し、そして105／ウェルで添加した。すべてのウェル中の細胞は、いくつかの
濃度（2．5ないし0．9μg／ml）のCon A（Sigma）の存在下で、総体積200μlのC
M中で、2日間培養した。細胞は、インキュベーションの最後の12-18時間、1μCi
／ウェルの3H-チミジン（New England Nuclear、デラウェア州ウィルミントン）
で標識し、そしてTomtec細胞採取装置（Wallac Incorporated、メリーランド州
ガイザーズバーグ）で採取した。取り込み放射能は、液体シンチレーション計測
（Wallac 1205 Betaplate、Wallac， Inc．）で測定した。3つ組ウェルの結果を
平均し、そして平均CPM±SEMとして報告する。
【０２０４】 混合リンパ球反応 MLRを用い、同種異系および同系未処理T細胞に対するDCの刺激機能を評価した
。T細胞は、先のように、Balb／CまたはC57BL／6マウスから単離した。刺激細胞
は、未感染；ニセ感染；あるいはV-WT、rV-137-1、rV-TRICOM、FP-WT、rF-B7-1
またはrF-TRICOMに感染したDCのいずれかからなり、そして放射線照射（20 Gy）
した。T細胞（5×104／ウェル）を平底96ウェル培養プレート中で、CM中の段階
的な数の刺激細胞と同時培養し、そして37℃、5％ CO2で4日間インキュベーショ
ンし、先のように、インキュベーションの最後の12-18時間、1μCi／ウェルの3H
-チミジンで標識し、採取し、そして解析した。
【０２０５】 in vitro補助的刺激解析：ペプチド特異的シグナル 休止OVAまたはCAP-M8 T細胞（反応因子）を、96ウェル平底プレートに、5×10 4 ／ウェルで添加した。刺激細胞は、未感染あるいはV-WT、rV-137-1、またはrV-
TRICOMに感染したDCのいずれかからなり、そして放射線照射（20 Gy）した。す
べてのウェル中の細胞は、総体積200μlのCM中で培養した。補助的刺激アッセイ
は、2組の条件を用いて行った：（1）10：1の固定比の反応因子：刺激細胞、い
くつかの濃度の特異的ペプチドまたは適切なコントロールペプチドの存在下で培
養、あるいは（2）固定濃度の特異的ペプチドまたはコントロールペプチド、多
様な反応因子：刺激細胞比で培養。細胞を72時間培養し、先のように、インキュ
ベーションの最後の12-18時間、1μCi／ウェルの3H-チミジンで標識し、採取し
、そして解析した。
【０２０６】 in vivoのCTL誘導および細胞傷害性解析 未感染、あるいはV-WTまたはrV-TRICOMに感染したDCいずれか（1×106）をOpt
i-Memで2回洗浄し、そして10μMのOVAまたはCAP-M8ペプチドいずれかを含む同じ
培地1 mlに再懸濁した。37℃で2時間インキュベーションした後、細胞をHBSSで2
回洗浄し、そして注射のためHBSSに再懸濁した。ペプチドパルス処理DC（1×105 細胞／マウス）を、7日間隔で、1-3回、静脈内注射した。コントロールマウスは
、Ribi／Detoxアジュバント（Ribi ImmunoChem Research、モンタナ州ハミルト
ン）中の100μgの示されるペプチドで皮下免疫した。最後の接種の14日後、群当
たり2匹の動物から脾臓を除去し、単細胞懸濁に分散させ、プールし、そして10
μg／mlの適切なペプチドと6日間、同時インキュベーションした。バルクのリン
パ球を密度勾配（LSM、Organon Teknika、ペンシルバニア州ウェストチェスター
）を通じた遠心分離により回収した。先のように45、111Inを用いた標準的細胞
溶解アッセイにおける標的として使用するために、EL-4細胞を調製した。標的細
胞を、10μMの特異的ペプチドで、37℃で1時間、パルス処理し、一方、第二の群
の標的細胞は、コントロールペプチドでパルス処理した。リンパ球およびペプチ
ドパルス処理標的（5×103細胞／ウェル）をCMに懸濁し、96ウェルU底プレート
（Costar）中で80：1ないし10：1のエフェクター：標的比で合わせ、そして37℃
で5時間、5％ CO2と共にインキュベーションした。インキュベーション後、Supe
rnatant Collection System（Skantron、バージニア州スターリング）を用い上
清を集め、そしてガンマカウンター（Cobra Autogamma、Packard、イリノイ州ダ
ウナーズグローブ）を用い、放射能を定量化した。111Inの特異的放出のパーセ
ンテージは、標準的等式：％特異的溶解＝[（実験-自発）／（最大-自発）]／10
0により決定した。示される場合、Wunderlichら、1994に記載されるように、CTL
活性を溶解単位（LU）に変換した。
【０２０７】 抗ワクシニア抗体解析 V-WTを5×105／ウェルで塩化ポリビニルプレート（Dynatech、バージニア州シ
ャンティリー）に添加し、37℃で一晩乾燥させ、そして5％ BSAでブロッキング
した。免疫マウス由来血清の段階的希釈を3つ組で添加し、そして37℃で1時間イ
ンキュベーションした。プレートを洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスIgG（Kirkgaard and Perry Laboratories、メリーランド州ガイザーズバ
ーグ）とさらに1時間インキュベーションした。ウェルをo-フェニレンジアミン
二塩酸（Sigma、ミズーリ州セントルイス）およびH2O2で染色した。Bio-Tek EL3
12eマイクロプレートELISA読取装置（バーモント州ウィヌースキー）を用い、各
ウェルの吸光度を405 nmで読み取った。
【０２０８】 結果 DC上の補助的刺激分子の発現増加 DCのポックスウイルス感染の効率を測定するため、これらの細胞を、B7-1、IC
AM-1、およびLFA-3をコードするrVウイルス（rV-TRICOMと称される）またはB7-1
、ICAM-1、LFA-3およびヒト癌胎児性抗原（CEA）をコードするrFウイルス（rF-C
EA／TRICOMと称される）いずれかに感染させた。後者の場合、鶏痘構造タンパク
質が感染細胞で発現されないため、CEAはレポーター遺伝子として用いられる。1
8時間後、特定のウイルス感染に関連する、細胞表面マーカーの発現に関し、細
胞を解析した。未感染コントロールDCはCD11bを発現し（97％）、そしてワクシ
ニアタンパク質の発現に関し、陰性であった。rV-TRICOMでの感染後、94％のDC
はCD11bおよびワクシニアタンパク質を共に同時発現した。rF-CEA／TRICOMに感
染したDCは、CD11bおよびCEAを共に同時発現した（87％）。これらのDCは、ポリ
クローナルウサギ抗鶏痘血清により検出されるように、鶏痘タンパク質を発現せ
ず（データ未提示）、これは鶏痘が哺乳動物細胞で複製しないと明記する報告と
一致した。総合すると、これらのデータは、DCがrVおよびrFベクター両方に、効
率的に感染することを示す。
【０２０９】 DCの重要な特性は、組織適合抗原および補助的刺激分子両方を高レベルで発現
することである。ウイルス感染後のDCの表現型をさらに性質決定するため、細胞
を野生型ワクシニアウイルス（V-WT）、rV-B7-1、rV-TRICOM、野生型鶏痘（FP-W
T）またはrF-TRICOMに感染させ、そしてDC表現型と関連する、細胞表面マーカー
の発現に関し解析した（表4）。期待されるように、未感染およびニセ感染DCは
、高レベルのMHCクラスIおよびII、CD11b、B7-2およびCD40分子と共に、高レベ
ルのB7-1、ICAM-1、およびLFA-3を発現した。V-WT感染DCは、（MFIにより測定さ
れるように）より低い細胞表面密度のいくつかの分子を発現し、一方、rV-B7-1
感染DCは、未感染DCより5倍多いB7-1を発現した（MFI329から1689）。rV-TRICOM
でのDCの感染は、MFI並びにB7-1、ICAM-1、およびLFA-3に関し陽性の細胞のパー
センテージを実質的に増加させた。FP-WT感染DCは、未感染DCのものと同様の表
現型プロフィールを有した。rF-TRICOMでのDCの感染もまた、MFI並びにB7-1、IC
AM-1、およびLFA-3に関し陽性の細胞のパーセンテージを実質的に増加させた。
すべてのDC集団は、rFまたはNベクターでの感染前および感染後とも、T細胞（CD
3）、B細胞（CD19）、単球／好中球（CD14）、およびNK細胞（Pan NK）マーカー
に関し、陰性のままであった（表4）。
【０２１０】 表4 rV-TRICOMまたはFP-TRICOMでのBMDCの感染は、B7-1、ICAM-1、およびLFA-3の
発現レベルを増加させる
【０２１１】
【表４】
【０２１２】 DCは、未感染、ニセ感染、あるいは25 MOIのV-WT、rV-B7、またはrV-TRICOMい
ずれか、または50 MOIのWT-FPまたはFP-TRICOMに5時間感染させた。18時間イン
キュベーションした後、3色フローサイトメトリー解析により、細胞を表現型決
定した。太字の数字は、細胞表面発現（MFI）の＞100％変化を示す。
【０２１３】 TRICOMベクターでのDC感染は、未処理T細胞を刺激する能力の亢進を示す in vitroモデルを用い、増加したレベルのB7-1、ICAM-1およびLFA-3発現が、
どのように未処理T細胞増殖誘導を補助するかを解析した。本モデルでは、T細胞
活性化の第一のシグナルは、薬理学的剤（Con A）を介し、搬送し、そしてさら
なる、または補助的刺激シグナルは、DCまたは組換えポックスウイルス感染の結
果としてより高いレベルのTRICOMを発現しているDCを介し、T細胞に搬送した。
これらのそして本明細書に報告されるすべての続く研究において、V-WTおよびEP
-WTもまた用い、ベクター単独による影響を排除した。図36Aに示されるように、
未感染およびニセ感染DCは共に、T細胞増殖を誘導した。V-WT感染DC（DC／V-TRI
COMと称される）は未感染DCより少ないT細胞増殖を誘導した。rV-B7-1に感染し
たDC（DC／rV-B7-1と称される）を介したさらなる補助的刺激の搬送は、未感染D
Cに比較し、増殖を増加させた。しかし、rV-TRICOMに感染したDC（DC／rV-TRICO
Mと称される）は、Con Aのすべての濃度で、T細胞増殖をさらに増加させた。さ
らに、T細胞をDC／rV-TRICOMで刺激した場合、未感染DCのものと匹敵するレベル
の増殖を誘導するのに、28倍少ないCon Aしか必要でなかった。鶏痘ベクターを
用い、これらの実験を繰り返すと、DC／rF-TRICOMはDCまたはDC／rF-B7-1と異な
り、すべてのCon A濃度でT細胞増殖増加を誘導した（図36B）。これらの実験を4
回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２１４】 TRICOMベクターに感染したDCによるアロ刺激活性の亢進 DC刺激能力に対するrV-TRICOM（図37A、C、E）またはrF-TRICOM（図37B、D、E
）感染の効果を、アロ特異的混合リンパ球反応で評価した。未感染DCおよびニセ
感染DC集団は共に、同種異系T細胞の強い増殖（78，000 CPM）を誘導した（図37
A、B）。rV-B7-1感染後、DCの刺激能力は増加した（図37C）。rV-TRICOMでのDC
感染は、すべてのDC／反応因子比で、DCおよびDC／rV-B7-1よりも、刺激能力を
増加させた（図37C）。重要なことに、rV-TRICOMに感染したDC集団は、同系T細
胞を刺激しなかった（図37E）。鶏痘ベクターを用い、これらの実験を繰り返す
と（図37B、D）、DC／rF-TRICOMはDCおよびDC／rF-B7-1より同種異系T細胞増殖
のより多い増加を誘導したが、DC-rF-TRICOMは同系T細胞を刺激しなかった（図3
7F）。これらの実験を3回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２１５】 in vitro補助的刺激解析：エフェクターT細胞へのペプチドの提示 ペプチドパルス処理DCの刺激能力を、DCをrV-TRICOMに感染させることにより
、亢進させることが可能であるかどうか決定する研究を行った。本目的のため、
H-2kb制限OVA（オボアルブミン257-264、SIINFEKL）およびOVA特異的CD8+エフェ
クターT細胞株を用いた。DCを異なる濃度のOVAペプチドに曝露し、そしてOVA T
細胞株の存在下でインキュベーションした（図38A-38F）。慣用的な（すなわち
未感染の）DCは、OVAペプチドとインキュベーションした際、OVA特異的T細胞の
強い増殖を誘導した（図38A）。これらのDCは、コントロールペプチド、VSVN（
水疱性口内炎ウイルスN52-59、RGYVYQGL）とインキュベーションした際、OVA特
異的T細胞の増殖を誘導しなかった（図38A、白い正方形）。DC／rV-B7-1は、こ
れらの細胞の全体的なペプチド特異的増殖を、1．8倍増加させた（図38C）。さ
らに、DC／rV-B7-1は、4倍少ないペプチドの存在下で、未感染またはニセ感染DC
のものと同様の増殖を誘導した。対照的に、DC／rV-TRICOMは、これらのT細胞の
全体的な増殖を、数倍増加させ、そして32倍少ないOVAペプチドの存在下で、未
感染DCのものと匹敵する増殖を誘導した（図38C）。ワクシニア感染DCがペプチ
ドを提示する能力をさらに評価するため、DCを単一濃度のOVAペプチド（1μM）
でパルス処理し、そしていくつかの比のT細胞の存在下でインキュベーションし
た（図38E）。細胞当たりに基づき、DCのものと匹敵する増殖レベルを誘導する
のに、4倍少ないDC／rV-B7-1が必要であった（白い三角形対黒い正方形）。最大
刺激効果は、DC／rV-TRICOMのものであり、これは32倍少ない細胞で、DCのもの
と匹敵する増殖レベルを誘導した（白い円対黒い正方形）。
【０２１６】 ペプチドパルス処理DCおよび樹立T細胞株を使用する第二のペプチド系を使用
し、OVAペプチドで得られたものと同様の結果が見られるかどうか決定した。こ
れらの実験は、H-2Db制限ペプチドCAP-M8（CEA526-533、EAQNTTYL）およびCAP-M
8特異的CD8+エフェクターT細胞株を用いて行い；同様の結果が見られた（図38B
、D、F）。これらの実験をさらに5回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２１７】 TNFαまたはCD40成熟DCに対するrV-TRICOM感染の影響 DCの機能的成熟は、T細胞補助的刺激分子の上方制御と相関すると考えられる
ため、TNF-αまたはCD40 mAbいずれかとの同時培養により成熟したDCに対するrV
-TRICOM感染の影響を調べる実験を行った。培養の最後の24時間にTNF-αでDCを
処理すると、その結果、フローサイトメトリー解析により測定されるように、MH
C-II、B7-2、およびICAM-1がいくらか上方制御され（表5）、一方、CD40 mAbでD
Cを処理すると、その結果、ICAM-1発現が上方制御され、そしてMHC-IIがわずか
に上方制御される。機能上、TNF-αまたはCD40 mAbでのDCの処理は、ペプチド特
異的増殖において、未操作DCのものより、それぞれ、28％および16％増加させた
（図39A）。DCをリポ多糖（LPS）で処理した後もまた、同様のデータが得られた
。未処理CDをrV-TRICOMに感染させると、T細胞増殖の実質的な増加が生じた（図
39A対39B）。しかし、TNF-αまたはCD40 mAbで前処理した後、rV-TRICOMに感染
させると、rV-TRICOM感染単独で見られたものより、わずかに高い刺激能力が与
えられたのみであった。これらの実験をさらに3回繰り返し、同様の結果を得た
。
【０２１８】 表5 rV-TRICOM感染前のTNF-αまたはCD40 mAbでのDCの前処理の影響
【０２１９】
【表５】
【０２２０】 DCは、培養の最後の24時間、TNF-α（100 ng／ml）またはCD40 mAb（1μg／ml
）で処理した。その後、DCまたは処理DCを25 MOIのrV-TRICOMに5時間感染させた
。18時間インキュベーションした後、3色フローサイトメトリー解析により、細
胞を表現型決定した。
【０２２１】 W-TRICOMに感染したDCは、in vivoのCTL反応の誘発（priming）に、より有効
である Con A（図36E-F）、混合リンパ球反応（図37）および2エフェクターT細胞モデ
ル（図38）を用い、in vitroで見られたDC／rV-TRICOMの刺激能力の亢進が、in
vivoの未処理T細胞反応誘発の有効性の亢進に転換されるかどうか決定する実験
を行った。本目的のため、DC、DC／V-WT、およびDC／rV-TRICOMを10μMのOVAペ
プチドでパルス処理し、そしてC57BL／6マウスに静脈内注射した。コントロール
マウスは、Ribi／Detoxアジュバント中のOVAペプチドで皮下免疫した。ワクチン
接種の14日後、脾臓細胞を採取し、in vitroで6日間再刺激し、そしてOVAパルス
処理EL-4細胞に対し、そのペプチド特異的溶解能に関し、評価した。VSVNペプチ
ドでパルス処理したEL-4細胞をコントロール標的細胞として用いた。図40Aに見
られるように、ペプチド／アジュバントで免疫したマウスから生成されたCTLは
、中程度のレベルのCTL活性を示した（図40A）。ペプチドパルス処理DCで免疫し
たマウスは、より大きいペプチド特異的CTL反応を示した（図40B）。誘導CTL反
応は、DC／v-WTで免疫されたマウスで、いくらか鈍っていた（図40C、＜2．5溶
解単位（LU）対5．2 LU）。対照的に、ペプチドパルス処理DC／rV-TRICOMで免疫
したマウス（図40D）は、DCのものより有意に強いCTL反応を示した（LU＝14．3
、p＝0．001）。その後、第二のモデルペプチド、CEAペプチドCAP-M8を用い、同
様の実験を行った（図40E-H）。再び、ペプチドパルス処理DCは、ペプチド／ア
ジュバントにより引き出されるものより、はるかに高いCTL活性を引き出した（5
．7 LU対＜2．5 LU）。さらに、ペプチドパルス処理DC／rV-TRICOMで免疫された
マウス（図40H）は、ペプチドパルス処理DCにより誘導されるもの（5．7 LU）に
比較し、強いCTL反応（＞20 LU、p＝＜0．001；図40F）を示した。
【０２２２】 多ベクター感染DCワクチン接種の有効性 抗ワクシニア抗体の生成は、免疫原としてのワクシニアウイルスの反復使用を
防ぐことが可能であると、一般的に考えられる。しかし、免疫原としてのワクシ
ニア感染細胞の反復使用に関しては、ほとんど知られていない。この問題に取り
組むため、CAP-M8ペプチドパルス処理DC免疫原を、7日間隔で、1、2、または3回
投与する、免疫計画を実行した。以前のように、最後の免疫の14日後に脾臓細胞
を採取し、in vitroで6日間再刺激し、そしてCAP-M8パルス処理EL-4細胞に対す
るそのペプチド特異的溶解能に関し、評価した。図41Aに見られるように、ペプ
チドパルス処理DC／rV-TRICOMは、ペプチドパルス処理DCに比較し、より高いレ
ベルのCTL活性を誘導した。これらのデータは図40E-Hに見られるものと同様であ
る。このDC／V-WTまたはDC／rV-TRICOMの単回投与により、定性的ELISAにより決
定されるように、1：4，000ないし1：9，000の範囲の値で、有意な抗ワクシニア
IgG抗体力価が誘導された。しかし、これらの力価は、これらの免疫原が、続く
免疫感作でCTL活性を高める能力に対し、いかなる影響も持たなかった（図41Bお
よび41C）。第二のワクチン接種後の抗ワクシニアウイルス力価は1：12，000な
いし1：50，000の範囲であり、一方、すべての群で、ペプチド特異的CTLの誘導
の上昇が見られた。再びDC／rV-TRICOMパルス処理細胞を使用して観察されるCTL
活性は、ペプチドパルス処理DCで観察されるものより高かった。
【０２２３】 実施例32 TRICOMベクターに感染した脾臓細胞または骨髄前駆細胞は、樹状細胞に匹敵す るT細胞活性化を誘導する 材料および方法 骨髄先駆細胞および樹状細胞培養の生成 骨髄由来DCの生成に用いた方法は、Inabaらに記載されるものに重要でない修
飾を加えたものであった。簡潔には、6-8週齢の雌C57BL／6マウス（Taconic Far
ms、ニューヨーク州ジャーマンタウン）から大腿骨を採取し、そして骨髄を洗い
出し、そしてFicoll-Hypaque勾配上に通過させた。CD4、CD8、およびMHCクラスI
Iに特異的な磁気ビーズカクテル（MiniMACS、Miltenyi Biotec、カリフォルニア
州オーバーン）を用い、骨髄細胞のリンパ球およびIa+細胞を枯渇させた。その
後、樹状細胞先駆体と称されるこれらの枯渇骨髄細胞を、感染のため調製し、ま
たは樹状細胞培養のため、枯渇骨髄細胞を、10 ng／ml GM-CSFおよび10 ng／ml
IL-4（R ＆ D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）を補ったCM中で、6ウェル培
養プレート（106細胞／ml、5 ml／ウェル）にプレーティングした。第2および4
日に、新鮮なサイトカインを補ったCM中にDC培養を再プレーティングし、第4日
に新たなプレートに分配した。培養7日目、解析、in vitroアッセイおよびin vi
vo免疫感作のため、細胞を採取した。
【０２２４】 脾臓細胞刺激細胞の生成 未処理の雌C57BL／6マウスから脾臓を採取し、押しつぶして単細胞懸濁物にし
、そしてFicoll-Hypaque勾配上に通過させた。脾臓細胞は、CD90、およびMHCク
ラスIIに特異的な磁気ビーズカクテルを用い、リンパ球およびIa+細胞を枯渇さ
せた。その後、精製脾臓細胞をOpti-Mem（Gibco-BRL）で2回洗浄し、そして組換
えポックスウイルスでの感染のため調製した。
【０２２５】 刺激細胞の感染 骨髄由来樹状細胞先駆体および脾臓細胞をOpti-Memで2回洗浄し、そしてニセ
感染させ、あるいは25 MOIのV-WT、rV-B7-1、rV-TRICOM、または50 MOIのFP-WT
、rF-B7-1またはrF-TRICOMに、25 MOI（感染多重度、PFU／細胞）で、最終体積1
mlのOpti-Mem中で5時間、感染させた。感染後、温かい（37℃）CMを添加し、そ
して細胞を37℃で一晩インキュベーションした。感染後、免疫染色、in vitro補
助的刺激解析、およびin vivo投与のため、細胞を採取した。
【０２２６】 補助的刺激解析 休止CAP-M8 T細胞（反応因子）を、96ウェル平底プレート（Costar、マサチュ
ーセッツ州ケンブリッジ）中に、5×104／ウェルで添加した。刺激細胞は、未感
染、ニセ感染、あるいはV-WT、rV-B7-1、rV-TRICOM、FP-WT、またはrF-TRICOMい
ずれかに感染した、BMDC、脾臓細胞、または骨髄先駆体のいずれかからなり、そ
して放射線照射した（20 Gy）。ウェル中の細胞は、総体積200 mlのCM中で培養
した。補助的刺激アッセイは、2組の条件を用いて行った：a）非BMDC刺激因子に
は、2．5：1、そしてBMDCには10：1の固定比の反応因子：刺激細胞、シグナル1
としてのいくつかの濃度のCon-A、特異的ペプチド、または適切なコントロール
ペプチドの存在下で培養、あるいはb）シグナル1としての固定濃度のCon-A、特
異的ペプチド、またはコントロールペプチド、多様な反応因子：刺激細胞比で培
養。細胞を、Con-Aおよびペプチド特異的アッセイのため、それぞれ、48または7
2時間培養し、そして先のように、インキュベーションの最後の12-18時間、1mCi
／ウェルの3H-チミジンで標識し、採取し、そして解析した。
【０２２７】 表6は、組換えベクターでの感染後、補助的刺激分子の脾臓細胞および骨髄（B
M）細胞表面発現を示す。精製ネズミ脾臓細胞または骨髄細胞は、25 MOIのワク
シニアベクターまたは50 MOIの鶏痘ベクターに5時間感染させた。細胞表現型をD
Cのものと比較した。すべての細胞は、フルオレセイン・イソチオシアネート、
フィコエリトリン、またはビオチン／ストレプトアビジン-シトクロムで標識し
た、補助的刺激分子特異的mAbで免疫染色した。アイソタイプコントロールは陰
性であった（データ未提示）。数字は陽性細胞パーセントを、そして括弧内の数
字は平均蛍光強度を示す。
【０２２８】 表6 rV-TricomまたはrF-TRICOMでのBMDC、脾臓細胞、およびBMDC先駆細胞の感染は 、B7-1、ICAM-1、およびLFA-3の発現レベルを増加させる1
【０２２９】
【表６】
【０２３０】 1細胞は未感染、あるいは25 MOIのV-WT、rV-B7-1、rV-Tricom、または50 MOI
のFP-WT、rF-B7-1またはrF-TRICOMに5時間感染させた。18時間のインキュベーシ
ョン期間後、3色フローサイトメトリー解析により、細胞を表現型決定した。値
は、％陽性細胞（平均蛍光強度）で示す。太字の数字は、細胞表面発現（MFI）
における、＞2倍の変化を示す。
【０２３１】 2BMDC：第6日骨髄由来樹状細胞（10 ng／ml GM-CSF／IL-4中で培養）。 3α-CD90（Thy 1．2）磁気ビーズを介し、T細胞を枯渇させた脾臓細胞。 4BMDC先駆体：骨髄細胞は、α-CD4、α-CD8、α-MHCII磁気ビーズを介し、T細
胞およびMHC-II細胞を枯渇させた。
【０２３２】 図42Aから46は、TRICOM感染脾臓細胞が、T細胞反応の刺激において、TRICOM感
染骨髄細胞と匹敵することを示す。
【０２３３】 実施例33 ペプチドでパルス処理した同種異系rF-TRICOM感染ヒト樹状細胞を用いたヒトT 細胞刺激 ヒト樹状細胞を、ロイコフェレーシス（leucopheresis）により、健常個体か
ら単離した。ヒト樹状細胞は、GM-CSFおよびIL-4の存在下で6-9日間培養した後
、樹状細胞の感染のため、rF-TRICOMまたはrF-コントロールを添加した。rF-TRI
COM感染樹状細胞をCEAペプチド（CAP-1またはCAP I、6D）（図47）；PSAペプチ
ド（PSA-3）（図48）；インフルエンザペプチド（Fluペプチド58-66）（図49お
よび50）；またはHPVペプチド（11-20）（図51-45）で1時間、パルス処理した。
末梢血単核細胞（PBMC）から単離したヒトT細胞は、ペプチドパルス処理rF-TRIC
OM感染樹状細胞の存在下で培養し、そしてT細胞によるIFN-αの産生を測定した
。図47-54は、ペプチドパルス処理rF-TRICOM感染ヒト樹状細胞が、コントロール
より高い度合いでT細胞を刺激したことを示す。図47-54と共に表7は、rF-TRICOM
に感染した同種異系ヒト樹状細胞が、いかなる抗原性ペプチドもT細胞に効果的
に提示し、免疫反応を亢進することが可能であることを示す。
【０２３４】 表7 HPV E7（11-20）ペプチドでパルス処理したDCを用いることによるT細胞株のCT L活性
【０２３５】
【表７】
【０２３６】 E：T比＝25：1 6時間の111-In放出アッセイを行った。C1R-A2細胞は、10μg／mlの濃度のHPV
E7ペプチド（11-20）YMDLQPETTでパルス処理した。
【０２３７】 表7に示される結果は、どちらもペプチドでパルス処理した場合、rF-TRICOM（
A）に感染したDCは、標準的DC（B）よりも、CTLを生成するAPCとして優れている
ことを示す。
【０２３８】 実施例34 rV-huTRICOM、rV-CEA hu TRICOMワクチンおよびrF-CEA TRICOMのヒト臨床試験 ヒト臨床試験の目的は、宿主抗腫瘍反応を引き出し、そして進行したCEA発現
腺癌の患者において許容可能な毒性と結び付けられる、組換えrV-hu TRICOMおよ
びrV-CEA-hu TRICOMワクチンの最適容認用量（OTD）を決定することである。
【０２３９】 rV-hu TRICOMおよびrV-CEA-hu TRICOMワクチンは、第I相および第II相ヒト臨
床試験に適した条件下で産生する。 最初の試験では、初期用量106 pfuウイルス、I．M．の後、107 pfuウイルス、
I．M．、その後、108 pfuウイルスまたは109 pfuウイルス、S．C．または乱切で
、増大する用量の組換えrVまたはrF CEA-hu TRICOM生ウイルスワクチンまたはrV
-CEAを加えたrV-hu TRICOMを提供する。
【０２４０】 各組換えワクチンに対する抗腫瘍反応は、当業に知られるように、新たな型の
療法に対する腫瘍反応を測定するのに許容される標準的規準を用い、腫瘍サイズ
、度合いおよび増殖の臨床的、実験室的および放射線医学的徴候を用い、決定す
る。
【０２４１】 組換えワクチンに対する患者の免疫反応は、抗CEA抗体アッセイ、抗ポックス
ウイルス抗体アッセイ、免疫複合体アッセイ、CEA特異的リンパ球増殖アッセイ
、CEA特異的細胞傷害性Tリンパ球アッセイ、ガンマ-インターフェロン放出T細胞
アッセイにおけるCEA反応性T細胞の先駆体頻度、ELISPOT、T細胞反応のためのFa
st Immune、Tetramereアッセイ（Scheibenhogenら， Int． J． Cancer 71：932
-936， 1997）、HLAアッセイおよびそれらに匹敵するものを含む、多様な免疫学
的アッセイを用い、評価する。処置前および処置後試料の比較を行い、CEA腫瘍
抗原に対して向けられる体液性および細胞性免疫反応の発展を立証する。
【０２４２】 実施例35 組換え鶏痘CEA-hu TRICOMのヒト臨床試験 最初の試験では、106 pfuウイルス、107 pfuウイルスおよび108 pfuウイルス
の増大する用量の組換え鶏痘CEA hu TRICOMワクチンを、進行したCEA発現腺癌の
患者の腫瘍塊に直接注射する。
【０２４３】 組換えワクチンに対する特異的抗腫瘍および免疫反応を、実施例34に記載され
るように決定する。 実施例36 多補助的刺激分子過剰発現樹状細胞により活性化されたTリンパ球のヒト臨床
試験 末梢血リンパ球および樹状細胞は、進行した前立腺癌の患者から得る。末梢血
リンパ球をCD8＋リンパ球に関し濃縮する。樹状細胞を、PSAエピトープの発現お
よび多数の補助的刺激分子の過剰発現を可能にするのに十分な期間、rV-PSAエピ
トープQVHPQKVTK／B7.1／ICAM-1／LFA-3に感染させる。PSAエピトープ特異的CD8 + リンパ球を、これらの処理樹状細胞の存在下で活性化し、そして拡大する。活
性化PSAエピトープ特異的CD8+自己Tリンパ球を単独で、そしてPSAエピトープと
組み合わせて注射する。処理に対する特異的抗腫瘍およびPSA特異的免疫反応は
、実施例34に記載されるものと匹敵する方法により、決定する。
【０２４４】 本発明の組換えベクター内で、別のTAAをコードする遺伝子でCEAをコードする
遺伝子を置き換えることにより、他のTAAを発現する癌患者の治療のための、同
様のヒト臨床試験を実施してもよい。
【０２４５】 実施例37 rF-TRICOMに感染したDCを用いた、免疫原性ペプチドおよび／または特異的ペ
プチドと免疫反応するヒトT細胞に関するスクリーニング 本発明は、腫瘍特異的CTLを活性化するための腫瘍関連抗原を持つウイルスベ
クターでのDCのex vivo操作を用いた抗癌療法を含む。TRICOM補助的刺激分子と
組み合わせたrF-CEAに感染したDCを用い、CEA特異的免疫反応を増大させた。rF-
CEA／TRICOMおよびrF-TRICOMに感染したDCのCTL誘導能力を評価する。四量体MHC
クラスI CAP-1複合体を用い、CAP-1特異的CTLを視覚化する。本プロトコルは、
腫瘍関連抗原、CEAに限定されず、癌、病原性細菌、ウイルス、原生動物、酵母
およびそれらに匹敵するものに対する免疫療法のため、いかなる抗原性ペプチド
またはその免疫原性エピトープでもよいものに関する抗原特異的免疫反応を引き
出すよう、修飾してもよい。さらに、該方法を修飾し、天然タンパク質、組換え
タンパク質、合成タンパク質、または各々由来の断片、コンビナトリアル・ライ
ブラリー、およびそれらに匹敵するものなどの供給源から免疫原性ペプチドをス
クリーニングし、そして同定してもよい。
【０２４６】 材料および方法 細胞培養 結腸直腸癌細胞株SW1463（HLA-A1，2）、LS174T（HLA-A2，-）は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州マナサス）から購入した
。培養はマイコプラズマを含まず、そして完全培地（10％ウシ胎児血清、2 mM
グルタミン、100単位／ml ペニシリン、100μg／ml ストレプトマイシン（Life
Technologies， Inc．、ニューヨーク州グランドアイランド）を補ったDMEM（Li
fe Technologies， Inc．））中で維持した。C1R細胞株は、ヒト血漿白血球細胞
株であり、内因性HLA-AまたはB抗原を発現しない（Storkus， W．J．ら， J． I mmunol． 138（6）：1657-1659， 1987）。C1R-A2細胞は、トランスフェクショ
ンされたHLA-A2．1のゲノムクローンを発現するC1R細胞である（Hogan， K．T．
ら， J． Exp． Med． 168（2）：725-736， 1988）。これらの細胞は、William
E. Biddison博士（National Institute of Neurological Disorders and Strok
e、NIH、メリーランド州ベセスダ）から得た。C1R-A2培養は、マイコプラズマを
含まず、そしてRPMI 1640完全培地（Life Technologies， Inc．）中で維持した
。CAP-1エピトープに対して向けられるCTL株、V8T細胞株は、rV-CEAを用いた第I
相試験に登録した、転移性結腸癌を持つ患者から樹立した（Tsang， K．Y．ら，
Clin． Cancer Res． 3（12）：2439-2449， 1997）。V8T細胞は、10％ヒトAB
血清およびIL-2（National Cancer Institute， Surgery Branchより供給、20単
位／ml）を含むRPMI 1640完全培地中で培養した。V8T細胞は、エフェクター細胞
対APC比1：3で先に再刺激した後、第16日にCAP-1ペプチド（25μg／ml）で再刺
激した。放射線照射（23，000ラド）自己EBV形質転換B細胞をAPCとして用いた。
【０２４７】 末梢血単核細胞由来のDCの培養 末梢血単核細胞（PBMC）は、rV-CEAおよびALVAC-CEAの組み合わせを用いた第I
相試験に登録した、転移性骨盤癌を持つ患者（＃15）由来のヘパリン処理血から
得た。患者材料を含むすべての実験は、NIHガイドラインにしたがって実施し、
そして書面のインフォームドコンセントをすべての個人から得た。以前記載され
るような（Boyum， A． Scand J Clin Lab Invest Suppl． 97：51-76， 1968）
、リンパ球分離培地勾配（Organon Teknika、ノースカロライナ州ダーラム）を
用い、PBMCを分離した。DCは、Sallustoら（Sallusto， F．ら， J． Exp． Med ． 179（4）：1109-1118， 1994）に記載される方法の修飾法を用い、調製した
。PBMC（1．5×108）を、2 mM グルタミン、50μg／ml ストレプトマイシン、10
μg／ml ゲンタマイシン（Life Technologies， Inc．）を含むAIM-V培地に再懸
濁し、そしてT-150フラスコ（Corning Costar Corp．、マサチューセッツ州ケン
ブリッジ）に付着させた。37℃で2時間インキュベーションした後、穏やかにリ
ンスし、非付着細胞を除去した。50 ng／mlの組換えヒトGM-CSF（rhGM-CSF）お
よび0．5 ng／mlの組換えヒトIL-4（rhIL-4）を含むAIM-V培地中で、付着細胞を
6-7日間培養した。培地は、3日ごとに補充した。
【０２４８】 組換えウイルス、並びにCEA、CEA／TRICOMおよびTRICOMを含むアビポックス（ avipox）ウイルスでのDCの感染 CEAの全オープンリーディングフレームをコードする2109 bpのDNA断片は、Kau
fmanら（Kaufman， F．ら， Int． J． Cancer 48（6）：900-907， 1991）に記
載されるように得た。組換えCEAアビポックスウイルス（鶏痘CEA；vCP248）は、
Taylorら（Taylor， J．ら， Virology 187（1）：321-328， 1992）、Coxら（C
ox， W．I．ら， Virology 187（1）：321-328， 1992）およびPerkusら（Perku
s， M．E．ら， J． Virol． 63（9）：3829-3836）に記載される方法を用い、T
herion Corpにより供給された。CEAおよびヒトTricom遺伝子（rF-CEA-Tricomと
称される）および組換えヒト鶏痘-TRICOM（rF-Tricom）をコードする組換えアビ
ポックスウイルスは、本明細書に開示されるように作成した。選択された実験で
、野生型鶏痘（FP-WT）を陰性コントロールとして用いた。DC（1×106）を、1 m
lのOpti-MEM培地（Life Technologies， Inc．）中で、37℃で、rF TRICOM、rF-
CEA、rF-CEA／TRICOM、FP-WTとインキュベーションした。力価測定実験は、感染
多重度（MOI）40：1に等しい2×107プラーク形成単位／mlが、感染DCのおよそ75
％でCEAの発現を恒常的に誘導することが可能であったことを示した。感染DCは
、50 ng／mlのrhGM-CSFおよび0．5 ng／mlのrhIL-4を含む新鮮な温かいRPMI-164
0完全培地10 mlに懸濁し、24時間培養し、そしてその後、続いて、刺激因子とし
て用いた。
【０２４９】 ペプチド 96％以上純粋な、CAP-1（Tsang， K．Y．ら， J． Natl Cancer Inst． 87（1
3）：982-990， 1995）、CEAアミノ酸位571-579 YLSGANLNL、CAP1-6D（Zaremba
， S．ら， Cancer Res． 57（20）：4570-4577， 1997）YLSGADLNLおよびFluペ
プチド、インフルエンザマトリックスタンパク質ペプチド58-66 GILGFVTLは、Mu
ltiple Peptide System（カリフォルニア州サンディエゴ）により作成された。
【０２５０】 T細胞株の生成 Tsangら（Tsang， K．Y．ら， J． Natl Cancer Inst． 87（13）：982-990，
1995）に記載されるプロトコルの修飾法を用い、CEA特異的CTLを生成した。未
感染DCおよびrF-TRICOM、rF-CEA、またはrF-CEA／TRICOMに感染したDCをAPCとし
て用いた。CAP-1ペプチドは、最終濃度25μg／mlで、未感染またはrF-TRICOM感
染DCに添加した。その後、自己非付着細胞を、APC対エフェクター比1：10でAPC
に添加した。その後、5％ CO2を含む加湿大気中で、37℃で3日間、培養をインキ
ュベーションした。その後、ペプチド含有培地を除去した後、培養に、20単位／
mlの濃度で組換えヒトIL-2を7日間補い、IL-2含有培地を3日ごとに補充した。ペ
プチドでの3日間のインキュベーションおよび7日間のIL-2補充は、1つのIVS周期
を構成した。初代培養を第11日にCAP-1ペプチド（25μg／ml）で再刺激し、次の
IVS周期を開始した。放射線照射（23，000ラド）自己EBV形質転換B細胞をAPCと
して用いた。CAP-1ペプチドが刺激にないことを除き、rF-CEAまたはrF-CEA／TRI
COMに感染したDCをAPCとして用いる場合、CTL生成のため、同様の方法を使用し
た。
【０２５１】 ペプチドMHC四量体の構築 ペプチド-MHC複合体は、Altmanら（Altman， J．D．ら， Science 274（5284
）：94-95， 1996）に記載されるように合成した。簡潔には、β2ミクログロブ
リン（β2M）クローンはGarboczi博士（ハーバード大学、マサチューセッツ州ケ
ンブリッジ）（Garboczi， D．N．ら， Proc Natl Acad Sci USA 89（8）：3429
-3433， 1992）から得て、そしてHLA-A2構築物はImmunotech（Beckman-Coulter
、フランス・マルセーユ）から得た。HLA-A2重鎖のCOOH末端へのBirA依存ビオチ
ン化のための15アミノ酸基質ペプチドを含む可溶性HLA-A2分子およびβ2Mは、大
腸菌中で別個に増殖させ、そして封入体として単離した。HLA-A2およびβ2Mを可
溶化し、そしてCAP-1またはFlu-M1 58-66ペプチドの存在下で再生した。複合体
は、Superdex 200（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上のFPLC
により精製した。精製ペプチド-MHC複合体はBirA酵素（Avidity、コロラド州デ
ンバー）を用いてビオチン化した。四量体は、ビオチン化ペプチド-MHC複合体を
フィコエリトリン標識UltraAvidin（Leinco Technologies， Inc．、ミズーリ州
ボールウィン）と、モル比4：1で混合することにより、産生した。
【０２５２】 フローサイトメトリー 染色およびT細胞選別（sorting）： フローサイトメトリー解析およびT細胞選
別には、CAP-1-MHC四量体-PEを用いた。四量体染色には上述のものと類似の方法
を用いた。CAP-1-MHC四量体-PEは、0．33μg／2×105細胞の濃度で用いた。細胞
は、CAP-1 MHC四量体-PEで、4℃で1時間染色し、そしてその後、抗CD8 FITCでさ
らに1時間染色した。細胞を洗浄し、そしてCellQuestソフトウェア（Becton Dic
kinson）を用い、Vantage細胞選別装置（Becton Dickinson）またはFACScan（Be
cton Dickinson）上で解析した。選別細胞を先に記載されるように培養し、そし
て拡大した。UltrAvidin-PEおよびFlu-MHC四量体で染色した細胞を、陰性コント
ロールとして用いた。
【０２５３】 細胞傷害アッセイ 標的細胞を、50μCiの111インジウム標識オキシキノリン（Medi-Physics Inc
．、イリノイ州アーリントン）で、室温で15分間標識した。100μlのRPMI-1640
完全培地中の標的細胞（0．3×104）を、平底アッセイプレート（Corning Costa
r， Corp．）の96ウェルの各々に添加した。エフェクター細胞を添加する前に、
標識標的細胞を5％ CO2中で、37℃で60分間、ペプチドとインキュベーションし
た。癌細胞株を標的として用いる場合、いかなるペプチドも用いなかった。プー
ルしたヒトAB血清10％を補ったRPMI-1640完全培地100μlにエフェクター細胞を
懸濁し、そして標的細胞に添加した。その後、プレートを5％ CO2中で、37℃で4
または16時間インキュベーションした。採取フレーム（Skatron， Inc．、バー
ジニア州スターリング）を用い、ガンマ計測のため、上清を採取した。測定は3
つ組で行い、そして標準偏差を計算した。特異的溶解は、以下の式（すべての値
はcpm）を用い、計算した： ％溶解＝（観察放出-自発放出）／（総放出-自発放出）x 100 自発放出は、100μlのRPMI-1640完全培地を添加したウェルから測定した。総
放出可能放射能は、標的を2．5％ Triton x-100で処理した後、得た。
【０２５４】 HLA型決定 HLA表現型決定は、標準的抗体依存微量細胞傷害アッセイおよび明示された抗H
LA抗血清団を用い、Blood Bank of the National Institute of Healthにより、
行った。V8T細胞株および患者＃15のクラスI表現型は、それぞれ、HLA-A2，-；B
18（W6）、44（12，W4）およびHLA-A2，28；B13（BW4），B51（BW4）；CW6であ
った。
【０２５５】 サイトカイン検出 IL-2不含培地中で、rF-CEA、rF-CEA／TRICOMに感染したDCまたはペプチドパル
ス処理未感染DCおよびrF-TRICOM感染DCに、多様な反応因子：刺激因子比で、24
時間曝露されたT細胞の上清を、ELISAキット（R＆D Systems、ミネソタ州ミネア
ポリス）を用い、IFNγの分泌に関し、スクリーニングした。結果はpg／mlで示
した。
【０２５６】 ELISPOTアッセイ Scheibenbogenら（Scheibenbogen， C．ら， Clin Cancer Res 3（2）：221-2
26，1997）に記載される方法の修飾法を用い、IFNγ産生を測定し、CAP-1特異的
T細胞を決定した。簡潔には、96ウェルMilliliter HAプレート（Millipore Corp
oration、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、10μg／mlの濃度の、ヒトIF
Nγに対する捕捉抗体100μlで被覆した。室温で24時間インキュベーションした
後、10％ヒトプールAB血清を含むRPMI-1640でプレートを30分間ブロッキングし
た。アッセイしようとする1×105細胞を各ウェルに添加した。CAP-1-6Dパルス処
理C1R-A2細胞をAPCとして、エフェクター：APC比1：3で各ウェルに添加した。非
パルス処理C1R-A2細胞を陰性コントロールとして用いた。HLA-A2結合Fluマトリ
ックスペプチド58-66（GILGFVFTL）もまた、コントロールとして用いた。反応細
胞は、Domino Image Analyzer（Otpomax、ニューハンプシャー州ホリス）を使用
し、決定した。
【０２５７】 統計解析 平均間の相違の統計解析は、両側t検定を用いて行った。 考察 未処理T細胞が抗原と出会った際、増殖、サイトカイン分泌、およびエフェク
ター細胞への分化と共に、不活性化、死、および無応答性（アネルギー）を含む
、いくつかの異なる結果の可能性がある。生理学的な条件下での主な結果は、適
切な補助的刺激シグナルが反応するT細胞に搬送されるかどうかにより決定され
る可能性がある（26）。通常、プロフェッショナルAPCの表面上には、少なくと
も3つの異なる分子：B7-1、ICAM-1、およびLFA-3がT細胞活性化に必須のシグナ
ルを提供することが可能であると考えられている。ここで、未処理T細胞活性化
における補助的刺激分子の役割を、B7-1、ICAM-1、LFA-3、または3つすべての分
子の組み合わせを発現するよう操作されたベクターを利用することにより、調べ
た。
【０２５８】 いくつかのグループが、T細胞補助的刺激におけるこれらの分子の2つの協力を
調べている。Dubeyらは、B7-1およびICAM-1両方による補助的刺激が未処理T細胞
活性化に欠くことができないと報告しており（26）、一方、Cavalloらは、抗腫
瘍記憶反応を確立するにはB7-1およびICAM-1が腫瘍細胞により同時発現されてい
なければならないと決定した（27）。さらに、B7-1およびLFA-3による補助的刺
激が、T細胞増殖およびサイトカイン産生両方に際し、付加的に作用することが
示されてきている（6、23、24）。これらの以前の研究は、2つの補助的刺激分子
およびレトロウイルスベクターを用いて行われた。1つの遺伝子を標的細胞株に
形質導入し、薬剤選択し、そしてその後、第二の組換えレトロウイルス構築物を
再び形質導入し、その後、異なる剤で選択した。この方法は、しばしば、何週間
または何ヶ月間を要する。組換えポックスウイルスベクターを利用することによ
り、感染5時間後に3つの補助的刺激分子の同時発現を達成することが可能である
。rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3またはrF-CEA／B7-1／ICAM-1／LFA-3いずれかに感染
したin vitro MC38細胞は、いかなる単一の補助的刺激分子の遺伝子を含むベク
ターに感染したMC38細胞よりも、はるかに高い度合いで、T細胞増殖を亢進する
ことが示された。さらに、補助的刺激分子の組み合わせによりT細胞に搬送され
る第二のシグナルの相対強度は、いかなる単一の補助的刺激分子を発現するMC38
細胞により搬送されるものより、数倍（＞6倍）高いようであった。Dubeyらは、
B7-1およびICAM-1を用い、低い刺激因子対T細胞比で、中程度ないし強い相乗作
用が見られることを示した（26）。我々の研究はこれらの知見を確認する。しか
し、非常に低い刺激細胞対T細胞比または弱いシグナル-1（0．625μg／ml Con A
）では、2遺伝子構築物（rV-B7-1／ICAM-1）は、増殖に対しあるとしてもわずか
な影響しか持たなかった；対照的に、3つ組構築物（rV-B7-1／ICAM-1／LFA-3）
を介した刺激は、増殖に対し、実質的および統計的に有意な影響を有した。多遺
伝子構築物（rV-B7-1、ICAM-1、LFA-3）を介した刺激の主な影響は、CD4+細胞か
らのIL-2同化およびCD8+細胞からのIFNγ同化であり、一方、2型サイトカインは
、あるとしても少量しか産生されなかった。RNアーゼ保護によるサイトカイン発
現解析は、in vitroサイトカインアッセイと適合したプロフィールを提供し、い
かなるものでもよい単一の補助的刺激分子による刺激に比較し、すべての3つの
補助的刺激分子で刺激されたCD4+およびCD8+ T細胞両方において、有意により高
いIL-2およびIFN-γ発現が示された。これらのデータは、低いCD28補助的刺激の
背景で、T細胞は低レベルのIL-1を産生するが、強いCD28補助的刺激は、IL-2、I
FN-γおよびIL-13の産生を支持することを立証した先の研究と一致する（28）。
さらに、T細胞のIFN-γ合成の制御において、IL-13がIL-2と相乗作用することが
報告されてきている（29）。興味深いことに、我々の結果は、MC38／B7-1／ICAM
-1／LFA-3でのCD4+ T細胞の刺激が高レベルのIL-2およびIFN-γ発現を生じ、IL-
13のいくぶん増加した発現を生じるというこの観察を支持する。さらに、MC38／
B7-1／ICAM-1／LFA-3での刺激に際し、CD4+ T細胞において、IL-9発現がさらに
亢進することが注目された。我々の研究で注目された、IL-2の上方制御と関連し
たIL-9の発現増加は、IL-9の最適産生が、IL-2により制御されることを立証した
、以前の研究と一致する（30）。総合すると、これらの結果は、最適未処理T細
胞反応は、以前考えられていたよりも、より高いレベルの補助的刺激を必要とし
、そしてこれは3つの補助的刺激分子を組み合わせた作用により提供することが
可能であることを示唆する。
【０２５９】 おそらく、最も研究されているT細胞補助的刺激分子はB7-1である。本分子がT
細胞活性化を亢進する能力は、レトロウイルスベクター、抗CTLA-4抗体、および
ポックスウイルスベクターを用い、よく確立されている。ここに報告される研究
は、単一の補助的刺激分子によるT細胞活性化の順序を、B7-1＞ICAM-1＞LFA-3と
段階付ける。しかし、3つの補助的刺激分子の使用は、T細胞増殖およびサイトカ
イン産生両方において、B7-1単独または第二の補助的刺激分子と組み合わせたB7
より、はるかに優れていた。
【０２６０】 理論に束縛されるわけではないが、B7-1、ICAM-1およびLFA-3の間の効率的な
協力には、いくつかの可能な機構がある。ICAM-1／LFA-3相互作用は、TCR結合に
より生成されるのと同じ細胞内第二メッセンジャーの増加を維持することにより
、TCRが仲介するT細胞活性化を補助的刺激すると報告される。本観察は、ICAM-1
によるLFA-1の結合が、CD3／TCR複合体を介して搬送されるシグナルを亢進する
ことにより、T細胞を補助的刺激することを示唆する（6）。ICAM-1／LFA-1相互
作用は、T細胞上のIL-2R-アルファ鎖およびCD28の発現を上方制御するのに必要
であり、これはT細胞にIL-2およびB7-1補助的刺激に反応する能力を与えるのに
必要である。一方、B7-1／CD28相互作用は、IL-2および他の免疫制御リンホカイ
ンの発現を転写的におよび転写後的に増加させる、TCR独立補助的刺激シグナル
を搬送する。LFA-3／CD2相互作用は、いくつかの細胞内第二メッセンジャーのチ
ロシンリン酸化、Ca2+動員、およびcAMP産生を誘導し、多様なサイトカイン、特
にIL-2およびIFN-γの同化を生じる（6）。したがって、3つの補助的刺激分子は
、T細胞の抗原依存活性化と共に、オートクリンおよびパラクリン増殖因子の産
生および該増殖因子に対する反応を亢進することにより、協力する可能性がある
ようである。
【０２６１】 結論として、本発明は、初めて、3つまたはそれ以上の補助的刺激分子を細胞
に導入し、そしてCD4+およびCD8+ T細胞集団両方を、これらの補助的刺激分子の
1つまたは2つを用いた場合達成されるものより、はるかに高いレベルに、迅速に
そして効率的に活性化するベクターの能力を立証する。T細胞活性化のこの新た
な閾値はワクチン設計および開発に広い関連を有する。
【０２６２】 DCに対する3つ組の補助的刺激分子の影響は、完全に期待されないものであっ
た。DCは、当業者に最も強力なAPCとして知られる。本発明に示されるデータは
、DCを「Tricom」ベクターに感染させた際、T細胞を活性化するその能力が劇的
に増加することを立証する。これらの研究は、DCが最も強力なAPCではないこと
を初めて立証する。
【０２６３】 参考文献 1. Hellstrom, K. E., Chen, L. & Hellstrom, I. (1996) Cancer Chemother P
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【図面の簡単な説明】
本発明のこれらおよびその他の目的、特徴、および、附随する多くの利点は、
発明の詳細な説明を読むことで、より良く理解されるだろう。
【図１】 ワクシニアゲノムのHind III M領域部分に隣接された（flanked
by）マウスLFA-3、ICAM-1およびB7.1をコードする核酸配列を含むプラスミドpT5
032のゲノム構造。
【図２】 ワクシニアゲノムのHind III J領域部分に隣接されたマウスLFA-
3、ICAM-1、B7.1およびlacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドpT504
7のゲノム構造。
【図３】 ワクシニアゲノムのHind III M領域部分に隣接されたマウスLFA-
3、ICAM-1およびB7.1をコードする核酸配列、および、CEAをコードする核酸配列
を含むプラスミドpT5031のゲノム構造。
【図４】 三つのマウス共刺激分子と共に、腫瘍関連抗原を発現する（図4C
）、または、発現しない（図4AおよびB）、組換えワクシニアウイルスのゲノム
構造。図4Aは、組換えワクシニアvT171のゲノム構造を示す。図4Bは、組換えワ
クシニアvT199のゲノム構造を示す。図4Cは、組換えワクシニアvT172のゲノム構
造を示す。Hind III Mおよび、Hind III Jは、ポックスウイルスゲノムにおける
外来遺伝子挿入部位である。プロモーター30K、I3、sE/L、7.5K、40KおよびClは
ポックスウイルスのプロモーターである。挿入配列中のBam HIおよびHind III制
限部位を、各部位の上の括弧内に記載の、挿入部の5'端（0）から各部位までの
距離（kbp）（縮尺どおりに書かれていない）と共に示す。
【図５】 鶏痘ウイルスゲノムのBamHI J領域部分に隣接されたマウスB7.1
、LFA-3、ICAM-1およびlacZ遺伝子をコードする核酸配列を含む、プラスミドpT8
001のゲノム構造。
【図６】 鶏痘ウイルスゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、腫瘍関連
抗原、CEAおよび、マウスB7.1、LFA-3、および、ICAM-1、コードする核酸配列を
、lacZ遺伝子と組み合わせて含む、プラスミドpT5049のゲノム構造。
【図７】 図7Aから7D。腫瘍関連抗原（TAA）と共に（図7B、7Cおよび7D）
または、なしで（図7A）、三つのマウス共刺激分子を発現する、組換え鶏痘ウイ
ルスのゲノム構造。図7Aは、組換え鶏痘vT222のゲノム構造を示す。図7Bは、組
換え鶏痘vT194のゲノム構造を示す。図7Cは、MUC-1、B7.1、ICAM-1およびLFA-3
を発現する組換え鶏痘のゲノム構造を示す。図7Dは、腫瘍関連抗原、B7.1、ICAM
-1およびLFA-3を発現する組換え鶏痘のゲノム構造を示す。BamHI Jは、鶏痘ウイ
ルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。sE/L、I3、7.5K、Cl、40Kおよび30K
はポックスウイルスプロモーターである。P1-P5は五つの異なるポックスウイル
スプロモーターを示す。挿入配列中のBam HIおよびHind III制限部位を、各部位
の上の括弧内に記載の、挿入部の5'端（0）から各部位までの距離（kbp）（縮尺
どおりに書かれていない）と共に示す。
【図８】 ワクシニアゲノムのHind III J領域部分に隣接された、ヒトLFA-
3、ヒトICAM-1、ヒトB7.1およびlacZ遺伝子をコードする核酸配列を含む、プラ
スミドpT5064のゲノム構造。
【図９】 腫瘍関連抗原と共に（図9B、C）または、なしで（図9A）、lacZ
遺伝子と共に三つのヒト共刺激分子LFA-3、ICAM-1、および、B7.1を発現する組
換えポックスウイルスのゲノム構造。Hind III Jはワクシニアウイルスゲノムに
おける外来遺伝子挿入部位である。BamHI Jは鶏痘ウイルスゲノムにおける挿入
部位である。30K、I3、sE/L、40KおよびClは、ポックスウイルスのプロモーター
である。挿入配列中のBgl IIおよびHind III制限部位を、各部位の上の括弧内に
記載の、挿入部の5'端（0）から各部位までの距離（kbp）（縮尺どおりに書かれ
ていない）と共に示す。
【図１０】 ワクシニアゲノムのHind III J領域部分に隣接された、CEA（6
D）およびヒトLFA-3、ICAM-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸
配列を含むプラスミドpT8016のゲノム構造。
【図１１】 CEA（6D）および、三つのヒト共刺激分子を発現する、組換え
ワクシニアウイルスvT238のゲノム構造。HindIII Jは、ポックスウイルスゲノム
における外来遺伝子挿入部位である。40K、30K、I3、sE/L、およびClは、ポック
スウイルスのプロモーターである。
【図１２】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、マウスLFA-3、IC
AM-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドpT
8019のゲノム構造。
【図１３】 マウスあるいはヒトの共刺激分子を発現する、組換え鶏痘ウイ
ルスのゲノム構造。図13Aは、組換え鶏痘vT251のゲノム構造を示す。図13Bは、
組換え鶏痘vT232のゲノム構造を示す。BamHI Jは、鶏痘ゲノムにおける外来遺伝
子挿入部位である。30K、I3、sE/LおよびClはポックスウイルスのプロモーター
である。
【図１４】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、ヒトLFA-3、ICAM
-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドpT50
72のゲノム構造。
【図１５】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、MUC-1、マウスLF
A-3、ICAM-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラ
スミドpT8020のゲノム構造。
【図１６】 少なくとも一つの腫瘍関連抗原と共に、マウスあるいはヒトの
共刺激分子を発現する組換え鶏痘ウイルスのゲノム構造。図16Aは組換え鶏痘vT2
50のゲノム構造を示す。図16Bは組換え鶏痘vT242のゲノム構造を示す。図16Cは
組換え鶏痘vT236のゲノム構造を示す。図16Dは組換え鶏痘vT257のゲノム構造を
示す。BamHI Jは、ポックスウイルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。40K
、7.5K、30K、I3、sE/L、および、C1はポックスウイルスのプロモーターである
。
【図１７】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、MUC-1、ヒトLFA-
3、ICAM-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラス
ミドpT2186のゲノム構造。
【図１８】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、CEA（6D）、ヒト
LFA-3、ICAM-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプ
ラスミドpT2187のゲノム構造。
【図１９】 鶏痘ゲノムのBamHI J領域部分に隣接された、PSA、PSMA、ヒト
LFA-3、ICAM-1B7.1、およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプ
ラスミドpT5080のゲノム構造。
【図２０】 MVAゲノムの欠損III領域部分に隣接された、マウスLFA-3、ICA
M-1、B7.1およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドpT5
085のゲノム構造。
【図２１】 腫瘍関連抗原と共に、または、なしで、マウスあるいはヒトの
共刺激分子を発現する、組換えMVAウイルスのゲノム構造。図21Aは、組換えMVA
vT264のゲノム構造を示す。図21Bは、組換えMVA vT260のゲノム構造を示す。欠
損IIIは、ポックスウイルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。40K、7.5K、
30K、I3、sE/L、および、C1はポックスウイルスのプロモーターである。
【図２２】 MVAゲノムの欠損III領域部分に隣接された、PSA、PSMA、ヒトL
FA-3、ICAM-1、B7.1、およびE. coli lacZ遺伝子をコードする核酸配列を含むプ
ラスミドpT5084のゲノム構造。
【図２３】 組換えウイルス感染による共刺激分子の表面発現。MC38腫瘍細
胞を示されたウイルスで5 MOI（multiplicity of infection; pfu/細胞）で、5
時間感染させた。感染後、細胞を共刺激分子特異的な、FITCラベルされたモノク
ローナル抗体（MAb）を用いて、免疫染色した。影をつけた領域は特異的Mabの蛍
光強度であり、一方、影のついていない領域は適当なアイソタイプの対照抗体の
蛍光強度である（材料および方法を参照）。
【図２４】 複数の共刺激分子のT細胞増殖への効果。第一のシグナルを与
えるための、様々な濃度のCon A存在下、マウスナイーブT細胞を組換えワクシニ
ア（図24A）または組換え鶏痘（図24B）ベクターのいずれかを感染させたMC38刺
激細胞と共培養した。組換えベクターは、野生型（すなわち、V-WyethまたはWT-
FP［白抜き四角］）、rV-LFA-3（黒三角）、rV-ICAM-1またはrF-ICAM-1（黒丸）
、rV-B7-1またはrF-B7-1（黒菱形）、および、rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3またはrF-C
EA/B7-1/ICAM-1/LFA-3（黒四角）である。未感染のMC38細胞は白抜き丸である。
増殖アッセイは材料および方法に記載の通りである。
【図２５】 組換えワクシニアウイルスにより伝えられる共刺激の特異性。
Con A存在下、T細胞と、白抜き丸で示される、V-Wyeth（図25A）、rV-B7-1（図2
5B）、rV-ICAM-1（図25C）、および、rV-LFA-3（図25D）で感染させたMC38刺激
細胞と共培養した。共刺激分子特異的なMAb存在下で感染させた刺激細胞は黒丸
で示されており、また、アイソタイプの対照抗体は黒三角で示されている。
【図２６】 T細胞増殖のための第二のシグナルを伝えるための、B7-1、ICA
M-1、LFA-3およびこれら共刺激分子三つ全ての共発現の相対的な能力。Con A存
在下（2.5 g/ml）、100,000 T細胞を10,000 MC38細胞と共培養した。一つあるい
は全ての共刺激分子を発現している刺激MC38細胞を、V-Wyeth感染感染細胞と様
々な割合で組み合わせて全量で104 MC38細胞/ウェルとなるように、ウェルに加
えた。MC38細胞をV-Wyeth（白抜き丸）、rV-LFA-3（黒三角）、rV-ICAM-1（黒丸
）、rV-B7-1（黒菱形）、または、rV-B7-1-ICAM-1-LFA-3（黒四角）で感染させ
た。細胞を48時間共培養した。最後の18時間にT細胞増殖を測るため、3H-チミジ
ンを加えた。はめ込んだパネルは、3％のMC38刺激細胞が、示したベクターに感
染している培養から得られる、増殖の値を示す。つまり、この実験において、T
細胞に対する刺激細胞の最終割合は0.003であった。これらの条件下では、rV-B7
/ICAM/LFA-3と比べて、rVB7.1/ICAMの方が比較的効果が弱いことに注意せよ。
【図２７】 特異的T細胞ポピュレーションへの共刺激の効果。マウスCD4+
（図27A）あるいはCD8+ T細胞（図27B）を、様々な濃度のCon A存在下、未感染M
C38細胞（白抜き丸）、あるいは、V-Wyeth（白抜き四角）、rV-LFA-3（黒三角）
、rV-ICAM-1（黒丸）、rV-B7-1（黒菱形）またはrV-B7-1/ICAM-1/LFA-3（黒四角
）を感染させた細胞と、10：1の比で、48時間共培養した。最後の18時間にT細胞
増殖を測るため、3H-チミジンを加えた。図27Cおよび27Dは、低濃度のCon A（0.
625μg/ml）において、ベクターを感染させたMC38刺激細胞存在下、共培養した
場合、精製したCD4+およびCD8+細胞の増殖応答をそれぞれ示す。
【図２８】 サイトカイン産生への共刺激の効果。マウスCD4+（図28Aおよ
び28C）またはCD8+（図28Bおよび28D）T細胞は、材料および方法に記載の通り精
製され、また、示されたMC38ベクター感染刺激細胞と、2.5μg/ml Con A存在下
、共培養した。上清液を、捕捉（capture）ELISAにより、IL-2（図28Aおよび図2
8B）、および、IFN-γ（図28Cおよび図28D）の産生を分析した。
【図２９】 サイトカインRNA発現への共刺激の効果。図29A：マウスCD4+ま
たはCD8+ T細胞をV-Wyeth（レーンA）、rV-B7-1（レーンB）、rV-ICAM-1（レー
ンC）、rV-LFA-3（レーンD）またはrV-B7-1/ICAM-1/LFA-3（レーンE）を感染さ
せたMC38刺激細胞と、T細胞対刺激細胞比、10：1で24時間、2.5pg/ml Con A存在
下、共培養した。培養後、T細胞RNAをマルチプローブRNAseプロテクションアッ
セイにより分析した。図29B（CD4+ 細胞）および、図29C（CD8+ 細胞）において
、オートラジオグラフによる結果の定量的表示は、ハウスキーピング遺伝子L32
の発現により標準化した。ヒストグラムバーの順序（左から右）は、MC38/V-Wye
th、MC38/B7-1、MC38/ICAM-1、MC38/LFA-3、およびMC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3であ
る。
【図３０】 C57BL/6マウス（5/群）にHBSS（黒四角）を投与、あるいは、1
07 pfu rV-CEA（黒三角）またはrV-CEA/TRICOM（黒丸）を接種した。100日後、1
×106のCEA発現MC38癌細胞を接種し、生存をモニターした。CEA/TRICOM群以外の
全てのマウスでは腫瘍が成長しており、また、腫瘍の長さあるいは幅が20mmを超
えた場合、または、マウスが瀕死の場合、屠殺した。図30：二番目の実験では、
C57BL/6マウス（5/群）に107 pfu rV-CEA、rV-CEA/B7.1、rV-CEA/TRICOMまたはH
BSSバッファーを接種した。接種22日後にプールした脾臓T細胞により、リンパ球
増殖応答を解析した。値は、培地に対して、3回の同一条件の平均cpmの刺激イン
デックスを示す。標準偏差は、10％を超えることはなかった。抗原は、Con A（5
μg/ml）、CEA（100μg/ml）およびオボアルブミン（100μg/ml）を使用した。
【図３１】 図31はin vitroにおける樹状細胞の共刺激アッセイの概略図を
示した。
【図３２】 図32Aおよび32Bは、Con A存在下、rV-B7/ICAM-1/LFA-3を感染
させた前駆DC、または、（未感染の、すなわち、CD 34+細胞をGM-CSF +IL-4で6
日間処理した）DCにより刺激された、ナイーブCD4+（図32A）またはナイーブCD8
+（図32B）T細胞の増殖応答を示す。
【図３３】 図33Aおよび33Bは、rV-B7/ICAM-1/LFA-3を感染させた前駆DC、
あるいは、rV-B7/ICAM-1/LFA-3またはV-Wyeth（対照）を感染させたDCにより刺
激された、ナイーブCD4+（図33A）またはナイーブCD8+（図33B）T細胞の増殖応
答を示す。
【図３４】 図34は、Balb/C脾臓細細胞対、25 MOIのV-WyethまたはrV TRIC
OMを感染させ、放射線照射したC57bl/6樹状細胞の、混合リンパ球反応（MLR）を
示す。3H-チミジンは3日目にパルスし、4日目に回収した。DC（白、未感染）、D
C（ドット、V-Wyeth感染）、DC（斜線、rV-TRICOM感染）である。
【図３５】 図35は、rV-TRICOMで感染させペプチドパルスしたDCで刺激後5
日目に回収し、2日間（APCまたはペプチドなしで）10 u/ml IL2中に置いた、様
々なAPC比での応答T細胞（CEAペプチド8特異的なCAP-M8 T細胞株）の増殖応答を
示す。アッセイにおいてペプチド8-（EAQNTTYL）の終濃度は1 ug/mlである。3H-
チミジンは2日目に加え、T細胞は3日目に回収した。0=DC（v-Wyeth）-pepおよび
、△=DC（rV-TRICOM）-pepの結果はベースラインである。
【図３６】 マウス樹状細胞（DC）のポックスウイルス感染の効率。DCに、
25 MOIのrV-TRICOMまたは50 MOIのrF CEA/TRICOMを5時間感染させた。TRICOMベ
クターを感染させたDCは、ナイーブT細胞を刺激する能力の増強を示した。すべ
てのDC集団はT細胞と10：1の割合で、シグナル1を与える異なる濃度のCon A存在
下、48時間共培養した。3H-チミジンを最後の18時間の間、加えた。図36A：未感
染DC（黒四角）、モック感染DC（黒菱形）、または、V-WT（黒逆三角）、rV-B7.
1（白抜き三角）またはrV-TRICOM（白抜き丸）を感染させたDC。図36B：DC（黒
四角）、モック感染DC（黒菱形）、または、WT-FP（黒逆三角）、rF-B7.1（白抜
き三角）またはrF TRICOM（白抜き丸）を感染させたDC。
【図３７】 ワクシニア（図37A、C、E）または鶏痘（図37B、D、F）ベクタ
ーを感染させたDCによる、同種刺激活性の増強。未感染DC（黒四角）；モック感
染DC（黒菱形）；または、野生型鶏痘ベクター（V-WTあるいはF-WT、黒逆三角）
、rV-B7.2またはrF-B7.1（白抜き三角）、またはrV-TRICOMあるいはrF-TRICOM（
白抜き丸）を感染させたDCを同種（図37A-D）あるいは同系T細胞（図37E-F）と
、5日間共培養した。3H-チミジンは最後の18時間に加えた。
【図３８】 ペプチド特異的T細胞増殖におけるDCのワクシニア感染の効果
。未感染DC（黒四角）、または、V-WT（黒逆三角）、rV-B7.1（白抜き三角）ま
たはrV-TRICOM（白抜き丸）感染DCをOVAペプチド特異的T細胞（図38A、C、E）ま
たはCAP-M8ペプチド特異的T細胞（図38B、D、F）と共培養した。実験条件は、様
々な濃度の適するペプチド（図38A-D）、負の対照ペプチド（白抜き四角）、VSV
N（図38A）、またはFLU-NP（図38B）のどちらかの存在下、固定化した10：1のエ
フェクター：刺激細胞比、あるいは、様々なエフェクター：刺激細胞比での存在
下、1μMに固定化したペプチド濃度（図38EおよびF）を含んだ。
【図３９】 TNF-αまたはCD40で成熟化させたDCへのrV-TRICOM感染の効果
。DC（黒四角）、または、培養の最後の24時間、100 ng/mlのTNF-α（白抜き三
角）、または5μg/mlのCD40 mAb（白抜き丸）のどちらかと共に培養したDCを用
いて、CAP-M8特異的エフェクターT細胞を刺激した（図39A）。25 MOI rV-TRICOM
を感染させた後の、これらDC集団に対するCAP-M8 T細胞の増殖（図39B）。すべ
てのパネルについて、T細胞：DC比は10：1であり、一方、CAP-M8ペプチド濃度は
1μg/mlであった。黒丸は1μg/mlのVSVNペプチド存在下、全てのDC集団に刺激さ
れた、CAP-M8 T細胞の増殖を示す。
【図４０】 CTL活性の誘導に対するDCへのワクシニア感染による効果。DC
（図40B）、または、V-WT（図40C）、あるいはrV-TRICOM（図40D）を感染させた
DCを10μM OVAペプチドで2時間パルスした。DC集団をマウスに静脈内投与した（
1×105細胞/マウス）。対照マウスにはRibi/Detoxアジュバントを用いて100μg
のOVAペプチドを皮下に免疫した（図40A）。14日後、脾臓を回収し、相当するペ
プチドで6日間再刺激し、そして、OVA（黒四角）またはVSVNペプチド（白抜き四
角）のどちらかでパルスしたEL-4細胞に対する溶菌能を調べた。書き入れた数は
、溶菌単位で表現したCTL活性を示す。CTL活性の誘導に対するDCへのワクシニア
感染による効果もまた示す。DC（図40F）、または、V-WT（図40G）、またはrV-T
RICOM（図40H）を感染させたDCを10μM CAP-M8ペプチドで、2時間パルスした。D
C集団をマウスに静脈内投与した（1×105細胞/マウス）。対照マウスにはRibi/D
etoxアジュバントを用いて100μgのCAP-M8ペプチドを皮下に免疫した（図40E）
。14日後、脾臓を回収し、相当するペプチドで6日間再刺激し、そして、CAP-M8
（黒四角）またはFLU-NPペプチド（白抜き四角）のどちらかでパルスしたEL-4細
胞に対する溶菌能を調べた。書き入れた数は、溶菌単位で表現したCTL活性を示
す。
【図４１】 CTL活性の誘導に対するワクシニアを感染させたDCの多重免疫
の効果。DC（黒四角）、またはV-WT（黒逆三角）またはrV-TRICOM（白抜き丸）
を感染させたDCを10μMのCAP-M8ペプチドで2時間パルスした。DC集団を7日間隔
で1、2、または、3回、マウスに静脈内投与した（1×105細胞/マウス）。対照マ
ウスにはRibi/Detoxアジュバントを用いて100μgのCAP-M8ペプチドを皮下に免疫
した（十字）。最後の免疫から14日後に脾臓を回収し、CAP-M8ペプチドで6日間
再刺激し、そして、CAP-M8または対照ペプチドVSVN（示していない）でパルスし
たEL-4細胞に対する溶菌能を調べた。
【図４２】 ワクシニアおよび鶏痘TRICOM感染脾細胞T細胞増殖への効果。
マウスナイーブT細胞を組換えワクシニアまたは鶏痘ベクターのどちらかを感染
させた自己の脾細胞と共培養した。シグナル1であるCon Aの様々な濃度において
共培養を行った。組換えベクターは、野生型（すなわち、V-WT、FP-WT、白抜き
菱形）、rV-B7-1またはrF-B7-1（白抜き丸）、あるいはrV-TRICOMまたはrF-TRIC
OM（黒四角）であった。未感染脾細胞は白抜き三角で示される。
【図４３】 TRICOMベクター感染脾細胞の同種T細胞への効果。ナイーブBal
b/C T細胞を、組換えワクシニア（図43AおよびC）または鶏痘（図43BおよびD）
ベクターを2日間（図43AおよびB）または5日間（図43CおよびD）感染させたC57B
1/6脾細胞と共培養した。組換えベクターは、V-WTまたはFP-WT（白抜き菱形）、
rV-B7-1またはrF-B7-1（白抜き丸）、あるいはrV-TRICOMまたはrF-TRICOM（黒四
角）であった。未感染脾細胞は白抜き三角で示される。DCにより誘導される増殖
は黒四角で示される。
【図４４】 rV-TRICOM感染脾細胞の特異的T細胞集団への効果。マウスナイ
ーブT細胞をCD3+、CD4+、および、CD8+亜集団に分画した。T細胞を、未感染自己
BMDC、または、組換えワクシニアベクターを感染させた脾細胞のどちらかと共培
養した。様々なCon A濃度（図44A-C）、または、様々な刺激細胞の数（図44D-F
）により第一のシグナルが与えられた。成熟BMDCに応答するT細胞増殖は、白抜
き四角で示され、また、未感染脾細胞は白抜き三角で示される。組換えベクター
は、野生型（V-WT、白抜き菱形）またはrV-TRICOM（黒四角）であった。
【図４５】 rV-TRICOM感染骨髄細胞の特異的T細胞への効果。マウスナイー
ブT細胞をCD3+、CD4+、および、CD8+亜集団に分画した。T細胞を、未感染自己BM
DC、または、組換えワクシニアベクターを感染させた脾細胞のどちらかと共培養
した。様々なCon A濃度（図45A-C）、または、様々な刺激細胞の数（図45D-F）
により第一のシグナルが与えられた。成熟BMDCに応答するT細胞増殖は、白抜き
四角により示され、また、未感染脾細胞は白抜き三角で示される。組換えベクタ
ーは、野生型（V-WT、白抜き菱形）またはrV-TRICOM（黒四角）であった。
【図４６】 rV-TRICOM感染脾細胞または骨髄（BM）細胞の、ペプチド特異
的メモリーCD8+ T細胞への効果。CAP-M8-特異的T細胞を自己の脾細胞（図46Aお
よびB）、または組換えワクシニアベクターを感染させた骨髄細胞（図46Cおよび
D）と共培養した。二組の条件を使用して分析を実行した：a）応答細胞：刺激細
胞の比を10：1に固定化し、いくつかの濃度のCAP-M8ペプチド存在下で培養（図4
6Aおよび46C）、または、b）固定化したペプチド濃度（1 uM）で、様々な応答細
胞：刺激細胞の比で培養した（図46Bおよび46D）。組換えベクターは、野生型（
白抜き菱形）、および、rV-TRICOM（黒四角）であった。未感染脾細胞は白抜き
三角で示される。BMは白抜き四角で示される。
【図４７】 CEAペプチド、CAP-1またはCAP1、6DでパルスしたrF-TRICOM感
染ヒト樹状細胞を使用したときの、末梢血骨髄細胞（PBMC）から単離したヒトT
細胞によるIFN-γの産生を示す。
【図４８】 PSAペプチド、PSA-3でパルスしたrF-TRICOM感染ヒト樹状細胞
を使用したときの、ヒトT細胞によるIFN-γの産生を示す。
【図４９】 Fluペプチド58-66でパルスしたrF-TRICOM、または、rF-B7.1感
染ヒト樹状細胞を使用したときの、PBMCから単離したヒトT細胞によるIFN-γの
産生を示す。
【図５０】 様々なエフェクター：APC比で、Fluペプチド58-66でパルスし
たrF-TRICOM感染、または、rF-B7.1感染ヒト樹状細胞を使用したときの、PBMCか
ら単離したヒトT細胞によるIFN-γの産生を示す。
【図５１】 1、または、2回のin vitro刺激（IVS）後、HPVペプチド（11-2
0）でパルスしたrF-TRICOM感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ドナー868から
のヒトT細胞によるIFN-γの産生を示す。
【図５２】 HPVペプチド（11-20）でパルスしたrF-TRICOM、または、rF-B7
.1感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトT細胞株によるIFN-γの産生を示す
。
【図５３】 様々な濃度のHPVペプチド（11-20）でパルスしたrF-TRICOM、
または、rF-B7.1感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトT細胞株によるIFN-γ
の産生を示す。
【図５４】 様々なエフェクター：APC比で、HPV E7ペプチド11-20でパルス
したrF-TRICOM、または、rF-B7.1感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトT細
胞によるIFN-γの産生を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/125 ４Ｃ０８７ 39/12 39/21 39/125 39/235 39/21 39/245 39/235 39/275 39/245 39/29 39/275 48/00 39/29 Ａ６１Ｐ 1/04 48/00 31/04 Ａ６１Ｐ 1/04 31/10 31/04 31/12 31/10 35/00 31/12 37/02 35/00 37/06 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 37/06 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 7/00 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＣＣ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュロム，ジェフリー アメリカ合衆国メリーランド州20854，ポ トマック，ソレル・アベニュー 10301 (72)発明者 ホッジ，ジェームズ アメリカ合衆国メリーランド州20879，ゲ イザーズバーグ，モントゴメリー・ビレッ ジ・アベニュー 19030 (72)発明者 パニカリ，デニス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01720， アクトン，ノンセット・パース 114 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA31 BA32 BA33 BA34 BA36 BA41 CA04 CA09 DA02 EA02 EA04 FA02 FA18 GA11 HA17 4B063 QA20 QQ03 QQ79 QR77 QS33 QX10 4B065 AA91X AA92X AA95X AA96X AA97X CA24 CA44 CA45 4C084 AA13 BA03 CA53 DA01 MA52 MA59 MA60 MA65 MA66 NA14 ZA682 ZB072 ZB132 ZB262 ZB332 ZB352 ZB382 4C085 AA03 BA51 BA52 BA55 BA65 BA69 BA77 BA78 BA85 BB01 BB17 CC07 CC08 CC26 DD23 DD31 GG01 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 GG10 4C087 AA01 AA02 AA04 BB65 BC01 BC30 BC83 CA12 MA52 MA59 MA60 MA65 MA66 NA14 ZA68 ZB07 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35 ZB38

Claims (106)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数の共刺激分子またはその機能性部分をコードする外来核酸
    配列を含む組換えベクター。
  2. 【請求項２】 核酸配列が少なくとも3つの共刺激分子をコードする、請求項1
    に記載の組換えベクター。
  3. 【請求項３】 それぞれの共刺激分子をコードする核酸配列が哺乳動物源に由
    来する、請求項1に記載の組換えベクター。
  4. 【請求項４】 複数の共刺激分子が、B7-1、B7-2、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、C
    D59、CD40、CD70、OX-40L、VCAM-1、およびその哺乳動物相同体よりなる群から
    選択される、請求項1に記載の組換えベクター。
  5. 【請求項５】 複数の共刺激分子が、B7-1、ICAM-1およびLFA-3である、請求
    項5に記載の組換えベクター。
  6. 【請求項６】 さらに、少なくとも1つのサイトカイン、ケモカイン、Flt-3L
    、またはその組合わせをコードする外来核酸配列を含む、請求項1に記載の組換
    えベクター。
  7. 【請求項７】 さらに複数のプロモーターを含む、請求項1に記載の組換えベ
    クター。
  8. 【請求項８】 プロモーターが真核細胞源、原核細胞源、またはウイルス源に
    由来する、請求項7に記載の組換えベクター。
  9. 【請求項９】 プロモーターが、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、
    アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトCMV極初期Iプロモーター、ポックス
    ウイルスプロモーター、30Kプロモーター、I3プロモーター、sE／Lプロモーター
    、7.5Kプロモーター、40Kプロモーター、およびC1プロモーターよりなる群から
    選択される、請求項7に記載の組換えベクター。
  10. 【請求項１０】 組換えベクターが、細菌、ウイルス、および核酸ベースのベ
    クターよりなる群から選択される、請求項1に記載の組換えベクター。
  11. 【請求項１１】 組換えベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘ
    ルペスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、およ
    びイリドウイルスよりなる群から選択される、請求項1に記載の組換えベクター
    。
  12. 【請求項１２】 組換えベクターが組換えポックスウイルスである、請求項11
    に記載の組換えベクター。
  13. 【請求項１３】 組換えポックスウイルスが複製性ウイルスまたは非複製性ウ
    イルスである、請求項12に記載の組換えベクター。
  14. 【請求項１４】 組換えポックスウイルスがオルトポックス、アビポックス、
    カプリポックスまたはスイポックスである、請求項12に記載の組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 アビポックスが、ニワトリポックス、カナリアポックス、ま
    たはその誘導体である、請求項14に記載の組換えベクター。
  16. 【請求項１６】 オルトポックスが、ワクシニア、ワクシニア-コペンハーゲ
    ン株、ワクシニア-Wyeth株、NYVAC、ワクシニア-MVA株、アライグマポックスま
    たはウサギポックスである、請求項14に記載の組換えベクター。
  17. 【請求項１７】 さらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エ
    ピトープをコードする外来核酸配列を含む、請求項1に記載の組換えベクター。
  18. 【請求項１８】 ターゲット抗原が、配列番号：2〜配列番号：40よりなる群
    から選択されるアミノ酸配列をもつ、請求項17に記載の組換えベクター。
  19. 【請求項１９】 ターゲット抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、組織特
    異性抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原虫抗原、および寄
    生虫抗原ならびにマイトジェンよりなる群から選択される、請求項17に記載の組
    換えベクター。
  20. 【請求項２０】 細菌抗原が、Chlamydia、Mycobacteria、Legionella、Menin
    giococcus、A群Streptococcus、Hemophilus influenzae、SalmonellaおよびList
    eriaよりなる群から選択される細菌に由来する、請求項18に記載の組換えベクタ
    ー。
  21. 【請求項２１】 ウイルス抗原が、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎
    ウイルス、オルトミクソウイルスおよびパピローマウイルスよりなる群から選択
    されるウイルスに由来する、請求項18に記載の組換えベクター。
  22. 【請求項２２】 レンチウイルスがHIV-1またはHIV-2である、請求項21に記載
    の組換えベクター。
  23. 【請求項２３】 ヘルペスウイルスがHSVまたはCMVである、請求項21に記載の
    組換えベクター。
  24. 【請求項２４】 肝炎ウイルスがA型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎または
    E型肝炎である、請求項21に記載の組換えベクター。
  25. 【請求項２５】 オルトミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請
    求項21に記載の組換えベクター。
  26. 【請求項２６】 腫瘍関連抗原、腫瘍特異性抗原または組織特異性抗原が、CE
    A、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、MUC-1、MUC-2、点変異ラット癌遺伝子、
    正常または点変異p53、過剰発現p53、CA-125、PSA、C-erb／B2、BRCA I、BRCA I
    I、PSMA、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、TAG72、KSA、HER-2／neu、b
    cr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、修飾TAA類、TAA類のスプライス変異体、その機
    能性エピトープおよびエピトープアゴニストよりなる群から選択される、請求項
    18に記載の組換えベクター。
  27. 【請求項２７】 抗原が、アミノ酸位置576にアミノ酸アスパラギン酸をもつC
    EA（6D）である、請求項26に記載の組換えベクター。
  28. 【請求項２８】 抗原がPSAおよびPSMAである、請求項26に記載の組換えベク
    ター。
  29. 【請求項２９】 抗原が、シグナル配列、10コピーの縦列反復配列、および3'
    側コード配列を含むトランケートMUC-1遺伝子によりコードされるMUC-1である、
    請求項26に記載の組換えベクター。
  30. 【請求項３０】 酵母抗原または真菌抗原が、Aspergillus、Nocardia、Histo
    plasmosis、Candida、およびCryptosporidiaよりなる群から選択される酵母また
    は真菌に由来する、請求項18に記載の組換えベクター。
  31. 【請求項３１】 寄生虫抗原が、Plasmodium属種、Toxoplasma gondii、Pneum
    ocystis carinii、Trypasosoma属種、またはLeishmania属種に由来する、請求項
    18に記載の組換えベクター。
  32. 【請求項３２】 ベクターがさらに選択性マーカーを含む、請求項1に記載の
    組換えベクター。
  33. 【請求項３３】 選択性マーカーが、lacZ遺伝子、チミジンキナーゼ、gpt、G
    USおよびワクシニアK1L宿主域遺伝子よりなる群から選択される、請求項32に記
    載の組換えベクター。
  34. 【請求項３４】 請求項1〜33のいずれか1項に記載の少なくとも1つの組換え
    ベクターおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項1〜16のいずれか1項に記載の少なくとも1つの組換え
    ベクター、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコード
    する少なくとも1つの核酸配列を含む第2組換えベクター、および医薬的に許容で
    きるキャリヤーを含む、医薬組成物。
  36. 【請求項３６】 さらに、サイトカイン、ケモカインまたはFlt-3Lを含む、請
    求項34または35に記載の医薬組成物。
  37. 【請求項３７】 請求項1〜33のいずれか1項に記載の組換えベクターで感染、
    トランスフェクションまたは誘発した宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 請求項1〜16のいずれか1項に記載の少なくとも1つの組換え
    ベクターで感染、トランスフェクションまたは誘発し、かつ少なくとも1つのタ
    ーゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする少なくとも1つの外来核酸
    配列を含む第2組換えベクターで感染、トランスフェクションまたは誘発した宿
    主細胞。
  39. 【請求項３９】 宿主細胞が抗原提示細胞またはその前駆体、悪性前細胞、過
    形成細胞または腫瘍細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 抗原提示細胞が樹状細胞またはその前駆体、単球、マクロフ
    ァージ、B細胞、線維芽細胞または筋細胞である、請求項39に記載の宿主細胞。
  41. 【請求項４１】 抗原提示細胞が骨髄、脾臓、皮膚、末梢血、腫瘍、リンパ節
    または筋肉に由来する、請求項39に記載の宿主細胞
  42. 【請求項４２】 宿主細胞が抗原提示細胞もしくはその前駆体、悪性前細胞、
    過形成細胞または腫瘍細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
  43. 【請求項４３】 抗原提示細胞が樹状細胞、その前駆体もしくは誘導体、単球
    、マクロファージ、B細胞、線維芽細胞または筋細胞である、請求項42に記載の
    宿主細胞。
  44. 【請求項４４】 誘導体がTNFα処理樹状細胞、CD40処理樹状細胞、または付
    着細胞サブポピュレーションである、請求項43に記載の宿主細胞。
  45. 【請求項４５】 複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む樹状細胞
    またはその前駆体。
  46. 【請求項４６】 複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む腫瘍細胞
    またはその前駆体。
  47. 【請求項４７】 細胞が少なくとも3つの共刺激分子をコードする外来核酸配
    列を含む、請求項45または46に記載の細胞。
  48. 【請求項４８】 複数の共刺激分子が、B7-1、B7-2、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL
    、CD59、CD40、CD70、OX-40L、VCAM-1、その哺乳動物相同体、およびその組合わ
    せよりなる群から選択される、請求項45または46に記載の細胞。
  49. 【請求項４９】 複数の共刺激分子が、少なくともB7-1、ICAM-1およびLFA-3
    である、請求項45または46に記載の細胞。
  50. 【請求項５０】 さらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エ
    ピトープをコードする外来核酸配列を含む、請求項45または46に記載の細胞。
  51. 【請求項５１】 少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープ
    をコードする外来核酸配列が、組換えベクター、腫瘍細胞溶解物由来のRNAもし
    くはDNAにより、またはその配列を含む腫瘍細胞との融合により供給される、請
    求項50に記載の細胞。
  52. 【請求項５２】 ターゲット抗原またはその免疫エピトープが、腫瘍特異性抗
    原、腫瘍関連抗原、組織特異性抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌
    抗原、原虫抗原、寄生虫抗原およびマイトジェンよりなる群から選択される、請
    求項50に記載の細胞。
  53. 【請求項５３】 請求項45〜52のいずれか1項に記載の細胞、および所望によ
    りターゲット抗原またはその免疫エピトープの外因性供給源を含む、医薬組成物
    。
  54. 【請求項５４】 複数の共刺激分子をコードする外来DNAがウイルスゲノムに
    組み込まれた組換えポックスウイルスであって、複数の共刺激分子をコードする
    外来DNAを含むプラスミドベクターを親ポックスウイルスゲノムと組み換えて、
    外来DNAがそのゲノムに挿入された組換えポックスウイルスを作成することを含
    む方法で作成された組換えポックスウイルス。
  55. 【請求項５５】 LFA-3、ICAM-1および少なくとも1つのB7分子をコードする外
    来DNAがウイルスゲノムに組み込まれた組換えポックスウイルスであって、LFA-3
    、ICAM-1および少なくとも1つのB7分子をコードする外来DNAを含むプラスミドベ
    クターを親ポックスウイルスゲノムと組み換えて、外来DNAがそのゲノムに挿入
    された組換えポックスウイルスを作成することを含む方法で作成された組換えポ
    ックスウイルス。
  56. 【請求項５６】 ゲノムがさらに、外来DNAの発現を制御しうる複数のポック
    スウイルスプロモーターを含む、請求項54または55に記載の組換えポックスウイ
    ルス。
  57. 【請求項５７】 さらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エ
    ピトープをコードする外来遺伝子を含む、請求項54または55に記載の組換えポッ
    クスウイルス。
  58. 【請求項５８】 請求項54〜57のいずれか1項に記載の組換えポックスウイル
    スおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物。
  59. 【請求項５９】 請求項54〜57のいずれか1項に記載の組換えポックスウイル
    スを含み、さらに少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エピトープを
    コードする少なくとも1つの外来核酸配列を含む第2組換えポックスウイルスを含
    む、医薬組成物。
  60. 【請求項６０】 請求項54〜57のいずれか1項に記載の組換えポックスウイル
    スを感染させた宿主細胞。
  61. 【請求項６１】 細胞が抗原提示細胞前駆体、抗原提示細胞または工学的に処
    理した抗原提示細胞である、請求項60に記載の宿主細胞。
  62. 【請求項６２】 細胞が樹状細胞前駆体、樹状細胞、単球、マクロファージ、
    B細胞、線維芽細胞または筋細胞である、請求項61に記載の宿主細胞。
  63. 【請求項６３】 細胞が過形成細胞、悪性前細胞または腫瘍細胞である、請求
    項60に記載の宿主細胞。
  64. 【請求項６４】 複数の共刺激分子またはその機能性部分をコードする核酸配
    列を含むプラスミドベクター。
  65. 【請求項６５】 さらに、選択性マーカーをコードする遺伝子を含む、請求項
    64に記載のプラスミドベクター。
  66. 【請求項６６】 共刺激分子がヒト由来、非ヒト霊長類由来またはネズミ由来
    である、請求項64に記載のプラスミドベクター。
  67. 【請求項６７】 さらに、少なくとも1つのターゲット抗原またはその免疫エ
    ピトープをコードする外来核酸配列を含む、請求項64に記載のプラスミドベクタ
    ー。
  68. 【請求項６８】 ターゲット抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、組織特
    異性抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原虫抗原、寄生虫抗
    原およびマイトジェンよりなる群から選択される、請求項67に記載のプラスミド
    ベクター。
  69. 【請求項６９】 ターゲット抗原が、癌胎児性抗原（CEA）またはその免疫エ
    ピトープである、請求項68に記載のプラスミドベクター。
  70. 【請求項７０】 LFA-3、ICAM-1および少なくとも1つのB7分子の3つの共刺激
    分子をコードする外来核酸配列を発現しうる組換えポックスウイルスを作成する
    ために設計された、ポックスウイルスとの組み換えのためのプラスミドベクター
    であって、（a）複数のポックスウイルスプロモーター、（b）LFA-3、ICAM-1お
    よび少なくとも1つのB7分子をコードする外来核酸配列、（c）要素（a）および
    （b）の構築体をフランキングするDNA配列を含み、5'末端および3'末端の両方の
    フランキング配列が、要素（a）および（b）を挿入する領域の親ポックスウイル
    スゲノムに相同である、プラスミドベクター。
  71. 【請求項７１】 pT5064と表示される、ATCCに寄託No. 203482で寄託された、
    請求項64に記載のプラスミドベクター。
  72. 【請求項７２】 pT5049と表示される、ATCCに寄託No. 203481で寄託された、
    請求項67に記載のプラスミドベクター。
  73. 【請求項７３】 請求項64〜72のいずれか1項に記載のプラスミドベクターお
    よび所望により親ポックスウイルスを含む、組換えポックスウイルス作成用キッ
    ト。
  74. 【請求項７４】 組換えポックスウイルスの作成方法であって、請求項64〜72
    のいずれか1項に記載のプラスミドベクターを親ポックスウイルスゲノムと組み
    換えて、外来DNAおよび外来DNA発現を制御しうる複数のポックスウイルスプロモ
    ーターがそのゲノムに挿入された組換えポックスウイルスを作成することを含む
    方法。
  75. 【請求項７５】 免疫応答を増強するのに有効な量の請求項1〜33のいずれか1
    項に記載の組換えベクターを投与することを含む、個体において免疫応答を増強
    する方法。
  76. 【請求項７６】 投与経路が静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内
    、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、膀胱点滴注入、または乱刺法による、請
    求項75に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 増強する免疫応答が細胞仲介性または体液性応答である、請
    求項75に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 増強が、CD4+T細胞増殖、CD8+T細胞増殖またはその組合わせ
    の増強である、請求項75に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 増強が、CD4+T細胞機能、CD8+T細胞機能またはその組合わせ
    の増強である、請求項75に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 増強がIL-2産生、IFN-γ産生またはその組合わせにおける増
    強である、請求項75に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 増強が抗原提示細胞の増殖、機能またはその組合わせの増強
    である、請求項75に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 個体においてターゲット抗原またはその免疫エピトープに対
    する抗原特異性T細胞応答を増強する方法であって、少なくとも1つのB7分子をコ
    ードする外来核酸配列、ICAM-1をコードする外来核酸配列、およびLFA-3をコー
    ドする外来核酸配列、ならびに所望により、ターゲット抗原またはその免疫エピ
    トープをコードする外来核酸配列を含む組換えポックスウイルスを投与すること
    を含み、それぞれの核酸配列は個体の感染細胞において少なくともT細胞応答を
    増強するのに有効な量で発現し、その際、この増強が単一の共刺激分子または2
    つの共刺激分子を用いて得られる増強より大きい方法。
  83. 【請求項８３】 増強が、CD4+T細胞増殖、CD8+T細胞増殖またはその組合わせ
    の増強である、請求項82に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 増強が、IL-2産生、IFN-γ産生またはその組合わせにおける
    増強である、請求項82に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 増強が抗原特異性細胞毒性の増強である、請求項82に記載の
    方法。
  86. 【請求項８６】 感染細胞が抗原提示細胞である、請求項82に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 細胞が樹状細胞、その前駆体、単球、マクロファージ、B細
    胞、線維芽細胞または筋細胞である、請求項86に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 感染細胞が腫瘍細胞またはその前駆体である、請求項82に記
    載の方法。
  89. 【請求項８９】 個体において疾病を治療または予防する方法であって、 （a）単独の、またはターゲット抗原もしくはその免疫エピトープと組み合わ
    せた請求項37に記載の細胞にTリンパ球をin vitroで曝露することにより、Tリン
    パ球を活性化し； （b）活性化したリンパ球を単独で、またはターゲット抗原と組み合わせて、
    免疫応答を増強するのに十分な量で個体に投与する ことを含む方法。
  90. 【請求項９０】 Tリンパ球が個体とオートロガスである、請求項89に記載の
    方法。
  91. 【請求項９１】 さらに、サイトカイン、ケモカイン、flt-3lまたはその組合
    わせの投与を含む、請求項89に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 免疫応答が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、組織特異性抗
    原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原虫抗原および寄生虫抗原
    よりなる群から選択されるターゲット抗原に対するものである、請求項89に記載
    の方法。
  93. 【請求項９３】 免疫応答が、ウイルス、細菌、原虫、寄生虫、悪性前細胞お
    よび腫瘍細胞よりなる群から選択される細胞または生物により引き起こされる疾
    病を予防または治療する、請求項89に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 免疫応答を増強するのに有効な量の請求項45〜52のいずれか
    1項に記載の細胞を投与することを含む、個体において免疫応答を増強する方法
    。
  95. 【請求項９５】 免疫応答を増強するのに有効な量の請求項46に記載の腫瘍細
    胞またはその前駆体を投与することを含む、個体において免疫応答を増強する方
    法。
  96. 【請求項９６】 細胞が個体とオートロガス、同系または同種異系である、請
    求項94または95に記載の方法。
  97. 【請求項９７】 細胞がターゲット抗原またはそのエピトープでパルス処理さ
    れている、請求項94または95に記載の方法。
  98. 【請求項９８】 さらに、ターゲット細胞、ターゲット抗原、またはそのエピ
    トープを投与することを含む、請求項94または95に記載の方法。
  99. 【請求項９９】 さらに、活性化したターゲット抗原特異性リンパ球を投与す
    ることを含む、請求項94に記載の方法。
  100. 【請求項１００】 複数の共刺激分子を過剰発現する樹状細胞前駆体または樹
    状細胞を作成する方法であって、 （a）複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む組換えベクターを、細
    胞が複数の共刺激分子を過剰発現するのに十分な期間、細胞に供給する ことを含む方法。
  101. 【請求項１０１】 細胞が骨髄から単離されたものまたは末梢血単核細胞であ
    る、請求項100に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 組換えベクターがさらに、少なくとも1つのターゲット抗
    原またはその免疫エピトープをコードする外来遺伝子を含む、請求項100に記載
    の方法。
  103. 【請求項１０３】 さらに、（b）少なくとも1つのターゲット抗原またはその
    免疫エピトープをコードする外来遺伝子を含む第2組換えベクターを細胞に供給
    することを含む、請求項100に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 ターゲット抗原に対するワクチンの有効性を評価するin
    vitro方法であって、 （a）予めターゲット抗原またはその免疫エピトープを接種した個体からリン
    パ球を採取し、 （b）請求項39に記載の抗原提示細胞の存在下でターゲット抗原特異性リンパ
    球の数および機能を測定し、その際、ターゲット抗原特異性リンパ球の数、機能
    またはその組合わせの増大はそのワクチンの有効性を示すものである ことを含む方法。
  105. 【請求項１０５】 多数のペプチドから新規な免疫原ペプチドをスクリーニン
    グするための方法であって、 （a）複数の共刺激分子をコードする組換えベクターを感染させた抗原提示細
    胞を多数のペプチドでパルス処理して、ペプチドパルスした抗原提示細胞を形成
    し； （b）ペプチドパルスした抗原提示細胞の存在下でリンパ球の免疫反応性を測
    定し、その際、免疫反応性の増大はペプチドパルスした抗原提示細胞上に免疫原
    ペプチドがあることを示すものである ことを含む方法。
  106. 【請求項１０６】 多数のペプチドの供給源がコンビナトリアルペプチドライ
    ブラリーである、請求項105に記載の方法。
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