DE69936061T2

DE69936061T2 - Recombinanter vector, welcher mehrere kostimulatorische moleküle exprimiert und dessen verwenden

Info

Publication number: DE69936061T2
Application number: DE69936061T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Potomac SCHLOM; James Gaithersburg HODGE; Dennis Acton PANICALI
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Therion Biologics Corp
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Therion Biologics Corp
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2019-11-13
Also published as: WO2000034494A1; EP1137792B1; CA2678259A1; EP1137792B9; JP4409097B2; AU774076B2; CA2354024A1; JP5254153B2; PT1137792E; EP1137792A1; CA2354024C; DK1137792T3; CA2678259C; AU774076C; DE69936061D1; JP2009254390A; JP2002531133A; ATE361988T1; AU1621800A; ES2286902T3

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten Vektor, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, und optional ein Fremdgen, das ein Zielantigen codiert, enthält. Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein rekombinantes Virus, das Fremdgene, die wenigstens drei kostimulatorische Moleküle codieren, und optional ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene, die wenigstens die folgenden kostimulatorischen Moleküle codieren: ein Molekül aus der B7-Familie, LFA-3 und ICAM-I, und optional ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst, und Verwendungen davon als Immunogene und Impfstoffe. Ferner bezieht sich die Erfindung auf antigenpräsentierende Zellen, die durch einen rekombinanten Vektor transfiziert, infiziert oder transduziert worden sind, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, und optional ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst.
Stand der Technik
Der Umfang der primären Reaktion von T-Zellen, die ihre Aktivierung, Expansion und Differenzierung umfasst, ist von höchster Wichtigkeit für eine erfolgreiche Immunreaktion auf ein Antigen. Die Auslösung einer Immunreaktion erfordert wenigstens zwei Signale für die Aktivierung naiver T-Zellen durch antigenpräsentierende Zellen (APC)(1-5). Das erste Signal ist antigenspezifisch, wird über den Peptid/Hauptgewebeverträglichkeits-Komplex durch den T-Zellen-Rezeptor geliefert und veranlasst, dass die T-Zelle in den Zellenzyklus eintritt. Das zweite oder "kostimulatorische" Signal ist für die Cytokin-Produktion und -Proliferation erforderlich. Es ist vorgeschlagen worden, dass wenigstens drei verschiedene Moleküle, die normalerweise an der Oberfläche einer professionellen APC zu finden sind, das zweite Signal liefern können, das entscheidend für die T-Zellen-Aktivierung ist: B7.1 (CD80), ein interzellulares Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1; CD54) und ein Leukozytenfunktions-assoziiertes Antigen-3 (LFA-3; menschliches CD58; Ratten-CD48) (2, 6, 7). Die T-Zellen-Liganden für diese kostimulatorischen Moleküle sind verschieden. B7-1 tritt mit den CD28- und CTLA-4-Molekülen in Wechselwirkung, ICAM-1 tritt mit dem CD11a/CD18-Komplex (LFA-1/⎕2-Integrin- Komplex) in Wechselwirkung und LFA-3 tritt mit den CD2-Molekülen (LFA-2-Molekülen) in Wechselwirkung. Es ist nicht bekannt, ob diese kostimulatorischen Moleküle in spezifischen Phasen einer induzierten Immunreaktion (2) äquivalente Funktionen ausführen oder spezialisierte Funktionen ausführen. Es ist gezeigt worden, dass diese Moleküle die T-Zellen-Proliferation in vitro einzeln kostimulieren (6). Da sie gleichzeitig in APC exprimiert werden können, ist es aber schwierig, die relativen Potenzen einzelner kostimulatorischer Moleküle während der Induktion der T-Zellen-Vervielfachung zu untersuchen (2).
Da vorgeschlagen worden ist, dass sowohl Antigenmoleküle als auch kostimulatorische Moleküle in der Nähe zueinander exprimiert werden müssen, um gleichzeitig richtig mit der T-Zelle und mit den kostimulatorischen Rezeptoren in Eingriff zu gelangen (8, 9), könnte das Gemisch mehrerer rekombinanter Viren genutzt werden, um das potentielle Zusammenwirken kostimulatorischer Moleküle zu untersuchen. Der Nachteil dieses Zugangs ist aber, dass dieses Gemisch von drei oder mehr Viren eine statistisch verminderte Wahrscheinlichkeit besitzt, dieselbe Zelle gleichzeitig zu infizieren, was ein Mehr-Gen-Konstrukt zur Verwendung mit drei kostimulatorischen Molekülgenen viel wünschenswerter macht.
WO 91/02805 , veröffentlicht am 7. März 1991, offenbart ein rekombinantes Retrovirusvektor-Konstrukt, das die Expression eines Zielantigens, eines MHC-Proteins und anderer an Immunwechselwirkungen beteiligter Proteine, die in einer Zielzelle fehlen oder unterrepräsentiert sind, lenkt.
Akagi u. a.. 1997, J. Immunotherapy, Bd. 20 (1): 38–47, offenbaren ein Gemisch eines rekombinanten Impfpockenvirus, das ein modifiziertes MUC1-Gen (rV-MUC1) enthält, und eines rekombinanten Impfpockenvirus, das das Gen für das kostimulatorische Rattenmolekül B7 (rV-B7) enthält.
Cavallo, P., u. a., 1995, Eur. J. Immunol. 25:1154–1162, offenbaren, dass die Transfektion von B7-1-cDNA in drei ICAM-1⁺-Tumorzelllinien ausreicht, um in syngenetischen Mäusen eine Zurückweisung zu induzieren.
Chen, L., u. a., 1994, J. Exp. Med., 179:523–532, offenbaren einen rekombinanten Retrovirusvektor, der cDNA für Ratten-B7 enthält, und die Verwendung des Vektors bei der Transduktion verschiedener Tumoren.
Damle, N. K., u. a., 1992, J. Immunol., Bd. 148 (Nr. 7): 1985–1992, offenbaren die Verwendung eines von antigenpräsentierenden Zellen unabhängigen (APC-unabhängigen) In-vitro-Kultursystems, das aus immobilisierten Kombinationen monoklonaler Antikörper, die auf den TCR/CD3-Komplex gerichtet sind, und aus löslichen Ig-Chimären (RG) von vier verschiedenen APC-assoziierten kostimulatorischen Molekülen besteht, um die Fähigkeiten dieser Moleküle zum Kostimulieren der T-Zellen-Proliferation zu vergleichen.
Dubey, C., u. a., 1995, J Immunol, 155:45–57, offenbaren eine Untersuchung des relativen Beitrags von ICAM-1:LFA- und B7:CD28/CTLA-4-kostimulatorischen Wegen in der naiven T-Zellenaktivierung unter Verwendung von entweder Anti-CD28-Antikörper- oder von juvenilen Bindegewebs-Zelllinien, die mit I-E^k transfiziert wurden, die entweder keine kostimulatorischen Moleküle, ICAM-1 allein, B7-1 allein oder ICAM-1 und B7-1 zusammen exprimieren.
Fenton, R. G., u. a., 1998, Bd. 21, Nr. 2, S. 95–108, offenbaren die Transfektion des Gens des kostimulatorischen Moleküls B7-1 in drei HLA-A2-exprimierenden menschliche Melanomzelllinien und ihre Fähigkeit zum Stimulieren primärer menschlicher T-Zellen. Die drei Melanomlinien exprimierten außerdem erfassbare Niveaus der kostimulatorischen Moleküle ICAM-1 (CD54) und LFA-3 (CD58).
Gjorloff Wingren, A., u. a., 1995, Critical Reviews in Immunol 15 (3 und 4): 235– 253, offenbaren, dass bei der Kotransfektion von HLA-DR, B7 und LFA-3 in CHO-Zellen diese Moleküle bei der Aktivierung sowohl von naiven als auch von Speicher-T-Zellen zusammenwirken und Reaktionen auf pikomolare Konzentrationen des Antigen-Staphylokokken-Enterotoxins B (SEB) ermöglichen.
Goldbach-Mansky, R., u. a., 1992, International Immunol, 4 (Nr. 12): 1351–1360, offenbaren, dass CD4⁺-T-Zellen in Anwesenheit von LFA-3, ICAM-1 und der B7-positiven Erythroleukämie-Zelllinie K562, von Ratten-L-Zellen und von menschlichen transfizierten B7-L-Zellen auf Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) reagieren.
Hodge, J. W., u. a., 1994, Cancer Research, 54:5552–5555, offenbaren die Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter Impfpockenviren, die die Ratten-B7.1- und -B7.2-Gene enthalten.
Hodge, J. W., u. a., 1995, Cancer Research, 55:3598–3603, offenbaren ein Gemisch rekombinanter Impfpocken-Ratten-B7.1 (rV-B7) plus rekombinanter Impfpocken, die das menschliche carcinoembryonale Antigen-Gen (rV-CEA) exprimieren, und die Verwendung dieses Gemischs für die Antitumoraktivität.
Parra, u. a., 1993, Scand J. Immunol, 38:508–514, Parra, E., u. a. 1994, J. Immunol, 153:2479–2487, und Parra, u. a., 1997, J. Immunol., 458:637–642, offenbaren mit Genen des menschlichen HLA-DR4-Moleküls (CHO-DR4); mit HLA-DR4- und B7- (CHO-DR4/B7), mit HLA-DR4- und mit LFA-3- (CHO-DR4/LFA3); mit HLA-DR4- und mit ICAM-1- (CHO-DR4/ICAM-I); oder mit DR4-, B7- und LFA-3- (CHO-DR4/B7/LFA-3-) Genen transfizierte CHO-Zellen.
Thomas, R., u. a., 1993, J. Immunol., 151:6840–6852, offenbaren, dass frisch erhaltene Dendritenzellen (DC) ähnliche Dichten von HLA-DR und den Hilfsmolekülen LFA-3, ICAM-1 und B7 wie Monozyten exprimieren.
Uzendoski, K., u. a., Mai 1997, Human Gene Therapy, 8:851–860, offenbaren die Konstruktion, die Charakterisierung und die immunologischen Folgen eines rekombinanten Impfpockenvirus, das das kostimulatorische Rattenmolekül ICAM-1 exprimiert.
WO 96/10419 , veröffentlicht am 11. April 1996 von PCT/US95/12624 , offenbart einen Gegenstand, der sich auf einen einzelnen rekombinanten Virusvektor bezieht, der eines oder mehrere Gene oder einen Abschnitt davon, die ein immunstimulatorisches Molekül codieren, und eines oder mehrere Gene oder einen Abschnitt davon, die ein Antigen eines Erkrankungszustands codieren, inkorporiert hat.
Robinson, u. a., US-Patent Nr. 5.738.852 , offenbart einen Retrovirusvektor, der eine Polynukleotidsequenz, die ein Zielantigen eines infektiösen Agens codiert, und eine Polynukleotidsequenz, die ein kostimulatorisches B7-Molekül codiert, enthält.
Die vorliegende Erfindung ist ein Vektor, der Fremd-DNA, die wenigstens drei kostimulatorische Moleküle codiert, allein oder in Kombination mit Fremd-DNA, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, das eine funktionale Expression jeder Fremd-DNA in einer infizierten Wirtszelle zulässt, enthält.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft einen rekombinanten Vektor, der Fremdgene oder exogene Gene oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst. Gene oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische Moleküle codieren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, ein Mitglied der B7-Familie; und ICAM-1-, LFA-3-, 4-1BBL-, CD59-, CD40-, CD70-, VCAM-1-, OX-40L-Moleküle, Funktionsabschnitte und menschliche Homologe davon. Der Vektor der Erfindung kann ferner in Kombination mit den Fremdgenen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, liefern. Das Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, kann von Zellen, von Geweben oder von Organismen wie etwa von Viren, von Bakterien, von Protozoen, von Parasiten, von Hefe, von Tumorzellen, von präneoplastischen Zellen, von hyperplastischen Zellen, von gewebespezifischen Zellen oder von synthetischen Antigenen abgeleitet sein. Ferner kann der Vektor ein Fremdgen liefern, das wenigstens eines oder eine Kombination von Cytokinen, Chemokinen und Flt-3L codiert.
Der rekombinante Vektor zur Verwendung in der Gruppe der vorliegenden Erfindung besteht aus Bakterienvektoren, Virusvektoren, nukleinsäurebasierten Vektoren und dergleichen. Die rekombinanten Virusvektoren enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Pockenvirus, Adenovirus, Herpesvirus, Alphavirus, Retrovirus, Picornavirus, Iridovirus und dergleichen. Das Pockenvirus enthält, ist aber nicht beschränkt auf, Orthopox, Avipox, Suipox und Capripox.
Die vorliegende Erfindung schafft ein rekombinantes Virus, das Fremdgene oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, um für eine Zielzelle, für ein Zielantigen oder für ein immunologisches Epitop davon eine verbesserte Immunreaktion zu liefern, die größer als eine Reaktion ist, die durch ein rekombinantes Virus geliefert wird, das ein Fremdgen oder Fremdgene, das/die einzelnen oder doppelten kostimulatorischen Moleküle codiert/codieren, umfasst. Ferner kann das rekombinante Virus der Erfindung in Kombination mit den Fremdgenen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, liefern. Ferner kann das rekombinante Virus ein Fremdgen liefern, das andere Klassen immunstimulatorischer Moleküle wie etwa Cytokine einschließlich, aber nicht beschränkt auf, IL-2, IL-12, GM-CSF und dergleichen, Chemokine wie etwa MIP1, MIP2, RANTES und dergleichen und Flt-3L, das die DC-Proliferation stimuliert, enthält.
Ferner schafft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene oder Abschnitte davon umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, um für eine Zielzelle, für ein Zielantigen oder für ein immunologisches Epitop davon eine verbesserte Immunreaktion zu liefern, die größer als eine Reaktion ist, die durch ein rekombinantes Pockenvirus geliefert wird, das ein Fremdgen oder Fremdgene umfasst, das/die einzelnen oder doppelten kostimulatorischen Moleküle codiert/codieren. Das rekombinante Pockenvirus der Erfindung kann ferner in Kombination mit den Fremdgenen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, liefern.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codiert und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Molekül aus der B7-Familie kostimulatorischer Moleküle codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ein kostimulatorisches ICAM-1-Molekül codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die in kostimulatorisches LFA-3-Molekül codiert, umfasst. Ferner liefert das rekombinante Virus mehrere Pockenvirusvorläufer, die die Expression jedes Fremdgens regulieren.
Die vorliegende Erfindung schafft ein rekombinantes Virus, das dadurch hergestellt wird, dass zugelassen wird, dass ein Plasmidvektor, der Fremd-DNA umfasst, die die kostimulatorischen Moleküle codiert, eine Rekombination mit einem Elternvirusgenom erfährt, um ein rekombinantes Virus herzustellen, in dessen Genom Fremd-DNA eingeführt ist. Ferner kann das durch Rekombination hergestellte rekombinante Virus ein Fremdgen enthalten, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, das durch den Plasmidvektor geliefert wird.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das dadurch hergestellt wird, dass zugelassen wird, dass ein Plasmidvektor, der Fremd-DNA umfasst, die das kostimulatorische Molekül, LFA-3, ICAM-1 und wenigstens ein Molekül aus der B7-Familie codiert, eine Rekombination mit einem Elternpockenvirusgenom erfährt, um ein rekombinantes Pockenvirus herzustellen, in dessen Genom die Fremd-DNA und mehrere Pockenviruspromotoren, die die Expression der Fremd-DNA steuern können, eingeführt ist. Ferner kann das durch Rekombination hergestellte rekombinante Pockenvirus ein Fremdgen enthalten, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, das durch den Plasmidvektor geliefert wird.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens zur Verbesserung der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene oder immunologische Epitope davon, das einen rekombinanten Vektor mit Fremdnukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst. Der Vektor kann ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens zur Verbesserung der Immunreaktionen gegen Zielzelle, Zielantigene oder immunologische Epitope davon, das einen rekombinanten Virusvektor mit Fremdnukleinsäuren, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst. Der rekombinante Virusvektor kann ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens eines oder mehrere Zielantigene oder immunologische Epitope davon codiert, umfassen.
Eine abermals weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens zur Verbesserung der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene oder immunologische Epitope davon, das einen rekombinanten Pockenvektor, der eine Fremdnukleinsäuresequenz, die die kostimulatorischen Moleküle LFA-3, ICAM-1 und ein Molekül aus der B7-Familie codiert, und eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung liefert einen Impfstoff zum Hervorrufen und Verbessern der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene oder Epitope davon für den Schutz vor und/oder für die Behandlung von Erkrankungszuständen. Der Vektorimpfstoff umfasst Fremdnukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren. Außerdem kann der Vektorimpfstoff Fremd nukleinsäuresequenzen umfassen, die eines oder mehrere Zielantigene oder immunologische Epitope davon codieren, um einen einwertigen oder mehrwertigen Impfstoff gegen eine Erkrankung herzustellen.
Die vorliegende Erfindung schafft Arzneimittelzusammensetzungen, die einen Vektor mit Fremdnukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Ferner kann der Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Zusätzlich kann der Vektor eine Nukleinsequenz, die ein Cytokin, ein Chemokin, Flt-3L oder eine Kombination davon codiert, umfassen.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung, die einen rekombinanten Virusvektor, der Fremdgene oder exogene Gene oder Funktionsabschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, und ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung Arzneimittelzusammensetzungen, die ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Ferner kann das rekombinante Pockenvirus eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Arzneimittelzusammensetzung, die ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst und das ferner ein Fremdgen oder einen Abschnitt davon, der wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen kann, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein immunologisches Epitop umfasst.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung eine Arzneimittelzusammensetzung, die einen ersten Vektor, der Fremdgene oder Funktionsabschnitte davon, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, umfasst, und einen zweiten Vektor, der Fremdgene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung schafft Wirtszellen, die mit einem ersten Vektor infiziert, transfiziert oder transduziert sind, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, die die Expression der drei kostimulatorischen Moleküle in den Wirtszellen veranlassen, umfasst. Ferner kann der erste Vektor oder ein zweiter Vektor ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, an die Wirtszelle liefern.
Die vorliegende Erfindung schafft antigenpräsentierende Zellen (APCs) oder Tumorzellen, die mit einem ersten Vektor infiziert, transfiziert oder transduziert sind, der Fremdgene oder exogen gelieferte Gene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, die die Expression oder Überexpression der drei kostimulatorischen Moleküle veranlassen, umfasst. Der erste Vektor oder ein zweiter Vektor kann ferner ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, an die Wirtszelle liefern.
Ferner schafft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Pockenvirus infiziert sind, das die Expression der drei kostimulatorischen Moleküle veranlasst und optional die Expression eines Zielantigens oder eines immunologischen Epitops davon veranlasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Dendritenzelle (DC) und ein Vorläufer davon, die/der infiziert, transfiziert oder genetisch manipuliert worden ist, um Gene, die drei exogene kostimulatorische Moleküle codieren, zu überexprimieren. Die DCs und die Vorläufer davon können weiter genetisch manipuliert worden sein, um Fremdgene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, zu exprimieren.
Ein abermals weiterer Aspekt der Erfindung ist eine DC und sind Vorläufer davon, die genetisch manipuliert worden ist/sind, um Gene, die drei exogene kostimulatorische Moleküle codieren, zu überexprimieren. Die DCs und ein Vorläufer davon können weiter genetisch manipuliert worden sein, um Fremdgene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, zu exprimieren.
Ferner schafft die vorliegende Erfindung eine DC und Vorläufer davon, die genetisch manipuliert worden ist/sind, um Gene, die ein B7-Molekül, ICAM-1 und LFA-3 codieren, zu überexprimieren. Die DCs und ein Vorläufer davon können ferner genetisch manipuliert werden, um Fremdgene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren und einen Plasmidvektor für die Rekombination mit einem Elternvirus, das so beschaffen ist, dass es ein rekombinantes Virus erzeugt, das Fremdnukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, exprimieren kann, umfassend: (a) mehrere Viruspromotoren, (b) die Fremdnukleinsäuresequenzen, die die drei kostimulatorischen Moleküle codieren, (c) DNA-Sequenzen, die die Konstrukte der Elemente (a) und (b) flankieren, wobei die flankierenden Sequenzen sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden Homologe zu einem Gebiet eines Elternvirusgenoms sind, wo die Elemente (a) und (b) einzuführen sind. Der Plasmidvektor kann ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz liefern, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Außerdem kann der Plasmidvektor ein Gen liefern, das einen wählbaren Marker codiert.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung Verfahren und einen Plasmidvektor für die Rekombination mit einem Elternpockenvirus, das so beschaffen ist, dass es ein rekombinantes Pockenvirus erzeugt, das Fremdnukleinsäuresequenzen exprimieren kann, die die kostimulatorischen Moleküle LFA-3, ICAM-1 und ein B7-Molekül codieren, das umfasst: (a) mehrere Pockenviruspromotoren, (b) die Fremdnukleinsäuresequenzen, die das LFA-3-, das ICAM-1- und ein B7-Molekül codieren, (c) DNA-Sequenzen, die das Konstrukt der Elemente (a) und (b) flankieren, wobei die flankierende Sequenzen sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden Homologe zu einem Gebiet eines Eltern-Pockenvirusgenoms sind, wo die Elemente (a) und (b) einzuführen sind. Ferner kann der Plasmidvektor eine Fremdnukleinsäuresequenz liefern, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Außerdem kann der Plasmidvektor ein Gen liefern, das einen wählbaren Marker codiert.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Verbessern der Immunreaktionen in einem Säugetier auf wenigstens eine Zielzelle, ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon, das das Verabreichen eines ersten Vektors, der Fremdnukleinsäuresequenzen umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, wobei jedes kostimulatorische Molekül in einer Zelle in dem Säugetier in einer Menge exprimiert wird, die die Verbesserung wenigstens einer Immunreaktion in dem Säugetier bewirkt. Gene oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische Moleküle codieren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, ein Mitglied der B7-Familie, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L und Homologe und Abschnitte davon. Eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, kann in dem Verfahren ferner durch den ersten Vektor oder durch einen zweiten Vektor geliefert werden.
Außer Genen oder einem Abschnitt davon, die/der drei kostimulatorische Moleküle codieren/codiert, können eine Fremdnukleinsäuresequenz oder exogene Nukleinsäuresequenz oder Funktionsabschnitte davon, die wenigstens eine oder eine Kombination weiterer Klassen immunstimulatorischer Moleküle codieren, ebenfalls durch den ersten Vektor, durch den zweiten Vektor oder durch einen dritten Vektor geliefert werden. Weitere Klassen immunstimulatorischer Moleküle enthalten Cytokine wie etwa IL-2, IL-12, GM-CSF und dergleichen. Chemokine wie etwa MIP1, MIP2, RANTES und dergleichen und Flt-3L.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Verbessern einer antigenspezifischen T-Zellen-Immunreaktion in einem Säugetier auf eine Zielzelle, auf ein Zielantigen oder auf ein immunologisches Epitop davon, das das Verabreichen eines rekombinanten Fremdpockenvirus umfasst, das Nukleinsäuresequenzen umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle, LFA-3, ICAM-1 und ein B7-Molekül, codieren, wobei jedes kostimulatorische Molekül in einer Zelle in dem Säugetier in einer Menge exprimiert wird, die die Verbesserung wenigstens einer T-Zellen-Immunreaktion bewirkt, in der die Verbesserung größer als die additive Summe der Verbesserung ist, die durch die Verabreichung einzelner oder doppelter kostimulatorischer Moleküle geschaffen wird.
In einem weiteren Verfahren zum Verbessern von Immunreaktionen werden APCs oder Tumorzellen, die fremd oder exogen gelieferte Gene exprimieren, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, in einer wirksamen Menge zum Verbessern der Immunreaktionen an ein Säugetier geliefert. Die APC oder Tumorzelle kann ferner Fremdgene exprimieren, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon für die Verbesserung der Immunreaktionen codieren. Ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon kann an das Säugetier vor der, gleichzeitig mit der oder nach der Verabreichung der APC oder Tumorzelle verabreicht werden. Zusätzlich oder alternativ werden APCs oder Tumorzellen vor der Verabreichung an das Säugetier mit wenigstens einem Zielantigen oder einem immunologischen Epitop davon gepulst.
Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren zum Verbessern der humoralen Reaktionen in einem Säugetier auf eine Zielzelle, auf ein Zielantigen oder auf ein immunologisches Epitop davon, die das Verabreichen eines rekombinanten Vektors, der Fremdnukleinsäuresequenzen umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, in einer wirksamen Menge zum Verbessern der humoralen Reaktion an ein Säugetier umfassen. Der Vektor kann ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren. Die Erfindung schafft weiter einen isolierten Antikörper oder einen Funktionsabschnitt davon gegen eine Zielzelle, ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon, der durch das Verfahren erzeugt wird.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung einen für ein Zielantigen spezifischen Antikörper oder ein immunologisches Epitop davon, der/das in Reaktion auf die Verabreichung eines rekombinanten Pockenvirus erzeugt wird, das Fremdgene, die B7, ICAM-1 und LFA-3 codieren, und Gene, die eines oder mehrere Zielgene oder Epitope davon codieren, umfasst.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und viele der begleitenden Vorteile der Erfindung werden besser verständlich beim Lesen der detaillierten Beschreibung der Erfindung.
1. Die Genomstruktur des Plasmids pT5032, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1 und -B7.1 codieren, flankiert von Abschnitten des Hind-III-M-Gebiets des Impfpockengenoms, umfasst.
2. Die Genomstruktur des Plasmids pT5047, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des Hind-III-J-Gebiets des Impfpockengenoms, umfasst.
3. Genomstruktur des Plasmids pT5031, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1 und -B7.1 codieren, und eine Nukleinsäuresequenz, die CEA codiert, flankiert von Abschnitten des Hind-III-M-Gebiets des Impfpocken genoms umfasst.
4A bis 4C. Genomstruktur rekombinanter Impfpockenviren, die drei kostimulatorische Rattenmoleküle mit einem tumorassoziierten Antigen (4C) oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (4A und B) exprimieren. 4A zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Impfpocken vT171. 4B zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Impfpocken vT199. 4C zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Impfpocken vT172. Hind III M und Hind III J sind die Einführungsstellen der Fremdgene in die Pockenvirusgenome. Die Promotoren 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K und C1 sind Pockenviruspromotoren. Es sind Bam-HI- und Hind-III-Restriktionsstellen in den eingeführten Sequenzen gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren) von dem oben aufgeführten 5'-Einführungs-Ende (0) jeder Stelle in Klammern gezeigt ist (nicht maßstäblich gezeichnet).
5. Genomstruktur des Plasmids pT8001, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-B7.1, -LFA-3, -ICAM-1 und das lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
6. Genomstruktur des Plasmids pT5049, das eine Nukleinsäuresequenz, die das tumorassoziierte Antigen, CEA, und Ratten-B7.1, -LFA-3 und -ICAM-1 in Kombination mit dem lacZ-Gen codiert, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
7A bis 7D. Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren, die drei kostimulatorische Rattenmoleküle mit einem tumorassoziierten Antigen (TAA) (7B, 7C und 7D) oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) (7A) exprimieren. 7A zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken vT222. 7B zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken vT194. 7C zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken, die MUC-1, B7.1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren. 7D zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken, die ein tumorassoziiertes Antigen, B7.1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren. BamHI J ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Geflügelpockenvirusgenom. sE/L, I3, 7.5K, C1, 40K und 30 K sind Pockenviruspromotoren. P1–P5 bezeichnen fünf verschiedene Pockenviruspromotoren. Es sind die Restriktionsstellen BamHI und HindIII in den eingeführten Sequenzen gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren) von dem 5'-Einführungs-Ende (0) über jeder Stelle in Klammern aufgeführt ist (nicht maß stäblich gezeichnet).
8. Genomstruktur des Plasmids pT5064, das Nukleinsäuresequenzen, die menschliches LFA-3, menschliches ICAM-1, menschliches B7.1 und das lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des HindIII-J-Gebiets des Impfpockengenoms, umfasst.
9A bis 9C. Genomstruktur des rekombinanten Pockenvirus, das drei kostimulatorische menschliche Moleküle, LFA-3, ICAM-1 und B7.1, exprimiert, zusammen mit dem lacZ-Gen mit einem tumorassoziierten Antigen (9B, C) oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (9A), HindIII J ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Impfpockenvirusgenom. BamHI J ist die Einführungsstelle in das Geflügelpockenvirusgenom. 30K, I3, sE/L, 40K und C1 sind Pockenviruspromotoren. Es sind die Restriktionsstellen BgIII und HindIII in den eingeführten Sequenzen gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren) von dem 5'-Einführungs-Ende (0) über jeder Stelle in Klammern aufgeführt ist (nicht maßstäblich gezeichnet).
10. Genomstruktur des Plasmids pT8016, das Nukleinsäuresequenzen, die CEA (6D) und menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des HindIII-J-Gebiets des Impfpockengenoms, umfasst.
11. Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT238, das CEA (6D) und drei kostimulatorische menschliche Moleküle exprimiert. HindIII J ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 30K, I3, sE/L und C1 sind Pockenviruspromotoren.
12. Genomstruktur des Plasmids pT8019, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
13A und 13B. Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren, die kostimulatorische Ratten- oder Menschenmoleküle exprimieren. 13A zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken vT251. 13B zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken vT232. BamHI J ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 30K, I3, sE/L und C1 sind Pockenviruspromotoren.
14. Genomstruktur des Plasmids pT5072, das Nukleinsäuresequenzen, die menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
15. Genomstruktur des Plasmids pT8020, das Nukleinsäuresequenzen, die MUC-1, Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
16A bis 16D. Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren, die kostimulatorische Ratten- oder Menschenmoleküle mit wenigstens einem tumorassoziierten Antigen exprimieren. 16A zeigt die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken vT250. 16B zeigt die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken vT242. 16C zeigt die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken vT236. 16D zeigt die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken vT257. BamHI J ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 7.5K, 30K, I3, sE/L und C1 sind Pockenviruspromotoren.
17. Genomstruktur des Plasmids pT2186, das Nukleinsäuresequenzen, die MUC-1, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
18. Genomstruktur des Plasmids pT2187, das Nukleinsäuresequenzen, die CEA (6D), menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
19. Genomstruktur des Plasmids pT5080, das Nukleinsäuresequenzen, die PSA, PSMA, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms, umfasst.
20. Genomstruktur des Plasmids pT5085, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des Deletion-III-Gebiets des MVA-Genoms, umfasst.
21A und 21B. Genomstruktur rekombinanter MVA-Viren, die kostimulatorische Ratten- oder Menschenmoleküle mit oder ohne tumorassoziierte Antigene exprimieren. 21A zeigt die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT246. 21B zeigt die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT260. Deletion III ist die Einführungsstelle der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 7.5K, 30K, I3, sE/L und C1 sind Pockenviruspromotoren.
22. Genomstruktur des Plasmids pT5084, das Nukleinsäuresequenzen, die PSA, PSMA, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten des Deletion-III-Gebiets des MVA-Genoms, umfasst.
23. Oberflächenexpression eines kostimulatorischen Moleküls nach Infektion mit rekombinanten Viren. Tumorzellen MC38 wurden 5 Stunden mit 5 MOI (Infektionsmultiplizität; PFU/Zelle) mit dem angegebenen Virus infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit für die kostimulatorische Moleküle spezifischen FITC-markierten monoklonalen Antikörpern (MAb) immunhistochemisch gefärbt. Schattierte Bereiche sind die Fluoreszenz-Intensität der spezifischen MAb, während unschattierte Bereiche die Fluoreszenz-Intensität des geeigneten Isotyp-Kontrollantikörpers (siehe Materialien und Verfahren) sind.
24A und 24B. Die Wirkung mehrerer kostimulatorischer Moleküle auf die T-Zellen-Proliferation. Naive Ratten-T-Zellen wurden in Anwesenheit veränderlicher Konzentrationen von Con A zum Liefern des ersten Signals mit MC38-Stimulatorzellen, die entweder mit rekombinanten Impfpockenvektoren (24A) oder mit rekombinanten Geflügelpockenvektoren (24B) infiziert wurden, kokultiviert. Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (d. h. V-Wyeth oder WT-FP [Leerquadrate]), rV-LFA-3 (Volldreieck), rV-ICAM-1 oder rF-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 oder rF-B7-1 (Vollrauten) und rV-B7-1-ICAM-1/LFA-3 oder rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Vollquadrate). Nicht infizierte MC38-Zellen sind Leerkreise. Der Proliferations-Assay ist wie in Materialien und Verfahren beschrieben.
25A bis 25D. Spezifizität der über rekombinante Impfpockenviren gelieferten Kostimulation. T-Zellen wurden in Anwesenheit von Con A mit MC38-Stimulatorzellen, die mit V-Wyeth (25A), rV-B7-1 (25B), rV-ICAM-1 (25C) und rV-LFA-3 (25D), wie durch Leerkreise bezeichnet ist, infiziert wurden, kokul tiviert. Infizierte Stimulatorzellen in Anwesenheit für kostimulatorische Moleküle spezifischer MAb sind durch Vollkreise bezeichnet und Isotypkontrollantikörper sind durch Volldreiecke bezeichnet.
26. Relative Fähigkeit von B7-1, ICAM-1, LFA-3 und die Koexpression aller drei kostimulatorischen Moleküle zum Liefern des zweiten Signals für die T-Zellen-Proliferation. 100.00 T-Zellen wurden in Anwesenheit von Con A (2,5 μg/ml) mit 10.000 MC38-Zellen kokultiviert. Die Stimulatorzellen MC38, die eines oder alle der kostimulatorischen Moleküle exprimieren, wurden in verschiedenen Verhältnissen in Kombination mit mit V-Wyeth infizierten Stimulatorzellen auf insgesamt 10⁴ MC38 Zellen/pro Well zu den Wells zugegeben. Die MC38-Zellen wurden mit V-Wyeth (Leerquadrat), rV-LFA-3 (Volldreiecke), rV-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 (Vollrauten) oder rV-B7-1-ICAM-1-LFA-3 (Vollquadrate) infiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden kokultiviert. Während der letzten 18 Stunden wurde ³H-Thymidin zugegeben, um die T-Zellen-Proliferation zu messen. Das Einsatzfeld zeigt Proliferationswerte, die von einer Kultur erhalten wurden, in der 3 % der MC38-Stimulatorzellen mit den gezeigten Vektoren infiziert wurden. Somit war das Endverhältnis der Stimulatorzellen zu T-Zellen in diesem Experiment 0,003. Es wird auf die verhältnismäßig schlechte Wirkung von rVB7.1/ICAM unter diesen Bedingungen im Vergleich zu rV-B7/ICAM-LFA-3 hingewiesen.
27A bis 27D. Die Wirkung der Kostimulation auf spezifische T-Zellen-Populationen. Ratten-CD4⁺-Zellen (27A) oder -CDA8⁺-T-Zellen (27B) wurden mit nicht infizierten MC38-Zellen (Leerkreis) oder mit Zellen, die mit V-Wyeth (Leerquadrate), rV-LFA-3 (Volldreiecke), rV-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 (Vollrauten) oder rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Vollquadrate) in einem Verhältnis von 10:1 infiziert wurden, 48 Stunden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Con A kokultiviert. Während der letzten 18 Stunden wurde ³H-Thymidin zur Messung der T-Zellen-Proliferation zugegeben. Die 27C und 27D zeigen die Proliferationsreaktionen gereinigter CD4⁺ bzw. CD8⁺-Zellen, wenn sie in Anwesenheit vektorinfizierter MC38-Stimulatorzellen mit einer niedrigen Konzentration von Con A (0,625 μg/ml) kokultiviert wurden.
28A bis 28D. Die Wirkung der Kostimulation auf die Cytokin-Produktion. Ratten-CD4⁺-T-Zellen (28A und 28C) oder -CD8⁺-T-Zellen (28B und 28D) wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben gereinigt und mit den angegebenen vektorinfizierten MC38-Stimulatorzellen 24 Stunden in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A kokultiviert. Die überstehenden Fluide wurden durch die Erfassung ELISA auf die Erzeugung von IL-2 (28A und 28B) und IFN-γ (28C und 28D) analysiert.
29A bis 29C. Die Wirkung der Kostimulation auf die Cytokin-RNA-Expression. 29A: Ratten-CD4⁺-T-Zellen oder -CD8⁺-T-Zellen wurden mit MC38-Stimulatorzellen, die in einem T-Zellen/Stimulatorzellen-Verhältnis von 10:1 mit V-Wyeth (Spur A), rV-B7-1 (Spur B), rV-ICAM-1 (Spur C), rV-LFA-3 (Spur D) oder rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Spur E) infiziert wurden, 24 Stunden in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A kokultiviert. Nach der Kultur wurde die T-Zellen-RNA durch einen Mehrproben-RNAse-Schutz-Assay analysiert. Die quantitative Darstellung der Ergebnisse von dem Autoradiogramm ist in 29B (CD4⁺-Zellen) und in 29C (CD8⁺-Zellen) für den Ausdruck des Organisationsgens L32 normiert. Die Reihenfolge der Histogrammbalken (von links nach rechts) ist MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1, MC38/LFA-3 und MC38/B7-1/ICAM-I/LFA-3.
30. C57BL/6-Mäusen (5/Gruppe) wurde HBSS verabreicht (Vollquadrate) oder diese wurden mit 10⁷ PFU rV-CEA (Volldreiecke) oder rV-CEA/TRICOM (Vollkreis) geimpft. Einhundert Tage später wurden die Mäuse mit 1·10⁶ MC38-Karzinomzellen inokuliert, die CEA exprimieren, und es wurde das Überleben beobachtet. Alle anderen Mäuse als die der rV-CEA/TRICOM-Gruppe entwickelten Tumoren und wurden geopfert, wenn die Länge oder Breite der Tumoren 20 mm überschritt oder wenn die Mäuse starben. 30: In einem zweiten Experiment wurden C57BL/6-Mäuse (5/Gruppe) mit 10⁷ PFU rV-CEA, rV-CEA/B7.1, rV-CEA/TRICOM oder eines HBSS-Puffers geimpft. 22 Tage nach der Impfung wurden die lymphoproliferativen Reaktionen von Pool-Milz-T-Zellen analysiert. Die Werte repräsentieren den Stimulationsindex der cpm der Dreifachen gegenüber den Medien. Die Standardabweichung überstieg nie 10 %. Die verwendeten Antigene waren Con A (5 μg/ml), CEA (100 μg/ml) und Ovalbumin (100 μg/ml).
31 zeigt ein Schema eines In-vitro-Kostimulations-Assays von Dendritenzellen.
32A und 32B zeigt die Proliferationsreaktion naiver CD4⁺-T-Zellen (32A) oder naiver CD8⁺-T-Zellen (32B), die in Anwesenheit von Con A mit Vorläufer-DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert wurden, oder mit DCs (nicht infiziert, d. h. CD-34⁺-Zellen, die 6 Tage mit GM-CSF + IL-4 behandelt wurden) stimuliert wurden.
33A und 33B zeigen die Proliferationsreaktion naiver CD4⁺-T-Zellen (33A) oder naiver CD8⁺-T-Zellen (33B), die mit Vorläufer-DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert wurden, oder mit DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 oder V-Wyeth (Kontrolle) infiziert wurden, stimuliert wurden.
34 zeigt die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) von Balb/C-Splenozyten gegenüber bestrahlten C57b1/6-Dendritenzellen, die mit 25 MOI V-Wyeth oder rV-TRICOM infiziert wurden. 3H-Thymidin-gepulst am Tag 3, geerntet am Tag 4, ⎕ DC (nicht infiziert), ∎ DC (V-Wyeth-infiziert), ⎕ DC (rV-TRICOM-infiziert).
35 zeigt die Proliferationsreaktion von Responder-T-Zellen (CAP-M8-T-Zelllinie, spezifisch für das CEA-Peptid 8) bei verschiedenen APC-Verhältnissen, die am Tag 5 nach der Stimulation mit peptidgepulsten DCs geerntet wurden, die mit rV-TRICOM infiziert wurden und 2 Tage mit 10 u/ml IL2 (keine APC oder Peptid) ruhten. Peptid 8 (EAQNTTYL) im Assay mit 1 ug/ml Endkonzentration. Am Tag 2 ³H-Thymidin zugegeben, am Tag 3 T-Zellen geerntet. Die Ergebnisse 0 = DC (v-Wyeth)-Pep und Δ = DC (rV-TRICOM)-Pep sind auf der Grundlinie.
36A und 36B. Wirksamkeit der Pockenvirusinfektion von Rattendendritenzellen (DC). Die DC wurden 5 h mit 25 MOI rV-TRICOM oder 50 MOI rf CEA/TRICOM infiziert. Die mit TRICOM-Vektoren infizierten DC zeigen eine erhöhte Fähigkeit zum Stimulieren naiver T-Zellen. Alle DC-Populationen wurden 48 h mit T-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Con A kokultiviert, um ein Signal 1 zu liefern. Während der letzten 18 h wurde ³H-Thymidin zugegeben. 36A: nicht infizierte DC (Vollquadrate), scheininfizierte DC (Vollrauten), oder DC, die mit V-WT infiziert wurden (volle umgekehrte Dreiecke), rV-B7.1 (Leerdreiecke) oder rV-TRICOM (Leerkreise). 36B: DC (Vollquadrate), scheininfizierte DC (Vollrauten) oder DC, die mit WT-FP (umgekehrte Volldreiecke), mit rF-B7.1 (Leerdreiecke) oder mit rF-TRICOM (Leerkreise) infiziert wurden.
37A bis 37F. Verbesserte allostimulatorische Aktivität durch DC, die mit Impfpockenvektoren (37A, C, E) oder mit Geflügelpockenvektoren (37B, D, F) infiziert wurden. Nicht infizierte DC (Vollquadrate); scheininfizierte DC (Vollrauten); oder DC, die mit Pockenvirusvektoren vom Wildtyp (V-WT oder FWT, umgekehrte Volldreiecke), mit rV-B7.2 oder mit rF-B7.1 (Leerdreiecke) oder mit rV-TRICOM oder mit rF-TRICOM (Leerkreise) infiziert worden sind, wurden mit allogenetischen (37A–D) oder mit syngenetischen T-Zellen (37E–F) 5 Tage kokultiviert. Während der letzten 18 h wurde ³H-Thymidin zugegeben.
38A bis 38F. Die Wirkung einer Impfpockeninfektion von DC auf die peptidspezifische T-Zellen-Proliferation. Nicht infizierte DC (Vollquadrate) oder DC, die mit V-WT (umgekehrte Volldreiecke), mit rV-B7.1 (Leerdreiecke) oder mit rV-TRICOM (Leerkreise) infiziert wurden, wurden mit OVA-Peptid-spezifischen T-Zellen (38A, C, E) oder mit CAP-M8-peptidspezifischen T-Zellen (38B, D, F) kokultiviert. Die experimentellen Bedingungen enthielten ein festes Verhältnis von Effektor:Stimulator-Zellen von 10:1 in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der passenden Peptide (38A–D), negativer Kontrollpeptide (Leerquadrate), entweder von VSVN (38A) oder von FLU-NP (38B), oder eine feste Peptidkonzentration von 1 μM in Anwesenheit verschiedener Effektor:Stimulator-Zellen-Verhältnisse (38E und F).
39A und 39B. Die Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion mit DC, die mit TNF-α oder mit CD40 gereift sind. DC (Vollquadrate) oder DC, die für die letzten 24 h Kultur entweder mit 100 ng/ml TNF-α (Leerdreiecke) oder mit 5 μg/ml CD40 mAb (Leerkreise) kultiviert wurden, wurden verwendet, um CAP-M8-spezifische Effektor-T-Zellen zu stimulieren (39A). Die Proliferation der CAP-M8-T-Zellen in Reaktion auf diese DC-Populationen nach Infektion mit 25 MOI rV-TRICOM (39B). Das T-Zellen:DC-Verhältnis war für alle Felder 10:1, während die CAP-M8-Peptidkonzentration 1 μg/ml war. Vollkreise bezeichnen die Proliferation von CAP-M8-T-Zellen, die mit allen DC-Populationen stimuliert wurden, in Anwesenheit von 1 μg/ml VSVN-Peptid.
40A bis 40H: Die Wirkung einer Impfpockeninfektion von DC auf die Induktion einer CTL-Aktivität. DC (40B) oder DC, die mit V-WT (40C) oder mit rV-TRICOM (40D) infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μm OVA gepulst. Die DC-Populationen wurden intravenös an Mäuse (1·10⁵-Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden subkutan mit 100 μg OVA-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert (40A). Vierzehn Tage später wurden die Milzen geerntet, 6 Tage mit dem entsprechenden Peptid restimuliert und auf die Lysefähigkeit gegen EL-4-Zellen, die entweder mit OVA (Vollquadrate) oder mit VSVN-Peptiden (Leerqua drate) gepulst wurden, beurteilt. Die Einsatzzahlen zeigen die CTL-Aktivität, ausgedrückt in Lyseeinheiten. Außerdem ist die Wirkung einer Impfpockeninfektion auf DC bei der Induktion einer CTL-Aktivität gezeigt. DC (40F) oder DC, die mit V-WT (40G) oder mit rV-TRICOM (40H) infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μm CAP-M8-Peptid gepulst. Die DC-Populationen wurden intravenös an Mäuse (1·10⁵ Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden subkutan mit 100 μg CAP-M8-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert (40E). Vierzehn Tage später wurden die Milzen geerntet, 6 Tage mit dem entsprechenden Peptid restimuliert und auf die Lysefähigkeit gegen EL-4-Zellen, die entweder mit CAP-M8 (Vollquadrate) oder mit FLU-NP-Peptiden (Leerquadrate) gepulst wurden, beurteilt. Die Einsatzzahlen zeigen die CTL-Aktivität, ausgedrückt in Lyseeinheiten.
41A bis 41C: Die Wirkung mehrerer Immunisierungen mit mit Impfpocken infizierten DC auf die Induktion der CTL-Aktivität. DC (Vollquadrate) oder DC, die mit V-WT (umgekehrte Volldreiecke) oder mit rV-TRICOM (Leerkreise) infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μM CAP-M8-Peptid gepulst. Die DC-Populationen wurden in 7-Tage-Intervallen 1-mal, 2-mal oder 3-mal intravenös an Mäuse (1·10⁵ Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden subkutan mit 100 μg CAP-M8-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans (Kreuze) immunisiert. Vierzehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzen geerntet, 6 Tage mit CAP-M8 restimuliert und auf die Lysefähigkeit gegen EL-4-Zellen, die mit CAP-M8 oder mit Kontrollpeptid VSVN (nicht gezeigt) gepulst wurden, beurteilt.
42A und 42B. Die Wirkung mit Impfpocken- und Geflügelpocken-TRICOM infizierter Splenozyten auf die T-Zellen-Proliferation. Naive Ratten-T-Zellen wurden mit autogenen Splenozyten, die entweder mit rekombinanten Impfpocken- oder mit rekombinanten Geflügelpockenvektoren infiziert wurden, kokultiviert. Die Kokultur wurde in veränderlichen Konzentrationen von Con-A als Signal 1 ausgeführt. Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (d. h. V-WT, FP-WT, Leerraute), rV-B7-1 oder rF-B7-1 (Leerkreise) oder rV-TRICOM oder rF-TRICOM (Vollquadrate). Nicht infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke gezeigt.
43A bis 43D. Die Wirkung TRICOM-Vektor-infizierter Splenozyten auf allogenetische T-Zellen. Naive Balb/C-T-Zellen wurden mit C57B1/6-Splenozyten, die entweder 2 Tage (43A und B) oder 5 Tage (43C und 43D) mit rekombinanten Impfpockenvektoren (43A und C) oder mit rekombinanten Geflügelpocken vektoren (43B und D) infiziert wurden, kokultiviert. Die rekombinanten Vektoren waren V-WT oder FP-WT, Leerrauten, rV-B7-1 oder rF-B7-1 (Leerkreise) oder rV-TRICOM oder rF-TRICOM (Vollquadrate). Nicht infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke angegeben. Die durch DC induzierte Proliferation ist als Vollquadrate angegeben.
44A bis 44F. Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Splenozyten auf spezifische T-Zellen-Populationen. Naive Ratten-T-Zellen wurden mit CD3⁺-, CD4⁺- und CD8⁺-Unterpopulationen fraktioniert. Die T-Zellen wurden entweder mit nicht infizierten autogenen BMDC oder mit Splenozyten, die mit rekombinanten Impfpockenvektoren infiziert wurden, kokultiviert. Veränderliche Con-A-Konzentrationen (44A–C) oder eine veränderliche Anzahl von Stimulatorzellen (44D–F) lieferten das erste Signal. Die T-Zellen-Proliferation in Reaktion auf gereifte BMDC ist durch Leerquadrate und die in Reaktion auf nicht infizierte Splenozyten ist durch Leerdreiecke angegeben. Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (V-WT, Leerrauten) oder rV-TRICOM (Vollquadrate).
45A bis 45F. Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Knochenmarkzellen auf spezifische T-Zellen-Populationen. Naive Ratten-T-Zellen wurden in CD3⁺-, CD4⁺- und CD8⁺-Unterpopulationen fraktioniert. T-Zellen wurden entweder mit nicht infizierten autogenen BMDC oder mit Splenozyten, die mit rekombinanten Impfpockenvektoren infiziert wurden, kokultiviert. Veränderliche Con-A-Konzentrationen (45A–C) oder eine veränderliche Anzahl von Stimulatorzellen (45D–F) lieferten das erste Signal. Die T-Zellen-Proliferation in Reaktion auf gereifte BMDC ist durch Leerquadrate und die auf nicht infizierte Splenozyten ist durch Leerdreiecke angegeben. Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (V-WT, Leerrauten) oder rV-TRICOM (Vollquadrate).
46A bis 46D. Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Splenozyten oder Knochenmarkzellen (BM-Zellen) auf peptidspezifische CD8⁺-T-Gedächtniszellen. CAP-M8-spezifische T-Zellen wurden mit autogenen Splenozyten (46A und B) oder Knochenmarkzellen (46C und D), die mit rekombinanten Impfpockenviren infiziert wurden, kokultiviert. Die Analyse wurde unter Verwendung von zwei Sätzen von Bedingungen ausgeführt: a) ein festes Verhältnis von 10:1 von Responderzellen:Stimulatorzellen, die in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen von CAP-M8-Peptid kultiviert wurden (46A und 46C) oder b) eine feste Konzentration von Peptid (1 uM) in verschiedenen Responder:Stimulator-Verhält nissen (46B und 46D). Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (Leerrauten) und rV-TRICOM (Vollquadrate). Nicht infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke gezeigt. BM sind als Leerquadrate gezeigt.
47. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen, die aus einkernigen Zellen von peripherem Blut (PBMC) isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit CEA-Peptiden, mit CAP-1 oder mit CAP1, 6D gepulst wurden.
48. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit PSA-Peptid, PSA-3, gepulst wurden.
49. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen, die aus PBMC isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit dem Flu-Peptid 58-66 gepulst wurden.
50. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen, die aus PBMC isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit dem Flu-Peptid 58-66 gepulst wurden, bei verschiedenen Effektor:APC-Verhältnissen.
51 zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen aus dem Donor 868 unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit HPV-Peptid (11-20) gepulst wurden, nach einer oder nach zwei In-vitro-Stimulationen (IVS).
52. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch eine menschliche T-Zelllinie unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit HPV-Peptid (11-20) gepulst wurden.
53. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch eine menschliche T-Zelllinie unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von HPV-Peptid (11-20) gepulst wurden.
54. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche T-Zellen unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit dem HPV-E7-Peptid 11-20 gepulst wurden, bei verschiedenen Effektor:APC-Verhältnissen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle in Kombination oder die funktionalen aktiven Abschnitte jedes kostimulatorischen Moleküls codieren, umfasst. Wie es hier verwendet wird, ist ein funktional aktiver Abschnitt jener Abschnitt des Moleküls, der für die Bindung an seinem jeweiligen Liganden verantwortlich ist und ein geeignetes kostimulatorisches Signal für die Immunzellenaktivierung auslöst. Ein Verfahren zum Bestimmen der funktionalen Aktivität ist das Zugreifen auf die Induktion der naiven T-Zellen-Proliferation durch Liefern des kostimulatorischen Moleküls an eine Zielzelle in vitro, wie es hier beschrieben wird. Ein Funktionsabschnitt eines kostimulatorischen Moleküls stimuliert eine wenigstens 20-%ige Zunahme der T-Zellen-Proliferation.
Der Begriff Fremdgen oder Fremdnukleinsäuresequenz oder Funktionsabschnitt davon, wie er hier verwendet wird, ist ein Gen, eine Nukleinsäuresequenz oder ein Funktionsabschnitt davon, das/die/der durch einen rekombinanten Vektor exogen an eine Wirtszelle oder an einen Wirtsorganismus geliefert wird. Das exogene Gen oder der Abschnitt davon, das/der an die Wirtszelle oder an den Wirtsorganismus geliefert wird, kann eines/einer sein, das/der nicht endogen in der Wirtszelle oder in dem Wirtsorganismus vorhanden ist, oder kann endogen vorhanden und funktional oder nichtfunktional sein. Falls in der Wirtszelle oder in dem Wirtsorganismus ein funktionales endogenes Gen vorhanden ist, führt das Fremdgen oder das exogen gelieferte Gen oder der Funktionsabschnitt davon zur Überexpression des Genprodukts.
Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind brauchbar bei der Schaffung einer verbesserten Immunreaktion auf Zellen des Immunsystems, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, NK-Zellen, antigenpräsentierende Zellen (APCs) und dergleichen. Die Verbesserung der Immunreaktion unter Verwendung der rekombinanten Vektoren, die drei kostimulatorische Moleküle exprimieren, ist im Vergleich zur Verwendung eines einzelnen kostimulatorischen Moleküls oder der Verwendung zweier kostimulatorischer Moleküle bei der Verbesserung der Immunreaktionen synergistisch. Die Immunreaktion kann eine zellulare und/oder humorale Immunreaktion sein und kann auf ein spezifisches Zielantigen oder auf ein Epitop davon gerichtet sein oder kann eine verallgemeinerte Immunverbesserungs- oder Aufwärtsregulierungswirkung sein, wie sie durch erhöhte Cytokin-Freisetzung, erhöhte Proliferation durch Immunzellen, erhöhte Mitogenreaktionsfähigkeit und dergleichen nachgewiesen wird. Die Verbesserung einer Immunreaktion enthält vorzugsweise die Hyperstimulation oder Stimulation mit hoher Intensität von T-Zellen (HITS) im Ergebnis der Stimulation unter Verwendung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung oder der Zellen, die durch den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert, transduziert oder induziert wurden.
Die Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Die Auswahl der Quelle der Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, kann von der unter Verwendung des rekombinanten Vektors zu immunisierenden oder zu behandelnden Spezies abhängen.
Die Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, können von der Ratte abgeleitet, vom Menschen abgeleitet, vom Affen abgeleitet sein und können auf der Grundlage von Säugetiergenen chemisch synthetisiert sein. Außerdem können die Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, vom Vogel abgeleitet oder auf der Grundlage kostimulatorischer Vogelmolekülgene chemisch synthetisiert sein. Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind brauchbar als Immunogene und als Impfstoffe bei der Stimulierung einer Verbesserung der Immunreaktionen auf Zielzellen, Zielantigene und immunologische Epitope davon. Ein solches Niveau der Verbesserung einer Immunreaktion unter Verwendung der vorliegenden rekombinanten Vektoren, die Gene umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, konnte unter Verwendung eines einzelnen oder doppelten kostimulatorischen Moleküls nicht erhalten worden.
Gene oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische Moleküle codieren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L, Säugetierhomologe und dergleichen. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst Gene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, für die synergistische Verbesserung der Immunreaktionen, die unter Verwendung eines einzelnen oder doppelten kostimulatorischen Moleküls nicht erhalten werden kann. Gene, die verschiedene Kombinationen kostimulatorischer Moleküle codieren, sind ein Bereich der Erfindung zur Verwendung in dem rekombinanten Vektor und können je nach der gewünschten Immunreaktion und der zur behandelnden Erkrankung oder Bedingung solche Kombinationen wie B7.1 oder B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1 oder B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1 oder B7.2, ICAM-1, 4-1BBL; B7.1 oder B7.2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL; CD59, VCAM-1; und B7.1 oder B7.2; CD59, CD40, 4-1BBL, CD70 und VCAM-1, B7.1 oder B7.2; OX-40L, 4-1BBL; und dergleichen enthalten. Anhand der unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der drei kostimulatorische Moleküle codiert, erzielten drastischen synergistischen Immunreaktion im Vergleich zur Verwendung eines rekombinanten Vektors, der eines oder zwei kostimulatorische Moleküle codiert, führt ein rekombinanter Vektor, der vier, fünf oder mehr kostimulatorische Moleküle codiert, zu einer synergistischen Immunreaktion oder zu einer Immunreaktion, die gleich oder größer der unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der drei kostimulatorische Moleküle codiert, ist.
B7 repräsentiert eine Familie kostimulatorischer Moleküle, die Mitglieder der Gen-Überfamilie Ig sind. Die Mitglieder enthalten Ratten-B7.1 (CD80) und -B7.2 (CD86). B7.1 und B7.2 sind die natürlichen Liganden von CD28/CTLA-4 (CD152). Die Gensequenz von Ratten-B7.1 ist in Freeman u. a. (J. Immunol. 143: 2714–2722, 1989) und in der GENBANK unter der Zugriffsnummer X60958 offenbart. Die Gensequenz von Ratten-B7.2 ist in Azuma, u. a., (Nature 366: 76–79, 1993) und in der GENBANK unter der Zugriffsnummer 125606 und MUSB72X offenbart.
Die menschlichen Homologe der kostimulatorischen Ratten-B7-Moleküle und der Funktionsabschnitte davon sind ein Bereich der vorliegenden Erfindung und haben besondere Nützlichkeit in rekombinanten Vektoren zur klinischen Verwendung beim Menschen. Das menschliche Homolog der kostimulatorischen Ratten-B7-Moleküle enthält CD80, das Homolog des Ratten-B7.1, und CD86, das Homolog des B7.2. Die Gensequenz von menschlichem 7.1 (CD80) ist in der GENBANK unter der Zugriffsnummer M27533 offenbart und die Gensequenz von menschlichem B7.2 (CD86) ist unter der Zugriffsnummer U04343 und AF099105 offenbart. Zur Verwirklichung dieser Erfindung kann eine Lizenz erforderlich sein.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinanter Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz enthalten, die außer anderen kostimulatorischen Molekülen ein Molekül aus der kostimulatorischen B7-Molekülgruppe oder eine Kombination der kostimulatorischen B7-Moleküle oder Funktionsabschnitte davon codiert. Die Kombination kostimulatorischer B7-Moleküle enthält, ist aber nicht beschränkt auf, zwei oder mehr B7.1-Moleküle, zwei oder mehr B7.2-Moleküle, B7.1 und B7.2 und dergleichen. In einer Ausführungsform enthält der rekombinante Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz, die das B7.1-Molekül codiert, in Kombination mit Fremdnukleinsäuresequenzen, die LFA-3 und ICAM-1 codieren.
Das interzellulare Adhäsionsmolekül 1 (Ratten-ICAM-1, -CD54) und das menschliche Homolog CD54 wirken ebenfalls als ein kostimulatorisches Molekül. Ihr Ligand ist das der Leukozytenfunktion zugeordnete Antigen-1 (LFA-1, CD11a/CD18), das auf der Oberfläche von Lymphozyten und Granulozyten exprimiert wird. Das Gen für Ratten-ICAM-1 ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer X52264 offenbart und das Gen für das menschliche ICAM-1-Homolog (CD54) ist in der Zugriffsnummer J03132 offenbart. In einer Ausführungsform enthält der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung außer Fremdnukleinsäuresequenzen, die zwei oder mehr zusätzliche kostimulatorische Moleküle codieren, eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Ratten-ICAM-1-Molekül, ein menschliches Homolog oder ein anderes Säugetierhomolog oder einen Funktionsabschnitt davon codiert.
Das kostimulatorische Molekül Leukozyten-Funktionsantigen 3, das Ratten-LFA-3 und sein menschliches Homolog LFA-3 (CD58), ein Glykosylphosphatidylinositolverkettetes Glykoprotein, ist ein Mitglied der CD2-Familie in der Immunglobulin-Gen-Überfamilie. Der natürliche Ligand von LFA-3 ist CD2 (LFA-2), das an Thymozyten, T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen exprimiert wird. Das Gen für das Ratten-LFA-3 ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer X53526 offenbart und das Gen für das menschliche Homolog ist in der Zugriffsnummer Y00636 offenbart.
Das T-Zellen-Antigen 4-1BBL ist ein kostimulatorisches Molekül, das kostimulatorische Signale in antigenstimulierten primären T-Zellen-Kulturen und bei der lectingesteuerten Aktivierung von Thymozyten weiterleitet (Hurtado, J. C., u. a., J. Immunol. 158(6): 2600–2609, 1997). 4-1BBL gehört zu der Tumornekrosefaktor-Rezeptorüberfamilie, einer Gruppe Zystein-reicher Zellenoberflächenmoleküle (Vinay, D. S., u. a., Seminars in Immunology, 1998, Bd. 10, S. 481–489). Das Gen für Ratten-4-1BBL ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer U02567 offenbart. Das Gen für das menschliche Homolog hu4-1BBL ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer U03397 offenbart.
OX-40L ist ein Typ-II-Membranprotein mit beschränkter Homologie zu TNF und ist in vitro stimulatorisch zu OX-40⁺-T-Zellen. Die Ratten- und Menschen-OX-40L-cDNAs haben auf der Nukleotidebene 68 % Homologie und auf der Aminosäureebene 46 %. Menschliches OX-40L stimuliert ausschließlich menschliche T-Zellen, während Ratten-OX-40L sowohl menschliche als auch Mäuse-T-Zellen stimuliert. APC exprimiert OX-40L und kann während der Präsentation des Antigens zu CD4⁺-T-Zellen das OX-40L:OX40R-Signal übertragen. Die OX-40L-Signalisierung ist wichtig für die Differenzierung menschlicher Dendritenzellen und führt zur erhöhten Erzeugung von IL-12, TNF-α, IL-1B und IL-6. (Weinberg, A. D., u. a., 1998 Seminars in Immunology, Bd. 10: 471–480). OX-40L ist ein potentes kostimulatorisches Molekül für die Aufrechterhaltung primärer CD4⁺-T-Zellen-Reaktionen, das in Kombination mit B7-1 verwendet wird (Gramaglia, I., u. a., 1998, J. Immunology, Bd. 161: 6510-7).
Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können eine Expression von wenigstens drei oder mehr Fremdgenen, vorzugsweise von fünf oder mehr Fremdgenen, veranlassen. Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten irgendeinen Vektor, der eine funktionale Expression von drei kostimulatorischen Fremdmolekülgenprodukten in einer Wirtszelle veranlassen kann. Außer den Genen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, kann der Vektor ebenfalls die Expression wenigstens eines Fremdgens veranlassen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon sowie einen wählbaren Marker codiert.
Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Bakterienvektoren wie etwa Salmonellen, Virusvektoren, nukleinsäurebasierte Vektoren und dergleichen. Virusvektoren enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Pockenvirus, Herpesvirus, Adenovirus. Alphavirus, Retrovirus, Picornavirus, Iridovirus und dergleichen. Pockenviren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten replizierende und nicht replizierende Vektoren. Solche Pockenviren enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Orthopox wie etwa Impfpocken, Waschbärpocken, Hasenpocken und dergleichen, Avipox, Suipox, Capripox und dergleichen. Pockenviren können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Kopenhagen-Impfpocken, dem Wyeth-Impfpockenstamm, dem MVA-Impfpockenstamm, NYVAC, Geflügelpocken, TROVAC, Kanarienpocken, ALVAC, Schweinepocken und dergleichen ausgewählt sind. In einer Ausführungsform ist der rekombinante Vektor ein Impfpockenvirus. In einer weiteren Ausführungsform sind der rekombinante Vektor Geflügelpocken.
Ein bevorzugter Vektor der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Virus, vorzugsweise ein Pockenvirus. Die rekombinanten Pockenviren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, besitzen eine Anzahl von Eigenschaften, einschließlich (i) der effektiven Lieferung von Genen an drei Zellentypen einschließlich APC und Tumorzellen; (ii) hohe Niveaus der Proteinexpression; (iii) optimale Präsentation von Antigenen an das Immunsystem; (iv) die Fähigkeit, zellenübertragene Immunreaktionen sowie Antikörperreaktionen hervorzurufen; (v) eher vorübergehende als dauerhafte genetische Modifizierung von Zellen und (vi) die Fähigkeit, Kombinationen von Pockenviren von verschiedenen Genera zu verwenden, da sie nicht immunologisch kreuzreaktiv sind. Elternpockenviren, die bei der Konstruktion des rekombinanten Pockenvirus der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, das Orthopox-Virus wie etwa ein replizierendes Impfpockenvirus (Perkus, u. a., Science, 229: 981–984, 1985; Kaufmann, u. a., Int. J. Cancer 48: 900–907, 1991, Moss, Science, 252: 1662, 1991), hoch verstärkte Impfpockenviren wie etwa MVA, die modifizierten Ankara-Impfpocken (Sutter und Moss, Proc. Nat9 Acad. Sci. U.S.A. 89: 10847–10851; Sutter, u. a., Virology 1994), Kopenhagen-Impfpocken und NYVAC: Avipox-Viren (15) wie etwa Geflügelpockenvirus (15), Kanarienpockenviren wie etwa ALVAC und dergleichen (Baxby und Paoletti, Vaccine 10: 8–9, 1992; Rinns, M. M. u. a. (Hrsg.), Recombinat Poxviruses CRC Press, Inc, Boca Raton 1992; Paoletti, E., Proc. Nat9 Acad. Sci. USA 93: 11349–11353, 1996) und Suipox-Virus, Capripox-Virus und dergleichen.
In einer Ausführungsform ist das Elternpockenvirus ein Impfpockenvirus. In einer besonderen Ausführungsform ist das Impfpockenvirus ein Wyeth-Stamm oder ein Abkömmling davon. Ein Abkömmling des Wyeth-Stamms enthält, ist aber nicht beschränkt auf, vTBC33, bei dem ein funktionales K1L-Gen und dergleichen fehlt. In einer abermals weiteren Ausführungsform ist das Virus Dry-Vax, das als Pockenimpfstoff von den Centers for Disease Control, Atlanta, GA, verfügbar ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das Elternpockenvirus ein Stamm von Geflügelpocken, z. B. PDXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) und dergleichen.
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann Wirtszellen in einem Wirt infizieren, transfizieren oder transduzieren. Der Wirt enthält, ist aber nicht beschränkt auf, Säugetiere, Vögel, Fische und dergleichen. Die Wirtszellen sind irgendeine Zelle, die für eine Infektion, Transfektion oder Transduktion durch den rekombinanten Vektor zugänglich ist und die Fremdgene aus dem rekombinanten Vektor in funktionalen Niveaus exprimieren kann. Die Wirtszellen enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, professionelle APC und antigenpräsentierende Vorläuferzellen wie etwa Monozyten, Makrophagen, DC, Langerhans-Zellen und dergleichen. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls Tumorzellen oder andere Zellentypen wie etwa juvenile Bindegewebs- oder Muskelzellen infizieren. Die Infektion der Wirtszellen ermöglicht die Expression jedes exogenen kostimulatorischen Fremdmoleküls und die Expression der Fremdnukleinsäuresequenz, die eines oder mehrere Zielantigene codiert, falls in dem rekombinanten Vektor vorhanden. Die Wirtszellen exprimieren die geeigneten Moleküle der MHC-(HLA-) Klasse I oder II für geeignete Antigenpräsentation für CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen oder sind genetisch dafür manipuliert worden, sie zu exprimieren. Somit kann praktisch irgendeine Säugetierzelle genetisch manipuliert werden, um zu einer geeigneten antigenpräsentierenden Zelle zu werden, die drei kostimulatorische Moleküle exprimiert.
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens ein Expressionssteuerelement, das funktional mit der Nukleinsäuresequenz verknüpft ist. Die Expressionssteuerelemente sind in den Vektor eingeführt worden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu steuern und zu regeln (Ausubel, u. a., 1987, in "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York New York). Expressionssteuerelemente sind im Gebiet bekannt und enthalten Promotoren. Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind Pockenviruspromotoren, wie sie im Gebiet gut bekannt sind, die 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K, C1 und dergleichen enthalten, sind darauf aber nicht beschränkt. Die Nukleinsäuresequenz des 30K-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer M35027 unter den Basennummern 28012 bis 28423 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz von I3 ist in der GenBank-Zugriffsnummer J03399 bei den Basennummern 1100 bis 1301 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz des 7.5K-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer M35027 unter den Basennummern 186550 bis 186680 offenbart. Die Nukleinsäuresequenz des 40K-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer Nr. M13209 bei den Basennummern 9700 bis 9858 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz des C1-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer Nr. M59027 unter den Basennummern 1 bis 242 und im US-Patent Nr. 5.093.258 offenbart. Die Sequenz des sE/L-Promotors ist in Literaturhinweise 16 offenbart. Es können weitere Pockenviruspromotoren wie etwa die von Davison und Moss (J. Mol. Biol. 210:749–769, (1989)) beschriebenen verwendet werden. Jeder dieser Promotoren kann unter Verwendung von Standardverfahren im Gebiet synthetisiert werden. Die Auswahl eines geeigneten Promotors beruht auf seinem Zeitpunkt und Expressionsniveau. Early- oder Early/Late-Promotoren sind bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht der genutzte Promotor oder die genutzte Kombination von Promotoren eine optimale Expression jedes kostimulatorischen Moleküls in einem infizierten Wirt, um eine synergistische Immunreaktion zu liefern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedes Fremdgen, das ein kostimulatorisches Molekül codiert, durch einen getrennten und verschiedenen Promotor gesteuert.
Im Fall nukleinsäurebasierter Vektoren können die Konstrukte entweder Nukleinsäure (DNA oder RNA) oder einem Lipidträger zugeordnet oder in einem Lipidträger gekapselt sein. Optional kann das Lipidträgermolekül und/oder -konstrukt in einem besonderen Zielzellentyp oder in besonderen Zieltypen eine Zielbildung und/oder Expression liefern. Nackte DNA-Vektoren können durch Verfahren vorbereitet werden, die im US-Patent Nr. 5.827.703 beschrieben sind. Für das Transkriptionsinitiationsgebiet oder für das Promotorelement kann unter der Bedingung, dass es das gewünschte Niveau der Transkription der interessierenden DNA-Sequenz liefert, irgendein Gebiet verwendet werden. Das Transkriptionsinitiationsgebiet kann nativ oder homolog zu der Wirtszelle und/oder zu der transkribierenden DNA sein oder kann fremd oder heterolog zu der zu transkribierenden Wirtszelle und/oder DNA-Sequenz sein. Effiziente Promotorelemente für die Transkriptionsinitiierung nackter DNA enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, den SV40-Early-Promotor (Affenvirus-40-Early-Promotor), den RSV-Promotor (Rous-Sarcoma-Virus-Promotor), den Adenovirus-Major-Late-Promotor, den menschlichen CMV-(Cytomegalievirus-)Immediate-Early-I-Promotor und dergleichen. Nukleinsäurebasierte Vektoren können an einen Wirt unter Verwendung einer Spritze, eines Katheters oder einer nadelfreien Injektionsvorrichtung wie etwa einer Genpistole geliefert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinanter Vektor geschaffen, der eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein erstes kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung eines ersten Promotors codiert, eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein zweites kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung eines zweiten Promotors codiert, und eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein drittes kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung eines dritten Promotors codiert, umfasst. Ferner kann der rekombinante Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz liefern, die ein Zielantigen oder einen immunologischen Abschnitt davon unter der Steuerung eines vierten Promotors codiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Pockenvirus geschaffen, das eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung eines 30K-Pockenviruspromotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung eines I3-Pockenviruspromotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung eines sE/L-Pockenviruspromotors codiert, umfasst. Ein Beispiel eines solchen rekombinanten Pockenviruskonstrukts sind die wie in 11A gezeigten Impfpocken vT171. Ferner kann das rekombinante Pockenvirus eine Nukleinsäuresequenz liefern, die ein tumorassoziiertes Antigen oder einen immunologischen Abschnitt davon codiert. Eine Ausführungsform der Erfindung sind die wie in 4C gezeigten rekombinanten Impfpocken vT172.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Pockenvirus geschaffen, das eine Nukleinsäuresequenz, die B7.1 unter der Steuerung eines sE/L-Pockenviruspromotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Pockenviruspromotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 7.5K-Pockenviruspromotors codiert, umfasst. Optional umfasst das Konstrukt ferner eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, und/oder eine Nukleinsäuresequenz, die einen wählbaren Marker codiert. Eine Ausführungsform eines solchen rekombinanten Pockenviruskonstrukts sind die wie in 4B gezeigten Impfpocken vT199, die ein lacZ-Gen als den wählbaren Marker enthalten.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein rekombinantes Geflügelpockenvirus eine Nukleinsäuresequenz, die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des sE/L-Pockenviruspromotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Pockenviruspromotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 7.5K-Pockenviruspromotors codiert. Ein Beispiel dieser Ausführungsform sind die wie in 4A gezeigten Geflügelpocken vT222. Ein rekombinantes Geflügelpockenvirus kann ferner eine Nukleinsäuresequenz, die ein Zielantigen CEA unter der Steuerung des 40K-Pockenviruspromotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die den wählbaren Marker lacZ unter der Steuerung des C1-Pockenviruspromotors codiert, umfassen. Ein Beispiel dieser Ausführungsform sind die wie in 4B gezeigten Geflügelpocken vT194.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein rekombinantes Geflügelpockenvirus, wie in 14C gezeigt ist, eine Nukleinsäuresequenz, die das tumorassoziierte Antigen MUC-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 40K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 30K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert. Wie in 4D gezeigt ist, kann das rekombinante Geflügelpockenvirus eine Nukleinsäuresequenz, die irgendein tumorassoziiertes Antigen oder einen Abschnitt davon codiert, und Nukleinsäuresequenzen, die LFA-3, ICAM-1 und B7.1 unter der Steuerung mehrerer Promotoren codieren, umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der Nukleinsäuresequenzen umfasst, die die menschlichen Homologe der kostimulatorischen Moleküle LFA-3, B7 und ICAM-1 codieren. Der rekombinante Vektor kann ferner die geeigneten Promotoren liefern, um die Expression jeder Sequenz in einer infizierten Wirtszelle zu ermöglichen. Eine Ausführungsform des rekombinanten Vektors ist der in 9 gezeigte vT224.
Die vorliegende Erfindung schafft Plasmidvektoren, die eine Fremdnukleinsäuresequenz umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codiert. In einer Ausführungsform werden Fremdnukleinsäuresequenzen ausgewählt, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L und dergleichen besteht. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Plasmidvektoren geschaffen, die eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein kostimulatorisches B7-Molekül codiert, eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein kostimulatorisches ICAM-1-Molekül codiert, und eine Fremdnukleinsäuresequenz, die ein kostimulatorisches LFA-3-Molekül codiert, umfassen. Ferner liefern die Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung wenigstens eine Promotorsequenz zum Steuern der Expression der kostimulatorischen Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jede Nukleinsäuresequenz, die ein kostimulatorisches Molekül codiert, durch eine getrennte diskrete Promotorsequenz gesteuert. Zur Verwendung bei der Herstellung eines rekombinanten Pockenvirus liefern die Plasmidvektoren der vorliegenden Entfernung ferner flankierende Virusnukleinsäuresequenzen aus einem unwesentlichen Gebiet eines Pockenvirusgenoms. Die flankierenden Virusnukleinsäuresequenzen lenken die Einführung der Fremdsequenzen in ein Elternpockengenom über homologe Rekombination. Die Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung können ferner einen oder mehrere wählbare Marker zur Auswahl und Identifizierung der rekombinanten Nachkommen, die die eingeführte Fremd-DNA enthalten, wie sie im Gebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichsgen, das E.-coli-lacZ-Gen, antibiotikaresistente Gene, das Gen, das β-Glucuronidase codiert, und dergleichen umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst ein Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 unter der Steuerung des 30K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 unter der Steuerung des I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, flankiert von Abschnitten des Hind-III-M-Gebiets des Impfpockengenoms. In einer Ausführungsform ist der Plasmidvektor wie in 1 als pT5032 gezeigt.
Eine weitere Ausführungsform des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 unter der Steuerung des I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 unter der Steuerung des 7.5K-Promotors codiert. Der Plasmidvektor kann ferner ein lacZ-Gen oder einen Abschnitt davon umfassen, das/der durch eine andere Promotorsequenz gesteuert wird. Diese Sequenzen werden von Abschnitten des Hind-III-J-Gebiets des Impfpockengenoms flankiert. Eine besondere Ausführungsform des Plasmidvektors ist in 2 als pT5047 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Plasmidvektor in Kombination mit den Nukleinsäuresequenzen, die B7, ICAM-1 und LFA-3 codieren, eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Zum Steuern der Expression des Zielantigens ist ein Promotor vorgesehen. Eine besondere Ausführungsform des Plasmidvektors ist in 3 als pT5031 gezeigt und umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die das Zielantigen CEA codiert.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst der Plasmidvektor eine Nukleinsäuresequenz, die das tumorassoziierte Antigen CEA unter der Steuerung des 40K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 unter der Steuerung eines I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 codiert. Ferner kann der wie in 6 als pT5049 gezeigte Plasmidvektor ein lacZ-Gen unter der Steuerung eines C1-Promotors umfassen. Das Plasmid pT5049 wurde am 13. November 1998 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, als ATCC-Zugriffsnummer 203481 hinterlegt.
In einer abermals weiteren Ausführungsform des Plasmidvektors umfasst der Vektor eine Nukleinsäuresequenz, die huLFA-3 unter der Steuerung des 30K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die hulCAM-1 unter der Steuerung eines I3-Promotors und huB7.1 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert. Eine besondere Ausführungsform des Plasmidvektors, die am 13. November 1998 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der ATCC als ATCC-Zugriffsnummer 203482 hinterlegt wurde, ist in 8 als pP5064 gezeigt.
Der Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung kann in Ausrüstungsform zur Verwendung in Verfahren zum Erzeugen rekombinanter Vektoren bereitgestellt werden. Die Ausrüstung kann ferner ein Elternvirus und weitere in dem Rekombinationsprozess verwendete Reagenzien bereitstellen.
Ferner schafft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erzeugen rekombinanter Pockenviren, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren. Ein Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten Pocken virus wird wie im US-Patent Nr. 5.093.258 offenbart über homologe Rekombination in vivo zwischen Elternpockenvirusgenom-DNA und einem Plasmidvektor, der die einzuführenden heterologen Sequenzen trägt, ausgeführt. Plasmidvektoren für die Einführung von Fremdsequenzen in Pockenviren werden durch Standardverfahren der Technologie rekombinanter DNA (36) konstruiert. Die Plasmidvektoren enthalten eines oder mehrere Chimärenfremdgene, die jeweils einen Pockenviruspromotor, der mit einer Proteincodierungssequenz verknüpft ist, umfassen, flankiert von Virussequenzen von einem unwesentlichen Abschnitt des Pockenvirusgenoms. Das Plasmid wird unter Verwendung von im Gebiet akzeptierten Transfektionsverfahren in Zellen transfiziert, die mit dem Elternpockenvirus infiziert worden sind, wobei die Rekombination zwischen Pockenvirussequenzen an dem Plasmid und der entsprechenden DNA in dem Elternvirusgenom zur Einführung der Chimärenfremdgene von dem Plasmid in das Virusgenom führt. Die rekombinanten Viren werden unter Verwendung irgendeines einer Vielzahl von Auswahl- oder Siebungssystemen, wie sie im Gebiet bekannt sind (14), ausgewählt und gereinigt. Die Einführung der Fremdgene in das Impfpockengenom wird durch Polymerasekettenreaktionsanalyse (PCR-Analyse) bestätigt. Die Expression der Fremdgene wird durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Ein alternatives Verfahren der Erzeugung rekombinanter Pockenviren wird durch direkte Ligation ausgeführt (Pleiderer u. a., J. Gen. Virol. 76:2957–2962, 1995; Merchlinsky u. a., Virol. 238:444–451, 1997).
Die Verwendung des rekombinanten Vektors, der Nukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, in Kombination mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein Epitop davon codiert, umfasst, ist brauchbar bei der Verbesserung einer Immunreaktion gegen das Zielantigen oder ein Epitop davon und bei der Verbesserung der Immunreaktion gegen Zellen, die das Zielantigen oder ein Epitop davon exprimieren. Die Stärke der Immunreaktion gegen das Zielantigen, Epitop oder Zellen, die das Zielantigen exprimieren, die unter Verwendung des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung erhalten wird, ist wesentlich größer als die, die unter Verwendung von Systemen erzielt wird, die ein einzelnes oder doppeltes kostimulatorisches Molekül nutzen.
Der rekombinante Vektor codiert drei kostimulatorische Moleküle in Kombination mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, um eine synergistische Immunreaktion auf das Zielantigen oder Epitop davon zu liefern. In einer Ausführungsform schafft ein rekombinantes Pockenvirus eine Nukleinsäuresequenz, die B7, ICAM-1 und LFA-3 codiert, zusammen mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. In einigen Fällen kann es brauchbar sein, mehr als eine Nukleinsäuresequenz zu liefern, um drei Zielantigene oder immunologische Epitope davon zu liefern, um einen mehrwertigen Impfstoff zu haben.
Das Zielantigen, wie es hier verwendet wird, ist ein Antigen oder ein immunologisches Epitop auf das Antigen, das wesentlich bei der Immunerkennung und schließlich -beseitigung oder -steuerung des die Krankheit verursachenden Mittels oder des Erkrankungszustands in einem Säugetier ist. Die Immunerkennung kann zellular und/oder humoral sein. Im Fall intrazellularer Krankheitserreger und von Krebs ist die Immunerkennung vorzugsweise eine T-Lymphozyten-Reaktion.
Das Zielantigen kann von einem pathogenen Mikroorganismus wie etwa von Viren einschließlich HIV (Korber u. a., Hrsg., HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1977), Grippe, Herpes simplex, des menschlichen Papillomavirus ( US-Patent Nr. 5.719.054 ), Hepatitis B ( US-Patent Nr. 5.780.036 ), Hepatitis C ( US-Patent Nr. 5.709.995 ), EBV, des Cytomegalievirus (CMV) und dergleichen abgeleitet oder isoliert werden. Das Zielantigen kann aus pathogenen Bakterien wie etwa Chlamydia ( US-Patent Nr. 5.869.608 ), Mykobakterien, Legionellen, Meningokokken, Streptokokken der Gruppe A, Salmonellen, Listeria, Hemophilus influenzae ( US-Patent Nr. 5.955.596 ) und dergleichen abgeleitet oder isoliert werden.
Das Zielantigen kann von einer pathogenen Hefe einschließlich Kolbenschimmel, invasiver Candida ( US-Patent Nr. 5.645.992 ), Nocardia, Histoplasmose Cryptosporidia und dergleichen abgeleitet oder isoliert sein sein.
Das Zielantigen kann von einem pathogenen Protozoon und von pathogenen Parasiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Pneumocystis carinii, Trypasosoma, Leishmania ( US-Patent Nr. 5.965.242 ), Plasmodium ( US-Patent Nr. 5.589.343 ) und Toxoplasma gondii abgeleitet oder isoliert sein.
Das Zielantigen enthält ein Antigen, das einem präneoplastischen oder hyperplastischen Zustand zugeordnet ist. Das Zielantigen kann ebenfalls einem Krebs zugeordnet sein oder einen Krebs verursachen.
Dieses Zielantigen kann ein tumorspezifisches Antigen, ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) oder ein gewebespezifisches Antigen, ein Epitop davon und ein Epitopagonist davon sein. Diese Zielantigene enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, ein carcinoembryonales Antigen (CEA) und Epitope davon wie etwa CAP-1, CAP-1-6D (46) und dergleichen (GenBank-Zugriffsnummer M29540), MART-1 (Kawakami u. a., J. Exp. Med. 180:347–352, 1994), MAGE-1 ( US-Patent Nr. 5.750.395 ), MAGE-3, GAGE ( US-Patent Nr. 5.648.226 ), GP-100 (Kawakami u. a. Proc. Nat'l Acad. Sci USA 91:6458–6462, 1992), MUC-1, MUC-2, ein punktmutiertes RAS-Onkogen, normale und punktmutierte p53-Onkogene (Hollstein u. a., Nucleic Acids Res., 22:3551–3555, 1994), PSMA (Israeli u. a. Cancer Res. 53:227–230, 1993), Tyrosinase (Kwon u. a. PNAS 84:7473–7477, 1987), TRP-1 (gp75)(Cohen u. a., Nucleic Acid Res. 18:2807–2808, 1990; US-Patent Nr. 5.840.839 ), NY-ESO-1 (Chef u. a. PNAS 94:1914–1918, 1997), TRP-2 (Jackson u. a. EMBOJ 11:527–535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, ( US-Patent Nr. 5.550.214 ), BRC-I, BRC-II, brc-abl, pax3-fkhr, ewsfli-1, Modifikationen von TAAs und gewebespezifischem Antigen, Spleißvarianten von TAAs, Epitopagonisten und dergleichen. Weitere TAAs können durch im Gebiet bekannte Verfahren wie etwa jene, die im US-Patent Nr. 4.514.506 offenbart sind, identifiziert, isoliert und geklont werden. Das Zielantigen kann außerdem einen oder mehrere Wachstumsfaktoren und Spleißvarianten von jedem enthalten.

Mögliche menschliche Tumorantigene und gewebespezifische Antigene sowie immunologische Epitope davon zur Zielsetzung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die beispielhaft in Tabelle 1 erläutert sind. Tabelle 1 Antigene und Epitope, die durch T-Zellen erkannt werden

Zielantigene	Restriktionselement	Immunologisches Peptidepitop	lfd.ID-Nr.
Durch T-Zellen erkannte menschliche Zieltumorantigene
gp 100	HLA-A2	KTWGQYWZY
	HLA-A2	ITDQVPPSV	2
	HLA-A2	YLEPGPVTA	3
	HLA-A2	LLDGTATLRL	4
	HLA-A2	VLYRYGSFSV	5
MART1-/Melan A	HLA-A2	AAGIGILTV	6
	HLA-A2	ILTVILGVL	7
TRP-1 (GP75)	HLA-A31	MSLQRQFLR	8
Tyrosinase	HLA-A2	MLLAVLYCL	9
	HLA-A2	YMNGTMSQV	10
	HLA-B44	SEIWRDIDF	11
	HLA-A24	AFLPWHRLF	12
	HLA-DR4	QNILLSNAPLGPQFP	13
	HLA-DR4	SVLQDSDPDSFQD	14
MAGE-1	HLA-A1	EADPTGHSY	15
	HLA-Cw16	SAYGEPRKL	16
MAGE-3	HLA-A1	EVDPIGHLY	17
	HLA-A2	FLWGPRALV	18
BAGE	HLA-Cw16	AARAVFLAL	19
GAGE-1,2	HLA-Cw6	YRPRPRRY	20
N-Metylglucosaminyltransferase-V	HLA-A2	VLPDVFIRC	21
p15	HLA-A24	AYGLDFYIL	22
CEA		YLSGANLNL(CAP1)	23
		YLSGADLNL (CAP1-6D)	24
			37
β-Catenin	HLA-A24	SYLDSGIHF	25
MUM-1	HLA-B44	EEKLIVVLF	26
CDK4	HLA-A2	ACDPHSGHFV	27
HER-2/neu	HLA-A2	IISAVVGIL	28
(Brust- und Eierstockkarzinom)	HLA-A2	KIFGSLAFL	29
menschl. Papillomavirus
E6,E7	HLA-A2	YMLDLQPETT	30
(Gebärmutterhalskrebs)
MUC-1	Nicht MHC-beschränkt	PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA	31
	MHC-beschränkt	(und Abschnitte davon)
(Brust- Eierstock- und
Bauchspeicheldrüsenkarzinom
PSA	A2, A3	FLTPKKLQCVDLHVISNDVCA-	32
		QVHPQKVTK
		FLTPKKLQCV	33
		KLQCVDLHV	34
		VISNDVCAQV	35
		QVHPQKVTK	36

Für Organismen, die ein DNA-Genom enthalten, wird aus der Genom-DNA ein Gen isoliert, das ein interessierendes Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Für Organismen mit RNA-Genomen kann das gewünschte Gen aus cDNA-Kopien des Genoms isoliert werden. Falls Restriktionskarten des Genoms verfügbar sind, wird das DNA-Fragment, das das interessierende Gen enthält, durch Restriktionsendonukleasedigestion durch Routineverfahren im Gebiet abgetrennt. In Fällen, in denen das gewünschte Gen zuvor geklont worden ist, können die Gene leicht aus den verfügbaren Klonen erhalten werden. Falls die DNA-Sequenz des Gens bekannt ist, kann das Gen alternativ durch irgendeine der herkömmlichen Techniken für die Synthese von Desoxyribonukleinsäuren synthetisiert werden.
Gene, die ein interessierendes Antigen codieren, können durch Klonen des Gens in einem Bakterienwirt verstärkt werden. Zu diesem Zweck können verschiedene prokaryontische Klonvektoren verwendet werden. Beispiele sind die Plasmide pBR322, pUC und pEMBL.
Die Gene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, können durch Standardtechniken für die Einführung in die für die Rekombination mit einem Virus bestimmtem Plasmidvektoren vorbereitet werden. Im Allgemeinen können die geklonten Gene durch Restriktionsenzymdigestion aus dem prokaryontischen Klonvektor herausgeschnitten werden. In den meisten Fällen enthält das herausgeschnittene Fragment das gesamte Codierungsgebiet des Gens. Das DNA-Fragment, das das geklonte Gen trägt, kann nach Bedarf wie hier beschrieben modifiziert werden, um z. B. die Enden des Fragments mit den Einführungsstellen der DNA-Vektoren, die für die Rekombination mit einem Virus verwendet werden, kompatibel zu machen, und daraufhin vor der Einführung in die Vektoren bei den Restriktionsendonuklease-Abtrennungsstellen (Klonungsstellen) gereinigt werden.
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können Erkrankungen behandelt oder verhindert werden, die Erkrankungen enthalten, die durch Viren, Bakterien, Hefe, Parasiten, Protozoen, Krebszellen und dergleichen verursacht werden. Der rekombinante Vektor, der drei kostimulatorische Moleküle umfasst, kann als ein verallgemeinertes Immunverbesserungsmittel verwendet werden und besitzt somit Nützlichkeit bei der Behandlung von Erkrankungen ohne bekannte ätiologische Ursache.
Präneoplastische oder hyperplastische Zustände, die unter Verwendung eines rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden können, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, präneoplastische oder hyperplastische Zustände wie etwa Dickarmpolypen, die Crohn-Krankheit, Colitis ulcerosa/gravis, Brustschädigungen und dergleichen.
Krebse, die unter Verwendung des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, ein primäres oder Metastasen-Melanom, ein Adenokarzinom, ein Plattenepithelkarzinom, ein Adenoplattenzellenkarzinom, eine Thymus-Geschwulst, einen Lymphknotentumor, ein Sarkom, Lungenkrebs, Leberkrebs, Nicht-Hodgkins-Lymphknotenkrebs, Hodgkins-Lymphknotenkrebs, Leukämien, Gebärmutterkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Dickdarmkrebs, Drei-Myelom, Neuroblastom, NPC, Blasenkrebs, Gebärmutterhalskrebs und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Drei Gene, die ein kostimulatorisches Molekül codieren, bilden einen Teil des rekombinanten Vektors und können aus der Gruppe von Genen ausgewählt werden, die B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L und dergleichen codieren. Ferner kann der rekombinante Vektor eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Arzneimittelzusammensetzung einen ersten rekombinanten Vektor, der Fremdgene umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, einen zweiten rekombinanten Vektor, der Nukleinsäuresequenzen umfasst, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Verabreichung der Arzneimittelzusammensetzung stellt für Wirtzellen die Fremdgene bereit, die drei kostimulatorische Moleküle codieren.
In einer Ausführungsform umfasst eine Arzneimittelzusammensetzung ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, enthält, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Das rekombinante Pockenvirus kann ferner eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen oder alternativ kann ein zweites rekombinantes Pockenvirus bereitgestellt sein, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung, die ein rekombinantes Pockenvirus, das eine Nukleinsäuresequenz, die B7.1 bis B7.2 codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die LFA-3 codiert, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Zusätzlich zu dem B7-, ICAM-1-, LFA-3-Konstrukt kann das rekombinante Pockenvirus der Arzneimittelzusammensetzung außerdem eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, oder kann die Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, in der Zusammensetzung durch ein zweites rekombinantes Pockenvirus bereitgestellt sein.
Außerdem kann die Arzneimittelzusammensetzung für zusätzliche Synergie oder Verbesserung einer Immunreaktion exogen hinzugefügte immunstimulatorische Moleküle, wie sie im Gebiet bekannt sind, einschließlich der kostimulatorischen Moleküle B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40-L und dergleichen, und/oder Cytokine und Chemokine einschließlich, aber nicht beschränkt auf, IL2, GM-CSF, TNFα, IFNγ, IL-12, RANTES, MIP-1α, Flt-3L ( US-Patent Nr. 5.554.512 ; 5.843.423 ) und dergleichen enthalten. Die Cytokine und Chemokine selbst können in der Zusammensetzung bereitgestellt sein oder alternativ können die Cytokine und Chemokine durch einen rekombinanten Virusvektor, der das Cytokin oder Chemokin codiert, bereitgestellt sein.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung hier offenbarte Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die durch pathogene Mikroorganismen oder durch Krebs verursacht wird.
In dem Behandlungsverfahren kann die Verabreichung des rekombinanten Vektors der Erfindung entweder zum "prophylaktischen" oder zum "therapeutischen" Zweck erfolgen. Wenn der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung prophylaktisch gegeben wird, wird er vor irgendeinem Symptom gegeben. Die prophylaktische Verabreichung des rekombinanten Vektors dient zur Verhinderung oder Milderung irgendeiner nachfolgenden Infektion oder Erkrankung. Wenn der rekombinante Vektor therapeutisch gegeben wird, wird er bei oder nach Einsetzen eines Infektions- oder Erkrankungssymptoms gegeben. Somit kann die vorliegende Erfindung entweder vor der erwarteten Gefährdung durch ein krank machendes Mittel oder einen Erkrankungszustand oder nach Beginn der Infektion oder Erkrankung gegeben werden.
Der Begriff "Einheitsdosis", wie er sich auf das Inokulum bezieht, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für Säugetiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorgegebene Menge des rekombinanten Vektors enthält, die so berechnet wird, dass sie im Zusammenhang mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel die gewünschte immunogene Wirkung erzeugt. Die Spezifikationen für die neue Einheitsdosis eines Inokulums dieser Erfindung werden durch die eindeutigen Eigenschaften des rekombinanten Virus und die besondere zu erzielende immunologische Wirkung vorgeschrieben und hängen davon ab.
Das Inokulum wird üblicherweise als eine Lösung in einem tolerierbaren (akzeptablen) Verdünnungsmittel wie etwa Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder in einem anderen physiologisch tolerierbaren Verdünnungsmittel und dergleichen zubereitet, um eine wässrige Arzneimittelzusammensetzung zu bilden.
Der Beimpfungsweg kann Hautritzung, intravenös (IV), intramuskulär (IM), subkutan (SC), intradermal (ID), intraperitoneal (IP), intratumoral und dergleichen sein, was dazu führt, dass eine Schutzreaktion gegen das krankheitsverursachende Mittel hervorgerufen wird. Die Dosis wird wenigstens einmal verabreicht. Nachfolgende Dosen können wie angegeben verabreicht werden.
In einer Ausführungsform werden heterologe Primärbeschleunigungsregimes genutzt. In einem Beispiel wird der Wirt wenigstens einmal mit einem ersten Vektor wie etwa mit einem nukleinsäurebasierten Vektor immunisiert. Nachfolgende Immunisierungen werden mit einem Pockenvirusvektor ausgeführt. In einem weiteren Beispiel wird der Wirt zuerst mit einem ersten Pockenvirusvektor und daraufhin mit einem zweiten Pockenvirusvektor einer anderen Gattung immunisiert.
Bei der Gabe des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, vorzugsweise an einen Menschen, ändert sich die Dosierung des verabreichten rekombinanten Vektors je nach solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, der allgemeinen medizinischen Bedingung, der medizinischen Vorgeschichte, des Erkrankungsfortschritts, der Tumorbelastung und dergleichen des Säugetiers.
Im allgemeinen ist erwünscht, an den Empfänger eine Dosis des rekombinanten Vektors in dem Bereich von etwa 10⁵ bis 10¹⁰ Plaque-bildende Einheiten zu geben, obgleich eine niedrigere oder eine höhere Dosis verabreicht werden kann.
Die genetische Definition tumorassoziierter und tumorspezifischer Antigene ermöglicht die Entwicklung gezielter antigenspezifischer Impfstoffe für die Krebstherapie. Die Einführung eines Tumorantigen-Gens in das Genom rekombinanter Pockenviren in Kombination mit Genen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, ist ein leistungsfähiges System, um hinsichtlich der Prävention bei Personen mit einem erhöhten Risiko der Krebsentwicklung eine spezifische Immunreaktion hervorzurufen (präventive Immunisierung), um Tumoren vor der Operation zu verkleinern, um die Erkrankungswiederkehr nach der Hauptoperation zu verhindern (Anti-Metastasen-Schutzimpfung), oder um die Anzahl zytotoxischer Lymphozyten (CTL) in vivo zu expandieren und somit ihre Effektivität bei der Vernichtung diffuser Tumoren zu verbessern (Behandlung der ausgebrochenen Erkrankung). Rekombinante Viren der vorliegenden Erfindung können in autogenen Lymphozyten (CD8⁺), entweder zytotoxischen T-Lymphozyten und/oder CD4⁺-T-Helferzellen oder -NK-Zellen ex vivo eine Immunreaktion hervorrufen, bevor sie zu dem tumortragenden Patienten zurück übertragen werden (adoptive Immuntherapie).
In Krebsbehandlungen können die rekombinanten Vektoren entweder vor irgendeiner Erscheinung von Krebsen wie etwa eines Adenokarzinoms oder, um eine Rückbildung der Erkrankung in einem mit einem Krebs wie etwa einem Adenokarzinom betroffenen Säugetier herbeizuführen, in ein Säugetier eingeführt werden.
Je nach der Erkrankung oder Bedingung, die zu behandeln ist, und dem Behandlungsverfahren kann der rekombinante Vektor zusätzlich zu den Genen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, eine Nukleinsäuresequenz, die ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen oder nicht umfassen. Das Zielantigen oder das immunologische Epitop davon kann endogen durch die mit dem rekombinanten Vektor infizierte Wirtszelle geliefert werden, während z. B. eine Tumorzelle endogen ein tumorassoziiertes Antigen oder ein Epitop davon exprimieren kann und keine Zugabe eines Fremdgens, das ein exogenes tumorassoziiertes Antigen codiert, zu erfordern braucht. Falls ein tumorassoziiertes Antigen in einer Wirtszelle fehlt, nicht exprimiert wird oder in niedrigen Pegeln exprimiert wird, kann ein Fremdgen geliefert werden, das ein exogenes tumorassoziiertes Antigen codiert. Ferner können Gene geliefert werden, die mehrere verschiedene tumorassoziierte Antigene codieren. Das Fremdgen, das ein exogenes tumorassoziiertes Antigen codiert, kann durch den gleichen rekombinanten Vektor geliefert werden, der Gene umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle umfassen, oder kann durch einen zweiten rekombinanten Vektor in einem Gemisch mit dem ersten rekombinanten Vektor geliefert werden.
Beispiele von Verfahren zur Verabreichung des rekombinanten Vektors in Säugetieren enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, dass Tumorzellen dem rekombinanten Virus ex vivo ausgesetzt werden, oder die Injektion des rekombinanten Vektors in den betroffenen Wirt durch intravenöse, SC-, ID- oder IM-Verabreichung des Virus. Alternativ kann der rekombinante Vektor oder die Kombination rekombinanter Vektoren lokal durch direkte Injektion in die Krebsverletzung oder den Tumor oder durch örtliche Applikation in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden. Die Menge des zu verabreichenden rekombinanten Vektors, der die Nukleinsäuresequenz eines oder mehrerer tumorassoziierter Antigene (TAAs) in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen, die drei zu verabreichende kostimulatorische Moleküle codieren, trägt, beruht auf dem Titer der Viruspartikel. Ein bevorzugter Bereich des zu verabreichenden Immunogens sind 10⁵ bis 10¹⁰ Viruspartikel pro Säugetier, vorzugsweise ein Mensch. Falls das zu immunisierende Säugetier bereits an Krebs oder an metastatischem Krebs leidet, kann der Impfstoff in Verbindung mit anderen therapeutischen Behandlungen verabreicht werden.
In einem Behandlungsverfahren können autogene zytotoxische Lymphozyten oder tumorinfiltrierende Lymphozyten aus Blut, Lymphknoten, einem Tumor und dergleichen von einem Patienten mit Krebs erhalten werden. Die Lymphozyten werden in Kultur gezüchtet und die zielantigenspezifischen Lymphozyten werden durch Kultivieren in Anwesenheit des spezifischen Zielantigens und entweder antigenpräsentierender Zellen, die drei kostimulatorische Fremdmoleküle exprimieren, oder der zielantigengepulsten APCs der vorliegenden Erfindung expandiert. Daraufhin werden die zielantigenspezifischen Lymphozyten wieder in den Patienten zurück infundiert.
Nach der Immunisierung kann die Effektivität des Impfstoffs durch die Herstellung von Antikörpern oder Immunzellen, die das Antigen erkennen, beurteilt werden, wie sie durch die spezifische Lyseaktivität oder durch die spezifische Cytokin-Produktion oder durch Tumorrückbildung beurteilt wird. Der Fachmann kennt die herkömmlichen Verfahren zur Beurteilung der oben erwähnten Parameter.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zum Verbessern der antigenspezifischen T-Zellen-Reaktionen durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines rekombinanten Vektors, der drei kostimulatorische Fremdmoleküle und ein Zielantigen codiert, in ein Säugetier allein oder durch Infizieren einer Zielzelle mit dem Vektor, mit dem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird ein rekombinanter Vektor, der ein Molekül aus der B7-Familie, ICAM-1 und LFA-3 codiert, allein oder gemischt mit einer Zielzelle, mit einem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon verabreicht. Der Immunisierungszugang ergänzt oder verbessert die Immunreaktionen, die durch das Zielantigen erzeugt werden, wobei er im Vergleich zur Verwendung einzelner oder doppelter kostimulatorischer Moleküle eine synergistische Reaktion schafft. Das Verfahren des Verabreichens eines rekombinanten Vektors, der Gene enthält, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, führt im Vergleich zur Verwendung eines rekombinanten Vektors, der ein einzelnes oder doppeltes kostimulatorisches Molekül codiert, zur erhöhten zielantigenspezifischen Lymphoproliferation, zur verbesserten cytolytischen Aktivität, zur verbesserten Cytokin-Absonderung und zu länger anhaltender Immunität für das Zielantigen. Ferner kann der rekombinante Vektor für die synergistische Verbesserung der zielantigenspezifischen Immunreaktionen eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen. Alternativ wird die Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, durch einen zweiten rekombinanten Vektor geliefert, der von dem Vektor, der die drei kostimulatorischen Moleküle codiert, verschieden ist. In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Verbessern antigenspezifischer T-Zellen-Reaktionen werden Säugetiere, vorzugsweise Menschen, mit einem rV-HIV-1-Epitop/B7-1/ICAM-1/LFA-3-Konstrukt immunisiert. Die Wirksamkeit der Behandlung kann in vitro und/oder in vivo durch Bestimmung der zielantigenspezifischen Lymphoproliferation, der zielantigenspezifischen Cytolyse-Reaktion, der klinischen Reaktionen und dergleichen überwacht werden.
Das Verfahren zum Verbessern antigenspezifischer T-Zellen-Reaktionen kann für irgendein Zielantigen oder immunologisches Epitop davon verwendet werden. Von besonderem Interesse sind tumorassoziierte Antigene, gewebespezifische Antigene und Antigene infektiöser Mittel.
Je nach der zu behandelnden Bedingung können zusätzlich zur Verabreichung des rekombinanten Vektors an den Patienten weitere exogene Immunmodulatoren oder immunstimulatorische Moleküle, chemotherapeutische Arzneimittel, Antibiotika, Antimykotika, antivirale Arzneimittel und dergleichen allein oder in Kombination davon verabreicht werden. Beispiele weiterer exogen zugegebener Mittel enthalten exogenes IL-2, IL-6, Alfa-, Beta- oder Gamma-Interferon, GM-CSF, Tumornekrosefaktor, Flt-3L, Cyclophosphamid, Cisplatin, Gancyclovir, Amphotericin B, 5-Fluorouracil und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung schafft Wirtszellen, die drei exogene kostimulatorische Fremdmoleküle exprimieren, in denen die Moleküle durch einen rekombinanten Vektor geliefert werden, der Fremdnukleinsäuresequenzen besitzt, die drei kostimulatorische Moleküle codieren. Die Wirtszellen können außerdem eines oder mehrere endogene Zielantigene oder immunologische Epitope davon exprimieren oder können genetisch manipuliert worden sein, um eines oder mehrere exogene Fremdzielantigene oder immunologische Epitope davon zu exprimieren, die ebenfalls durch einen rekombinanten Vektor, der drei kostimulatorische Moleküle codiert, oder durch einen zweiten rekombinanten Vektor bereitgestellt werden können.
Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung, die beim Stimulieren einer antigenspezifischen Immunreaktion genutzt werden können, können irgendeine Zelle sein, die unter Verwendung des rekombinanten Virus der vorliegenden Erfindung infizieren kann und drei exogene kostimulatorische Moleküle exprimieren kann, und kann ferner genetisch manipuliert worden sein, um eines oder mehrere exogene Zielantigene oder immunologische Epitope davon zu exprimieren. Solche Wirtszellen enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Tumorzellen, antigenpräsentierende Zellen wie etwa PBMC, Dendritenzellen, Zellen der Haut oder des Muskels und dergleichen. Antigenpräsentierende Zellen enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Monozyten, Makrophagen, Dendritenzellen, Vorläuferdendritenzellen, Langerhans-Zellen, Splenozyten, B-Zellen, Tumorzellen, Muskelzellen, Epithelzellen und dergleichen.
In einer Ausführungsform sind die Wirtszellen Tumorzellen, in denen die Tumorzellen dem rekombinanten Vektor in situ oder in vitro ausgesetzt werden, um an den Tumorzellen die Expression von drei kostimulatorischen Fremd- oder exogenen Molekülen zu veranlassen. Die Tumorzellen können ein endogenes Zielanti gen exprimieren oder die Tumorzellen können ferner genetisch manipuliert worden sein, um ein Zielantigen wie etwa TAA oder ein immunologisches Epitop davon zu exprimieren. Tumorzellen, die das TAA zusammen mit drei immunstimulatorischen Molekülen exprimieren, werden einem Säugetier in einer wirksamen Menge verabreicht, die in dem an einem Krebs leidenden Säugetier zur Tumorverringerung oder -beseitigung führt.
Außerdem schafft die vorliegende Erfindung Vorläuferdendritenzellen, Dendritenzellen (DC), DC-Unterpopulationen und Abkömmlinge davon, die drei kostimulatorische Moleküle, in denen drei kostimulatorische Moleküle exogen durch einen rekombinanten Vektor mit Nukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, geliefert werden, überexprimieren. Die Vorläufer-DC und die DC der vorliegenden Erfindung exprimieren höhere Niveaus kostimulatorischer Moleküle als durch eine nicht behandelte Vorläufer-DC oder DC endogen exprimiert werden. Die APCs wie etwa Vorläuferdendritenzellen und Dendritenzellen können außerdem eine oder mehrere endogene Zielantigene oder immunologische Epitope davon exprimieren oder das exogene Zielantigen kann außerdem dadurch, dass der rekombinante Vektor drei kostimulatorische Moleküle codiert, oder durch einen zweiten rekombinanten Vektor geliefert werden. Ferner schafft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der drei kostimulatorischen Moleküle überexprimierenden APCs wie etwa der drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden Vorläuferdendritenzellen und der drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden Dendritenzellen bei der Aktivierung von T-Zellen in vivo oder in vitro für die Impfung und für Immuntherapiereaktionen gegen eine oder mehrere Zielzellen, Zielantigene und immunologische Epitope davon.
Die APCs wie etwa Vorläuferdendritenzellen, Dendritenzellen, DC-Unterpopulationen und Abkömmlinge davon, die von einer Quelle isoliert worden sind, werden mit einem rekombinanten Vektor, der exogene Gene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die funktionale Überexpression der drei kostimulatorischen Moleküle zuzulassen, infiziert, transfiziert oder transduziert. Solche kostimulatorischen Moleküle überexprimierenden antigenpräsentierende Vorläuferdendritenzellen und Dendritenzellen können ebenfalls mit wenigstens einer Zielzelle, einem Zielzellenlysat, einer Zielzellenmembran, einem Zielantigen oder einem immunologischen Epitop davon oder mit RNA oder DNA wenigstens einer Zielzelle gepulst oder inkubiert werden und in einer Menge, die ausreicht, die relevanten T-Zellen-Reaktionen in vivo zu aktivie ren, an eine Spezies verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die antigenpräsentierenden Vorläuferdendritenzellen und Dendritenzellen zusätzlich wenigstens ein Fremdzielantigen oder ein immunologisches Epitop davon.
Wirtszellen, die drei exogene kostimulatorische Moleküle exprimieren, können in einer Dosis von 10³ bis 10⁹ Zellen geliefert werden. Die Verabreichungswege, die verwendet werden können, enthalten intravenös, subkutan, intralymphatisch, intratumoral, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intrarektal, intravaginal, intranasal, oral, über Blasentropfinfusion, über Hautritzung und dergleichen.
In einer Ausführungsform werden die drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden antigenpräsentierenden Vorläuferdendritenzellen oder Dendritenzellen einer Zielzelle, Zielzellenlysaten, Zielzellenmembranen, einem Zielantigen oder einem immunologischen Epitop davon oder mit DNA oder RNA von wenigstens einer Zielzelle in vitro ausgesetzt und mit vorbehandelten oder unvorbehandelten T-Zellen inkubiert, um die relevanten T-Zellen-Reaktionen in vitro zu aktivieren. Daraufhin werden die aktivierten T-Zellen allein oder in Kombination mit den Vorläufer-DC oder DC zur Schutzimpfung oder Immuntherapie gegen eine Zielzelle, ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon an eine Spezies wie etwa an einen Menschen verabreicht. In einem Verwendungsverfahren werden die Vorläuferdendritenzellen oder Dendritenzellen vorteilhaft verwendet, um eine immuntherapeutische wachstumshemmende Reaktion gegen Krebszellen hervorzurufen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die drei kostimulatorische Moleküle überexprimierende antigenpräsentierende Zelle, vorzugsweise eine Vorläufer-DC oder DC, durch im Gebiet bekannte Verfahren (Gong, J., u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6279–6283, 1998) mit einer Zielzelle, die ein relevantes Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon exprimiert, verschmolzen, um ein Heterokaryon einer APC und der Zielzelle zu bilden. Eine solche Verschmelzungszelle oder Chimären-APC/Zielantigen-Zelle exprimiert sowohl drei kostimulatorische Moleküle als auch ein Zielantigen oder immunologische Epitope davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielzelle eine hyperplastische Zelle, eine präkanzeröse Zelle oder eine bösartige Zelle. Die Chimären-APC/Zielantigen-Zelle kann sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden, um die Immunreaktionen von T- und B-Lymphozyten zu verbessern.
Vorläuferdendritenzellen werden aus Knochenmark, peripherem Blut und Lymphknoten von einem Patienten erhalten. Der Patient kann zuvor mit einer Verbindung wie etwa Flt-3L geimpft oder behandelt worden sein, um die Anzahl antigenpräsentierender Zellen zu erhöhen. Dendritenzellen werden aus irgendeinem Gewebe wie etwa aus der Epidermis der Haut (Langerhans-Zellen) und aus lymphatischen Geweben erhalten, wie sie etwa in der Milz, im Knochenmark, in den Lymphknoten und im Thymus sowie im Blutkreislauf, einschließlich Blut und Lymphe (Schleierzellen), zu finden sind. Nabelschnurblut ist eine weitere Quelle von Dendritenzellen.
Dendritenzellen können zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von im Gebiet bekannten Verfahren wie etwa jenen, die im US-Patent Nr. 5.788.963 beschrieben sind, angereichert oder isoliert werden. Wenn die Vorläuferdendritenzellen, Dendritenzellen und Abkömmlinge davon erhalten werden, werden sie unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert, um die Zellenpopulation zu expandieren und/oder die Zellen in einem Zustand für optimale Infektion, Transfektion oder Transduktion durch einen rekombinanten Vektor und für optimale Zielantigenaufnahme, -verarbeitung und -präsentation zu halten. Besonders vorteilhaft für die Aufrechterhaltung des richtigen Reifezustand der Dendritenzellen in einer In-vitro-Kultur ist die Anwesenheit sowohl des Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) als auch von Interleukin 4 (IL-4). Anhand der Adhäsion und/oder des Reifegrads können auf der Grundlage von Zellenoberflächenmarkern Unterpopulationen von Dendritenzellen isoliert werden. Der Phänotyp der Vorläufer-DC, der DC und von Unterpopulationen davon ist in Banchereau und Steinman, Nature 392:245–252, 1998, offenbart.
In einer Ausführungsform werden GM-CSF und IL-4 jeweils für eine Dauer von etwa 6 Tagen in einer Konzentration von etwa 500 Einheiten/ml bereitgestellt (41, 42). In einer weiteren Ausführungsform wird TNFα und/oder CD40 verwendet, um zu veranlassen, dass die Vorläufer-DC oder DC reifen.
Die Vorläuferdendritenzellen oder Dendritenzellen können von der zu behandelnden Person erhalten werden und sind somit hinsichtlich der relevanten HLA-Antigene autogen, oder die Zellen können von einer Person erhalten werden, deren relevante HLA-Antigene (sowohl Klasse I als auch II, z. B. HLA-A, B, C und DR) zu der zu behandelnden Person passen. Alternativ werden die Vorläufer dendritenzellen gentechnisch hergestellt, um die geeigneten relevanten HLA-Antigene der Person, die die Behandlung empfängt, zu exprimieren.
Ferner können die Vorläuferdendritenzellen und Dendritenzellen durch solche Verfahren wie EBV-Transformation, wie sie im US-Patent Nr. 5.788.963 offenbart ist, genetisch modifiziert werden, um ihre Lebensdauer zu verlängern.
Die Dendritenzellen und die Vorläufer davon können in Form einer Arzneimittelzusammensetzung in einem physiologisch akzeptablen Medium bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung kann ferner eine Zielzelle, ein Zielzellenlysat, eine Zielzellenmembran, ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon umfassen. Zusätzlich kann die Zusammensetzung zur zusätzlichen synergistischen Verbesserung einer Immunreaktion Cytokine und/oder Chemokine wie etwa IL-4 und GM-CSF umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die APC der vorliegenden Erfindung, die drei kostimulatorische Moleküle überexprimiert, in Verfahren zum Bewerten der Wirksamkeit eines Impfstoffs durch Bestimmung der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation und -funktion brauchbar. In einem solchen Verfahren werden einer Person, die mit einem Zielzellenlysat, mit einer Zielzellenmembran, mit einem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon geimpft worden ist, Lymphozyten entnommen. Die Lymphozyten werden mit einer APC der vorliegenden Erfindung in Anwesenheit der Zielzelle, des Zielzellenlysats, der Zielzellenmembran, des Zielantigens oder eines immunologischen Epitops davon in vitro kultiviert, wobei durch im Gebiet bekannte Verfahren eine Verbesserung der antigenspezifischen Lymphozytenanzahlen und -funktionen bestimmt wird. Eine Verbesserung der Anzahl und/oder der Funktionen gibt die Wirksamkeit des Impfstoffs an. Besonders wirksam ist das Verfahren bei der Bestimmung der Wirksamkeit von Peptidimpfstoffen bei der Stimulation einer geeigneten Immunreaktion.
In einer weiteren Ausführungsform sind die APCs der vorliegenden Erfindung, die exogen drei kostimulatorische Moleküle exprimieren, in einem Verfahren zur Selektion für neue Immunität hervorrufende Peptide aus einer Vielzahl von Peptiden brauchbar. In dem Selektionsverfahren werden antigenpräsentierende Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor, der drei kostimulatorische Moleküle oder Funktionsabschnitte davon codiert, infiziert worden sind, mit mehreren Peptiden gepulst, um eine peptidgepulste antigenpräsentierende Zelle zu bilden. Die peptidgepulste antigenpräsentierende Zelle wird mit Lymphoidzellen inkubiert und es wird die Immunreaktionsfähigkeit der Lymphoidzellen gemessen. Eine Verbesserung der Immunreaktionsfähigkeit der Lymphoidzellen in Anwesenheit der peptidgepulsten APC gibt eine antigenspezifische Reaktion für das Peptid an. Das Peptid, das die verbesserte Reaktion hervorruft, kann durch Auswaschen aus einem Tumor, durch Analyse der HLA-Bindung usw. identifiziert werden. Die Quelle der Multiplizität der Peptide kann eine kombinatorische Bibliothek sein, die mehrere zufällige Peptide ausdrückt. Die verbesserte Immunreaktionsfähigkeit kann eine humorale oder durch Zellen übermittelte Immunreaktion sein und kann unter Verwendung im Gebiet bekannter Standardtechniken wie etwa antigeninduzierter Proliferation, Zytotoxizität, Antikörperabsonderung, Signaltransduktion und dergleichen gemessen werden. Die identifizierten neuen Peptide können als Immunogene, Impfstoffe oder Diagnosemittel verwendet werden. Die Proteine, die die Peptide enthalten, können durch Subtraktionsbibliotheken und Differentialanzeige-Gentechnologien identifiziert werden.
Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sowie die Wirtszellen, die durch den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung infiziert, transfiziert oder induziert werden, sind in Verfahren zum Stimulieren einer verbesserten humoralen Reaktion sowohl in vivo als auch in vitro brauchbar. Eine solche verbesserte humorale Reaktion kann dem Wesen nach monoklonal oder polyklonal sein. Die Verbesserung der humoralen Reaktionen unter Verwendung dreier kostimulatorischer Moleküle ist im Vergleich zu einer humoralen Reaktion, die ein einzelnes oder doppeltes kostimulatorisches Molekül verwendet, synergistisch. Die synergistische Verbesserung der humoralen Reaktion kann durch erhöhte Proliferation und/oder Cytokin-Absonderung durch CD4⁺-T-Zellen, erhöhte Proliferation oder Antikörperproduktion durch B-Zellen, erhöhte antikörperabhängige Zellentoxizität (ADCC), erhöhte komplementübertragene Lyse und dergleichen bestimmt werden. Es wird erwartet, dass die unter Verwendung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung oder unter Verwendung durch den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung infizierter, transfizierter oder induzierter Wirtszellen hervorgerufenen Antikörper eine höhere Affinität und/oder Avidität und einen höheren Titer als durch Standardverfahren hervorgerufene Antikörper haben. Die durch Verfahren unter Verwendung des rekombinanten Vektors hervorgerufenen Antikörper können immundominante Zielepitope oder nicht dominante Zielepitope erkennen.
Ferner umfasst diese Erfindung einen oder mehrere Antikörper, der/die durch Immunisierung mit dem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung hervorgerufen wird/werden. Der Antikörper besitzt eine Spezifizität für das interessierende Zielantigen oder immunologische Epitop davon und reagiert oder bindet sich mit ihm. In dieser Ausführungsform der Erfindung sind die Antikörper dem Wesen nach monoklonal oder polyklonal.
Beispielhafte Antikörpermoleküle sind unversehrte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen unversehrte Immunglobulinmoleküle oder jene Abschnitte eines Immunglobulinmoleküls, die die Antigenbindungsstelle enthalten, einschließlich jener Abschnitte von Immunglobulinmolekülen, die im Gebiet als F(ab)F(ab'), F(ab')₂ und F(v) bekannt sind. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können durch im Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. (Kohler und Milstein (1975) Nature 256, 495–497; Campbell "Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas", in Burdon u. a. (Hrsg.), (1985), "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Bd. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Die Antikörper oder Antigenbindungsfragmente können ebenfalls durch genetische Manipulation hergestellt werden. Die Technologie für die Expression sowohl schwerer als auch leichter Kettengene in E. coli ist der Gegenstand der folgenden PCT-Patentanmeldungen: Veröffentlichungsnummern WO 901443 , WO 901443 und WO 9014424 sowie in Huse, u. a., (1989), Science 246:1275–1281.
In einer Ausführungsform werden die Antikörper dieser Erfindung in Immunoassays verwendet, um das interessierende neue Antigen in biologischen Proben zu erfassen.
In einer Ausführungsform werden die Antikörper dieser Erfindung, die durch Immunisierung mit einem rekombinanten Impfpockenvirus, das ein TAA exprimiert und B7-1, ICAM-1 und LFA-3 exprimiert, erzeugt werden, dazu verwendet, unter Verwendung der Immunzytochemie die Anwesenheit des TAA aus einer Gewebebiopsie eines Säugetiers, das an einem Krebs leidet, der TAA exprimiert, zu beurteilen. Eine solche Beurteilung der Darstellung des TAA-Antigens in erkranktem Gewebe kann verwendet werden, um den Fortschritt der Erkrankung in einem an der Krankheit leidenden Säugetier oder die Wirksamkeit der Immuntherapie vorauszusagen. In dieser Ausführungsform enthalten Beispiele der TAAs CEA, PSA und MUC-1, sind darauf aber nicht beschränkt. Herkömmliche Verfahren für die Immunhistochemie sind beschrieben in (Harlow und Lane (Hrsg.) (1988) in "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spinning Harbor Rest, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel u. a. (Hrsg.) (1987). In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, New York).
In einer weiteren Ausführungsform werden die Antikörper der vorliegenden Erfindung für die Immuntherapie verwendet. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in der passiven Immuntherapie verwendet werden.
Bei der Bereitstellung der antikörper- oder antigenbindenden Fragmente für ein Empfängersäugetier, vorzugsweise für einen Menschen, an einen Patienten ändert sich die Dosierung der verabreichten antikörper- oder antigenbindenden Fragmente je nach solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, der allgemeinmedizinischen Bedingung, der medizinischen Vorbedingung und dergleichen des Säugetiers.
Die antikörper- oder antigenbindenden Fragmente der vorliegenden Erfindung sollen für die Empfängerperson in einer Menge bereitgestellt werden, die ausreicht, die Schwere, den Umfang oder die Dauer der Erkrankung oder Infektion zu verhindern, zu verringern oder zu mildern.
Anti-Idiotypen-Antikörper entstehen normalerweise während der Immunreaktionen, wobei ein Abschnitt des Anti-Idiotypen-Antikörpers dem Epitop ähnelt, das die ursprüngliche Immunreaktion induziert hat. In der vorliegenden Erfindung wird das Immunglobulin-Gen oder ein Abschnitt davon eines Antikörpers, dessen Bindungsstelle ein Zielantigen eines Erkrankungszustands widerspiegelt, allein oder in Kombination mit einem Gen oder mit einem Abschnitt davon von drei immunstimulatorischen Molekülen in das Genom oder einen Abschnitt davon eines Virusgenoms inkorporiert, wobei das resultierende rekombinante Virus eine Zellen- und humorale Immunreaktionen auf das Antigen hervorrufen kann.
Die Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen offenbart das allgemeine Wesen der Erfindung so umfassend, dass Andere solche spezifischen Ausführungsformen für verschiedene Zwecke leicht modifizieren und/oder annehmen können, ohne von dem allgemeinen Konzept abzuweichen, sodass solche Anpassungen oder Modifikationen so zu verstehen sind, dass die im Sinn und Bereich von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen liegen.
Alle Literaturhinweise und Patente, auf die Bezug genommen wird, sind hiermit durch Literaturhinweis eingefügt.
Beispiel 1
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TRICOM(mu1) Nr. T171
Der Ursprung des Impfpocken-Elternvirus ist der Stamm des New York City Board of Health und wurde durch Wyeth von dem New City Board of Health erhalten und in Kälber eingebracht, um das Pockenimpfstoff-Seed zu erzeugen. Die Flow Laboratories empfingen von den Dr. Chanock und Moss (National Institutes of Health) ein gefriergetrocknetes Fläschchen des Pockenimpfstoff-Seeds, Los 3197, Passage 28. Dieses Seed-Virus wurde dreimal mit Äther behandelt und Plaquegereinigt.
Für die Erzeugung von rV-TRICOM(mu1) wurde ein mit pT5032 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das M2L-Gen (30K-Gen), das sich in dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, zu lenken. Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des 30K-Pockenimpfstoffpromotors (M2L) (34), das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Pockenimpfstoffpromotors (18) und das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L) (32). Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert (siehe 1). Diese flankierenden Sequenzen enthalten das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichgen (33). Ein Abkömmling des Wyeth-Impfpockenstamms wurde bei der Konstruktion des rekombinanten Impfpockenvirus als das Elternvirus verwendet. Dieses mit vTBC33 bezeichnete Elternvirus besitzt kein funktionales K1L-Gen und kann sich somit in Kaninchennieren-RK₁₃-Zellen nicht effizient replizieren (38). Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom vTBC33 und den entsprechenden Sequenzen in pT5032 in mit Impfpocken infizierten RK₁₃-Zellen, die mit pT5032 transfiziert wurden, ausgeführt. Das mit vT171 bezeichnete rekombinante Virus wurde durch Züchtung an RK₁₃-Zellen (ATCC, CCL 37) ausgewählt. Aus der Zellenmonoschicht wurden die Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde weiter fortgepflanzt. Zwei Runden der Plaque-Isolation und Nachfüllung an RK₁₃-Zellen führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT171 ist in 4A gezeigt.
Beispiel 2
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TRICOM(mu2), Nr. vT199
Für die Erzeugung von rV-TRICOM(mu2) wurde ein mit pT5047 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, zu lenken. Das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors, das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des I3-Promotors und das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Pockenimpfstoffpromotors (39). Außerdem wird das E.-coli-lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Geflügelpockenvirus-Promotors (15) als eine Selektion für rekombinante Nachkommenschaft aufgenommen. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert (siehe 2). Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT5047 in mit Impfpocken infizierten Hu143TK-Zellen (Bacchetti und Graham 1977), die mit pT5047 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde wie zuvor beschrieben (31) unter Verwendung einer Auswahl für das TK-Virus in Anwesenheit von Bromdeoxyuridin (BudR) in Kombination mit einem an Virus-Plaques in situ ausgeführten chromogenen Assay, die die Expression des lacZ-Genprodukts in Anwesenheit eines halogenierten Indolyl-Beta-D-Galaktosids (Bluo-gal) erfasst, identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques ausgewählt, die mit vT199 bezeichnet sind, und ihre Nachkommenschaft wurde unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen replattiert. In anderen rekombinanten Viren, die auf diese Weise ausgewählt und gereinigt wurden, waren die einzigen Plaques, die unter diesen selektiven Bedingungen erschienen, blau, wobei diese blauen Plaques leicht isoliert und gereinigt wurden. Allerdings wurden im Fall von vT199 in der zweiten Runde der Plaque-Reinigung nur weiße Plaques beobachtet; es waren keine blauen Plaques sichtbar. Es wurde ein neuer Satz blauer Plaques ausgewählt und replattiert; in der zweiten Runde der Plaque-Reinigung wurden wieder nur weißen Plaques beobachtet. Eine letzte Studie unter Verwendung eines nochmals weiteren Satzes blauer Plaques lieferte nach der zweiten Runde der Plaque-Reinigung sowohl blaue als auch weiße Plaques. Die blauen Plaques wurden ausgewählt und replattiert. Zwei zusätzliche Runden der Plaque-Reinigung (insgesamt vier Runden) lieferten rekombinante Viren, die 100 % blau waren. Die Genomstruktur der Rekombinante vT199 ist in 4B gezeigt.
Beispiel 3
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TAA/TRICOM(mu)
Für die Erzeugung von rV-TAA/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das Impfpockengenom zu lenken. Das TAA-Gen, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Impfpockengenom flankiert, in das die Fremdsequenzen eingeführt werden sollen. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken infizierten Zellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, ausgeführt. Aus der Zellenmonoschicht werden unter selektiven Bedingungen rekombinante Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird weiter fortgepflanzt. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und Replattierung führen zur Reinigung des gewünschten rekombinanten Virus.
Beispiel 4
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-MUC-1/TRICOM(mu)
Für die Erzeugung von rV-MUC-1/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das Impfpockengenom zu lenken. Das Gen MUC-1, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Impfpockengenom flankiert, in das die Fremdsequenzen eingeführt werden sollen. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken infizierten Zellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert werden, ausgeführt. Aus der Zellenmonoschicht werden unter selektiven Bedingungen rekombinante Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird weiter fortgepflanzt. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und Replattierung führen zur Reinigung des gewünschten rekombinanten Virus.
Beispiel 5
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-CEA/TRICOM(mu) Nr. vT172
Für die Erzeugung von rV-CEA/TRICOM(mu) wurde ein mit pT5031 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das M2L-Gen (30K-Gen), das sich in dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms befindet (siehe 3), zu lenken. Das CEA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors (13), das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors und das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert, das das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichsgen enthält. Das oben konstruierte vTBC33 wurde als das Elternvirus in der Konstruktion des rekombinanten Impfpockenvirus verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom vTBC33 und den entsprechenden Sequenzen in pT5031 in mit Impfpocken infizierten RK₁₃-Zellen, die mit pT5031 transfiziert wurden, ausgeführt. Das mit vT172 bezeichnete rekombinante Virus wurde wie oben beschrieben durch Züchtung an RK₁₃-Zellen ausgewählt. Aus der Zellenmonoschicht wurden Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde weiter fortgepflanzt. Zwei Runden Plaque-Isolation und Replattierung an RK13-Zellen führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT172 ist in 4C gezeigt.
Beispiel 6
Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken rF-TRICOM(mu) Nr. vT222
Der Ursprung des für die Erzeugung der Rekombinanten verwendeten Elterngeflügelpockenvirus wurde aus einem Fläschchen eines von USDA lizenzierten Vogelimpfstoffs, PDXVAC-TC, der durch die Schering-Plough Corporation hergestellt wird, Plaque-gereinigt. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung von PDXVAC-TC war ein Fläschchen Geflügelpockenimpfstoff der Vineland-Laboratorien von Hühnerembryo-Ursprung, das von Schering-Plough erhalten wurde. Das Virus wurde zweimal an der Chorioallantois-Membran von Hühnereiern passieren gelassen, um ein Master-Seed-Virus zu erzeugen. Zusätzlich wurde das Master-Seed-Virus 27 Mal in juvenilen Hühnerembryo-Bindegeweben passieren gelassen, um das PDXVAC-TC-Master-Seed zuzubereiten. Das PDXVAC-TC-Master-Seed zweimal an juvenilen Hühnerembryo-Bindegeweben passieren gelassen, um Virusstämme für die Erzeugung von PDXVAC-TC-Produktlosen zuzubereiten. Ein Fläschchen PDXVAC-TC, lfd. Nr. 96125, wurde dreimal an primären Hühnerembryo-Dermalzellen Plaque-gereinigt.
Für die Erzeugung von rF-TRICOM(mu) wurde ein mit pT8001 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors, das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 5) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT8001 in mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen, die mit pT8001 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT222 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Sechs Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT222 ist in 7A gezeigt.
Beispiel 7
Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken rF-TAA/TRICOM(mu)
Für die Erzeugung von rF-TAA/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das TAA-Gen, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren. Außerdem steht das lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten Virus.
Beispiel 8
Erzeugung von rekombinanten Geflügelpocken rF-MUC-1/TRICOM(mu)
Für die Erzeugung von rF-MUC-1/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das MUC-1-Gen, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren. Außerdem steht das lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in den mit dem Plasmidvektor transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten rekombinanten Virus.
Beispiel 9
Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken rF-CEA/TRICOM(mu) Nr. vT194
Für die Erzeugung von rF-CEA/TRICOM(mu) wurde ein als pT5049 bezeichneter Plasmidvektor zur direkten Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Das CEA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Pockenimpfstoffpromotors, das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors, das Ratten-LFA3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des I3-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des 7.5K-Pockenimpfstoffpromotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert (siehe 6) Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem POXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT5049 in den mit pT5049 transfizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden mit vT194 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden der Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT194 ist in 7B gezeigt.
Beispiel 10
Erzeugung eines rekombinanten Pockenimpfstoffs rV-TRICOM(hu) Nr. vT224
Für die Erzeugung von rV-TRICOM(hu) wurde ein als pT5064 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, konstruiert. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Außerdem ist das E.-coli-lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors als eine Selektion für rekombinante Nachkommenschaft enthalten. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert (siehe 8). Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT5064 in mit Impfpocken infizierten CV-1-Zellen (ATTC, CCL 70), die mit pT5064 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden als vT224 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden der Plaque-Isolation und des Replattierens in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT224 ist in 9A gezeigt.
Beispiel 11
Erzeugung eines rekombinanten Pockenimpfstoffs rV-TAA/TRICOM(hu)
Für die Erzeugung von rV-TAA/TRICOM(hu) wird ein Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, konstruiert. Das TAA-Gen, das menschliche LFA-3-Gen, das menschliche ICAM-1-Gen, das menschliche B7.1-Gen und das E.-coli-lacZ-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Pockenviruspromotoren. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken infizierten CV-1-Zellen (ATTC, CCL 70), die mit Plasmid transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und des Replattierens in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung der gewünschten Rekombinante.
Beispiel 12
Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken rF-TAA/TRICOM(hu)
Für die Erzeugung von rF-TAA/TRICOM(hu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das TAA-Gen, das menschliche LFA-3-Gen, das menschliche ICAM-1-Gen, das menschliche B7.1-Gen und das E.-Coli-lacZ-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Pockenviruspromotoren. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem POXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wird über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten rekombinanten Virus.
Beispiel 13
Erzeugung eines rekombinanten Impfpockenvirus rV-CEA (6D)/TRICOM(hu) Nr. vT238
Für die Erzeugung von rV-CEA(6D)/TRICOM(hu) wurde ein als pT8016 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen) zu lenken, das sich in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet. Das CEA-Gen wurde durch In-vitro-Mutagenese geändert, um Protein voller Länge zu exprimieren, das ein modifiziertes Epitop enthält. Diese Mutation änderte die an der Position 576 codierte Aminosäure von Asparagin in Asparaginsäure. Das mit CEA(6D) bezeichnete modifizierte Gen war dazu bestimmt, die Immunogenität des CEA zu verbessern (Zaremba, u. a. 1997, Cancer Res. 57:4570–4577). Das Gen CEA(6D) steht unter der Steuerung des 40K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors und das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Außerdem ist das E.-coli-lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors als eine Selektion für rekombinante Nachkommenschaft enthalten. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert (siehe 10). Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT8016 in mit Impfpocken infizierten CV-1-Zellen (American Type Culture Collection (ATTC), Rockville, MD, CCL 70), die mit pT8016 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden als vT238 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Sechs Runden der Plaque-Isolation und des Replattierens in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT238 ist in 11 gezeigt.
Beispiel 14
Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-TRICOM(mu) Nr. vT251
Für die Erzeugung von rF-TRICOM(mu) wurde ein mit pT8019 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors, und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 12) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT8019 in mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen, die mit pT8019 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT251 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Drei Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT251 ist in 13A gezeigt.
Beispiel 15
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-TRICOM(hu) Nr. vT232
Für die Erzeugung von rF-TRICOM(hu) wurde ein als pT5072 bezeichneter Plasmidvektor zur direkten Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert (siehe 14) Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT5072 in dem Plasmidvektor in den mit pT5072 transfizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden mit vT232 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden der Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT232 ist in 13B gezeigt.
Beispiel 16
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-MUC-I/TRICOM(mu) Nr. vT250
Für die Erzeugung von rF-MUC-1/TRICOM(mu) wurde ein als pT8020 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Es wurde eine verkürzte Version des MUC-1-Gens verwendet, die aus der Signalsequenz, aus zehn Kopien der Tandemwiederholungssequenz und aus der eindeutigen 3'-Codie rungssequenz bestand. (SEQ ID NO:41). Die Nukleotidsequenz des Tandemwiederholungsgebiets wurde geändert, um die Homologie zwischen den Wiederholungen zu minimieren, ohne die Aminosäuresequenz zu ändern. Das Gen war in einem 1881-bp-Fragment enthalten, das die verkürzte Codierungssequenz, 6 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 186 Nukleotide des Nicht-Translations-3'-Gebiets enthält (Gendler u. a., 1990, J. Biol. Chem. 265: 15286–15293). Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 15) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT8020 in mit pT8020 transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT250 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT250 ist in 16A gezeigt.
Beispiel 17
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-MUC-1/TRICOM(hu) Nr. vT242
Für die Erzeugung von rF-MUC-1/TRICOM(hu) wurde ein als pT2186 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Es wurde eine verkürzte Version des MUC-1-Gens verwendet, wie sie oben in Beispiel 16 beschrieben ist. Das MUC-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 17) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT2186 in mit pT2186 transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zelienmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT242 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT242 ist in 16B gezeigt.
Beispiel 18
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-CEA(6D)/TRICOM(hu) Nr. vT236
Für die Erzeugung von rF-CEA(6D)/TRICOM(hu) wurde ein als pT2187 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Das CEA(6D)-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 18) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügel pockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT2187 in mit pT2187 transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT236 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Acht Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT236 ist in 16C gezeigt.
Beispiel 19
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu) Nr. vT257
Für die Erzeugung von rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu) wurde ein als pT5080 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken. Das Gen, das PSA codiert, wurde durch Polymerasekettenreaktions-Verstärkung von cDNA, die von RNA aus der menschlichen LNCaP-Zelllinie (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) abgeleitet wurde, isoliert. Das Gen war an einem 1346-bp-Fragment enthalten, das die gesamte Codierungssequenz für PSA, 41 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 552 Nukleotide des Nicht-Translations-3'-Gebiets enthält (Lundwall und Lilja, 1987, FERS Lett. 214: 317–322). Das Gen, das PSMA codiert, wurde durch Polymerasekettenreaktions-Verstärkung der cDNA, die von RNA aus der menschlichen LNCaP-Zelllinie abgeleitet wurde, isoliert. Das Gen war an einem 2298 bp-Fragment enthalten, das die gesamte Codierungssequenz für PSMA, 26 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 19 Nukleotide des Nicht-Translations-3'-Gebiets enthielt (Israeli, u. a., 1993, Cancer Res., 52:227–230). Das PSA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors und das PSMA-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 19) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus wurde über homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und den entsprechenden Sequenzen in pT5080 in mit pT5080 transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT257 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT257 ist in 16D gezeigt.
Beispiel 20
Erzeugung eines rekombinanten MVA-Virus rMVA-TRICOM(mu) Nr. vT264
Die modifizierten Ankara-Impfpocken (MVA) sind eine attenuierte Abgeleitete des Ankara-Impfpockenvirusstamms (Meyer u. a., 1991, J. Gen Virol. 72:1031–1038). Der Seed-Stamm von dem als Pockenimpfstoff bei Menschen verwendeten MVA-Impfstoff wurde von Dr. Anton Mayr (Institut für Medizinische Mikrobiologie, München) erhalten. Der Seed-Stamm wurde zweimal an primären Hühnerembryo-Dermalzellen Plaque-gereinigt.
Für die Erzeugung von rMVA-TRICOM(mu) wurde ein als pT5085 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert, um die Einführung der Fremdsequenzen in das Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms zu lenken (Meyer, u. a., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031–1038). Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms (siehe 20) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaquegereinigtes Isolat aus dem MVA-Impfstoffstamm verwendet. Die Erzeugung der rekombinanten MVA wurde über eine homologe Rekombinante zwischen MVA-Sequenzen in dem MVA-Genom und den entsprechenden Sequenzen in pT5085 in die mit pT5085 transfizierten, mit MVA infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT264 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT264 ist in 21A gezeigt.
Beispiel 21
Erzeugung eines rekombinanten MVA-Virus rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu) Nr. vT260
Für die Erzeugung von rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu) wurde ein als pT5084 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen in das Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms konstruiert. Das PSA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors und das PSMA-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms (siehe 22) flankiert. Als das Elternvirus für diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem MVA-Impfstoffstamm verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten MVA wurde über homologe Rekombination zwischen MVA-Sequenzen in dem MVA-Genom und den entsprechenden Sequenzen in pT5084 in mit pT5084 transfizierten, mit MVA infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays für das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques, die mit vT260 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT260 ist in 21B gezeigt.
Beispiel 22
Rekombinante Pockenviren
Es sind die einzelnen rekombinanten Impfpockenviren, die entweder das Gen, das das kostimulatorische Rattenmolekül B7-1 codiert (als rV-B7-1 bezeichnet), oder das Gen, das das interzellulare Rattenadhäsionsmolekül-1 codiert (als rV-ICAM-1 bezeichnet) enthalten, beschrieben worden (10, 11). Das rekombinante Impfpockenvirus, das das Gen für Ratten-C48 enthält [das als rV-LFA-3 bezeichnet wird; das Ratten-CD48 ist das Homologe des menschlichen LFA-3 (CD58) (6)], wurde auf ähnliche Weise wie rV-B7-1 und rV-ICAM-1 konstruiert und ist beschrieben worden (12). Das Gen, das das kostimulatorische Molekül codiert, wurde in jedem dieser einzelnen rekombinanten Impfpockenviren unter die Steuerung des Impfpockenvirus-Early-Late-40K-Promotors gestellt (15), und das Transgen wurde wie in (13) beschrieben in das Hind-III-M-Gebiet des Genoms des Wyeth-Impfpockenvirusstamms eingeführt. Rekombinante Geflügelpockenviren wurden wie in (14) beschrieben durch die Einführung von Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Genoms des PDXVAC-TC-Geflügelpockenvirusstamms (Schering Corporation) konstruiert. In rekombinanten Viren, die ein einzelnes Fremdgen enthalten, steht das Gen unter der Steuerung des 40K-Impfpockenpromotors. rV-B7-1/ICAM-1 ist ein rekombinantes Impfpockenvirus, das das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L-Promotors) (16) und das Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des 40K-Promotors enthält. rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 ist ein rekombinantes Impfpockenvirus, das das Ratten-LFA-3-Gen unter der Steuerung des 30K-Impfpockenpromotors (M2L) (17), das Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des I3-Impfpockenpromotors (18) und das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L-Promotors) enthält. rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 ist ein rekombinantes Geflügelpockenvirus, das das menschliche carcinoembryonale Antigen (CEA) unter der Steuerung des 40K-Promotors, das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des sE/L-Promotors, das Ratten-LFA-3-Gen unter der Steuerung des I3-Promotors und das Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des 7.5K-Impfpockenpromotors enthält (19). Das nicht rekombinante Impfpockenvirus wurde mit V-Wyeth bezeichnet, während das nicht rekombinante Geflügel pockenvirus mit WT-FP bezeichnet wurde.
Beispiel 23
Expression rekombinanter kostimulatorischer Moleküle
Um zu bestätigen, dass jeder der rekombinanten Vektoren das richtige Transgen bzw. die richtigen Transgene exprimieren könnte, wurde die Ratten-Adenokarzinom-Zelllinie MC38 mit den verschiedenen rekombinanten Impfpocken- oder Geflügelpockenkonstrukten infiziert und wurde durch Durchflusszytometrie die Zelloberflächenexpression des Transgens bzw. der Transgene nachgewiesen (23). Nicht infizierte Zellen (Daten nicht gezeigt) und Zellen, die mit Impfpocken vom Wildtyp infiziert waren, exprimierten keines der drei kostimulatorischen Moleküle. Diese Beobachtung wurde durch PCR (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Im Gegensatz dazu wurden mit rV-B7-1 infizierte Zellen stark positiv für B7-1-Protein; wurden mit rV-ICAM-1 infizierte Zellen positiv für ICAM-1; und wurden mit rV-LFA-3 infizierte Zellen positiv für LFA-3-Protein. Ein ähnliche Analyse eines Konstrukts, das zwei kostimulatorische Moleküle (rV-B7-1/ICAM-1) enthielt, zeigte die Expression von B7-1 (78 % positiv mit einer mittleren Fluoreszenz-Intensität (MFI) von 1012) und ICAM-1 (70 % positiv mit einer MFI von 690). Darüber hinaus koexprimierten mit dem Impfpocken-Mehr-Gen-Konstrukt rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierte Zellen alle drei kostimulatorischen Moleküle. Um zu bestimmen, ob die rekombinanten Geflügelpockenviren drei rekombinante Proteine exprimierten, wurden MC38-Zellen auf ähnliche Weise mit den Geflügelpockenkonstrukten infiziert (23). Zellen, die mit dem Geflügelpockenvirus vom Wildtyp WT-FP infiziert wurden, exprimierten wieder kein kostimulatorisches Molekül. Mit rF-B7-1 infizierte Zellen wurden positiv für das Protein B7-1 und mit rF-ICAM-1 infizierte Zellen wurden positiv für das Protein ICAM-1. Ein Vektor rF-LFA-3 wurde nicht konstruiert. Allerdings koexprimierten mit dem Geflügelpocken-Mehr-Gen-Konstrukt rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierte Zellen alle drei kostimulatorischen Moleküle.
Charakterisierung rekombinanter Viren: Fluoreszenzanalyse der Proteinoberflächenexpression
Die Ratten-Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinie MC38 ist beschrieben worden (20). Konfluierende MC38-Zellen wurden 5 Stunden mit Impfpockenkonstrukten (V- Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1, rV-LFA-3, rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) oder mit Geflügelpockenkonstrukten (WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3) mit 5 MOI (Infektionsmultiplizität; PFU/Zelle) infiziert. CEA wurde in einem rF-Konstrukt nur als Marker-Gen verwendet. Nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und mit für Ratten-CD80 (-B7-1), -CD54 (-ICAM-1) oder -CD48 (-LFA-1; PharMingen, San Diego, CA) spezifischen FITC-konjugierten monoklonalen Antikörpern (MAb) immunhistochemisch gefärbt. Die Zellenfluoreszenz wurde mit einem FACSCAN-Zytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) mit der Software Lysis II analysiert.
In-vitro-Kostimulationsanalyse
Von den Taconic Farms (Germantown NY) wurden weibliche C57BL/6-Mäuse (6–8 Wochen alt) erhalten. Aus den Milzen wurden naive T-Zellen isoliert, die durch 70 m-Zellensiebe (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) mechanisch dispergiert wurden, um Einzelzellensuspensionen zu isolieren, und rote Blutkörperchen und tote Zellen wurden durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque-Gradienten (Dichte = 1,119 g/ml) (Sigma, St. Louis, MO) entfernt. Durch den aufeinanderfolgenden Durchgang der einkernigen Milzzellen über zwei Nylonwollsäulen wurden Populationen erhalten, die näherungsweise aus 95 % T-Zellen bestanden (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale CA). Für bestimmte Experimente wurden die T-Zellen durch Negativselektion unter Nutzung paramagnetischer Anti-CD-4- oder Anti-CD-8-Perlen (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) in CD4⁺- und CD8⁺-Populationen weiter fraktioniert. Die T-Zellen wurden bei 10⁵/Well in 96-Well-Platten mit flachen Böden (Costar, Cambridge, MA) hinzugefügt. Die Stimulatorzellen bestanden aus nicht infizierten MC38-Zellen oder aus Zellen, die 5 Stunden mit 5 MOI Impfpockenkonstrukten (V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1, rV-LFA-3, rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) oder Geflügelpockenkonstrukten (WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3) infiziert, mit 2 % Formaldehyd fixiert und mit 10⁴/Well zugegeben wurden. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl Vollnährmedien (CM) [RPMI 1640 mit fötalem Kalbsserum (10 %), Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Hepes (7 mM), Gentamicin (50 μg/ml), 2-Mercaptoethanol (50 μM) und unwesentlichen Aminosäuren (0,1 mM) (Biofluids, Rockville, MD)] in Anwesenheit mehrerer Verdünnungen (5 bis 0,625 μg/ml für 2 Tage) Concanavalin-A (Con A, Sigma) kultiviert. Die Kontroll-Wells empfingen nur T-Zellen, Stimulatorzellen und Medien. Für die angegebenen Experimente wurde Con A durch plattengebundenes Anti-CD3 (1,5 μg/Well - 0,012 μg/Well) ersetzt. Die Zellen wurden für die letzten 12–18 h der Inkubation mit 1 Ci/Well ³H-Thymidin (New England Nuclear, Wilmington, DE) markiert und mit einem Tomtec-Zellenernter (Wallac Incorporated, Gaithersburg, MD) geerntet. Die enthaltene Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Wallac 1205 Betaplate, Wallac, inc.) gemessen. Die Ergebnisse von drei Wells wurden gemittelt und als Mittelwert CPM ± SEM berichtet. Für die angegebenen Experimente wurde die In-vitro-Kostimulationsanalyse entweder in Anwesenheit einer für das exprimierte kostimulatorische Molekül spezifischen MAb oder des passenden Isotyp-Kontrollantikörpers (armenischer Hamster IgG, polyklonal) ausgeführt. Die zum Blockieren der T-Zellen-Proliferation verwendeten Antikörper waren Hamster-Anti-Ratten-CD80 (B7-1; Klon 16-10A1), Hamster-Anti-Ratten-CD54 (ICAM-1; Klon 3E2) oder Hamster-Anti-Ratten-CD48 (BCM-1; Klon HM48-1), alle von PharMingen. Alle Antikörper wurden mit einer Endkonzentration von 25 μg/ml verwendet.
Bestimmung der Fähigkeit kostimulatorischer Moleküle
T-Zellen und Stimulatorzellen wurden wie oben beschrieben vorbereitet. Zu den Wells wurden in verschiedenen Verhältnissen feste Stimulatorzellen, die eines oder mehrere kostimulatorische Moleküle exprimieren, in Kombination mit V-Wyeth-infizierten/festen Stimulatorzellen auf insgesamt 10⁴/Well zugegeben. Daraufhin wurden T-Zellen (10⁵/Well) zugegeben und die Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl CM in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A 2 Tage kultiviert und für die letzten 12–18 h der Inkubation mit 1 μCi/Well ³H-Thymidin markiert. Die enthaltene Radioaktivität wurde wie zuvor durch Flüssigkeitsszintillationszählung gemessen.
Cytokin-Analyse
CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellenpopulationen wurden wie oben beschrieben vorbereitet und mit 2,5·10⁶/Well in eine 6-Well-Platte (Costar) zugegeben. Die Stimulatorzellenpopulationen wurden wie oben vorbereitet und mit 2,5·10⁵/Well zugegeben. Die Zellen wurden in einem Gesamtvolumen von 5 ml CM in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A 24 Stunden kultiviert. Die überstehenden Fluide wurden gesammelt und durch die Erfassung ELISA wie zuvor beschrieben (21) auf Ratten-IL-2, -IFNγ, -TFN-α, -GM-CSF und -IL-4 analysiert. Die Empfindlichkeit der Detektion war in dieser Reihenfolge 30, 100, 20, 20 und 20 pg/ml.
RNA-Populationen von den stimulierten Zellen wurden ebenfalls durch einen Mehrproben-RNAse-Schutz-Assay (mpRPA) analysiert. Von PharMingen wurden definierte Ribo-Proben für Ratten-Cytokine gekauft. Die Assays wurden wie zuvor beschrieben (22) ausgeführt. Durch Elektrophorese an 6 %-Polyacrylamid-Gelen wurden mit einer geschützten Sonde markierte Duplexe abgetrennt. Die getrockneten Gele wurden bei –70 °C 24–72 Stunden einem Biomax-Film (Kodak) ausgesetzt. Die in den Bändern enthaltene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Storm-System-Phosphoimagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Die Netto-CPM für ein gegebenes Band wurde durch die folgende Formel berechnet [cpm Cytokin-Gen minus cpm Hintergrund] und als Prozent des Organisations-Gen-Transskripts L32 ausgedrückt.
Beispiel 24
B7-1, ICAM-1 und LFA-3 wirken synergistisch zusammen, um die T-Zellen-Proliferation zu verbessern.
Es ist gezeigt worden, dass B7-1-, ICAM-1- und LFA-3-Moleküle die T-Zellen-Proliferation einzeln kostimulieren. Da sie gleichzeitig an APC exprimiert werden können, ist es aber schwierig, die relativen Rollen der einzelnen kostimulatorischen Moleküle während der Induktion der T-Zellen-Proliferation zu untersuchen (2). Um den Beitrag von B7-1-, ICAM-1- und/oder LFA-3-Molekülen zur Induktion der naiven T-Zellen-Proliferation zu analysieren, wurde ein modifiziertes In-vitro-Modell (23, 24) genutzt, bei dem das erste Signal für die T-Zellen-Aktivierung über ein pharmakologisches Reagens (Con A) geliefert wurde. Unter Verwendung der Zelllinie MC38, die mit verschiedenen rekombinanten Impfpockenviren (24A) oder Geflügelpockenviren (24B) infiziert wurde, die manipuliert wurden, um kostimulatorische Moleküle zu exprimieren, wurde ein Feld von Stimulatorzellen erzeugt, die sich nur in Bezug auf die kostimulatorischen Moleküle unterschieden. Das zweite oder "kostimulatorische" Signal wurde über eines oder mehrere kostimulatorische Moleküle, die auf der Oberfläche dieser "Stimulator"-MC38-Zellen exprimiert wurden, an die T-Zelle geliefert. Wie in 24A gezeigt ist, induzierten die beiden nicht infizierten MC38-Zellen und MC38N-Wyeth bei allen untersuchten Niveaus von Con A eine geringfügige Proliferation von T-Zellen. MC38/LFA-3 induzierten eine kleine (2,1-fache), aber wesentliche (P < 0,05) Zunahme der T-Zellen-Proliferation. Die Lieferung des Signals 2 über MC38/ICAM-1 induzierte bei 2,5 μg/ml Con A eine 3,5-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation. MC38/B7-1 induzierte bei 2,5 bzw. bei 1,25 μg/ml Con A eine 7,8-fache und eine 16-fache Zunahme der Proliferation. Dagegen induzierten MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (MC38-Zellen, die alle drei kostimulatorischen Moleküle koexprimieren) bei 2,5 μg/ml Con A eine 17,5-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation und bei 1,25 μg/ml Con A eine 34-fache Zunahme. Darüber hinaus induzierte die Expression von ICAM-1 und LFA-3 bei niedrigen Con-A-Niveaus (0,625 μg/ml) keine T-Zellen-Proliferation. Obgleich B7-1 bei 0,625 μg/ml Con A eine messbare Proliferation (20.000 CPM) induzierte, induzierte die Koexpression aller drei kostimulatorischen Moleküle ein noch größeres Niveau der Proliferation (100.000 CPM) (24A). Diese Experimente wurden viermal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Außerdem wurden MC38-Stimulatorzellen durch Infektion mit rekombinanten Geflügelpockenvektoren vorbereitet (24B). Nicht infizierte MC38 oder MC38/WT-FP induzierten wieder bei allen untersuchten Niveaus von Con A eine geringfügige Proliferation von T-Zellen. Bei 2,5 μg/ml Con A unterstützten MC38/rF-ICAM-1 eine 2-fache Zunahme, unterstützten MC38/rF-B7-1 eine 3,2-fache Zunahme und unterstützten MC38/rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3 eine 6-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation. Wenn dieses Experiment zwei weitere Male wiederholt wurde, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Außerdem wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn das erste Signal über immobilisierte Anti-CD3 geliefert wurde (Daten nicht gezeigt). Die in der durch MC38/rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 und MC38/rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 unterstützten Proliferation (17-fach gegenüber 6-fach) festgestellten Unterschiede sind höchstwahrscheinlich eine Folge der Niveaus des exprimierten rekombinanten Proteins bzw. der exprimierten rekombinanten Proteine nach einer 5-Stunden-Infektionsperiode (23). Genauer exprimieren näherungsweise 70 % der mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierten Zellen die kostimulatorischen Moleküle, während näherungsweise 40 % der mit rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierten Zellen positiv sind. Diese mit den rF-Vektoren infizierten positiven Zellen exprimieren bei den verwendeten Bedingungen die rekombinante B7-1 und ICAM-1 mit Niveaus von 50 % jener Zellen, die mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 infiziert werden.
Beispiel 25
Spezifizität des Beitrags kostimulatorischer Moleküle zur T-Zellen-Proliferation
Um die Spezifizität des Proliferationsbeitrags von B7-1, ICAM-1 oder LFA-3 weiter zu bestätigen, wurden wieder durch Infektion mit V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1 oder rV-LFA-3 MC38-Stimulatorzellen vorbereitet und mit naiven Ratten-T-Zellen und Con A in Anwesenheit oder Abwesenheit von für das gegebene kostimulatorische Molekül spezifischer MAb kokultiviert. Wie in 3B gezeigt ist, verbesserte MC38/B7-1 die T-Zellen-Proliferation 4,5-mal mehr als MC38N-Wyeth (25A). Diese erhöhte Proliferation wurde durch die Zugabe eines blockierenden MAb für Ratten-B7-1 zu 83 % verhindert. Ähnlich erhöhte MC38/ICAM-1 (25C) die Proliferation 2,25-fach, was daraufhin in Anwesenheit von Anti-Ratten-ICAM-1-MAb um 88 % verringert wurde. Schließlich erhöhte MC38/LFA-3 (25D) die Proliferation 2,1-fach, was daraufhin in Anwesenheit von Anti-Ratten-CD48-MAb um 98 % verringert wurde. Für jede Gruppe blockierte die Inkubation mit dem geeigneten Isotypkontrollantikörper (wie in Materialien und Verfahren spezifiziert) die festgestellte Proliferation nicht. Dieses Experiment wurde zwei weitere Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 26
Bestimmung der Fähigkeit kostimulatorischer Moleküle
Die Modifizierung des In-vitro-Kostimulations-Assays ermöglichte eine quantitative Schätzung der relativen Fähigkeit von B7-1, ICAM-1 und/oder LFA-1 zum Liefern des zweiten Signals für die T-Zellen-Proliferation. Zu diesem Zweck wurden Stimulatorzellen (mit den verschiedenen rekombinanten Impfpockenviren infizierte MC38-Zellen) durch Verdünnung mit veränderlichen Mengen von mit V-Wyeth infizierten MC38-Zellen ausgetitert und mit einer konstanten Anzahl von T-Zellen in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A kokultiviert. Das MC38/T-Zellen-Verhältnis in diesen Experimenten blieb konstant bei 1:10. Wie in 4 zu sehen ist, verbesserte MC38/LFA-3 (Volldreiecke) die Proliferation der T-Zellen gegenüber der von MC38/V-Wyeth (Leerquadrate) bis zu einer Konzentration von 40 % (d. h. von den Stimulatorzellen in der Well wurden 40 % mit rV-LFA-3 infiziert und wurden die verbleibenden 60 % mit V-Wyeth infiziert). MC38/ICAM-1 (Vollkreise) oder MC38/B7-1 (Vollrauten) unterstützten die erhöhte Proliferation bis zu einer Konzentration von 13 % bzw. 6 %. Im Gegensatz dazu verbesserten MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 die Proliferation, wenn weniger als 3 % Stimulatorzellen den Dreiervektor enthielten (extrapoliert auf weniger als 1 % über lineare Analyse der kleinsten Quadrate). Bei gegebenen Titrationskurven dieser einzelnen kostimulatorischen Moleküle schien es, dass der durch ICAM-1 und B7-1 vermittelte Umfang der T-Zellen-Proliferation 3-mal bzw. 6-mal potenter als der durch LFA-3 allein vermittelte ist. Allerdings wird die stärkste Proliferation eindeutig durch B7-1/ICAM-1/LFA-3 vermittelt. Es wird angemerkt (26), dass die Expression von LFA-3, ICAM-1 und sogar B7-1 allein bei verhältnismäßig niedrigen Stimulatorzellenkonzentrationen (d. h., wenn 3 %–6 % der MC38-Zellen als Stimulatorzellen wirken) die T-Zellen-Aktivierung nicht verbessern, während die drei kostimulatorischen Moleküle, die Stimulatorzellen exprimieren, die T-Zellen-Aktivierung wesentlich verbessern. Die Daten in 26 (Einsatz) zeigen die Proliferationsergebnisse, die erhalten wurden, wenn 3 % der MC38-Stimulatorzellen mit den bezeichneten Vektoren infiziert wurden. Da jede Well 10⁴ Gesamt-MC38-Zellen und 10⁵ naive T-Zellen enthielt, war das tatsächliche Stimulator/T-Zellen-Verhältnis in diesen Kulturen 0,003. Es wird angemerkt, dass die mit dem Zwei-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1) infizierten MC38-Zellen unter diesen Bedingungen wenig, wenn überhaupt, Proliferation von T-Zellen induzierten, während MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 die Proliferation wesentlich erhöhten (p < 0,0001).
Beispiel 27
Kostimulation von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen
Um die T-Zellen-Reaktion auf einzeln oder in Kombination exprimierte kostimulatorische Moleküle weiter zu charakterisieren, wurde die Fähigkeit von B7-1, ICAM-1 und LFA-3 zur Kostimulation gereinigter CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen getestet. 5 zeigt die Proliferation gereinigter CD4⁺-Zellen (27A) und CD8⁺-T-Zellen (27B), die mit suboptimalen Konzentrationen von Con A aktiviert wurden. Die Wirkungen der Schichtung der Stimulatorzellen auf die Proliferation war für CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen ähnlich: MC38/LFA-3 stimulierten die schwächste Proliferation, gefolgt von MC38/ICAM-1 und MC38/B7-1, MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 waren die potentesten Stimulatorzellen für CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen. Diese Experimente wurden drei weitere Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Es wird angemerkt, dass es bei sehr niedrigen Konzentrationen von Con A (0,625 μg/ml, 5, Felder C und D) keine wesentliche Verbesserung der Aktivierung von CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen gab, wenn zum Liefern des zweiten Signals entweder die ICAM-1-, LFA-3-, B7-1- oder die B7-1/ICAM-1-Kombination verwendet wurde. Dagegen wurde eine wesentliche Aktivierung der beiden T-Zellen-Teilmengen beobachtet, wenn das die Dreiergruppe kostimulatorischer Moleküle koexprimierende Impfpockenvirus genutzt wurde. Wenn das erste Signal über immobilisierte Anti-CD3 geliefert wurde (Daten nicht gezeigt), wurden ähnliche Ergebnisse festgestellt.
Es ist berichtet worden, dass die B7-1-Kostimulatrion die Halbwertszeit von IL-2 mRNA und die Aufwärtsregulation der IL-2-Transkription verlängert, was zur Erzeugung beträchtlicher Mengen abgesonderter IL-2 führt (4,25). Zusätzlich ist berichtet worden, dass die T-Zellen-Kostimulation mit LFA-3 eine Wirkung auf eine Vielzahl von Cytokinen, insbesondere IL-2 und IFN-γ, hat (6). Um qualitative und quantitative Wirkungen der Kostimulation durch einzelne und mehrere kostimulatorische Moleküle auf die Cytokin-Produktion zu bestimmen, wurden gereinigte CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen erneut mit verschiedenen Stimulatorzellen, die B7-1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren, allein oder in Kombination mit der Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A kokultiviert. Die überstehenden Fluide wurden nach 24 Stunden auf IL-2, IFN-γ, TFN-α, GM-CSF und IL-4 analysiert. Nicht infizierte MC38 (Daten nicht gezeigt) und MC38/V-Wyeth induzierten aus CD4⁺-Zellen eine geringfügige Menge IL-2 (28A), während MC38/B7-1 3,979 pg/ml induzierten. Dagegen induzierte eine T-Zellen-Stimulation mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 eine 10-mal größere Menge IL-2. Ähnlich induzierte MC38/B7-1 aus CD8⁺-Zellen eine geringfügige Menge IL-2 (28B), während MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 eine 20-mal höhere Menge (6,182 pg/ml) induzierte. Die IFN-γ-Produktion durch stimulierte T-Zellen wurde ebenfalls untersucht. MC38/B7-1 und MC38/LFA-3 induzierten aus CD4⁺-Zellen nur mäßige Mengen IFN-γ (28C). Im Gegensatz dazu induzierte die Stimulation von CD4⁺-Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 4-mal mehr IFN-γ als die Stimulation mit irgendeinem anderen Konstrukt. Die Stimulation von CD8⁺-Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 induzierte die größte Menge IFN-γ, mehr als 6-mal mehr als die CD8⁺-Zellen, die mit irgendeinem der anderen Konstrukte stimuliert wurden (28D). Die Stimulation jedes Zelltyps mit irgendeinem Konstrukt vermittelte keine wesentlichen Änderungen (p > 0,05) in Bezug auf die Niveaus abgesonderter TNF-α, GM-CSF oder IL-4 (Daten nicht gezeigt). Es scheint, dass der vorherrschende Gipfelpunkt der Stimulation über das Dreierkonstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) die IL-2-Absonderung von CD4⁺-Zellen und die IFN-γ-Absonderung von CD8⁺-T-Zellen war. Diese Experimente wurden weitere dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Außerdem wurden Untersuchungen ausgeführt, um mit dem Zwei-Gen-Konstrukt infizierte Stimulatorzellen (rV-B7-1/ICAM-1) gegenüber dem Mehr-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) auf ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Cytokin-Produktion durch T-Zellen zu vergleichen. In der IFN-γ-Produktion entweder durch CD4⁺- oder durch CD8⁺-Zellen oder in der IL-2-Produktion durch CD8⁺-Zellen wurden zwischen den beiden nur kleine Unterschiede beobachtet. In der Stimulation der IL-2-Produktion durch CD4⁺-Zellen (5.000 pg/ml unter Nutzung von MC38/B7-1/ICAM-1 gegenüber 39.600 pg/ml unter Nutzung von MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3) war aber ein wesentlicher Unterschied zu sehen.
Die mit einzelnen oder mehreren kostimulatorischen Molekülen stimulierte Cytokin-Expression von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen wurde unter Nutzung des Mehrsonden-RNAse-Schutz-Assays (mRPA) ebenfalls auf der RNA-Ebene analysiert. Es sind ein repräsentatives Röntgenprofil und eine quantitative Analyse von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt (29). Die Niveaus von IL-4, IL-5, IL-10, IL-15 und IL-6 waren in mit MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1, MC38/LFA-3 oder MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimulierten CD4⁺-T-Zellen ähnlich (29, Histogramm des Felds B). Die IL-2- und IFN-γ-Expressionsniveaus waren in mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimulierten CD4⁺-T-Zellen im Vergleich mit CD4⁺-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert wurden, die irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül exprimieren, am höchsten (29B). In CD4⁺-Zellen, die mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimuliert wurden, wurden ebenfalls etwas höhere Niveaus von IL-13, IL-9 und IL-6 festgestellt. In stimulierten CD8⁺-T-Zellen wurde die Expression von Cytokin-Genen ebenfalls analysiert. Von den analysierten Cytokin-RNAs waren die IL-2- und insbesondere die IFN-γ-Niveaus im Vergleich zu T-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert wurden, die irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül exprimieren, wesentlich höher, wenn diese Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimuliert wurden. Somit war der vorherrschende synergistische Effekt der Dreiergruppe kostimulatorischer Moleküle in der Cytokin-Produktion in CD4⁺-Zellen IL-2 und in CD8⁺-T-Zellen IFN-γ.
Beispiel 28
Wirkung der TRICOM-Kostimulation auf die Apoptosis stimulierter T-Zellen
Apoptosis-Untersuchungen
Um zu bestimmen, ob die Stimulation von T-Zellen mit Signal 1 und rV-TRICOM zum Zellenüberleben oder zum programmierten Zellentod (PCD) führen würde, wurden CD8⁺-T-Zellen für Signal 1 mit Con A aktiviert, 48 h mit mit V-WT, mit rV-B7-1 oder mit rV-TRICOM infizierten MC38-Zellen kultiviert und 24 h im Medium replattiert, um die Apoptosis zu messen. Die Apoptosis wurde unter Verwendung des TUNEL-Assays beurteilt, wie er von Gavrieli, Y., u. a., J. Cell Biol 119:493–501, 1992, beschrieben wurde. Durch die Kombination von MC38 und Con A oder von MC38/V-WT und Con A aktivierte T-Zellen zeigten in Abwesenheit kostimulatorischer Signale hohe Niveaus spontaner Apoptosis (jeweils 82,9 ± 1). Durch Con A und MC38/B7-1 oder durch Con A und MC38/TRICOM aktivierte T-Zellen zeigten eine wesentlich kleinere spontane Apoptosis (31,3 ± 3,8 bzw. 30,7 ± 1).
Die Ergebnisse weisen in T-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert wurden, in Anwesenheit von Con A mit oder ohne V-WT-Infektion (d. h. in Anwesenheit des Signals 2) deutlich die Apoptosis nach. Obgleich Con A mit MC38/TRICOM CD8⁺-Zellen eindeutig auf viel stärkere Niveaus als Con A mit MC38/B7-1 stimulierte und zur Herstellung höherer Niveaus von IFN-γ und IL-2 führte, führt dies nicht zu einem höheren Grad der Apoptosis.
Beispiel 29
Anti-Tumor-Wirkung von rV-CEA/TRICOM in vivo
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine antigenspezifische Immunreaktion unter Verwendung eines TRICOM-Vektors verbessert werden könnte. Es wurde eine mit rV-CEA/TRICOM bezeichnete Vier-Gen-Impfpocken-Rekombinante konstruiert, die das menschliche CEA-Gen und die Gene B7-1, ICAM-1 und LFA-3 enthielt, wie sie hier offenbart ist. Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57-BL/6-Mäuse (Taconic Farms) oder C57-BL/6-Mäuse, die transgenisch für menschliche CEA sind (Kass, E., u. a., Cancer Res. 59:676–683, 1999), wurden durch Schwanzhautritzung entweder mit Hanks ausbalancierter Salzlösung (HBSS) oder einmal mit 10⁷ PFU rV-CEA, rV-CEA/B7-1 oder rV-CEA/TRICOM geimpft, und 22 Tage später wurden die Milzen geerntet. Die lymphoproliferative Aktivität der Splenozyten wurde wie zuvor beschrieben analysiert (5).
Wie in 30 (Einsatz) zu sehen ist, zeigten die Milz-T-Zellen der mit rV-TRICOM geimpften Mäuse im Vergleich zu T-Zellen, die von Mäusen erhalten wurden, die mit rV-CEA geimpft wurden, höhere Niveaus einer CEA-spezifischen Stimulation; Ovalbumin und Con A wurden als Kontrollen verwendet. Daraufhin wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob rV-CEA/TRICOM eine Langzeitimmunität induzieren könnte. Mäuse (5/Gruppe) wurden einmal mit einem von VWT, rV-CEA oder rV-CEA/TRICOM geimpft. Einhundert Tage später wurden die Mäuse mit einer hohen Dosis (1·10⁶) MC38-Dickdarmkarzinomzellen, die CEA exprimieren (5), herausgefordert. Alle Mäuse, die V-WT und rV-CEA empfingen, erlagen den Tumoren, während alle mit rV-TRICOM geimpften Mäuse 50 Tage nach der Herausforderung am Leben waren (30).

CEA-transgenische Mäuse (Kass 1999, ebd.; Thompson, J. A., u. a., J. Clin. Lab. Anal. 5:344–366, 1999), in denen das menschliche CEA-Gen in normalem gereiftem Magen-Darm-Gewebe exprimiert wird und deren Serum CEA-positiv ist, wurden genutzt, um zu bestimmen, ob der rV-CEA/TRICOM-Vektor die T-Zellen-Reaktionen auf ein Autoantigen verbessern konnte. Die CEA-transgenischen Mäuse wurden in 5 Mäuse/Gruppe getrennt. Zwei Mäuse wurden einmal mit 10⁷ PFU rV-CEA, rV-CEA/B7-1, rV-CEA/TRICOM oder mit einem Puffer geimpft und wurden am Tag 30 eingeschläfert, um die CEA-spezifischen T-Zellen-Reaktionen zu analysieren. Die nach der Impfung mit rV-CEA/TRICOM erhaltenen T-Zellen-Reaktionen waren wesentlich größer als jene, die mit rV-CEA erhalten wurden (Tabelle 2). Die Reaktionen auf Ovalbumin und Con A wurden als Kontrollen verwendet. Die verbleibenden 3 CEA-transgenischen Mäuse in jeder Gruppe wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die Anti-Tumor-Reaktionen auf einen CEA-exprimierenden Tumor unter Nutzung eines TRICOM-Vektors verbessert werden konnten. Diese Mäuse wurden zuerst SC mit 4·10¹⁵ MC38-Karzinomzellen, die das CEA-Gen exprimieren, inokuliert (5). Vier Tage später wurden die Mäuse einmal an einer entfernten Stelle mit 10⁷ PFU-Virusrekombinante oder mit einem Puffer geimpft. In Mäusen, die mit rV-CEA/TRICOM geimpft wurden, wuchsen keine Tumoren, während in Mäusen, die mit einem Puffer, mit rV-CEA und mit rV-CEA/B7-1 geimpft wurden, weiter Tumoren wuchsen (Tabelle 2). Diese Ergebnisse unterstützen die In-vivo-Aktivität von TRICOM-Vektoren. Tabelle 2. Verbesserte Immunreaktion und Anti-Tumor-Reaktion von rV-CEA/TRICOM in CEA-transgenen Mäusen

Stimulationsindex (SI)
	Con A	Oval	CEA	CEA	Tumorwert
Immunogen	(5 μg/ml)	(100 μg/ml)	(100 μg/ml)	(25 μg/ml)	Tag 14	Tag 35
HBSS	109	1,0	1,3	2,0	698±928	3,674±3,107
rV-CEA	123	0,9	4,9	4,0	259±0	1,112±1,685
rV-CEA/B7-1	93	1,3	7,1	4,3	150 ± 236	2,696 ± 1,936
rV-CEA/TRICOM	111	1,1	19,2	15,9	0±0	±0

C57BL/6-CEA-transgene Mäuse (5 pro Gruppe) wurden einmal am Tag 0 über Hautritzung mit Puffer oder mit Impfpockenrekombinante (10⁷ PFU) geimpft. Am Tag 30 wurden 2 Mäuse getötet und die Milz-T-Zellen auf T-Zellen-Proliferationsreaktionen analysiert. Jeder Wert repräsentiert den SI des mittleren CPM von Dreifachproben gegenüber Medien. Die Standardabweichung überstieg nie 10 %. Am Tag –4 erhielten 3 Mäuse pro Gruppe 4·10⁵ MC38-Dickdarmkarzinomzellen, die CEA exprimieren. Das Tumorvolumen ist an den Tagen 14 und 35 nach der Impfung gegeben.
Beispiel 30
Kostimulation von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen durch Vorläufer-Dendritenzellen und Dendritenzellen, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert sind

Von C57BL/6-Mäusen wurden durch das Verfahren von Inaba u. a. (41) frische CD34⁺-Knochenmarkzellen (Dendritenzellenvorläufer) erhalten. Diese Vorläuferzellen wurden entweder sofort verwendet oder 6 Tage in GM-CSF und IL-4 kultiviert (42), um gereifte Dendritenzellen (DC) zu erzeugen. Die CD34⁺-Vorläuferzellen und die DC wurden 18 Stunden mit dem rekombinanten Impfpockenvirus, das mehrere kostimulatorische Moleküle rV-B7/ICAM-1/LFA-3 (rV-Tricom) codiert, 10 MOI, infiziert. Nach 5 Stunden Infektion wurde eine Zellenprobe geerntet und eine Phänotypanalyse ausgeführt. Die Dendritenzellen werden im Gebiet als die 'endgültigen' APC vorgestellt, die mit hohen Niveaus eine große Anordnung kostimulatorischer Moleküle exprimieren. Tabelle 3 zeigt, dass Ratten-DC tatsächlich die kostimulatorischen Moleküle B7-1, B7-2, ICAM-1 und LFA-3 mit verhältnismäßig hohen Niveaus (mittlere Fluoreszenz-Intensität, MFI; in Klammern gezeigt) exprimiert. Allerdings gab es dann, wenn DC mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert wurden, eine wesentliche Zunahme sowohl des Niveaus der Expression kostimulatorischer Moleküle als auch des Prozentsatzes der Zellen, die die mehreren kostimulatorischen Moleküle exprimieren. Der Prozentsatz der Zellen, die B7-1 exprimieren, nahm von 65 % auf 86 % zu, während die MFI 4-fach zunahm; der Prozentsatz der Zellen, die ICAM-1 exprimieren, nahm von 32 % auf 68 % zu, während die MFI 2,5-fach zunahm; der Prozentsatz der Zellen, die LFA-3 exprimieren, nahm von 44 % auf 75 % zu. Tabelle 3 Phänotypanalyse der Vorläufer-DC vor und nach der Infektion¹ mit rV-COS²

Marker
Infektion	H2-K^b	I-A^b	CD11b	CD11c	B7-2	B7-1	ICAM-1	LFA-3
keine	90³ (994)⁴	64 (621)	63 (397)	29 (223)	38 (319)	65 (300)	32 (336)	44 (378)
V-Wyeth	75 (554)	60 (633)	59 (398)	27 (218)	36 (317)	65 (311)	33 (296)	43 (322)
rV-B7	76 (516)	67 (755)	70 (419)	34 (213)	41 (320)	83 (661)	43 (363)	51 (333)
rV-B7I/	79	63	63	30	42	86	68	75
ICAM/ LFA-3	(579)	(696)	(408)	(203)	(360)	(1253)	(810)	(484)

¹ 5 Stunden Infektion mit 10 MOI
² rV-COS = rekombinante Impfpocken, die ein kostimulatorisches Fremdmolekül codieren.
³ = % Zellen, die den Marker exprimieren
⁴ = mittlere Fluoreszenz-Intensität

Wie in 31 umrissen ist, wurden die infizierten CD34⁺-Vorläuferzellen und DC zur Verwendung als Stimulatorzellen bestrahlt (2.000 Rad) und zum Stimulieren naiver CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen in Anwesenheit von Con A verwendet.
Vorläuferdendritenzellen, die mit einem rekombinanten Pockenvirus infiziert waren, das B7.1, ICAM-1 und LFA-3 codiert, konnten sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellen stimulieren. Die Stimulation der CD8⁺-T-Zellen durch die B7.1-, ICAM-1-, LFA-3-exprimierenden Vorläuferdendritenzellen war größer als die, die unter Verwendung nicht infizierter gereifter CD34⁺-Dendritenzellen erzielt wurde (32). Darüber hinaus führten die Infektion und Expression der drei kostimula torischen Moleküle in gereiften CD34⁺-Dendritenzellen (die mit IL-4 und mit GM-CSF vorbehandelt wurden) zu einer drastischen Zunahme der Stimulation sowohl von CD4⁺- als auch von CD8⁺-T-Zellen (33).
Der Fachmann kann außerdem die Qualität einer Dendritenzellenpopulation anhand ihrer Fähigkeit messen, eine alloreaktive Reaktion (gemischte Lymphozytenreaktion, MLR) zu unterstützen (43). 34 zeigt die Ergebnisse einer gemischten Lymphozytenkultur, die mit rV-TRICOM infizierte Dendritenzellen verwendet. Die gemischte Lymphozytenreaktion verwendet DCs von C57BL/6-Mäusen, die T-Lymphozyten von Balb/c stimulieren (d. h. eine Anti-Allotyp-Reaktion).
Diese Daten zeigen, dass der Grad der Proliferation in einer gemischten Lymphozytenreaktion unter Verwendung von mit rV-TRICOM infizierten DCs im Vergleich zu nicht infizierten DCs oder im Vergleich zu mit Impfpocken vom Wildtyp infizierten DCs drastisch höher ist.
35 veranschaulicht, dass mit rV-TRICOM infizierte DCs beim Stimulieren einer CEA-Peptid-spezifischen Ratten-T-Zelllinie viel besser sind als Standard-DCs. Diese T-Zelllinie ist CD8⁺ und ist spezifisch für das CEA-D^b-Klasse-I-beschränkte Epitop EAQNTTYL (CAP-M8). Die Kombination mit dem CEA-Peptid (1 μg/ml) gepulster und zuvor mit rV-TRICOM infizierter DCs ist beim Stimulieren CEA-spezifischer T-Zellen-Reaktionen, insbesondere bei niedrigen T-Zellen-DC-Verhältnissen, deutlich überlegen.
Beispiel 31
Ratten-T-Zellen-Stimulation in vitro und in vivo unter Verwendung rV- oder rF-TRICOM-infizierter von Rattenknochenmark abgeleiteter Dendritenzellen
Experimentelles Protokoll
Peptide
Die H-2k^b-beschränkten Peptide OVA (Ovalbumin_257-264, SIINFEKL)⁴¹ und VSVN (Gingivostomatitis-Virus N_52-59, RGYVYQGL)⁴² und die H-2D^b-beschränkten Peptide CAP-M8 (CEA_526-533, EAQNTTYL) und FLU-NP (NP_366-374, ASNENMDAM)⁴³ wurden entweder gekauft (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) oder firmenintern synthetisiert (Applied Biosystems 432A Synergy Peptide Synthesizer, Foster City, CA).
Zelllinien und Zellenkulturen
Die OVA- und Cap-M8-CD8⁺-zytotoxischen T-Zelllinien wurden firmenintern aus C57BL/6-Mäusen erzeugt und erkennen die OVA- bzw. die Cap-M8-Peptide. Die CTL-Zelllinien wurden durch wöchentliche In-vitro-Stimulationszyklen mit bestrahlten naiven Splenozyten in Vollnährmedium (CM) [RPMI 1640 mit fötalem Kalbsserum (10%); Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Hepes (7 mM) Gentamicin (50 μg/ml), 2-Mercaptoethanol (50 μM) und unwesentliche Aminosäuren (0,1 mM), (Biofluids, Rockville, MD)], ergänzt mit 1 μg/ml spezifischem Peptid und 10 U/ml Ratten-IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), erhalten. Vierundzwanzig Stunden vor der Verwendung dieser Zellen als Responder in antigenspezifischen Proliferations-Assays wurden die Zellen durch Zentrifugation über einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (Dichte = 1,119 g/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gereinigt und in Sechs-Well-Kulturplatten (10⁶ Zellen/ml, 5 ml/Well) in CM, das nur mit 10 U/ml Ratten-IL-2 ergänzt war, replattiert. Die für Zytotoxizitätsproben verwendete Ziel-Tumorzelllinie war EL-4 (C57BL/6, H-2^b, Thymusgeschwulst, ATCC TIB-39).
DC-Vorbereitung
Von sechs bis acht Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen (Taconic Farms, Germantown, NY) wurde Knochenmark abgeleitet. Die in dieser Untersuchung verwendete Prozedur war eine gegenüber der von Inaba u. a.⁴¹ beschriebenen etwas modifizierte Version. Kurz gesagt, wurde das Knochenmark von den langen Knochen der Gliedmaßen gespült und über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geleitet. Die Knochenmarkzellen wurden unter Verwendung eines Cocktails für CD4, CD8 und Anti-MHC-Klasse-II spezifischer Magnetperlen (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) von Lymphozyten und Ia⁺-Zellen geleert. Die Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten (10⁶ Zellen/ml, 5 ml/Well) in CM, das mit 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 ergänzt war (R&D Systems, Minneapolis, MN), plattiert. An den Tagen 2 und 4 wurden die Zellen in frischen mit Cytokin ergänzten Medien replattiert. An Tag 6 der Kultur wurden die Zellen für die Infektion, für die Analyse und für die Immunisierungen geerntet. Für spezifische Experimente wurden die DC während der letzten 24 h der Kultur mit Ratten-TFN-α (100 ng/ml, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) oder mit CD40 mAb (5 μg/ml, PharMingen, San Diego, CA) behandelt.
Rekombinantes Pockenvirus
Das rV-Virus, das das Gen enthält, das unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L) das kostimulatorische Rattenmolekül B7-1 (CD80) codiert (mit rV-B7-1 bezeichnet), ist hier beschrieben worden. Das rV-Virus, das das Ratten-LFA-3-Gen (CD48) unter der Steuerung des 30K-Impfpockenpromotors (M2L), das Ratten-ICAM-1-Gen (CD54) unter der Steuerung des I3-Impfpockenpromotors und das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L) enthält, ist als rV-TRICOM bezeichnet worden. Die Vektoren rF-B7-1 und rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (die als rF-TRICOM bezeichnet sind) sind rF-Viren, die ähnlich wie rV-B7-1 bzw. rV-TRICOM konstruiert wurden. In bestimmten Experimenten wurde ein Geflügelpocken-TRICOM-Konstrukt verwendet, das ein Reporter-Gen, menschliches CEA, enthält. Ein nicht rekombinantes Impfpockenvirus vom Wildtyp (Wyeth-Stamm) wurde mit V-WT bezeichnet, während das Geflügelpockenvirus vom Wildtyp mit FP-WT bezeichnet wurde.
Infektion von DC
Die DC wurden an Tag 6 geerntet und mit Opti-Mem (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) gewaschen. Daraufhin wurden die Zellen 5 h entweder mit HBSS scheininfiziert; mit V-WT, rV-B7 oder rV-TRICOM mit 25 MOI (Infektionsmultiplizität; PFU/Zelle) infiziert; oder mit FP-WT, rF-B7-1 oder rF-TRICOM in Opti-Mem mit 50 MOI infiziert. Nach der Infektion wurde warmes CM zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen für die immunhistochemische Färbung, In-vitro-Kostimulationsanalyse und In-vivo-Verabreichung geerntet.
Durchflusszytometrische Analyse
Die Zelloberflächenfärbung nutzte Dreifarben-Immunfluoreszenz. Die Färbung wurde mit primären FITC-markierten Antikörpern CD11c, CD11b, H-2K^b, H-2D^b, CD19, Pan-NK; mit primären PS-markierten Antikörpern IA^b, CD48 (mLFA-3), CD86 (B7-2), CD3, CD14; und mit biotinmarkierten Antikörpern CD80 (B7-1), CD57 (ICAM-1), CD40 ausgeführt. Die biotinmarkierten Antikörper wurden nachfolgend mit Cychrom-Streptavidin markiert. Alle Antikörper wurden von PharMingen gekauft. Die Zellenfluoreszenz wurde mit einem FACSCAN-Zytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) unter Verwendung der Software Lysis II analysiert und mit den geeigneten isotypangepassten Kontrollen (PharMingen) verglichen.
In-vitro-Kostimulationsanalyse: Pharmakologisches Signal 1
Es wurden weibliche sechs- bis acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse erhalten (Taconic Farms, Germantown, NY) und wie zuvor beschrieben⁵ naive T-Zellen isoliert. Die T-Zellen wurden mit 10⁵/Well in 96-Well-Platten mit flachem Boden (Costar, Cambridge, MA) zugegeben. Die Stimulatorzellen bestanden entweder aus nicht infizierten DC, aus scheininfizierten DC oder aus DC, die mit Impfpockenvektoren (V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM) oder mit Geflügelpockenvektoren (FP-WT, rF-B7-1 oder rF-TRICOM) infiziert, bestrahlt (20 Gy) und mit 10⁴/Well zugegeben wurden. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl von CM 2 Tage in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen (2,5 bis 0,9 μg/ml) von Con A (Sigma) kultiviert. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl CM in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen (2,5 bis 0,9 μg/ml) von Con A (Sigma) 2 Tage kultiviert. Die Zellen wurden für die letzten 12–18 h der Inkubation mit 1 μCi/Well ³H-Thymidin (New England Nuclear, Wilmington, DE) markiert und mit einem Tomtec-Zellenernter (Wallac Incorporated, Gaithersburg, MD) geerntet. Die enthaltene Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Wallac 1205 Betaplate, Wallac, Inc.) gemessen. Die Ergebnisse von drei Wells wurden gemittelt und als Mittelwert CPM ± SEM berichtet.
Reaktion gemischter Lymphozyten
Um die stimulierende Funktion von DC für allogenetische und syngenetische naive T-Zellen zu beurteilen, wurden MLR verwendet. Die T-Zellen wurden wie zuvor aus Balb/C- oder C57BL/6-Mäusen isoliert. Die Stimulatorzellen bestanden aus DC, die entweder nicht infiziert wurden, scheininfiziert wurden oder mit V-WT, rV-137-1, rV-TRICOM, FP-WT, rF-B7-1 oder RF-TRICOM infiziert und bestrahlt (20 Gy) wurden. Die T-Zellen (5·10⁴/Well) wurden mit abgestuften Anzahlen von Stimulatorzellen in CM in 96-Well-Kulturplatten mit flachem Boden kokultiviert und 4 Tage bei 37 °C, 5 % CO₂, inkubiert, für die letzten 12–18 h der Inkubation mit 1 μCi/Well ³H-Thymidin markiert, geerntet und wie zuvor analysiert.
In-vitro-Kostimulationsanalyse: peptidspezifisches Signal
Die erholten OVA- oder CAP-M8-T-Zellen (Responder) wurden mit 5·10⁴/Well in 96-Well-Platten mit flachen Böden zugegeben. Die Stimulatorzellen bestanden aus DC, die entweder nicht infiziert wurden oder mit V-WT, rV-137-1 oder rV-TRICOM infiziert und bestrahlt (20 Gy) wurden. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl CM kultiviert. Der Kostimulations-Assay wurde unter Verwendung von zwei Sätzen von Bedingungen ausgeführt: (1) ein festes Verhältnis von 10:1 von Responder:Stimulator-Zellen, die in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen eines spezifischen Peptids oder eines geeigneten Kontrollpeptids kultiviert wurden, oder (2) eine feste Konzentration eines spezifischen Peptids oder eines Kontrollpeptids, das bei verschiedenen Responder:Stimulator-Zellen-Verhältnissen kultiviert wurde. Die Zellen wurden wie zuvor 72 h kultiviert, für die letzten 12–18 h der Inkubation mit 1 μCi/Well mit ³H-Thymidin markiert, geerntet und analysiert.
CTL-Induktion in vivo und zytotoxische Analyse
DC (1·10⁶), die entweder nicht infiziert waren oder mit V-WT oder rV-TRICOM infiziert waren, wurden zweimal in Opti-Mem gewaschen und in 1 ml desselben Mediums, das 10 μM entweder OVA- oder CAP-M8-Peptide enthielt, resuspendiert. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen zweimal in HBSS gewaschen und in HBSS für die Injektionen resuspendiert. Peptidgepulste DC (1·10⁵ Zellen/Maus) wurden 1–3-mal intravenös in 7-Tage-Intervallen injiziert. Kontrollmäuse wurden subkutan mit 100 μg angegebenem Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans (Ribi ImmunoChem Research, Hamilton, MT) immunisiert. Vierzehn Tage nach der letzten Inokulation wurden die Milzen von zwei Tieren pro Gruppe entnommen, in Einzellensuspensionen dispergiert, gemischt und mit 10 μg/ml eines geeigneten Peptids sechs Tage koinkubiert. Die Masse der Lymphozyten wurden durch Zentrifugation durch einen Dichtegradienten (LSM, Organon Teknika, West Chester, PA) entfernt. Wie zuvor⁴⁵ wurden EL-4-Zellen unter Verwendung von ¹¹¹In zur Verwendung als Ziele in einem Standardzytolyse-Assay vorbereitet. Die Zielzellen wurden 1 Stunde bei 37 °C mit 10 μM spezifischem Peptid gepulst, während eine zweite Gruppe von Zielzellen mit Kontrollpeptid gepulst wurden.
Lymphozyten und peptidgepulste Ziele (5·10³ Zellen/Well) wurden in CM suspendiert, in Effektor:Ziel-Verhältnissen von 80:1 bis 10:1 in 96-Well-Platten mit U-Boden (Costar) kombiniert und 5 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation wurden überstehende Flüssigkeiten unter Verwendung eines Supernatant Collection Systems (Skantron, Sterling, VA) gesammelt und wurde unter Verwendung eines Gammazählers (Cobra Autogamma, Packard, Downers Grove, 1L) die Radioaktivität quantifiziert. Der Prozentsatz spezifischer Freisetzung von ¹¹¹In wurde durch die Standardgleichung: % spezifische Lyse = [(experimentell spontan)/(maximal spontan)]·100 bestimmt. Wo angegeben, wurde die CTL-Aktivität, wie von Wunderlich, u. a., 1994 beschrieben in Lyse-Einheiten (LU) umgewandelt.
Anti-Impfpocken-Antikörperanalyse
V-WT wurde mit 5·10⁵/Well zu Polyvinylchloridplatten (Dynatech, Chantilly, VA) zugegeben, über Nacht bei 37 °C getrocknet und mit 5 % BSA blockiert. Abgestufte Verdünnungen von Seren von immunisierten Mäusen wurden dreifach zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und eine weitere Stunde mit mit Peroxidase markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) inkubiert. Die Wells wurden mit o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) entwickelt und die H₂O₂-Reaktionen wurden mit H₂SO₄ angehalten. Die Extinktion jeder Well wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-ELISA-Lesers Bio-Tek EL312e (Winooski, VT) gelesen.
Ergebnisse
Erhöhte Expression kostimulatorischer Moleküle an DC
Um die Effizienz der Pockenvirusinfektion von DC zu bestimmen, wurden diese Zellen entweder mit einem rV-Virus, das B7-1, ICAM-1 und LFA-3 codiert (als rV-TRICOM bezeichnet), oder mit einem rF-Virus, das B7-1, ICAM-1, LFA-1 und menschliches carcinoembryonales Antigen (CEA) codiert (als rF-CEA/TRICOM), infiziert. Im letzteren Fall wurde das CEA als ein Reporter-Gen verwendet, da Geflügelpocken-Strukturproteine nicht in infizierten Zellen exprimiert werden. Nach 18 h wurden die Zellen auf die Expression von der besonderen Virusinfektion zugeordneten Zellenoberflächenmarkern analysiert. Nicht infizierte Kontroll-DC exprimierten CD11b (97 %) und waren negativ für die Expression von Impfpockenproteinen. Nach der Infektion mit rV-TRICOM koexprimierten 94 % DC sowohl CD11b als auch Impfpockenproteine. Mit rF-CEA/TRICOM infizierte DC koexprimierten sowohl CD11b als auch CEA (87 %). Wie durch polyklonale Hasen-Anti-Geflügelpocken-Seren (Daten nicht gezeigt) erfasst wurde, exprimierten diese DC keine Geflügelpockenproteine, was in Übereinstimmung mit Berichten steht, die besagen, dass sich Geflügelpocken in Säugetierzellen nicht fortpflanzen. Zusammengenommen geben diese Daten an, dass DC sowohl durch rV- als auch durch rF-Vektoren effizient infiziert werden.
Die Haupteigenschaften von DC sind hohe Expressionsniveaus sowohl von Histokompatibilitätsantigenen als auch von kostimulatorischen Molekülen. Um den Phänotyp der DC nach der Virusinfektion weiter zu charakterisieren, wurden die Zellen mit Impfpockenvirus vom Wildtyp (V-WT), rV-B7-1, rV-TRICOM, mit Geflügelpocken vom Wildtyp (FP-WT) oder mit rF-TRICOM infiziert und auf die Expression von Zellenoberflächenmarkern, die dem DC-Phänotyp zugeordnet sind, analysiert (Tabelle 4). Wie erwartet, exprimierten nicht infizierte und scheininfizierte DC hohe Niveaus von MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-, CD11b-, B7-2- und CD40-Molekülen sowie hohe Niveaus von B7-1, ICAM-1 und LFA-3. Mit V-WT infizierte DC exprimierten (wie durch MFI bestimmt wurde) niedrigere Zelloberflächendichten mehrerer Moleküle, während mit rV-B7-1 infizierte DC 5-mal mehr B7-1 als nicht infizierte DC (MFI von 329 auf 1689) exprimierten. Die Infektion von DC mit rV-TRICOM erhöhte wesentlich die MFI und den Prozentsatz der Zellen, die positiv für B7-1, ICAM-1 und LFA-3 sind. Mit FP-WT infizierte DC hatten ein ähnliches Phänotypprofil wie die nicht infizierten DC. Die Infektion von DC mit rF-TRICOM erhöhte ebenfalls wesentlich die MF1 und den Prozentsatz der Zellen, die positiv für B7-1, ICAM-1 und LFA-3 waren. Alle DC-Populationen blieben sowohl vor als auch nach der Infektion mit rF- oder N-Vektoren negativ für T-Zellen- (CD3-), B-Zellen- (CD19-), Monozyten-/Neutrophile-Granylozyten(CD14-) und NK-Zellen- (Pan NK-)Marker (Tabelle 4).
Mit TRICOM-Vektoren infizierte DC zeigen eine verbesserte Fähigkeit zum Stimulieren naiver T-Zellen
Es wurde ein In-vitro-Modell verwendet, um zu analysieren, wie erhöhte Niveaus der B7-1-, ICAM-1- und LFA-3-Expression eine naive T-Zellen-Proliferation induzieren helfen. In diesem Modell wurde das erste Signal für die T-Zellen-Aktivierung über ein pharmakologisches Reagens (Con A) geliefert und wurde das zusätzliche oder kostimulatorische Signal an die T-Zelle über DC oder DC, die infolge Infektion mit rekombinantem Pockenvirus höhere Niveaus von TRICOM exprimieren, geliefert. In diesen und in allen nachfolgenden hier berichteten Untersuchungen wurden V-WT und FP-WT ebenfalls verwendet, um Effekte wegen des Vektors allein auszuschließen. Wie in 36A gezeigt ist, induzierten sowohl nicht infizierte als auch scheininfizierte DC eine Proliferation der T-Zellen. Mit V-WT infizierte DC (mit DC/V-TRICOM bezeichnet) induzierten weniger T-Zellen-Proliferation als nicht infizierte DC. Die Lieferung zusätzlicher kostimulatorischer Signale über mit rV-B7-1 infizierte DC (als DC/rV-B7-1 bezeichnet) erhöhte die Proliferation im Vergleich zu nicht infizierten DC. Allerdings induzierten mit rV-TRICOM infizierte DC (als DC/rV-TRICOM bezeichnet) bei allen Konzentrationen von Con A weitere Zunahmen der T-Zellen-Proliferation. Außerdem war dann, wenn T-Zellen mit DC/rV-TRICOM stimuliert wurden, 28-mal weniger Con A notwendig, um eine Proliferation auf Niveaus zu induzieren, die mit denen nicht infizierter DC vergleichbar waren. Wenn diese Experimente unter Verwendung von Geflügelpockenvektoren wiederholt wurden, induzierten DC/rF-TRICOM anders als DC oder DC/rF-B7-1 bei allen Konzentrationen von Con A Zunahmen der T-Zellen-Proliferation (36). Diese Experimente wurden 4-mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Verbesserte allostimulatorische Aktivität durch mit TRICOM-Vektoren infizierte DC
Die Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion (37A, C, E) oder einer rF-TRICOM-Infektion (37B, D, E) auf die DC-Stimulationsfähigkeit wurde in einer allospezifischen Reaktion mit gemischten Lymphozyten beurteilt. Sowohl nicht infizierte DC-Populationen als auch scheininfizierte DC-Populationen induzierten eine starke Proliferation (78.000 CPM) allogenetischer T-Zellen (37A, B). Die Stimulationsfähigkeit von DC wurde nach der Infektion mit rV-B7-1 erhöht (37C). Die Infektion von DC mit rV-TRICOM erhöhte bei allen DC/Responder-Verhältnissen die Stimulationsfähigkeit gegenüber DC und DC/rV-B7-1 (37C).
Wichtig ist, dass mit rV-TRICOM-Vektoren infizierte DC-Populationen keine synergistischen T-Zellen stimulierten (37E). Wenn diese Experimente unter Verwendung von Geflügelpockenvektoren wiederholt wurden (37B, D), induzierten DC/rF-TRICOM größere Zunahmen der allogenetischen T-Zellen-Proliferation als DC und DC/rF-B7-1, während DC/rF-TRICOM keine synergistischen T-Zellen stimulierten (37F). Diese Experimente wurden 3-mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
In-vitro-Kostimulationsanalyse: Präsentation von Peptiden an Effektor-T-Zellen
Es wurden Untersuchungen unternommen, um zu bestimmen, ob die Stimulationsfähigkeit peptidgepulster DC durch Infektion der DC mit rV-TRICOM verbessert werden könnte. Zu diesem Zweck wurden das H-2K^b-beschränkte OVA-Peptid (Ovalbumin_257-264, SIINFEKL) und eine DVA-spezifische CD8⁺-Effektor-T-Zelllinie verwendet. Die DC wurden verschiedenen Konzentrationen von OVA-Peptid ausgesetzt und in Anwesenheit der OVA-T-Zelllinie inkubiert (38A–38F). Die herkömmlichen (d. h. nicht infizierten) DC induzierten, wenn sie mit dem OVA-Peptid inkubiert wurden, eine starke Proliferation DVA-spezifischer T-Zellen (38A). Diese DC induzierten keine Proliferation DVA-spezifischer T-Zellen, wenn sie mit dem Kontrollpeptid VSVN (Gingivostomatitis-Virus N_52-59 RGYVYQGL) inkubiert wurden (38A, Leerquadrate). DC/rV-B7-1 erhöhte die gesamte peptidspezifische Proliferation dieser Zellen 1,8-fach (38C). Außerdem induzierte DC/rV-B7-1 in Anwesenheit von 4-mal weniger Peptid eine ähnliche Proliferation wie nicht infizierte oder scheininfizierte DC. Im Gegensatz dazu erhöhte DC/rV-TRICOM die Gesamtproliferation dieser T-Zellen mehrfach und induzierte in Anwesenheit von 32-mal weniger OVA-Peptid eine Proliferation, die mit der nicht infizierter DC vergleichbar ist (38C). Um die Fähigkeit mit Impfpocken infizierter DC zur Präsentation von Peptid weiter zu bewerten, wurden die DC mit einer einzigen Konzentration OVA-Peptid (1 μM) gepulst und in Anwesenheit mehrerer Verhältnisse von T-Zellen inkubiert (38E). Auf Zellenbasis war 4-mal weniger DC/rV-B7-1 erforderlich, um Proliferationsniveaus zu induzieren, die mit denen von DC vergleichbar waren (Leerdreiecke gegenüber Volldreiecken). Die höchste stimulatorische Wirkung war die von DC/rV-TRICOM, das mit 32-mal weniger Zellen Proliferationsniveaus induzierte, die mit denen von DC vergleichbar waren (Leerkreise gegenüber Vollkreisen).
Ein zweites Peptidsystem, das peptidgepulste DC und eine bestehende T-Zelllinie nutzt, wurden genutzt, um zu bestimmen, ob ähnliche Ergebnisse wie die mit dem OVA-Peptid erhaltenen festgestellt werden könnten. Diese Experimente wurden unter Verwendung des H-2D^b-beschränkten Peptids CAP-M8 (CEA_526-533, EAQNTTYL) und einer CAP-M8-spezifischen CD8⁺-Effektor-T-Zelllinie durchgeführt; es wurden ähnliche Ergebnisse festgestellt (38B, D, F). Diese Experimente wurden 5 weitere Male mit den gleichen Ergebnissen wiederholt.
Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion auf TFN-α- oder CD40-gereifte DC
Da angenommen wird, dass die funktionale Reifung von DC mit der Aufwärtsregulierung T-Zellen-kostimulatorischer Moleküle korreliert, wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion auf DC zu untersuchen, die durch Kokultur entweder mit TFN-α oder mit CD40 mAb gereift worden sind. Wie durch Durchflusszytometrieanalyse bestimmt wird (Tabelle 5), führte die Behandlung von DC mit TFN-α während der letzten 24 h der Kultur zu einer gewissen Aufwärtsregulierung von MHC-II, B7-2 und ICAM-1, während die Behandlung von DC mit CD40 mAb zur Aufwärtsregulierung der ICAM-1-Expression und zu einer geringfügigen Aufwärtsregulierung von MHC-II führte. Funktional gipfelte die Behandlung von DC mit TFN-α oder mit CD40 mAb in einer 28 %igen bzw. 16 %igen Zunahme der peptidspezifischen Proliferation gegenüber unmanipulierten DC (39A). Ähnliche Daten wurden auch nach der Behandlung von DC mit Lipopolysaccharid (LPS) erhalten. Die Infektion unbehandelter DC mit rV-TRICOM führte zu einer wesentlichen Zunahme der T-Zellen-Proliferation (39A gegenüber 39B). Eine Vorbehandlung mit TFN-α oder mit CD40 mAb, gefolgt von einer Infektion mit rV-TRICOM, verlieh dagegen nur eine geringfügigen Stimulationsfähigkeit gegenüber der, die mit einer rV-TRICOM-Infektion allein zu sehen war (39B). Diese Experimente wurden 3 weitere Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
W-TRICOM infizierte DC sind effizienter beim Vorbehandeln von CTL-Reaktionen in vivo
Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob sich die verbesserte Stimulationsfähigkeit von DC/rV-TRICOM, die in vitro unter Verwendung von Con A (36E–F), Reaktionen mit gemischten Lymphozyten (37) und Zwei-Effektor-T-Zellen-Modellen (38) festgestellt wurde, in eine verbesserte Wirksamkeit bei der Vorbehandlung naiver T-Zellen-Reaktionen in vivo umsetzen würde. Zu diesem Zweck wurden DC, DC/V-WT und DC/rV-TRICOM mit 10 μM OVA-Peptid gepulst und intravenös an C57BL/6-Mäuse verabreicht. Kontrollmäuse wurden subkutan mit OVA-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert. 14 Tage nach der Impfung wurden Splenozyten geerntet, 6 Tage in vitro restimuliert und auf ihre peptidspezifische Lysefähigkeit gegenüber OVA-gepulsten EL-4-Zellen beurteilt. Als Kontrollzielzellen wurden mit VSVN-Peptid gepulste EL-4-Zellen verwendet. Wie in 40A zu sehen ist, zeigten CTL, die von Mäusen erzeugt wurden, die mit Peptid/Adjuvans immunisiert wurden, mäßige Niveaus einer CTL-Aktivität (40A). Mäuse, die mit peptidgepulsten DC immunisiert wurden, zeigten eine größere peptidspezifische CTL-Reaktion (40B). In Mäusen, die mit DC/v-WT immunisiert wurden (40C, < 2,5 Lyseeinheiten (LU) gegenüber 5,2 LU), war die induzierte CTL-Reaktion etwas beschränkt. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit peptidgepulsten DC/rV-TRICOM immunisiert wurden (40D), eine CTL-Reaktion, die wesentlich stärker als die von DC war (LU = 14,3, p = 0,001). Daraufhin wurden ähnliche Experimente unter Verwendung eines zweiten Modellpeptids, des CEA-Peptids CAP-M8, durchgeführt (40E–H). Peptidgepulste DC riefen erneut eine viel stärkere CTL-Aktivität als jene, die durch Peptid/Adjuvans abgeleitet wurden, hervor (5,7 LU gegenüber < 2,5 LU). Außerdem zeigten Mäuse, die mit peptidgepulsten DC/rV-TRICOM (40H) immunisiert waren, eine starke CTL-Reaktion (> 20 LU) im Vergleich zu der durch peptidgepulste DC (5,7 LU, p = < 0,001; 40F) induzierten.
Wirksamkeit mehrfach vektorinfizierter DC-Impfungen
Allgemein wird angenommen, dass die Erzeugung von Anti-Impfpocken-Antikörpern die wiederholte Verwendung eines Impfpockenvirus als Immunogen verhindern kann. Dagegen ist über die wiederholte Verwendung von mit Impfpocken infizierten Zellen als Immunogen wenig bekannt. Um dieses Problem zu behandeln, wurde ein Immunisierungsschema ausgeführt, in dem ein-, zwei- oder dreimal in 7-Tage-Intervallen CAP-M8-peptidgepulste DC-Immunogene verabreicht wurden. Wie zuvor wurden 14 Tage nach der letzten Immunisierung Splenozyten geerntet, in vitro 6 Tage restimuliert und auf ihre peptidspezifische Lysefähigkeit gegen CAP-M8-gepulste EL-4-Zellen beurteilt. Wie in 41A zu sehen ist, induzierten peptidgepulste DC/rV-TRICOM im Vergleich zu peptidgepulsten DC höhere Niveaus der CTL-Aktivität. Diese Daten sind ähnlich jenen, die in 40E–H zu sehen sind. Wie durch qualitative ELISA bestimmt wurde, induzierte diese Einzelverabreichung von DC/V-WT oder DC/rV-TRICOM wesentliche Anti-Impfpocken-IgG-Antikörpertiter mit Werten im Bereich von 1:4.000 bis 1:9.000. Allerdings hatten diese Titer keine Wirkung auf die Fähigkeit dieser Immunogene zum Beschleunigen der CTL-Aktivität auf nachfolgende Immunisierungen (41B und 41C). Während Anti-Impfpocken-Virustiter nach der zweiten Impfung im Bereich von 1:12.000 bis 1:50.000 lagen, war in allen Gruppen eine Beschleunigung der Induktion peptidspezifischer CTL zu sehen. Die unter Nutzung DC/rV-TRICOM-gepulster Zellen beobachtete CTL-Aktivität war wieder größer als die mit Peptid gepulsten DC beobachtete.
Beispiel 32
Mit TRICOM-Vektoren infizierte Splenozyten oder Knochenmark-Vorläuferzellen induzieren eine mit den Dendritenzellen vergleichbare T-Zellen-Aktivierung
Materialien und Verfahren
Erzeugung von Knochenmark-Vorläuferzellen- und Dendritenzellenkulturen.
Die zur Erzeugung von von Knochenmark abgeleiteten DC verwendete Prozedur war mit kleinen Änderungen die von Inaba u. a. beschriebene. Kurz gesagt, wurden von 6–8 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen (Taconic Farms, Germantown, NY) die Oberschenkelknochen entnommen, wobei das Knochenmark gespült und über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geleitet wurde. Die Knochenmarkzellen wurden unter Verwendung eines für CD4, CD8 und die MHC-Klasse II spezifischen Magnetperlencocktails (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) von Lymphozyten und Ia⁺-Zellen geleert. Diese als Dendritenzellenvorläufer bezeichneten geleerten Knochenmarkzellen wurden daraufhin für die Infektion vorbereitet oder es wurden geleerte Knochenmarkzellen für Dendritenzellen kulturen in Sechs-Well-Kulturplatten (106 Zellen/ml, 5 ml/Well) in CM, ergänzt mit 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) plattiert. An den Tagen 2 und 4 wurden die DC-Kulturen in mit frischem Cytokin ergänzten CM replattiert und an Tag 4 in neue Platten aufgeteilt. An Tag 7 der Kultur wurden Zellen für die Analyse, In-vitro-Assays und In-vivo-Immunisierungen geerntet.
Erzeugung von Splenozytenstimulatorzellen.
Es wurden die Milzen von naiven weiblichen C57BL/6-Mäusen geerntet, zu einer Einzelzellensuspension zerdrückt und über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geleitet. Die Splenozyten wurden unter Verwendung eines für CD90 und für die MHC-Klasse II spezifischen Magnetperlencocktails von Lymphozyten und Ia⁺-Zellen geleert. Die gereinigten Splenozyten wurden daraufhin zweimal mit Opti-Mem (Gibco-BRL) gewaschen und für die Infektion mit den rekombinanten Pockenviren vorbereitet.
Infektion von Stimulatorzellen.
Von Knochenmark abgeleitete Dendritenzellenvorläuferzellen und Splenozytenzellen wurden zweimal mit Opti-Mem gewaschen und entweder scheininfiziert oder mit 25 MOI V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM oder 50 MOI FP-WT, rF-B7-1 oder mit rF-TRICOM bei 25 MOI (Infektionsmultiplizität, PFU/Zelle) in 1 ml Endvolumen Opti-Mem 5 Stunden infiziert. Nach der Infektion wurde warmes (37 Grad) CM zugegeben und wurden die Zellen bei 37 °C über Nacht inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen für die immunhistochemische Färbung, In-vitro-Kostimulationsanalyse und In-vivo-Verabreichung geerntet.
Kostimulationsanalyse
Die erholten CAP-M8-T-Zellen (Responder) wurden mit 5·10⁴/Well in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden (Costar, Cambridge, MA) zugegeben. Die Stimulatorzellen bestanden aus BMDC, Splenozyten oder Knochenmarkvorläufern, die entweder nicht infiziert, scheininfiziert oder entweder mit V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM, FP-WT oder mit rF-TRICOM infiziert und bestrahlt (20 Gy) wurden. Die Zellen in den Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 ml CM kultiviert. Der Kostimulations-Assay wurde unter Verwendung von zwei Sätzen von Bedingungen ausgeführt: a) festes Verhältnis von Responder:Stimulator-Zellen von 2,5:1 für Nicht-BMDC-Stimulatoren und von 10:1 für BMDC, in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen von Con-A als Signal eins, eines spezifischen Peptids oder eines geeigneten Kontrollpeptids kultiviert, oder b) eine feste Konzentration von Con-A als Signal eins, spezifisches Peptid oder Kontrollpeptid, in verschiedenen Responder:Stimulator-Zellen-Verhältnissen kultiviert. Die Zellen wurden für Con-A und für peptidspezifische Assays 48 bzw. 72 Stunden kultiviert und für die letzten 12–18 Stunden der Inkubation mit 1 mCi/Well ³H-Thymidin markiert, geerntet und wie oben beschrieben analysiert.
Tabelle 6 zeigt die Splenozyten- und Knochenmark- (BM-) Zellenoberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle nach der Infektion mit rekombinanten Vektoren. Gereinigte Rattensplenozyten oder -knochenmarkzellen wurden 5 Stunden mit 25 MOI Impfpockenvektoren oder mit 50 MOI Geflügelpockenvektoren infiziert. Der Zellenphänotyp wurde mit dem der DC verglichen. Alle Zellen wurden mit für die kostimulatorischen Moleküle spezifischen mAbs, die mit Fluoresceinisothiocyanat, Phycoerythrin oder Biotin/Streptavidin-Cychrom markiert worden sind, immunhistochemisch gefärbt. Die Isotypkontrolle war negativ (Daten nicht gezeigt). Die Zahlen geben die Prozent positiver Zellen und die mittlere Fluoreszenz-Intensität in Klammern an.
Die 42A bis 46 veranschaulichen, dass TRICOM-infizierte Splenozyten in Bezug auf die Stimulation von T-Zellen-Reaktionen mit TRICOM-infizierten Knochenmarkzellen vergleichbar sind.
Beispiel 33
Stimulation menschlicher T-Zellen unter Verwendung allogenetischer, mit rF-TRICOM infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit Peptiden gepulst sind

Menschliche Dendritenzellen wurden durch Leukophorese für eine normale gesunde Person isoliert. Die menschlichen Dendritenzellen wurden 6–9 Tage in Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 kultiviert, gefolgt von der Zugabe von rF-TRICOM oder rF-Kontrollen für die Infektion der Dendritenzellen. Die rF-TRICOM-infizierten Dendritenzellen wurden 1 Stunde mit einem CEA-Peptid (CAP-1 oder CAP I, 6D) (47); mit einem PSA-Peptid (PSA-3) (48); mit einem Influenzapeptid (Flu-Peptid 58-66) (49 und 50); oder mit einem HPV-Peptid (11-20) gepulst (51–45). Aus einkernigen Zellen von peripherem Blut (PBMC) isolierte menschliche T-Zellen wurden in Anwesenheit peptidgepulster rF-TRICOM-infizierter Dendritenzellen kultiviert und es wurde die Erzeugung von IFN-α durch die T-Zellen bestimmt. Die 47–54 zeigen, dass peptidgepulste rF-TRICOM-infizierte menschliche Dendritenzellen T-Zellen in einem größeren Umfang als die Kontrollen stimulierten. Die 47–54 sowie Tabelle 7 veranschaulichen, dass mit rF-TRICOM infizierte allogenetische menschliche Dendritenzellen für die Verbesserung einer Immunreaktion irgendein Antigenpeptid effizient an T-Zellen präsentieren können. Tabelle 7 CTL-Aktivität von T-Zelllinien unter Verwendung mit HPV-E7(11-20-)peptidgepulster DC

Ziel	T-Zelllinien hergestellt unter Verwendung von:
	A		B
	rF-Tricom + P	rF-B7.1 + P	rF-FPV + P	DC + P
C1R-A2 + HPV	39,6 (3,1)	24,7 (0,4)	19,9 (2,9)	7,3 (0,4)
C1R-A2	5,1 (2,0)	6,9 (4,0)	7,6 (2,0)	8,0 (0,2)

E:T-Verhältnis = 25:1

Es wurde ein 6-Stunden-111-In-Freisetzungs-Assay ausgeführt. Die C1R-A2-Zellen wurden bei einer Konzentration von 10 μg/ml mit HPV-E7-Peptid (11-20) YMDLQPETT gepulst.
Die in Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse veranschaulichen, dass mit rF-TRICOM infizierte DC (A) als APC zum Erzeugen von CTL besser als Standard-DC (B) sind, wenn beide mit Peptid gepulst werden.
Beispiel 34
Klinische Menschenstudien eines rV-huTRICOM-, rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffs und rF-CEA-TRICOM
Das Ziel der klinischen Menschenstudie ist die Bestimmung der optimalen tolerierten Dosis (OTD) des rekombinanten rV-huTRICOM- und rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffs, der eine Wirts-Antitumor-Immunreaktion hervorruft und in Patienten mit fortgeschrittenen CEA-exprimierenden Adenokarzinomen einer akzeptablen Toxizität zugeordnet ist.
Die rV-huTRICOM- und rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffe werden unter den für Klinische Menschenstudien der Phase I und der Phase II geeigneten Bedingungen hergestellt.
In einer Anfangsstudie werden eskalierende Dosen rekombinanter rV- oder rF-CEA-huTRICOM-Lebendvirus-Impfstoff oder rV-huTRICOM- plus rV-CEA-Impfstoff mit einer Anfangsdosis von 10⁶ PFU Virus IM, worauf eine Dosis 10⁷ PFU Virus IM folgt, auf die später 10⁸ PFU Virus oder 10⁹ SC oder durch Hautritzung folgen, gegeben.
Die Antitumorreaktion jedes rekombinanten Impfstoffs wird unter Verwendung der klinischen, Labor- und radiologischen Beweisstücke der Tumorgröße, des Tumorumfangs und des Tumorwachstums unter Verwendung akzeptierter Standardkriterien für die Messung der Reaktion von Tumoren auf neue Therapieformen, wie sie im Gebiet bekannt sind, bestimmt.
Die Immunrektion des Patienten auf den rekombinanten Impfstoff wird unter Verwendung einer Vielzahl immunologischer Assays einschließlich Anti-CEA-Antikörper-Assay, Anti-Pockenvirus-Antikörper-Assay, Immunkomplex-Assay, CEA-spezifische lymphoproliferative Assays, CEA-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Assays, der Vorläuferhäufigkeit CEA-reaktiver T-Zellen im Gamma-Interferon-Freisetzungs-T-Zellen-Assay, einem ELISPOT, Fast Immune, Tetramer-Assays für T-Zellen-Reaktionen (Scheibenhogen, u. a., Int. J. Cancer 71:932–936, 1997), HLA-Proben und dergleichen beurteilt. Um die Entwicklung humoraler und zellularer Immunrektionen, die gegen das CEA-Tumorantigen gerichtet sind, zu dokumentieren, wurde ein Vergleich der Proben vor der Behandlung und nach der Behandlung vorgenommen.
Beispiel 35
Klinische Menschenstudien eines rekombinanten Geflügelpocken-CEA-huTRICOM
In einer Anfangsstudie werden eskalierende Dosen eines rekombinanten Geflügelpocken-CEA-huTRICOM-Impfstoffs von 10⁶ PFU Virus, 10⁷ PFU Virus und 10⁸ PFU Virus direkt in eine Tumormasse eines Patienten mit fortgeschrittenen CEA-exprimierenden Adenokarzinomen injiziert.
Die spezifische Antitumor- und Immunreaktion auf den rekombinanten Impfstoff wird wie in Beispiel 34 beschrieben bestimmt.
Beispiel 36
Klinische Menschenstudie von T-Lymphozyten, die durch mehrere kostimulatorische Moleküle überexprimierende Dendritenzellen aktiviert werden
Von einem Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs werden Lymphozyten und Dendritenzellen von peripherem Blut erhalten. Die Lymphozyten des peripheren Bluts werden für CD8⁺-Lymphozyten angereichert. Die Dendritenzellen werden für eine Zeitdauer, die ausreicht, die Expression des PSA-Epitops und die Überexpression der mehreren kostimulatorischen Moleküle zuzulassen, mit dem rV-PSA-Epitop QVHPQKVTK/B7.1/ICAM-1/LFA-3 infiziert. Die PSA-Epitopspezifischen CD8⁺-Lymphozyten werden in Anwesenheit dieser behandelten Dendritenzellen aktiviert und expandiert. Die aktivierten PSA-Epitop-spezifischen autogenen CD8⁺-T-Lymphozyten werden allein und in Kombination mit dem PSA-Epitop in den Patienten injiziert. Die spezifische Antitumor- und PSA-spezifische Immunreaktion auf die Behandlung wird durch Verfahren bestimmt, die mit den in Beispiel 34 beschriebenen vergleichbar sind.
Für die Behandlung von Patienten mit anderen TAA-exprimierenden Krebsen können durch Ersatz des Gens, das CEA codiert, durch ein Gen, das ein anderes TAA codiert, in dem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung ähnliche Klinische Menschenstudien durchgeführt werden.
Beispiel 37
Selektion für Immunität hervorrufende Peptide und/oder menschliche T-Zellen, die mit einem spezifischen Peptid immunreaktiv sind, unter Verwendung mit rF-TRICOM infizierter DC
Die vorliegende Erfindung umfasst antineoplastische Therapien unter Verwendung der Ex-vivo-Manipulation von DC mit Virusvektoren, die ein tumorassoziiertes Antigen tragen, zur Aktivierung tumorspezifischer CTL. Mit rF-CEA infizierte DC in Kombination mit kostimulatorischen TRICOM-Molekülen werden verwendet, um CEA-spezifische Immunreaktionen zu verstärken. Es wird die CTL-Induktionsfähigkeit von mit rF-CEA/TRICOM und mit rF-TRICOM infizierten DC bewertet. Zur Visualisierung CAP-1-spezifischer CTL werden tetramere MHC, Klasse I, CAP-1-Komplex, verwendet. Dieses Protokoll ist nicht auf das tumorassoziierte Antigen, CEA, beschränkt, sondern kann geändert werden, um antigenspezifische Immunreaktionen für irgendein Antigenpeptid oder ein Immunität hervorrufendes Epitop davon für die Immuntherapie gegen Krebs, pathogene Bakterien, Viren, Proto zoen, Hefe und dergleichen hervorzurufen. Darüber hinaus kann das Verfahren geändert werden, um Immunität hervorrufende Peptide von einer Quelle wie etwa natürlichem Protein, rekombinantem Protein, synthetischem Protein oder Fragmente von jedem, kombinatorische Bibliotheken und dergleichen zu selektieren und zu identifizieren.
Materialien und Verfahren
Zellkulturen
Von der American Type Culture Collection (Manassas, MD) wurden kolorektale Karzinomzelllinien SW1463 (HLA-A1,2), 151 74 (HLA-A2,-) gekauft. Die Kulturen waren mykoplasmafrei und wurden in einem Vollnährmedium gehalten [DMEM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), ergänzt mit 10 % Fötusrinderserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc.)]. Die C1R-Zelllinie ist eine menschliche Plasmaleukämiezellllinie, die keine endogenen HLA-A- oder HLA-B-Antigene exprimiert (Storkus, W. J., u. a., J. Immunol. 138(6):1657–1659, 1987). C1R-A2-Zellen sind C1R-Zellen, die einen transfizierten Genomklon von HLA-A2.1 exprimieren (Hogan, K. T., u. a., J. Exp. Med. 168(2):725–736, 1988). Diese Zellen wurden von Dr. William E. Biddison (National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NIH, Bethesda, MD) erhalten. Die C1R-A2-Kultur war mykoplasmafrei und wurde in einem RPMI-1640-Vollnährmedium (Life Technologies, Inc.) gehalten. Die V8T-Zelllinie, eine gegen das CAP-1-Epitop gerichtete CTL-Linie, wurde von einem Patienten mit metastatischem Dickdarmkarzinom hergestellt, der in eine Studie der Phase I unter Verwendung von rV-CEA aufgenommen wurde (Tsang, K. Y., u. a., Clin. Cancer Res. 3(12):2439–2449, 1997). Die V8T-Zellen wurden in einem RPMI-1640-Vollnährmedium kultiviert, das 10 % menschliches AB-Serum und IL-2 (bereitgestellt vom National Cancer Institute, Surgery Branch, 20 Einheiten/ml) enthielt. Die V8T-Zellen wurden am Tag 16 nach der vorherigen Restimulation mit einem Effektorzellen/APC-Verhältnis von 1:3 mit CAP-1-Peptid (25 μg/ml) restimuliert. Als APC wurden bestrahlte (23.000 Rad) autogene EBV-transformierte B-Zellen verwendet.
Kultur von DC von einkernigen Zellen von peripherem Blut
Von mit Heparin behandeltem Blut von einem Patienten (Nr. 15) mit metastatischem Beckenkarzinom, der in eine Studie der Phase I unter Verwendung einer Kombination von rV-CEA und ALVAC-CEA aufgenommen wurde, wurden einkernige Zellen von peripherem Blut (PBMC) erhalten. Alle Experimente, die Patientenmaterialien umfassten, wurden gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt, und es wurde von allen Personen die schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die PBMC wurden unter Verwendung eines Lymphozytentrennungsmedium-Gradienten (Organon Teknika, Durham, NC) wie zuvor beschrieben (Boyum, A., Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97:51–76, 1968) abgetrennt. Die DC wurden unter Verwendung einer Modifikation der von Sallusto u. a. beschriebenen Prozedur (Sallusto, F., u. a., J. Exp. Med. 179(4):1109–1118, 1994) vorbereitet. Die PBMC (1,5·10⁸) wurden in einem AIM-V-Medium, das 2 mM Glutamin, 50 μg/ml Streptomycin, 10 μg/ml Gentamyzin enthielt (Life Technologies, Inc.), resuspendiert und an einer T-150-Flasche (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) haften gelassen. Nach 2 Stunden bei 37 °C wurden die nicht haftenden Zellen mit einem sanften Spülen entfernt. Die haftenden Zellen wurden 6–7 Tage in einem AIM-V-Medium, das 50 ng/ml rekombinantes menschliches GM-CSF (rhGM-CSF) und 0,5 ng/ml rekombinantes menschliches IL-4 (rhIL-4) enthielt, kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle drei Tage aufgefüllt.
Rekombinantes Virus und Infektion von DC mit dem Avipox-Virus, das CEA, CEA/TRICOM und TRICOM enthält
Wie von Kaufman u. a. (Kaufman, F., u. a., Int. J. Cancer 48(6):900–907, 1991) beschrieben wurde, wurde ein 2109 bp-DNA-Fragment erhalten, das den gesamten offenen Leserahmen von CEA codiert. Das rekombinante CEA-Avipox-Virus (Geflügelpocken-CEA; vCP248) wurde unter Verwendung von Verfahren, die von Taylor (Taylor, J., u. a., Virology 187(1):321–328, 1992), Cox u. a. (Cox, W. I., u. a., Virology 187(1):321–328, 1992) und Perkus u. a. (Perkus., M. E., u. a., J. Virol. 63(9):3829–3836) beschrieben wurden, von der Therion Corp geliefert. Das rekombinante Avipox-Virus, das CEA und das menschliche Tricom-Gen (als rF-CEA-Tricom bezeichnet) und das rekombinante menschliche Geflügelpocken-TRICOM (rF-Tricom) codiert, wurden wie hier offenbart hergestellt. Als Negativkontrolle wurden in ausgewählten Experimenten Geflügelpocken vom Wildtyp (FP-WT) verwendet. DC (1·10⁶) wurden bei 37 °C in 1 ml Optim-MEM-Medium (Life Technologies, Inc.) mit rF-TRICOM, rF-CEA, rF-CEA/TRICOM, FP-WT inkubiert. Titrationsexperimente gaben an, dass 2·10⁷ plaquebildende Einheiten/ml gleich einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 40:1 für 2 Stunden in näherungsweise 75 % der infizierten DC gleichbleibend eine Expression von CEA induzieren konnten.
Die infizierten DC wurden in 10 ml frischem, warmem RPMI-1640-Vollnährmedium, das 50 ng/ml rhGM-CSF und 0,5 ng/ml rhIL-4 enthielt, suspendiert, 24 Stunden kultiviert und daraufhin nachfolgend als Stimulatoren verwendet.
Peptid
CAP-1 (Tsang, K. Y., u. a., J. Natl Cancer Inst. 87(13):982–990, 1995), CEA-Aminosäureposition 571–579 YLSGANLNL, CAP-1-6D (Zaremba, S., u. a., Cancer Res. 57(20):4570–4577, 1997) YLSGADLNL und Flu-Peptid, Influenzamatrix-Proteinpeptid 58-66 GILGFVTL, mehr als 96 % rein, wurden von Multiple Peptide System (San Diego, CA) hergestellt.
Erzeugung von T-Zelllinien
Die von Tsang u. a. (Tsang, K. Y., u. a., J. Natl Cancer Inst. 87(13):982–990, 1995) beschriebene Modifikation des Protokolls wurde verwendet, um CEA-spezifische CTL zu erzeugen. Als APC wurden nicht infizierte DC und mit rF-TRICOM, mit rF-CEA oder mit rF-CEA/TRICOM infizierte DC verwendet. Zu den nicht infizierten oder mit rF-TRICOM infizierten DC wurde CAP-1-Peptid mit einer Endkonzentration von 25 μg/ml zugegeben. Daraufhin wurden zu APC in einem APC/Effektor-Verhältnis von 1:10 autonome nicht haftende Zeilen zugegeben. Daraufhin wurden die Kulturen in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO₂ enthielt, 3 Tage bei 37 °C inkubiert. Nach Entfernung des peptidhaltigen Mediums wurden die Kulturen mit rekombinantem menschlichen IL-2 mit einer Konzentration von 20 Einheiten/ml 7 Tage ergänzt, wobei alle 3 Tage IL-2-haltiges Medium aufgefüllt wurde. Die 3-Tage-Inkubation mit Peptid und die 7-Tage-IL-2-Ergänzung bildeten einen IVS-Zyklus. Am Tag 11 wurden die Primärkulturen mit CAP-1-Peptid (25 μg/ml) restimuliert, um den nächsten (VS-Zyklus zu beginnen. Die bestrahlten (23.000 Rad) autogenen EBV-transformierten B-Zellen wurden als APC verwendet. Abgesehen davon, dass in der Stimulation kein CAP-1-Peptid war, wurde für die CTL-Erzeugung eine ähnliche Prozedur genutzt, wenn als APC mit rF-CEA oder rF-CEA/TRICOM infizierte DC verwendet wurden.
Konstruktion von Peptid-MHC-Tetrameren
Wie von Altman u. a. (Altman, J. D., u. a., Science 274(5284):94–95, 1996) beschrieben, wurden Peptid-MHC-Komplexe synthetisiert. Kurz gesagt, wurde von Dr. Garboczi (Harvard University, Cambridge, MA) (Garboczi, D. N., u. a., Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429–3433, 1992) der β₂-Mikroglobulin-Klon (β₂M-Klon) erhalten und wurde von Immunotech (Beckman-Coulter, Marseille, Frankreich) das HLA-A2-Konstrukt erhalten. Die löslichen HLA-A2-Moleküle, die das 15-Aminosäuren-Substratpeptid für die BirA-abhängige Biotinierung bis zu dem COOH-Therminus der HLA-A2-Schwerkette und das β₂M enthielten, wurden getrennt in E. coli gezüchtet und als Einschlusskörper isoliert. HLA-A2 und β₂M wurden löslich gemacht und in Anwesenheit von CAP-1- oder Flu-M1-58-66-Peptid renaturiert. Der Komplex wurde durch FPLC an Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt. Der gereinigte Peptid-MHC-Komplex wurde unter Verwendung des BirA-Enzyms (Avidity, Denver, CO) biotiniert. Durch Mischen des biotinierten Peptid-MHC-Komplexes mit mit Phycoerythrin markiertem UltraAvidin (Leinco Technologies, Inc. Ballwin, MO) in einem Molverhältnis von 4:1 wurden Tetramere erzeugt.
Durchflusszytometrie
Färbung und Sortierung von T-Zellen: Für die Durchflussmengenzytometrie-Analyse und für das Sortieren der T-Zellen wurde ein CAP-1-MHC-Tetramer-PE verwendet. Für die Tetramerfärbung wurde eine ähnliche Prozedur wie oben beschrieben verwendet. Der CAP-1-MHC-Tetramer-PE wurde in einer Konzentration von 0,33 μg/2·10⁵ Zellen verwendet. Die Zellen wurden 1 Stunde bei 4 °C mit CAP-1-MHC-Tetramer-PE gefärbt und daraufhin eine weitere Stunde mit Anti-CD8-FITC gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und in einem Vantage-Cell-Sortierer (Becton Dickinson) oder einem FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung der Software CellQuest (Becton Dickinson) analysiert. Die Sortiererzellen wurden kultiviert und wie zuvor beschrieben expandiert. Die mit UltrAvidin-PE und mit Flu-MHC-Tetramer gefärbten Zellen wurden als Negativkontrollen verwendet.
Zytotoxischer Assay
Die Zielzellen wurden bei Zimmertemperatur 15 min mit 50 μCi ¹¹¹Indium-markiertem Oxychinolin (Medi-Physics Inc., Arlington, IL) markiert. Die Zielzellen (0,3·10⁴) in 100 μl RPMI-1640-Vollnährmedium wurden zu jeder der 96 Wells in den Assay-Platten mit flachem Boden (Corning Costar, Corp.) zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden 60 min bei 37 °C in 5 % CO₂ mit Peptiden inkubiert, bevor Effektorzellen zugegeben wurden. Wenn Karzinomzelllinien als Ziele verwendet wurden, wurde kein Peptid verwendet. Die Effektorzellen wurden in 100 μl RPMI-1640-Vollnährmedium, das mit 10 % menschlichem Pool-AB-Serum ergänzt wurde, suspendiert und zu den Zielzellen zugegeben. Daraufhin wurden die Platten 4 oder 16 Stunden bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung von Ernterahmen (Skatron, Inc., Sterling, VA) für die Gammazählung geerntet. Die Bestimmungen wurden dreifach ausgeführt und es wurden Standardabweichungen berechnet. Die spezifische Lyse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet (alle Werte in cpm):
Es wurde die spontane Freisetzung von Wells, zu denen 100 μl RPMI-1640-Vollnährmedium zugegeben wurden, bestimmt. Nach der Behandlung der Ziele mit 2,5 % Triton x-100 wurde die freisetzbare Gesamtradioaktivität erhalten.
HLA-Typbestimmung
Die HLA-Phänotypbestimmung wurde durch die Blutbank des National Institutes of Health unter Verwendung eines antikörperabhängigen Standard-Mikrozytotoxizitäts-Assays und eines definierten Felds von Anti-HLA-Antiseren ausgeführt. Die Klasse-I-Phänotypen der V8T-Zelllinie und des Patienten Nr. 15 waren jeweils HLA-A2, -; B18(W6), 44(12, W4) und HLA-A2, 28; B13 (BW4), B51(BW4); CW6.
Erfassung von Cytokinen
Überstehende T-Zellen, die 24 Stunden mit rF-CEA, rF-CEA/TRICOM infizierten DC oder peptidgepulsten, nicht infizierten DC und mit rF-TRICOM infizierten DC in einem IL-2-freien Medium bei verschiedenen Responder:Stimulator-Verhältnissen ausgesetzt wurden, wurden unter Verwendung einer ELISA-Ausrüstung (R&D Systems, Minneapolis, MN) zur Absonderung von IFNγ selektiert. Die Ergebnisse wurden in pg/ml ausgedrückt.
ELISPOT-Assay
Um die IFNγ-Produktion zu messen, um CAP-1-spezifische T-Zellen zu bestimmen, wurde eine Modifikation des von Scheibenbogen u. a. (Scheibenbogen, C., u. a., Clin Cancer Res 3(2):221–226, 1997) beschriebenen Verfahrens verwendet. Kurz gesagt, wurden 96-Well-Milliliter-HA-Platten (Millipore Corporation, Redford, MA) mit 100 μl Erfassungsantikörpern gegen menschliches IFNγ mit einer Konzentration von 10 μg/ml beschichtet. Nach 24 Stunden Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Platten 30 min mit RPMI-1640, die 10 % menschliches Pool-AB-Serum enthielt, blockiert. Zu jeder Well wurden 1·10⁵ dem Assay auszusetzende Zellen hinzugefügt. In jede Well wurden als APC in einem Effektor:APC-Verhältnis von 1:3 CAP-1-6D-gepulste C1R-A2-Zellen zugegeben. Als Negativkontrolle wurden ungepulste C1R-A2-Zellen verwendet. Das HLA-A2-bindende Flu-Matrixpeptid 58-66 (GILGFVFTL) wurde ebenfalls als Kontrolle verwendet. Die reagierenden Zellen wurden unter Verwendung eines Domino Image Analyzer (Otpomax, Hollis, NH) bestimmt.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse von Unterschieden zwischen den Mitteln erfolgte unter Verwendung eines Zwei-Schwanz-t-Tests.
Diskussion
Wenn eine naive T-Zelle ein Antigen feststellt, sind mehrere verschiedene Ergebnisse einschließlich Proliferation, Cytokin-Absonderung und Differentiation in Effektorzellen sowie die Aktivierung, der Tod und die Reaktionslosigkeit (Unempfindlichkeit) möglich. Das vorrangige Ergebnis unter physiologischen Bedingungen kann dadurch bestimmt werden, ob geeignete kostimulatorische Signale an die reagierende T-Zelle geliefert werden (26). Wenigstens drei verschiedene Moleküle, die normalerweise an der Oberfläche einer professionellen APC zu finden sind, werden für fähig gehalten, die für die T-Zellen-Aktivierung entscheidenden Signale zu liefern: B7-1, ICAM-1 und LFA-3. Die Rolle der kostimulatorischen Moleküle bei der Aktivierung naiver T-Zellen wurde hier unter Nutzung von Vektoren untersucht, die genetisch so manipuliert wurden, dass sie entweder B7-1, ICAM-1, LFA-3 oder eine Kombination aller drei Moleküle exprimieren.
Mehrere Gruppen haben das Zusammenwirken von zwei dieser Moleküle bei der T-Zellen-Kostimulation untersucht. Dubey u. a. haben berichtet (26), dass die Kostimulation sowohl von B7-1 als auch von ICAM-1 eine Vorbedingung für die Aktivierung naiver T-Zellen ist, während Cavallo u. a. bestimmt hatten, dass B7-1 und ICAM-1 durch Tumorzellen koexprimiert werden müssen, um eine Antitumor-Erinnerungsreaktion zu erzeugen (27). Außerdem ist gezeigt worden, dass die Kostimulation durch B7-1 und LFA-3 zusätzlich sowohl auf die T-Zellen-Proliferation als auch auf die Cytokin-Produktion wirkt (6, 23, 24). Diese früheren Untersuchungen wurden unter Verwendung zweier kostimulatorischer Moleküle und Retrovirusvektoren ausgeführt. Ein Gen wurde in die Zielzelllinie transduziert, es wurde ein Arzneimittel ausgewählt und daraufhin mit einem zweiten rekombinanten Retroviruskonstrukt erneut transduziert, worauf die Selektion mit einem anderen Mittel folgte. Dieser Prozess erfordert häufig Wochen oder Monate. Unter Nutzung rekombinanter Pockenvirusvektoren kann die Koexpression dreier kostimulatorischer Molekülen 5 Stunden nach der Infektion erzielt werden. Es ist gezeigt worden, dass In-vitro-MC38-Zellen, die entweder mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 oder mit rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 infiziert wurden, die Proliferation der T-Zellen in viel größerem Umfang als MC38-Zellen, die mit Vektoren infiziert wurden, die das Gen für irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül enthielten, verbessern. Außerdem erschien die relative Stärke des durch die Kombination der kostimulatorischen Moleküle an die T-Zelle gelieferten zweiten Signals um ein Mehrfaches (> 6) größer als die, die durch MC38-Zellen geliefert wurde, die irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül exprimieren. Dubey u. a. haben nachgewiesen, dass bei niedrigen Stimulator/T-Zellen-Verhältnissen mäßige bis starke Synergie mit B7-1 und ICAM-1 festgestellt wurde (26). Die Untersuchungen der Erfinder bestätigen diese Forschungsergebnisse. Allerdings hatte das Zwei-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1) bei sehr niedrigen Stimulatorzelle/T-Zelle-Verhältnissen oder schwachem Signal 1 (0,625 μg/ml Con A) wenig, wenn überhaupt, Wirkung auf die Proliferation; im Gegensatz dazu hatte die Stimulation über das Dreierkonstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) eine wesentliche und statistisch signifikante Wirkung auf die Proliferation. Die vorrangige Wirkung der Stimulation über das Mehr-Gen-Konstrukt (rV-B7-1, ICAM-1, LFA-3) war die IL-2-Ausarbeitung aus CD4⁺-Zellen und die IFN-γ-Ausarbeitung aus CD8⁺-T-Zellen, während wenig, wenn überhaupt, Typ-2-Cytokine erzeugt wurden. Die Cytokin-Expressions-Analyse durch den RNAse-Schutz lieferte ein mit dem In-vitro-Cytokin-Assay kompatibles Profil, das sich im Vergleich zur Stimulation durch irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül durch wesentlich höhere Expression von IL-2 und IFN-γ sowohl in CD4⁺- als auch in CD8⁺-T-Zellen, die mit allen drei kostimulatorischen Molekülen stimuliert wurden manifestierte. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen, die nachwiesen, dass im Kontext niedriger CD28-Kostimulation T-Zellen niedrige Niveaus von IL-1 erzeugten, während eine starke CD28-Kostimulation die Erzeugung von IL-2, IFN-γ und IL-13 unterstützte (28). Darüber hinaus ist berichtet worden, dass IL-13 mit IL-2 bei der Regulierung der IFN-γ-Synthese in T-Zellen synergiert (29). Es ist interessant, dass die vorliegenden Ergebnisse diese Beobachtung dahingehend weiter unterstützten, dass die Stimulation von CD4⁺-T-Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3-Ergebnissen zu einem höheren Niveau der IL-2- und IFN-γ-Expression mit einiger erhöhter Expression von IL-13 führt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die IL-9-Expression in CD4⁺-T-Zellen bei der Stimulation mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 weiter verbessert wurde. Die in den vorliegenden Untersuchungen festgestellte erhöhte Expression von IL-9 in Verbindung mit der Aufwärtsregelung von IL-2 steht in Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen, die nachwiesen, dass die optimale Erzeugung von IL-9 durch IL-2 reguliert wird (30). Zusammengenommen legen diese Untersuchungen nahe, dass optimale Reaktionen naiver T-Zellen ein höheres Niveau der Kostimulation erfordern, als es früher angenommen wurde, und dass dies durch die kombinierte Wirkung dreier kostimulatorischer Moleküle geliefert werden könnte.
Das vielleicht am meisten untersuchende kostimulatorische T-Zellen-Molekül ist B7-1. Die Fähigkeit dieses Moleküls zur Verbesserung der T-Zellen-Aktivierung unter Verwendung von Retrovirusvektoren, Ani-CTLA-4-Antikörpern und Pockenvirusvektoren ist gut bekannt. Die hier berichteten Untersuchungen ordnen die Reihenfolge der T-Zellen-Stimulation durch ein einzelnes kostimulatorisches Molekül als B7-1 > ICAM-1 > LFA-3. Allerdings war die Nutzung dreier kostimulatorischer Moleküle gegenüber B7-1 allein oder in B7 in Kombination mit einem zweiten kostimulatorischen Molekül sowohl in Bezug auf die T-Zellen-Proliferation als auch auf die Cytokin-Produktion weitaus besser.
Obgleich dies an keine Theorie gebunden ist, gibt es für ein effizientes Zusammenwirken zwischen B7-1, ICAM-1 und LFA-3 mehrere mögliche Mechanismen. Die ICAM-1/LFA-3-Wechselwirkung kostimuliert Berichten zufolge die TCR-vermittelte Aktivierung von T-Zellen durch Aufrechterhaltung der Zunahme derselben intrazellularen zweiten Boten, wie sie durch den TCR-Eingriff erzeugt wird. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Ligation von LFA-1 durch ICAM-1 T-Zellen durch Verbessern des über den CD3/TCR-Komplex gelieferten Signals kostimuliert (6). Die ICAM-1/LFA-1-Wechselwirkung ist notwendig, um die Expression der IL-2R-Alphakette und des CD28 an T-Zellen aufwärts zu regulieren, was notwendig ist, um sie in die Lage zu versetzten, auf die IL-2- und B7-1-Kostimula tion zu reagieren. Andererseits liefert die B7-1/CD28-Wechselwirkung ein TCR-unabhängiges kostimulatorisches Signal, das die Expression des IL-2 und anderer immunregulatorischer Lymphokine sowohl transkribierend als auch nach der Transkription erhöht. Die LFA-3/CD2-Wechselwirkung induziert eine Tyrosinphosphorylierung mehrerer intrazellularer zweiter Boten, eine Ca²⁺-Mobilisierung und eine cAMP-Produktion, was zur Ausarbeitung einer Vielzahl von Cytokinen, besonders IL-2 und IFN-γ, führt (6). Somit scheinen die drei kostimulatorischen Moleküle dadurch zusammenwirken zu können, dass die antigenabhängige Aktivierung von T-Zellen sowie ihre Produktion autokriner und parakriner Wachstumsfaktoren verbessert werden.
Schlussfolgernd weist diese Erfindung erstmals die Fähigkeit von Vektoren nach, drei oder mehr kostimulatorische Moleküle in eine Zelle einzuführen und sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellen-Populationen schnell und effizient auf weitaus höhere Niveaus zu aktivieren als jene, die erzielt werden, wenn eines oder zwei dieser kostimulatorischen Moleküle verwendet werden. Dieser neue Schwellenwert der T-Zellen-Aktivierung hat umfassende Auswirkungen im Impfstoffentwurf und in der Impfstoffentwicklung.
Die Wirkung der Dreiergruppe kostimulatorischer Moleküle auf DCs war vollständig unerwartet. DCs sind dem Fachmann als die potentesten APC bekannt. Die in dieser Erfindung dargestellten Daten weisen nach, dass die Fähigkeit von DCs zur Aktivierung von T-Zellen drastisch zunimmt, wenn sie mit dem "Tricom"-Vektor infiziert werden. Diese Untersuchungen weisen erstmals nach, dass eine DC nicht die potenteste APC ist.
Literaturhinweise

1. Hellstrom, K. E., Chen, L., und Hellstrom, I. (1996) Cancer Chemother Pharmacol 38, S. 40–1.
2. Damle, N. K., Klussman, K., Linsley, P. S., und Aruffo, A. (1992) J Immunol 148, 1985–92.
3. Green, J. M., Zheng, X. G., Shimizu, Y., Thompson, C. B., und Turka, L. A. (1994) Eur J Immunol 24, 265–72.
4. Guinan, E. C., Gribben, J. G., Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., und Nadler, L. M. (1994) Blood 84, 3261–82.
5. Hodge, J. W., McLaughlin, J. P., Abrams, S. I., Shupert, W. L., Schlom, J., und Kantor, J. A. (1995) Cancer Res 55, 3598–603.
6. Wingren, A. G., Parra, E., Varga, M., Kalland, T., Sjogren, H. O., Hedlund, G., und Dohlsten, M. (1995) Crit Rev Immunol 15, 235–53.
7. Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Sjogren, H. O., Kalland, T., Sansom, D., und Dolsten, M. (1993) Scand J Immunol 38, 508–14.
8. Harding, F. A., und Allison, J. P. (1993) J Exp Med 177, 1791–6.
9. Hellstrom, K. E., Hellstrom, I., Linsley, P., und Chen, L. (1993) Ann N Y Acad Sci 690, 225–30.
10. Hodge, J. W., Abrams, S., Schlom, J., und Kantor, J. A. (1994) Cancer Res 54, 5552–5.
11. Uzendoski, K., Kantor, J. A., Abrams, S. I., Schlom, J., und Hodge, J. W. (1997) Human Gene Ther 8, 851–60.
12. Lorenz, M. G. O., Kantor, J. A., Schlom, J., und Hodge, J. W. (1998) Human Gene Therapy Im Druck.
13. Gritz, L., Destree, A., Cormier, N., Day, E., Stallard, V., Caiazzo, T., Mazzara, G., und Panicili, D. (1990) J Virol 64, 5948–57.
14. Mazzara, G. P., Destree, A., und Mahr, A. (1993) Methods Enzymol 217, 557–81.
15. Jenkins, S., Gritz, L., Fedor, C. H., O'Neill, E. M., Cohen, L. K., und Panicali, D. L. (1991) AIDS Res Hum Retroviruses 7, 991–8.
16. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., und Moss, B. (1997) Bio Techniques 23, 1094–7.
17. Perkus, M. E., Piccini, A., Lipinskas, B. R., und Paoletti, E. (1985) Science 229, 981–4.
18. Schmitt, J. F., und Stunnenberg, H. G. (1988) J Virol 62, 1889–97.
19. Venkatesan, S., Baroudy, B. M., und Moss, B. (1981) Cell 25, 805–13.
20. Fox, B. A., Spiess, P. J., Kasid, A., Puri, R., Mule, J. J., Weber, J. S., und Rosenberg, S. A. (1990) J Biol Response Mod 9, 499–511.
21. Abrams, S. I., Dobrzanski, M. J., Wells, D. T., Stanziale, S. F., Zaremba, S., Masuelli, L., Kantor, J. A., Schlom, J., und Masuelle, L. (1995) Eur J Immunol 25, 2588–97.
22. Sabzevari, H., Propp, S., Kono, D. H., und Theofilopoulus, A. N. (1997) Eur J Immunol 27, 1901–10.
23. Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Bjorklund, M., Sjogren, H. O., Kalland, T., Sansom, D., und Dohlsten, M. (1994) J Immunol 153, 2479–87.
24. Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Kalland, T., und Dohlsten, M. (1997) J Immunol 158, 637–42.
25. Sperling, A. I., Auger, J. A., Ehst, B. D., Rulifson, I. C., Thompson, C. B., und Bluestone, J. A. (1996) J Immunol 157, 3909–17.
26. Dubey, C., Croft, M., und Swain, S. L. (1995) J Immunol 155, 45–57.
27. Cavallo, F., Martin-Fontecha, A., Bellone, M., Heltai, S., Gatti, E., Tornaghi, P., Freschi, M., Forni, G., Dellabona, P., und Casorati, G. (1995) Eur J Immunol 25, 1154–62.
28. Delespesse, G., Yang, L. P., Ohshima, Y., Demeure, C., Shu, U., Byun, D. G., und Sarfati, M. (1998) Vaccine 16, 1415–9.
29. Minty, A., Chalon, P., Derocq, J. M., Dumont, X., Guillemot, J. C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B., u. a. (1993) Nature 362, 248–50.
30. Schmitt, E., Germann, T., Goedert, S., Hoehn, P., Huels, C., Koelsch, S., Kuhn, R., Muller, W.; Palm, N., und Rude, E. (1994) J Immunol 153, 3989–96.
31. Chakrabarti, S., Brechling, K., und Moss, B. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3403– 3409.
32. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., und Moss, B. (1997) Bio Techniques 23:1094–1097.
33. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., und Kir, A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 83:5573–5577.
34. Morgan, J. R., und Roberts, B. E. (1994) J Virol. 51:283–297.
35. Panicali, D., Grzelecki, A., und Huang, C. (1986) Gene 47:193–199.
36. Samboock, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Hrsg. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
37. Schmitt, J. F. C., und Stunnenberg, H. G. (1988) J. Virol. 62:1889–1897.
38. Smith, K., Stallard, V., Ross, J., Hart, C., Cormier, N., Cohen, L., Roberts, B., und Payne, L. (1993) Vaccine 11:43–53.
39: Venkatesan, S., Baroudy, B. M., und Moss, B. (1981) Cell 125:805:813.
40. Bacchetti, S., und Graham, F. L. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 74:1590–1594, 1977.
41. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S., und Steinman, R. M. (1992) J Exp. Med. 176, 1693–702.
42. Sallusto, F., und Lanzaveccia, A. (1994) J. Exp. Med. 179, 1109-8.
43. Fields, R. C., Osterholzer, J. J., Fuller, J. A., Thomas, E. K., Geraghty, P. J., und Mule, J. J. (1998) J. Immunother. 21, 323–39.
44. Zaremba u. a. Cancer Res. 57:4570–4577, 1997.
45. Gong, J., u. a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6279–6283, 1998.
46. Correale, P., u. a. 1998, J. Immunol. 161(6):3186–94.

SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinanter Vektor, der Fremdkern-Säuresequenzen umfasst, die drei verschiedene kostimulatorische Moleküle, eines aus der B7-Familie, die aus B7-1 und B7-2 oder menschlichen Homologen oder einem Funktionsabschnitt davon besteht, und zwei, die aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, OX-40L, VCAM-1 oder menschlichen Homologen oder einem Funktionsabschnitt davon besteht, codieren.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 1, bei dem die genannten drei kostimulatorischen Moleküle B7-1, ICAM-1 und LFA-3 sind.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 2, bei dem die genannten kostimulatorischen Moleküle vom Menschen abgeleitet, vom Affen abgeleitet oder von der Ratte abgeleitet sind.
Rekombinanter Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–3, der ferner eine Fremdkern-Säuresequenz umfasst, die wenigstens ein Cytokin, Chemokin, Flt-3L oder eine Kombination davon codiert.
Rekombinanter Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–4, der ferner einen wählbaren Marker umfasst.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, bei dem der wählbare Marker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem lacZ-Gen, aus Thymidin-Kinase, aus gpt, aus GUS und aus einem Impfpocken-K1L-Wirtsbereichsgen besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–6, der ferner wenigstens einen Promotor umfasst, der von einer eukaryontischen Quelle, von einer prokaryontischen Quelle oder von einer Virusquelle abgeleitet ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 7, bei dem der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem SV40-Early-Promotor, aus einem RSV-Promotor, aus einem Adenovirus-Major-Late-Promotor, aus einem menschlichen CMV-Immediate-Early-I-Promotor, aus einem Pockenvirus-Promotor, aus einem 30K-Promotor, aus einem I3-Promotor, aus einem sE/L-Promotor, aus einem 7.5K-Promotor, aus einem 40K-Promotor und aus einem C1-Promotor besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–8, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem bakterien-, aus einem virus- und aus einem nukleinsäurebasierten Vektor besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 9, bei dem der genannte Virusvektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pockenvirus, Adenovirus, Herpesvirus, Alphavirus, Retrovirus, Picornavirus und Iridovirus besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass er ein rekombinantes Pockenvirus ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 11, bei dem das rekombinante Pockenvirus Orthopox, Avipox, Capripox oder Suipox ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 12, bei dem das Avipox Geflügelpocken, Kanarienpocken oder Ableitungen davon ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 12, bei dem das Orthopox Impfpocken, der Kopenhagen-Impfpockenstamm, der Wyeth-Impfpockenstamm, NYVAC, der MVA-Impfpockenstamm, Waschbärpocken oder Hasenpocken sind.
Rekombinantes Pockenvirus gemäß einem der Ansprüche 11–14, das ferner wenigstens einen Pockenviruspromotor umfasst, der die Expression der Fremd-DNA steuern kann.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Bakterienvektor ein Plasmidvektor ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 16, der Folgendes umfasst: (a) wenigstens einen Pockenviruspromotor, (b) die Fremdnukleinsäuresequenzen, die LFA-3, ICAM-1 und wenigstens ein B7-Molekül codieren, (c) DNA-Sequenzen, die das Konstrukt aus den Elementen (a) und (b) flankieren, wobei die flankierenden Sequenzen sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden Homologe zu einem Gebiet eines Eltern-Pockenvirusgenoms sind, wobei die Elemente (a) und (b) zur Rekombination mit einem Pockenvirus einzuführen sind, das so beschaffen ist, dass es ein rekombinantes Pockenvirus erzeugt, das Fremdnukleinsäuresequenzen exprimieren kann, die drei kostimulatorische Moleküle, LFA-3, ICAM-1 und wenigstens ein B7-Molekül, codieren.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 16, der als pT5064 bezeichnet ist und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer 203482 gelagert ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 16, der mit pT5049 bezeichnet ist und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer 203481 gelagert ist.
Rekombinanter Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–19, der ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 20, bei dem das Zielantigen eine Aminosäuresequenz besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der SEQ ID NO: 2 bis zu der SEQ ID NO: 40 besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 20, bei dem das Zielantigen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem tumorspezifischen Antigen, aus einem tumorassoziierten Antigen (TAA), aus einem gewebespezifischen Antigen, aus einem bakteriellen Antigen, aus einem Virusantigen, aus einem Hefeantigen, aus einem Pilzantigen, aus einem Protozoon-Antigen und aus einem Parasitenantigen und aus einem Mitogen besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 22, bei dem das bakterielle Antigen von einem Bakterium abgeleitet ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chlamydia, Mycobacteria, Legionella, Meningococcus, Streptococcus der Gruppe A, Hemophilus influenzae, Salmonella und Listeria besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 22, bei dem das Virusantigen von einem Virus abgeleitet ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lentivirus, Herpesvirus, Hepatitisvirus, Orthomyxovirus und Papillomavirus besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 24, bei dem das Lentivirus HIV-1 oder HIV-2 ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 24, bei dem das Herpesvirus HSV oder CMV ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 24, bei dem das Hepatitisvirus Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D oder Hepatitis E ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 24, bei dem das Orthomyxovirus das Influenzavirus ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 22, bei dem das tumorassoziierte Antigen, das tumorspezifische Antigen oder das gewebespezifische Antigen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, aus einem punktmutierten ras-Onkogen, aus normalem oder punktmutiertem p53, aus überexprimiertem p53, aus CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, aus modifizierten TAAs, aus Spleißvarianten von TAAs, aus funktionellen Epitopen und aus Epitopagonisten davon besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 29, bei dem das Antigen CEA (6D) ist, das bei der Aminosäurenposition 576 eine Aminosäure Asparaginsäure besitzt.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 29, bei dem das Antigen PSA oder PSMA ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 29, bei dem das Antigen MUC-1 oder ein Abschnitt davon ist.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 22, bei dem das Hefe- oder Pilzantigen von einer Hefe oder von einem Pilz abgeleitet ist, die/der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kolbenschimmel, Nocardia, Histoplasmose, Candida und Cryptosporidia besteht.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 22, bei dem das Parasitenantigen von einer Plasmodium-Species, von Toxoplasma gondii, von Pneumocystis carinii, von einer Trypasosoma-Spezies oder von einer Leishmania-Spezies abgeleitet ist.
Isolierte Wirtszelle, die den rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–34 umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 35, die ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert.
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 35–36, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Zelle eine antigenpräsentierende Zelle oder ein Vorläufer davon, eine präkanzeröse Zelle, eine hyperplastische Zelle oder eine Tumorzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 37, bei der die genannte antigenpräsentierende Zelle eine dendritische Retikulumzelle oder ein Vorläufer oder ein Abkömmling davon, ein Monozyt, ein Makrophage, eine B-Zelle, eine juvenile Bindegewebszelle oder eine Muskelzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 37, bei der die antigenpräsentierende Zelle von Knochenmark, von der Milz, von der Haut, von peripherem Blut, von einem Tumor, von einem Lymphknoten oder von einem Muskel abgeleitet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 37, bei der die genannte antigenpräsentierende Zelle eine vorläuferantigenpräsentierende Zelle, eine antigenpräsentierende Zelle oder eine gentechnisch hergestellte antigenpräsentierende Zelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 38, bei der der genannte Dendritenabkömmling eine TNF-α-behandelte Dendritenzelle, eine CD40-behandelte Dendritenzelle oder eine Unterpopulation von Haftzellen ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 36, bei der die Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, durch einen rekombinanten Vektor, durch RNA oder durch DNA von einem Tumorzellenlysat oder durch Fusion mit einer Tumorzelle, die die genannte Sequenz umfasst, bereitgestellt ist.
Arzneimittelzusammensetzung, die wenigstens einen rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–34 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Arzneimittelzusammensetzung gemäß Anspruch 43, die ein rekombinantes Pockenvirus gemäß einem der Ansprüche 11–15 und optional als einen zweiten rekombinanten Vektor ein Pockenvirus, das wenigstens eine Fremdnukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst.
Arzneimittelzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 43–44, die ferner ein Cytokin, ein Chemokin oder Flt-3L umfasst.
Arzneimittelzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 43–44, die für die Verabreichung über den intravenösen, über den subkutanen, über den intralymphatischen, über den intratumoralen, über den intradermalen, über den intramuskulären, über den intraperitonealen, über den intrarektalen, über den intravaginalen, über den intranasalen oder über den oralen Weg oder über Blasentropfinfusion oder über Hautritzung geeignet ist.
Arzneimittelzusammensetzung, die die Dendritenzellen und Abkömmlinge davon gemäß Anspruch 38 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
In-vitro-Verfahren zum Verbessern einer antigenspezifischen Immunreaktion in einer isolierten Zelle des Immunsystems, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–34 oder die Wirtszellen gemäß den Ansprüchen 35–42 verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 48, bei dem die Wirtszellen gemäß einem der Ansprüche 35–42 verwendet werden und das ferner optional einen Schritt des Pulsens der genannten Zellen mit einem Zielantigen oder mit einem Epitop davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 48, bei dem die isolierten Zellen des Immunsystems T-Lymphozyten sind, dadurch gekennzeichnet, dass das verfahren den Schritt umfasst, dass ein isolierter T-Lymphozyt einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 35–42 allein oder in Kombination mit einem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon ausgesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 50, bei dem die genannten T-Lymphozyten autogen mit einem Individuum sind.
Verwendung des rekombinanten Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–34 für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder für die Verhütung von Krebs oder von durch einen pathogenen Mikroorganismus verursachten Erkrankungen.
Verwendung des rekombinanten Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–34 für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder für die Verhütung präneoplastischer oder hyperplastischer Zustände.
Verwendung des rekombinanten Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–34 für die Zubereitung eines Medikaments zur Verbesserung der Immunreaktion.
Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 37–42 allein oder in Kombination mit einem Zielantigen für die Zubereitung eines Medikaments für die Immuntherapie oder für die Schutzimpfung.
Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten Pockenvirus, wobei das Verfahren umfasst, dass zugelassen wird, dass der rekombinante Vektor gemäß einem der Ansprüche 16–19 eine Rekombination mit einem Elternpockenvirusgenom erfährt.
Ausrüstung für die Herstellung eines rekombinanten Pockenvirus, das den rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 16–19 und optional ein Elternpockenvirus umfasst.
Verfahren zum In-vitro-Beurteilen der Wirksamkeit eines Impfstoffs gegen ein Zielantigen, das das Bestimmen der Anzahl und der Funktion der zielantigenspezifischen Lymphozyten in Anwesenheit der antigenpräsentierenden Zelle gemäß Anspruch 37 umfasst, in dem eine Zunahme der Anzahl, der Funktion oder einer Kombination davon zielantigenspezifischer Lymphozyten die Wirksamkeit des Impfstoffs gegen ein Zielantigen angibt.
Verfahren zum Selektieren für immunologene Peptide aus einer Mehrzahl von Peptiden, wobei das Verfahren umfasst: (a) Pulsen antigenpräsentierender Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–34 infiziert sind, mit einer Mehrzahl von Peptiden, um peptidgepulste antigenpräsentierende Zellen zu bilden; (b) Messen der Lymphoidimmunreaktivität in Anwesenheit der peptidgepulsten antigenpräsentierenden Zellen, wobei eine erhöhte Immunreaktivität ein immunogenes Peptid an der peptidgepulsten antigenpräsentierenden Zelle angibt.
Verfahren gemäß Anspruch 59, bei dem die Quelle der Mehrzahl von Peptiden eine kombinatorische Peptidbibliothek ist.