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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten Vektor,
der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, und optional ein
Fremdgen, das ein Zielantigen codiert, enthält. Ferner bezieht sich die
Erfindung auf ein rekombinantes Virus, das Fremdgene, die wenigstens
drei kostimulatorische Moleküle
codieren, und optional ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen
oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst. Genauer
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein rekombinantes Pockenvirus,
das Fremdgene, die wenigstens die folgenden kostimulatorischen Moleküle codieren:
ein Molekül
aus der B7-Familie, LFA-3 und ICAM-I, und optional ein Fremdgen,
das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfasst, und Verwendungen davon als Immunogene und Impfstoffe.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf antigenpräsentierende Zellen, die durch
einen rekombinanten Vektor transfiziert, infiziert oder transduziert
worden sind, der Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
und optional ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein
immunologisches Epitop davon codiert, umfasst.
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Stand der Technik
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Der
Umfang der primären
Reaktion von T-Zellen, die ihre Aktivierung, Expansion und Differenzierung umfasst,
ist von höchster
Wichtigkeit für
eine erfolgreiche Immunreaktion auf ein Antigen. Die Auslösung einer Immunreaktion
erfordert wenigstens zwei Signale für die Aktivierung naiver T-Zellen
durch antigenpräsentierende
Zellen (APC)(1-5). Das erste Signal ist antigenspezifisch, wird über den
Peptid/Hauptgewebeverträglichkeits-Komplex
durch den T-Zellen-Rezeptor geliefert und veranlasst, dass die T-Zelle
in den Zellenzyklus eintritt. Das zweite oder "kostimulatorische" Signal ist für die Cytokin-Produktion und
-Proliferation erforderlich. Es ist vorgeschlagen worden, dass wenigstens
drei verschiedene Moleküle,
die normalerweise an der Oberfläche einer
professionellen APC zu finden sind, das zweite Signal liefern können, das
entscheidend für
die T-Zellen-Aktivierung
ist: B7.1 (CD80), ein interzellulares Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1; CD54) und ein
Leukozytenfunktions-assoziiertes Antigen-3 (LFA-3; menschliches
CD58; Ratten-CD48) (2, 6, 7). Die T-Zellen-Liganden für diese
kostimulatorischen Moleküle
sind verschieden. B7-1 tritt mit den CD28- und CTLA-4-Molekülen in Wechselwirkung,
ICAM-1 tritt mit dem CD11a/CD18-Komplex (LFA-1/⎕2-Integrin- Komplex) in Wechselwirkung und
LFA-3 tritt mit den CD2-Molekülen
(LFA-2-Molekülen) in
Wechselwirkung. Es ist nicht bekannt, ob diese kostimulatorischen
Moleküle
in spezifischen Phasen einer induzierten Immunreaktion (2) äquivalente
Funktionen ausführen
oder spezialisierte Funktionen ausführen. Es ist gezeigt worden,
dass diese Moleküle
die T-Zellen-Proliferation in vitro einzeln kostimulieren (6). Da
sie gleichzeitig in APC exprimiert werden können, ist es aber schwierig,
die relativen Potenzen einzelner kostimulatorischer Moleküle während der
Induktion der T-Zellen-Vervielfachung zu untersuchen (2).
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Da
vorgeschlagen worden ist, dass sowohl Antigenmoleküle als auch
kostimulatorische Moleküle
in der Nähe
zueinander exprimiert werden müssen,
um gleichzeitig richtig mit der T-Zelle und mit den kostimulatorischen
Rezeptoren in Eingriff zu gelangen (8, 9), könnte das Gemisch mehrerer rekombinanter
Viren genutzt werden, um das potentielle Zusammenwirken kostimulatorischer
Moleküle
zu untersuchen. Der Nachteil dieses Zugangs ist aber, dass dieses
Gemisch von drei oder mehr Viren eine statistisch verminderte Wahrscheinlichkeit
besitzt, dieselbe Zelle gleichzeitig zu infizieren, was ein Mehr-Gen-Konstrukt
zur Verwendung mit drei kostimulatorischen Molekülgenen viel wünschenswerter
macht.
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WO 91/02805 , veröffentlicht
am 7. März
1991, offenbart ein rekombinantes Retrovirusvektor-Konstrukt, das
die Expression eines Zielantigens, eines MHC-Proteins und anderer an Immunwechselwirkungen beteiligter
Proteine, die in einer Zielzelle fehlen oder unterrepräsentiert
sind, lenkt.
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Akagi
u. a.. 1997, J. Immunotherapy, Bd. 20 (1): 38–47, offenbaren ein Gemisch
eines rekombinanten Impfpockenvirus, das ein modifiziertes MUC1-Gen
(rV-MUC1) enthält, und
eines rekombinanten Impfpockenvirus, das das Gen für das kostimulatorische
Rattenmolekül
B7 (rV-B7) enthält.
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Cavallo,
P., u. a., 1995, Eur. J. Immunol. 25:1154–1162, offenbaren, dass die
Transfektion von B7-1-cDNA in drei ICAM-1+-Tumorzelllinien
ausreicht, um in syngenetischen Mäusen eine Zurückweisung
zu induzieren.
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Chen,
L., u. a., 1994, J. Exp. Med., 179:523–532, offenbaren einen rekombinanten
Retrovirusvektor, der cDNA für
Ratten-B7 enthält,
und die Verwendung des Vektors bei der Transduktion verschiedener
Tumoren.
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Damle,
N. K., u. a., 1992, J. Immunol., Bd. 148 (Nr. 7): 1985–1992, offenbaren
die Verwendung eines von antigenpräsentierenden Zellen unabhängigen (APC-unabhängigen)
In-vitro-Kultursystems, das aus immobilisierten Kombinationen monoklonaler
Antikörper,
die auf den TCR/CD3-Komplex gerichtet sind, und aus löslichen
Ig-Chimären
(RG) von vier verschiedenen APC-assoziierten kostimulatorischen
Molekülen
besteht, um die Fähigkeiten
dieser Moleküle
zum Kostimulieren der T-Zellen-Proliferation zu vergleichen.
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Dubey,
C., u. a., 1995, J Immunol, 155:45–57, offenbaren eine Untersuchung
des relativen Beitrags von ICAM-1:LFA- und B7:CD28/CTLA-4-kostimulatorischen
Wegen in der naiven T-Zellenaktivierung unter Verwendung von entweder
Anti-CD28-Antikörper- oder
von juvenilen Bindegewebs-Zelllinien, die mit I-Ek transfiziert
wurden, die entweder keine kostimulatorischen Moleküle, ICAM-1
allein, B7-1 allein
oder ICAM-1 und B7-1 zusammen exprimieren.
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Fenton,
R. G., u. a., 1998, Bd. 21, Nr. 2, S. 95–108, offenbaren die Transfektion
des Gens des kostimulatorischen Moleküls B7-1 in drei HLA-A2-exprimierenden
menschliche Melanomzelllinien und ihre Fähigkeit zum Stimulieren primärer menschlicher
T-Zellen. Die drei Melanomlinien exprimierten außerdem erfassbare Niveaus der
kostimulatorischen Moleküle
ICAM-1 (CD54) und LFA-3 (CD58).
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Gjorloff
Wingren, A., u. a., 1995, Critical Reviews in Immunol 15 (3 und
4): 235– 253,
offenbaren, dass bei der Kotransfektion von HLA-DR, B7 und LFA-3
in CHO-Zellen diese
Moleküle
bei der Aktivierung sowohl von naiven als auch von Speicher-T-Zellen
zusammenwirken und Reaktionen auf pikomolare Konzentrationen des
Antigen-Staphylokokken-Enterotoxins B (SEB) ermöglichen.
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Goldbach-Mansky,
R., u. a., 1992, International Immunol, 4 (Nr. 12): 1351–1360, offenbaren,
dass CD4+-T-Zellen in Anwesenheit von LFA-3,
ICAM-1 und der B7-positiven
Erythroleukämie-Zelllinie
K562, von Ratten-L-Zellen und von menschlichen transfizierten B7-L-Zellen
auf Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) reagieren.
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Hodge,
J. W., u. a., 1994, Cancer Research, 54:5552–5555, offenbaren die Konstruktion
und Charakterisierung rekombinanter Impfpockenviren, die die Ratten-B7.1-
und -B7.2-Gene enthalten.
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Hodge,
J. W., u. a., 1995, Cancer Research, 55:3598–3603, offenbaren ein Gemisch
rekombinanter Impfpocken-Ratten-B7.1 (rV-B7) plus rekombinanter
Impfpocken, die das menschliche carcinoembryonale Antigen-Gen (rV-CEA)
exprimieren, und die Verwendung dieses Gemischs für die Antitumoraktivität.
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Parra,
u. a., 1993, Scand J. Immunol, 38:508–514, Parra, E., u. a. 1994,
J. Immunol, 153:2479–2487, und
Parra, u. a., 1997, J. Immunol., 458:637–642, offenbaren mit Genen
des menschlichen HLA-DR4-Moleküls (CHO-DR4);
mit HLA-DR4- und B7- (CHO-DR4/B7), mit HLA-DR4- und mit LFA-3- (CHO-DR4/LFA3); mit HLA-DR4-
und mit ICAM-1- (CHO-DR4/ICAM-I); oder mit DR4-, B7- und LFA-3-
(CHO-DR4/B7/LFA-3-) Genen transfizierte CHO-Zellen.
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Thomas,
R., u. a., 1993, J. Immunol., 151:6840–6852, offenbaren, dass frisch
erhaltene Dendritenzellen (DC) ähnliche
Dichten von HLA-DR und den Hilfsmolekülen LFA-3, ICAM-1 und B7 wie
Monozyten exprimieren.
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Uzendoski,
K., u. a., Mai 1997, Human Gene Therapy, 8:851–860, offenbaren die Konstruktion,
die Charakterisierung und die immunologischen Folgen eines rekombinanten
Impfpockenvirus, das das kostimulatorische Rattenmolekül ICAM-1
exprimiert.
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WO 96/10419 , veröffentlicht
am 11. April 1996 von
PCT/US95/12624 ,
offenbart einen Gegenstand, der sich auf einen einzelnen rekombinanten
Virusvektor bezieht, der eines oder mehrere Gene oder einen Abschnitt
davon, die ein immunstimulatorisches Molekül codieren, und eines oder
mehrere Gene oder einen Abschnitt davon, die ein Antigen eines Erkrankungszustands
codieren, inkorporiert hat.
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Robinson,
u. a.,
US-Patent Nr. 5.738.852 ,
offenbart einen Retrovirusvektor, der eine Polynukleotidsequenz,
die ein Zielantigen eines infektiösen Agens codiert, und eine
Polynukleotidsequenz, die ein kostimulatorisches B7-Molekül codiert,
enthält.
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Die
vorliegende Erfindung ist ein Vektor, der Fremd-DNA, die wenigstens
drei kostimulatorische Moleküle
codiert, allein oder in Kombination mit Fremd-DNA, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, das
eine funktionale Expression jeder Fremd-DNA in einer infizierten
Wirtszelle zulässt,
enthält.
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Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung schafft einen rekombinanten Vektor, der Fremdgene
oder exogene Gene oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, umfasst. Gene oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische
Moleküle
codieren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind
aber nicht beschränkt
auf, ein Mitglied der B7-Familie; und ICAM-1-, LFA-3-, 4-1BBL-,
CD59-, CD40-, CD70-, VCAM-1-, OX-40L-Moleküle, Funktionsabschnitte und
menschliche Homologe davon. Der Vektor der Erfindung kann ferner
in Kombination mit den Fremdgenen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon codiert, liefern. Das Fremdgen, das wenigstens ein
Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, kann
von Zellen, von Geweben oder von Organismen wie etwa von Viren,
von Bakterien, von Protozoen, von Parasiten, von Hefe, von Tumorzellen,
von präneoplastischen
Zellen, von hyperplastischen Zellen, von gewebespezifischen Zellen
oder von synthetischen Antigenen abgeleitet sein. Ferner kann der
Vektor ein Fremdgen liefern, das wenigstens eines oder eine Kombination
von Cytokinen, Chemokinen und Flt-3L codiert.
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Der
rekombinante Vektor zur Verwendung in der Gruppe der vorliegenden
Erfindung besteht aus Bakterienvektoren, Virusvektoren, nukleinsäurebasierten
Vektoren und dergleichen. Die rekombinanten Virusvektoren enthalten,
sind aber nicht beschränkt
auf, Pockenvirus, Adenovirus, Herpesvirus, Alphavirus, Retrovirus, Picornavirus,
Iridovirus und dergleichen. Das Pockenvirus enthält, ist aber nicht beschränkt auf,
Orthopox, Avipox, Suipox und Capripox.
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Die
vorliegende Erfindung schafft ein rekombinantes Virus, das Fremdgene
oder Abschnitte davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
umfasst, um für
eine Zielzelle, für
ein Zielantigen oder für
ein immunologisches Epitop davon eine verbesserte Immunreaktion
zu liefern, die größer als
eine Reaktion ist, die durch ein rekombinantes Virus geliefert wird,
das ein Fremdgen oder Fremdgene, das/die einzelnen oder doppelten
kostimulatorischen Moleküle
codiert/codieren, umfasst. Ferner kann das rekombinante Virus der
Erfindung in Kombination mit den Fremdgenen, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein
immunologisches Epitop davon codiert, liefern. Ferner kann das rekombinante
Virus ein Fremdgen liefern, das andere Klassen immunstimulatorischer
Moleküle
wie etwa Cytokine einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, IL-2, IL-12, GM-CSF und dergleichen, Chemokine wie etwa MIP1,
MIP2, RANTES und dergleichen und Flt-3L, das die DC-Proliferation
stimuliert, enthält.
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Ferner
schafft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus,
das Fremdgene oder Abschnitte davon umfasst, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, um für
eine Zielzelle, für
ein Zielantigen oder für
ein immunologisches Epitop davon eine verbesserte Immunreaktion
zu liefern, die größer als
eine Reaktion ist, die durch ein rekombinantes Pockenvirus geliefert
wird, das ein Fremdgen oder Fremdgene umfasst, das/die einzelnen
oder doppelten kostimulatorischen Moleküle codiert/codieren. Das rekombinante
Pockenvirus der Erfindung kann ferner in Kombination mit den Fremdgenen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein
immunologisches Epitop davon codiert, liefern.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das eine
Nukleinsäuresequenz
umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codiert und exprimiert,
wobei die Nukleinsäuresequenz eine
Nukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Molekül
aus der B7-Familie kostimulatorischer Moleküle codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die ein kostimulatorisches ICAM-1-Molekül codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die in kostimulatorisches LFA-3-Molekül codiert, umfasst. Ferner
liefert das rekombinante Virus mehrere Pockenvirusvorläufer, die
die Expression jedes Fremdgens regulieren.
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Die
vorliegende Erfindung schafft ein rekombinantes Virus, das dadurch
hergestellt wird, dass zugelassen wird, dass ein Plasmidvektor,
der Fremd-DNA umfasst, die die kostimulatorischen Moleküle codiert, eine
Rekombination mit einem Elternvirusgenom erfährt, um ein rekombinantes Virus
herzustellen, in dessen Genom Fremd-DNA eingeführt ist. Ferner kann das durch
Rekombination hergestellte rekombinante Virus ein Fremdgen enthalten,
das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, das durch den Plasmidvektor geliefert wird.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das dadurch
hergestellt wird, dass zugelassen wird, dass ein Plasmidvektor,
der Fremd-DNA umfasst, die das kostimulatorische Molekül, LFA-3,
ICAM-1 und wenigstens ein Molekül
aus der B7-Familie codiert, eine Rekombination mit einem Elternpockenvirusgenom
erfährt,
um ein rekombinantes Pockenvirus herzustellen, in dessen Genom die Fremd-DNA
und mehrere Pockenviruspromotoren, die die Expression der Fremd-DNA
steuern können,
eingeführt
ist. Ferner kann das durch Rekombination hergestellte rekombinante
Pockenvirus ein Fremdgen enthalten, das wenigstens ein Zielantigen
oder ein immunologisches Epitop davon codiert, das durch den Plasmidvektor
geliefert wird.
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens zur Verbesserung
der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene oder immunologische
Epitope davon, das einen rekombinanten Vektor mit Fremdnukleinsäuresequenzen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, umfasst. Der Vektor kann ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfassen.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens
zur Verbesserung der Immunreaktionen gegen Zielzelle, Zielantigene
oder immunologische Epitope davon, das einen rekombinanten Virusvektor
mit Fremdnukleinsäuren,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, umfasst. Der rekombinante Virusvektor kann ferner eine
Fremdnukleinsäuresequenz,
die wenigstens eines oder mehrere Zielantigene oder immunologische
Epitope davon codiert, umfassen.
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Eine
abermals weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Immunogens
zur Verbesserung der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene
oder immunologische Epitope davon, das einen rekombinanten Pockenvektor,
der eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die die kostimulatorischen Moleküle
LFA-3, ICAM-1 und ein Molekül
aus der B7-Familie codiert, und eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfasst.
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Der
Vektor der vorliegenden Erfindung liefert einen Impfstoff zum Hervorrufen
und Verbessern der Immunreaktionen gegen Zielzellen, Zielantigene
oder Epitope davon für
den Schutz vor und/oder für
die Behandlung von Erkrankungszuständen. Der Vektorimpfstoff umfasst
Fremdnukleinsäuresequenzen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren. Außerdem
kann der Vektorimpfstoff Fremd nukleinsäuresequenzen umfassen, die
eines oder mehrere Zielantigene oder immunologische Epitope davon
codieren, um einen einwertigen oder mehrwertigen Impfstoff gegen
eine Erkrankung herzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung schafft Arzneimittelzusammensetzungen, die
einen Vektor mit Fremdnukleinsäuresequenzen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Ferner kann der Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz umfassen, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Zusätzlich kann
der Vektor eine Nukleinsequenz, die ein Cytokin, ein Chemokin, Flt-3L
oder eine Kombination davon codiert, umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung,
die einen rekombinanten Virusvektor, der Fremdgene oder exogene
Gene oder Funktionsabschnitte davon, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, und ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder
ein immunologisches Epitop davon codiert, umfasst, und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
umfasst.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung Arzneimittelzusammensetzungen, die ein
rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene oder Abschnitte davon,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Ferner kann das rekombinante Pockenvirus eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfassen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Arzneimittelzusammensetzung,
die ein rekombinantes Pockenvirus, das Fremdgene oder Abschnitte
davon, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst und das
ferner ein Fremdgen oder einen Abschnitt davon, der wenigstens ein
Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, umfassen
kann, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein immunologisches
Epitop umfasst.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung eine Arzneimittelzusammensetzung, die
einen ersten Vektor, der Fremdgene oder Funktionsabschnitte davon,
die die kostimulatorischen Moleküle
codieren, umfasst, und einen zweiten Vektor, der Fremdgene, die
wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codieren, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung schafft Wirtszellen, die mit einem ersten
Vektor infiziert, transfiziert oder transduziert sind, der Fremdgene,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, die die Expression der drei kostimulatorischen Moleküle in den
Wirtszellen veranlassen, umfasst. Ferner kann der erste Vektor oder
ein zweiter Vektor ein Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen
oder ein immunologisches Epitop davon codiert, an die Wirtszelle
liefern.
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Die
vorliegende Erfindung schafft antigenpräsentierende Zellen (APCs) oder
Tumorzellen, die mit einem ersten Vektor infiziert, transfiziert
oder transduziert sind, der Fremdgene oder exogen gelieferte Gene,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, die die Expression oder Überexpression der drei kostimulatorischen Moleküle veranlassen,
umfasst. Der erste Vektor oder ein zweiter Vektor kann ferner ein
Fremdgen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon codiert, an die Wirtszelle liefern.
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Ferner
schafft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem rekombinanten
Pockenvirus infiziert sind, das die Expression der drei kostimulatorischen
Moleküle
veranlasst und optional die Expression eines Zielantigens oder eines
immunologischen Epitops davon veranlasst.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Dendritenzelle (DC) und ein
Vorläufer
davon, die/der infiziert, transfiziert oder genetisch manipuliert
worden ist, um Gene, die drei exogene kostimulatorische Moleküle codieren,
zu überexprimieren.
Die DCs und die Vorläufer
davon können
weiter genetisch manipuliert worden sein, um Fremdgene, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren,
zu exprimieren.
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Ein
abermals weiterer Aspekt der Erfindung ist eine DC und sind Vorläufer davon,
die genetisch manipuliert worden ist/sind, um Gene, die drei exogene
kostimulatorische Moleküle
codieren, zu überexprimieren. Die
DCs und ein Vorläufer
davon können
weiter genetisch manipuliert worden sein, um Fremdgene, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codieren,
zu exprimieren.
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Ferner
schafft die vorliegende Erfindung eine DC und Vorläufer davon,
die genetisch manipuliert worden ist/sind, um Gene, die ein B7-Molekül, ICAM-1
und LFA-3 codieren, zu überexprimieren.
Die DCs und ein Vorläufer
davon können ferner
genetisch manipuliert werden, um Fremdgene, die wenigstens ein Zielantigen oder
ein immunologisches Epitop davon codieren, zu exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung schafft Verfahren und einen Plasmidvektor
für die
Rekombination mit einem Elternvirus, das so beschaffen ist, dass
es ein rekombinantes Virus erzeugt, das Fremdnukleinsäuresequenzen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, exprimieren kann, umfassend: (a) mehrere Viruspromotoren,
(b) die Fremdnukleinsäuresequenzen,
die die drei kostimulatorischen Moleküle codieren, (c) DNA-Sequenzen,
die die Konstrukte der Elemente (a) und (b) flankieren, wobei die
flankierenden Sequenzen sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden
Homologe zu einem Gebiet eines Elternvirusgenoms sind, wo die Elemente
(a) und (b) einzuführen
sind. Der Plasmidvektor kann ferner eine Fremdnukleinsäuresequenz
liefern, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon codiert. Außerdem
kann der Plasmidvektor ein Gen liefern, das einen wählbaren
Marker codiert.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung Verfahren und einen Plasmidvektor für die Rekombination mit
einem Elternpockenvirus, das so beschaffen ist, dass es ein rekombinantes
Pockenvirus erzeugt, das Fremdnukleinsäuresequenzen exprimieren kann,
die die kostimulatorischen Moleküle
LFA-3, ICAM-1 und ein B7-Molekül codieren,
das umfasst: (a) mehrere Pockenviruspromotoren, (b) die Fremdnukleinsäuresequenzen,
die das LFA-3-, das ICAM-1- und ein B7-Molekül codieren, (c) DNA-Sequenzen,
die das Konstrukt der Elemente (a) und (b) flankieren, wobei die
flankierende Sequenzen sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden Homologe zu einem Gebiet eines
Eltern-Pockenvirusgenoms sind, wo die Elemente (a) und (b) einzuführen sind. Ferner
kann der Plasmidvektor eine Fremdnukleinsäuresequenz liefern, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Außerdem kann
der Plasmidvektor ein Gen liefern, das einen wählbaren Marker codiert.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Verbessern der Immunreaktionen
in einem Säugetier auf
wenigstens eine Zielzelle, ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon, das das Verabreichen eines ersten Vektors, der Fremdnukleinsäuresequenzen
umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, umfasst, wobei
jedes kostimulatorische Molekül
in einer Zelle in dem Säugetier
in einer Menge exprimiert wird, die die Verbesserung wenigstens
einer Immunreaktion in dem Säugetier
bewirkt. Gene oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische
Moleküle
codieren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten,
sind aber nicht beschränkt
auf, ein Mitglied der B7-Familie,
ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L und Homologe
und Abschnitte davon. Eine Fremdnukleinsäuresequenz, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, kann
in dem Verfahren ferner durch den ersten Vektor oder durch einen
zweiten Vektor geliefert werden.
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Außer Genen
oder einem Abschnitt davon, die/der drei kostimulatorische Moleküle codieren/codiert, können eine
Fremdnukleinsäuresequenz
oder exogene Nukleinsäuresequenz
oder Funktionsabschnitte davon, die wenigstens eine oder eine Kombination
weiterer Klassen immunstimulatorischer Moleküle codieren, ebenfalls durch
den ersten Vektor, durch den zweiten Vektor oder durch einen dritten
Vektor geliefert werden. Weitere Klassen immunstimulatorischer Moleküle enthalten
Cytokine wie etwa IL-2, IL-12, GM-CSF und dergleichen. Chemokine
wie etwa MIP1, MIP2, RANTES und dergleichen und Flt-3L.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Verbessern einer antigenspezifischen
T-Zellen-Immunreaktion in einem Säugetier auf eine Zielzelle,
auf ein Zielantigen oder auf ein immunologisches Epitop davon, das
das Verabreichen eines rekombinanten Fremdpockenvirus umfasst, das
Nukleinsäuresequenzen
umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle, LFA-3, ICAM-1 und ein B7-Molekül, codieren,
wobei jedes kostimulatorische Molekül in einer Zelle in dem Säugetier
in einer Menge exprimiert wird, die die Verbesserung wenigstens einer
T-Zellen-Immunreaktion
bewirkt, in der die Verbesserung größer als die additive Summe
der Verbesserung ist, die durch die Verabreichung einzelner oder
doppelter kostimulatorischer Moleküle geschaffen wird.
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In
einem weiteren Verfahren zum Verbessern von Immunreaktionen werden
APCs oder Tumorzellen, die fremd oder exogen gelieferte Gene exprimieren,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, in einer wirksamen Menge zum Verbessern der Immunreaktionen
an ein Säugetier
geliefert. Die APC oder Tumorzelle kann ferner Fremdgene exprimieren,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon für die Verbesserung
der Immunreaktionen codieren. Ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon kann an das Säugetier
vor der, gleichzeitig mit der oder nach der Verabreichung der APC
oder Tumorzelle verabreicht werden. Zusätzlich oder alternativ werden
APCs oder Tumorzellen vor der Verabreichung an das Säugetier
mit wenigstens einem Zielantigen oder einem immunologischen Epitop
davon gepulst.
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Die
vorliegende Erfindung schafft Verfahren zum Verbessern der humoralen
Reaktionen in einem Säugetier
auf eine Zielzelle, auf ein Zielantigen oder auf ein immunologisches
Epitop davon, die das Verabreichen eines rekombinanten Vektors,
der Fremdnukleinsäuresequenzen
umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, in einer wirksamen
Menge zum Verbessern der humoralen Reaktion an ein Säugetier
umfassen. Der Vektor kann ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen, die
wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codieren. Die Erfindung schafft weiter einen isolierten Antikörper oder
einen Funktionsabschnitt davon gegen eine Zielzelle, ein Zielantigen
oder ein immunologisches Epitop davon, der durch das Verfahren erzeugt
wird.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung einen für ein Zielantigen spezifischen
Antikörper
oder ein immunologisches Epitop davon, der/das in Reaktion auf die
Verabreichung eines rekombinanten Pockenvirus erzeugt wird, das
Fremdgene, die B7, ICAM-1 und LFA-3 codieren, und Gene, die eines
oder mehrere Zielgene oder Epitope davon codieren, umfasst.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Diese
und weitere Aufgaben, Merkmale und viele der begleitenden Vorteile
der Erfindung werden besser verständlich beim Lesen der detaillierten
Beschreibung der Erfindung.
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1.
Die Genomstruktur des Plasmids pT5032, das Nukleinsäuresequenzen,
die Ratten-LFA-3, -ICAM-1 und -B7.1 codieren, flankiert von Abschnitten
des Hind-III-M-Gebiets
des Impfpockengenoms, umfasst.
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2.
Die Genomstruktur des Plasmids pT5047, das Nukleinsäuresequenzen,
die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das lacZ-Gen codieren, flankiert
von Abschnitten des Hind-III-J-Gebiets des Impfpockengenoms, umfasst.
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3.
Genomstruktur des Plasmids pT5031, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-LFA-3, -ICAM-1
und -B7.1 codieren, und eine Nukleinsäuresequenz, die CEA codiert,
flankiert von Abschnitten des Hind-III-M-Gebiets des Impfpocken genoms
umfasst.
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4A bis 4C.
Genomstruktur rekombinanter Impfpockenviren, die drei kostimulatorische
Rattenmoleküle
mit einem tumorassoziierten Antigen (4C)
oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (4A und
B) exprimieren. 4A zeigt die Genomstruktur
der rekombinanten Impfpocken vT171. 4B zeigt
die Genomstruktur der rekombinanten Impfpocken vT199. 4C zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Impfpocken
vT172. Hind III M und Hind III J sind die Einführungsstellen der Fremdgene
in die Pockenvirusgenome. Die Promotoren 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K
und C1 sind Pockenviruspromotoren. Es sind Bam-HI- und Hind-III-Restriktionsstellen
in den eingeführten
Sequenzen gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren)
von dem oben aufgeführten
5'-Einführungs-Ende (0) jeder Stelle
in Klammern gezeigt ist (nicht maßstäblich gezeichnet).
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5.
Genomstruktur des Plasmids pT8001, das Nukleinsäuresequenzen, die Ratten-B7.1,
-LFA-3, -ICAM-1 und das lacZ-Gen codieren, flankiert von Abschnitten
des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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6.
Genomstruktur des Plasmids pT5049, das eine Nukleinsäuresequenz,
die das tumorassoziierte Antigen, CEA, und Ratten-B7.1, -LFA-3 und
-ICAM-1 in Kombination mit dem lacZ-Gen codiert, flankiert von Abschnitten
des BamHI-J-Gebiets
des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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7A bis 7D.
Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren,
die drei kostimulatorische Rattenmoleküle mit einem tumorassoziierten
Antigen (TAA) (7B, 7C und 7D)
oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) (7A) exprimieren. 7A zeigt
die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken vT222. 7B zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken
vT194. 7C zeigt die Genomstruktur
der rekombinanten Geflügelpocken,
die MUC-1, B7.1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren. 7D zeigt die Genomstruktur der rekombinanten Geflügelpocken,
die ein tumorassoziiertes Antigen, B7.1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren.
BamHI J ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Geflügelpockenvirusgenom.
sE/L, I3, 7.5K, C1, 40K und 30 K sind Pockenviruspromotoren. P1–P5 bezeichnen
fünf verschiedene Pockenviruspromotoren.
Es sind die Restriktionsstellen BamHI und HindIII in den eingeführten Sequenzen
gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren)
von dem 5'-Einführungs-Ende
(0) über
jeder Stelle in Klammern aufgeführt
ist (nicht maß stäblich gezeichnet).
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8.
Genomstruktur des Plasmids pT5064, das Nukleinsäuresequenzen, die menschliches
LFA-3, menschliches ICAM-1, menschliches B7.1 und das lacZ-Gen codieren,
flankiert von Abschnitten des HindIII-J-Gebiets des Impfpockengenoms,
umfasst.
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9A bis 9C.
Genomstruktur des rekombinanten Pockenvirus, das drei kostimulatorische menschliche
Moleküle,
LFA-3, ICAM-1 und B7.1, exprimiert, zusammen mit dem lacZ-Gen mit
einem tumorassoziierten Antigen (9B,
C) oder ohne ein tumorassoziiertes Antigen (9A),
HindIII J ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Impfpockenvirusgenom. BamHI J ist die Einführungsstelle
in das Geflügelpockenvirusgenom.
30K, I3, sE/L, 40K und C1 sind Pockenviruspromotoren. Es sind die
Restriktionsstellen BgIII und HindIII in den eingeführten Sequenzen
gezeigt, wobei die Entfernung jeder Stelle (in Kilobasenpaaren)
von dem 5'-Einführungs-Ende
(0) über
jeder Stelle in Klammern aufgeführt
ist (nicht maßstäblich gezeichnet).
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10. Genomstruktur des Plasmids pT8016, das Nukleinsäuresequenzen,
die CEA (6D) und menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des HindIII-J-Gebiets des Impfpockengenoms,
umfasst.
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11. Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT238, das CEA (6D) und drei kostimulatorische menschliche Moleküle exprimiert.
HindIII J ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 30K, I3, sE/L und C1
sind Pockenviruspromotoren.
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12. Genomstruktur des Plasmids pT8019, das Nukleinsäuresequenzen,
die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren,
flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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13A und 13B.
Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren,
die kostimulatorische Ratten- oder Menschenmoleküle exprimieren. 13A zeigt die Genomstruktur der rekombinanten
Geflügelpocken
vT251. 13B zeigt die Genomstruktur
der rekombinanten Geflügelpocken
vT232. BamHI J ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 30K, I3, sE/L und C1 sind Pockenviruspromotoren.
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14. Genomstruktur des Plasmids pT5072, das Nukleinsäuresequenzen,
die menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren,
flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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15. Genomstruktur des Plasmids pT8020, das Nukleinsäuresequenzen,
die MUC-1, Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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16A bis 16D.
Genomstruktur rekombinanter Geflügelpockenviren,
die kostimulatorische Ratten- oder Menschenmoleküle mit wenigstens einem tumorassoziierten
Antigen exprimieren. 16A zeigt
die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken vT250. 16B zeigt die Genomstruktur rekombinanter Geflügelpocken
vT242. 16C zeigt die Genomstruktur
rekombinanter Geflügelpocken
vT236. 16D zeigt die Genomstruktur
rekombinanter Geflügelpocken
vT257. BamHI J ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 7.5K, 30K, I3, sE/L
und C1 sind Pockenviruspromotoren.
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17. Genomstruktur des Plasmids pT2186, das Nukleinsäuresequenzen,
die MUC-1, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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18. Genomstruktur des Plasmids pT2187, das Nukleinsäuresequenzen,
die CEA (6D), menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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19. Genomstruktur des Plasmids pT5080, das Nukleinsäuresequenzen,
die PSA, PSMA, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des BamHI-J-Gebiets des Geflügelpockengenoms,
umfasst.
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20. Genomstruktur des Plasmids pT5085, das Nukleinsäuresequenzen,
die Ratten-LFA-3, -ICAM-1, -B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen codieren,
flankiert von Abschnitten des Deletion-III-Gebiets des MVA-Genoms,
umfasst.
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21A und 21B.
Genomstruktur rekombinanter MVA-Viren, die kostimulatorische Ratten-
oder Menschenmoleküle
mit oder ohne tumorassoziierte Antigene exprimieren. 21A zeigt die Genomstruktur des rekombinanten
MVA vT246. 21B zeigt die Genomstruktur
des rekombinanten MVA vT260. Deletion III ist die Einführungsstelle
der Fremdgene in das Pockenvirusgenom. 40K, 7.5K, 30K, I3, sE/L
und C1 sind Pockenviruspromotoren.
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22. Genomstruktur des Plasmids pT5084, das Nukleinsäuresequenzen,
die PSA, PSMA, menschliches LFA-3, ICAM-1, B7.1 und das E.-coli-lacZ-Gen
codieren, flankiert von Abschnitten des Deletion-III-Gebiets des
MVA-Genoms, umfasst.
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23. Oberflächenexpression
eines kostimulatorischen Moleküls
nach Infektion mit rekombinanten Viren. Tumorzellen MC38 wurden
5 Stunden mit 5 MOI (Infektionsmultiplizität; PFU/Zelle) mit dem angegebenen
Virus infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit für die kostimulatorische
Moleküle
spezifischen FITC-markierten monoklonalen Antikörpern (MAb) immunhistochemisch
gefärbt.
Schattierte Bereiche sind die Fluoreszenz-Intensität der spezifischen
MAb, während
unschattierte Bereiche die Fluoreszenz-Intensität des geeigneten Isotyp-Kontrollantikörpers (siehe
Materialien und Verfahren) sind.
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24A und 24B.
Die Wirkung mehrerer kostimulatorischer Moleküle auf die T-Zellen-Proliferation.
Naive Ratten-T-Zellen wurden in Anwesenheit veränderlicher Konzentrationen
von Con A zum Liefern des ersten Signals mit MC38-Stimulatorzellen,
die entweder mit rekombinanten Impfpockenvektoren (24A) oder mit
rekombinanten Geflügelpockenvektoren
(24B) infiziert wurden, kokultiviert. Die rekombinanten Vektoren waren
vom Wildtyp (d. h. V-Wyeth oder WT-FP [Leerquadrate]), rV-LFA-3
(Volldreieck), rV-ICAM-1 oder rF-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 oder rF-B7-1 (Vollrauten)
und rV-B7-1-ICAM-1/LFA-3 oder rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Vollquadrate). Nicht infizierte
MC38-Zellen sind Leerkreise. Der Proliferations-Assay ist wie in
Materialien und Verfahren beschrieben.
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25A bis 25D.
Spezifizität
der über
rekombinante Impfpockenviren gelieferten Kostimulation. T-Zellen
wurden in Anwesenheit von Con A mit MC38-Stimulatorzellen, die mit
V-Wyeth (25A), rV-B7-1 (25B), rV-ICAM-1 (25C)
und rV-LFA-3 (25D), wie durch Leerkreise
bezeichnet ist, infiziert wurden, kokul tiviert. Infizierte Stimulatorzellen
in Anwesenheit für
kostimulatorische Moleküle
spezifischer MAb sind durch Vollkreise bezeichnet und Isotypkontrollantikörper sind
durch Volldreiecke bezeichnet.
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26. Relative Fähigkeit
von B7-1, ICAM-1, LFA-3 und die Koexpression aller drei kostimulatorischen
Moleküle
zum Liefern des zweiten Signals für die T-Zellen-Proliferation. 100.00
T-Zellen wurden in Anwesenheit von Con A (2,5 μg/ml) mit 10.000 MC38-Zellen
kokultiviert. Die Stimulatorzellen MC38, die eines oder alle der
kostimulatorischen Moleküle
exprimieren, wurden in verschiedenen Verhältnissen in Kombination mit
mit V-Wyeth infizierten Stimulatorzellen auf insgesamt 104 MC38 Zellen/pro Well zu den Wells zugegeben. Die
MC38-Zellen wurden mit V-Wyeth (Leerquadrat), rV-LFA-3 (Volldreiecke),
rV-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 (Vollrauten) oder rV-B7-1-ICAM-1-LFA-3
(Vollquadrate) infiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden kokultiviert. Während der
letzten 18 Stunden wurde 3H-Thymidin zugegeben,
um die T-Zellen-Proliferation zu messen. Das Einsatzfeld zeigt Proliferationswerte,
die von einer Kultur erhalten wurden, in der 3 % der MC38-Stimulatorzellen
mit den gezeigten Vektoren infiziert wurden. Somit war das Endverhältnis der
Stimulatorzellen zu T-Zellen in diesem Experiment 0,003. Es wird
auf die verhältnismäßig schlechte
Wirkung von rVB7.1/ICAM unter diesen Bedingungen im Vergleich zu
rV-B7/ICAM-LFA-3 hingewiesen.
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27A bis 27D.
Die Wirkung der Kostimulation auf spezifische T-Zellen-Populationen.
Ratten-CD4+-Zellen (27A)
oder -CDA8+-T-Zellen (27B) wurden mit nicht infizierten MC38-Zellen
(Leerkreis) oder mit Zellen, die mit V-Wyeth (Leerquadrate), rV-LFA-3
(Volldreiecke), rV-ICAM-1 (Vollkreise), rV-B7-1 (Vollrauten) oder
rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 (Vollquadrate) in einem Verhältnis von
10:1 infiziert wurden, 48 Stunden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen
von Con A kokultiviert. Während
der letzten 18 Stunden wurde 3H-Thymidin
zur Messung der T-Zellen-Proliferation zugegeben. Die 27C und 27D zeigen
die Proliferationsreaktionen gereinigter CD4+ bzw.
CD8+-Zellen, wenn sie in Anwesenheit vektorinfizierter MC38-Stimulatorzellen
mit einer niedrigen Konzentration von Con A (0,625 μg/ml) kokultiviert
wurden.
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28A bis 28D.
Die Wirkung der Kostimulation auf die Cytokin-Produktion. Ratten-CD4+-T-Zellen (28A und 28C) oder -CD8+-T-Zellen
(28B und 28D)
wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben gereinigt und
mit den angegebenen vektorinfizierten MC38-Stimulatorzellen 24 Stunden
in Anwesenheit von 2,5 μg/ml
Con A kokultiviert. Die überstehenden
Fluide wurden durch die Erfassung ELISA auf die Erzeugung von IL-2
(28A und 28B)
und IFN-γ (28C und 28D)
analysiert.
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29A bis 29C.
Die Wirkung der Kostimulation auf die Cytokin-RNA-Expression. 29A: Ratten-CD4+-T-Zellen
oder -CD8+-T-Zellen wurden mit MC38-Stimulatorzellen,
die in einem T-Zellen/Stimulatorzellen-Verhältnis von 10:1 mit V-Wyeth
(Spur A), rV-B7-1 (Spur B), rV-ICAM-1 (Spur C), rV-LFA-3 (Spur D) oder
rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3
(Spur E) infiziert wurden, 24 Stunden in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con
A kokultiviert. Nach der Kultur wurde die T-Zellen-RNA durch einen
Mehrproben-RNAse-Schutz-Assay analysiert. Die quantitative Darstellung
der Ergebnisse von dem Autoradiogramm ist in 29B (CD4+-Zellen) und in 29C (CD8+-Zellen) für den Ausdruck des Organisationsgens
L32 normiert. Die Reihenfolge der Histogrammbalken (von links nach
rechts) ist MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1, MC38/LFA-3 und MC38/B7-1/ICAM-I/LFA-3.
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30. C57BL/6-Mäusen
(5/Gruppe) wurde HBSS verabreicht (Vollquadrate) oder diese wurden
mit 107 PFU rV-CEA (Volldreiecke) oder rV-CEA/TRICOM
(Vollkreis) geimpft. Einhundert Tage später wurden die Mäuse mit
1·106 MC38-Karzinomzellen
inokuliert, die CEA exprimieren, und es wurde das Überleben
beobachtet. Alle anderen Mäuse
als die der rV-CEA/TRICOM-Gruppe entwickelten Tumoren und wurden
geopfert, wenn die Länge
oder Breite der Tumoren 20 mm überschritt
oder wenn die Mäuse
starben. 30: In einem zweiten Experiment
wurden C57BL/6-Mäuse
(5/Gruppe) mit 107 PFU rV-CEA, rV-CEA/B7.1, rV-CEA/TRICOM oder
eines HBSS-Puffers geimpft. 22 Tage nach der Impfung wurden die
lymphoproliferativen Reaktionen von Pool-Milz-T-Zellen analysiert.
Die Werte repräsentieren
den Stimulationsindex der cpm der Dreifachen gegenüber den
Medien. Die Standardabweichung überstieg
nie 10 %. Die verwendeten Antigene waren Con A (5 μg/ml), CEA
(100 μg/ml)
und Ovalbumin (100 μg/ml).
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31 zeigt ein Schema eines In-vitro-Kostimulations-Assays
von Dendritenzellen.
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32A und 32B zeigt
die Proliferationsreaktion naiver CD4+-T-Zellen
(32A) oder naiver CD8+-T-Zellen
(32B), die in Anwesenheit von Con A mit Vorläufer-DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3
infiziert wurden, oder mit DCs (nicht infiziert, d. h. CD-34+-Zellen, die 6 Tage mit GM-CSF + IL-4 behandelt
wurden) stimuliert wurden.
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33A und 33B zeigen
die Proliferationsreaktion naiver CD4+-T-Zellen
(33A) oder naiver CD8+-T-Zellen
(33B), die mit Vorläufer-DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert
wurden, oder mit DCs, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 oder V-Wyeth (Kontrolle)
infiziert wurden, stimuliert wurden.
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34 zeigt die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)
von Balb/C-Splenozyten gegenüber
bestrahlten C57b1/6-Dendritenzellen, die mit 25 MOI V-Wyeth oder
rV-TRICOM infiziert
wurden. 3H-Thymidin-gepulst am Tag 3, geerntet am Tag 4, ⎕ DC
(nicht infiziert), ∎ DC (V-Wyeth-infiziert), ⎕ DC
(rV-TRICOM-infiziert).
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35 zeigt die Proliferationsreaktion von Responder-T-Zellen
(CAP-M8-T-Zelllinie,
spezifisch für
das CEA-Peptid 8) bei verschiedenen APC-Verhältnissen, die am Tag 5 nach
der Stimulation mit peptidgepulsten DCs geerntet wurden, die mit
rV-TRICOM infiziert wurden und 2 Tage mit 10 u/ml IL2 (keine APC
oder Peptid) ruhten. Peptid 8 (EAQNTTYL) im Assay mit 1 ug/ml Endkonzentration.
Am Tag 2 3H-Thymidin zugegeben, am Tag 3
T-Zellen geerntet. Die Ergebnisse 0 = DC (v-Wyeth)-Pep und Δ = DC (rV-TRICOM)-Pep
sind auf der Grundlinie.
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36A und 36B.
Wirksamkeit der Pockenvirusinfektion von Rattendendritenzellen (DC).
Die DC wurden 5 h mit 25 MOI rV-TRICOM oder 50 MOI rf CEA/TRICOM
infiziert. Die mit TRICOM-Vektoren infizierten DC zeigen eine erhöhte Fähigkeit
zum Stimulieren naiver T-Zellen. Alle DC-Populationen wurden 48
h mit T-Zellen in einem Verhältnis
von 10:1 in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Con A
kokultiviert, um ein Signal 1 zu liefern. Während der letzten 18 h wurde 3H-Thymidin zugegeben. 36A: nicht infizierte DC (Vollquadrate), scheininfizierte
DC (Vollrauten), oder DC, die mit V-WT infiziert wurden (volle umgekehrte Dreiecke),
rV-B7.1 (Leerdreiecke) oder rV-TRICOM (Leerkreise). 36B: DC (Vollquadrate), scheininfizierte DC (Vollrauten)
oder DC, die mit WT-FP (umgekehrte Volldreiecke), mit rF-B7.1 (Leerdreiecke)
oder mit rF-TRICOM (Leerkreise) infiziert wurden.
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37A bis 37F.
Verbesserte allostimulatorische Aktivität durch DC, die mit Impfpockenvektoren (37A, C, E) oder mit Geflügelpockenvektoren (37B, D, F) infiziert wurden. Nicht infizierte
DC (Vollquadrate); scheininfizierte DC (Vollrauten); oder DC, die
mit Pockenvirusvektoren vom Wildtyp (V-WT oder FWT, umgekehrte Volldreiecke),
mit rV-B7.2 oder mit rF-B7.1 (Leerdreiecke) oder mit rV-TRICOM oder
mit rF-TRICOM (Leerkreise) infiziert worden sind, wurden mit allogenetischen
(37A–D)
oder mit syngenetischen T-Zellen (37E–F) 5 Tage
kokultiviert. Während
der letzten 18 h wurde 3H-Thymidin zugegeben.
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38A bis 38F.
Die Wirkung einer Impfpockeninfektion von DC auf die peptidspezifische
T-Zellen-Proliferation. Nicht infizierte DC (Vollquadrate) oder
DC, die mit V-WT (umgekehrte Volldreiecke), mit rV-B7.1 (Leerdreiecke)
oder mit rV-TRICOM
(Leerkreise) infiziert wurden, wurden mit OVA-Peptid-spezifischen T-Zellen (38A, C, E) oder mit CAP-M8-peptidspezifischen
T-Zellen (38B, D, F) kokultiviert. Die
experimentellen Bedingungen enthielten ein festes Verhältnis von
Effektor:Stimulator-Zellen von 10:1 in Anwesenheit verschiedener
Konzentrationen der passenden Peptide (38A–D), negativer
Kontrollpeptide (Leerquadrate), entweder von VSVN (38A) oder von FLU-NP (38B),
oder eine feste Peptidkonzentration von 1 μM in Anwesenheit verschiedener
Effektor:Stimulator-Zellen-Verhältnisse
(38E und F).
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39A und 39B.
Die Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion mit DC, die mit TNF-α oder mit
CD40 gereift sind. DC (Vollquadrate) oder DC, die für die letzten
24 h Kultur entweder mit 100 ng/ml TNF-α (Leerdreiecke) oder mit 5 μg/ml CD40
mAb (Leerkreise) kultiviert wurden, wurden verwendet, um CAP-M8-spezifische
Effektor-T-Zellen zu stimulieren (39A).
Die Proliferation der CAP-M8-T-Zellen in Reaktion auf diese DC-Populationen
nach Infektion mit 25 MOI rV-TRICOM (39B).
Das T-Zellen:DC-Verhältnis
war für
alle Felder 10:1, während
die CAP-M8-Peptidkonzentration
1 μg/ml
war. Vollkreise bezeichnen die Proliferation von CAP-M8-T-Zellen,
die mit allen DC-Populationen stimuliert wurden, in Anwesenheit
von 1 μg/ml
VSVN-Peptid.
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40A bis 40H:
Die Wirkung einer Impfpockeninfektion von DC auf die Induktion einer
CTL-Aktivität.
DC (40B) oder DC, die mit V-WT
(40C) oder mit rV-TRICOM (40D)
infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μm OVA gepulst. Die DC-Populationen wurden
intravenös
an Mäuse
(1·105-Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden
subkutan mit 100 μg
OVA-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert (40A). Vierzehn Tage später wurden die Milzen geerntet,
6 Tage mit dem entsprechenden Peptid restimuliert und auf die Lysefähigkeit
gegen EL-4-Zellen,
die entweder mit OVA (Vollquadrate) oder mit VSVN-Peptiden (Leerqua drate)
gepulst wurden, beurteilt. Die Einsatzzahlen zeigen die CTL-Aktivität, ausgedrückt in Lyseeinheiten.
Außerdem
ist die Wirkung einer Impfpockeninfektion auf DC bei der Induktion
einer CTL-Aktivität gezeigt.
DC (40F) oder DC, die mit V-WT
(40G) oder mit rV-TRICOM (40H)
infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μm CAP-M8-Peptid gepulst. Die
DC-Populationen wurden intravenös
an Mäuse
(1·105 Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden
subkutan mit 100 μg
CAP-M8-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert (40E). Vierzehn Tage später wurden die Milzen geerntet,
6 Tage mit dem entsprechenden Peptid restimuliert und auf die Lysefähigkeit
gegen EL-4-Zellen, die entweder mit CAP-M8 (Vollquadrate) oder mit FLU-NP-Peptiden
(Leerquadrate) gepulst wurden, beurteilt. Die Einsatzzahlen zeigen
die CTL-Aktivität,
ausgedrückt
in Lyseeinheiten.
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41A bis 41C:
Die Wirkung mehrerer Immunisierungen mit mit Impfpocken infizierten
DC auf die Induktion der CTL-Aktivität. DC (Vollquadrate) oder DC,
die mit V-WT (umgekehrte Volldreiecke) oder mit rV-TRICOM (Leerkreise)
infiziert wurden, wurden 2 h mit 10 μM CAP-M8-Peptid gepulst. Die
DC-Populationen wurden in 7-Tage-Intervallen 1-mal, 2-mal oder 3-mal
intravenös
an Mäuse
(1·105 Zellen/Maus) verabreicht. Kontrollmäuse wurden
subkutan mit 100 μg
CAP-M8-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans (Kreuze) immunisiert. Vierzehn
Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzen geerntet,
6 Tage mit CAP-M8 restimuliert und auf die Lysefähigkeit gegen EL-4-Zellen,
die mit CAP-M8 oder mit Kontrollpeptid VSVN (nicht gezeigt) gepulst
wurden, beurteilt.
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42A und 42B.
Die Wirkung mit Impfpocken- und Geflügelpocken-TRICOM infizierter
Splenozyten auf die T-Zellen-Proliferation. Naive Ratten-T-Zellen
wurden mit autogenen Splenozyten, die entweder mit rekombinanten
Impfpocken- oder
mit rekombinanten Geflügelpockenvektoren
infiziert wurden, kokultiviert. Die Kokultur wurde in veränderlichen
Konzentrationen von Con-A als Signal 1 ausgeführt. Die rekombinanten Vektoren
waren vom Wildtyp (d. h. V-WT, FP-WT, Leerraute), rV-B7-1 oder rF-B7-1
(Leerkreise) oder rV-TRICOM oder rF-TRICOM (Vollquadrate). Nicht
infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke gezeigt.
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43A bis 43D.
Die Wirkung TRICOM-Vektor-infizierter Splenozyten auf allogenetische
T-Zellen. Naive Balb/C-T-Zellen wurden mit C57B1/6-Splenozyten,
die entweder 2 Tage (43A und
B) oder 5 Tage (43C und 43D)
mit rekombinanten Impfpockenvektoren (43A und
C) oder mit rekombinanten Geflügelpocken vektoren
(43B und D) infiziert wurden, kokultiviert. Die
rekombinanten Vektoren waren V-WT oder FP-WT, Leerrauten, rV-B7-1
oder rF-B7-1 (Leerkreise) oder rV-TRICOM oder rF-TRICOM (Vollquadrate).
Nicht infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke angegeben. Die
durch DC induzierte Proliferation ist als Vollquadrate angegeben.
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44A bis 44F.
Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Splenozyten auf spezifische T-Zellen-Populationen.
Naive Ratten-T-Zellen wurden mit CD3+-,
CD4+- und CD8+-Unterpopulationen
fraktioniert. Die T-Zellen wurden entweder mit nicht infizierten
autogenen BMDC oder mit Splenozyten, die mit rekombinanten Impfpockenvektoren
infiziert wurden, kokultiviert. Veränderliche Con-A-Konzentrationen
(44A–C)
oder eine veränderliche
Anzahl von Stimulatorzellen (44D–F) lieferten
das erste Signal. Die T-Zellen-Proliferation in Reaktion auf gereifte
BMDC ist durch Leerquadrate und die in Reaktion auf nicht infizierte
Splenozyten ist durch Leerdreiecke angegeben. Die rekombinanten
Vektoren waren vom Wildtyp (V-WT, Leerrauten) oder rV-TRICOM (Vollquadrate).
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45A bis 45F.
Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Knochenmarkzellen auf spezifische
T-Zellen-Populationen. Naive Ratten-T-Zellen wurden in CD3+-, CD4+- und CD8+-Unterpopulationen
fraktioniert. T-Zellen wurden entweder mit nicht infizierten autogenen
BMDC oder mit Splenozyten, die mit rekombinanten Impfpockenvektoren
infiziert wurden, kokultiviert. Veränderliche Con-A-Konzentrationen
(45A–C)
oder eine veränderliche
Anzahl von Stimulatorzellen (45D–F) lieferten
das erste Signal. Die T-Zellen-Proliferation in Reaktion auf gereifte
BMDC ist durch Leerquadrate und die auf nicht infizierte Splenozyten
ist durch Leerdreiecke angegeben. Die rekombinanten Vektoren waren
vom Wildtyp (V-WT, Leerrauten) oder rV-TRICOM (Vollquadrate).
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46A bis 46D.
Die Wirkung rV-TRICOM-infizierter Splenozyten oder Knochenmarkzellen (BM-Zellen)
auf peptidspezifische CD8+-T-Gedächtniszellen.
CAP-M8-spezifische
T-Zellen wurden mit autogenen Splenozyten (46A und
B) oder Knochenmarkzellen (46C und
D), die mit rekombinanten Impfpockenviren infiziert wurden, kokultiviert.
Die Analyse wurde unter Verwendung von zwei Sätzen von Bedingungen ausgeführt: a)
ein festes Verhältnis
von 10:1 von Responderzellen:Stimulatorzellen, die in Anwesenheit mehrerer
Konzentrationen von CAP-M8-Peptid kultiviert wurden (46A und 46C)
oder b) eine feste Konzentration von Peptid (1 uM) in verschiedenen
Responder:Stimulator-Verhält nissen
(46B und 46D).
Die rekombinanten Vektoren waren vom Wildtyp (Leerrauten) und rV-TRICOM
(Vollquadrate). Nicht infizierte Splenozyten sind als Leerdreiecke
gezeigt. BM sind als Leerquadrate gezeigt.
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47. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen, die aus einkernigen Zellen von peripherem Blut (PBMC)
isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher
Dendritenzellen, die mit CEA-Peptiden, mit CAP-1 oder mit CAP1,
6D gepulst wurden.
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48. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter menschlicher Dendritenzellen,
die mit PSA-Peptid, PSA-3, gepulst wurden.
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49. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen, die aus PBMC isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter
menschlicher Dendritenzellen, die mit dem Flu-Peptid 58-66 gepulst wurden.
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50. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen, die aus PBMC isoliert wurden, unter Verwendung rF-TRICOM-
oder rF-B7.1-infizierter menschlicher Dendritenzellen, die mit dem
Flu-Peptid 58-66 gepulst wurden, bei verschiedenen Effektor:APC-Verhältnissen.
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51 zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen aus dem Donor 868 unter Verwendung rF-TRICOM-infizierter
menschlicher Dendritenzellen, die mit HPV-Peptid (11-20) gepulst
wurden, nach einer oder nach zwei In-vitro-Stimulationen (IVS).
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52. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch eine
menschliche T-Zelllinie unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter
menschlicher Dendritenzellen, die mit HPV-Peptid (11-20) gepulst
wurden.
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53. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch eine
menschliche T-Zelllinie unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter
menschlicher Dendritenzellen, die mit verschiedenen Konzentrationen
von HPV-Peptid (11-20) gepulst wurden.
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54. Zeigt die Erzeugung von IFN-γ durch menschliche
T-Zellen unter Verwendung rF-TRICOM- oder rF-B7.1-infizierter menschlicher
Dendritenzellen, die mit dem HPV-E7-Peptid 11-20 gepulst wurden,
bei verschiedenen Effektor:APC-Verhältnissen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der Fremdgene,
die drei kostimulatorische Moleküle
in Kombination oder die funktionalen aktiven Abschnitte jedes kostimulatorischen
Moleküls
codieren, umfasst. Wie es hier verwendet wird, ist ein funktional
aktiver Abschnitt jener Abschnitt des Moleküls, der für die Bindung an seinem jeweiligen
Liganden verantwortlich ist und ein geeignetes kostimulatorisches
Signal für die
Immunzellenaktivierung auslöst.
Ein Verfahren zum Bestimmen der funktionalen Aktivität ist das
Zugreifen auf die Induktion der naiven T-Zellen-Proliferation durch
Liefern des kostimulatorischen Moleküls an eine Zielzelle in vitro,
wie es hier beschrieben wird. Ein Funktionsabschnitt eines kostimulatorischen
Moleküls
stimuliert eine wenigstens 20-%ige Zunahme der T-Zellen-Proliferation.
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Der
Begriff Fremdgen oder Fremdnukleinsäuresequenz oder Funktionsabschnitt
davon, wie er hier verwendet wird, ist ein Gen, eine Nukleinsäuresequenz
oder ein Funktionsabschnitt davon, das/die/der durch einen rekombinanten
Vektor exogen an eine Wirtszelle oder an einen Wirtsorganismus geliefert
wird. Das exogene Gen oder der Abschnitt davon, das/der an die Wirtszelle
oder an den Wirtsorganismus geliefert wird, kann eines/einer sein,
das/der nicht endogen in der Wirtszelle oder in dem Wirtsorganismus
vorhanden ist, oder kann endogen vorhanden und funktional oder nichtfunktional
sein. Falls in der Wirtszelle oder in dem Wirtsorganismus ein funktionales
endogenes Gen vorhanden ist, führt
das Fremdgen oder das exogen gelieferte Gen oder der Funktionsabschnitt
davon zur Überexpression
des Genprodukts.
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Die
rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind brauchbar
bei der Schaffung einer verbesserten Immunreaktion auf Zellen des
Immunsystems, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, NK-Zellen, antigenpräsentierende Zellen (APCs) und
dergleichen. Die Verbesserung der Immunreaktion unter Verwendung
der rekombinanten Vektoren, die drei kostimulatorische Moleküle exprimieren,
ist im Vergleich zur Verwendung eines einzelnen kostimulatorischen
Moleküls
oder der Verwendung zweier kostimulatorischer Moleküle bei der
Verbesserung der Immunreaktionen synergistisch. Die Immunreaktion
kann eine zellulare und/oder humorale Immunreaktion sein und kann
auf ein spezifisches Zielantigen oder auf ein Epitop davon gerichtet
sein oder kann eine verallgemeinerte Immunverbesserungs- oder Aufwärtsregulierungswirkung
sein, wie sie durch erhöhte
Cytokin-Freisetzung, erhöhte
Proliferation durch Immunzellen, erhöhte Mitogenreaktionsfähigkeit
und dergleichen nachgewiesen wird. Die Verbesserung einer Immunreaktion
enthält
vorzugsweise die Hyperstimulation oder Stimulation mit hoher Intensität von T-Zellen
(HITS) im Ergebnis der Stimulation unter Verwendung der rekombinanten
Vektoren der vorliegenden Erfindung oder der Zellen, die durch den
rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert, transduziert
oder induziert wurden.
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Die
Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, können aus
einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Die Auswahl der Quelle
der Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, kann von der unter
Verwendung des rekombinanten Vektors zu immunisierenden oder zu
behandelnden Spezies abhängen.
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Die
Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, können von
der Ratte abgeleitet, vom Menschen abgeleitet, vom Affen abgeleitet
sein und können
auf der Grundlage von Säugetiergenen
chemisch synthetisiert sein. Außerdem
können
die Fremdgene, die die kostimulatorischen Moleküle codieren, vom Vogel abgeleitet
oder auf der Grundlage kostimulatorischer Vogelmolekülgene chemisch
synthetisiert sein. Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden
Erfindung sind brauchbar als Immunogene und als Impfstoffe bei der Stimulierung
einer Verbesserung der Immunreaktionen auf Zielzellen, Zielantigene
und immunologische Epitope davon. Ein solches Niveau der Verbesserung
einer Immunreaktion unter Verwendung der vorliegenden rekombinanten
Vektoren, die Gene umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
konnte unter Verwendung eines einzelnen oder doppelten kostimulatorischen
Moleküls
nicht erhalten worden.
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Gene
oder Funktionsabschnitte davon, die kostimulatorische Moleküle codieren,
die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten, sind
aber nicht beschränkt
auf, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L, Säugetierhomologe
und dergleichen. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung
umfasst Gene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, für die synergistische Verbesserung
der Immunreaktionen, die unter Verwendung eines einzelnen oder doppelten
kostimulatorischen Moleküls
nicht erhalten werden kann. Gene, die verschiedene Kombinationen
kostimulatorischer Moleküle
codieren, sind ein Bereich der Erfindung zur Verwendung in dem rekombinanten
Vektor und können
je nach der gewünschten
Immunreaktion und der zur behandelnden Erkrankung oder Bedingung
solche Kombinationen wie B7.1 oder B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1 oder
B7.2, ICAM-1, LFA-3; B7.1 oder B7.2, ICAM-1, 4-1BBL; B7.1 oder B7.2,
ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL; CD59, VCAM-1; und B7.1 oder B7.2; CD59, CD40,
4-1BBL, CD70 und VCAM-1, B7.1 oder B7.2; OX-40L, 4-1BBL; und dergleichen enthalten.
Anhand der unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der drei
kostimulatorische Moleküle
codiert, erzielten drastischen synergistischen Immunreaktion im
Vergleich zur Verwendung eines rekombinanten Vektors, der eines
oder zwei kostimulatorische Moleküle codiert, führt ein
rekombinanter Vektor, der vier, fünf oder mehr kostimulatorische
Moleküle
codiert, zu einer synergistischen Immunreaktion oder zu einer Immunreaktion,
die gleich oder größer der unter
Verwendung eines rekombinanten Vektors, der drei kostimulatorische
Moleküle
codiert, ist.
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B7
repräsentiert
eine Familie kostimulatorischer Moleküle, die Mitglieder der Gen-Überfamilie Ig sind. Die Mitglieder
enthalten Ratten-B7.1 (CD80) und -B7.2 (CD86). B7.1 und B7.2 sind
die natürlichen
Liganden von CD28/CTLA-4 (CD152). Die Gensequenz von Ratten-B7.1
ist in Freeman u. a. (J. Immunol. 143: 2714–2722, 1989) und in der GENBANK
unter der Zugriffsnummer X60958 offenbart. Die Gensequenz von Ratten-B7.2
ist in Azuma, u. a., (Nature 366: 76–79, 1993) und in der GENBANK
unter der Zugriffsnummer 125606 und MUSB72X offenbart.
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Die
menschlichen Homologe der kostimulatorischen Ratten-B7-Moleküle und der
Funktionsabschnitte davon sind ein Bereich der vorliegenden Erfindung
und haben besondere Nützlichkeit
in rekombinanten Vektoren zur klinischen Verwendung beim Menschen.
Das menschliche Homolog der kostimulatorischen Ratten-B7-Moleküle enthält CD80,
das Homolog des Ratten-B7.1, und CD86, das Homolog des B7.2. Die
Gensequenz von menschlichem 7.1 (CD80) ist in der GENBANK unter
der Zugriffsnummer M27533 offenbart und die Gensequenz von menschlichem
B7.2 (CD86) ist unter der Zugriffsnummer U04343 und AF099105 offenbart. Zur
Verwirklichung dieser Erfindung kann eine Lizenz erforderlich sein.
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Zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinanter
Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz
enthalten, die außer
anderen kostimulatorischen Molekülen
ein Molekül
aus der kostimulatorischen B7-Molekülgruppe oder eine Kombination
der kostimulatorischen B7-Moleküle
oder Funktionsabschnitte davon codiert. Die Kombination kostimulatorischer
B7-Moleküle
enthält,
ist aber nicht beschränkt
auf, zwei oder mehr B7.1-Moleküle,
zwei oder mehr B7.2-Moleküle,
B7.1 und B7.2 und dergleichen. In einer Ausführungsform enthält der rekombinante
Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die das B7.1-Molekül
codiert, in Kombination mit Fremdnukleinsäuresequenzen, die LFA-3 und
ICAM-1 codieren.
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Das
interzellulare Adhäsionsmolekül 1 (Ratten-ICAM-1,
-CD54) und das menschliche Homolog CD54 wirken ebenfalls als ein
kostimulatorisches Molekül.
Ihr Ligand ist das der Leukozytenfunktion zugeordnete Antigen-1
(LFA-1, CD11a/CD18), das auf der Oberfläche von Lymphozyten und Granulozyten
exprimiert wird. Das Gen für
Ratten-ICAM-1 ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer X52264
offenbart und das Gen für das
menschliche ICAM-1-Homolog (CD54) ist in der Zugriffsnummer J03132
offenbart. In einer Ausführungsform
enthält
der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung außer Fremdnukleinsäuresequenzen,
die zwei oder mehr zusätzliche
kostimulatorische Moleküle
codieren, eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Ratten-ICAM-1-Molekül, ein menschliches Homolog
oder ein anderes Säugetierhomolog
oder einen Funktionsabschnitt davon codiert.
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Das
kostimulatorische Molekül
Leukozyten-Funktionsantigen 3, das Ratten-LFA-3 und sein menschliches
Homolog LFA-3 (CD58), ein Glykosylphosphatidylinositolverkettetes
Glykoprotein, ist ein Mitglied der CD2-Familie in der Immunglobulin-Gen-Überfamilie.
Der natürliche
Ligand von LFA-3 ist CD2 (LFA-2), das an Thymozyten, T-Zellen, B-Zellen
und NK-Zellen exprimiert wird. Das Gen für das Ratten-LFA-3 ist in der
GenBank unter der Zugriffsnummer X53526 offenbart und das Gen für das menschliche
Homolog ist in der Zugriffsnummer Y00636 offenbart.
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Das
T-Zellen-Antigen 4-1BBL ist ein kostimulatorisches Molekül, das kostimulatorische
Signale in antigenstimulierten primären T-Zellen-Kulturen und bei
der lectingesteuerten Aktivierung von Thymozyten weiterleitet (Hurtado,
J. C., u. a., J. Immunol. 158(6): 2600–2609, 1997). 4-1BBL gehört zu der
Tumornekrosefaktor-Rezeptorüberfamilie,
einer Gruppe Zystein-reicher Zellenoberflächenmoleküle (Vinay, D. S., u. a., Seminars
in Immunology, 1998, Bd. 10, S. 481–489). Das Gen für Ratten-4-1BBL
ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer U02567 offenbart. Das
Gen für
das menschliche Homolog hu4-1BBL ist in der GenBank unter der Zugriffsnummer
U03397 offenbart.
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OX-40L
ist ein Typ-II-Membranprotein mit beschränkter Homologie zu TNF und
ist in vitro stimulatorisch zu OX-40+-T-Zellen.
Die Ratten- und Menschen-OX-40L-cDNAs
haben auf der Nukleotidebene 68 % Homologie und auf der Aminosäureebene
46 %. Menschliches OX-40L stimuliert ausschließlich menschliche T-Zellen,
während
Ratten-OX-40L sowohl menschliche als auch Mäuse-T-Zellen stimuliert. APC
exprimiert OX-40L und kann während
der Präsentation
des Antigens zu CD4+-T-Zellen das OX-40L:OX40R-Signal übertragen.
Die OX-40L-Signalisierung ist wichtig für die Differenzierung menschlicher
Dendritenzellen und führt zur
erhöhten
Erzeugung von IL-12, TNF-α,
IL-1B und IL-6. (Weinberg, A. D., u. a., 1998 Seminars in Immunology,
Bd. 10: 471–480).
OX-40L ist ein potentes kostimulatorisches Molekül für die Aufrechterhaltung primärer CD4+-T-Zellen-Reaktionen, das in Kombination mit B7-1
verwendet wird (Gramaglia, I., u. a., 1998, J. Immunology, Bd. 161:
6510-7).
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Vektoren,
die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können eine
Expression von wenigstens drei oder mehr Fremdgenen, vorzugsweise
von fünf
oder mehr Fremdgenen, veranlassen. Vektoren, die in der vorliegenden
Erfindung brauchbar sind, enthalten irgendeinen Vektor, der eine
funktionale Expression von drei kostimulatorischen Fremdmolekülgenprodukten
in einer Wirtszelle veranlassen kann. Außer den Genen, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, kann der Vektor ebenfalls die Expression wenigstens eines
Fremdgens veranlassen, das wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon sowie einen wählbaren
Marker codiert.
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Vektoren
der vorliegenden Erfindung enthalten, sind aber nicht beschränkt auf,
Bakterienvektoren wie etwa Salmonellen, Virusvektoren, nukleinsäurebasierte
Vektoren und dergleichen. Virusvektoren enthalten, sind aber nicht
beschränkt
auf, Pockenvirus, Herpesvirus, Adenovirus. Alphavirus, Retrovirus,
Picornavirus, Iridovirus und dergleichen. Pockenviren, die in der
vorliegenden Erfindung brauchbar sind, enthalten replizierende und
nicht replizierende Vektoren. Solche Pockenviren enthalten, sind
aber nicht beschränkt
auf, Orthopox wie etwa Impfpocken, Waschbärpocken, Hasenpocken und dergleichen,
Avipox, Suipox, Capripox und dergleichen. Pockenviren können aus
der Gruppe ausgewählt
werden, die aus Kopenhagen-Impfpocken, dem Wyeth-Impfpockenstamm,
dem MVA-Impfpockenstamm, NYVAC, Geflügelpocken, TROVAC, Kanarienpocken, ALVAC,
Schweinepocken und dergleichen ausgewählt sind. In einer Ausführungsform
ist der rekombinante Vektor ein Impfpockenvirus. In einer weiteren
Ausführungsform
sind der rekombinante Vektor Geflügelpocken.
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Ein
bevorzugter Vektor der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes
Virus, vorzugsweise ein Pockenvirus. Die rekombinanten Pockenviren,
die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, besitzen eine Anzahl
von Eigenschaften, einschließlich
(i) der effektiven Lieferung von Genen an drei Zellentypen einschließlich APC
und Tumorzellen; (ii) hohe Niveaus der Proteinexpression; (iii)
optimale Präsentation
von Antigenen an das Immunsystem; (iv) die Fähigkeit, zellenübertragene
Immunreaktionen sowie Antikörperreaktionen
hervorzurufen; (v) eher vorübergehende
als dauerhafte genetische Modifizierung von Zellen und (vi) die
Fähigkeit, Kombinationen
von Pockenviren von verschiedenen Genera zu verwenden, da sie nicht
immunologisch kreuzreaktiv sind. Elternpockenviren, die bei der
Konstruktion des rekombinanten Pockenvirus der vorliegenden Erfindung
brauchbar sind, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf,
das Orthopox-Virus wie etwa ein replizierendes Impfpockenvirus (Perkus,
u. a., Science, 229: 981–984,
1985; Kaufmann, u. a., Int. J. Cancer 48: 900–907, 1991, Moss, Science,
252: 1662, 1991), hoch verstärkte
Impfpockenviren wie etwa MVA, die modifizierten Ankara-Impfpocken
(Sutter und Moss, Proc. Nat9 Acad. Sci. U.S.A. 89: 10847–10851;
Sutter, u. a., Virology 1994), Kopenhagen-Impfpocken und NYVAC:
Avipox-Viren (15) wie etwa Geflügelpockenvirus
(15), Kanarienpockenviren wie etwa ALVAC und dergleichen (Baxby
und Paoletti, Vaccine 10: 8–9,
1992; Rinns, M. M. u. a. (Hrsg.), Recombinat Poxviruses CRC Press,
Inc, Boca Raton 1992; Paoletti, E., Proc. Nat9 Acad. Sci. USA 93: 11349–11353,
1996) und Suipox-Virus, Capripox-Virus und dergleichen.
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In
einer Ausführungsform
ist das Elternpockenvirus ein Impfpockenvirus. In einer besonderen
Ausführungsform
ist das Impfpockenvirus ein Wyeth-Stamm oder ein Abkömmling davon.
Ein Abkömmling
des Wyeth-Stamms enthält,
ist aber nicht beschränkt
auf, vTBC33, bei dem ein funktionales K1L-Gen und dergleichen fehlt.
In einer abermals weiteren Ausführungsform
ist das Virus Dry-Vax, das als Pockenimpfstoff von den Centers for
Disease Control, Atlanta, GA, verfügbar ist. In einer weiteren
Ausführungsform
ist das Elternpockenvirus ein Stamm von Geflügelpocken, z. B. PDXVAC-TC
(Schering-Plough Corporation) und dergleichen.
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Der
rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann Wirtszellen
in einem Wirt infizieren, transfizieren oder transduzieren. Der
Wirt enthält,
ist aber nicht beschränkt
auf, Säugetiere,
Vögel,
Fische und dergleichen. Die Wirtszellen sind irgendeine Zelle, die
für eine
Infektion, Transfektion oder Transduktion durch den rekombinanten
Vektor zugänglich
ist und die Fremdgene aus dem rekombinanten Vektor in funktionalen
Niveaus exprimieren kann. Die Wirtszellen enthalten, sind aber nicht
beschränkt
auf, professionelle APC und antigenpräsentierende Vorläuferzellen
wie etwa Monozyten, Makrophagen, DC, Langerhans-Zellen und dergleichen.
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls
Tumorzellen oder andere Zellentypen wie etwa juvenile Bindegewebs-
oder Muskelzellen infizieren. Die Infektion der Wirtszellen ermöglicht die Expression
jedes exogenen kostimulatorischen Fremdmoleküls und die Expression der Fremdnukleinsäuresequenz,
die eines oder mehrere Zielantigene codiert, falls in dem rekombinanten
Vektor vorhanden. Die Wirtszellen exprimieren die geeigneten Moleküle der MHC-(HLA-)
Klasse I oder II für
geeignete Antigenpräsentation für CD4+- und/oder CD8+-T-Zellen
oder sind genetisch dafür
manipuliert worden, sie zu exprimieren. Somit kann praktisch irgendeine
Säugetierzelle
genetisch manipuliert werden, um zu einer geeigneten antigenpräsentierenden
Zelle zu werden, die drei kostimulatorische Moleküle exprimiert.
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Der
rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens
ein Expressionssteuerelement, das funktional mit der Nukleinsäuresequenz
verknüpft
ist. Die Expressionssteuerelemente sind in den Vektor eingeführt worden,
um die Expression der Nukleinsäuresequenz
zu steuern und zu regeln (Ausubel, u. a., 1987, in "Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York New York). Expressionssteuerelemente
sind im Gebiet bekannt und enthalten Promotoren. Promotoren, die
in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind Pockenviruspromotoren,
wie sie im Gebiet gut bekannt sind, die 30K, I3, sE/L, 7.5K, 40K,
C1 und dergleichen enthalten, sind darauf aber nicht beschränkt. Die
Nukleinsäuresequenz
des 30K-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer M35027 unter
den Basennummern 28012 bis 28423 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz
von I3 ist in der GenBank-Zugriffsnummer J03399 bei den Basennummern
1100 bis 1301 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz
des 7.5K-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer M35027 unter
den Basennummern 186550 bis 186680 offenbart. Die Nukleinsäuresequenz
des 40K-Promotors
ist in der GenBank-Zugriffsnummer Nr. M13209 bei den Basennummern
9700 bis 9858 (Antisense) offenbart. Die Nukleinsäuresequenz des
C1-Promotors ist in der GenBank-Zugriffsnummer Nr. M59027 unter
den Basennummern 1 bis 242 und im
US-Patent
Nr. 5.093.258 offenbart. Die Sequenz des sE/L-Promotors
ist in Literaturhinweise 16 offenbart. Es können weitere Pockenviruspromotoren
wie etwa die von Davison und Moss (J. Mol. Biol. 210:749–769, (1989))
beschriebenen verwendet werden. Jeder dieser Promotoren kann unter
Verwendung von Standardverfahren im Gebiet synthetisiert werden.
Die Auswahl eines geeigneten Promotors beruht auf seinem Zeitpunkt
und Expressionsniveau. Early- oder Early/Late-Promotoren sind bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ermöglicht
der genutzte Promotor oder die genutzte Kombination von Promotoren
eine optimale Expression jedes kostimulatorischen Moleküls in einem
infizierten Wirt, um eine synergistische Immunreaktion zu liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird jedes Fremdgen, das ein kostimulatorisches Molekül codiert,
durch einen getrennten und verschiedenen Promotor gesteuert.
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Im
Fall nukleinsäurebasierter
Vektoren können
die Konstrukte entweder Nukleinsäure
(DNA oder RNA) oder einem Lipidträger zugeordnet oder in einem
Lipidträger
gekapselt sein. Optional kann das Lipidträgermolekül und/oder -konstrukt in einem
besonderen Zielzellentyp oder in besonderen Zieltypen eine Zielbildung
und/oder Expression liefern. Nackte DNA-Vektoren können durch
Verfahren vorbereitet werden, die im
US-Patent
Nr. 5.827.703 beschrieben sind. Für das Transkriptionsinitiationsgebiet
oder für
das Promotorelement kann unter der Bedingung, dass es das gewünschte Niveau
der Transkription der interessierenden DNA-Sequenz liefert, irgendein
Gebiet verwendet werden. Das Transkriptionsinitiationsgebiet kann
nativ oder homolog zu der Wirtszelle und/oder zu der transkribierenden
DNA sein oder kann fremd oder heterolog zu der zu transkribierenden
Wirtszelle und/oder DNA-Sequenz sein. Effiziente Promotorelemente
für die
Transkriptionsinitiierung nackter DNA enthalten, sind aber nicht
beschränkt
auf, den SV40-Early-Promotor (Affenvirus-40-Early-Promotor), den
RSV-Promotor (Rous-Sarcoma-Virus-Promotor), den Adenovirus-Major-Late-Promotor,
den menschlichen CMV-(Cytomegalievirus-)Immediate-Early-I-Promotor
und dergleichen. Nukleinsäurebasierte
Vektoren können
an einen Wirt unter Verwendung einer Spritze, eines Katheters oder
einer nadelfreien Injektionsvorrichtung wie etwa einer Genpistole
geliefert werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein rekombinanter Vektor geschaffen, der eine
Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein erstes kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt
davon unter der Steuerung eines ersten Promotors codiert, eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein zweites kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt
davon unter der Steuerung eines zweiten Promotors codiert, und eine
Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein drittes kostimulatorisches Molekül oder einen Funktionsabschnitt
davon unter der Steuerung eines dritten Promotors codiert, umfasst.
Ferner kann der rekombinante Vektor eine Fremdnukleinsäuresequenz
liefern, die ein Zielantigen oder einen immunologischen Abschnitt
davon unter der Steuerung eines vierten Promotors codiert.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Pockenvirus geschaffen, das
eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung
eines 30K-Pockenviruspromotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 oder einen Funktionsabschnitt davon unter der Steuerung
eines I3-Pockenviruspromotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung eines sE/L-Pockenviruspromotors
codiert, umfasst. Ein Beispiel eines solchen rekombinanten Pockenviruskonstrukts
sind die wie in 11A gezeigten Impfpocken
vT171. Ferner kann das rekombinante Pockenvirus eine Nukleinsäuresequenz
liefern, die ein tumorassoziiertes Antigen oder einen immunologischen
Abschnitt davon codiert. Eine Ausführungsform der Erfindung sind
die wie in 4C gezeigten rekombinanten
Impfpocken vT172.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Pockenvirus geschaffen,
das eine Nukleinsäuresequenz,
die B7.1 unter der Steuerung eines sE/L-Pockenviruspromotors codiert,
eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Pockenviruspromotors
codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 7.5K-Pockenviruspromotors
codiert, umfasst. Optional umfasst das Konstrukt ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, und/oder eine Nukleinsäuresequenz,
die einen wählbaren
Marker codiert. Eine Ausführungsform
eines solchen rekombinanten Pockenviruskonstrukts sind die wie in 4B gezeigten Impfpocken vT199, die ein lacZ-Gen
als den wählbaren
Marker enthalten.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein rekombinantes Geflügelpockenvirus eine Nukleinsäuresequenz,
die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des sE/L-Pockenviruspromotors
codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Pockenviruspromotors
codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 7.5K-Pockenviruspromotors
codiert. Ein Beispiel dieser Ausführungsform sind die wie in 4A gezeigten Geflügelpocken vT222. Ein rekombinantes
Geflügelpockenvirus
kann ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Zielantigen CEA unter der Steuerung des 40K-Pockenviruspromotors
codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die den wählbaren
Marker lacZ unter der Steuerung des C1-Pockenviruspromotors codiert, umfassen.
Ein Beispiel dieser Ausführungsform
sind die wie in 4B gezeigten Geflügelpocken
vT194.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein rekombinantes Geflügelpockenvirus,
wie in 14C gezeigt ist, eine Nukleinsäuresequenz,
die das tumorassoziierte Antigen MUC-1 oder einen Abschnitt davon unter
der Steuerung des 40K-Promotors
codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des 30K-Promotors
codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des I3-Promotors codiert,
und eine Nukleinsäuresequenz,
die B7.1 oder einen Abschnitt davon unter der Steuerung des sE/L-Promotors
codiert. Wie in 4D gezeigt ist, kann
das rekombinante Geflügelpockenvirus
eine Nukleinsäuresequenz,
die irgendein tumorassoziiertes Antigen oder einen Abschnitt davon
codiert, und Nukleinsäuresequenzen,
die LFA-3, ICAM-1 und B7.1 unter der Steuerung mehrerer Promotoren
codieren, umfassen.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der Nukleinsäuresequenzen
umfasst, die die menschlichen Homologe der kostimulatorischen Moleküle LFA-3,
B7 und ICAM-1 codieren. Der rekombinante Vektor kann ferner die
geeigneten Promotoren liefern, um die Expression jeder Sequenz in
einer infizierten Wirtszelle zu ermöglichen. Eine Ausführungsform
des rekombinanten Vektors ist der in 9 gezeigte
vT224.
-
Die
vorliegende Erfindung schafft Plasmidvektoren, die eine Fremdnukleinsäuresequenz
umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codiert. In einer Ausführungsform
werden Fremdnukleinsäuresequenzen ausgewählt, die
drei kostimulatorische Moleküle
codieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus B7, ICAM-1,
LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L und dergleichen besteht.
In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Plasmidvektoren geschaffen, die
eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein kostimulatorisches B7-Molekül codiert, eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein kostimulatorisches ICAM-1-Molekül codiert, und eine Fremdnukleinsäuresequenz,
die ein kostimulatorisches LFA-3-Molekül codiert, umfassen. Ferner
liefern die Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung wenigstens
eine Promotorsequenz zum Steuern der Expression der kostimulatorischen
Moleküle.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird jede Nukleinsäuresequenz,
die ein kostimulatorisches Molekül
codiert, durch eine getrennte diskrete Promotorsequenz gesteuert.
Zur Verwendung bei der Herstellung eines rekombinanten Pockenvirus
liefern die Plasmidvektoren der vorliegenden Entfernung ferner flankierende
Virusnukleinsäuresequenzen
aus einem unwesentlichen Gebiet eines Pockenvirusgenoms. Die flankierenden
Virusnukleinsäuresequenzen
lenken die Einführung
der Fremdsequenzen in ein Elternpockengenom über homologe Rekombination.
Die Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung können ferner einen oder mehrere
wählbare
Marker zur Auswahl und Identifizierung der rekombinanten Nachkommen,
die die eingeführte
Fremd-DNA enthalten, wie sie im Gebiet bekannt sind, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichsgen, das E.-coli-lacZ-Gen,
antibiotikaresistente Gene, das Gen, das β-Glucuronidase codiert, und
dergleichen umfassen.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst ein Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 unter der Steuerung des 30K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 unter der Steuerung des I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, flankiert
von Abschnitten des Hind-III-M-Gebiets des Impfpockengenoms. In
einer Ausführungsform
ist der Plasmidvektor wie in 1 als
pT5032 gezeigt.
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Eine
weitere Ausführungsform
des Plasmidvektors der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz,
die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 unter der Steuerung des I3-Promotors codiert, und eine Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 unter der Steuerung des 7.5K-Promotors codiert. Der Plasmidvektor
kann ferner ein lacZ-Gen oder einen Abschnitt davon umfassen, das/der
durch eine andere Promotorsequenz gesteuert wird. Diese Sequenzen
werden von Abschnitten des Hind-III-J-Gebiets des Impfpockengenoms flankiert.
Eine besondere Ausführungsform
des Plasmidvektors ist in 2 als
pT5047 gezeigt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst der Plasmidvektor in Kombination mit den Nukleinsäuresequenzen,
die B7, ICAM-1 und LFA-3 codieren, eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert. Zum
Steuern der Expression des Zielantigens ist ein Promotor vorgesehen.
Eine besondere Ausführungsform
des Plasmidvektors ist in 3 als
pT5031 gezeigt und umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die das Zielantigen
CEA codiert.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform
umfasst der Plasmidvektor eine Nukleinsäuresequenz, die das tumorassoziierte
Antigen CEA unter der Steuerung des 40K-Promotors codiert, eine
Nukleinsäuresequenz,
die B7 unter der Steuerung des sE/L-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 unter der Steuerung eines I3-Promotors codiert, und eine
Nukleinsäuresequenz,
die ICAM-1 codiert. Ferner kann der wie in 6 als
pT5049 gezeigte Plasmidvektor ein lacZ-Gen unter der Steuerung eines C1-Promotors
umfassen. Das Plasmid pT5049 wurde am 13. November 1998 gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection,
10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, als ATCC-Zugriffsnummer
203481 hinterlegt.
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In
einer abermals weiteren Ausführungsform
des Plasmidvektors umfasst der Vektor eine Nukleinsäuresequenz,
die huLFA-3 unter der Steuerung des 30K-Promotors codiert, eine Nukleinsäuresequenz,
die hulCAM-1 unter der Steuerung eines I3-Promotors und huB7.1 unter
der Steuerung des sE/L-Promotors codiert. Eine besondere Ausführungsform
des Plasmidvektors, die am 13. November 1998 gemäß den Bestimmungen des Budapester
Vertrags bei der ATCC als ATCC-Zugriffsnummer
203482 hinterlegt wurde, ist in 8 als pP5064
gezeigt.
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Der
Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung kann in Ausrüstungsform
zur Verwendung in Verfahren zum Erzeugen rekombinanter Vektoren
bereitgestellt werden. Die Ausrüstung
kann ferner ein Elternvirus und weitere in dem Rekombinationsprozess
verwendete Reagenzien bereitstellen.
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Ferner
schafft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erzeugen rekombinanter
Pockenviren, die Nukleinsäuresequenzen
umfassen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren. Ein Verfahren
zur Erzeugung eines rekombinanten Pocken virus wird wie im
US-Patent Nr. 5.093.258 offenbart über homologe
Rekombination in vivo zwischen Elternpockenvirusgenom-DNA und einem
Plasmidvektor, der die einzuführenden
heterologen Sequenzen trägt,
ausgeführt.
Plasmidvektoren für
die Einführung
von Fremdsequenzen in Pockenviren werden durch Standardverfahren
der Technologie rekombinanter DNA (36) konstruiert. Die Plasmidvektoren enthalten
eines oder mehrere Chimärenfremdgene,
die jeweils einen Pockenviruspromotor, der mit einer Proteincodierungssequenz
verknüpft
ist, umfassen, flankiert von Virussequenzen von einem unwesentlichen
Abschnitt des Pockenvirusgenoms. Das Plasmid wird unter Verwendung
von im Gebiet akzeptierten Transfektionsverfahren in Zellen transfiziert,
die mit dem Elternpockenvirus infiziert worden sind, wobei die Rekombination
zwischen Pockenvirussequenzen an dem Plasmid und der entsprechenden
DNA in dem Elternvirusgenom zur Einführung der Chimärenfremdgene
von dem Plasmid in das Virusgenom führt. Die rekombinanten Viren werden
unter Verwendung irgendeines einer Vielzahl von Auswahl- oder Siebungssystemen,
wie sie im Gebiet bekannt sind (14), ausgewählt und gereinigt. Die Einführung der
Fremdgene in das Impfpockengenom wird durch Polymerasekettenreaktionsanalyse
(PCR-Analyse) bestätigt.
Die Expression der Fremdgene wird durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.
Ein alternatives Verfahren der Erzeugung rekombinanter Pockenviren wird
durch direkte Ligation ausgeführt
(Pleiderer u. a., J. Gen. Virol. 76:2957–2962, 1995; Merchlinsky u.
a., Virol. 238:444–451,
1997).
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Die
Verwendung des rekombinanten Vektors, der Nukleinsäuresequenzen,
die drei kostimulatorische Moleküle
codieren, in Kombination mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein Epitop davon codiert, umfasst, ist brauchbar
bei der Verbesserung einer Immunreaktion gegen das Zielantigen oder
ein Epitop davon und bei der Verbesserung der Immunreaktion gegen
Zellen, die das Zielantigen oder ein Epitop davon exprimieren. Die
Stärke
der Immunreaktion gegen das Zielantigen, Epitop oder Zellen, die
das Zielantigen exprimieren, die unter Verwendung des rekombinanten
Vektors der vorliegenden Erfindung erhalten wird, ist wesentlich
größer als
die, die unter Verwendung von Systemen erzielt wird, die ein einzelnes
oder doppeltes kostimulatorisches Molekül nutzen.
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Der
rekombinante Vektor codiert drei kostimulatorische Moleküle in Kombination
mit einer Nukleinsäuresequenz,
die ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert,
um eine synergistische Immunreaktion auf das Zielantigen oder Epitop
davon zu liefern. In einer Ausführungsform
schafft ein rekombinantes Pockenvirus eine Nukleinsäuresequenz,
die B7, ICAM-1 und LFA-3 codiert, zusammen mit einer Nukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert. In einigen Fällen kann
es brauchbar sein, mehr als eine Nukleinsäuresequenz zu liefern, um drei
Zielantigene oder immunologische Epitope davon zu liefern, um einen
mehrwertigen Impfstoff zu haben.
-
Das
Zielantigen, wie es hier verwendet wird, ist ein Antigen oder ein
immunologisches Epitop auf das Antigen, das wesentlich bei der Immunerkennung
und schließlich
-beseitigung oder -steuerung des die Krankheit verursachenden Mittels
oder des Erkrankungszustands in einem Säugetier ist. Die Immunerkennung
kann zellular und/oder humoral sein. Im Fall intrazellularer Krankheitserreger
und von Krebs ist die Immunerkennung vorzugsweise eine T-Lymphozyten-Reaktion.
-
Das
Zielantigen kann von einem pathogenen Mikroorganismus wie etwa von
Viren einschließlich
HIV (Korber u. a., Hrsg., HIV Molecular Immunology Database, Los
Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1977), Grippe,
Herpes simplex, des menschlichen Papillomavirus (
US-Patent Nr. 5.719.054 ), Hepatitis B
(
US-Patent Nr. 5.780.036 ),
Hepatitis C (
US-Patent Nr. 5.709.995 ),
EBV, des Cytomegalievirus (CMV) und dergleichen abgeleitet oder
isoliert werden. Das Zielantigen kann aus pathogenen Bakterien wie
etwa Chlamydia (
US-Patent Nr.
5.869.608 ), Mykobakterien, Legionellen, Meningokokken,
Streptokokken der Gruppe A, Salmonellen, Listeria, Hemophilus influenzae
(
US-Patent Nr. 5.955.596 )
und dergleichen abgeleitet oder isoliert werden.
-
Das
Zielantigen kann von einer pathogenen Hefe einschließlich Kolbenschimmel,
invasiver Candida (
US-Patent
Nr. 5.645.992 ), Nocardia, Histoplasmose Cryptosporidia
und dergleichen abgeleitet oder isoliert sein sein.
-
Das
Zielantigen kann von einem pathogenen Protozoon und von pathogenen
Parasiten, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Pneumocystis carinii, Trypasosoma, Leishmania (
US-Patent Nr. 5.965.242 ), Plasmodium
(
US-Patent Nr. 5.589.343 )
und Toxoplasma gondii abgeleitet oder isoliert sein.
-
Das
Zielantigen enthält
ein Antigen, das einem präneoplastischen
oder hyperplastischen Zustand zugeordnet ist. Das Zielantigen kann
ebenfalls einem Krebs zugeordnet sein oder einen Krebs verursachen.
-
Dieses
Zielantigen kann ein tumorspezifisches Antigen, ein tumorassoziiertes
Antigen (TAA) oder ein gewebespezifisches Antigen, ein Epitop davon
und ein Epitopagonist davon sein. Diese Zielantigene enthalten,
sind aber nicht beschränkt
auf, ein carcinoembryonales Antigen (CEA) und Epitope davon wie
etwa CAP-1, CAP-1-6D (46) und dergleichen (GenBank-Zugriffsnummer
M29540), MART-1 (Kawakami u. a., J. Exp. Med. 180:347–352, 1994),
MAGE-1 (
US-Patent Nr. 5.750.395 ),
MAGE-3, GAGE (
US-Patent Nr. 5.648.226 ),
GP-100 (Kawakami u. a. Proc. Nat'l
Acad. Sci USA 91:6458–6462,
1992), MUC-1, MUC-2, ein punktmutiertes RAS-Onkogen, normale und
punktmutierte p53-Onkogene (Hollstein u. a., Nucleic Acids Res., 22:3551–3555, 1994),
PSMA (Israeli u. a. Cancer Res. 53:227–230, 1993), Tyrosinase (Kwon
u. a. PNAS 84:7473–7477,
1987), TRP-1 (gp75)(Cohen u. a., Nucleic Acid Res. 18:2807–2808, 1990;
US-Patent Nr. 5.840.839 ), NY-ESO-1
(Chef u. a. PNAS 94:1914–1918,
1997), TRP-2 (Jackson u. a. EMBOJ 11:527–535, 1992), TAG72, KSA, CA-125,
PSA, HER-2/neu/c-erb/B2,
(
US-Patent Nr. 5.550.214 ),
BRC-I, BRC-II, brc-abl, pax3-fkhr, ewsfli-1, Modifikationen von
TAAs und gewebespezifischem Antigen, Spleißvarianten von TAAs, Epitopagonisten
und dergleichen. Weitere TAAs können
durch im Gebiet bekannte Verfahren wie etwa jene, die im
US-Patent Nr. 4.514.506 offenbart
sind, identifiziert, isoliert und geklont werden. Das Zielantigen
kann außerdem
einen oder mehrere Wachstumsfaktoren und Spleißvarianten von jedem enthalten.
-
Mögliche menschliche
Tumorantigene und gewebespezifische Antigene sowie immunologische
Epitope davon zur Zielsetzung unter Verwendung der vorliegenden
Erfindung enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die beispielhaft
in Tabelle 1 erläutert
sind. Tabelle 1 Antigene und Epitope, die durch T-Zellen
erkannt werden
Zielantigene | Restriktionselement | Immunologisches
Peptidepitop | lfd.ID-Nr. |
Durch T-Zellen
erkannte menschliche Zieltumorantigene | |
gp
100 | HLA-A2 | KTWGQYWZY | |
| HLA-A2 | ITDQVPPSV | 2 |
| HLA-A2 | YLEPGPVTA | 3 |
| HLA-A2 | LLDGTATLRL | 4 |
| HLA-A2 | VLYRYGSFSV | 5 |
MART1-/Melan
A | HLA-A2 | AAGIGILTV | 6 |
| HLA-A2 | ILTVILGVL | 7 |
TRP-1
(GP75) | HLA-A31 | MSLQRQFLR | 8 |
Tyrosinase | HLA-A2 | MLLAVLYCL | 9 |
| HLA-A2 | YMNGTMSQV | 10 |
| HLA-B44 | SEIWRDIDF | 11 |
| HLA-A24 | AFLPWHRLF | 12 |
| HLA-DR4 | QNILLSNAPLGPQFP | 13 |
| HLA-DR4 | SVLQDSDPDSFQD | 14 |
MAGE-1 | HLA-A1 | EADPTGHSY | 15 |
| HLA-Cw16 | SAYGEPRKL | 16 |
MAGE-3 | HLA-A1 | EVDPIGHLY | 17 |
| HLA-A2 | FLWGPRALV | 18 |
BAGE | HLA-Cw16 | AARAVFLAL | 19 |
GAGE-1,2 | HLA-Cw6 | YRPRPRRY | 20 |
N-Metylglucosaminyltransferase-V | HLA-A2 | VLPDVFIRC | 21 |
p15 | HLA-A24 | AYGLDFYIL | 22 |
CEA | | YLSGANLNL(CAP1) | 23 |
| | YLSGADLNL (CAP1-6D) | 24 |
| | | 37 |
β-Catenin | HLA-A24 | SYLDSGIHF | 25 |
MUM-1 | HLA-B44 | EEKLIVVLF | 26 |
CDK4 | HLA-A2 | ACDPHSGHFV | 27 |
HER-2/neu | HLA-A2 | IISAVVGIL | 28 |
(Brust-
und Eierstockkarzinom) | HLA-A2 | KIFGSLAFL | 29 |
menschl.
Papillomavirus | | | |
E6,E7 | HLA-A2 | YMLDLQPETT | 30 |
(Gebärmutterhalskrebs) | | | |
MUC-1 | Nicht
MHC-beschränkt | PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA | 31 |
| MHC-beschränkt | (und
Abschnitte davon) | |
(Brust-
Eierstock- und | | | |
Bauchspeicheldrüsenkarzinom | | | |
PSA | A2, A3 | FLTPKKLQCVDLHVISNDVCA- | 32 |
| | QVHPQKVTK | |
| | FLTPKKLQCV | 33 |
| | KLQCVDLHV | 34 |
| | VISNDVCAQV | 35 |
| | QVHPQKVTK | 36 |
-
Für Organismen,
die ein DNA-Genom enthalten, wird aus der Genom-DNA ein Gen isoliert,
das ein interessierendes Zielantigen oder ein immunologisches Epitop
davon codiert. Für
Organismen mit RNA-Genomen kann das gewünschte Gen aus cDNA-Kopien
des Genoms isoliert werden. Falls Restriktionskarten des Genoms
verfügbar
sind, wird das DNA-Fragment, das das interessierende Gen enthält, durch
Restriktionsendonukleasedigestion durch Routineverfahren im Gebiet
abgetrennt. In Fällen,
in denen das gewünschte
Gen zuvor geklont worden ist, können
die Gene leicht aus den verfügbaren
Klonen erhalten werden. Falls die DNA-Sequenz des Gens bekannt ist,
kann das Gen alternativ durch irgendeine der herkömmlichen
Techniken für
die Synthese von Desoxyribonukleinsäuren synthetisiert werden.
-
Gene,
die ein interessierendes Antigen codieren, können durch Klonen des Gens
in einem Bakterienwirt verstärkt
werden. Zu diesem Zweck können
verschiedene prokaryontische Klonvektoren verwendet werden. Beispiele
sind die Plasmide pBR322, pUC und pEMBL.
-
Die
Gene, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop
davon codieren, können durch
Standardtechniken für
die Einführung
in die für
die Rekombination mit einem Virus bestimmtem Plasmidvektoren vorbereitet
werden. Im Allgemeinen können
die geklonten Gene durch Restriktionsenzymdigestion aus dem prokaryontischen
Klonvektor herausgeschnitten werden. In den meisten Fällen enthält das herausgeschnittene
Fragment das gesamte Codierungsgebiet des Gens. Das DNA-Fragment,
das das geklonte Gen trägt,
kann nach Bedarf wie hier beschrieben modifiziert werden, um z.
B. die Enden des Fragments mit den Einführungsstellen der DNA-Vektoren,
die für
die Rekombination mit einem Virus verwendet werden, kompatibel zu
machen, und daraufhin vor der Einführung in die Vektoren bei den
Restriktionsendonuklease-Abtrennungsstellen (Klonungsstellen) gereinigt
werden.
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Unter
Verwendung der vorliegenden Erfindung können Erkrankungen behandelt
oder verhindert werden, die Erkrankungen enthalten, die durch Viren,
Bakterien, Hefe, Parasiten, Protozoen, Krebszellen und dergleichen
verursacht werden. Der rekombinante Vektor, der drei kostimulatorische
Moleküle
umfasst, kann als ein verallgemeinertes Immunverbesserungsmittel
verwendet werden und besitzt somit Nützlichkeit bei der Behandlung
von Erkrankungen ohne bekannte ätiologische
Ursache.
-
Präneoplastische
oder hyperplastische Zustände,
die unter Verwendung eines rekombinanten Vektors der vorliegenden
Erfindung behandelt oder verhindert werden können, enthalten, sind aber
nicht beschränkt auf,
präneoplastische
oder hyperplastische Zustände
wie etwa Dickarmpolypen, die Crohn-Krankheit, Colitis ulcerosa/gravis,
Brustschädigungen
und dergleichen.
-
Krebse,
die unter Verwendung des rekombinanten Vektors der vorliegenden
Erfindung behandelt werden können,
enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, ein primäres oder
Metastasen-Melanom, ein Adenokarzinom, ein Plattenepithelkarzinom,
ein Adenoplattenzellenkarzinom, eine Thymus-Geschwulst, einen Lymphknotentumor,
ein Sarkom, Lungenkrebs, Leberkrebs, Nicht-Hodgkins-Lymphknotenkrebs,
Hodgkins-Lymphknotenkrebs, Leukämien,
Gebärmutterkrebs,
Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Dickdarmkrebs, Drei-Myelom, Neuroblastom, NPC, Blasenkrebs, Gebärmutterhalskrebs
und dergleichen.
-
Die
vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung,
die einen rekombinanten Vektor, der Fremdgene, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, umfasst, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Drei Gene, die ein kostimulatorisches Molekül codieren, bilden einen Teil
des rekombinanten Vektors und können
aus der Gruppe von Genen ausgewählt
werden, die B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1,
OX-40L und dergleichen codieren. Ferner kann der rekombinante Vektor
eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon codiert. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Arzneimittelzusammensetzung
einen ersten rekombinanten Vektor, der Fremdgene umfasst, die drei
kostimulatorische Moleküle
codieren, einen zweiten rekombinanten Vektor, der Nukleinsäuresequenzen
umfasst, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop
davon codieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die
Verabreichung der Arzneimittelzusammensetzung stellt für Wirtzellen
die Fremdgene bereit, die drei kostimulatorische Moleküle codieren.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst eine Arzneimittelzusammensetzung ein rekombinantes Pockenvirus,
das Fremdgene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, enthält, in einem
pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Das rekombinante Pockenvirus kann ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfassen oder alternativ kann ein zweites rekombinantes
Pockenvirus bereitgestellt sein, das wenigstens ein Zielantigen
oder ein immunologisches Epitop davon codiert.
-
Die
vorliegende Erfindung schafft eine Arzneimittelzusammensetzung,
die ein rekombinantes Pockenvirus, das eine Nukleinsäuresequenz,
die B7.1 bis B7.2 codiert, eine Nukleinsäuresequenz, die ICAM-1 codiert,
und eine Nukleinsäuresequenz,
die LFA-3 codiert, umfasst, und einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger
umfasst. Zusätzlich
zu dem B7-, ICAM-1-, LFA-3-Konstrukt kann das rekombinante Pockenvirus
der Arzneimittelzusammensetzung außerdem eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches
Epitop davon codiert, oder kann die Nukleinsäuresequenz, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, in
der Zusammensetzung durch ein zweites rekombinantes Pockenvirus
bereitgestellt sein.
-
Außerdem kann
die Arzneimittelzusammensetzung für zusätzliche Synergie oder Verbesserung
einer Immunreaktion exogen hinzugefügte immunstimulatorische Moleküle, wie
sie im Gebiet bekannt sind, einschließlich der kostimulatorischen
Moleküle
B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40-L und
dergleichen, und/oder Cytokine und Chemokine einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, IL2, GM-CSF, TNFα,
IFNγ, IL-12,
RANTES, MIP-1α,
Flt-3L (
US-Patent Nr. 5.554.512 ;
5.843.423 ) und dergleichen enthalten.
Die Cytokine und Chemokine selbst können in der Zusammensetzung
bereitgestellt sein oder alternativ können die Cytokine und Chemokine
durch einen rekombinanten Virusvektor, der das Cytokin oder Chemokin
codiert, bereitgestellt sein.
-
Außerdem umfasst
die vorliegende Erfindung hier offenbarte Verfahren zur Behandlung
oder Verhinderung einer Erkrankung, die durch pathogene Mikroorganismen
oder durch Krebs verursacht wird.
-
In
dem Behandlungsverfahren kann die Verabreichung des rekombinanten
Vektors der Erfindung entweder zum "prophylaktischen" oder zum "therapeutischen" Zweck erfolgen. Wenn der rekombinante
Vektor der vorliegenden Erfindung prophylaktisch gegeben wird, wird
er vor irgendeinem Symptom gegeben. Die prophylaktische Verabreichung
des rekombinanten Vektors dient zur Verhinderung oder Milderung
irgendeiner nachfolgenden Infektion oder Erkrankung. Wenn der rekombinante
Vektor therapeutisch gegeben wird, wird er bei oder nach Einsetzen
eines Infektions- oder Erkrankungssymptoms gegeben. Somit kann die
vorliegende Erfindung entweder vor der erwarteten Gefährdung durch
ein krank machendes Mittel oder einen Erkrankungszustand oder nach
Beginn der Infektion oder Erkrankung gegeben werden.
-
Der
Begriff "Einheitsdosis", wie er sich auf
das Inokulum bezieht, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten,
die als Einheitsdosen für
Säugetiere
geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorgegebene Menge des rekombinanten
Vektors enthält,
die so berechnet wird, dass sie im Zusammenhang mit dem erforderlichen
Verdünnungsmittel
die gewünschte
immunogene Wirkung erzeugt. Die Spezifikationen für die neue
Einheitsdosis eines Inokulums dieser Erfindung werden durch die
eindeutigen Eigenschaften des rekombinanten Virus und die besondere
zu erzielende immunologische Wirkung vorgeschrieben und hängen davon
ab.
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Das
Inokulum wird üblicherweise
als eine Lösung
in einem tolerierbaren (akzeptablen) Verdünnungsmittel wie etwa Salzlösung, phosphatgepufferter
Salzlösung
oder in einem anderen physiologisch tolerierbaren Verdünnungsmittel
und dergleichen zubereitet, um eine wässrige Arzneimittelzusammensetzung
zu bilden.
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Der
Beimpfungsweg kann Hautritzung, intravenös (IV), intramuskulär (IM),
subkutan (SC), intradermal (ID), intraperitoneal (IP), intratumoral
und dergleichen sein, was dazu führt,
dass eine Schutzreaktion gegen das krankheitsverursachende Mittel
hervorgerufen wird. Die Dosis wird wenigstens einmal verabreicht.
Nachfolgende Dosen können
wie angegeben verabreicht werden.
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In
einer Ausführungsform
werden heterologe Primärbeschleunigungsregimes
genutzt. In einem Beispiel wird der Wirt wenigstens einmal mit einem
ersten Vektor wie etwa mit einem nukleinsäurebasierten Vektor immunisiert.
Nachfolgende Immunisierungen werden mit einem Pockenvirusvektor
ausgeführt.
In einem weiteren Beispiel wird der Wirt zuerst mit einem ersten
Pockenvirusvektor und daraufhin mit einem zweiten Pockenvirusvektor
einer anderen Gattung immunisiert.
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Bei
der Gabe des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung an
ein Säugetier,
vorzugsweise an einen Menschen, ändert
sich die Dosierung des verabreichten rekombinanten Vektors je nach
solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem
Geschlecht, der allgemeinen medizinischen Bedingung, der medizinischen
Vorgeschichte, des Erkrankungsfortschritts, der Tumorbelastung und
dergleichen des Säugetiers.
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Im
allgemeinen ist erwünscht,
an den Empfänger
eine Dosis des rekombinanten Vektors in dem Bereich von etwa 105 bis 1010 Plaque-bildende
Einheiten zu geben, obgleich eine niedrigere oder eine höhere Dosis
verabreicht werden kann.
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Die
genetische Definition tumorassoziierter und tumorspezifischer Antigene
ermöglicht
die Entwicklung gezielter antigenspezifischer Impfstoffe für die Krebstherapie.
Die Einführung
eines Tumorantigen-Gens in das Genom rekombinanter Pockenviren in
Kombination mit Genen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
ist ein leistungsfähiges
System, um hinsichtlich der Prävention
bei Personen mit einem erhöhten
Risiko der Krebsentwicklung eine spezifische Immunreaktion hervorzurufen
(präventive
Immunisierung), um Tumoren vor der Operation zu verkleinern, um
die Erkrankungswiederkehr nach der Hauptoperation zu verhindern (Anti-Metastasen-Schutzimpfung),
oder um die Anzahl zytotoxischer Lymphozyten (CTL) in vivo zu expandieren
und somit ihre Effektivität
bei der Vernichtung diffuser Tumoren zu verbessern (Behandlung der
ausgebrochenen Erkrankung). Rekombinante Viren der vorliegenden
Erfindung können
in autogenen Lymphozyten (CD8+), entweder
zytotoxischen T-Lymphozyten und/oder CD4+-T-Helferzellen
oder -NK-Zellen ex vivo eine Immunreaktion hervorrufen, bevor sie
zu dem tumortragenden Patienten zurück übertragen werden (adoptive Immuntherapie).
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In
Krebsbehandlungen können
die rekombinanten Vektoren entweder vor irgendeiner Erscheinung von
Krebsen wie etwa eines Adenokarzinoms oder, um eine Rückbildung
der Erkrankung in einem mit einem Krebs wie etwa einem Adenokarzinom
betroffenen Säugetier
herbeizuführen,
in ein Säugetier
eingeführt
werden.
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Je
nach der Erkrankung oder Bedingung, die zu behandeln ist, und dem
Behandlungsverfahren kann der rekombinante Vektor zusätzlich zu
den Genen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren, eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert,
umfassen oder nicht umfassen. Das Zielantigen oder das immunologische
Epitop davon kann endogen durch die mit dem rekombinanten Vektor
infizierte Wirtszelle geliefert werden, während z. B. eine Tumorzelle
endogen ein tumorassoziiertes Antigen oder ein Epitop davon exprimieren
kann und keine Zugabe eines Fremdgens, das ein exogenes tumorassoziiertes
Antigen codiert, zu erfordern braucht. Falls ein tumorassoziiertes
Antigen in einer Wirtszelle fehlt, nicht exprimiert wird oder in
niedrigen Pegeln exprimiert wird, kann ein Fremdgen geliefert werden,
das ein exogenes tumorassoziiertes Antigen codiert. Ferner können Gene
geliefert werden, die mehrere verschiedene tumorassoziierte Antigene
codieren. Das Fremdgen, das ein exogenes tumorassoziiertes Antigen
codiert, kann durch den gleichen rekombinanten Vektor geliefert
werden, der Gene umfasst, die drei kostimulatorische Moleküle umfassen,
oder kann durch einen zweiten rekombinanten Vektor in einem Gemisch
mit dem ersten rekombinanten Vektor geliefert werden.
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Beispiele
von Verfahren zur Verabreichung des rekombinanten Vektors in Säugetieren
enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, dass Tumorzellen dem
rekombinanten Virus ex vivo ausgesetzt werden, oder die Injektion
des rekombinanten Vektors in den betroffenen Wirt durch intravenöse, SC-,
ID- oder IM-Verabreichung des Virus. Alternativ kann der rekombinante
Vektor oder die Kombination rekombinanter Vektoren lokal durch direkte
Injektion in die Krebsverletzung oder den Tumor oder durch örtliche
Applikation in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht
werden. Die Menge des zu verabreichenden rekombinanten Vektors,
der die Nukleinsäuresequenz
eines oder mehrerer tumorassoziierter Antigene (TAAs) in Kombination
mit Nukleinsäuresequenzen,
die drei zu verabreichende kostimulatorische Moleküle codieren,
trägt,
beruht auf dem Titer der Viruspartikel. Ein bevorzugter Bereich
des zu verabreichenden Immunogens sind 105 bis
1010 Viruspartikel pro Säugetier, vorzugsweise ein Mensch.
Falls das zu immunisierende Säugetier
bereits an Krebs oder an metastatischem Krebs leidet, kann der Impfstoff
in Verbindung mit anderen therapeutischen Behandlungen verabreicht
werden.
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In
einem Behandlungsverfahren können
autogene zytotoxische Lymphozyten oder tumorinfiltrierende Lymphozyten
aus Blut, Lymphknoten, einem Tumor und dergleichen von einem Patienten
mit Krebs erhalten werden. Die Lymphozyten werden in Kultur gezüchtet und
die zielantigenspezifischen Lymphozyten werden durch Kultivieren
in Anwesenheit des spezifischen Zielantigens und entweder antigenpräsentierender
Zellen, die drei kostimulatorische Fremdmoleküle exprimieren, oder der zielantigengepulsten
APCs der vorliegenden Erfindung expandiert. Daraufhin werden die
zielantigenspezifischen Lymphozyten wieder in den Patienten zurück infundiert.
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Nach
der Immunisierung kann die Effektivität des Impfstoffs durch die
Herstellung von Antikörpern oder
Immunzellen, die das Antigen erkennen, beurteilt werden, wie sie
durch die spezifische Lyseaktivität oder durch die spezifische
Cytokin-Produktion
oder durch Tumorrückbildung
beurteilt wird. Der Fachmann kennt die herkömmlichen Verfahren zur Beurteilung
der oben erwähnten
Parameter.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zum Verbessern der antigenspezifischen
T-Zellen-Reaktionen durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines
rekombinanten Vektors, der drei kostimulatorische Fremdmoleküle und ein
Zielantigen codiert, in ein Säugetier
allein oder durch Infizieren einer Zielzelle mit dem Vektor, mit
dem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon. In
einer Ausführungsform
des Verfahrens wird ein rekombinanter Vektor, der ein Molekül aus der
B7-Familie, ICAM-1 und LFA-3 codiert, allein oder gemischt mit einer
Zielzelle, mit einem Zielantigen oder mit einem immunologischen
Epitop davon verabreicht. Der Immunisierungszugang ergänzt oder
verbessert die Immunreaktionen, die durch das Zielantigen erzeugt
werden, wobei er im Vergleich zur Verwendung einzelner oder doppelter
kostimulatorischer Moleküle eine
synergistische Reaktion schafft. Das Verfahren des Verabreichens
eines rekombinanten Vektors, der Gene enthält, die drei kostimulatorische
Moleküle
codieren, führt
im Vergleich zur Verwendung eines rekombinanten Vektors, der ein
einzelnes oder doppeltes kostimulatorisches Molekül codiert,
zur erhöhten
zielantigenspezifischen Lymphoproliferation, zur verbesserten cytolytischen
Aktivität,
zur verbesserten Cytokin-Absonderung und zu länger anhaltender Immunität für das Zielantigen.
Ferner kann der rekombinante Vektor für die synergistische Verbesserung
der zielantigenspezifischen Immunreaktionen eine Nukleinsäuresequenz,
die wenigstens ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon
codiert, umfassen. Alternativ wird die Nukleinsäuresequenz, die wenigstens
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon codiert, durch
einen zweiten rekombinanten Vektor geliefert, der von dem Vektor,
der die drei kostimulatorischen Moleküle codiert, verschieden ist.
In einer Ausführungsform
des Verfahrens zum Verbessern antigenspezifischer T-Zellen-Reaktionen
werden Säugetiere,
vorzugsweise Menschen, mit einem rV-HIV-1-Epitop/B7-1/ICAM-1/LFA-3-Konstrukt
immunisiert. Die Wirksamkeit der Behandlung kann in vitro und/oder
in vivo durch Bestimmung der zielantigenspezifischen Lymphoproliferation,
der zielantigenspezifischen Cytolyse-Reaktion, der klinischen Reaktionen
und dergleichen überwacht
werden.
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Das
Verfahren zum Verbessern antigenspezifischer T-Zellen-Reaktionen
kann für
irgendein Zielantigen oder immunologisches Epitop davon verwendet
werden. Von besonderem Interesse sind tumorassoziierte Antigene,
gewebespezifische Antigene und Antigene infektiöser Mittel.
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Je
nach der zu behandelnden Bedingung können zusätzlich zur Verabreichung des
rekombinanten Vektors an den Patienten weitere exogene Immunmodulatoren
oder immunstimulatorische Moleküle,
chemotherapeutische Arzneimittel, Antibiotika, Antimykotika, antivirale
Arzneimittel und dergleichen allein oder in Kombination davon verabreicht
werden. Beispiele weiterer exogen zugegebener Mittel enthalten exogenes IL-2,
IL-6, Alfa-, Beta- oder Gamma-Interferon, GM-CSF, Tumornekrosefaktor,
Flt-3L, Cyclophosphamid, Cisplatin, Gancyclovir, Amphotericin B,
5-Fluorouracil und dergleichen.
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Die
vorliegende Erfindung schafft Wirtszellen, die drei exogene kostimulatorische
Fremdmoleküle
exprimieren, in denen die Moleküle
durch einen rekombinanten Vektor geliefert werden, der Fremdnukleinsäuresequenzen
besitzt, die drei kostimulatorische Moleküle codieren. Die Wirtszellen
können
außerdem
eines oder mehrere endogene Zielantigene oder immunologische Epitope
davon exprimieren oder können
genetisch manipuliert worden sein, um eines oder mehrere exogene
Fremdzielantigene oder immunologische Epitope davon zu exprimieren,
die ebenfalls durch einen rekombinanten Vektor, der drei kostimulatorische
Moleküle
codiert, oder durch einen zweiten rekombinanten Vektor bereitgestellt
werden können.
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Die
Wirtszellen der vorliegenden Erfindung, die beim Stimulieren einer
antigenspezifischen Immunreaktion genutzt werden können, können irgendeine
Zelle sein, die unter Verwendung des rekombinanten Virus der vorliegenden
Erfindung infizieren kann und drei exogene kostimulatorische Moleküle exprimieren
kann, und kann ferner genetisch manipuliert worden sein, um eines
oder mehrere exogene Zielantigene oder immunologische Epitope davon
zu exprimieren. Solche Wirtszellen enthalten, sind aber nicht beschränkt auf,
Tumorzellen, antigenpräsentierende
Zellen wie etwa PBMC, Dendritenzellen, Zellen der Haut oder des
Muskels und dergleichen. Antigenpräsentierende Zellen enthalten,
sind aber nicht beschränkt
auf, Monozyten, Makrophagen, Dendritenzellen, Vorläuferdendritenzellen,
Langerhans-Zellen, Splenozyten, B-Zellen, Tumorzellen, Muskelzellen,
Epithelzellen und dergleichen.
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In
einer Ausführungsform
sind die Wirtszellen Tumorzellen, in denen die Tumorzellen dem rekombinanten
Vektor in situ oder in vitro ausgesetzt werden, um an den Tumorzellen
die Expression von drei kostimulatorischen Fremd- oder exogenen
Molekülen
zu veranlassen. Die Tumorzellen können ein endogenes Zielanti gen
exprimieren oder die Tumorzellen können ferner genetisch manipuliert
worden sein, um ein Zielantigen wie etwa TAA oder ein immunologisches
Epitop davon zu exprimieren. Tumorzellen, die das TAA zusammen mit
drei immunstimulatorischen Molekülen
exprimieren, werden einem Säugetier
in einer wirksamen Menge verabreicht, die in dem an einem Krebs
leidenden Säugetier
zur Tumorverringerung oder -beseitigung führt.
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Außerdem schafft
die vorliegende Erfindung Vorläuferdendritenzellen,
Dendritenzellen (DC), DC-Unterpopulationen und Abkömmlinge
davon, die drei kostimulatorische Moleküle, in denen drei kostimulatorische Moleküle exogen
durch einen rekombinanten Vektor mit Nukleinsäuresequenzen, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
geliefert werden, überexprimieren.
Die Vorläufer-DC
und die DC der vorliegenden Erfindung exprimieren höhere Niveaus
kostimulatorischer Moleküle
als durch eine nicht behandelte Vorläufer-DC oder DC endogen exprimiert
werden. Die APCs wie etwa Vorläuferdendritenzellen
und Dendritenzellen können außerdem eine
oder mehrere endogene Zielantigene oder immunologische Epitope davon
exprimieren oder das exogene Zielantigen kann außerdem dadurch, dass der rekombinante
Vektor drei kostimulatorische Moleküle codiert, oder durch einen
zweiten rekombinanten Vektor geliefert werden. Ferner schafft die
vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der drei kostimulatorischen
Moleküle überexprimierenden
APCs wie etwa der drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden Vorläuferdendritenzellen
und der drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden Dendritenzellen
bei der Aktivierung von T-Zellen in vivo oder in vitro für die Impfung
und für
Immuntherapiereaktionen gegen eine oder mehrere Zielzellen, Zielantigene
und immunologische Epitope davon.
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Die
APCs wie etwa Vorläuferdendritenzellen,
Dendritenzellen, DC-Unterpopulationen und Abkömmlinge davon, die von einer
Quelle isoliert worden sind, werden mit einem rekombinanten Vektor,
der exogene Gene, die drei kostimulatorische Moleküle codieren,
umfasst, für
eine Zeitdauer, die ausreicht, um die funktionale Überexpression
der drei kostimulatorischen Moleküle zuzulassen, infiziert, transfiziert
oder transduziert. Solche kostimulatorischen Moleküle überexprimierenden
antigenpräsentierende
Vorläuferdendritenzellen
und Dendritenzellen können
ebenfalls mit wenigstens einer Zielzelle, einem Zielzellenlysat,
einer Zielzellenmembran, einem Zielantigen oder einem immunologischen
Epitop davon oder mit RNA oder DNA wenigstens einer Zielzelle gepulst
oder inkubiert werden und in einer Menge, die ausreicht, die relevanten
T-Zellen-Reaktionen in vivo zu aktivie ren, an eine Spezies verabreicht
werden. In einer weiteren Ausführungsform
exprimieren die antigenpräsentierenden
Vorläuferdendritenzellen
und Dendritenzellen zusätzlich
wenigstens ein Fremdzielantigen oder ein immunologisches Epitop
davon.
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Wirtszellen,
die drei exogene kostimulatorische Moleküle exprimieren, können in
einer Dosis von 103 bis 109 Zellen
geliefert werden. Die Verabreichungswege, die verwendet werden können, enthalten
intravenös, subkutan,
intralymphatisch, intratumoral, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal,
intrarektal, intravaginal, intranasal, oral, über Blasentropfinfusion, über Hautritzung
und dergleichen.
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In
einer Ausführungsform
werden die drei kostimulatorische Moleküle überexprimierenden antigenpräsentierenden
Vorläuferdendritenzellen
oder Dendritenzellen einer Zielzelle, Zielzellenlysaten, Zielzellenmembranen,
einem Zielantigen oder einem immunologischen Epitop davon oder mit
DNA oder RNA von wenigstens einer Zielzelle in vitro ausgesetzt
und mit vorbehandelten oder unvorbehandelten T-Zellen inkubiert,
um die relevanten T-Zellen-Reaktionen in vitro zu aktivieren. Daraufhin
werden die aktivierten T-Zellen allein oder in Kombination mit den
Vorläufer-DC
oder DC zur Schutzimpfung oder Immuntherapie gegen eine Zielzelle,
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon an eine Spezies
wie etwa an einen Menschen verabreicht. In einem Verwendungsverfahren
werden die Vorläuferdendritenzellen
oder Dendritenzellen vorteilhaft verwendet, um eine immuntherapeutische
wachstumshemmende Reaktion gegen Krebszellen hervorzurufen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird die drei kostimulatorische Moleküle überexprimierende antigenpräsentierende
Zelle, vorzugsweise eine Vorläufer-DC
oder DC, durch im Gebiet bekannte Verfahren (Gong, J., u. a., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:6279–6283,
1998) mit einer Zielzelle, die ein relevantes Zielantigen oder ein
immunologisches Epitop davon exprimiert, verschmolzen, um ein Heterokaryon
einer APC und der Zielzelle zu bilden. Eine solche Verschmelzungszelle
oder Chimären-APC/Zielantigen-Zelle
exprimiert sowohl drei kostimulatorische Moleküle als auch ein Zielantigen
oder immunologische Epitope davon. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Zielzelle eine hyperplastische Zelle, eine präkanzeröse Zelle
oder eine bösartige
Zelle. Die Chimären-APC/Zielantigen-Zelle
kann sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden, um die Immunreaktionen
von T- und B-Lymphozyten zu verbessern.
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Vorläuferdendritenzellen
werden aus Knochenmark, peripherem Blut und Lymphknoten von einem
Patienten erhalten. Der Patient kann zuvor mit einer Verbindung
wie etwa Flt-3L geimpft oder behandelt worden sein, um die Anzahl
antigenpräsentierender
Zellen zu erhöhen.
Dendritenzellen werden aus irgendeinem Gewebe wie etwa aus der Epidermis
der Haut (Langerhans-Zellen) und aus lymphatischen Geweben erhalten, wie
sie etwa in der Milz, im Knochenmark, in den Lymphknoten und im
Thymus sowie im Blutkreislauf, einschließlich Blut und Lymphe (Schleierzellen),
zu finden sind. Nabelschnurblut ist eine weitere Quelle von Dendritenzellen.
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Dendritenzellen
können
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von
im Gebiet bekannten Verfahren wie etwa jenen, die im
US-Patent
Nr. 5.788.963 beschrieben sind, angereichert oder isoliert
werden. Wenn die Vorläuferdendritenzellen,
Dendritenzellen und Abkömmlinge
davon erhalten werden, werden sie unter geeigneten Kulturbedingungen
kultiviert, um die Zellenpopulation zu expandieren und/oder die
Zellen in einem Zustand für
optimale Infektion, Transfektion oder Transduktion durch einen rekombinanten Vektor
und für
optimale Zielantigenaufnahme, -verarbeitung und -präsentation
zu halten. Besonders vorteilhaft für die Aufrechterhaltung des
richtigen Reifezustand der Dendritenzellen in einer In-vitro-Kultur
ist die Anwesenheit sowohl des Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden
Faktors (GM-CSF) als auch von Interleukin 4 (IL-4). Anhand der Adhäsion und/oder
des Reifegrads können
auf der Grundlage von Zellenoberflächenmarkern Unterpopulationen
von Dendritenzellen isoliert werden. Der Phänotyp der Vorläufer-DC,
der DC und von Unterpopulationen davon ist in Banchereau und Steinman,
Nature 392:245–252,
1998, offenbart.
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In
einer Ausführungsform
werden GM-CSF und IL-4 jeweils für
eine Dauer von etwa 6 Tagen in einer Konzentration von etwa 500
Einheiten/ml bereitgestellt (41, 42). In einer weiteren Ausführungsform
wird TNFα und/oder
CD40 verwendet, um zu veranlassen, dass die Vorläufer-DC oder DC reifen.
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Die
Vorläuferdendritenzellen
oder Dendritenzellen können
von der zu behandelnden Person erhalten werden und sind somit hinsichtlich
der relevanten HLA-Antigene
autogen, oder die Zellen können
von einer Person erhalten werden, deren relevante HLA-Antigene (sowohl
Klasse I als auch II, z. B. HLA-A, B, C und DR) zu der zu behandelnden
Person passen. Alternativ werden die Vorläufer dendritenzellen gentechnisch
hergestellt, um die geeigneten relevanten HLA-Antigene der Person, die die Behandlung
empfängt,
zu exprimieren.
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Ferner
können
die Vorläuferdendritenzellen
und Dendritenzellen durch solche Verfahren wie EBV-Transformation,
wie sie im
US-Patent Nr. 5.788.963 offenbart
ist, genetisch modifiziert werden, um ihre Lebensdauer zu verlängern.
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Die
Dendritenzellen und die Vorläufer
davon können
in Form einer Arzneimittelzusammensetzung in einem physiologisch
akzeptablen Medium bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung kann
ferner eine Zielzelle, ein Zielzellenlysat, eine Zielzellenmembran,
ein Zielantigen oder ein immunologisches Epitop davon umfassen.
Zusätzlich
kann die Zusammensetzung zur zusätzlichen
synergistischen Verbesserung einer Immunreaktion Cytokine und/oder
Chemokine wie etwa IL-4 und GM-CSF umfassen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die APC der vorliegenden Erfindung, die drei kostimulatorische Moleküle überexprimiert,
in Verfahren zum Bewerten der Wirksamkeit eines Impfstoffs durch
Bestimmung der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation und
-funktion brauchbar. In einem solchen Verfahren werden einer Person,
die mit einem Zielzellenlysat, mit einer Zielzellenmembran, mit
einem Zielantigen oder mit einem immunologischen Epitop davon geimpft
worden ist, Lymphozyten entnommen. Die Lymphozyten werden mit einer
APC der vorliegenden Erfindung in Anwesenheit der Zielzelle, des
Zielzellenlysats, der Zielzellenmembran, des Zielantigens oder eines
immunologischen Epitops davon in vitro kultiviert, wobei durch im
Gebiet bekannte Verfahren eine Verbesserung der antigenspezifischen
Lymphozytenanzahlen und -funktionen bestimmt wird. Eine Verbesserung
der Anzahl und/oder der Funktionen gibt die Wirksamkeit des Impfstoffs
an. Besonders wirksam ist das Verfahren bei der Bestimmung der Wirksamkeit
von Peptidimpfstoffen bei der Stimulation einer geeigneten Immunreaktion.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind die APCs der vorliegenden Erfindung, die exogen drei kostimulatorische
Moleküle
exprimieren, in einem Verfahren zur Selektion für neue Immunität hervorrufende
Peptide aus einer Vielzahl von Peptiden brauchbar. In dem Selektionsverfahren
werden antigenpräsentierende
Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor, der drei kostimulatorische
Moleküle
oder Funktionsabschnitte davon codiert, infiziert worden sind, mit
mehreren Peptiden gepulst, um eine peptidgepulste antigenpräsentierende Zelle
zu bilden. Die peptidgepulste antigenpräsentierende Zelle wird mit
Lymphoidzellen inkubiert und es wird die Immunreaktionsfähigkeit
der Lymphoidzellen gemessen. Eine Verbesserung der Immunreaktionsfähigkeit der
Lymphoidzellen in Anwesenheit der peptidgepulsten APC gibt eine
antigenspezifische Reaktion für
das Peptid an. Das Peptid, das die verbesserte Reaktion hervorruft,
kann durch Auswaschen aus einem Tumor, durch Analyse der HLA-Bindung
usw. identifiziert werden. Die Quelle der Multiplizität der Peptide
kann eine kombinatorische Bibliothek sein, die mehrere zufällige Peptide
ausdrückt.
Die verbesserte Immunreaktionsfähigkeit
kann eine humorale oder durch Zellen übermittelte Immunreaktion sein
und kann unter Verwendung im Gebiet bekannter Standardtechniken
wie etwa antigeninduzierter Proliferation, Zytotoxizität, Antikörperabsonderung,
Signaltransduktion und dergleichen gemessen werden. Die identifizierten
neuen Peptide können
als Immunogene, Impfstoffe oder Diagnosemittel verwendet werden.
Die Proteine, die die Peptide enthalten, können durch Subtraktionsbibliotheken
und Differentialanzeige-Gentechnologien identifiziert werden.
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Die
rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sowie die Wirtszellen,
die durch den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung infiziert,
transfiziert oder induziert werden, sind in Verfahren zum Stimulieren
einer verbesserten humoralen Reaktion sowohl in vivo als auch in
vitro brauchbar. Eine solche verbesserte humorale Reaktion kann
dem Wesen nach monoklonal oder polyklonal sein. Die Verbesserung
der humoralen Reaktionen unter Verwendung dreier kostimulatorischer
Moleküle
ist im Vergleich zu einer humoralen Reaktion, die ein einzelnes
oder doppeltes kostimulatorisches Molekül verwendet, synergistisch.
Die synergistische Verbesserung der humoralen Reaktion kann durch
erhöhte
Proliferation und/oder Cytokin-Absonderung durch CD4+-T-Zellen,
erhöhte
Proliferation oder Antikörperproduktion
durch B-Zellen, erhöhte
antikörperabhängige Zellentoxizität (ADCC),
erhöhte
komplementübertragene
Lyse und dergleichen bestimmt werden. Es wird erwartet, dass die
unter Verwendung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung oder
unter Verwendung durch den rekombinanten Vektor der vorliegenden
Erfindung infizierter, transfizierter oder induzierter Wirtszellen
hervorgerufenen Antikörper
eine höhere
Affinität
und/oder Avidität
und einen höheren
Titer als durch Standardverfahren hervorgerufene Antikörper haben.
Die durch Verfahren unter Verwendung des rekombinanten Vektors hervorgerufenen
Antikörper
können
immundominante Zielepitope oder nicht dominante Zielepitope erkennen.
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Ferner
umfasst diese Erfindung einen oder mehrere Antikörper, der/die durch Immunisierung
mit dem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung hervorgerufen
wird/werden. Der Antikörper
besitzt eine Spezifizität
für das
interessierende Zielantigen oder immunologische Epitop davon und
reagiert oder bindet sich mit ihm. In dieser Ausführungsform
der Erfindung sind die Antikörper
dem Wesen nach monoklonal oder polyklonal.
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Beispielhafte
Antikörpermoleküle sind
unversehrte Immunglobulinmoleküle,
im Wesentlichen unversehrte Immunglobulinmoleküle oder jene Abschnitte eines
Immunglobulinmoleküls,
die die Antigenbindungsstelle enthalten, einschließlich jener
Abschnitte von Immunglobulinmolekülen, die im Gebiet als F(ab)F(ab'), F(ab')
2 und
F(v) bekannt sind. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können durch
im Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. (Kohler und Milstein
(1975) Nature 256, 495–497;
Campbell "Monoclonal
Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent
and Human Hybridomas",
in Burdon u. a. (Hrsg.), (1985), "Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology",
Bd. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Die Antikörper oder
Antigenbindungsfragmente können
ebenfalls durch genetische Manipulation hergestellt werden. Die
Technologie für
die Expression sowohl schwerer als auch leichter Kettengene in E.
coli ist der Gegenstand der folgenden PCT-Patentanmeldungen: Veröffentlichungsnummern
WO 901443 ,
WO 901443 und
WO 9014424 sowie in Huse, u. a., (1989),
Science 246:1275–1281.
-
In
einer Ausführungsform
werden die Antikörper
dieser Erfindung in Immunoassays verwendet, um das interessierende
neue Antigen in biologischen Proben zu erfassen.
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In
einer Ausführungsform
werden die Antikörper
dieser Erfindung, die durch Immunisierung mit einem rekombinanten
Impfpockenvirus, das ein TAA exprimiert und B7-1, ICAM-1 und LFA-3
exprimiert, erzeugt werden, dazu verwendet, unter Verwendung der
Immunzytochemie die Anwesenheit des TAA aus einer Gewebebiopsie
eines Säugetiers,
das an einem Krebs leidet, der TAA exprimiert, zu beurteilen. Eine
solche Beurteilung der Darstellung des TAA-Antigens in erkranktem
Gewebe kann verwendet werden, um den Fortschritt der Erkrankung
in einem an der Krankheit leidenden Säugetier oder die Wirksamkeit
der Immuntherapie vorauszusagen. In dieser Ausführungsform enthalten Beispiele
der TAAs CEA, PSA und MUC-1, sind darauf aber nicht beschränkt. Herkömmliche
Verfahren für
die Immunhistochemie sind beschrieben in (Harlow und Lane (Hrsg.) (1988)
in "Antibodies A
Laboratory Manual",
Cold Spinning Harbor Rest, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel
u. a. (Hrsg.) (1987). In Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons (New York, New York).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden die Antikörper
der vorliegenden Erfindung für
die Immuntherapie verwendet. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung
können
in der passiven Immuntherapie verwendet werden.
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Bei
der Bereitstellung der antikörper-
oder antigenbindenden Fragmente für ein Empfängersäugetier, vorzugsweise für einen
Menschen, an einen Patienten ändert
sich die Dosierung der verabreichten antikörper- oder antigenbindenden
Fragmente je nach solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der
Größe, dem
Geschlecht, der allgemeinmedizinischen Bedingung, der medizinischen
Vorbedingung und dergleichen des Säugetiers.
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Die
antikörper-
oder antigenbindenden Fragmente der vorliegenden Erfindung sollen
für die
Empfängerperson
in einer Menge bereitgestellt werden, die ausreicht, die Schwere,
den Umfang oder die Dauer der Erkrankung oder Infektion zu verhindern,
zu verringern oder zu mildern.
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Anti-Idiotypen-Antikörper entstehen
normalerweise während
der Immunreaktionen, wobei ein Abschnitt des Anti-Idiotypen-Antikörpers dem
Epitop ähnelt,
das die ursprüngliche
Immunreaktion induziert hat. In der vorliegenden Erfindung wird
das Immunglobulin-Gen oder ein Abschnitt davon eines Antikörpers, dessen
Bindungsstelle ein Zielantigen eines Erkrankungszustands widerspiegelt,
allein oder in Kombination mit einem Gen oder mit einem Abschnitt
davon von drei immunstimulatorischen Molekülen in das Genom oder einen
Abschnitt davon eines Virusgenoms inkorporiert, wobei das resultierende
rekombinante Virus eine Zellen- und humorale Immunreaktionen auf
das Antigen hervorrufen kann.
-
Die
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen offenbart das
allgemeine Wesen der Erfindung so umfassend, dass Andere solche
spezifischen Ausführungsformen
für verschiedene
Zwecke leicht modifizieren und/oder annehmen können, ohne von dem allgemeinen
Konzept abzuweichen, sodass solche Anpassungen oder Modifikationen
so zu verstehen sind, dass die im Sinn und Bereich von Äquivalenten
der offenbarten Ausführungsformen
liegen.
-
Alle
Literaturhinweise und Patente, auf die Bezug genommen wird, sind
hiermit durch Literaturhinweis eingefügt.
-
Beispiel 1
-
Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TRICOM(mu1)
Nr. T171
-
Der
Ursprung des Impfpocken-Elternvirus ist der Stamm des New York City
Board of Health und wurde durch Wyeth von dem New City Board of
Health erhalten und in Kälber
eingebracht, um das Pockenimpfstoff-Seed zu erzeugen. Die Flow Laboratories
empfingen von den Dr. Chanock und Moss (National Institutes of Health)
ein gefriergetrocknetes Fläschchen
des Pockenimpfstoff-Seeds, Los 3197, Passage 28. Dieses Seed-Virus
wurde dreimal mit Äther
behandelt und Plaquegereinigt.
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Für die Erzeugung
von rV-TRICOM(mu1) wurde ein mit pT5032 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das M2L-Gen
(30K-Gen), das sich in dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms
befindet, zu lenken. Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des
30K-Pockenimpfstoffpromotors (M2L) (34), das Ratten-ICAM-1-Gen steht
unter der Steuerung des I3-Pockenimpfstoffpromotors (18) und das
Ratten-B7.1-Gen
steht unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors
(sE/L) (32). Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem
Hind-III-M-Gebiet des
Impfpockengenoms flankiert (siehe 1). Diese
flankierenden Sequenzen enthalten das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichgen
(33). Ein Abkömmling
des Wyeth-Impfpockenstamms wurde bei der Konstruktion des rekombinanten
Impfpockenvirus als das Elternvirus verwendet. Dieses mit vTBC33
bezeichnete Elternvirus besitzt kein funktionales K1L-Gen und kann
sich somit in Kaninchennieren-RK13-Zellen
nicht effizient replizieren (38). Die Erzeugung des rekombinanten
Impfpockenvirus wurde über
homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom
vTBC33 und den entsprechenden Sequenzen in pT5032 in mit Impfpocken
infizierten RK13-Zellen, die mit pT5032
transfiziert wurden, ausgeführt.
Das mit vT171 bezeichnete rekombinante Virus wurde durch Züchtung an
RK13-Zellen (ATCC, CCL 37) ausgewählt. Aus
der Zellenmonoschicht wurden die Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft
wurde weiter fortgepflanzt. Zwei Runden der Plaque-Isolation und
Nachfüllung
an RK13-Zellen führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT171 ist in 4A gezeigt.
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Beispiel 2
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Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TRICOM(mu2),
Nr. vT199
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Für die Erzeugung
von rV-TRICOM(mu2) wurde ein mit pT5047 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich
in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, zu lenken.
Das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors,
das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des
I3-Promotors und das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung
des 7.5K-Pockenimpfstoffpromotors (39). Außerdem wird das E.-coli-lacZ-Gen
unter der Steuerung des C1-Geflügelpockenvirus-Promotors
(15) als eine Selektion für rekombinante
Nachkommenschaft aufgenommen. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen
aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms flankiert (siehe 2).
Als das Elternvirus für
diesen rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat
von dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet.
Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wurde über homologe
Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT5047 in mit Impfpocken infizierten
Hu143TK-Zellen (Bacchetti und Graham 1977), die mit pT5047 transfiziert
wurden, ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde wie zuvor beschrieben (31) unter Verwendung
einer Auswahl für
das TK-Virus in Anwesenheit von Bromdeoxyuridin (BudR) in Kombination
mit einem an Virus-Plaques in situ ausgeführten chromogenen Assay, die
die Expression des lacZ-Genprodukts in Anwesenheit eines halogenierten
Indolyl-Beta-D-Galaktosids (Bluo-gal) erfasst, identifiziert. Virus-Plaques,
die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren Hintergrund
blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques ausgewählt, die
mit vT199 bezeichnet sind, und ihre Nachkommenschaft wurde unter
den oben beschriebenen selektiven Bedingungen replattiert. In anderen
rekombinanten Viren, die auf diese Weise ausgewählt und gereinigt wurden, waren
die einzigen Plaques, die unter diesen selektiven Bedingungen erschienen, blau,
wobei diese blauen Plaques leicht isoliert und gereinigt wurden.
Allerdings wurden im Fall von vT199 in der zweiten Runde der Plaque-Reinigung
nur weiße
Plaques beobachtet; es waren keine blauen Plaques sichtbar. Es wurde
ein neuer Satz blauer Plaques ausgewählt und replattiert; in der
zweiten Runde der Plaque-Reinigung
wurden wieder nur weißen
Plaques beobachtet. Eine letzte Studie unter Verwendung eines nochmals
weiteren Satzes blauer Plaques lieferte nach der zweiten Runde der
Plaque-Reinigung sowohl blaue als auch weiße Plaques. Die blauen Plaques
wurden ausgewählt
und replattiert. Zwei zusätzliche
Runden der Plaque-Reinigung (insgesamt vier Runden) lieferten rekombinante
Viren, die 100 % blau waren. Die Genomstruktur der Rekombinante
vT199 ist in 4B gezeigt.
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Beispiel 3
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Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-TAA/TRICOM(mu)
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Für die Erzeugung
von rV-TAA/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die
Einführung
der Fremdsequenzen in das Impfpockengenom zu lenken. Das TAA-Gen,
das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen stehen unter
der Steuerung mehrerer Promotoren. Diese Fremdsequenzen werden von
DNA-Sequenzen aus dem Impfpockengenom flankiert, in das die Fremdsequenzen eingeführt werden
sollen. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe
Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken
infizierten Zellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden,
ausgeführt.
Aus der Zellenmonoschicht werden unter selektiven Bedingungen rekombinante
Plaques ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wird weiter fortgepflanzt. Zusätzliche
Runden der Plaque-Isolation und Replattierung führen zur Reinigung des gewünschten
rekombinanten Virus.
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Beispiel 4
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Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-MUC-1/TRICOM(mu)
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Für die Erzeugung
von rV-MUC-1/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die
Einführung der
Fremdsequenzen in das Impfpockengenom zu lenken. Das Gen MUC-1,
das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das Ratten-B7.1-Gen
stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem Impfpockengenom flankiert, in das
die Fremdsequenzen eingeführt
werden sollen. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe
Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken
infizierten Zellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert werden,
ausgeführt.
Aus der Zellenmonoschicht werden unter selektiven Bedingungen rekombinante
Plaques ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wird weiter fortgepflanzt. Zusätzliche
Runden der Plaque-Isolation und Replattierung führen zur Reinigung des gewünschten
rekombinanten Virus.
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Beispiel 5
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Erzeugung rekombinanter Impfpocken rV-CEA/TRICOM(mu)
Nr. vT172
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Für die Erzeugung
von rV-CEA/TRICOM(mu) wurde ein mit pT5031 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das M2L-Gen
(30K-Gen), das sich in dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms
befindet (siehe 3), zu lenken. Das CEA-Gen
steht unter der Steuerung des 40K-Promotors (13), das Ratten-LFA-3-Gen
steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht
unter der Steuerung des I3-Promotors und das Ratten-B7.1-Gen steht
unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden
von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-M-Gebiet des Impfpockengenoms
flankiert, das das Impfpocken-K1L-Wirtsbereichsgen enthält. Das
oben konstruierte vTBC33 wurde als das Elternvirus in der Konstruktion
des rekombinanten Impfpockenvirus verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Impfpockenvirus wurde über
homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Impfpockengenom
vTBC33 und den entsprechenden Sequenzen in pT5031 in mit Impfpocken infizierten
RK13-Zellen, die mit pT5031 transfiziert
wurden, ausgeführt.
Das mit vT172 bezeichnete rekombinante Virus wurde wie oben beschrieben
durch Züchtung
an RK13-Zellen ausgewählt. Aus der Zellenmonoschicht
wurden Plaques ausgewählt
und ihre Nachkommenschaft wurde weiter fortgepflanzt. Zwei Runden Plaque-Isolation
und Replattierung an RK13-Zellen führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT172 ist in 4C gezeigt.
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Beispiel 6
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Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken
rF-TRICOM(mu) Nr. vT222
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Der
Ursprung des für
die Erzeugung der Rekombinanten verwendeten Elterngeflügelpockenvirus
wurde aus einem Fläschchen
eines von USDA lizenzierten Vogelimpfstoffs, PDXVAC-TC, der durch
die Schering-Plough Corporation hergestellt wird, Plaque-gereinigt.
Das Ausgangsmaterial für
die Herstellung von PDXVAC-TC war ein Fläschchen Geflügelpockenimpfstoff
der Vineland-Laboratorien von Hühnerembryo-Ursprung,
das von Schering-Plough erhalten wurde. Das Virus wurde zweimal
an der Chorioallantois-Membran von Hühnereiern passieren gelassen,
um ein Master-Seed-Virus zu erzeugen. Zusätzlich wurde das Master-Seed-Virus 27 Mal
in juvenilen Hühnerembryo-Bindegeweben
passieren gelassen, um das PDXVAC-TC-Master-Seed zuzubereiten. Das
PDXVAC-TC-Master-Seed zweimal an juvenilen Hühnerembryo-Bindegeweben passieren
gelassen, um Virusstämme
für die
Erzeugung von PDXVAC-TC-Produktlosen zuzubereiten. Ein Fläschchen
PDXVAC-TC, lfd. Nr. 96125, wurde dreimal an primären Hühnerembryo-Dermalzellen Plaque-gereinigt.
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Für die Erzeugung
von rF-TRICOM(mu) wurde ein mit pT8001 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet
des Geflügelpockengenoms
zu lenken. Das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors,
das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors
und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese
Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
(siehe 5) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen rekombinanten
Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough
Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT8001 in mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen,
die mit pT8001 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus
wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays
für das
lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen
gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden
positive Plaques, die mit vT222 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Sechs Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT222 ist in 7A gezeigt.
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Beispiel 7
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Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken
rF-TAA/TRICOM(mu)
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Für die Erzeugung
von rF-TAA/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die
Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
zu lenken. Das TAA-Gen, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das
Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren.
Außerdem
steht das lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms flankiert.
Als das Elternvirus für
diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat
aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus wird über homologe
Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen
in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen,
die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, ausgeführt. Das
rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erscheinen
gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden
positive Plaques ausgewählt
und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten Virus.
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Beispiel 8
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Erzeugung von rekombinanten Geflügelpocken
rF-MUC-1/TRICOM(mu)
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Für die Erzeugung
von rF-MUC-1/TRICOM(mu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die
Einführung der
Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms zu lenken.
Das MUC-1-Gen, das Ratten-LFA-3-Gen, das Ratten-ICAM-1-Gen und das
Ratten-B7.1-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Promotoren.
Außerdem
steht das lacZ-Gen unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden
von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
flankiert. Als das Elternvirus für
diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat
aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus
wird über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom und
den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in den mit dem
Plasmidvektor transfizierten, mit Geflügelpocken infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
werden positive Plaques ausgewählt
und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten rekombinanten
Virus.
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Beispiel 9
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Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken
rF-CEA/TRICOM(mu) Nr. vT194
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Für die Erzeugung
von rF-CEA/TRICOM(mu) wurde ein als pT5049 bezeichneter Plasmidvektor
zur direkten Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert.
Das CEA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Pockenimpfstoffpromotors,
das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors,
das Ratten-LFA3-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung des
I3-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Transskriptionssteuerung
des 7.5K-Pockenimpfstoffpromotors und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors.
Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet
des Geflügelpockengenoms
flankiert (siehe 6) Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem POXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus wurde über homologe
Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen
in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT5049 in den mit pT5049 transfizierten
primären
Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden mit vT194 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden der Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT194 ist in 7B gezeigt.
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Beispiel 10
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Erzeugung eines rekombinanten Pockenimpfstoffs
rV-TRICOM(hu) Nr. vT224
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Für die Erzeugung
von rV-TRICOM(hu) wurde ein als pT5064 bezeichneter Plasmidvektor
für die
direkte Einführung
der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich
in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet, konstruiert.
Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors,
das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen
steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Außerdem ist das E.-coli-lacZ-Gen
unter der Steuerung des C1-Promotors
als eine Selektion für
rekombinante Nachkommenschaft enthalten. Diese Fremdsequenzen werden
von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms
flankiert (siehe 8). Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von
dem Wyeth-Impfpockenstamm
(New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT5064 in mit Impfpocken infizierten
CV-1-Zellen (ATTC, CCL 70), die mit pT5064 transfiziert wurden,
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden als vT224 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden der Plaque-Isolation
und des Replattierens in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur
Reinigung der gewünschten Rekombinante.
Die Genomstruktur der Rekombinante vT224 ist in 9A gezeigt.
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Beispiel 11
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Erzeugung eines rekombinanten Pockenimpfstoffs
rV-TAA/TRICOM(hu)
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Für die Erzeugung
von rV-TAA/TRICOM(hu) wird ein Plasmidvektor für die direkte Einführung der Fremdsequenzen
in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen), das sich in dem Hind-III-J-Gebiet
des Impfpockengenoms befindet, konstruiert. Das TAA-Gen, das menschliche
LFA-3-Gen, das menschliche ICAM-1-Gen, das menschliche B7.1-Gen
und das E.-coli-lacZ-Gen stehen unter der Steuerung mehrerer Pockenviruspromotoren.
Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet
des Impfpockengenoms flankiert. Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von
dem Wyeth-Impfpockenstamm (New York City Board of Health) verwendet.
Die Erzeugung des rekombinanten Impfpockenvirus wird über homologe
Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Impfpocken
infizierten CV-1-Zellen (ATTC, CCL 70), die mit Plasmid transfiziert
wurden, ausgeführt.
Das rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
werden positive Plaques ausgewählt
und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation
und des Replattierens in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur
Reinigung der gewünschten
Rekombinante.
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Beispiel 12
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Erzeugung rekombinanter Geflügelpocken
rF-TAA/TRICOM(hu)
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Für die Erzeugung
von rF-TAA/TRICOM(hu) wird ein Plasmidvektor konstruiert, um die
Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
zu lenken. Das TAA-Gen, das menschliche LFA-3-Gen, das menschliche
ICAM-1-Gen, das menschliche B7.1-Gen und das E.-Coli-lacZ-Gen stehen unter
der Steuerung mehrerer Pockenviruspromotoren. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
flankiert. Als das Elternvirus für
diesen rekombinanten Impfstoff wird ein Plaque-gereinigtes Isolat
aus dem POXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus
wird über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in dem Plasmidvektor in mit Geflügelpocken
infizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen,
die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, ausgeführt. Das
rekombinante Virus wird unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erscheinen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
werden positive Plaques ausgewählt
und ihre Nachkommenschaft wird replattiert. Zusätzliche Runden der Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führen zur Reinigung des gewünschten
rekombinanten Virus.
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Beispiel 13
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Erzeugung eines rekombinanten Impfpockenvirus
rV-CEA (6D)/TRICOM(hu) Nr. vT238
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Für die Erzeugung
von rV-CEA(6D)/TRICOM(hu) wurde ein als pT8016 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert,
um die Einführung
der Fremdsequenzen in das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen) zu lenken,
das sich in dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms befindet.
Das CEA-Gen wurde durch In-vitro-Mutagenese geändert, um Protein voller Länge zu exprimieren,
das ein modifiziertes Epitop enthält. Diese Mutation änderte die
an der Position 576 codierte Aminosäure von Asparagin in Asparaginsäure. Das
mit CEA(6D) bezeichnete modifizierte Gen war dazu bestimmt, die
Immunogenität
des CEA zu verbessern (Zaremba, u. a. 1997, Cancer Res. 57:4570–4577).
Das Gen CEA(6D) steht unter der Steuerung des 40K-Promotors. Das
menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche
ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors und das menschliche B7.1-Gen
steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors. Außerdem ist das E.-coli-lacZ-Gen
unter der Steuerung des C1-Promotors
als eine Selektion für
rekombinante Nachkommenschaft enthalten. Diese Fremdsequenzen werden
von DNA-Sequenzen aus dem Hind-III-J-Gebiet des Impfpockengenoms
flankiert (siehe 10). Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat von
dem Wyeth-Impfpockenstamm
(New York City Board of Health) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Impfpockenvirus wurde über
homologe Rekombination zwischen Impfpockensequenzen in dem Wyeth-Impfpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT8016 in mit Impfpocken infizierten
CV-1-Zellen (American Type Culture Collection (ATTC), Rockville,
MD, CCL 70), die mit pT8016 transfiziert wurden, ausgeführt. Das
rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen
gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden
als vT238 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft
wurde replattiert. Sechs Runden der Plaque-Isolation und des Replattierens
in Anwesenheit von Bluo-Gal führten
zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT238 ist in 11 gezeigt.
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Beispiel 14
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Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-TRICOM(mu) Nr. vT251
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Für die Erzeugung
von rF-TRICOM(mu) wurde ein mit pT8019 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet
des Geflügelpockengenoms
zu lenken. Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors,
das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors,
und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese
Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des
Geflügelpockengenoms
(siehe 12) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen rekombinanten
Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm (Schering-Plough
Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT8019 in mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen,
die mit pT8019 transfiziert wurden, ausgeführt. Das rekombinante Virus
wurde unter Verwendung des oben beschriebenen chromogenen Assays
für das
lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden positive Plaques, die mit vT251 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Drei Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur der Rekombinante vT251 ist in 13A gezeigt.
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Beispiel 15
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Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-TRICOM(hu) Nr. vT232
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Für die Erzeugung
von rF-TRICOM(hu) wurde ein als pT5072 bezeichneter Plasmidvektor
zur direkten Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert.
Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors,
das menschliche ICAM-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und
das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
flankiert (siehe 14) Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus wurde über homologe
Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen
in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT5072 in dem Plasmidvektor
in den mit pT5072 transfizierten primären Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das
rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen
gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht werden
mit vT232 bezeichnete positive Plaques ausgewählt und ihre Nachkommenschaft
wurde replattiert. Vier Runden der Plaque-Isolation und Replattierung
in Anwesenheit von Bluo-Gal führten
zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT232 ist in 13B gezeigt.
-
Beispiel 16
-
Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-MUC-I/TRICOM(mu) Nr. vT250
-
Für die Erzeugung
von rF-MUC-1/TRICOM(mu) wurde ein als pT8020 bezeichneter Plasmidvektor
für die
direkte Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
konstruiert. Es wurde eine verkürzte
Version des MUC-1-Gens verwendet, die aus der Signalsequenz, aus
zehn Kopien der Tandemwiederholungssequenz und aus der eindeutigen
3'-Codie rungssequenz
bestand. (SEQ ID NO:41). Die Nukleotidsequenz des Tandemwiederholungsgebiets
wurde geändert,
um die Homologie zwischen den Wiederholungen zu minimieren, ohne
die Aminosäuresequenz
zu ändern.
Das Gen war in einem 1881-bp-Fragment enthalten, das die verkürzte Codierungssequenz,
6 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 186 Nukleotide des Nicht-Translations-3'-Gebiets enthält (Gendler
u. a., 1990, J. Biol. Chem. 265: 15286–15293). Das Ratten-LFA-3-Gen
steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das Ratten-ICAM-1-Gen
steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das Ratten-B7.1-Gen steht unter
der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter der
Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen
aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
(siehe 15) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough
Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT8020 in mit pT8020 transfizierten,
mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden positive Plaques, die mit vT250 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT250 ist in 16A gezeigt.
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Beispiel 17
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Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-MUC-1/TRICOM(hu) Nr. vT242
-
Für die Erzeugung
von rF-MUC-1/TRICOM(hu) wurde ein als pT2186 bezeichneter Plasmidvektor
für die
direkte Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms konstruiert. Es
wurde eine verkürzte
Version des MUC-1-Gens verwendet, wie sie oben in Beispiel 16 beschrieben
ist. Das MUC-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors. Das
menschliche LFA-3-Gen
steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen steht
unter der Steuerung des I3-Promotors, das menschliche B7.1-Gen steht
unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das lacZ-Gen steht unter
der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen werden von
DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms (siehe 17) flankiert. Als das Elternvirus für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT2186 in mit pT2186 transfizierten,
mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das
rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für das
lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zelienmonoschicht
wurden positive Plaques, die mit vT242 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT242 ist in 16B gezeigt.
-
Beispiel 18
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Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-CEA(6D)/TRICOM(hu) Nr. vT236
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Für die Erzeugung
von rF-CEA(6D)/TRICOM(hu) wurde ein als pT2187 bezeichneter Plasmidvektor für die direkte
Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
konstruiert. Das CEA(6D)-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors.
Das menschliche LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors,
das menschliche ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors, das
menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors
und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese
Fremdsequenzen werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des
Geflügelpockengenoms
(siehe 18) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügel pockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT2187 in mit pT2187 transfizierten,
mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen
gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden
positive Plaques, die mit vT236 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Acht Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus
vT236 ist in 16C gezeigt.
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Beispiel 19
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Erzeugung eines rekombinanten Geflügelpockenvirus
rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu) Nr. vT257
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Für die Erzeugung
von rF-PSA/PSMA/TRICOM(hu) wurde ein als pT5080 bezeichneter Plasmidvektor konstruiert,
um die Einführung
der Fremdsequenzen in das BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
zu lenken. Das Gen, das PSA codiert, wurde durch Polymerasekettenreaktions-Verstärkung von
cDNA, die von RNA aus der menschlichen LNCaP-Zelllinie (CRL 1740,
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) abgeleitet
wurde, isoliert. Das Gen war an einem 1346-bp-Fragment enthalten,
das die gesamte Codierungssequenz für PSA, 41 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 552
Nukleotide des Nicht-Translations-3'-Gebiets enthält (Lundwall und Lilja, 1987,
FERS Lett. 214: 317–322).
Das Gen, das PSMA codiert, wurde durch Polymerasekettenreaktions-Verstärkung der
cDNA, die von RNA aus der menschlichen LNCaP-Zelllinie abgeleitet
wurde, isoliert. Das Gen war an einem 2298 bp-Fragment enthalten,
das die gesamte Codierungssequenz für PSMA, 26 Nukleotide des Nicht-Translations-5'-Gebiets und 19 Nukleotide
des Nicht-Translations-3'-Gebiets
enthielt (Israeli, u. a., 1993, Cancer Res., 52:227–230). Das
PSA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors und das PSMA-Gen
steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors. Das menschliche LFA-3-Gen
steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen
steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das
lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem BamHI-J-Gebiet des Geflügelpockengenoms
(siehe 19) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem PDXVAC-TC-Geflügelpockenstamm
(Schering-Plough Corporation) verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
Geflügelpockenvirus
wurde über
homologe Rekombination zwischen Geflügelpockensequenzen in dem Geflügelpockengenom
und den entsprechenden Sequenzen in pT5080 in mit pT5080 transfizierten,
mit Geflügelpocken
infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden positive Plaques, die mit vT257 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Fünf Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten Rekombinante.
Die Genomstruktur des rekombinanten Impfpockenvirus vT257 ist in 16D gezeigt.
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Beispiel 20
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Erzeugung eines rekombinanten MVA-Virus
rMVA-TRICOM(mu) Nr. vT264
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Die
modifizierten Ankara-Impfpocken (MVA) sind eine attenuierte Abgeleitete
des Ankara-Impfpockenvirusstamms (Meyer u. a., 1991, J. Gen Virol.
72:1031–1038).
Der Seed-Stamm von dem als Pockenimpfstoff bei Menschen verwendeten
MVA-Impfstoff wurde
von Dr. Anton Mayr (Institut für
Medizinische Mikrobiologie, München)
erhalten. Der Seed-Stamm wurde zweimal an primären Hühnerembryo-Dermalzellen Plaque-gereinigt.
-
Für die Erzeugung
von rMVA-TRICOM(mu) wurde ein als pT5085 bezeichneter Plasmidvektor
konstruiert, um die Einführung
der Fremdsequenzen in das Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms zu
lenken (Meyer, u. a., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031–1038).
Das Ratten-LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors,
das Ratten-ICAM-1-Gen steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das Ratten-B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors
und das lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms
(siehe 20) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaquegereinigtes Isolat aus dem MVA-Impfstoffstamm
verwendet. Die Erzeugung der rekombinanten MVA wurde über eine
homologe Rekombinante zwischen MVA-Sequenzen in dem MVA-Genom und den entsprechenden
Sequenzen in pT5085 in die mit pT5085 transfizierten, mit MVA infizierten
primären
Hühnerembryo-Dermalzellen ausgeführt. Das
rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert. Virus-Plaques, die lacZ exprimieren,
erschienen gegen einen klaren Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht
wurden positive Plaques, die mit vT264 bezeichnet sind, ausgewählt und
ihre Nachkommenschaft wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation
und Replattierung in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT264 ist in 21A gezeigt.
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Beispiel 21
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Erzeugung eines rekombinanten MVA-Virus
rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu) Nr. vT260
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Für die Erzeugung
von rMVA-PSA/PSMA/TRICOM(hu) wurde ein als pT5084 bezeichneter Plasmidvektor
für die
direkte Einführung
der Fremdsequenzen in das Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms konstruiert.
Das PSA-Gen steht unter der Steuerung des 40K-Promotors und das
PSMA-Gen steht unter der Steuerung des 7.5K-Promotors. Das menschliche
LFA-3-Gen steht unter der Steuerung des 30K-Promotors, das menschliche ICAM-1-Gen
steht unter der Steuerung des I3-Promotors,
das menschliche B7.1-Gen steht unter der Steuerung des sE/L-Promotors und das
lacZ-Gen steht unter der Steuerung des C1-Promotors. Diese Fremdsequenzen
werden von DNA-Sequenzen aus dem Deletion-III-Gebiet des MVA-Genoms
(siehe 22) flankiert. Als das Elternvirus
für diesen
rekombinanten Impfstoff wurde ein Plaque-gereinigtes Isolat aus
dem MVA-Impfstoffstamm verwendet. Die Erzeugung des rekombinanten
MVA wurde über
homologe Rekombination zwischen MVA-Sequenzen in dem MVA-Genom und
den entsprechenden Sequenzen in pT5084 in mit pT5084 transfizierten,
mit MVA infizierten primären
Hühnerembryo-Dermalzellen
ausgeführt.
Das rekombinante Virus wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
chromogenen Assays für
das lacZ-Genprodukt identifiziert.
Virus-Plaques, die lacZ exprimieren, erschienen gegen einen klaren
Hintergrund blau. Aus der Zellenmonoschicht wurden positive Plaques,
die mit vT260 bezeichnet sind, ausgewählt und ihre Nachkommenschaft
wurde replattiert. Vier Runden Plaque-Isolation und Replattierung
in Anwesenheit von Bluo-Gal führten zur
Reinigung der gewünschten
Rekombinante. Die Genomstruktur des rekombinanten MVA vT260 ist
in 21B gezeigt.
-
Beispiel 22
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Rekombinante Pockenviren
-
Es
sind die einzelnen rekombinanten Impfpockenviren, die entweder das
Gen, das das kostimulatorische Rattenmolekül B7-1 codiert (als rV-B7-1
bezeichnet), oder das Gen, das das interzellulare Rattenadhäsionsmolekül-1 codiert
(als rV-ICAM-1 bezeichnet) enthalten, beschrieben worden (10, 11).
Das rekombinante Impfpockenvirus, das das Gen für Ratten-C48 enthält [das
als rV-LFA-3 bezeichnet wird; das Ratten-CD48 ist das Homologe des
menschlichen LFA-3 (CD58) (6)], wurde auf ähnliche Weise wie rV-B7-1 und
rV-ICAM-1 konstruiert und ist beschrieben worden (12). Das Gen,
das das kostimulatorische Molekül
codiert, wurde in jedem dieser einzelnen rekombinanten Impfpockenviren
unter die Steuerung des Impfpockenvirus-Early-Late-40K-Promotors
gestellt (15), und das Transgen wurde wie in (13) beschrieben in
das Hind-III-M-Gebiet des Genoms des Wyeth-Impfpockenvirusstamms
eingeführt.
Rekombinante Geflügelpockenviren
wurden wie in (14) beschrieben durch die Einführung von Fremdsequenzen in
das BamHI-J-Gebiet des Genoms des PDXVAC-TC-Geflügelpockenvirusstamms (Schering
Corporation) konstruiert. In rekombinanten Viren, die ein einzelnes
Fremdgen enthalten, steht das Gen unter der Steuerung des 40K-Impfpockenpromotors. rV-B7-1/ICAM-1
ist ein rekombinantes Impfpockenvirus, das das Ratten-B7-1-Gen unter
der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L-Promotors)
(16) und das Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des 40K-Promotors enthält. rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3
ist ein rekombinantes Impfpockenvirus, das das Ratten-LFA-3-Gen
unter der Steuerung des 30K-Impfpockenpromotors (M2L) (17), das
Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des I3-Impfpockenpromotors
(18) und das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des synthetischen
Early/Late-Promotors (sE/L-Promotors) enthält. rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3
ist ein rekombinantes Geflügelpockenvirus,
das das menschliche carcinoembryonale Antigen (CEA) unter der Steuerung
des 40K-Promotors, das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des sE/L-Promotors,
das Ratten-LFA-3-Gen unter der Steuerung des I3-Promotors und das
Ratten-ICAM-1-Gen unter der Steuerung des 7.5K-Impfpockenpromotors
enthält
(19). Das nicht rekombinante Impfpockenvirus wurde mit V-Wyeth bezeichnet,
während
das nicht rekombinante Geflügel pockenvirus
mit WT-FP bezeichnet wurde.
-
Beispiel 23
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Expression rekombinanter kostimulatorischer
Moleküle
-
Um
zu bestätigen,
dass jeder der rekombinanten Vektoren das richtige Transgen bzw.
die richtigen Transgene exprimieren könnte, wurde die Ratten-Adenokarzinom-Zelllinie
MC38 mit den verschiedenen rekombinanten Impfpocken- oder Geflügelpockenkonstrukten
infiziert und wurde durch Durchflusszytometrie die Zelloberflächenexpression
des Transgens bzw. der Transgene nachgewiesen (23). Nicht infizierte Zellen (Daten nicht gezeigt)
und Zellen, die mit Impfpocken vom Wildtyp infiziert waren, exprimierten
keines der drei kostimulatorischen Moleküle. Diese Beobachtung wurde
durch PCR (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Im Gegensatz dazu wurden
mit rV-B7-1 infizierte Zellen stark positiv für B7-1-Protein; wurden mit
rV-ICAM-1 infizierte Zellen positiv für ICAM-1; und wurden mit rV-LFA-3
infizierte Zellen positiv für
LFA-3-Protein. Ein ähnliche
Analyse eines Konstrukts, das zwei kostimulatorische Moleküle (rV-B7-1/ICAM-1)
enthielt, zeigte die Expression von B7-1 (78 % positiv mit einer
mittleren Fluoreszenz-Intensität
(MFI) von 1012) und ICAM-1 (70 % positiv mit einer MFI von 690).
Darüber
hinaus koexprimierten mit dem Impfpocken-Mehr-Gen-Konstrukt rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierte
Zellen alle drei kostimulatorischen Moleküle. Um zu bestimmen, ob die
rekombinanten Geflügelpockenviren
drei rekombinante Proteine exprimierten, wurden MC38-Zellen auf ähnliche Weise
mit den Geflügelpockenkonstrukten
infiziert (23). Zellen, die mit dem Geflügelpockenvirus
vom Wildtyp WT-FP infiziert wurden, exprimierten wieder kein kostimulatorisches
Molekül.
Mit rF-B7-1 infizierte Zellen wurden positiv für das Protein B7-1 und mit
rF-ICAM-1 infizierte Zellen wurden positiv für das Protein ICAM-1. Ein Vektor
rF-LFA-3 wurde nicht
konstruiert. Allerdings koexprimierten mit dem Geflügelpocken-Mehr-Gen-Konstrukt
rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3 infizierte Zellen alle drei kostimulatorischen
Moleküle.
-
Charakterisierung rekombinanter Viren:
Fluoreszenzanalyse der Proteinoberflächenexpression
-
Die
Ratten-Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinie MC38 ist beschrieben worden
(20). Konfluierende MC38-Zellen wurden 5 Stunden mit Impfpockenkonstrukten
(V- Wyeth, rV-B7-1,
rV-ICAM-1, rV-LFA-3, rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) oder mit Geflügelpockenkonstrukten
(WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3) mit 5 MOI
(Infektionsmultiplizität;
PFU/Zelle) infiziert. CEA wurde in einem rF-Konstrukt nur als Marker-Gen
verwendet. Nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und mit
für Ratten-CD80
(-B7-1), -CD54 (-ICAM-1) oder -CD48 (-LFA-1; PharMingen, San Diego,
CA) spezifischen FITC-konjugierten monoklonalen Antikörpern (MAb)
immunhistochemisch gefärbt.
Die Zellenfluoreszenz wurde mit einem FACSCAN-Zytometer (Becton
Dickinson, Mountain View, CA) mit der Software Lysis II analysiert.
-
In-vitro-Kostimulationsanalyse
-
Von
den Taconic Farms (Germantown NY) wurden weibliche C57BL/6-Mäuse (6–8 Wochen
alt) erhalten. Aus den Milzen wurden naive T-Zellen isoliert, die
durch 70 m-Zellensiebe (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes,
NJ) mechanisch dispergiert wurden, um Einzelzellensuspensionen zu
isolieren, und rote Blutkörperchen
und tote Zellen wurden durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque-Gradienten (Dichte
= 1,119 g/ml) (Sigma, St. Louis, MO) entfernt. Durch den aufeinanderfolgenden
Durchgang der einkernigen Milzzellen über zwei Nylonwollsäulen wurden
Populationen erhalten, die näherungsweise
aus 95 % T-Zellen bestanden (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale
CA). Für
bestimmte Experimente wurden die T-Zellen durch Negativselektion unter
Nutzung paramagnetischer Anti-CD-4-
oder Anti-CD-8-Perlen (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) in
CD4+- und
CD8+-Populationen weiter fraktioniert. Die
T-Zellen wurden bei 105/Well in 96-Well-Platten mit
flachen Böden
(Costar, Cambridge, MA) hinzugefügt.
Die Stimulatorzellen bestanden aus nicht infizierten MC38-Zellen
oder aus Zellen, die 5 Stunden mit 5 MOI Impfpockenkonstrukten (V-Wyeth,
rV-B7-1, rV-ICAM-1, rV-LFA-3,
rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) oder Geflügelpockenkonstrukten
(WT-FP, rF-B7-1, rF-ICAM-1, rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3) infiziert,
mit 2 % Formaldehyd fixiert und mit 104/Well
zugegeben wurden. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen
von 200 μl
Vollnährmedien
(CM) [RPMI 1640 mit fötalem Kalbsserum
(10 %), Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Hepes (7 mM), Gentamicin
(50 μg/ml),
2-Mercaptoethanol (50 μM)
und unwesentlichen Aminosäuren
(0,1 mM) (Biofluids, Rockville, MD)] in Anwesenheit mehrerer Verdünnungen
(5 bis 0,625 μg/ml
für 2 Tage)
Concanavalin-A (Con A, Sigma) kultiviert. Die Kontroll-Wells empfingen nur
T-Zellen, Stimulatorzellen und Medien. Für die angegebenen Experimente
wurde Con A durch plattengebundenes Anti-CD3 (1,5 μg/Well -
0,012 μg/Well)
ersetzt. Die Zellen wurden für
die letzten 12–18
h der Inkubation mit 1 Ci/Well 3H-Thymidin
(New England Nuclear, Wilmington, DE) markiert und mit einem Tomtec-Zellenernter
(Wallac Incorporated, Gaithersburg, MD) geerntet. Die enthaltene
Radioaktivität wurde
durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Wallac
1205 Betaplate, Wallac, inc.) gemessen. Die Ergebnisse von drei
Wells wurden gemittelt und als Mittelwert CPM ± SEM berichtet. Für die angegebenen
Experimente wurde die In-vitro-Kostimulationsanalyse entweder in
Anwesenheit einer für
das exprimierte kostimulatorische Molekül spezifischen MAb oder des
passenden Isotyp-Kontrollantikörpers
(armenischer Hamster IgG, polyklonal) ausgeführt. Die zum Blockieren der
T-Zellen-Proliferation verwendeten Antikörper waren Hamster-Anti-Ratten-CD80
(B7-1; Klon 16-10A1), Hamster-Anti-Ratten-CD54 (ICAM-1; Klon 3E2)
oder Hamster-Anti-Ratten-CD48 (BCM-1; Klon HM48-1), alle von PharMingen.
Alle Antikörper
wurden mit einer Endkonzentration von 25 μg/ml verwendet.
-
Bestimmung der Fähigkeit
kostimulatorischer Moleküle
-
T-Zellen
und Stimulatorzellen wurden wie oben beschrieben vorbereitet. Zu
den Wells wurden in verschiedenen Verhältnissen feste Stimulatorzellen,
die eines oder mehrere kostimulatorische Moleküle exprimieren, in Kombination
mit V-Wyeth-infizierten/festen
Stimulatorzellen auf insgesamt 104/Well
zugegeben. Daraufhin wurden T-Zellen (105/Well)
zugegeben und die Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl CM in Anwesenheit
von 2,5 μg/ml
Con A 2 Tage kultiviert und für
die letzten 12–18
h der Inkubation mit 1 μCi/Well 3H-Thymidin markiert. Die enthaltene Radioaktivität wurde
wie zuvor durch Flüssigkeitsszintillationszählung gemessen.
-
Cytokin-Analyse
-
CD4+- und CD8+-T-Zellenpopulationen
wurden wie oben beschrieben vorbereitet und mit 2,5·106/Well in eine 6-Well-Platte (Costar) zugegeben.
Die Stimulatorzellenpopulationen wurden wie oben vorbereitet und mit
2,5·105/Well zugegeben. Die Zellen wurden in einem
Gesamtvolumen von 5 ml CM in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con
A 24 Stunden kultiviert. Die überstehenden
Fluide wurden gesammelt und durch die Erfassung ELISA wie zuvor
beschrieben (21) auf Ratten-IL-2, -IFNγ, -TFN-α, -GM-CSF und -IL-4 analysiert.
Die Empfindlichkeit der Detektion war in dieser Reihenfolge 30,
100, 20, 20 und 20 pg/ml.
-
RNA-Populationen
von den stimulierten Zellen wurden ebenfalls durch einen Mehrproben-RNAse-Schutz-Assay
(mpRPA) analysiert. Von PharMingen wurden definierte Ribo-Proben
für Ratten-Cytokine
gekauft. Die Assays wurden wie zuvor beschrieben (22) ausgeführt. Durch
Elektrophorese an 6 %-Polyacrylamid-Gelen wurden mit einer geschützten Sonde
markierte Duplexe abgetrennt. Die getrockneten Gele wurden bei –70 °C 24–72 Stunden
einem Biomax-Film (Kodak) ausgesetzt. Die in den Bändern enthaltene
Radioaktivität
wurde unter Verwendung eines Storm-System-Phosphoimagers (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Die Netto-CPM für ein gegebenes
Band wurde durch die folgende Formel berechnet [cpm Cytokin-Gen
minus cpm Hintergrund] und als Prozent des Organisations-Gen-Transskripts
L32 ausgedrückt.
-
Beispiel 24
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B7-1, ICAM-1 und LFA-3 wirken synergistisch
zusammen, um die T-Zellen-Proliferation
zu verbessern.
-
Es
ist gezeigt worden, dass B7-1-, ICAM-1- und LFA-3-Moleküle die T-Zellen-Proliferation einzeln
kostimulieren. Da sie gleichzeitig an APC exprimiert werden können, ist
es aber schwierig, die relativen Rollen der einzelnen kostimulatorischen
Moleküle
während
der Induktion der T-Zellen-Proliferation zu untersuchen (2). Um
den Beitrag von B7-1-, ICAM-1- und/oder LFA-3-Molekülen zur
Induktion der naiven T-Zellen-Proliferation zu analysieren, wurde
ein modifiziertes In-vitro-Modell
(23, 24) genutzt, bei dem das erste Signal für die T-Zellen-Aktivierung über ein
pharmakologisches Reagens (Con A) geliefert wurde. Unter Verwendung
der Zelllinie MC38, die mit verschiedenen rekombinanten Impfpockenviren
(24A) oder Geflügelpockenviren (24B)
infiziert wurde, die manipuliert wurden, um kostimulatorische Moleküle zu exprimieren,
wurde ein Feld von Stimulatorzellen erzeugt, die sich nur in Bezug
auf die kostimulatorischen Moleküle
unterschieden. Das zweite oder "kostimulatorische" Signal wurde über eines
oder mehrere kostimulatorische Moleküle, die auf der Oberfläche dieser "Stimulator"-MC38-Zellen exprimiert
wurden, an die T-Zelle geliefert. Wie in 24A gezeigt
ist, induzierten die beiden nicht infizierten MC38-Zellen und MC38N-Wyeth
bei allen untersuchten Niveaus von Con A eine geringfügige Proliferation
von T-Zellen. MC38/LFA-3 induzierten eine kleine (2,1-fache), aber
wesentliche (P < 0,05)
Zunahme der T-Zellen-Proliferation. Die Lieferung des Signals 2 über MC38/ICAM-1
induzierte bei 2,5 μg/ml
Con A eine 3,5-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation. MC38/B7-1 induzierte
bei 2,5 bzw. bei 1,25 μg/ml
Con A eine 7,8-fache und eine 16-fache Zunahme der Proliferation.
Dagegen induzierten MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 (MC38-Zellen, die alle
drei kostimulatorischen Moleküle
koexprimieren) bei 2,5 μg/ml
Con A eine 17,5-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation und bei 1,25 μg/ml Con
A eine 34-fache Zunahme. Darüber
hinaus induzierte die Expression von ICAM-1 und LFA-3 bei niedrigen
Con-A-Niveaus (0,625 μg/ml)
keine T-Zellen-Proliferation. Obgleich B7-1 bei 0,625 μg/ml Con
A eine messbare Proliferation (20.000 CPM) induzierte, induzierte
die Koexpression aller drei kostimulatorischen Moleküle ein noch größeres Niveau
der Proliferation (100.000 CPM) (24A).
Diese Experimente wurden viermal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
-
Außerdem wurden
MC38-Stimulatorzellen durch Infektion mit rekombinanten Geflügelpockenvektoren vorbereitet
(24B). Nicht infizierte MC38 oder MC38/WT-FP induzierten
wieder bei allen untersuchten Niveaus von Con A eine geringfügige Proliferation
von T-Zellen. Bei 2,5 μg/ml
Con A unterstützten MC38/rF-ICAM-1
eine 2-fache Zunahme, unterstützten
MC38/rF-B7-1 eine 3,2-fache
Zunahme und unterstützten
MC38/rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3 eine 6-fache Zunahme der T-Zellen-Proliferation.
Wenn dieses Experiment zwei weitere Male wiederholt wurde, wurden ähnliche
Ergebnisse erhalten. Außerdem
wurden ähnliche
Ergebnisse erhalten, wenn das erste Signal über immobilisierte Anti-CD3
geliefert wurde (Daten nicht gezeigt). Die in der durch MC38/rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 und MC38/rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3
unterstützten
Proliferation (17-fach gegenüber
6-fach) festgestellten Unterschiede sind höchstwahrscheinlich eine Folge
der Niveaus des exprimierten rekombinanten Proteins bzw. der exprimierten
rekombinanten Proteine nach einer 5-Stunden-Infektionsperiode (23). Genauer exprimieren näherungsweise 70 % der mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3
infizierten Zellen die kostimulatorischen Moleküle, während näherungsweise 40 % der mit rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3
infizierten Zellen positiv sind. Diese mit den rF-Vektoren infizierten
positiven Zellen exprimieren bei den verwendeten Bedingungen die
rekombinante B7-1 und ICAM-1 mit Niveaus von 50 % jener Zellen,
die mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3
infiziert werden.
-
Beispiel 25
-
Spezifizität des Beitrags kostimulatorischer
Moleküle
zur T-Zellen-Proliferation
-
Um
die Spezifizität
des Proliferationsbeitrags von B7-1, ICAM-1 oder LFA-3 weiter zu
bestätigen,
wurden wieder durch Infektion mit V-Wyeth, rV-B7-1, rV-ICAM-1 oder
rV-LFA-3 MC38-Stimulatorzellen vorbereitet und mit naiven Ratten-T-Zellen
und Con A in Anwesenheit oder Abwesenheit von für das gegebene kostimulatorische
Molekül
spezifischer MAb kokultiviert. Wie in 3B gezeigt
ist, verbesserte MC38/B7-1 die T-Zellen-Proliferation 4,5-mal mehr
als MC38N-Wyeth (25A). Diese erhöhte Proliferation
wurde durch die Zugabe eines blockierenden MAb für Ratten-B7-1 zu 83 % verhindert. Ähnlich erhöhte MC38/ICAM-1
(25C) die Proliferation 2,25-fach, was daraufhin
in Anwesenheit von Anti-Ratten-ICAM-1-MAb um 88 % verringert wurde. Schließlich erhöhte MC38/LFA-3
(25D) die Proliferation 2,1-fach, was daraufhin
in Anwesenheit von Anti-Ratten-CD48-MAb um 98 % verringert wurde.
Für jede
Gruppe blockierte die Inkubation mit dem geeigneten Isotypkontrollantikörper (wie
in Materialien und Verfahren spezifiziert) die festgestellte Proliferation nicht.
Dieses Experiment wurde zwei weitere Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
-
Beispiel 26
-
Bestimmung der Fähigkeit kostimulatorischer
Moleküle
-
Die
Modifizierung des In-vitro-Kostimulations-Assays ermöglichte
eine quantitative Schätzung
der relativen Fähigkeit
von B7-1, ICAM-1 und/oder LFA-1 zum Liefern des zweiten Signals
für die
T-Zellen-Proliferation. Zu diesem Zweck wurden Stimulatorzellen
(mit den verschiedenen rekombinanten Impfpockenviren infizierte
MC38-Zellen) durch Verdünnung
mit veränderlichen
Mengen von mit V-Wyeth infizierten MC38-Zellen ausgetitert und mit
einer konstanten Anzahl von T-Zellen in Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con
A kokultiviert. Das MC38/T-Zellen-Verhältnis in diesen Experimenten
blieb konstant bei 1:10. Wie in 4 zu
sehen ist, verbesserte MC38/LFA-3 (Volldreiecke) die Proliferation
der T-Zellen gegenüber
der von MC38/V-Wyeth (Leerquadrate) bis zu einer Konzentration von
40 % (d. h. von den Stimulatorzellen in der Well wurden 40 % mit rV-LFA-3
infiziert und wurden die verbleibenden 60 % mit V-Wyeth infiziert).
MC38/ICAM-1 (Vollkreise) oder MC38/B7-1 (Vollrauten) unterstützten die
erhöhte
Proliferation bis zu einer Konzentration von 13 % bzw. 6 %. Im Gegensatz
dazu verbesserten MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3
die Proliferation, wenn weniger als 3 % Stimulatorzellen den Dreiervektor
enthielten (extrapoliert auf weniger als 1 % über lineare Analyse der kleinsten
Quadrate). Bei gegebenen Titrationskurven dieser einzelnen kostimulatorischen
Moleküle
schien es, dass der durch ICAM-1 und B7-1 vermittelte Umfang der
T-Zellen-Proliferation 3-mal bzw. 6-mal potenter als der durch LFA-3
allein vermittelte ist. Allerdings wird die stärkste Proliferation eindeutig
durch B7-1/ICAM-1/LFA-3
vermittelt. Es wird angemerkt (26),
dass die Expression von LFA-3, ICAM-1 und sogar B7-1 allein bei
verhältnismäßig niedrigen
Stimulatorzellenkonzentrationen (d. h., wenn 3 %–6 % der MC38-Zellen als Stimulatorzellen
wirken) die T-Zellen-Aktivierung nicht verbessern, während die
drei kostimulatorischen Moleküle,
die Stimulatorzellen exprimieren, die T-Zellen-Aktivierung wesentlich
verbessern. Die Daten in 26 (Einsatz)
zeigen die Proliferationsergebnisse, die erhalten wurden, wenn 3
% der MC38-Stimulatorzellen mit den bezeichneten Vektoren infiziert
wurden. Da jede Well 104 Gesamt-MC38-Zellen
und 105 naive T-Zellen enthielt, war das
tatsächliche
Stimulator/T-Zellen-Verhältnis
in diesen Kulturen 0,003. Es wird angemerkt, dass die mit dem Zwei-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1)
infizierten MC38-Zellen unter diesen Bedingungen wenig, wenn überhaupt,
Proliferation von T-Zellen induzierten, während MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 die
Proliferation wesentlich erhöhten
(p < 0,0001).
-
Beispiel 27
-
Kostimulation von CD4+-
und CD8+-T-Zellen
-
Um
die T-Zellen-Reaktion auf einzeln oder in Kombination exprimierte
kostimulatorische Moleküle
weiter zu charakterisieren, wurde die Fähigkeit von B7-1, ICAM-1 und
LFA-3 zur Kostimulation gereinigter CD4+- und
CD8+-T-Zellen getestet. 5 zeigt
die Proliferation gereinigter CD4+-Zellen
(27A) und CD8+-T-Zellen (27B), die mit suboptimalen Konzentrationen von
Con A aktiviert wurden. Die Wirkungen der Schichtung der Stimulatorzellen
auf die Proliferation war für
CD4+- und
CD8+-T-Zellen ähnlich: MC38/LFA-3 stimulierten die
schwächste
Proliferation, gefolgt von MC38/ICAM-1 und MC38/B7-1, MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3
waren die potentesten Stimulatorzellen für CD4+-
und CD8+-T-Zellen. Diese Experimente wurden
drei weitere Male mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt. Es wird angemerkt, dass es bei sehr niedrigen
Konzentrationen von Con A (0,625 μg/ml, 5,
Felder C und D) keine wesentliche Verbesserung der Aktivierung von
CD4+- oder CD8+-T-Zellen
gab, wenn zum Liefern des zweiten Signals entweder die ICAM-1-,
LFA-3-, B7-1- oder die B7-1/ICAM-1-Kombination verwendet wurde.
Dagegen wurde eine wesentliche Aktivierung der beiden T-Zellen-Teilmengen
beobachtet, wenn das die Dreiergruppe kostimulatorischer Moleküle koexprimierende
Impfpockenvirus genutzt wurde. Wenn das erste Signal über immobilisierte
Anti-CD3 geliefert wurde (Daten nicht gezeigt), wurden ähnliche
Ergebnisse festgestellt.
-
Es
ist berichtet worden, dass die B7-1-Kostimulatrion die Halbwertszeit
von IL-2 mRNA und die Aufwärtsregulation
der IL-2-Transkription verlängert,
was zur Erzeugung beträchtlicher
Mengen abgesonderter IL-2 führt
(4,25). Zusätzlich
ist berichtet worden, dass die T-Zellen-Kostimulation mit LFA-3
eine Wirkung auf eine Vielzahl von Cytokinen, insbesondere IL-2
und IFN-γ,
hat (6). Um qualitative und quantitative Wirkungen der Kostimulation
durch einzelne und mehrere kostimulatorische Moleküle auf die
Cytokin-Produktion zu bestimmen, wurden gereinigte CD4+-
und CD8+-T-Zellen erneut mit verschiedenen
Stimulatorzellen, die B7-1, ICAM-1 und LFA-3 exprimieren, allein
oder in Kombination mit der Anwesenheit von 2,5 μg/ml Con A kokultiviert. Die überstehenden
Fluide wurden nach 24 Stunden auf IL-2, IFN-γ, TFN-α, GM-CSF und IL-4 analysiert. Nicht
infizierte MC38 (Daten nicht gezeigt) und MC38/V-Wyeth induzierten
aus CD4+-Zellen eine geringfügige Menge
IL-2 (28A), während MC38/B7-1 3,979 pg/ml
induzierten. Dagegen induzierte eine T-Zellen-Stimulation mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3
eine 10-mal größere Menge
IL-2. Ähnlich
induzierte MC38/B7-1 aus CD8+-Zellen eine
geringfügige
Menge IL-2 (28B), während MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3
eine 20-mal höhere Menge
(6,182 pg/ml) induzierte. Die IFN-γ-Produktion durch stimulierte
T-Zellen wurde ebenfalls untersucht. MC38/B7-1 und MC38/LFA-3 induzierten
aus CD4+-Zellen nur mäßige Mengen IFN-γ (28C). Im Gegensatz dazu induzierte die Stimulation
von CD4+-Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3
4-mal mehr IFN-γ als
die Stimulation mit irgendeinem anderen Konstrukt. Die Stimulation
von CD8+-Zellen
mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 induzierte die größte Menge IFN-γ, mehr als
6-mal mehr als die CD8+-Zellen, die mit
irgendeinem der anderen Konstrukte stimuliert wurden (28D). Die Stimulation jedes Zelltyps mit irgendeinem
Konstrukt vermittelte keine wesentlichen Änderungen (p > 0,05) in Bezug auf
die Niveaus abgesonderter TNF-α,
GM-CSF oder IL-4 (Daten nicht gezeigt). Es scheint, dass der vorherrschende
Gipfelpunkt der Stimulation über
das Dreierkonstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) die IL-2-Absonderung
von CD4+-Zellen und die IFN-γ-Absonderung
von CD8+-T-Zellen war. Diese Experimente
wurden weitere dreimal mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt. Außerdem
wurden Untersuchungen ausgeführt,
um mit dem Zwei-Gen-Konstrukt infizierte Stimulatorzellen (rV-B7-1/ICAM-1) gegenüber dem
Mehr-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) auf ihre Fähigkeit
zur Verbesserung der Cytokin-Produktion durch T-Zellen zu vergleichen.
In der IFN-γ-Produktion entweder
durch CD4+- oder durch CD8+-Zellen
oder in der IL-2-Produktion durch CD8+-Zellen
wurden zwischen den beiden nur kleine Unterschiede beobachtet. In
der Stimulation der IL-2-Produktion durch CD4+-Zellen (5.000 pg/ml
unter Nutzung von MC38/B7-1/ICAM-1 gegenüber 39.600 pg/ml unter Nutzung
von MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3) war aber ein wesentlicher Unterschied
zu sehen.
-
Die
mit einzelnen oder mehreren kostimulatorischen Molekülen stimulierte
Cytokin-Expression von CD4+- und CD8+-T-Zellen wurde unter Nutzung des Mehrsonden-RNAse-Schutz-Assays
(mRPA) ebenfalls auf der RNA-Ebene analysiert. Es sind ein repräsentatives
Röntgenprofil
und eine quantitative Analyse von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt
(29). Die Niveaus von IL-4, IL-5,
IL-10, IL-15 und IL-6 waren in mit MC38/V-Wyeth, MC38/B7-1, MC38/ICAM-1,
MC38/LFA-3 oder MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimulierten CD4+-T-Zellen ähnlich (29, Histogramm des Felds B). Die IL-2-
und IFN-γ-Expressionsniveaus
waren in mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimulierten CD4+-T-Zellen
im Vergleich mit CD4+-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert
wurden, die irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül exprimieren,
am höchsten
(29B). In CD4+-Zellen,
die mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimuliert wurden, wurden ebenfalls
etwas höhere
Niveaus von IL-13, IL-9 und IL-6 festgestellt. In stimulierten CD8+-T-Zellen wurde die Expression von Cytokin-Genen
ebenfalls analysiert. Von den analysierten Cytokin-RNAs waren die
IL-2- und insbesondere die IFN-γ-Niveaus
im Vergleich zu T-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert wurden,
die irgendein einzelnes kostimulatorisches Molekül exprimieren, wesentlich höher, wenn
diese Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 stimuliert wurden. Somit war
der vorherrschende synergistische Effekt der Dreiergruppe kostimulatorischer
Moleküle
in der Cytokin-Produktion in CD4+-Zellen
IL-2 und in CD8+-T-Zellen IFN-γ.
-
Beispiel 28
-
Wirkung der TRICOM-Kostimulation
auf die Apoptosis stimulierter T-Zellen
-
Apoptosis-Untersuchungen
-
Um
zu bestimmen, ob die Stimulation von T-Zellen mit Signal 1 und rV-TRICOM
zum Zellenüberleben oder
zum programmierten Zellentod (PCD) führen würde, wurden CD8+-T-Zellen
für Signal
1 mit Con A aktiviert, 48 h mit mit V-WT, mit rV-B7-1 oder mit rV-TRICOM infizierten
MC38-Zellen kultiviert und 24 h im Medium replattiert, um die Apoptosis
zu messen. Die Apoptosis wurde unter Verwendung des TUNEL-Assays
beurteilt, wie er von Gavrieli, Y., u. a., J. Cell Biol 119:493–501, 1992,
beschrieben wurde. Durch die Kombination von MC38 und Con A oder
von MC38/V-WT und Con A aktivierte T-Zellen zeigten in Abwesenheit
kostimulatorischer Signale hohe Niveaus spontaner Apoptosis (jeweils
82,9 ± 1).
Durch Con A und MC38/B7-1 oder durch Con A und MC38/TRICOM aktivierte
T-Zellen zeigten eine wesentlich kleinere spontane Apoptosis (31,3 ± 3,8 bzw.
30,7 ± 1).
-
Die
Ergebnisse weisen in T-Zellen, die mit MC38-Zellen stimuliert wurden,
in Anwesenheit von Con A mit oder ohne V-WT-Infektion (d. h. in
Anwesenheit des Signals 2) deutlich die Apoptosis nach. Obgleich
Con A mit MC38/TRICOM CD8+-Zellen eindeutig
auf viel stärkere
Niveaus als Con A mit MC38/B7-1 stimulierte und zur Herstellung
höherer
Niveaus von IFN-γ und
IL-2 führte,
führt dies
nicht zu einem höheren
Grad der Apoptosis.
-
Beispiel 29
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Anti-Tumor-Wirkung von rV-CEA/TRICOM in
vivo
-
Es
wurden Untersuchungen durchgeführt,
um zu bestimmen, ob eine antigenspezifische Immunreaktion unter
Verwendung eines TRICOM-Vektors verbessert werden könnte. Es
wurde eine mit rV-CEA/TRICOM bezeichnete Vier-Gen-Impfpocken-Rekombinante
konstruiert, die das menschliche CEA-Gen und die Gene B7-1, ICAM-1
und LFA-3 enthielt, wie sie hier offenbart ist. Sechs bis acht Wochen
alte weibliche C57-BL/6-Mäuse
(Taconic Farms) oder C57-BL/6-Mäuse,
die transgenisch für
menschliche CEA sind (Kass, E., u. a., Cancer Res. 59:676–683, 1999),
wurden durch Schwanzhautritzung entweder mit Hanks ausbalancierter
Salzlösung
(HBSS) oder einmal mit 107 PFU rV-CEA, rV-CEA/B7-1
oder rV-CEA/TRICOM
geimpft, und 22 Tage später
wurden die Milzen geerntet. Die lymphoproliferative Aktivität der Splenozyten
wurde wie zuvor beschrieben analysiert (5).
-
Wie
in 30 (Einsatz) zu sehen ist, zeigten die Milz-T-Zellen
der mit rV-TRICOM geimpften Mäuse im
Vergleich zu T-Zellen, die von Mäusen
erhalten wurden, die mit rV-CEA geimpft wurden, höhere Niveaus einer
CEA-spezifischen Stimulation; Ovalbumin und Con A wurden als Kontrollen
verwendet. Daraufhin wurde ein Experiment durchgeführt, um
zu bestimmen, ob rV-CEA/TRICOM eine Langzeitimmunität induzieren
könnte.
Mäuse (5/Gruppe)
wurden einmal mit einem von VWT, rV-CEA oder rV-CEA/TRICOM geimpft.
Einhundert Tage später
wurden die Mäuse
mit einer hohen Dosis (1·106) MC38-Dickdarmkarzinomzellen, die CEA exprimieren
(5), herausgefordert. Alle Mäuse,
die V-WT und rV-CEA empfingen, erlagen den Tumoren, während alle
mit rV-TRICOM geimpften Mäuse
50 Tage nach der Herausforderung am Leben waren (30).
-
CEA-transgenische
Mäuse (Kass
1999, ebd.; Thompson, J. A., u. a., J. Clin. Lab. Anal. 5:344–366, 1999),
in denen das menschliche CEA-Gen in normalem gereiftem Magen-Darm-Gewebe
exprimiert wird und deren Serum CEA-positiv ist, wurden genutzt,
um zu bestimmen, ob der rV-CEA/TRICOM-Vektor die T-Zellen-Reaktionen auf ein
Autoantigen verbessern konnte. Die CEA-transgenischen Mäuse wurden
in 5 Mäuse/Gruppe
getrennt. Zwei Mäuse
wurden einmal mit 10
7 PFU rV-CEA, rV-CEA/B7-1,
rV-CEA/TRICOM oder mit einem Puffer geimpft und wurden am Tag 30
eingeschläfert,
um die CEA-spezifischen T-Zellen-Reaktionen zu analysieren. Die
nach der Impfung mit rV-CEA/TRICOM erhaltenen T-Zellen-Reaktionen waren wesentlich größer als
jene, die mit rV-CEA erhalten wurden (Tabelle 2). Die Reaktionen
auf Ovalbumin und Con A wurden als Kontrollen verwendet. Die verbleibenden
3 CEA-transgenischen Mäuse
in jeder Gruppe wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die Anti-Tumor-Reaktionen
auf einen CEA-exprimierenden Tumor unter Nutzung eines TRICOM-Vektors
verbessert werden konnten. Diese Mäuse wurden zuerst SC mit 4·10
15 MC38-Karzinomzellen, die das CEA-Gen exprimieren,
inokuliert (5). Vier Tage später
wurden die Mäuse
einmal an einer entfernten Stelle mit 10
7 PFU-Virusrekombinante
oder mit einem Puffer geimpft. In Mäusen, die mit rV-CEA/TRICOM geimpft
wurden, wuchsen keine Tumoren, während
in Mäusen,
die mit einem Puffer, mit rV-CEA und mit rV-CEA/B7-1 geimpft wurden,
weiter Tumoren wuchsen (Tabelle 2). Diese Ergebnisse unterstützen die
In-vivo-Aktivität
von TRICOM-Vektoren. Tabelle 2. Verbesserte Immunreaktion und
Anti-Tumor-Reaktion von rV-CEA/TRICOM in CEA-transgenen Mäusen
Stimulationsindex
(SI) |
| Con
A | Oval | CEA | CEA | Tumorwert |
Immunogen | (5 μg/ml) | (100 μg/ml) | (100 μg/ml) | (25 μg/ml) | Tag
14 | Tag
35 |
HBSS | 109 | 1,0 | 1,3 | 2,0 | 698±928 | 3,674±3,107 |
rV-CEA | 123 | 0,9 | 4,9 | 4,0 | 259±0 | 1,112±1,685 |
rV-CEA/B7-1 | 93 | 1,3 | 7,1 | 4,3 | 150 ± 236 | 2,696 ± 1,936 |
rV-CEA/TRICOM | 111 | 1,1 | 19,2 | 15,9 | 0±0 | ±0 |
-
C57BL/6-CEA-transgene
Mäuse (5
pro Gruppe) wurden einmal am Tag 0 über Hautritzung mit Puffer oder
mit Impfpockenrekombinante (107 PFU) geimpft.
Am Tag 30 wurden 2 Mäuse
getötet
und die Milz-T-Zellen auf T-Zellen-Proliferationsreaktionen analysiert.
Jeder Wert repräsentiert
den SI des mittleren CPM von Dreifachproben gegenüber Medien.
Die Standardabweichung überstieg
nie 10 %. Am Tag –4
erhielten 3 Mäuse pro
Gruppe 4·105 MC38-Dickdarmkarzinomzellen, die CEA exprimieren.
Das Tumorvolumen ist an den Tagen 14 und 35 nach der Impfung gegeben.
-
Beispiel 30
-
Kostimulation von CD4+-
und CD8+-T-Zellen durch Vorläufer-Dendritenzellen
und Dendritenzellen, die mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert sind
-
Von
C57BL/6-Mäusen
wurden durch das Verfahren von Inaba u. a. (41) frische CD34
+-Knochenmarkzellen (Dendritenzellenvorläufer) erhalten.
Diese Vorläuferzellen
wurden entweder sofort verwendet oder 6 Tage in GM-CSF und IL-4
kultiviert (42), um gereifte Dendritenzellen (DC) zu erzeugen. Die
CD34
+-Vorläuferzellen und die DC wurden
18 Stunden mit dem rekombinanten Impfpockenvirus, das mehrere kostimulatorische
Moleküle
rV-B7/ICAM-1/LFA-3 (rV-Tricom) codiert, 10 MOI, infiziert. Nach
5 Stunden Infektion wurde eine Zellenprobe geerntet und eine Phänotypanalyse
ausgeführt.
Die Dendritenzellen werden im Gebiet als die 'endgültigen' APC vorgestellt,
die mit hohen Niveaus eine große
Anordnung kostimulatorischer Moleküle exprimieren. Tabelle 3 zeigt,
dass Ratten-DC tatsächlich
die kostimulatorischen Moleküle
B7-1, B7-2, ICAM-1 und LFA-3 mit verhältnismäßig hohen Niveaus (mittlere
Fluoreszenz-Intensität,
MFI; in Klammern gezeigt) exprimiert. Allerdings gab es dann, wenn
DC mit rV-B7/ICAM-1/LFA-3 infiziert wurden, eine wesentliche Zunahme
sowohl des Niveaus der Expression kostimulatorischer Moleküle als auch
des Prozentsatzes der Zellen, die die mehreren kostimulatorischen
Moleküle
exprimieren. Der Prozentsatz der Zellen, die B7-1 exprimieren, nahm
von 65 % auf 86 % zu, während
die MFI 4-fach zunahm; der Prozentsatz der Zellen, die ICAM-1 exprimieren,
nahm von 32 % auf 68 % zu, während
die MFI 2,5-fach zunahm; der Prozentsatz der Zellen, die LFA-3 exprimieren,
nahm von 44 % auf 75 % zu. Tabelle 3 Phänotypanalyse
der Vorläufer-DC
vor und nach der Infektion
1 mit rV-COS
2 Marker |
Infektion | H2-Kb | I-Ab | CD11b | CD11c | B7-2 | B7-1 | ICAM-1 | LFA-3 |
keine | 903
(994)4 | 64
(621) | 63
(397) | 29
(223) | 38
(319) | 65
(300) | 32
(336) | 44
(378) |
V-Wyeth | 75
(554) | 60
(633) | 59
(398) | 27
(218) | 36
(317) | 65
(311) | 33
(296) | 43
(322) |
rV-B7 | 76
(516) | 67
(755) | 70
(419) | 34
(213) | 41
(320) | 83
(661) | 43
(363) | 51
(333) |
rV-B7I/ | 79 | 63 | 63 | 30 | 42 | 86 | 68 | 75 |
ICAM/
LFA-3 | (579) | (696) | (408) | (203) | (360) | (1253) | (810) | (484) |
- 1 5 Stunden Infektion
mit 10 MOI
- 2 rV-COS = rekombinante Impfpocken,
die ein kostimulatorisches Fremdmolekül codieren.
- 3 = % Zellen, die den Marker exprimieren
- 4 = mittlere Fluoreszenz-Intensität
-
Wie
in 31 umrissen ist, wurden die infizierten CD34+-Vorläuferzellen
und DC zur Verwendung als Stimulatorzellen bestrahlt (2.000 Rad)
und zum Stimulieren naiver CD4+- und CD8+-T-Zellen in Anwesenheit von Con A verwendet.
-
Vorläuferdendritenzellen,
die mit einem rekombinanten Pockenvirus infiziert waren, das B7.1,
ICAM-1 und LFA-3 codiert, konnten sowohl CD4+-
als auch CD8+-T-Zellen stimulieren. Die
Stimulation der CD8+-T-Zellen durch die
B7.1-, ICAM-1-, LFA-3-exprimierenden Vorläuferdendritenzellen war größer als
die, die unter Verwendung nicht infizierter gereifter CD34+-Dendritenzellen erzielt wurde (32). Darüber hinaus führten die Infektion
und Expression der drei kostimula torischen Moleküle in gereiften CD34+-Dendritenzellen (die mit IL-4 und mit GM-CSF vorbehandelt
wurden) zu einer drastischen Zunahme der Stimulation sowohl von
CD4+- als auch von CD8+-T-Zellen
(33).
-
Der
Fachmann kann außerdem
die Qualität
einer Dendritenzellenpopulation anhand ihrer Fähigkeit messen, eine alloreaktive
Reaktion (gemischte Lymphozytenreaktion, MLR) zu unterstützen (43). 34 zeigt die Ergebnisse einer gemischten Lymphozytenkultur,
die mit rV-TRICOM infizierte Dendritenzellen verwendet. Die gemischte
Lymphozytenreaktion verwendet DCs von C57BL/6-Mäusen,
die T-Lymphozyten von Balb/c stimulieren (d. h. eine Anti-Allotyp-Reaktion).
-
Diese
Daten zeigen, dass der Grad der Proliferation in einer gemischten
Lymphozytenreaktion unter Verwendung von mit rV-TRICOM infizierten
DCs im Vergleich zu nicht infizierten DCs oder im Vergleich zu mit Impfpocken
vom Wildtyp infizierten DCs drastisch höher ist.
-
35 veranschaulicht, dass mit rV-TRICOM infizierte
DCs beim Stimulieren einer CEA-Peptid-spezifischen Ratten-T-Zelllinie
viel besser sind als Standard-DCs. Diese T-Zelllinie ist CD8+ und ist spezifisch für das CEA-Db-Klasse-I-beschränkte Epitop
EAQNTTYL (CAP-M8). Die Kombination mit dem CEA-Peptid (1 μg/ml) gepulster
und zuvor mit rV-TRICOM infizierter DCs ist beim Stimulieren CEA-spezifischer T-Zellen-Reaktionen,
insbesondere bei niedrigen T-Zellen-DC-Verhältnissen,
deutlich überlegen.
-
Beispiel 31
-
Ratten-T-Zellen-Stimulation
in vitro und in vivo unter Verwendung rV- oder rF-TRICOM-infizierter
von Rattenknochenmark abgeleiteter Dendritenzellen
-
Experimentelles Protokoll
-
Peptide
-
Die
H-2kb-beschränkten Peptide OVA (Ovalbumin257-264, SIINFEKL)41 und
VSVN (Gingivostomatitis-Virus N52-59, RGYVYQGL)42 und die H-2Db-beschränkten Peptide
CAP-M8 (CEA526-533, EAQNTTYL) und FLU-NP (NP366-374, ASNENMDAM)43 wurden
entweder gekauft (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) oder
firmenintern synthetisiert (Applied Biosystems 432A Synergy Peptide
Synthesizer, Foster City, CA).
-
Zelllinien und Zellenkulturen
-
Die
OVA- und Cap-M8-CD8+-zytotoxischen T-Zelllinien
wurden firmenintern aus C57BL/6-Mäusen erzeugt und erkennen die
OVA- bzw. die Cap-M8-Peptide. Die CTL-Zelllinien wurden durch wöchentliche
In-vitro-Stimulationszyklen mit bestrahlten naiven Splenozyten in
Vollnährmedium
(CM) [RPMI 1640 mit fötalem Kalbsserum
(10%); Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Hepes (7 mM) Gentamicin
(50 μg/ml),
2-Mercaptoethanol (50 μM)
und unwesentliche Aminosäuren
(0,1 mM), (Biofluids, Rockville, MD)], ergänzt mit 1 μg/ml spezifischem Peptid und
10 U/ml Ratten-IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), erhalten.
Vierundzwanzig Stunden vor der Verwendung dieser Zellen als Responder
in antigenspezifischen Proliferations-Assays wurden die Zellen durch
Zentrifugation über
einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (Dichte = 1,119 g/ml, Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) gereinigt und in Sechs-Well-Kulturplatten (106 Zellen/ml, 5 ml/Well) in CM, das nur mit
10 U/ml Ratten-IL-2 ergänzt
war, replattiert. Die für
Zytotoxizitätsproben
verwendete Ziel-Tumorzelllinie war EL-4 (C57BL/6, H-2b,
Thymusgeschwulst, ATCC TIB-39).
-
DC-Vorbereitung
-
Von
sechs bis acht Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen (Taconic Farms, Germantown,
NY) wurde Knochenmark abgeleitet. Die in dieser Untersuchung verwendete
Prozedur war eine gegenüber
der von Inaba u. a.41 beschriebenen etwas
modifizierte Version. Kurz gesagt, wurde das Knochenmark von den
langen Knochen der Gliedmaßen
gespült
und über
einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geleitet. Die Knochenmarkzellen wurden
unter Verwendung eines Cocktails für CD4, CD8 und Anti-MHC-Klasse-II
spezifischer Magnetperlen (MiniMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
von Lymphozyten und Ia+-Zellen geleert.
Die Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten (106 Zellen/ml,
5 ml/Well) in CM, das mit 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 ergänzt war
(R&D Systems,
Minneapolis, MN), plattiert. An den Tagen 2 und 4 wurden die Zellen
in frischen mit Cytokin ergänzten
Medien replattiert. An Tag 6 der Kultur wurden die Zellen für die Infektion,
für die
Analyse und für die
Immunisierungen geerntet. Für
spezifische Experimente wurden die DC während der letzten 24 h der
Kultur mit Ratten-TFN-α (100
ng/ml, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) oder mit CD40 mAb
(5 μg/ml,
PharMingen, San Diego, CA) behandelt.
-
Rekombinantes Pockenvirus
-
Das
rV-Virus, das das Gen enthält,
das unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors (sE/L)
das kostimulatorische Rattenmolekül B7-1 (CD80) codiert (mit
rV-B7-1 bezeichnet), ist hier beschrieben worden. Das rV-Virus,
das das Ratten-LFA-3-Gen (CD48) unter der Steuerung des 30K-Impfpockenpromotors (M2L),
das Ratten-ICAM-1-Gen (CD54) unter der Steuerung des I3-Impfpockenpromotors
und das Ratten-B7-1-Gen unter der Steuerung des synthetischen Early/Late-Promotors
(sE/L) enthält,
ist als rV-TRICOM bezeichnet worden. Die Vektoren rF-B7-1 und rF-B7-1/ICAM-1/LFA-3
(die als rF-TRICOM bezeichnet sind) sind rF-Viren, die ähnlich wie
rV-B7-1 bzw. rV-TRICOM konstruiert wurden. In bestimmten Experimenten
wurde ein Geflügelpocken-TRICOM-Konstrukt
verwendet, das ein Reporter-Gen, menschliches CEA, enthält. Ein nicht
rekombinantes Impfpockenvirus vom Wildtyp (Wyeth-Stamm) wurde mit
V-WT bezeichnet, während
das Geflügelpockenvirus
vom Wildtyp mit FP-WT bezeichnet wurde.
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Infektion von DC
-
Die
DC wurden an Tag 6 geerntet und mit Opti-Mem (Gibco-BRL, Gaithersburg,
MD) gewaschen. Daraufhin wurden die Zellen 5 h entweder mit HBSS
scheininfiziert; mit V-WT, rV-B7 oder rV-TRICOM mit 25 MOI (Infektionsmultiplizität; PFU/Zelle)
infiziert; oder mit FP-WT, rF-B7-1 oder rF-TRICOM in Opti-Mem mit
50 MOI infiziert. Nach der Infektion wurde warmes CM zugegeben und
die Zellen wurden über
Nacht bei 37 °C
inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen für die immunhistochemische
Färbung,
In-vitro-Kostimulationsanalyse und In-vivo-Verabreichung geerntet.
-
Durchflusszytometrische Analyse
-
Die
Zelloberflächenfärbung nutzte
Dreifarben-Immunfluoreszenz. Die Färbung wurde mit primären FITC-markierten
Antikörpern
CD11c, CD11b, H-2Kb, H-2Db,
CD19, Pan-NK; mit primären
PS-markierten Antikörpern
IAb, CD48 (mLFA-3), CD86 (B7-2), CD3, CD14;
und mit biotinmarkierten Antikörpern
CD80 (B7-1), CD57 (ICAM-1), CD40 ausgeführt. Die biotinmarkierten Antikörper wurden
nachfolgend mit Cychrom-Streptavidin markiert. Alle Antikörper wurden
von PharMingen gekauft. Die Zellenfluoreszenz wurde mit einem FACSCAN-Zytometer
(Becton Dickinson, Mountain View, CA) unter Verwendung der Software
Lysis II analysiert und mit den geeigneten isotypangepassten Kontrollen
(PharMingen) verglichen.
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In-vitro-Kostimulationsanalyse: Pharmakologisches
Signal 1
-
Es
wurden weibliche sechs- bis acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse erhalten
(Taconic Farms, Germantown, NY) und wie zuvor beschrieben5 naive T-Zellen isoliert. Die T-Zellen wurden
mit 105/Well in 96-Well-Platten mit flachem
Boden (Costar, Cambridge, MA) zugegeben. Die Stimulatorzellen bestanden
entweder aus nicht infizierten DC, aus scheininfizierten DC oder
aus DC, die mit Impfpockenvektoren (V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM) oder
mit Geflügelpockenvektoren
(FP-WT, rF-B7-1 oder rF-TRICOM) infiziert, bestrahlt (20 Gy) und
mit 104/Well zugegeben wurden. Die Zellen
in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl von CM
2 Tage in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen (2,5 bis 0,9 μg/ml) von
Con A (Sigma) kultiviert. Die Zellen in allen Wells wurden in einem
Gesamtvolumen von 200 μl
CM in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen (2,5 bis 0,9 μg/ml) von
Con A (Sigma) 2 Tage kultiviert. Die Zellen wurden für die letzten
12–18
h der Inkubation mit 1 μCi/Well 3H-Thymidin (New England Nuclear, Wilmington,
DE) markiert und mit einem Tomtec-Zellenernter (Wallac Incorporated,
Gaithersburg, MD) geerntet. Die enthaltene Radioaktivität wurde
durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Wallac
1205 Betaplate, Wallac, Inc.) gemessen. Die Ergebnisse von drei
Wells wurden gemittelt und als Mittelwert CPM ± SEM berichtet.
-
Reaktion gemischter Lymphozyten
-
Um
die stimulierende Funktion von DC für allogenetische und syngenetische
naive T-Zellen zu beurteilen, wurden MLR verwendet. Die T-Zellen
wurden wie zuvor aus Balb/C- oder C57BL/6-Mäusen isoliert. Die Stimulatorzellen
bestanden aus DC, die entweder nicht infiziert wurden, scheininfiziert
wurden oder mit V-WT, rV-137-1,
rV-TRICOM, FP-WT, rF-B7-1 oder RF-TRICOM infiziert und bestrahlt
(20 Gy) wurden. Die T-Zellen (5·104/Well)
wurden mit abgestuften Anzahlen von Stimulatorzellen in CM in 96-Well-Kulturplatten
mit flachem Boden kokultiviert und 4 Tage bei 37 °C, 5 % CO2, inkubiert, für die letzten 12–18 h der
Inkubation mit 1 μCi/Well 3H-Thymidin markiert, geerntet und wie zuvor
analysiert.
-
In-vitro-Kostimulationsanalyse: peptidspezifisches
Signal
-
Die
erholten OVA- oder CAP-M8-T-Zellen (Responder) wurden mit 5·104/Well in 96-Well-Platten mit flachen Böden zugegeben.
Die Stimulatorzellen bestanden aus DC, die entweder nicht infiziert
wurden oder mit V-WT, rV-137-1 oder rV-TRICOM infiziert und bestrahlt (20 Gy)
wurden. Die Zellen in allen Wells wurden in einem Gesamtvolumen
von 200 μl
CM kultiviert. Der Kostimulations-Assay wurde unter Verwendung von
zwei Sätzen
von Bedingungen ausgeführt:
(1) ein festes Verhältnis
von 10:1 von Responder:Stimulator-Zellen, die in Anwesenheit mehrerer
Konzentrationen eines spezifischen Peptids oder eines geeigneten
Kontrollpeptids kultiviert wurden, oder (2) eine feste Konzentration
eines spezifischen Peptids oder eines Kontrollpeptids, das bei verschiedenen
Responder:Stimulator-Zellen-Verhältnissen
kultiviert wurde. Die Zellen wurden wie zuvor 72 h kultiviert, für die letzten
12–18
h der Inkubation mit 1 μCi/Well
mit 3H-Thymidin markiert, geerntet und analysiert.
-
CTL-Induktion in vivo und
zytotoxische Analyse
-
DC
(1·106), die entweder nicht infiziert waren oder
mit V-WT oder rV-TRICOM infiziert waren, wurden zweimal in Opti-Mem
gewaschen und in 1 ml desselben Mediums, das 10 μM entweder OVA- oder CAP-M8-Peptide
enthielt, resuspendiert. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C wurden
die Zellen zweimal in HBSS gewaschen und in HBSS für die Injektionen
resuspendiert. Peptidgepulste DC (1·105 Zellen/Maus)
wurden 1–3-mal
intravenös
in 7-Tage-Intervallen injiziert. Kontrollmäuse wurden subkutan mit 100 μg angegebenem Peptid
in Ribi/Detox-Adjuvans (Ribi ImmunoChem Research, Hamilton, MT)
immunisiert. Vierzehn Tage nach der letzten Inokulation wurden die
Milzen von zwei Tieren pro Gruppe entnommen, in Einzellensuspensionen dispergiert,
gemischt und mit 10 μg/ml
eines geeigneten Peptids sechs Tage koinkubiert. Die Masse der Lymphozyten
wurden durch Zentrifugation durch einen Dichtegradienten (LSM, Organon
Teknika, West Chester, PA) entfernt. Wie zuvor45 wurden
EL-4-Zellen unter Verwendung von 111In zur
Verwendung als Ziele in einem Standardzytolyse-Assay vorbereitet.
Die Zielzellen wurden 1 Stunde bei 37 °C mit 10 μM spezifischem Peptid gepulst,
während
eine zweite Gruppe von Zielzellen mit Kontrollpeptid gepulst wurden.
-
Lymphozyten
und peptidgepulste Ziele (5·103 Zellen/Well) wurden in CM suspendiert,
in Effektor:Ziel-Verhältnissen
von 80:1 bis 10:1 in 96-Well-Platten mit U-Boden (Costar) kombiniert und 5 h bei
37 °C mit
5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden überstehende
Flüssigkeiten
unter Verwendung eines Supernatant Collection Systems (Skantron,
Sterling, VA) gesammelt und wurde unter Verwendung eines Gammazählers (Cobra
Autogamma, Packard, Downers Grove, 1L) die Radioaktivität quantifiziert.
Der Prozentsatz spezifischer Freisetzung von 111In
wurde durch die Standardgleichung: % spezifische Lyse = [(experimentell spontan)/(maximal
spontan)]·100
bestimmt. Wo angegeben, wurde die CTL-Aktivität, wie von Wunderlich, u. a.,
1994 beschrieben in Lyse-Einheiten (LU) umgewandelt.
-
Anti-Impfpocken-Antikörperanalyse
-
V-WT
wurde mit 5·105/Well zu Polyvinylchloridplatten (Dynatech,
Chantilly, VA) zugegeben, über
Nacht bei 37 °C
getrocknet und mit 5 % BSA blockiert. Abgestufte Verdünnungen
von Seren von immunisierten Mäusen
wurden dreifach zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden
gewaschen und eine weitere Stunde mit mit Peroxidase markiertem
Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg,
MD) inkubiert. Die Wells wurden mit o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma,
St. Louis, MO) entwickelt und die H2O2-Reaktionen
wurden mit H2SO4 angehalten.
Die Extinktion jeder Well wurde bei 405 nm unter Verwendung eines
Mikroplatten-ELISA-Lesers Bio-Tek EL312e (Winooski, VT) gelesen.
-
Ergebnisse
-
Erhöhte Expression kostimulatorischer
Moleküle
an DC
-
Um
die Effizienz der Pockenvirusinfektion von DC zu bestimmen, wurden
diese Zellen entweder mit einem rV-Virus, das B7-1, ICAM-1 und LFA-3
codiert (als rV-TRICOM
bezeichnet), oder mit einem rF-Virus, das B7-1, ICAM-1, LFA-1 und
menschliches carcinoembryonales Antigen (CEA) codiert (als rF-CEA/TRICOM), infiziert.
Im letzteren Fall wurde das CEA als ein Reporter-Gen verwendet,
da Geflügelpocken-Strukturproteine nicht
in infizierten Zellen exprimiert werden. Nach 18 h wurden die Zellen
auf die Expression von der besonderen Virusinfektion zugeordneten
Zellenoberflächenmarkern
analysiert. Nicht infizierte Kontroll-DC exprimierten CD11b (97
%) und waren negativ für
die Expression von Impfpockenproteinen. Nach der Infektion mit rV-TRICOM
koexprimierten 94 % DC sowohl CD11b als auch Impfpockenproteine.
Mit rF-CEA/TRICOM infizierte DC koexprimierten sowohl CD11b als
auch CEA (87 %). Wie durch polyklonale Hasen-Anti-Geflügelpocken-Seren
(Daten nicht gezeigt) erfasst wurde, exprimierten diese DC keine
Geflügelpockenproteine,
was in Übereinstimmung
mit Berichten steht, die besagen, dass sich Geflügelpocken in Säugetierzellen
nicht fortpflanzen. Zusammengenommen geben diese Daten an, dass
DC sowohl durch rV- als
auch durch rF-Vektoren effizient infiziert werden.
-
Die
Haupteigenschaften von DC sind hohe Expressionsniveaus sowohl von
Histokompatibilitätsantigenen
als auch von kostimulatorischen Molekülen. Um den Phänotyp der
DC nach der Virusinfektion weiter zu charakterisieren, wurden die
Zellen mit Impfpockenvirus vom Wildtyp (V-WT), rV-B7-1, rV-TRICOM,
mit Geflügelpocken
vom Wildtyp (FP-WT) oder mit rF-TRICOM infiziert und auf die Expression
von Zellenoberflächenmarkern,
die dem DC-Phänotyp
zugeordnet sind, analysiert (Tabelle 4). Wie erwartet, exprimierten
nicht infizierte und scheininfizierte DC hohe Niveaus von MHC-Klasse-I-
und MHC-Klasse-II-, CD11b-, B7-2-
und CD40-Molekülen
sowie hohe Niveaus von B7-1, ICAM-1 und LFA-3. Mit V-WT infizierte DC
exprimierten (wie durch MFI bestimmt wurde) niedrigere Zelloberflächendichten
mehrerer Moleküle,
während
mit rV-B7-1 infizierte DC 5-mal mehr B7-1 als nicht infizierte DC
(MFI von 329 auf 1689) exprimierten. Die Infektion von DC mit rV-TRICOM
erhöhte
wesentlich die MFI und den Prozentsatz der Zellen, die positiv für B7-1,
ICAM-1 und LFA-3 sind. Mit FP-WT infizierte DC hatten ein ähnliches
Phänotypprofil
wie die nicht infizierten DC. Die Infektion von DC mit rF-TRICOM
erhöhte
ebenfalls wesentlich die MF1 und den Prozentsatz der Zellen, die
positiv für
B7-1, ICAM-1 und LFA-3 waren. Alle DC-Populationen blieben sowohl
vor als auch nach der Infektion mit rF- oder N-Vektoren negativ
für T-Zellen-
(CD3-), B-Zellen- (CD19-), Monozyten-/Neutrophile-Granylozyten(CD14-)
und NK-Zellen- (Pan NK-)Marker (Tabelle 4).
-
-
Mit TRICOM-Vektoren infizierte DC zeigen
eine verbesserte Fähigkeit
zum Stimulieren naiver T-Zellen
-
Es
wurde ein In-vitro-Modell verwendet, um zu analysieren, wie erhöhte Niveaus
der B7-1-, ICAM-1- und LFA-3-Expression eine naive T-Zellen-Proliferation
induzieren helfen. In diesem Modell wurde das erste Signal für die T-Zellen-Aktivierung über ein
pharmakologisches Reagens (Con A) geliefert und wurde das zusätzliche
oder kostimulatorische Signal an die T-Zelle über DC oder DC, die infolge
Infektion mit rekombinantem Pockenvirus höhere Niveaus von TRICOM exprimieren,
geliefert. In diesen und in allen nachfolgenden hier berichteten
Untersuchungen wurden V-WT und FP-WT ebenfalls verwendet, um Effekte
wegen des Vektors allein auszuschließen. Wie in 36A gezeigt ist, induzierten sowohl nicht infizierte
als auch scheininfizierte DC eine Proliferation der T-Zellen. Mit
V-WT infizierte DC (mit DC/V-TRICOM bezeichnet) induzierten weniger T-Zellen-Proliferation
als nicht infizierte DC. Die Lieferung zusätzlicher kostimulatorischer
Signale über
mit rV-B7-1 infizierte DC (als DC/rV-B7-1 bezeichnet) erhöhte die
Proliferation im Vergleich zu nicht infizierten DC. Allerdings induzierten
mit rV-TRICOM infizierte
DC (als DC/rV-TRICOM bezeichnet) bei allen Konzentrationen von Con
A weitere Zunahmen der T-Zellen-Proliferation. Außerdem war
dann, wenn T-Zellen mit DC/rV-TRICOM stimuliert wurden, 28-mal weniger
Con A notwendig, um eine Proliferation auf Niveaus zu induzieren,
die mit denen nicht infizierter DC vergleichbar waren. Wenn diese
Experimente unter Verwendung von Geflügelpockenvektoren wiederholt
wurden, induzierten DC/rF-TRICOM anders als DC oder DC/rF-B7-1 bei
allen Konzentrationen von Con A Zunahmen der T-Zellen-Proliferation (36).
Diese Experimente wurden 4-mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
-
Verbesserte allostimulatorische Aktivität durch
mit TRICOM-Vektoren infizierte DC
-
Die
Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion (37A,
C, E) oder einer rF-TRICOM-Infektion
(37B, D, E) auf die DC-Stimulationsfähigkeit
wurde in einer allospezifischen Reaktion mit gemischten Lymphozyten beurteilt.
Sowohl nicht infizierte DC-Populationen als auch scheininfizierte
DC-Populationen induzierten eine starke Proliferation (78.000 CPM)
allogenetischer T-Zellen (37A,
B). Die Stimulationsfähigkeit
von DC wurde nach der Infektion mit rV-B7-1 erhöht (37C).
Die Infektion von DC mit rV-TRICOM erhöhte bei allen DC/Responder-Verhältnissen
die Stimulationsfähigkeit
gegenüber
DC und DC/rV-B7-1 (37C).
-
Wichtig
ist, dass mit rV-TRICOM-Vektoren infizierte DC-Populationen keine
synergistischen T-Zellen stimulierten (37E).
Wenn diese Experimente unter Verwendung von Geflügelpockenvektoren wiederholt wurden
(37B, D), induzierten DC/rF-TRICOM größere Zunahmen
der allogenetischen T-Zellen-Proliferation
als DC und DC/rF-B7-1, während
DC/rF-TRICOM keine synergistischen T-Zellen stimulierten (37F). Diese Experimente wurden 3-mal mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt.
-
In-vitro-Kostimulationsanalyse: Präsentation
von Peptiden an Effektor-T-Zellen
-
Es
wurden Untersuchungen unternommen, um zu bestimmen, ob die Stimulationsfähigkeit
peptidgepulster DC durch Infektion der DC mit rV-TRICOM verbessert
werden könnte.
Zu diesem Zweck wurden das H-2Kb-beschränkte OVA-Peptid (Ovalbumin257-264, SIINFEKL) und eine DVA-spezifische
CD8+-Effektor-T-Zelllinie verwendet. Die DC wurden verschiedenen
Konzentrationen von OVA-Peptid
ausgesetzt und in Anwesenheit der OVA-T-Zelllinie inkubiert (38A–38F). Die herkömmlichen
(d. h. nicht infizierten) DC induzierten, wenn sie mit dem OVA-Peptid
inkubiert wurden, eine starke Proliferation DVA-spezifischer T-Zellen (38A). Diese DC induzierten keine Proliferation
DVA-spezifischer T-Zellen, wenn sie mit dem Kontrollpeptid VSVN
(Gingivostomatitis-Virus N52-59 RGYVYQGL)
inkubiert wurden (38A, Leerquadrate). DC/rV-B7-1 erhöhte die
gesamte peptidspezifische Proliferation dieser Zellen 1,8-fach (38C). Außerdem
induzierte DC/rV-B7-1 in Anwesenheit von 4-mal weniger Peptid eine ähnliche
Proliferation wie nicht infizierte oder scheininfizierte DC. Im
Gegensatz dazu erhöhte
DC/rV-TRICOM die Gesamtproliferation dieser T-Zellen mehrfach und
induzierte in Anwesenheit von 32-mal weniger OVA-Peptid eine Proliferation,
die mit der nicht infizierter DC vergleichbar ist (38C). Um die Fähigkeit
mit Impfpocken infizierter DC zur Präsentation von Peptid weiter
zu bewerten, wurden die DC mit einer einzigen Konzentration OVA-Peptid
(1 μM) gepulst
und in Anwesenheit mehrerer Verhältnisse
von T-Zellen inkubiert (38E).
Auf Zellenbasis war 4-mal weniger DC/rV-B7-1 erforderlich, um Proliferationsniveaus
zu induzieren, die mit denen von DC vergleichbar waren (Leerdreiecke
gegenüber
Volldreiecken). Die höchste
stimulatorische Wirkung war die von DC/rV-TRICOM, das mit 32-mal
weniger Zellen Proliferationsniveaus induzierte, die mit denen von
DC vergleichbar waren (Leerkreise gegenüber Vollkreisen).
-
Ein
zweites Peptidsystem, das peptidgepulste DC und eine bestehende
T-Zelllinie nutzt, wurden genutzt, um zu bestimmen, ob ähnliche
Ergebnisse wie die mit dem OVA-Peptid erhaltenen festgestellt werden könnten. Diese
Experimente wurden unter Verwendung des H-2Db-beschränkten Peptids
CAP-M8 (CEA526-533, EAQNTTYL) und einer
CAP-M8-spezifischen CD8+-Effektor-T-Zelllinie
durchgeführt;
es wurden ähnliche
Ergebnisse festgestellt (38B,
D, F). Diese Experimente wurden 5 weitere Male mit den gleichen
Ergebnissen wiederholt.
-
Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion auf
TFN-α- oder
CD40-gereifte DC
-
Da
angenommen wird, dass die funktionale Reifung von DC mit der Aufwärtsregulierung
T-Zellen-kostimulatorischer Moleküle korreliert, wurden Experimente
durchgeführt,
um die Wirkung einer rV-TRICOM-Infektion auf DC zu untersuchen,
die durch Kokultur entweder mit TFN-α oder mit CD40 mAb gereift worden
sind. Wie durch Durchflusszytometrieanalyse bestimmt wird (Tabelle
5), führte
die Behandlung von DC mit TFN-α während der
letzten 24 h der Kultur zu einer gewissen Aufwärtsregulierung von MHC-II,
B7-2 und ICAM-1, während
die Behandlung von DC mit CD40 mAb zur Aufwärtsregulierung der ICAM-1-Expression
und zu einer geringfügigen
Aufwärtsregulierung
von MHC-II führte.
Funktional gipfelte die Behandlung von DC mit TFN-α oder mit
CD40 mAb in einer 28 %igen bzw. 16 %igen Zunahme der peptidspezifischen
Proliferation gegenüber unmanipulierten
DC (39A). Ähnliche Daten wurden auch nach
der Behandlung von DC mit Lipopolysaccharid (LPS) erhalten. Die
Infektion unbehandelter DC mit rV-TRICOM führte zu einer wesentlichen
Zunahme der T-Zellen-Proliferation (39A gegenüber 39B). Eine Vorbehandlung mit TFN-α oder mit
CD40 mAb, gefolgt von einer Infektion mit rV-TRICOM, verlieh dagegen
nur eine geringfügigen
Stimulationsfähigkeit
gegenüber
der, die mit einer rV-TRICOM-Infektion allein zu sehen war (39B). Diese Experimente wurden 3 weitere Male
mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt.
-
-
W-TRICOM infizierte DC sind effizienter
beim Vorbehandeln von CTL-Reaktionen in vivo
-
Es
wurden Experimente durchgeführt,
um zu bestimmen, ob sich die verbesserte Stimulationsfähigkeit von
DC/rV-TRICOM, die in vitro unter Verwendung von Con A (36E–F),
Reaktionen mit gemischten Lymphozyten (37)
und Zwei-Effektor-T-Zellen-Modellen
(38) festgestellt wurde, in eine verbesserte
Wirksamkeit bei der Vorbehandlung naiver T-Zellen-Reaktionen in
vivo umsetzen würde.
Zu diesem Zweck wurden DC, DC/V-WT und DC/rV-TRICOM mit 10 μM OVA-Peptid
gepulst und intravenös
an C57BL/6-Mäuse
verabreicht. Kontrollmäuse
wurden subkutan mit OVA-Peptid in Ribi/Detox-Adjuvans immunisiert.
14 Tage nach der Impfung wurden Splenozyten geerntet, 6 Tage in
vitro restimuliert und auf ihre peptidspezifische Lysefähigkeit gegenüber OVA-gepulsten
EL-4-Zellen beurteilt.
Als Kontrollzielzellen wurden mit VSVN-Peptid gepulste EL-4-Zellen verwendet.
Wie in 40A zu sehen ist, zeigten CTL,
die von Mäusen
erzeugt wurden, die mit Peptid/Adjuvans immunisiert wurden, mäßige Niveaus
einer CTL-Aktivität
(40A). Mäuse,
die mit peptidgepulsten DC immunisiert wurden, zeigten eine größere peptidspezifische
CTL-Reaktion (40B). In Mäusen, die mit DC/v-WT immunisiert
wurden (40C, < 2,5 Lyseeinheiten (LU) gegenüber 5,2
LU), war die induzierte CTL-Reaktion etwas beschränkt. Im
Gegensatz dazu zeigten Mäuse,
die mit peptidgepulsten DC/rV-TRICOM immunisiert wurden (40D), eine CTL-Reaktion, die wesentlich stärker als
die von DC war (LU = 14,3, p = 0,001). Daraufhin wurden ähnliche
Experimente unter Verwendung eines zweiten Modellpeptids, des CEA-Peptids
CAP-M8, durchgeführt
(40E–H).
Peptidgepulste DC riefen erneut eine viel stärkere CTL-Aktivität als jene,
die durch Peptid/Adjuvans abgeleitet wurden, hervor (5,7 LU gegenüber < 2,5 LU). Außerdem zeigten
Mäuse,
die mit peptidgepulsten DC/rV-TRICOM (40H)
immunisiert waren, eine starke CTL-Reaktion (> 20 LU) im Vergleich zu der durch peptidgepulste
DC (5,7 LU, p = < 0,001; 40F) induzierten.
-
Wirksamkeit mehrfach vektorinfizierter
DC-Impfungen
-
Allgemein
wird angenommen, dass die Erzeugung von Anti-Impfpocken-Antikörpern die
wiederholte Verwendung eines Impfpockenvirus als Immunogen verhindern
kann. Dagegen ist über
die wiederholte Verwendung von mit Impfpocken infizierten Zellen
als Immunogen wenig bekannt. Um dieses Problem zu behandeln, wurde
ein Immunisierungsschema ausgeführt,
in dem ein-, zwei- oder dreimal in 7-Tage-Intervallen CAP-M8-peptidgepulste
DC-Immunogene verabreicht wurden. Wie zuvor wurden 14 Tage nach
der letzten Immunisierung Splenozyten geerntet, in vitro 6 Tage
restimuliert und auf ihre peptidspezifische Lysefähigkeit
gegen CAP-M8-gepulste EL-4-Zellen beurteilt. Wie in 41A zu sehen ist, induzierten peptidgepulste DC/rV-TRICOM
im Vergleich zu peptidgepulsten DC höhere Niveaus der CTL-Aktivität. Diese
Daten sind ähnlich
jenen, die in 40E–H zu sehen sind. Wie durch
qualitative ELISA bestimmt wurde, induzierte diese Einzelverabreichung
von DC/V-WT oder DC/rV-TRICOM wesentliche Anti-Impfpocken-IgG-Antikörpertiter
mit Werten im Bereich von 1:4.000 bis 1:9.000. Allerdings hatten
diese Titer keine Wirkung auf die Fähigkeit dieser Immunogene zum
Beschleunigen der CTL-Aktivität
auf nachfolgende Immunisierungen (41B und 41C). Während
Anti-Impfpocken-Virustiter nach der zweiten Impfung im Bereich von
1:12.000 bis 1:50.000 lagen, war in allen Gruppen eine Beschleunigung
der Induktion peptidspezifischer CTL zu sehen. Die unter Nutzung
DC/rV-TRICOM-gepulster Zellen beobachtete CTL-Aktivität war wieder
größer als
die mit Peptid gepulsten DC beobachtete.
-
Beispiel 32
-
Mit TRICOM-Vektoren infizierte
Splenozyten oder Knochenmark-Vorläuferzellen induzieren eine
mit den Dendritenzellen vergleichbare T-Zellen-Aktivierung
-
Materialien und Verfahren
-
Erzeugung von Knochenmark-Vorläuferzellen-
und Dendritenzellenkulturen.
-
Die
zur Erzeugung von von Knochenmark abgeleiteten DC verwendete Prozedur
war mit kleinen Änderungen
die von Inaba u. a. beschriebene. Kurz gesagt, wurden von 6–8 Wochen
alten weiblichen C57BL/6-Mäusen
(Taconic Farms, Germantown, NY) die Oberschenkelknochen entnommen,
wobei das Knochenmark gespült
und über
einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geleitet wurde. Die Knochenmarkzellen
wurden unter Verwendung eines für
CD4, CD8 und die MHC-Klasse
II spezifischen Magnetperlencocktails (MiniMACS, Miltenyi Biotec,
Auburn, CA) von Lymphozyten und Ia+-Zellen
geleert. Diese als Dendritenzellenvorläufer bezeichneten geleerten
Knochenmarkzellen wurden daraufhin für die Infektion vorbereitet
oder es wurden geleerte Knochenmarkzellen für Dendritenzellen kulturen in
Sechs-Well-Kulturplatten (106 Zellen/ml, 5 ml/Well) in CM, ergänzt mit
10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) plattiert.
An den Tagen 2 und 4 wurden die DC-Kulturen in mit frischem Cytokin
ergänzten
CM replattiert und an Tag 4 in neue Platten aufgeteilt. An Tag 7
der Kultur wurden Zellen für
die Analyse, In-vitro-Assays und In-vivo-Immunisierungen geerntet.
-
Erzeugung von Splenozytenstimulatorzellen.
-
Es
wurden die Milzen von naiven weiblichen C57BL/6-Mäusen geerntet,
zu einer Einzelzellensuspension zerdrückt und über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten
geleitet. Die Splenozyten wurden unter Verwendung eines für CD90 und
für die
MHC-Klasse II spezifischen Magnetperlencocktails von Lymphozyten
und Ia+-Zellen geleert.
Die gereinigten Splenozyten wurden daraufhin zweimal mit Opti-Mem (Gibco-BRL) gewaschen
und für die
Infektion mit den rekombinanten Pockenviren vorbereitet.
-
Infektion von Stimulatorzellen.
-
Von
Knochenmark abgeleitete Dendritenzellenvorläuferzellen und Splenozytenzellen
wurden zweimal mit Opti-Mem gewaschen und entweder scheininfiziert
oder mit 25 MOI V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM oder 50 MOI FP-WT, rF-B7-1
oder mit rF-TRICOM bei 25 MOI (Infektionsmultiplizität, PFU/Zelle)
in 1 ml Endvolumen Opti-Mem 5 Stunden infiziert. Nach der Infektion
wurde warmes (37 Grad) CM zugegeben und wurden die Zellen bei 37 °C über Nacht
inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen für die immunhistochemische
Färbung, In-vitro-Kostimulationsanalyse
und In-vivo-Verabreichung geerntet.
-
Kostimulationsanalyse
-
Die
erholten CAP-M8-T-Zellen (Responder) wurden mit 5·104/Well in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden (Costar,
Cambridge, MA) zugegeben. Die Stimulatorzellen bestanden aus BMDC,
Splenozyten oder Knochenmarkvorläufern,
die entweder nicht infiziert, scheininfiziert oder entweder mit
V-WT, rV-B7-1, rV-TRICOM,
FP-WT oder mit rF-TRICOM infiziert und bestrahlt (20 Gy) wurden.
Die Zellen in den Wells wurden in einem Gesamtvolumen von 200 ml
CM kultiviert. Der Kostimulations-Assay wurde unter Verwendung von
zwei Sätzen
von Bedingungen ausgeführt:
a) festes Verhältnis
von Responder:Stimulator-Zellen von 2,5:1 für Nicht-BMDC-Stimulatoren und
von 10:1 für
BMDC, in Anwesenheit mehrerer Konzentrationen von Con-A als Signal
eins, eines spezifischen Peptids oder eines geeigneten Kontrollpeptids
kultiviert, oder b) eine feste Konzentration von Con-A als Signal
eins, spezifisches Peptid oder Kontrollpeptid, in verschiedenen
Responder:Stimulator-Zellen-Verhältnissen
kultiviert. Die Zellen wurden für
Con-A und für
peptidspezifische Assays 48 bzw. 72 Stunden kultiviert und für die letzten
12–18
Stunden der Inkubation mit 1 mCi/Well 3H-Thymidin
markiert, geerntet und wie oben beschrieben analysiert.
-
Tabelle
6 zeigt die Splenozyten- und Knochenmark- (BM-) Zellenoberflächenexpression
kostimulatorischer Moleküle
nach der Infektion mit rekombinanten Vektoren. Gereinigte Rattensplenozyten
oder -knochenmarkzellen wurden 5 Stunden mit 25 MOI Impfpockenvektoren
oder mit 50 MOI Geflügelpockenvektoren
infiziert. Der Zellenphänotyp
wurde mit dem der DC verglichen. Alle Zellen wurden mit für die kostimulatorischen Moleküle spezifischen
mAbs, die mit Fluoresceinisothiocyanat, Phycoerythrin oder Biotin/Streptavidin-Cychrom
markiert worden sind, immunhistochemisch gefärbt. Die Isotypkontrolle war
negativ (Daten nicht gezeigt). Die Zahlen geben die Prozent positiver
Zellen und die mittlere Fluoreszenz-Intensität in Klammern an.
-
-
-
Die 42A bis 46 veranschaulichen,
dass TRICOM-infizierte Splenozyten in Bezug auf die Stimulation
von T-Zellen-Reaktionen mit TRICOM-infizierten Knochenmarkzellen
vergleichbar sind.
-
Beispiel 33
-
Stimulation menschlicher T-Zellen unter
Verwendung allogenetischer, mit rF-TRICOM infizierter menschlicher Dendritenzellen,
die mit Peptiden gepulst sind
-
Menschliche
Dendritenzellen wurden durch Leukophorese für eine normale gesunde Person
isoliert. Die menschlichen Dendritenzellen wurden 6–9 Tage
in Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 kultiviert, gefolgt von der Zugabe
von rF-TRICOM oder
rF-Kontrollen für
die Infektion der Dendritenzellen. Die rF-TRICOM-infizierten Dendritenzellen wurden 1
Stunde mit einem CEA-Peptid (CAP-1 oder CAP I, 6D) (
47); mit einem PSA-Peptid (PSA-3) (
48); mit einem Influenzapeptid (Flu-Peptid 58-66)
(
49 und
50);
oder mit einem HPV-Peptid (11-20) gepulst (
51–
45). Aus einkernigen Zellen von peripherem
Blut (PBMC) isolierte menschliche T-Zellen wurden in Anwesenheit
peptidgepulster rF-TRICOM-infizierter Dendritenzellen kultiviert und
es wurde die Erzeugung von IFN-α durch
die T-Zellen bestimmt. Die
47–
54 zeigen,
dass peptidgepulste rF-TRICOM-infizierte
menschliche Dendritenzellen T-Zellen in einem größeren Umfang als die Kontrollen
stimulierten. Die
47–
54 sowie
Tabelle 7 veranschaulichen, dass mit rF-TRICOM infizierte allogenetische
menschliche Dendritenzellen für
die Verbesserung einer Immunreaktion irgendein Antigenpeptid effizient
an T-Zellen präsentieren
können. Tabelle 7 CTL-Aktivität von T-Zelllinien unter Verwendung
mit HPV-E7(11-20-)peptidgepulster DC
Ziel | T-Zelllinien
hergestellt unter Verwendung von: |
| A | | B |
rF-Tricom
+ P | rF-B7.1
+ P | rF-FPV
+ P | DC
+ P |
C1R-A2
+ HPV | 39,6
(3,1) | 24,7
(0,4) | 19,9
(2,9) | 7,3
(0,4) |
C1R-A2 | 5,1
(2,0) | 6,9
(4,0) | 7,6
(2,0) | 8,0
(0,2) |
E:T-Verhältnis
= 25:1
-
Es
wurde ein 6-Stunden-111-In-Freisetzungs-Assay ausgeführt. Die
C1R-A2-Zellen wurden bei einer Konzentration von 10 μg/ml mit
HPV-E7-Peptid (11-20) YMDLQPETT gepulst.
-
Die
in Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse veranschaulichen, dass mit
rF-TRICOM infizierte DC (A) als APC zum Erzeugen von CTL besser
als Standard-DC (B) sind, wenn beide mit Peptid gepulst werden.
-
Beispiel 34
-
Klinische Menschenstudien eines rV-huTRICOM-,
rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffs und rF-CEA-TRICOM
-
Das
Ziel der klinischen Menschenstudie ist die Bestimmung der optimalen
tolerierten Dosis (OTD) des rekombinanten rV-huTRICOM- und rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffs, der eine
Wirts-Antitumor-Immunreaktion hervorruft und in Patienten mit fortgeschrittenen
CEA-exprimierenden Adenokarzinomen einer akzeptablen Toxizität zugeordnet
ist.
-
Die
rV-huTRICOM- und rV-CEA-huTRICOM-Impfstoffe werden unter den für Klinische
Menschenstudien der Phase I und der Phase II geeigneten Bedingungen
hergestellt.
-
In
einer Anfangsstudie werden eskalierende Dosen rekombinanter rV-
oder rF-CEA-huTRICOM-Lebendvirus-Impfstoff
oder rV-huTRICOM- plus rV-CEA-Impfstoff mit einer Anfangsdosis von
106 PFU Virus IM, worauf eine Dosis 107 PFU Virus IM folgt, auf die später 108 PFU Virus oder 109 SC
oder durch Hautritzung folgen, gegeben.
-
Die
Antitumorreaktion jedes rekombinanten Impfstoffs wird unter Verwendung
der klinischen, Labor- und radiologischen Beweisstücke der
Tumorgröße, des
Tumorumfangs und des Tumorwachstums unter Verwendung akzeptierter
Standardkriterien für
die Messung der Reaktion von Tumoren auf neue Therapieformen, wie
sie im Gebiet bekannt sind, bestimmt.
-
Die
Immunrektion des Patienten auf den rekombinanten Impfstoff wird
unter Verwendung einer Vielzahl immunologischer Assays einschließlich Anti-CEA-Antikörper-Assay,
Anti-Pockenvirus-Antikörper-Assay, Immunkomplex-Assay,
CEA-spezifische lymphoproliferative Assays, CEA-spezifischer zytotoxischer
T-Lymphozyten-Assays,
der Vorläuferhäufigkeit
CEA-reaktiver T-Zellen im Gamma-Interferon-Freisetzungs-T-Zellen-Assay,
einem ELISPOT, Fast Immune, Tetramer-Assays für T-Zellen-Reaktionen (Scheibenhogen,
u. a., Int. J. Cancer 71:932–936,
1997), HLA-Proben und dergleichen beurteilt. Um die Entwicklung
humoraler und zellularer Immunrektionen, die gegen das CEA-Tumorantigen
gerichtet sind, zu dokumentieren, wurde ein Vergleich der Proben
vor der Behandlung und nach der Behandlung vorgenommen.
-
Beispiel 35
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Klinische Menschenstudien
eines rekombinanten Geflügelpocken-CEA-huTRICOM
-
In
einer Anfangsstudie werden eskalierende Dosen eines rekombinanten
Geflügelpocken-CEA-huTRICOM-Impfstoffs
von 106 PFU Virus, 107 PFU
Virus und 108 PFU Virus direkt in eine Tumormasse
eines Patienten mit fortgeschrittenen CEA-exprimierenden Adenokarzinomen
injiziert.
-
Die
spezifische Antitumor- und Immunreaktion auf den rekombinanten Impfstoff
wird wie in Beispiel 34 beschrieben bestimmt.
-
Beispiel 36
-
Klinische Menschenstudie von T-Lymphozyten,
die durch mehrere kostimulatorische Moleküle überexprimierende Dendritenzellen
aktiviert werden
-
Von
einem Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs werden Lymphozyten
und Dendritenzellen von peripherem Blut erhalten. Die Lymphozyten
des peripheren Bluts werden für
CD8+-Lymphozyten angereichert. Die Dendritenzellen
werden für
eine Zeitdauer, die ausreicht, die Expression des PSA-Epitops und
die Überexpression
der mehreren kostimulatorischen Moleküle zuzulassen, mit dem rV-PSA-Epitop
QVHPQKVTK/B7.1/ICAM-1/LFA-3 infiziert. Die PSA-Epitopspezifischen
CD8+-Lymphozyten werden in Anwesenheit dieser
behandelten Dendritenzellen aktiviert und expandiert. Die aktivierten
PSA-Epitop-spezifischen autogenen CD8+-T-Lymphozyten
werden allein und in Kombination mit dem PSA-Epitop in den Patienten injiziert. Die
spezifische Antitumor- und PSA-spezifische Immunreaktion auf die
Behandlung wird durch Verfahren bestimmt, die mit den in Beispiel
34 beschriebenen vergleichbar sind.
-
Für die Behandlung
von Patienten mit anderen TAA-exprimierenden Krebsen können durch
Ersatz des Gens, das CEA codiert, durch ein Gen, das ein anderes
TAA codiert, in dem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung ähnliche
Klinische Menschenstudien durchgeführt werden.
-
Beispiel 37
-
Selektion für Immunität hervorrufende Peptide und/oder
menschliche T-Zellen, die mit einem spezifischen Peptid immunreaktiv
sind, unter Verwendung mit rF-TRICOM infizierter DC
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst antineoplastische Therapien unter
Verwendung der Ex-vivo-Manipulation von DC mit Virusvektoren, die
ein tumorassoziiertes Antigen tragen, zur Aktivierung tumorspezifischer CTL.
Mit rF-CEA infizierte DC in Kombination mit kostimulatorischen TRICOM-Molekülen werden
verwendet, um CEA-spezifische Immunreaktionen zu verstärken. Es
wird die CTL-Induktionsfähigkeit
von mit rF-CEA/TRICOM und mit rF-TRICOM infizierten DC bewertet.
Zur Visualisierung CAP-1-spezifischer CTL werden tetramere MHC,
Klasse I, CAP-1-Komplex,
verwendet. Dieses Protokoll ist nicht auf das tumorassoziierte Antigen, CEA,
beschränkt,
sondern kann geändert
werden, um antigenspezifische Immunreaktionen für irgendein Antigenpeptid oder
ein Immunität
hervorrufendes Epitop davon für
die Immuntherapie gegen Krebs, pathogene Bakterien, Viren, Proto zoen,
Hefe und dergleichen hervorzurufen. Darüber hinaus kann das Verfahren
geändert
werden, um Immunität
hervorrufende Peptide von einer Quelle wie etwa natürlichem
Protein, rekombinantem Protein, synthetischem Protein oder Fragmente
von jedem, kombinatorische Bibliotheken und dergleichen zu selektieren
und zu identifizieren.
-
Materialien und Verfahren
-
Zellkulturen
-
Von
der American Type Culture Collection (Manassas, MD) wurden kolorektale
Karzinomzelllinien SW1463 (HLA-A1,2), 151 74 (HLA-A2,-) gekauft.
Die Kulturen waren mykoplasmafrei und wurden in einem Vollnährmedium
gehalten [DMEM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), ergänzt mit
10 % Fötusrinderserum,
2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin
(Life Technologies, Inc.)]. Die C1R-Zelllinie ist eine menschliche
Plasmaleukämiezellllinie,
die keine endogenen HLA-A- oder HLA-B-Antigene exprimiert (Storkus,
W. J., u. a., J. Immunol. 138(6):1657–1659, 1987). C1R-A2-Zellen
sind C1R-Zellen, die einen transfizierten Genomklon von HLA-A2.1
exprimieren (Hogan, K. T., u. a., J. Exp. Med. 168(2):725–736, 1988).
Diese Zellen wurden von Dr. William E. Biddison (National Institute
of Neurological Disorders and Stroke, NIH, Bethesda, MD) erhalten.
Die C1R-A2-Kultur war mykoplasmafrei und wurde in einem RPMI-1640-Vollnährmedium
(Life Technologies, Inc.) gehalten. Die V8T-Zelllinie, eine gegen
das CAP-1-Epitop gerichtete CTL-Linie, wurde von einem Patienten
mit metastatischem Dickdarmkarzinom hergestellt, der in eine Studie der
Phase I unter Verwendung von rV-CEA aufgenommen wurde (Tsang, K.
Y., u. a., Clin. Cancer Res. 3(12):2439–2449, 1997). Die V8T-Zellen
wurden in einem RPMI-1640-Vollnährmedium
kultiviert, das 10 % menschliches AB-Serum und IL-2 (bereitgestellt
vom National Cancer Institute, Surgery Branch, 20 Einheiten/ml)
enthielt. Die V8T-Zellen
wurden am Tag 16 nach der vorherigen Restimulation mit einem Effektorzellen/APC-Verhältnis von
1:3 mit CAP-1-Peptid (25 μg/ml)
restimuliert. Als APC wurden bestrahlte (23.000 Rad) autogene EBV-transformierte
B-Zellen verwendet.
-
Kultur von DC von einkernigen
Zellen von peripherem Blut
-
Von
mit Heparin behandeltem Blut von einem Patienten (Nr. 15) mit metastatischem
Beckenkarzinom, der in eine Studie der Phase I unter Verwendung
einer Kombination von rV-CEA und ALVAC-CEA aufgenommen wurde, wurden
einkernige Zellen von peripherem Blut (PBMC) erhalten. Alle Experimente,
die Patientenmaterialien umfassten, wurden gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt, und
es wurde von allen Personen die schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
Die PBMC wurden unter Verwendung eines Lymphozytentrennungsmedium-Gradienten (Organon
Teknika, Durham, NC) wie zuvor beschrieben (Boyum, A., Scand J Clin Lab
Invest Suppl. 97:51–76,
1968) abgetrennt. Die DC wurden unter Verwendung einer Modifikation
der von Sallusto u. a. beschriebenen Prozedur (Sallusto, F., u.
a., J. Exp. Med. 179(4):1109–1118,
1994) vorbereitet. Die PBMC (1,5·108)
wurden in einem AIM-V-Medium, das 2 mM Glutamin, 50 μg/ml Streptomycin,
10 μg/ml Gentamyzin
enthielt (Life Technologies, Inc.), resuspendiert und an einer T-150-Flasche
(Corning Costar Corp., Cambridge, MA) haften gelassen. Nach 2 Stunden
bei 37 °C
wurden die nicht haftenden Zellen mit einem sanften Spülen entfernt.
Die haftenden Zellen wurden 6–7
Tage in einem AIM-V-Medium, das 50 ng/ml rekombinantes menschliches
GM-CSF (rhGM-CSF) und 0,5 ng/ml rekombinantes menschliches IL-4
(rhIL-4) enthielt, kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle drei
Tage aufgefüllt.
-
Rekombinantes Virus und Infektion von
DC mit dem Avipox-Virus, das CEA, CEA/TRICOM und TRICOM enthält
-
Wie
von Kaufman u. a. (Kaufman, F., u. a., Int. J. Cancer 48(6):900–907, 1991)
beschrieben wurde, wurde ein 2109 bp-DNA-Fragment erhalten, das
den gesamten offenen Leserahmen von CEA codiert. Das rekombinante
CEA-Avipox-Virus (Geflügelpocken-CEA;
vCP248) wurde unter Verwendung von Verfahren, die von Taylor (Taylor,
J., u. a., Virology 187(1):321–328,
1992), Cox u. a. (Cox, W. I., u. a., Virology 187(1):321–328, 1992)
und Perkus u. a. (Perkus., M. E., u. a., J. Virol. 63(9):3829–3836) beschrieben
wurden, von der Therion Corp geliefert. Das rekombinante Avipox-Virus,
das CEA und das menschliche Tricom-Gen (als rF-CEA-Tricom bezeichnet) und das rekombinante
menschliche Geflügelpocken-TRICOM (rF-Tricom)
codiert, wurden wie hier offenbart hergestellt. Als Negativkontrolle
wurden in ausgewählten
Experimenten Geflügelpocken
vom Wildtyp (FP-WT)
verwendet. DC (1·106) wurden bei 37 °C in 1 ml Optim-MEM-Medium (Life Technologies,
Inc.) mit rF-TRICOM, rF-CEA, rF-CEA/TRICOM, FP-WT inkubiert. Titrationsexperimente
gaben an, dass 2·107 plaquebildende Einheiten/ml gleich einer
Infektionsmultiplizität
(MOI) von 40:1 für
2 Stunden in näherungsweise
75 % der infizierten DC gleichbleibend eine Expression von CEA induzieren
konnten.
-
Die
infizierten DC wurden in 10 ml frischem, warmem RPMI-1640-Vollnährmedium,
das 50 ng/ml rhGM-CSF und 0,5 ng/ml rhIL-4 enthielt, suspendiert,
24 Stunden kultiviert und daraufhin nachfolgend als Stimulatoren
verwendet.
-
Peptid
-
CAP-1
(Tsang, K. Y., u. a., J. Natl Cancer Inst. 87(13):982–990, 1995),
CEA-Aminosäureposition 571–579 YLSGANLNL,
CAP-1-6D (Zaremba, S., u. a., Cancer Res. 57(20):4570–4577, 1997)
YLSGADLNL und Flu-Peptid, Influenzamatrix-Proteinpeptid 58-66 GILGFVTL, mehr als
96 % rein, wurden von Multiple Peptide System (San Diego, CA) hergestellt.
-
Erzeugung von T-Zelllinien
-
Die
von Tsang u. a. (Tsang, K. Y., u. a., J. Natl Cancer Inst. 87(13):982–990, 1995)
beschriebene Modifikation des Protokolls wurde verwendet, um CEA-spezifische
CTL zu erzeugen. Als APC wurden nicht infizierte DC und mit rF-TRICOM,
mit rF-CEA oder
mit rF-CEA/TRICOM infizierte DC verwendet. Zu den nicht infizierten
oder mit rF-TRICOM infizierten DC wurde CAP-1-Peptid mit einer Endkonzentration
von 25 μg/ml
zugegeben. Daraufhin wurden zu APC in einem APC/Effektor-Verhältnis von
1:10 autonome nicht haftende Zeilen zugegeben. Daraufhin wurden
die Kulturen in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt,
3 Tage bei 37 °C
inkubiert. Nach Entfernung des peptidhaltigen Mediums wurden die
Kulturen mit rekombinantem menschlichen IL-2 mit einer Konzentration
von 20 Einheiten/ml 7 Tage ergänzt,
wobei alle 3 Tage IL-2-haltiges Medium aufgefüllt wurde. Die 3-Tage-Inkubation mit
Peptid und die 7-Tage-IL-2-Ergänzung
bildeten einen IVS-Zyklus.
Am Tag 11 wurden die Primärkulturen
mit CAP-1-Peptid (25 μg/ml)
restimuliert, um den nächsten (VS-Zyklus
zu beginnen. Die bestrahlten (23.000 Rad) autogenen EBV-transformierten
B-Zellen wurden als APC verwendet. Abgesehen davon, dass in der
Stimulation kein CAP-1-Peptid war, wurde für die CTL-Erzeugung eine ähnliche
Prozedur genutzt, wenn als APC mit rF-CEA oder rF-CEA/TRICOM infizierte
DC verwendet wurden.
-
Konstruktion von Peptid-MHC-Tetrameren
-
Wie
von Altman u. a. (Altman, J. D., u. a., Science 274(5284):94–95, 1996)
beschrieben, wurden Peptid-MHC-Komplexe synthetisiert. Kurz gesagt,
wurde von Dr. Garboczi (Harvard University, Cambridge, MA) (Garboczi,
D. N., u. a., Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429–3433, 1992) der β2-Mikroglobulin-Klon
(β2M-Klon) erhalten und wurde von Immunotech
(Beckman-Coulter, Marseille, Frankreich) das HLA-A2-Konstrukt erhalten.
Die löslichen
HLA-A2-Moleküle,
die das 15-Aminosäuren-Substratpeptid
für die
BirA-abhängige
Biotinierung bis zu dem COOH-Therminus der HLA-A2-Schwerkette und
das β2M enthielten, wurden getrennt in E. coli gezüchtet und
als Einschlusskörper
isoliert. HLA-A2 und β2M wurden löslich gemacht und in Anwesenheit
von CAP-1- oder Flu-M1-58-66-Peptid
renaturiert. Der Komplex wurde durch FPLC an Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway,
NJ) gereinigt. Der gereinigte Peptid-MHC-Komplex wurde unter Verwendung
des BirA-Enzyms (Avidity, Denver, CO) biotiniert. Durch Mischen
des biotinierten Peptid-MHC-Komplexes mit mit Phycoerythrin markiertem
UltraAvidin (Leinco Technologies, Inc. Ballwin, MO) in einem Molverhältnis von
4:1 wurden Tetramere erzeugt.
-
Durchflusszytometrie
-
Färbung und
Sortierung von T-Zellen: Für
die Durchflussmengenzytometrie-Analyse
und für
das Sortieren der T-Zellen wurde ein CAP-1-MHC-Tetramer-PE verwendet.
Für die
Tetramerfärbung
wurde eine ähnliche
Prozedur wie oben beschrieben verwendet. Der CAP-1-MHC-Tetramer-PE
wurde in einer Konzentration von 0,33 μg/2·105 Zellen
verwendet. Die Zellen wurden 1 Stunde bei 4 °C mit CAP-1-MHC-Tetramer-PE
gefärbt und
daraufhin eine weitere Stunde mit Anti-CD8-FITC gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen
und in einem Vantage-Cell-Sortierer
(Becton Dickinson) oder einem FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung
der Software CellQuest (Becton Dickinson) analysiert. Die Sortiererzellen
wurden kultiviert und wie zuvor beschrieben expandiert. Die mit
UltrAvidin-PE und
mit Flu-MHC-Tetramer gefärbten
Zellen wurden als Negativkontrollen verwendet.
-
Zytotoxischer Assay
-
Die
Zielzellen wurden bei Zimmertemperatur 15 min mit 50 μCi
111Indium-markiertem Oxychinolin (Medi-Physics
Inc., Arlington, IL) markiert. Die Zielzellen (0,3·10
4) in 100 μl
RPMI-1640-Vollnährmedium
wurden zu jeder der 96 Wells in den Assay-Platten mit flachem Boden
(Corning Costar, Corp.) zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden
60 min bei 37 °C
in 5 % CO
2 mit Peptiden inkubiert, bevor
Effektorzellen zugegeben wurden. Wenn Karzinomzelllinien als Ziele
verwendet wurden, wurde kein Peptid verwendet. Die Effektorzellen wurden
in 100 μl
RPMI-1640-Vollnährmedium,
das mit 10 % menschlichem Pool-AB-Serum ergänzt wurde, suspendiert und
zu den Zielzellen zugegeben. Daraufhin wurden die Platten 4 oder
16 Stunden bei 37 °C
in 5 % CO
2 inkubiert. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde unter Verwendung von Ernterahmen (Skatron, Inc., Sterling,
VA) für
die Gammazählung
geerntet. Die Bestimmungen wurden dreifach ausgeführt und
es wurden Standardabweichungen berechnet. Die spezifische Lyse wurde
unter Verwendung der folgenden Formel berechnet (alle Werte in cpm):
-
Es
wurde die spontane Freisetzung von Wells, zu denen 100 μl RPMI-1640-Vollnährmedium
zugegeben wurden, bestimmt. Nach der Behandlung der Ziele mit 2,5
% Triton x-100 wurde die freisetzbare Gesamtradioaktivität erhalten.
-
HLA-Typbestimmung
-
Die
HLA-Phänotypbestimmung
wurde durch die Blutbank des National Institutes of Health unter
Verwendung eines antikörperabhängigen Standard-Mikrozytotoxizitäts-Assays
und eines definierten Felds von Anti-HLA-Antiseren ausgeführt. Die
Klasse-I-Phänotypen
der V8T-Zelllinie und des Patienten Nr. 15 waren jeweils HLA-A2,
-; B18(W6), 44(12, W4) und HLA-A2, 28; B13 (BW4), B51(BW4); CW6.
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Erfassung von Cytokinen
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Überstehende
T-Zellen, die 24 Stunden mit rF-CEA, rF-CEA/TRICOM infizierten DC
oder peptidgepulsten, nicht infizierten DC und mit rF-TRICOM infizierten
DC in einem IL-2-freien Medium bei verschiedenen Responder:Stimulator-Verhältnissen
ausgesetzt wurden, wurden unter Verwendung einer ELISA-Ausrüstung (R&D Systems, Minneapolis,
MN) zur Absonderung von IFNγ selektiert.
Die Ergebnisse wurden in pg/ml ausgedrückt.
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ELISPOT-Assay
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Um
die IFNγ-Produktion
zu messen, um CAP-1-spezifische T-Zellen zu bestimmen, wurde eine
Modifikation des von Scheibenbogen u. a. (Scheibenbogen, C., u.
a., Clin Cancer Res 3(2):221–226,
1997) beschriebenen Verfahrens verwendet. Kurz gesagt, wurden 96-Well-Milliliter-HA-Platten
(Millipore Corporation, Redford, MA) mit 100 μl Erfassungsantikörpern gegen
menschliches IFNγ mit
einer Konzentration von 10 μg/ml beschichtet.
Nach 24 Stunden Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Platten
30 min mit RPMI-1640, die 10 % menschliches Pool-AB-Serum enthielt,
blockiert. Zu jeder Well wurden 1·105 dem
Assay auszusetzende Zellen hinzugefügt. In jede Well wurden als
APC in einem Effektor:APC-Verhältnis
von 1:3 CAP-1-6D-gepulste C1R-A2-Zellen zugegeben. Als Negativkontrolle
wurden ungepulste C1R-A2-Zellen verwendet. Das HLA-A2-bindende Flu-Matrixpeptid
58-66 (GILGFVFTL) wurde ebenfalls als Kontrolle verwendet. Die reagierenden
Zellen wurden unter Verwendung eines Domino Image Analyzer (Otpomax,
Hollis, NH) bestimmt.
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Statistische Analyse
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Die
statistische Analyse von Unterschieden zwischen den Mitteln erfolgte
unter Verwendung eines Zwei-Schwanz-t-Tests.
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Diskussion
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Wenn
eine naive T-Zelle ein Antigen feststellt, sind mehrere verschiedene
Ergebnisse einschließlich Proliferation,
Cytokin-Absonderung und Differentiation in Effektorzellen sowie
die Aktivierung, der Tod und die Reaktionslosigkeit (Unempfindlichkeit)
möglich.
Das vorrangige Ergebnis unter physiologischen Bedingungen kann dadurch
bestimmt werden, ob geeignete kostimulatorische Signale an die reagierende
T-Zelle geliefert werden (26). Wenigstens drei verschiedene Moleküle, die
normalerweise an der Oberfläche
einer professionellen APC zu finden sind, werden für fähig gehalten,
die für
die T-Zellen-Aktivierung entscheidenden Signale zu liefern: B7-1,
ICAM-1 und LFA-3. Die Rolle der kostimulatorischen Moleküle bei der
Aktivierung naiver T-Zellen wurde hier unter Nutzung von Vektoren
untersucht, die genetisch so manipuliert wurden, dass sie entweder B7-1, ICAM-1, LFA-3
oder eine Kombination aller drei Moleküle exprimieren.
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Mehrere
Gruppen haben das Zusammenwirken von zwei dieser Moleküle bei der
T-Zellen-Kostimulation untersucht. Dubey u. a. haben berichtet (26),
dass die Kostimulation sowohl von B7-1 als auch von ICAM-1 eine
Vorbedingung für
die Aktivierung naiver T-Zellen ist, während Cavallo u. a. bestimmt
hatten, dass B7-1 und ICAM-1 durch Tumorzellen koexprimiert werden
müssen,
um eine Antitumor-Erinnerungsreaktion
zu erzeugen (27). Außerdem
ist gezeigt worden, dass die Kostimulation durch B7-1 und LFA-3
zusätzlich
sowohl auf die T-Zellen-Proliferation als auch auf die Cytokin-Produktion
wirkt (6, 23, 24). Diese früheren
Untersuchungen wurden unter Verwendung zweier kostimulatorischer
Moleküle
und Retrovirusvektoren ausgeführt.
Ein Gen wurde in die Zielzelllinie transduziert, es wurde ein Arzneimittel
ausgewählt
und daraufhin mit einem zweiten rekombinanten Retroviruskonstrukt
erneut transduziert, worauf die Selektion mit einem anderen Mittel
folgte. Dieser Prozess erfordert häufig Wochen oder Monate. Unter
Nutzung rekombinanter Pockenvirusvektoren kann die Koexpression
dreier kostimulatorischer Molekülen
5 Stunden nach der Infektion erzielt werden. Es ist gezeigt worden,
dass In-vitro-MC38-Zellen, die entweder mit rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3 oder mit rF-CEA/B7-1/ICAM-1/LFA-3
infiziert wurden, die Proliferation der T-Zellen in viel größerem Umfang als MC38-Zellen,
die mit Vektoren infiziert wurden, die das Gen für irgendein einzelnes kostimulatorisches
Molekül enthielten,
verbessern. Außerdem
erschien die relative Stärke
des durch die Kombination der kostimulatorischen Moleküle an die
T-Zelle gelieferten zweiten Signals um ein Mehrfaches (> 6) größer als
die, die durch MC38-Zellen geliefert wurde, die irgendein einzelnes
kostimulatorisches Molekül
exprimieren. Dubey u. a. haben nachgewiesen, dass bei niedrigen
Stimulator/T-Zellen-Verhältnissen
mäßige bis
starke Synergie mit B7-1 und ICAM-1 festgestellt wurde (26). Die
Untersuchungen der Erfinder bestätigen
diese Forschungsergebnisse. Allerdings hatte das Zwei-Gen-Konstrukt (rV-B7-1/ICAM-1)
bei sehr niedrigen Stimulatorzelle/T-Zelle-Verhältnissen
oder schwachem Signal 1 (0,625 μg/ml
Con A) wenig, wenn überhaupt,
Wirkung auf die Proliferation; im Gegensatz dazu hatte die Stimulation über das
Dreierkonstrukt (rV-B7-1/ICAM-1/LFA-3) eine wesentliche und statistisch
signifikante Wirkung auf die Proliferation. Die vorrangige Wirkung
der Stimulation über
das Mehr-Gen-Konstrukt (rV-B7-1, ICAM-1, LFA-3) war die IL-2-Ausarbeitung
aus CD4+-Zellen und die IFN-γ-Ausarbeitung
aus CD8+-T-Zellen, während wenig, wenn überhaupt,
Typ-2-Cytokine erzeugt wurden. Die Cytokin-Expressions-Analyse durch den
RNAse-Schutz lieferte ein mit dem In-vitro-Cytokin-Assay kompatibles Profil,
das sich im Vergleich zur Stimulation durch irgendein einzelnes
kostimulatorisches Molekül
durch wesentlich höhere
Expression von IL-2 und IFN-γ sowohl in
CD4+- als auch in CD8+-T-Zellen,
die mit allen drei kostimulatorischen Molekülen stimuliert wurden manifestierte.
Diese Daten stehen in Übereinstimmung
mit früheren
Untersuchungen, die nachwiesen, dass im Kontext niedriger CD28-Kostimulation
T-Zellen niedrige Niveaus von IL-1 erzeugten, während eine starke CD28-Kostimulation
die Erzeugung von IL-2, IFN-γ und
IL-13 unterstützte
(28). Darüber
hinaus ist berichtet worden, dass IL-13 mit IL-2 bei der Regulierung
der IFN-γ-Synthese
in T-Zellen synergiert (29). Es ist interessant, dass die vorliegenden
Ergebnisse diese Beobachtung dahingehend weiter unterstützten, dass
die Stimulation von CD4+-T-Zellen mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3-Ergebnissen
zu einem höheren
Niveau der IL-2- und IFN-γ-Expression
mit einiger erhöhter
Expression von IL-13 führt.
Darüber
hinaus wurde festgestellt, dass die IL-9-Expression in CD4+-T-Zellen
bei der Stimulation mit MC38/B7-1/ICAM-1/LFA-3 weiter verbessert
wurde. Die in den vorliegenden Untersuchungen festgestellte erhöhte Expression
von IL-9 in Verbindung mit der Aufwärtsregelung von IL-2 steht
in Übereinstimmung
mit früheren
Untersuchungen, die nachwiesen, dass die optimale Erzeugung von
IL-9 durch IL-2 reguliert wird (30). Zusammengenommen legen diese
Untersuchungen nahe, dass optimale Reaktionen naiver T-Zellen ein
höheres
Niveau der Kostimulation erfordern, als es früher angenommen wurde, und dass
dies durch die kombinierte Wirkung dreier kostimulatorischer Moleküle geliefert
werden könnte.
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Das
vielleicht am meisten untersuchende kostimulatorische T-Zellen-Molekül ist B7-1.
Die Fähigkeit dieses
Moleküls
zur Verbesserung der T-Zellen-Aktivierung unter Verwendung von Retrovirusvektoren, Ani-CTLA-4-Antikörpern und
Pockenvirusvektoren ist gut bekannt. Die hier berichteten Untersuchungen
ordnen die Reihenfolge der T-Zellen-Stimulation durch ein einzelnes
kostimulatorisches Molekül
als B7-1 > ICAM-1 > LFA-3. Allerdings
war die Nutzung dreier kostimulatorischer Moleküle gegenüber B7-1 allein oder in B7
in Kombination mit einem zweiten kostimulatorischen Molekül sowohl
in Bezug auf die T-Zellen-Proliferation als auch auf die Cytokin-Produktion
weitaus besser.
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Obgleich
dies an keine Theorie gebunden ist, gibt es für ein effizientes Zusammenwirken
zwischen B7-1, ICAM-1 und LFA-3 mehrere mögliche Mechanismen. Die ICAM-1/LFA-3-Wechselwirkung
kostimuliert Berichten zufolge die TCR-vermittelte Aktivierung von T-Zellen
durch Aufrechterhaltung der Zunahme derselben intrazellularen zweiten
Boten, wie sie durch den TCR-Eingriff erzeugt wird. Diese Beobachtung
legt nahe, dass die Ligation von LFA-1 durch ICAM-1 T-Zellen durch Verbessern
des über
den CD3/TCR-Komplex gelieferten Signals kostimuliert (6). Die ICAM-1/LFA-1-Wechselwirkung
ist notwendig, um die Expression der IL-2R-Alphakette und des CD28
an T-Zellen aufwärts
zu regulieren, was notwendig ist, um sie in die Lage zu versetzten,
auf die IL-2- und B7-1-Kostimula tion zu reagieren. Andererseits
liefert die B7-1/CD28-Wechselwirkung ein TCR-unabhängiges kostimulatorisches Signal,
das die Expression des IL-2 und anderer immunregulatorischer Lymphokine
sowohl transkribierend als auch nach der Transkription erhöht. Die
LFA-3/CD2-Wechselwirkung induziert eine Tyrosinphosphorylierung
mehrerer intrazellularer zweiter Boten, eine Ca2+-Mobilisierung
und eine cAMP-Produktion, was zur Ausarbeitung einer Vielzahl von
Cytokinen, besonders IL-2 und IFN-γ, führt (6). Somit scheinen die
drei kostimulatorischen Moleküle
dadurch zusammenwirken zu können, dass
die antigenabhängige
Aktivierung von T-Zellen sowie ihre Produktion autokriner und parakriner
Wachstumsfaktoren verbessert werden.
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Schlussfolgernd
weist diese Erfindung erstmals die Fähigkeit von Vektoren nach,
drei oder mehr kostimulatorische Moleküle in eine Zelle einzuführen und
sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen-Populationen schnell
und effizient auf weitaus höhere
Niveaus zu aktivieren als jene, die erzielt werden, wenn eines oder zwei
dieser kostimulatorischen Moleküle
verwendet werden. Dieser neue Schwellenwert der T-Zellen-Aktivierung
hat umfassende Auswirkungen im Impfstoffentwurf und in der Impfstoffentwicklung.
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Die
Wirkung der Dreiergruppe kostimulatorischer Moleküle auf DCs
war vollständig
unerwartet. DCs sind dem Fachmann als die potentesten APC bekannt.
Die in dieser Erfindung dargestellten Daten weisen nach, dass die
Fähigkeit
von DCs zur Aktivierung von T-Zellen drastisch zunimmt, wenn sie
mit dem "Tricom"-Vektor infiziert
werden. Diese Untersuchungen weisen erstmals nach, dass eine DC
nicht die potenteste APC ist.
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