CN102458458B - 组合免疫疗法组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了免疫治疗性组合物和此类组合物的组合用于改进诱导治疗性免疫应答和/或用于预防、改善和/或治疗疾病(包括但不限于癌症和传染性疾病)的并行用途。

Description

组合免疫疗法组合物和方法
政府的权利
本发明是在执行与国家卫生研究院(卫生及公共服务部的一个机构)的合作研究和开发协议时创造的。美国政府具有本发明的某些权利。
关于联合研究协议的声明
本发明由2008年5月8日生效的合作研究和开发协议的参与方或以其名义做出。该合作研究和开发协议的参与方为：全球免疫公司和美国卫生和及公共服务部，由国家癌症研究所(国家卫生研究院的一个研究所、中心或部门)代表。
关于序列表
本申请含有作为文本文件通过EFS-Web电子提交的序列表。名称为“3923-24-PCT_ST25”的该文本文件具有47KB字节的大小，而且记录于2010年4月16日。依据37 CFR§1.52(e)(5)，通过述及将该文本文件中含有的信息完整收入本文。
发明领域
本发明一般涉及两种不同免疫治疗性组合物用于改进诱导治疗性免疫应答和/或用于预防、改善和/或治疗疾病(包括但不限于癌症和传染性疾病)的并行用途。
发明背景
免疫治疗性组合物(包括疫苗)是医疗工业可用于预防和治疗疾病的最划算措施之一。然而，仍然迫切需要开发安全且有效的针对多种疾病(包括那些由致病体感染、癌症、遗传缺陷和免疫系统的其它病症引起的或与其有关的)的免疫治疗策略和佐剂。对于治疗癌症和许多传染性疾病(包括病毒性疾病和由胞内病原体引起的疾病)，希望提供引发细胞介导的(细胞)免疫应答的 免疫疗法，尽管许多疫苗主要或完全致力于引发体液免疫。确实，许多亚单位疫苗以及许多杀灭或减毒病原体疫苗的缺点在于虽然它们表现出刺激强烈的体液免疫应答，但是它们不能引发保护性的细胞介导的免疫。
癌症是全世界首要死因，而且针对癌症的有效疗法的开发继续成为最活跃的研究领域之一。虽然已经提出了用于治疗和预防癌症的多种创新办法，但是许多癌症继续具有高死亡率且可能难以治疗或相对不响应常规疗法。癌症生物学的新发现提供了机会来设计靶特异性抗癌剂，而且促进了药物和免疫疗法开发的进步。这些发现使之有可能设计针对癌细胞中特定靶具有高选择性的分子和治疗性组合物。
已经报告了众多免疫疗法研究，在诱导免疫细胞活性和抗肿瘤效果的能力方面比较靶向相同抗原的疫苗平台(参见例如Weide et al.，Immunol Lett 2008 Jan 15；115(1)：33-42；Riezebos-Brilman et al.，Gene Ther 2007 Dec；14(24)：1695-704；Naslundet al.，J Immunol 2007 Jun 1；178(11)：6761-9；Mylin et al.，J Virol 2000 Aug；74(15)：6922-34；Millar et al.，Cell Immunol 2007Nov-Dec；250(1-2)：55-67；Hodge etal.，Cancer Res 2003 Nov 15；63(22)：7942-9；Chan et al.，Gene Ther 2006 Oct；13(19)：1391-402；Casimiro et al.，J Virol 2003 Jun；77(11)：6305-13；及Bos et al.，JImmunol 2007 Nov 1；179(9)：6115-22)。Millar等人显示了由靶向相同抗原的两种不同载体(rV和重组腺病毒)诱导的T细胞群的功能性没有差别(Millar et al.，Cell Immunol2007Nov-Dec；250(1-2)：55-67)。
先前在临床前模型中报告了含有鼠B7-1、ICAM-1、和LFA-3基因以及人癌胚抗原(CEA)基因的重组痘苗(rV)和重组禽痘(rF)病毒的多样化引发和加强疫苗方案(rV/F-CEA/TRICOM)的抗肿瘤功效(Hodge et al.，Cancer Res 2003Nov 15；63(22)：7942-9；Hodge etal.，Cancer Res 1999 Nov 15；59(22)：5800-7；Hodge et al.，Clin Cancer Res 2003May；9(5)：1837-49；Grosenbach et al.，Cancer Res 2001 Jun 1；61(11)：4497-505；Greiner et al.，Cancer Res 2002 Dec1；62(23)：6944-51；Arlen et al.，Crit RevImmunol 2007；27(5)：451-62)。最近，还在临床前模型中证明了重组啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母-CEA)疫苗的抗肿瘤效果(Bernstein et al.，Vaccine2008 Jan 24；26(4)：509-21；Wansley et al.，Clin Cancer Res 2008 Jul 1；14(13)：4316-25)。证明了接种rV/FCEA/TRICOM或酵母-CEA任一后对免疫应答的诱导，而且 由任一疫苗引发的抗肿瘤效果主要归于对CEA特异性T细胞群的诱导。
数项研究证明了对更多样的T细胞群的诱导在多种疾病(包括癌症)模型中发起免疫应答中是有利的(Dudley et al.，Cancer J 2000 Mar-Apr；6(2)：69-77；Dutoit etal.，Cancer Res 2001 Aug 1；61(15)：5850-6；Echchakir et al.，Int Immunol 2000Apr；12(4)：537-46；Ferradini et al.，Cancer Res 1992 Sep 1；52(17)：4649-54；Messaoudi et al.，Science 2002 Nov 29；298(5599)：1797-800；Nikolich-Zugich etal.，Nat Rev Immunol 2004 Feb；4(2)：123-32；Sportes et al.，J Exp Med 2008 Jul 7；205(7)：1701-14；Zhou et al.，Cancer Res 2005 Feb 1；65(3)：1079-88)。然而，没有靶向相同抗原的疫苗的并行使用的报告。在靶向相同抗原的研究(诸如上文描述的那些)之后，调查人员在历史上或是选择最有效的疫苗进行进一步研究，或是采用多样化引发和加强策略来扩大T细胞应答。例如，靶向CEA的重组痘苗和禽痘载体的多样化引发-加强接种策略(Hodge et al.，Vaccine 1997 Apr-May；15(6-7)：759-68；Marshall et al.，J ClinOncol 2000 Dec 1；18(23)：3964-73)得到采用，因为针对第一疫苗的免疫应答显示出降低后续相同载体接种的效果(Naslund et al.，2007，见上文；Grosenbach et al.，2001，见上文；Hodge et al.，1997，见上文；及Wu et al.，J Virol 2005 Jul；79(13)：8024-31)。在多种癌症和其它疾病模型(包括HIV和疟疾)中记载了相似结果，证明多样化引发-加强策略的清楚优点(Wu et al，2005，见上文；Pancholi et al.，J Infect Dis 2000 Jul；182(1)：18-27；Barnett et al.，AIDS Res Hum Retroviruses 1998 Oct；14 Suppl 3：S299-309；Dunachie et al.，J Exp Biol 2003 Nov；206(Pt 21)：3771-9；McMichael，Annu RevImmunol 2006；24：227-55；Moore et al.，Immunol Rev 2004 Jun；199：126-43)。在这些研究中观察到的增强的应答归于有关抗原特异性T细胞群的扩大，但是再次使用多样化引发-加强办法来实现这些结果。
因而，尽管癌症疗法和传染性疾病免疫疗法/疫苗技术有进步，但是仍然迫切需要改进安全且有效的免疫治疗办法来治疗此类疾病。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种在个体中预防、改善或治疗癌症的至少一种症状，延长具有癌症的个体的存活，和/或在个体中诱导针对一种或多种癌症抗原的治疗性免疫应答的方法。该方法包括对个体施用下述各项的步 骤：(a)包含重组痘苗病毒的第一免疫疗法组合物，该重组痘苗病毒包含编码至少一种共刺激性分子的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。该第一和第二免疫疗法组合物并行施用于该个体。在一个方面，该重组痘苗病毒包含编码共刺激性分子B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及一种在个体中预防、改善或治疗癌症的至少一种症状，延长具有癌症的个体的存活，和/或在个体中诱导针对一种或多种癌症抗原的治疗性免疫应答的方法。该方法包括对个体施用下述各项的步骤：(a)包含下述各项的第一免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性部分的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组痘苗病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。该第一和第二免疫疗法组合物并行施用于该个体。在此实施方案的一个方面，在第一次施用后至少一周，该方法另外包括对个体施用下述各项的步骤：(a)包含下述各项的第三免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性部分的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组禽痘病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。该第二和第三免疫疗法组合物并行施用于该个体。
本发明的又一个实施方案涉及免疫疗法组合物的组合在制备药物中的用途，该药物并行施用于个体，以在个体中预防、改善或治疗癌症的至少一种症状，延长具有癌症的个体的存活，和/或在个体中诱导针对一种或多种抗原的治疗性免疫应答。该免疫疗法组合物包含：(a)包含下述各项的第一免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性部分的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组痘苗病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。在一个方面，该免疫疗法组合物进一步包含包含下述各项的第三免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性 部分的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组禽痘病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒。
本发明的一个实施方案涉及一种在个体中预防、改善或治疗疾病或状况的至少一种症状的方法。该方法包括对个体施用下述各项的步骤：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物并行施用于该个体。
本发明的另一个实施方案涉及一种在个体中诱导针对一种或多种抗原的治疗性免疫应答的方法。该方法包括对个体施用下述各项的步骤：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物并行施用于该个体。
本发明的另一个实施方案涉及一种延长具有疾病或状况的个体的存活的方法。该方法包括对个体施用下述各项的步骤：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物并行施用于该个体。
本发明的又一个实施方案涉及免疫疗法组合物的组合在制备药物中的用途，该药物并行施用于个体，以在个体中预防、改善或治疗疾病或状况的至少一种症状。该免疫疗法组合物包括：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该组合物配制用于并行施用。
本发明的另一个实施方案涉及免疫疗法组合物的组合在制备药物中的用途，该药物并行施用于个体，以在个体中诱导针对一种或多种抗原的治疗性免疫应答。该免疫疗法组合物包含：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物之一或二者包含至少一种抗原或其免疫原性域。该组合物配制用于并行施用。
本发明的又一个实施方案涉及免疫疗法组合物的组合在制备药物中的用途，该药物并行施用于具有疾病或状况的个体，以延长个体的存活。该免疫疗法组合物包含：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包 含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物之一或二者包含至少一种抗原或其免疫原性域。该组合物配制用于并行施用。
本发明的又一个实施方案涉及一种组合物，其包含：(a)包含重组病毒的第一免疫疗法组合物，该重组病毒包含病毒基因组或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物。该第一和第二免疫疗法组合物之一或二者包含至少一种抗原或其免疫原性域。该第一和第二免疫疗法组合物混合提供。
本发明的另一个实施方案涉及一种试剂盒，其包含下述免疫疗法组合物：(a)包含重组痘苗病毒的第一免疫疗法组合物，该重组痘苗病毒包含编码至少一种共刺激性分子的核酸序列和编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种抗原或其免疫原性域。在一个方面，该重组痘苗病毒包含编码共刺激性分子B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列。在一个方面，该抗原是癌症抗原。在一个方面，该抗原是包含CAP-1-6D表位的经修饰CEA。下文描述了本发明试剂盒的其它方面。
本发明的另一个实施方案涉及一种试剂盒，其包含下述免疫疗法组合物：(a)包含下述各项的第一免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性部分的核酸序列和编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组痘苗病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种抗原或其免疫原性域。在一个方面，该试剂盒进一步包含包含下述各项的第三免疫疗法组合物：(i)包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1或其生物学活性部分的核酸序列和编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组禽痘病毒；和(ii)包含编码GM-CSF或其生物学活性部分的核酸序列的重组禽痘病毒。在一个方面，该抗原是癌症抗原。在一个方面，该抗原是包含CAP-1-6D表位的经修饰CEA。下文描述了本发明试剂盒的其它方面。
在本文(上文或下文)描述的任何实施方案中，包括涉及本发明方法、用途组合物或试剂盒的任何实施方案，该第一和第二免疫疗法组合物(和/或特定实施方案中的第三免疫疗法组合物)之一或二者包含至少一种抗原或其免疫原性域。在一个方面，该第一和第二免疫疗法组合物(和/或特定实施方案 中的第三免疫疗法组合物)二者包含至少一种抗原或其免疫原性域。在一个方面，该第一免疫疗法组合物包含至少一种抗原或其免疫原性域，且该第二免疫疗法组合物不然。在一个方面，该第二免疫疗法组合物包含至少一种抗原或其免疫原性域，且该第一免疫疗法组合物不然。在一个方面，该第一和第二免疫疗法组合物均包含相同抗原或其免疫原性域。在一个方面，该第一和第二免疫疗法组合物(和/或特定实施方案中的第三免疫疗法组合物)包含不同抗原或其免疫原性域。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括任何实施方案涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒，该第一和/或第三免疫疗法组合物包含重组病毒，该重组病毒包含编码一种或多种免疫刺激性分子的一种或多种核酸序列。在一个方面，该第一和/或第三免疫疗法组合物包含：包含病毒基因组或其部分和编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组病毒和包含编码一种或多种免疫刺激性分子的一种或多种核酸序列的重组病毒。在一个方面，该第一和/或第三免疫疗法组合物包含重组病毒，该重组病毒包含编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列和编码一种或多种免疫刺激性分子的一种或多种核酸序列。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该第一和/或第三免疫疗法组合物中的重组病毒或病毒是痘病毒。在一个方面，该重组病毒或该第一和/或第三免疫疗法组合物中的病毒是重组痘苗病毒。在一个方面，该痘苗病毒是经修饰的安卡拉(Ankara)痘苗病毒(MVA)。在一个方面，该重组病毒或该第一和/或第三免疫疗法组合物中的病毒是禽痘病毒。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该免疫刺激性分子包含一种或多种共刺激性分子。在一个方面，该免疫刺激性分子包括但不限于B7.1(B7-1)、B7.2(B7-2)、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD40L和/或CD70。在一个方面，该免疫刺激性分子包含B7-1、ICAM-1、和LFA-3中一种、两种或所有三种。在一个方面，该免疫刺激性分子包含一种或多种细胞因子，包括但不限于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)，IFN-α、IFN-λ、白介素-12(IL-12)、RANTES、和白介素-2(IL-2)。在一个方面，该细胞因子 是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该第二免疫疗法组合物包含表达至少一种抗原或其免疫原性域的酵母媒介。在一个方面，该第二免疫疗法组合物中的酵母媒介是完整酵母。在一个方面，该第二免疫疗法组合物中的酵母媒介是完整、热杀死酵母。在一个方面，该第二免疫疗法组合物中的酵母媒介来自糖酵母属(Saccharomyces)。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的一个方面，该第一和第二免疫疗法组合物(和/或特定实施方案中的第三免疫疗法组合物)施用于个体中的不同部位。在另一个方面，该第一和第二(和/或第三)免疫疗法组合物施用于个体中的相同部位或邻近部位。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的另一个方面，该方法或用途进一步包括对该个体加强该免疫疗法组合物之一或二者(或某些实施方案中的所有三种)的步骤。在一个方面，对该个体加强该第二免疫疗法组合物，比该第一免疫疗法组合物更加频繁。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的另一个方面，其中有第一和第二免疫疗法组合物，该方法或用途进一步包括对该个体加强与该第一免疫疗法组合物不同的包含重组病毒的第三免疫疗法组合物的步骤，该重组病毒包含病毒基因组或其部分。例如，在一个方面，该第一免疫疗法组合物包含重组痘苗病毒，且该第三免疫疗法组合物包含禽痘病毒。
在本文所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该第一或该第二免疫疗法组合物任一比另一更加频繁地施用。例如，在一个方面，当该第一免疫疗法组合物是基于病毒的免疫疗法组合物，且该第二免疫疗法组合物是基于酵母的免疫疗法组合物时，该第二免疫疗法组合物可以比该第一免疫疗法组合物更加频繁地施用。例如，在一个方面，在该第一和第二免疫疗法组合物的并行施用中间，该第二免疫疗法组合物可以多施用一次、两次、三次或更多次。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的另一个方面，该方法进一步包括对该个体加强该抗原或其免疫原性域的另一种来源的步骤。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的另一个方面，该方法进一步包括对该个体施用至少一种生物应答修饰剂的步骤。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该个体具有癌症。在一个方面，该方法或用途在个体中降低肿瘤负荷或抑制肿瘤生长。在本发明的任何实施方案的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该抗原来自选自下组的癌症：黑素瘤，鳞状细胞癌，乳腺癌，头颈癌，甲状腺癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，睾丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮肤癌，脑癌，血管肉瘤(angiosarcoma)，血管肉瘤(hemangiosarcoma)，肥大细胞瘤，白血病，淋巴瘤，原发性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃肠癌，肾细胞癌，造血瘤形成或其转移癌。在一个方面，该抗原选自下组：癌胚抗原(CEA)，点突变的Ras癌蛋白，Brachyury，MUC-1，EGFR，BCR-Abl，MART-1，MAGE-1，MAGE-3，GAGE，GP-100，MUC-2，正常的和点突变的p53癌蛋白，PSMA，酪氨酸酶，TRP-1(gp75)，NY-ESO-1，TRP-2，TAG72，KSA，CA-125，PSA，HER-2/neu/c-erb/B2，hTERT，p73，B-RAF，腺瘤性结肠息肉病(APC)，Myc，冯希佩尔-林道蛋白(VHL)，Rb-1，Rb-2，雄激素受体(AR)，Smad4，MDR1，Flt-3，BRCA-1，BRCA-2，pax3-fkhr，ews-fli-1，HERV-H，HERV-K，TWIST，间皮素，NGEP，此类抗原的修饰，此类抗原的剪接变体，和此类抗原的表位激动剂，以及此类抗原的组合，和/或其免疫原性域，其修饰，其变体，和/或其表位激动剂。在一个方面，该抗原是癌胚抗原(CEA)，在一个实施方案，其包含CAP1-6D表位。在一个方面，该抗原是包含CAP-1-6D表位的经修饰CEA。在一个方面，该CEA包含氨基酸序列SEQ ID NO：2(由本文中SEQ ID NO：1所示核酸序列编码)。在另一个方面，该抗原是突变的Ras。在一个方面，该抗原是包含一个或多个Ras片段的多域融合蛋白，每个片段包含Ras位置12、13、59、61和/或76处的一处或多处突变。在一个方面，该Ras融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO：4(由本文中SEQ ID NO：3所示核酸序列编码)、SEQ ID NO：6(由本文中SEQ ID NO：5所示核酸序列编码)、SEQ ID NO：8(由本文中SEQ ID NO：7所示核酸序列编码)、和/或SEQ ID NO：10(由本文中SEQ ID NO：9所示核酸序列编码)。在一个方面，该抗原是Brachyury。在一个方面，该抗原是MUC-1。在一个方面，该抗原是EGFR。在一个方面，该抗原是BCR-Abl。
在本文(上文或下文)所述发明的任何方法或用途实施方案或方面的一个方面，该方法或用途进一步包括用化疗治疗该个体和/或用放疗治疗该个体的步骤。
在本文(上文或下文)所述发明的任何实施方案或方面的另一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该个体具有由病原体引起或与病原体有关的疾病。在一个方面，该方法或用途减轻或预防病原体对个体的感染。在一个方面，该方法或用途降低个体中的病原体滴度。
在本发明的任何实施方案的一个方面，包括涉及本发明方法、用途、组合物或试剂盒的任何实施方案，该抗原选自下组：病毒抗原，真菌抗原，细菌抗原，蠕虫抗原，寄生物抗原，外寄生物抗原，和原生动物抗原。在一个方面，该抗原来自选自下组的病毒：腺病毒，沙粒病毒，布尼亚病毒，冠状病毒，柯萨奇病毒，巨细胞病毒，埃巴二氏病毒，黄病毒，肝DNA病毒，肝炎病毒，疱疹病毒，流感病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，粘病毒，致癌病毒，正粘病毒，乳头瘤病毒，乳多泡病毒，副流感病毒，副粘病毒，细小病毒，微小RNA病毒，痘病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，呼肠病毒，杆状病毒，风疹病毒，披膜病毒，水痘病毒，和T-淋巴营养性病毒。在一个方面，该抗原来自选自下组的属的感染因子：曲霉(Aspergillus)，博德特氏菌(Bordatella，Bordetella)，布鲁丝虫(Brugia)，假丝酵母(Candida)，衣原体(Chlamydia)，球虫(Coccidia)，隐球菌(Cryptococcus)，恶丝虫(Dirofilaria)，埃希氏菌(Escherichia)，弗朗西丝氏菌(Francisella)，淋球菌(Gonococcus)，组织胞浆菌(Histoplasma)，利什曼原虫(Leishmania)，分枝杆菌(Mycobacterium)，支原体(Mycoplasma)，草履虫(Paramecium)，百日咳(Pertussis)，疟原虫(Plasmodium)，肺炎球菌(Pneumococcus)，肺囊虫(Pneumocystis)，立克次氏体(Rickettsia)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)，弓形体(Toxoplasma)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，和耶尔森氏菌(Yersinia)。在一个方面，该抗原来自选自下组的属的细菌：假单胞菌(Pseudomonas)，博德特氏菌(Bordetella)，分枝杆菌(Mycobacterium)，弧菌(Vibrio)，芽孢杆菌(Bacillus)，沙门氏菌(Salmonella)，弗朗西丝氏菌(Francisella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，肠球菌(Enterococcus)，巴斯德氏菌(Pasteurella)，和耶尔森氏菌(Yersinia)。
附图简述
血图2A-2F显示了接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA诱导独特TCR全集(显示了无处理(图2A)、rV/F-CEA/TRICOM(图2B)、和酵母-CEA(图2C)的Vα谱，且显示了无处理(图2D)、rV/F-CEA/TRICOM(图2E)、和酵母-CEA(图2F)的Vβ谱)。
图3A显示了CEA域III A3环上离散、不交叠的CEA-526和CEA-572表位。
图3B-3C显示了接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA响应两种离散CEA特异性表位即CEA-526(图3B)和CEA-572(图3C)的体外刺激诱导独特细胞因子谱。
图4A-4D显示了来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠对CEA-572表位特异性的T细胞系具有独特TCR Vα谱(rV/F-CEA/TRICOM T细胞系(黑色柱)的VαTCR全集在CEA-526肽(图4A)和CEA-572肽(图4B)存在下维持；酵母-CEA T细胞系(白色柱)的VαTCR全集在CEA-526肽(图4C)和CEA-572肽(图4D)存在下维持)。
图5A-5F显示了自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠生成的表位特异性T细胞系具有相似水平的裂解活性但独特的亲合力(图5A和5C显示了自rV/F-CEA/TRICOM接种生成的且对CEA-526肽(图5A)和CEA-572肽(图5C)特异性的T细胞系；图5B和5D显示了自酵母-CEA接种生成的且对CEA-526肽(图5B)和CEA-572肽(图5D)特异性的T细胞系；图5E和5F显示了自接种rV/F-CEA/TRICOM(图5E)或酵母-CEA(图5F)的小鼠生成的对CEA-572表位特异性的T细胞系)。
图6显示了在正位肺部转移模型中并行施用rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA疫苗提高抗肿瘤功效。
发明详述
本发明涉及两种免疫治疗性组合物(在本文中也称为疫苗)用于诱导治疗性免疫应答和/或用于预防、改善和/或治疗疾病(包括但不限于癌症和传染性疾病)的并行用途。更具体地，使用均靶向相同抗原或其免疫原性域的重组病毒免疫治疗性疫苗和基于酵母的免疫治疗性疫苗，在本文中证明疫苗载体和抗原二者在诱导具有共享的和独特的细胞因子应答、基因表达谱、和T细胞受体表型的T细胞群中具有作用。因而，抗原和载体二者在诱导独特T细胞群中发挥作用。本文中呈现的研究指示由靶向相同抗原的两种载体平台诱导了表型上和功能上独特的T细胞群。最后，本发明人证明了两种疫苗可并行组合来改进治疗功效，在本文所述实验中显示了疫苗的并行施用改进抗肿瘤功效。这些结果指示来自靶向单一抗原的两种独特载体平台的并行施用的治疗好处，这是由于对更多样的T细胞群的诱导和改善的治疗功效。
认为此研究首次证明靶向相同抗原的两种不同疫苗载体的有效并行施用。虽然先前显示了本文所述研究中使用的疫苗均个别地诱导相似水平的CD4+T细胞群和CD8+T细胞溶胞活性(Wansley et al.，Clin Cancer Res，2008Jul 1；14(13)：4316-25)，但是不知道或没有预期这些疫苗诱导表型上和功能上独特的T细胞群，及疫苗可并行组合来实质性改进抗肿瘤功效的发现。
与显示由靶向相同抗原(OVA)的两种不同疫苗平台(rV和重组腺病毒)诱导的T细胞群的功能性没有差别的在先研究(Millar et al.，2007，Cell Immunol 250(1-2)：55-67)相反，本发明提供了载体和抗原二者影响由两种不同免疫治疗性疫苗(一种基于病毒的免疫疗法组合物(在本文中称为rV-CEA/TRICOM)和一种基于酵母的免疫疗法组合物(在本文中称为酵母-CEA)诱导的T细胞群的功能性的证据。在细胞因子生成、基因表达、和TCR谱测定方面比较由两种疫苗诱导的T细胞群，本文中呈现的研究发现了rV-CEA/TRICOM诱导Th1应答和具有Tc1表型的CD8+T细胞，而酵母-CEA诱导混合Th1/Th2应答和具有混合Tc1/Tc2表型的CD8+T细胞(图1和3)。观察到两种疫苗对涉及免疫细胞迁移和TCR信号传导和T细胞增殖的基因的上调(表1)。有趣地，虽然这些疫苗以表观不利的方式调控涉及多种细胞途径的基因的表达，但是没有消除抗原特异性免疫应答或抗肿瘤功效(Wansley et al.，ClinCancer Res 2008 Jul 1；14(13)：4316-25)。本文中还证明了由任一疫苗诱导的T细胞群具有共享的和独特的Vα和VβTCR基因使用(图2)，而且自接种CEA-Tg的小鼠创建的对两种CEA表位之一特异性的T细胞系展现出不同的亲合力和抗原特异性溶胞活性(图5)。总之，这些研究证明了两种免疫治疗性疫苗诱导独特T细胞群，而且这些T细胞群在表型和功能方面的差异可归于载体和抗原二者。这些发现适 用于在免疫疗法组合物的背景中使用任何抗原。
任一疫苗平台投递抗原的模式可影响这些独特应答的生成。酵母-CEA激活免疫应答的主要机制是经由摄取表达CEA的酵母及随后由树突细胞(DC)加工并呈递CEA抗原(Bernstein et al.，Vaccine 2008 Jan 24；26(4)：509-21)，而rV/F-CEA/TRICOM载体感染细胞，诱导容许CEA抗原加工和呈递的胞内表达(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15；59(22)：5800-7)。观察到的另一种差别是rV/F-CEA/TRICOM接种诱导CEA特异性抗体的生成，而酵母-CEA不然(数据未显示)。免疫系统的细胞和体液分支的激活中的此类机制差别也可影响对独特T细胞群的载体和抗原特异性诱导。
令人惊讶地，本发明人发现了在鼠正位肺部转移模型中施用靶向相同抗原的两种疫苗诱导独特T细胞群且导致显著更高的抗肿瘤免疫(图6)。此研究还首次显示了靶向相同抗原的两种疫苗平台能并行施用，这是由于它们对独特T细胞群的诱导。另外，这些数据显示了两种疫苗的并行施用导致实质性升高的抗肿瘤效果，这是由于对更多样的靶向相同抗原的T细胞群的诱导。这些发现指示并行组合这些疫苗可用于提高抗原特异性免疫。本文所述免疫治疗性疫苗的并行使用诱导更多样的T细胞群，其由自两种疫苗生成的T细胞组成，使得本发明之前使用的多样化引发-加强进度表不必要，尽管组合多样化引发-加强进度表与本文所述并行施用方案可进一步增强有效免疫应答。本发明使免疫应答最大化，始于初始接种，诱导更多样的T细胞群，然后用每一次后续接种在程度上加强和扩大。此类策略在癌症患者以及罹患慢性传染性疾病的患者中会是有效的，因为会在他们的治疗中早期诱导更多样的T细胞群。
因而，本发明涉及两种或更多种不同免疫疗法组合物的并行使用，以诱导针对一种或多种抗原的治疗性免疫应答，和/或至预防、改善和/或治疗疾病或状况，包括癌症或传染性疾病。在一个实施方案中，两种或更多种不同免疫疗法组合物靶向相同抗原。在另一个实施方案中，两种或更多种不同免疫疗法组合物之一靶向一种或多种抗原，且另一免疫疗法组合物作为佐剂提供，不必靶向抗原，或不必与另一组合物靶向相同抗原(即在一个实施方案中，第二组合物靶向不同抗原)。在一个实施方案中，其可包括上文实施方案的任何组合，两种或更多种免疫疗法组合物并行施用，但是施用于患者中的不同身体部位。在另一个实施方案中，其可包括上文实施方案的任何组合， 两种或更多种不同免疫疗法组合物并行施用，而且施用于患者中的相同部位或实质性邻近部位。
本发明中使用的两种或更多种不同免疫疗法组合物均能够个别地诱导免疫应答，而且优选至少细胞免疫应答，而且更优选T细胞介导的细胞免疫应答。在一个方面，至少一种组合物能够诱导CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫应答，而且更优选CD8+和CD4+T细胞介导的免疫应答。优选地，所有依照本发明并行使用的组合物能够诱导CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫应答，而且更优选CD8+和CD4+免疫应答。任选地，至少一种组合物能够引发体液免疫应答。优选地，由免疫疗法组合物之一引发的T细胞介导的免疫应答在表型上和/或在功能上在一个或多个方面不同于由另一免疫疗法组合物引发的T细胞介导的免疫应答。在一个方面，免疫治疗性组合物具有一项或多项下述特征：(a)刺激一种或多种有效激活抗原呈递细胞的样式识别受体；(b)上调抗原呈递细胞上的粘附分子、共刺激性分子、和MHC I类和/或II类分子；(c)诱导抗原呈递细胞生成促炎性细胞因子；(d)诱导T细胞生成Th1型细胞因子；(e)诱导T细胞生成Th17型细胞因子；(f)抑制或下调Treg；和/或(g)引发MHC I类和/或MHC II类抗原特异性免疫应答。合适的免疫治疗性组合物可包括基于酵母的免疫疗法组合物、基于病毒的免疫疗法组合物、基于抗体的免疫疗法组合物、DNA免疫疗法组合物、亚单位疫苗、和对于刺激或调控免疫应答有用的任何成分或佐剂(诸如TLR激动剂、细胞因子、免疫强化剂、和其它药剂)、及其任何组合，下文更为详细地描述了其中许多。在一个方面，本发明中要使用的免疫疗法组合物包括基于重组病毒的组合物和基于酵母的组合物(下文详细描述)。
基于病毒的免疫疗法组合物
本发明的一个方面涉及基于重组病毒的免疫疗法组合物(该短语可以与“基于病毒的免疫疗法产品”、“基于病毒的组合物”、“基于病毒的免疫治疗剂”、“基于病毒的疫苗”、“包含或包括重组病毒或重组病毒载体的免疫疗法组合物”、或这些短语的任何相似衍变互换使用)。如本文中使用的，短语“基于病毒的免疫疗法组合物”指包括病毒载体成分(例如重组病毒或其有效构成病毒载体的部分)且在受试者中引发足以实现至少一种治疗性好处的免疫应答的组合物。基于病毒的免疫疗法组合物及其制备和一般使用的方法详细记载于例如美国专利No.6,045,802，美国专利No.6,893,869，美国专利No. 6,548,068，及美国专利No.6,969,609，通过述及将其每一篇完整收入本文。在一个方面，在本发明中有用的基于病毒的免疫疗法组合物能够诱导CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫应答，而且在一个方面，CD8+和CD4+T细胞介导的免疫应答，而且在一个方面，体液免疫应答。在本发明中有用的基于病毒的免疫疗法组合物能例如在个体中引发免疫应答，使得该个体的疾病或状况得到治疗，或使得源自疾病或状况的症状得到缓解或治疗。
基于病毒的免疫疗法组合物通常包含病毒载体，该病毒载体包含病毒基因组或其部分(例如重组病毒)和编码至少一种来自疾病引起物或疾病状态的抗原(例如癌症抗原、传染性疾病抗原、和/或至少一种其免疫原性域)的核酸序列。在一些实施方案中，基于病毒的免疫疗法组合物进一步包括至少一种病毒载体，该病毒载体包含编码一种或多种免疫刺激性分子的一种或多种核酸序列。在一些实施方案中，编码免疫刺激性分子和抗原的基因插入相同病毒载体(相同重组病毒)。
可用于此类本发明免疫疗法组合物的病毒为感染细胞，诱导病毒携带的抗原胞内表达，容许抗原加工并呈递的任何病毒。这些病毒中优选那些诱导Th1应答和具有Tc1表型的CD8+T细胞的。可用于本发明组合物的病毒包括部分基因组可删除以引入新基因，不破坏病毒侵染性的病毒。
可用于生成本发明病毒载体的亲本病毒(即自其生成、衍生、建立、等病毒载体/重组病毒的病毒)包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、α病毒、逆转录病毒、微小RNA病毒、杆状病毒、和虹彩病毒。可用于本发明的痘病毒(痘病毒科的成员)包括复制型和非复制型载体。此类痘病毒包括但不限于正痘(正痘病毒属)，诸如痘苗病毒(Perkus et al.，Science 229：981-984，1985；Kaufman et al.，Int.J.Cancer 48：900-907，1991；Moss，Science 252：1662，1991)、浣熊痘、家兔痘等等，禽痘(禽痘病毒属)，包括禽痘病毒，猪痘(猪痘病毒属)，山羊痘(山羊痘病毒属)等等。痘病毒可选自下组：痘苗-哥本哈根，痘苗-Wyeth株，高度减毒的痘苗病毒(痘苗-MVA株)，经修饰的安卡拉豆苗病毒(Sutter andMoss，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.89：10847-10851；Sutter et al.，Virology 1994)，NYVAC，TROVAC，金丝雀痘，ALVAC(Baxby and Paoletti，Vaccine 10：8-9，1992；Rinns，M.M.et al.，(Eds)Recombinant Poxviruses CRC Press，Inc.，Boca Raton 1992；Paoletti，E.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：11349-11353，1996)，猪痘，等等。痘苗-Wyeth株的衍生物包 括但不限于缺失功能性K1L基因的vTBC33。在又一个实施方案，病毒是作为天花疫苗自疾病控制中心(Atlanta，Georgia)可得的Dry-Vax。在一个实施方案中，重组载体是痘苗病毒。在另一个实施方案中，重组载体来自禽痘病毒。例如，禽痘病毒的一个株是POXVAC-TC(Schering-Plough Corporation)。
可用于本发明的重组痘病毒具有多种属性，包括(i)将基因有效投递至多种细胞类型，包括抗原呈递细胞(APC)和肿瘤细胞；(ii)高水平的蛋白质表达；(iii)将抗原最佳呈递给免疫系统；(iv)引发细胞介导的免疫应答以及抗体应答的能力；(v)瞬时而非永久的对细胞的遗传修饰，和(vi)使用来自不同属的痘病毒的组合的能力，因为它们没有免疫学交叉反应性。
重组痘苗(rV，rMVA)和重组禽痘(rF)病毒是用于本发明基于病毒的免疫疗法组合物的两种例示性病毒。含有鼠B7-1、ICAM-1、和LFA-3基因以及人CEA基因的重组痘苗和禽痘病毒(rV/F-CEA/TRICOM)已有记载(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15；59(22)：5800-7；Grosenbach et al.，Cancer Res 2001Jun 1；61(11)：4497-505；及Hodge et al.，Cancer Res 2003 Nov 15；63：7942-7949)，通过述及将其每一篇完整收入本文。表达鼠GM-CSF的rF病毒(rF-GM-CSF)先前已有记载(Kass et al.，Cancer Res 2001 Jan 1；61(1)：206-14)。为了本发明的目的，称作“rV/F-CEA/TRICOM”的疫苗指包括用rV-CEA/TRICOM(含有编码B7-1、ICAM-1、LFA-3和CEA的多核苷酸的重组痘苗)与rF-GM-CSF(含有编码GM-CSF的基因的重组禽痘)混合引发，每7天用含有编码B7-1、ICAM-1、LFA-3和CEA的多核苷酸的rF-CEA/TRICOM重组禽痘与rF-GM-CSF混合加强的完全疫苗方案。要理解，CEA仅仅是要与一种或多种本发明免疫疗法组合物联合使用的合适抗原(在此情况中是肿瘤相关或癌症抗原)的一个例子。
本发明的病毒载体包含至少一种与核酸序列可操作连接的表达控制元件。表达控制元件插入载体以控制和调节核酸序列的表达(Ausubel et al，1987，in″CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，N.Y.)。表达控制元件是本领域已知的，而且包括启动子。在本发明中有用的启动子是痘病毒启动子，如本领域已知的，其包括但不限于30K、I3、sE/L、7.5K、40K、和C1。30K启动子的核酸序列已披露于GenBank登录号M35027，位于碱基编号28,012至28,423(反义)。I3的核酸序列披露于GenBank登录号J03399，位于碱基编号1100至1301(反义)。7.5K启动子的核酸序列披 露于GenBank登录号M35027，位于碱基编号186550至186680。40K启动子的核酸序列披露于GenBank登录号M13209，位于碱基编号9700至9858(反义)。C1启动子的核酸序列披露于GenBank登录号M59027，位于碱基编号1至242及美国专利No.5,093,258。sE/L启动子的序列是本领域已知的。可使用其它痘病毒启动子，诸如Davison and Moss，J.Mol.Biol.210：749-769，1989)记载的那些。任何这些启动子可使用本领域标准方法来合成。适宜启动子的选择基于其表达时机和水平。在一个方面使用早期或早期/晚期启动子。在一个实施方案中，所利用的启动子或启动子组合容许受感染宿主中每一种抗原和/或共刺激性分子的最佳表达以提供协同免疫应答。在一个实施方案中，编码抗原或共刺激性分子的核酸分子均受分开的和独特的启动子控制。
如本文中与为本发明中使用而描述的任何免疫疗法组合物一起使用的，免疫刺激性分子包括但不限于细胞因子和共刺激性分子。例如，细胞因子可包括但不限于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、IFN-α、IFN-λ、白介素-12(IL-12)、RANTES、和白介素-2(IL-2)。共刺激性分子包括但不限于B7.1(在本文中也称为B7-1)、B7.2(在本文中也称为B7-2)、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD40L和CD70。免疫刺激性分子可以在本发明的免疫疗法组合物中单独地和/或以各种组合提供，而且可以由一种或多种病毒载体或其它疫苗载体来表达。在一个方面，本发明的重组载体含编码至少三种共刺激性分子的基因，用于协同增强使用一种或两种共刺激性分子得不到的免疫应答。编码共刺激性分子各种组合的基因是本发明用于重组载体的一个元件，而且可以包括诸如下述组合：B7.1，B7.2，ICAM-1，和LFA-3；B7.1，ICAM-1，和LFA-3；B7.1，B7.2，ICAM-1，和4-1BBL；B7.1，B7.2，ICAM-1，LFA-3，和4-1BBL；CD59和VCAM-1；及B7.1和B7.2；CD59，CD40，4-BBL，CD70和VCAM-1，B7.1，B7.2；OX-40L，4-1BBL；取决于所期望的免疫应答和要治疗的疾病或状况。
B7.1(CD80)是T细胞抗原CD28的天然配体，介导T和B细胞粘附。B7.1在活化的B细胞和γ-干扰素刺激的单核细胞上表达。CD80对CD28和CTLA-4的结合对T细胞提供共刺激性信号并导致上调的淋巴因子生成。B7.2(CD86)是CD28和CTLA-4的备选配体。
ICAM-1(细胞间粘附分子1)，也称为CD54，是白细胞和内皮相关细胞间 粘附分子，而且是白细胞受体LFA-1(整联蛋白)的配体。ICAM-1在细胞因子刺激后上调，而且涉及细胞相互作用、白细胞内皮移行、和涉及募集促炎性免疫细胞的信号传导。
LFA-3(淋巴细胞功能相关抗原-3)，或CD58，是由抗原呈递细胞(APC)表达的粘附分子，介导经由在T细胞和天然杀伤(NK)细胞上找到的粘附分子CD2的共刺激性信号。此相互作用促进细胞间粘附和T细胞活化。
4-1BBL在活化的抗原呈递细胞(APC)上表达，而且是在活化的CD4和CD8 T细胞上表达的肿瘤坏死因子受体家族共刺激性成员4-1BB的配体。这些分子的相互作用能增强T细胞增殖和存活，及扩大和活化CD8+T细胞记忆(Bukczynski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2004，101(5)：1291-6)。
CD59是一种补体调节蛋白。病毒(包括痘苗病毒，痘苗)将宿主细胞CD59掺入它们自己的病毒被膜以防止补体的裂解作用(Bohana-Kashtan et al.，2004，Mol.Immunol.41(6-7)：583-97)。
VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)，或CD106，是由内皮细胞表达的粘附分子，而且介导淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、和嗜碱性细胞对血管内皮的粘附。它还在白细胞-内皮细胞信号转导中发挥功能。
CD40是由抗原呈递细胞(APC)表达的共刺激性蛋白。CD40对T细胞上其天然配体CD40L的结合活化APC并启动介导多种免疫和炎性应答的信号传导级联。
CD70是生成和维持长期T细胞免疫所需要的受体CD27的配体。
OX40-L在活化的B细胞、T细胞、树突细胞和内皮细胞上表达，并结合主要由活化的CD4+T细胞表达的其天然受体OX40，因此，此相互作用涉及T细胞活化。
GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)是作为由T细胞、巨噬细胞、和其它细胞生成的白血球生长因子发挥功能的细胞因子。GM-CSF刺激干细胞生成粒细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、和嗜碱性细胞)和单核细胞，因此是免疫系统活化和发育过程的一部分。
免疫刺激性分子和抗原在病毒复制/感染部位(在任何情况中，抗原生成部位)同时生成增强特定效应器的生成。取决于具体的免疫刺激性分子，可能由不同机制负责增强的免疫原性：提示辅助信号(IL-2)，募集专门APC(GM-CSF)，提高CTL频率(IL-2)，和/或对抗原加工途径和MHC表达的影 响(IFN-γ和TNFα)。在一些情况中，为了具有多价疫苗而生成包含超过一种感兴趣抗原的重组病毒可能是有益的。
在一个实施方案中，药物组合物在药学可接受载体中包含重组病毒(例如痘病毒)，该重组病毒含有编码多种共刺激性分子的核酸分子。重组病毒可进一步包含编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列，或者可提供编码至少一种抗原或其免疫原性域的第二重组病毒(例如痘病毒)。
在一个实施方案中，可用于本发明的基于病毒的免疫疗法组合物包括包含重组病毒(例如重组痘病毒)和药学可接受载体的药物组合物，该重组病毒包含编码B7.1或B7.2的核酸序列、编码ICAM-1的核酸序列、和编码LFA-3的核酸序列。在B7、ICAM-1、LFA-3构建体之外，药物组合物的重组病毒可另外包含编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列，或者可以通过第二重组病毒在组合物中提供编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列。
在一个实施方案中，组合物也可包含外源添加的免疫刺激性分子，如本领域已知的，包括但不限于共刺激性分子B7、ICAM-1、LFA-3、4-1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-1、OX-40L，和/或结合此类免疫刺激性分子的抗体，和/或此类免疫刺激性分子的激动剂或拮抗剂，和/或细胞因子和趋化因子，包括但不限于IL-2、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、IFN-λ、IL-12、RANTES、MIP-1α、Flt-3L(美国专利No.5,554,512；5,843,423)等等，以实现另外的免疫应答协同或增强。可以在组合物中提供细胞因子和趋化因子自身，或者可以通过编码细胞因子或趋化因子的重组病毒载体来提供细胞因子和趋化因子。
在本发明的一个实施方案中，提供重组痘病毒，其包含在30K痘病毒启动子控制下编码LFA-3或其功能性部分的核酸序列、在I3痘病毒启动子控制下编码ICAM-1或其部分的核酸序列、和在sE/L痘病毒启动子控制下编码B7.1或其部分的核酸序列。重组痘病毒可进一步提供编码至少一种抗原或其免疫原性域的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，提供重组痘病毒，其包含在sE/L痘病毒启动子控制下编码B7.1的核酸序列、在I3痘病毒启动子控制下编码LFA-3或其部分的核酸序列、和在7.5K痘病毒启动子控制下编码ICAM-1或其部分的核酸序列。任选地，构建体进一步包含编码至少抗原或其免疫原性域的核酸序列。
在本发明的一个实施方案中，重组禽痘病毒包含在sE/L痘病毒启动子控制下编码B7.1或其部分的核酸序列、在I3痘病毒启动子控制下编码LFA-3或其部分的核酸序列、和在7.5K痘病毒启动子控制下编码ICAM-1或其部分的核酸序列。重组禽痘病毒可进一步包含在痘病毒启动子诸如40K痘病毒启动子控制下编码靶抗原的核酸序列。
在本发明的一些实施方案中，基于重组病毒的免疫疗法组合物不表达抗原，尽管在此类情况中，此类组合物的重组病毒载体优选会表达一种或多种免疫刺激性分子，如本文中别处描述的。在本发明的这个实施方案中，抗原由一种或多种不同免疫疗法组合物提供，如本文中描述的，诸如本发明基于酵母的免疫疗法组合物。因为本发明中使用的免疫疗法组合物均可给免疫系统提供一些独特的“危险信号”或共刺激性信号，因此只有一种组合物包含抗原可能就足以提供载体的贡献了。
本发明进一步提供了生成包含编码抗原和/或多种共刺激性分子的核酸序列的重组病毒的方法。一种生成重组痘病毒的方法是经亲本痘病毒基因组DNA和携带要插入的异源序列的质粒载体之间的体内同源重组实现的，如美国专利No.5,093,258中披露的。用于将外来序列插入痘病毒的质粒载体通过重组DNA技术的标准方法来构建。质粒载体含有一种或多种嵌合外来基因，均包含与蛋白质编码序列连接的痘病毒启动子，侧翼为来自痘病毒基因组非必需区域的病毒序列。使用本领域公认的转染方法将质粒转染入受到亲本痘病毒感染的细胞，而且质粒上的痘病毒序列和亲本病毒基因组中对应DNA之间的重组导致来自质粒的嵌合外来基因插入病毒基因组。重组病毒使用本领域已知的多种选择或筛选系统任一来选择和纯化。外来基因插入痘苗基因组通过聚合酶链式反应(PCR)分析来确认。外来基因的表达通过Western印迹分析来证明。一种生成重组痘病毒的备选方法是通过直接连接来实现的(Pleiderer et al.，J.Gen.Virol.76：2957-2962，1995；Merchlinsky et al.，Virol.238：444-451，1997)。
基于酵母的免疫疗法组合物
在本发明的一个实施方案中，本发明包括use of至少一种“基于酵母的免疫治疗性组合物”(该短语可以与“基于酵母的免疫疗法产品”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫治疗剂”、“基于酵母的疫苗”、“包含酵母媒介的免疫疗法组合物”、或这些短语的任何相似衍变互换使用)。如本文中使 用的，短语“基于酵母的免疫疗法组合物”指包括酵母媒介成分且在受试者中引发足以实现至少一种治疗性好处的免疫应答的组合物。更特别地，基于酵母的免疫治疗性组合物是包括酵母媒介成分且能引发或诱导免疫应答，诸如细胞免疫应答，包括但不限于T细胞介导的细胞免疫应答的组合物。在一个方面，在本发明中有用的基于酵母的免疫疗法组合物能够诱导CD8+和/或aCD4+T细胞介导的免疫应答，而且在一个方面，CD8+和CD4+T细胞介导的免疫应答。任选地，基于酵母的免疫疗法组合物能够引发体液免疫应答。在本发明中有用的基于酵母的免疫疗法组合物能例如在个体中引发免疫应答，使得该个体的疾病或状况得到治疗，或使得源自疾病或状况的症状得到缓解或治疗。
基于酵母的免疫疗法组合物通常包括酵母媒介和至少一种由酵母媒介表达、附着于酵母媒介、或与酵母媒介混合的抗原或其免疫原性域。在一些实施方案中，抗原或其免疫原性域作为融合蛋白来提供。在本发明的一个方面，融合蛋白可包括两种或更多种抗原。在一个方面，融合蛋白可包括一种或多种抗原的两种或更多种免疫原性域或者一种或多种抗原的两种或更多种表位。 是在本发明中有用的基于酵母的免疫疗法组合物的一个非限制性例子。 (靶向分子免疫原，GlobeImmune，Inc.，Louisville，Colorado)一般指胞外(在其表面上)和/或胞内(内部或细胞溶质)表达一种或多种异源抗原的酵母媒介。
基于酵母的免疫疗法组合物及其制备和一般使用的方法详细记载于例如美国专利No.5,830,463，美国专利No.7,083,787，美国专利No.7,465,454，美国专利公开号2007-0224208，美国专利公开号US 2008-0003239，及Stubbs et al.，Nat.Med.7：625-629(2001)，Lu et al.，Cancer Research 64：5084-5088(2004)，及Bernstein et al.，Vaccine 2008 Jan 24；26(4)：509-21，通过述及将其每一篇完整收入本文。这些基于酵母的免疫治疗性产品已经显示出引发免疫应答，包括细胞和体液免疫应答。基于酵母的免疫治疗性产品能够在多种动物物种中在体内杀死表达多种抗原的靶细胞，而且是经抗原特异性CD8+和/或CD4+介导的免疫应答这样做的。别的研究显示了酵母被树突细胞热切吞噬并直接活化树突细胞，然后树突细胞以高度有效的方式将酵母相关蛋白呈递给CD4+和CD8+T细胞。参见例如Stubbs et al.Nature Med.5：625-629(2001)和美国专利No.7,083,787。
在本发明中使用的任何基于酵母的免疫疗法组合物中，涉及酵母媒介的以下方面包括在本发明内。依照本发明，酵母媒介指可以与一种或多种抗原、其免疫原性域或其表位联合用于本发明的治疗性组合物的任何酵母细胞(例如完整细胞)或其衍生物(见下文)，或者在一个方面，酵母媒介可以单独地或作为佐剂使用。酵母媒介因此可以包括但不限于活的完整酵母微生物(即具有其所有成分(包括细胞壁)的酵母细胞)、杀死的(死的)或灭活的完整酵母微生物、或其衍生物，包括酵母原生质球(即缺乏细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺乏细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母空细胞(即缺乏细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其级分(也称为酵母膜颗粒，先前称为亚细胞酵母颗粒)、任何其它酵母颗粒、或酵母细胞壁制备物。
酵母原生质球通常通过酶促消化酵母细胞壁来生成。这样的方法加载于例如Franzusoff et al.，1991，Meth.Enzymol.194，662-674，通过述及完整收入本文。
酵母胞质体通常通过对酵母细胞去核来生成。这样的方法加载于例如Coon，1978，Natl.Cancer Inst.Monogr.48，45-55，通过述及完整收入本文。
酵母空细胞通常通过将经透化或溶解的细胞重新密封(reseal)来生成，可以而非必需包含该细胞的至少一些细胞器。这样的方法加载于例如Franzusoff et al.，1983，J.Biol.Chem.258，3608-3614及Bussey et al.，1979，Biochim.Biophys.Acta 553，185-196，通过述及将其每一篇完整收入本文。
酵母膜颗粒(亚细胞酵母膜提取物或其级分)指缺乏天然细胞核或细胞质的酵母膜。该颗粒可以是任何大小的，包括范围从天然酵母膜大小至通过超声处理或本领域技术人员知道的其它膜破碎方法继以重新密封生成的微粒大小的大小。用于生成亚细胞酵母膜提取物的一种方法记载于例如Franzusoff et al.，1991，Meth.Enzymol.194，662-674。还可以使用包含酵母膜部分和(在制备酵母膜颗粒前由酵母重组表达抗原或其它蛋白质时)感兴趣抗原或其它蛋白质的酵母膜颗粒级分。感兴趣抗原或其它蛋白质可以在膜内、在膜的表面上、或其组合方式(即蛋白质可以既有膜内的又有膜外的，和/或跨越酵母膜颗粒的膜)运载。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，其可以是完整的、遭到破坏的、或遭到破坏并重新密封的酵母膜，其在膜的表面上包含至少一种期望感兴趣抗原或其它蛋白质或所述抗原或其它蛋白质至少部分包埋在膜内。
酵母细胞壁制备物的一个例子是在其表面上携带抗原或所述抗原至少部分包埋在细胞壁内的分离的酵母细胞壁，使得该酵母细胞壁制备物在施用于动物时刺激针对疾病靶的所期望的免疫应答。
任何酵母菌株都可用于生成本发明的酵母媒介。酵母是属于以下三个纲之一的单细胞微生物：子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和不完全菌纲(FungiImperfecti)。关于选择用作免疫调控剂的酵母类型的一项考虑是酵母的病原性。在一个实施方案中，酵母是非病原性菌株，诸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。选择非病原性酵母菌株使对接受酵母媒介施用的个体的任何不利效应最小化。然而，如果酵母的病原性可以通过本领域技术人员知道的任何手段(例如突变株)来消除，那么可以使用病原性酵母。依照本发明的一个方面，使用非病原性酵母菌株是优选的。
可用于本发明的酵母菌株的属包括但不限于糖酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)(其可以是病原性的)、隐球酵母属(Cryptococcus)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、和亚罗酵母属(Yarrowia)。在一个方面，酵母属选自糖酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖糖酵母属，而且在一个方面，使用糖酵母属。可用于本发明的酵母菌株的物种包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、罗仑氏隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克思克鲁维酵母乳变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和脂肪溶解亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。应当领会，这些物种中的许多包括多种亚种、型、亚型等，它们意图包括在上述物种内。在一个方面，本发明中使用的酵母种包括啤酒糖酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。啤酒糖酵母是有用的，因为相对易于操作而且用作食品添加剂是“公认是安全的”(Generally Recognized As Safe或GRAS)(GRAS，1997年4月17日FDA建议的 规则62FR18938)。本发明的一个实施方案是能够复制质粒至特别高的拷贝数的酵母菌株，诸如啤酒糖酵母cir°株。该啤酒糖酵母菌株是这样一种菌株，其能够支持容许一种或多种靶抗原和/或抗原融合蛋白和/或其它蛋白质以高水平表达的表达载体。另外，任何突变酵母株都可用于本发明，包括那些展现出所表达靶抗原或其它蛋白质的翻译后修饰降低，诸如延伸N-连接的糖基化的酶中有突变的。
在一个实施方案中，本发明的酵母媒介能够与接受酵母媒介和抗原/药剂投递的细胞类型(诸如树突细胞或巨噬细胞)融合，由此实现特别有效的将酵母媒介和(在许多实施方案中的)一种或多种抗原或其它药剂投递至该细胞类型。在用于本文时，酵母媒介与靶细胞类型的融合指酵母细胞膜或其颗粒与靶细胞类型(例如树突细胞或巨噬细胞)的膜融合而导致合胞体形成的能力。在用于本文时，合胞体指通过细胞合并而生成的多核原生质块。许多病毒表面蛋白(包括免疫缺陷病毒诸如HIV、流感病毒、脊髓灰质炎病毒和腺病毒的那些)和其它促融剂(fusogen)(诸如那些牵涉卵子与精子间融合的)已经显示出能够实现两种膜之间(即病毒与哺乳动物细胞膜之间或哺乳动物细胞膜之间)的融合。例如，在其表面上生成HIV gp120/gp41异源抗原的酵母媒介能够与CD4+T淋巴细胞融合。然而，应当注意，将寻靶模块掺入酵母媒介不是必需的，尽管这可能是有些情况中所期望的。在酵母媒介胞外表达抗原情况中，这可以是本发明酵母媒介的另一项优点。可用于本发明的酵母媒介一般易于由树突细胞(以及其它细胞，诸如巨噬细胞)摄取。
在本发明的一些实施方案中，基于酵母的免疫疗法组合物包括至少一种抗原、其免疫原性域、或其表位。可用于本发明的抗原包括期望针对它引发免疫应答的任何抗原(下文更为详细地描述)。
在本发明的一些实施方案中，基于酵母的免疫疗法组合物不表达或以其它方式含有或展示抗原，尽管在这种情况中，酵母媒介可任选表达一种或多种免疫刺激性分子。在本发明的这个实施方案中，抗原由一种或多种不同免疫疗法组合物来提供，如本文中描述的，诸如基于病毒的免疫疗法组合物。因为本发明中使用的免疫疗法组合物均可给免疫系统提供一些独特的“危险信号”或共刺激性信号，因此只有一种组合物包含抗原可能就足以提供载体的贡献了。
依照本发明，术语“酵母媒介-抗原复合物”或“酵母-抗原复合物”一 般用于描述酵母媒介与抗原的任何联合体，而且可以与“基于酵母的免疫疗法组合物”互换使用，当此类组合物如上文所述用于引发免疫应答时。此类联合体包括由酵母(重组酵母)进行的抗原的表达、将抗原导入酵母、抗原物理附着至酵母、及酵母与抗原混合在一起(诸如在缓冲液或其它溶液或配制剂中)。这些类型的复合物在下文中有详细描述。
在一个实施方案中，将用于制备所述酵母媒介或作为所述酵母媒介的酵母细胞(完整酵母)用编码蛋白质(例如抗原或药剂)的异源核酸分子转染，使得该酵母细胞表达该蛋白质。此类酵母在本文中也称为重组酵母或重组酵母媒介。然后可以施用酵母细胞，或者可以将酵母细胞杀死，或者可以将它衍生化，诸如通过形成酵母原生质球、胞质体、空细胞、或亚细胞颗粒。还可以将酵母原生质球直接用重组核酸分子转染(例如从完整酵母生成原生质球，然后转染)，用以生成表达抗原或其它蛋白质的重组原生质球。
一方面，将用于制备所述酵母媒介的酵母细胞或酵母原生质球用编码抗原或其它蛋白质的重组核酸分子转染，使得该酵母细胞或酵母原生质球重组表达该抗原或其它蛋白质。在这方面，使用重组表达抗原或其它蛋白质的酵母细胞或酵母原生质球来生成一种酵母媒介，其包含酵母胞质体、酵母空细胞、或酵母膜颗粒或酵母细胞壁颗粒，或其级分。
由本发明的酵母媒介生成的抗原和/或其它蛋白质的数目是酵母媒介合理生成的抗原和/或蛋白质的任何数目，典型范围为至少一种至至少大约6种或更多，包括大约2种至大约6种异源抗原和/或其它蛋白质。
本发明酵母媒介中的抗原或其它蛋白质表达可以使用本领域技术人员知道的技术来实现。简言之，在一个方面，以这样一种方式将编码至少一种期望抗原或其它蛋白质的核酸分子插入表达载体，使得该核酸分子与转录控制序列可操作连接，从而在转化入宿主酵母细胞时能够实现核酸分子的组成性的或受调节的表达。编码一种或多种抗原和/或其它蛋白质的核酸分子可以在一种或多种表达载体上，可操作连接至一种或多种表达控制序列。特别重要的表达控制序列是那些控制转录起始的，诸如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子可用于本发明，而且多种此类启动子是本领域技术人员知道的。用于在啤酒糖酵母中表达的启动子包括但不限于编码如下酵母蛋白质的基因的启动子：醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、翻译延长因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶(GAPDH；也称为TDH3，即磷酸丙糖脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7)、UDP-半乳糖差向异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括杂合启动子，诸如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子，而且包括ADH2/GAPDH启动子(其在细胞中的葡萄糖浓度低时(例如大约0.1％至大约0.2％)被诱导)以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，知道许多上游激活序列(UAS)，也称为增强子。用于在啤酒糖酵母中表达的上游激活序列包括但不限于编码如下蛋白质的基因的UAS：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及由GAL4基因产物激活的其它UAS，在一个方面使用ADH2 UAS。因为ADH2 UAS受ADR1基因产物激活，所以可能优选在异源基因可操作连接至ADH2 UAS时过表达ADR1基因。用于在啤酒糖酵母中表达的转录终止序列包括α-因子、GAPDH、和CYC1基因的终止序列。
用于在甲基营养酵母中表达基因的转录控制序列包括编码醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录控制区。
将核酸分子转染入依照本发明的酵母细胞的转染可以通过将核酸分子施用入细胞的任何方法来实现，包括但不限于扩散、主动转运、超声浴、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附、和原生质体融合。使用本领域技术人员知道的方法，可以将所转染的核酸分子整合入酵母染色体或保留在染色体外载体上。携带此类核酸分子的酵母载体的例子在本文中有详细描述。如上所述，酵母胞质体、酵母空细胞、和酵母膜颗粒或细胞壁制备物还可以如下重组生产，使用本领域技术人员知道的技术，将完整的酵母微生物或酵母原生质球用期望核酸分子转染，在其中生成抗原，然后进一步操作微生物或原生质球，以生成含有期望抗原或其它蛋白质的胞质体、空细胞或亚细胞酵母膜提取物或其级分。
在本发明的一个方面，对酵母媒介进行操作，使得抗原通过所表达蛋白质产物的投递或易位而部分的或完全的在酵母媒介表面上表达或提供(胞外表达)。用于实现本发明这个方面的一种方法是使用间隔臂将一种或多种蛋白质定位在酵母媒介的表面上。例如，可以使用间隔臂来创建感兴趣抗原或其它蛋白质与将该感兴趣抗原或其它蛋白质靶向酵母细胞壁的蛋白质的融合蛋白。例如，可用于其它蛋白质靶向的一种此类蛋白质是使得抗原或其它蛋白质靶向酵母细胞壁，从而使得抗原或其它蛋白质定位在酵母表面上的酵 母蛋白质(例如细胞壁蛋白质2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flo1蛋白质)。可以使用酵母蛋白质以外的蛋白质作为间隔臂；然而，对于任何间隔臂蛋白质，最希望免疫原性应当针对靶抗原而非间隔臂蛋白质。因此，如果使用其它蛋白质作为间隔臂，那么所使用的间隔臂蛋白质不应生成这样大的针对间隔臂蛋白质自身的免疫应答，其使得针对靶抗原的免疫应答被淹没。本领域技术人员应当致力于相对于针对靶抗原的免疫应答为小的针对间隔臂蛋白质的免疫应答。如果需要，间隔臂可构建成具有切割位点(例如蛋白酶切割位点)，容许容易地切下抗原或自酵母加工掉抗原。可以使用测定免疫应答量级的任何已知方法(例如抗体生成、溶解测定法等)，它们是本领域技术人员早就知道的。
定位有待在酵母表面上暴露的靶抗原或其它蛋白质的另一种方法是利用信号序列诸如糖基磷脂酰肌醇(GPI)将靶物锚定至酵母细胞壁。或者，定位可以通过附加使感兴趣抗原或其它蛋白质经易位入内质网(ER)而靶向入分泌途径的信号序列，使得抗原与结合至细胞壁的蛋白质(例如cwp)结合来实现。
一方面，间隔臂蛋白质是酵母蛋白质。酵母蛋白质可以由介于大约2个和大约800个氨基酸之间的酵母蛋白质组成。在一个实施方案中，酵母蛋白质是大约10-700个氨基酸。在另一个实施方案中，酵母蛋白质是大约40-600个氨基酸。本发明的其它实施方案包括至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸、至少500个氨基酸、至少550个氨基酸、至少600个氨基酸、或至少650个氨基酸的酵母蛋白质。在一个实施方案中，酵母蛋白质的长度是至少450个氨基酸。
使用酵母蛋白质能稳定融合蛋白在酵母媒介中的表达，防止所表达融合蛋白的翻译后修饰，和/或将融合蛋白靶向酵母中的特定隔室(例如表达在酵母细胞表面上)。为了投递入酵母分泌途径，待使用的例示性酵母蛋白质包括但不限于：Aga(包括但不限于Aga1和/或Aga2)；SUC2(酵母转化酶)；α因子信号前导序列；CPY；Cwp2p，用于其在细胞壁中的定位和保持；BUD基因，用于子细胞形成的初始阶段中在酵母细胞芽处的定位；Flo1p；Pir2p；和Pir4p。
可以使用其它序列来进行蛋白质对酵母媒介其它部分的靶向、保持、和/或稳定，例如在胞质溶胶或线粒体中。可用于任何上述实施方案的合适酵母 蛋白质的例子包括但不限于SEC7；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油激酶PGK和磷酸丙糖异构酶TPI基因产物，因其在葡萄糖中的可抑制表达和胞质溶胶定位；热休克蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1，其表达是诱导性的而且其蛋白质在细胞暴露于热处理时是更加热稳定的；线粒体蛋白质CYC1，用于输入线粒体；ACT1。
在一个实施方案中，使用控制酵母糖基化的量来控制酵母对抗原的表达，特别是在表面上的。酵母糖基化的量可影响在表面上表达的抗原的免疫原性和抗原性，因为糖模块趋向于是大体积的。因此，在依照本发明调控酵母时应当考虑酵母表面上糖模块的存在及其对靶抗原周围三维空间的影响。可使用任何方法来降低酵母糖基化的量(或提高它，如果需要的话)。例如，可以使用因具有低糖基化而选择的酵母突变株(例如mnn1、och1和mnn9突变体)，或者可以通过突变靶抗原上的糖基化受体序列来消除。或者，可以使用具有简化糖基化样式的酵母，例如毕赤酵母属。也可以使用降低或改变糖基化的方法来处理酵母。
在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介中重组表达抗原或其它蛋白质的替代，给酵母媒介胞内加载蛋白质或肽，或者碳水化合物或其它充当抗原和/或可用作依照本发明的免疫调控剂或生物应答修饰剂的分子。随后，现在胞内包含抗原和/或其它蛋白质的酵母媒介可以施用于患者或加载入载体诸如树突细胞。肽和蛋白质可以通过本领域技术人员知道的技术直接插入本发明的酵母媒介，诸如通过扩散、主动转运、脂质体融合、电穿孔、吞噬作用、冻融循环和超声浴。可以直接加载肽、蛋白质、碳水化合物、或其它分子的酵母媒介包括完整酵母，以及原生质球、空细胞或胞质体，它们可以在生成后加载抗原和其它药剂。或者，可以给完整酵母加载抗原和/或药剂，然后由其制备原生质球、空细胞、胞质体、或亚细胞颗粒。在此实施方案中可以将任何数目的抗原和/或其它药剂加载入酵母媒介，从至少1、2、3、4个/种或任何整数直至数百或数千抗原和/或其它药剂，诸如例如通过加载微生物或其部分会提供的。
在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其它药剂物理附着至酵母媒介。抗原和/或其它药剂对酵母媒介的物理附着可以通过本领域的任何合适方法来实现，包括共价的和非共价的结合方法，包括但不限于化学交联抗原和/或其它药剂至酵母媒介的外表面或生物学连接抗原和/或其它药剂至酵母媒 介的外表面，诸如通过使用抗体或其它结合配偶。化学交联可以通过例如以下方法来实现，包括戊二醛连接、光亲和标记、碳二亚胺处理、能够连接二硫键的化学药品的处理、和本领域的标准交联化学药品的处理。或者，可以使化学药品接触酵母媒介，改变酵母膜的脂双层或细胞壁的组成的电荷，使得酵母的外表面更有可能融合或结合具有特定电荷特征的抗原和/或其它药剂。靶向剂(诸如抗体、结合肽、可溶性受体和其它配体)也可掺入抗原作为融合蛋白或以其它方式与抗原联合用于将抗原结合至酵母媒介。
在又一个实施方案中，酵母媒介和抗原或其它蛋白质通过更被动的、非特异性的或非共价的结合机制彼此联合，诸如通过在缓冲液或其它合适配制剂(例如混合物)中一起温和混合酵母媒介和抗原或其它蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，将酵母媒介和抗原或其它蛋白质二者都胞内加载入载体，诸如树突细胞或巨噬细胞，以形成本发明的治疗性组合物或疫苗。
在一个实施方案中，可以将完整酵母(有或无异源抗原或其它蛋白质的表达)磨碎或以一定方式加工以生成酵母细胞壁制备物、酵母膜颗粒或酵母片段(即不完整的)，而在有些实施方案中，酵母片段可以与包括抗原(例如DNA疫苗、蛋白质亚单位疫苗、杀死的或灭活的病原体)的其它组合物一起提供或施用来增强。例如，酶学处理、化学处理或物理力(例如机械剪切或超声处理)可以用来将酵母破碎成多个用作佐剂的部分。
在本发明的一个实施方案中，在本发明中有用的酵母媒介包括已经杀死或灭活的酵母媒介。杀死或灭活酵母可通过本领域已知的多种合适方法任一来实现。例如，酵母热灭活是灭活酵母的标准方式，而且，本领域技术人员能通过本领域已知的标准方法监测靶抗原的结构变化，如果需要的话。或者，可以采用灭活酵母的其它方法，诸如化学的、电学的、放射性的或UV方法。参见例如标准酵母培养教科书中披露的方法学，诸如Methods ofEnzymology，Vol.194，Cold Spring Harbor Publishing(1990)。任何所用灭活策略应当考虑靶抗原的二级、三级或四级结构及保持此类结构以优化其免疫原性。
生产重组酵母媒介和酵母媒介表达抗原和/或其它蛋白质(例如本文所述药剂)的有效条件包括能培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是含有可同化的碳水化合物源、氮源和磷酸盐源，以及适宜的盐、矿物质、金属 和其它养分，诸如如维生素和生长因子的水性培养基。培养基可以包含复合营养素，或者可以是确定成分的极限培养基。本发明的酵母菌株可以在多种容器中培养，包括但不限于生物反应器、锥形烧瓶、试管、微量滴定皿、和皮氏培养皿。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧含量进行。此类培养条件在本领域普通技术人员的专业知识内(参见例如Guthrie et al.(eds.)，1991，Methods in Enzymology，vol.194，Academic Press，San Diego)。
在本发明的一些方面，在中性pH条件下培养酵母，而且特别是在pH水平维持在至少5.5的培养基中，即培养液的pH不容许降至pH 5.5以下。在其它方面，酵母在维持在大约5.5的pH水平培养。本领域技术人员将领会，培养过程不仅包括酵母培养的开始，还包括培养物的维持。因为已知酵母培养会随时间变酸(即降低pH)，所以在培养过程中必须小心监测pH水平。此工艺详细记载于2008年8月14日公布的WO 2008/097863。
可以使用本领域技术人员知道的许多技术将酵母媒介配制入本发明的基于酵母的免疫疗法组合物或产品，包括直接施用于受试者的制备物，或者首先加载入载体。例如，可以通过冻干将酵母媒介干燥。包含酵母媒介的配制剂还可以如下制备，即在蛋糕或药片中包装酵母，诸如对烘烤或酿造操作中所使用酵母的所进行的那样。另外，可以将酵母媒介与药学可接受赋形剂混合，诸如宿主或宿主细胞耐受的等张缓冲液。此类赋形剂的例子包括水、盐水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液、Hank氏溶液、和其它含水生理平衡盐溶液。也可使用非水媒介，诸如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯、或甘油三酯。其它有用配制剂包括含有粘性增强剂诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或右旋糖苷的悬浮液。赋形剂也可含有微量的添加剂，诸如增强等张性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的例子包括硫柳汞、间或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准配制剂可以是注射液，或者是固体，可以在合适的液体中取用，成为悬浮液或溶液进行注射。如此，在非液体配制剂中，赋形剂可包含例如右旋糖、人血清清蛋白、和/或防腐剂，可以在施用前对其添加无菌水或盐水。
可用于本发明免疫疗法组合物的抗原
依照本发明，术语“抗原”在本文中的一般使用指：蛋白质(肽、部分蛋白质、全长蛋白质)的任何部分，其中所述蛋白质是天然存在的或合成衍生的；细胞组合物(完整细胞、细胞溶解物或破碎的细胞)；有机体(完整有机 体、溶解物或破碎的细胞)；或碳水化合物、或其它分子、或其一部分。在一些实施方案中，抗原可引发针对免疫系统成分(例如T细胞、抗体)遭遇的相同或相似抗原的抗原特异性免疫应答(例如体液的和/或细胞介导的免疫应答)。术语“癌症抗原”在本文中可以与术语“肿瘤特异性抗原”、“肿瘤相关抗原”、“癌症相关靶”或“肿瘤相关靶”互换使用。
抗原可以小至单一表位，或较大，而且可以包括多个表位。因此，抗原的大小可以小至大约5-12个氨基酸(例如肽)，大至：部分蛋白质、全长蛋白质，包括多聚体和融合蛋白、嵌合蛋白、或激动性蛋白质或肽。另外，抗原可以包括碳水化合物
在提到免疫应答的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的一个子集，因此在有些情况中可以与术语“抗原”互换使用。免疫原，在用于本文时，描述引发体液的和/或细胞介导的免疫应答(即免疫原性的)，使得免疫原对个体的施用引起针对个体的免疫系统遭遇的相同或相似抗原的抗原特异性免疫应答的抗原。
给定抗原的“免疫原性域”可以是抗原中包含至少一种在施用于动物时充当免疫原的表位的任何部分、片段或表位(例如肽片段或亚单位或抗体表位或其它构象表位)。例如，单一蛋白质可以包含多种不同免疫原性域。免疫原性域并不必然是蛋白质内的线性序列，诸如在体液免疫应答的情况中。
“表位”在本文中定义为给定抗原内足以引发免疫应答的单一免疫原性位点。本领域技术人员会认可，T细胞表位在大小和组成上与B细胞表位不同，而且经I型MHC途径呈递的表位与经II型MHC途径呈递的表位不同。表位可以是线性序列或构象表位(保守结合区)。
在本文所述任何免疫疗法组合物中有用的抗原可以包括希望针对它引发免疫应答的任何抗原或其免疫原性域其，而且特别包括针对此类抗原的治疗性免疫应答会对个体有益的任何抗原或其免疫原性域。抗原可以包括但不限于：癌症抗原，病毒抗原，过表达的哺乳动物细胞表面分子，细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原，蠕虫抗原，外寄生物抗原，携带一个或多个突变氨基酸的哺乳动物细胞分子，正常情况下由哺乳动物细胞在出生前或新生时表达的蛋白质，其表达由流行病学因子(例如病毒)的插入诱导的蛋白质，其表达由基因易位诱导的蛋白质，和其表达由调节序列的突变诱导的蛋白质。
在本发明的一个方面，在本发明的一种或多种免疫疗法组合物中有用的 抗原包括任何癌症或肿瘤相关抗原。在一个方面，抗原包括与瘤形成前或增生状态有关的抗原。抗原也可以与癌症有关或引起癌症。此类抗原可以是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或组织特异性抗原、其表位，或其表位激动剂。癌症抗原包括但不限于来自任何肿瘤或癌症的抗原，包括但不限于黑素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大细胞瘤、白血病、淋巴瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌(包括结肠直肠癌)、肾细胞癌、造血瘤形成及其转移癌。
合适的癌症抗原包括但不限于至癌胚抗原(CEA)及其表位诸如CAP-1、CAP-1-6D(GenBank登录号M29540或Zaremba et al.，1997，Cancer Research 57：4570-4577)、MART-1(Kawakami et al，J.Exp.Med.180：347-352，1994)、MAGE-1(美国专利No.5,750,395)、MAGE-3、GAGE(美国专利No.5,648,226)、GP-100(Kawakami et al.，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 91：6458-6462，1992)、MUC-1(例如Jerome et al.，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))、MUC-2，突变的Ras癌蛋白(参见例如美国专利No.7,465,454和7,563,447)、正常的和突变的p53癌蛋白(Hollstein et al，Nucleic Acids Res.22：3551-3555，1994)、PSMA(前列腺特异性膜抗原；Israeli et al.，Cancer Res.53：227-230，1993)、酪氨酸酶(Kwon et al，PNAS 84：7473-7477，1987)、TRP-1(gp75)(Cohen et al，Nucleic AcidRes.18：2807-2808，1990；美国专利No.5,840,839)、NY-ESO-1(Chen et al，PNAS 94：1914-1918，1997)、TRP-2(Jackson et al.，EMBOJ，11：527-535，1992)、TAG72、KSA、CA-125、PSA(前列腺特异性抗原；Xue et al.，The Prostate，30：73-78(1997))、HER-2/neu/c-erb/B2(美国专利No.5,550,214)、EGFR(表皮生长因子受体；Harris et al.，Breast CancerRes.Treat，29：1-2(1994))、hTERT、p73、B-RAF(B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶；Sithanandam et al.，(1990)，Oncogene 5(12)：1775-80)、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、冯·希佩尔-林道蛋白蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1(也称作P-糖蛋白)、Flt-3、BRCA-1(乳腺癌1；美国专利No.5,747,282)、BRCA-2(乳腺癌2；美国专利No.5,747,282))、Bcr-Abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、Brachyury(GenBank登录号NP_003172.1或NM_003181.2；Edwards et al.，1996，Genome Res.6：226-233)、HERV-H(人 内源逆转录病毒H)、HERV-K(人内源逆转录病毒K)、TWIST(GenBank登录号NM_000474和NP_000465)、间皮素(Kojima et al.，1995，J.Biol.Chem.270(37)：21984-90；Chang and Pastan，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1)：136-40)、NGEP(在前列腺中表达的新基因；Bera etal.，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(9)：3059-3064；Cereda et al.，2010，CancerImmunol.Immunother.59(1)：63-71；GenBank登录号AAT40139或AAT40140)、组织特异性抗原和此类抗原的修饰、此类抗原的间接变体、和/或此类抗原的表位激动剂。本领域知道其它癌症抗原。也可以通过本领域已知方法，诸如美国专利No.4,514,506中记载的那些来鉴定、分离和克隆其它癌症抗原。癌症抗原也可包括一种或多种生长因子及其剪接变体。
在本发明的一个方面，癌症抗原是癌胚抗原(CEA)，包含其表位或由其表位组成的多肽(诸如CAP-1，CAP-1-6D(GenBank登录号M29540或Zaremba et al.，1997，CancerResearch 57：4570-4577))、经修饰CEA、CEA的剪接变体、此类CEA蛋白的表位激动剂，和/或包含至少一种CEA免疫原性域或其激动性表位的融合蛋白。在一个方面，CEA是经修饰CEA，与具有2007年3月1日公布的美国专利公开号US 2007_0048860中由核酸序列SEQ ID NO：45编码的SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的经修饰CEA对应的。在一个方面，抗原是具有本文中由SEQ ID NO：1所示核酸序列编码的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的经修饰CEA。
在本发明的一个方面，抗原是突变的Ras癌蛋白。例示性Ras癌蛋白已经记载于例如美国专利No.7,465,454和7,563,447。Ras是已知特定位置处存在几处与一种或多种类型的癌症的发生有关的突变的癌蛋白的一个例子。因此，可构建由含有已知在某些癌症中突变的特定残基的肽组成的融合蛋白，其中每个域含有该位点处的不同突变以覆盖该位点处的数种或所有已知突变。在本发明中有用的融合蛋白可具有一个、两个、或多个域，其中每个域由来自特定蛋白质(相同或不同的蛋白质)的肽组成，每个肽由包括表位或突变氨基酸(诸如在蛋白质中找到的突变氨基酸，其中突变与特定疾病例如癌症有关)及任一侧侧翼的至少4个氨基酸残基组成。例如，关于Ras，可提供一种、两种、三种、或更多种免疫原性域，其包含包括位置12及任一侧的至少4个氨基酸，其中每种域具有对非突变Ras蛋白中正常存在的甘氨酸的不同替代(例如用缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、或丙氨酸替代甘氨酸)。 再例如，可以提供一种、两种、三种、或更多种免疫原性域，其包含包括位置13及任一侧的至少4个氨基酸，其中每种域具有对非突变Ras蛋白中正常存在的甘氨酸的不同替代(例如用天冬氨酸替代甘氨酸)。又例如，可提供一种、两种、三种、或更多种免疫原性域，其包含包括位置61及任一侧的至少4个氨基酸，其中每种域具有对非突变Ras蛋白中正常存在的谷氨酰胺的不同替代(例如用亮氨酸、精氨酸、或组氨酸替代谷氨酰胺)。例如，癌症抗原包含野生型Ras蛋白的至少5-9个连续氨基酸残基的片段，其含有相对于野生型Ras蛋白的氨基酸位置12、13、59、61或76，其中位置12、13、59、61或76处的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白是突变的。在一个方面，融合蛋白构建体由以符合读码框的方式与另一种突变的肿瘤抗原(例如相对于野生型Ras蛋白序列包含至少一处突变的Ras蛋白)融合的至少一种肽组成，其中该肽选自下组：(a)至少包含野生型Ras(人或鼠K-Ras、N-Ras或H-Ras)位置8-16的肽，其中相对于野生型Ras位置12处的氨基酸残基与野生型Ras相比是突变的；(b)至少包含野生型Ras位置9-17的肽，其中相对于野生型Ras位置13处的氨基酸残基相对于野生型Ras是突变的；(c)至少包含野生型Ras位置55-63的肽，其中相对于SEQ ID NO：3位置59处的氨基酸残基与野生型Ras相比是突变的；(d)至少包含野生型Ras位置57-65的肽，其中相对于野生型Ras位置61处的氨基酸残基与野生型Ras相比是突变的；或(e)至少包含野生型Ras位置72-80的肽，其中相对于野生型Ras位置76处的氨基酸残基与野生型Ras相比是突变的。注意到这些位置在人和小鼠K-Ras、N-Ras和H-Ras间是相同的，因为人和小鼠序列在蛋白质的这个区域是相同的且因为K-Ras、H-Ras和N-Ras在这个区域是相同的。在一个方面，适于用作本发明抗原的Ras融合蛋白选自：SEQ ID NO：4(由本文中SEQ ID NO：3所示核酸序列编码)，SEQ ID NO：6(由本文中SEQ ID NO：5所示核酸序列编码)，SEQ ID NO：8(由本文中SEQID NO：7所示核酸序列编码)，和/或SEQ ID NO：10(由本文中SEQ ID NO：9所示核酸序列编码)。
在本发明的一个方面，抗原是人Brachyury。人Brachyury的氨基酸序列在本文中呈现于SEQ ID NO：15，其由SEQ ID NO：14所示核酸序列编码。
在本发明的另一个方面，在本发明的一种或多种免疫疗法组合物中有用的抗原包括与病原体或由病原体引起的与病原体有关的疾病或状况有关的任何抗原。此类抗原包括但不限于病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原、蠕虫抗 原、寄生物抗原、外寄生物抗原、原生动物抗原、或来自任何其它感染因子的抗原。
在一个方面，抗原来自病毒，包括但不限于腺病毒，沙粒病毒，布尼亚病毒，冠状病毒，柯萨奇病毒，巨细胞病毒，埃巴二氏病毒，黄病毒，肝DNA病毒，肝炎病毒，疱疹病毒，流感病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，粘病毒，正粘病毒，乳头瘤病毒，乳多泡病毒，副流感病毒，副粘病毒，细小病毒，微小RNA病毒，痘病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，呼肠病毒，杆状病毒，风疹病毒，披膜病毒，和水痘病毒。其它病毒包括T-淋巴营养性病毒，诸如人T-细胞淋巴营养性病毒(HTLV，诸如HTLV-I和HTLV-II)，牛白血病病毒(BLVS)和猫白血病病毒(FLV)。慢病毒包括但不限于人(HIV，包括HIV-1或HIV-2)，猿(SIV)，猫(FIV)和犬(CIV)免疫缺陷病毒。在一个实施方案中，病毒抗原包括那些来自非致癌病毒的。
在另一个方面)，(抗原来自选自下述的属的感染因子：曲霉(Aspergillus)，博德特氏菌(Bordatella，Bordetella)，布鲁丝虫(Brugia)，假丝酵母(Candida)，衣原体(Chlamydia)，球虫(Coccidia)，隐球菌(Cryptococcus)，恶丝虫(Dirofilaria)，埃希氏菌(Escherichia)，弗朗西丝氏菌(Francisella)，淋球菌(Gonococcus)，组织胞浆菌(Histoplasma)，利什曼原虫(Leishmania)，分枝杆菌(Mycobacterium)，支原体(Mycoplasma)，草履虫(Paramecium)，百日咳(Pertussis)，疟原虫(Plasmodium)，肺炎球菌(Pneumococcus)，肺囊虫(Pneumocystis)，立克次氏体(Rickettsia)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)，弓形体(Toxoplasma)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，和耶尔森氏菌(Yersinia)。在一个方面，感染因子选自镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)或间日疟原虫(Plasmodium vivax)。
在一个方面，抗原来自来自选自下述的科的细菌：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，微球菌科(Micrococcaceae)，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，支原体科(Mycoplasmataceae)，和立克次氏体科(Rickettsiaceae)。在一个方面，细菌是选自下述的属的：假单胞菌(Pseudomonas)，博德特氏菌(Bordetella)，分枝杆菌(Mycobacterium)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，芽孢杆菌(Bacillus)，沙门氏菌(Salmonella)，弗朗西丝氏菌(Francisella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)，埃希氏 菌(Escherichia)，肠球菌(Enterococcus)，巴斯德氏菌(Pasteurella)，和耶尔森氏菌(Yersinia)。在一个方面，细菌来自选自下述的种：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)，鼻疽假单胞菌(Pseudomonasmallei)，类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)，土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，肠沙门氏菌(Salmonellaenteric)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，大肠埃希氏菌/大肠杆菌(Escherichiacoli)和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)。
在一个方面，抗原来自真菌，此类真菌包括但不限于来自下述的真菌：糖酵母(Saccharomyces spp.)，曲霉(Aspergillus spp.)，隐球菌(Cryptococcus spp.)，球孢子菌(Coccidioides spp.)，脉孢菌(Neurospora spp.)，组织胞浆菌(Histoplasma spp.)，或芽生菌(Blastomyces spp.)。在一个方面，真菌来自选自下述的种：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，黑曲霉(A.niger)，土曲霉(A.terreus)，构巢曲霉(A.nidulans)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，Coccidioides posadasii或新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)。引起侵入性疾病的最常见曲霉属物种包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉和构巢曲霉，而且可以在例如具有免疫抑制或T细胞或吞噬细胞损伤的患者中找到。已经将烟曲霉与哮喘、曲霉肿和侵入性曲霉病联系起来。球孢子菌病(也称作圣华金谷热)是由粗球孢子菌引起的真菌病，而且可导致急性呼吸道感染和慢性肺部状况或扩散至脑膜、骨、和关节。本发明的方法还靶向隐球菌病相关状况，例如在非免疫抑制受试者或免疫抑制受试者，诸如感染有HIV的受试者中。
在一些实施方案中，抗原是融合蛋白。在本发明的一个方面，融合蛋白可包括两种或更多种抗原。在一个方面，融合蛋白可包括一种或多种抗原的两种或更多种免疫原性域和/或两种或更多种表位。涵盖抗原、其免疫原性域、和/或其表位的任何组合以用于本发明的组合物。含有此类抗原、其免疫原性域、和/或其表位的免疫治疗性组合物可以在广泛的患者中提供抗原特异性免疫接种。例如，在本发明中有用的融合蛋白可具有多个域(两个或更多个域)，其中每个域由来自特定蛋白质的肽或多肽组成，该肽或多肽由包括在蛋白质中找到的突变氨基酸及任一侧侧翼的至少4个氨基酸残基组成，其中突变与 特定疾病或状况有关。
在一个实施方案中，可用作在本发明中有用的基于酵母的免疫治疗性组合物的成分的融合蛋白是使用对于在酵母中表达异源抗原特别有用的构建体生成的。典型地，将期望的抗原性蛋白质或肽在其氨基末端融合至：(a)稳定融合蛋白在酵母媒介中的表达或阻止对所表达的融合蛋白的翻译后修饰的特定合成肽(此类肽有详细记载，例如2004年8月12日公布的美国专利公开号2004-0156858A1，通过述及完整收入本文)；(b)内源酵母蛋白质的至少一部分，其中任一融合配偶提供显著增强的在酵母中表达蛋白质的能力和/或阻止酵母细胞对蛋白质的翻译后修饰(此类蛋白质也有详细记载，例如美国专利公开号2004-0156858A1，见上文)；和/或(c)引起融合蛋白在酵母表面上表达的酵母蛋白质的至少一部分(例如Aga蛋白，详细记载于WO2008/019366)。另外，本发明包括融合至编码抗原的构建体C端的肽的使用，特别是用于选择和鉴定蛋白质。此类肽包括但不限于任何合成或天然肽，诸如肽标签(例如6X His)或任何其它短表位标签。附着至依照本发明的抗原C端的肽可以在有或没有添加上文所讨论的N端肽的情况中使用。
依照本发明，在一个实施方案中，该两种或更多种不同免疫疗法组合物优选靶向相同抗原。在这个实施方案中，相同抗原或其免疫原性域通常由每一种免疫疗法组合物载体表达，尽管可以将抗原和/或其免疫原性域与组合物之一或二者混合，和/或在基于酵母的免疫疗法组合物的情况中，可以将抗原附着至酵母媒介和/或在酵母媒介内部携带抗原。在一个实施方案中，两种组合物都可靶向相同抗原，尽管每一种组合物可靶向相同抗原内的不同表位或免疫原性域。在一个实施方案中，每一种免疫疗法组合物靶向不同抗原和/或其免疫原性域和/或表位。例如，可能有利的是，使用一种组合物靶向一种抗原，诸如Ras，并使用另一种免疫疗法组合物靶向另一种也在相同癌症或相同癌症的子集中表达的癌症抗原，诸如CEA。在另一个实施方案中，提供一种类型的免疫疗法组合物的组合，其中有相同类型内的至少两种不同抗原组合物(例如表达突变的Ras或包含突变的Ras的多个免疫原性域的融合蛋白的基于酵母的免疫疗法组合物和表达CEA或本文所述经修饰CEA的基于酵母的免疫疗法组合物的组合)。这种组合与另一种类型的表达相同或不同抗原的免疫疗法组合物(例如基于病毒的组合物)并行施用。在此类实施方案一个方面，可以混合各种组合，或者在另一个方面，不需要物理混合各种组合， 而是可以并行施用，诸如施用于相同部位或不同部位，或在相同施用期内施用。在又一个实施方案中，两种或更多种不同免疫疗法组合物之一靶向一种或多种抗原，而另一种免疫疗法组合物作为佐剂提供，不需要靶向任何抗原(即该组合物利用其非抗原特异性免疫疗法好处)，或不需要与另一组合物靶向相同癌症抗原。更特别地，因为每一种本文所述免疫疗法载体已显示出促成组合物功效的载体特异性效果，所以在一些实施方案中，可以只有一种载体与抗体相关或表达抗原，而另一种载体并行使用以提供非抗原特异性免疫疗法效果。
本发明组合物的使用方法
在本发明的方法中，首先将两种或更多种本文所述免疫疗法组合物并行施用于个体。如本文中关于组合物施用使用的，术语“并行”表示施用每一种组合物，特别是此类组合物的第一剂，尤其是在基本上相同时间或在相同剂量给药期内，或在发生免疫疗法组合物引发免疫系统的初始效果期间的时期内(例如在1-2天和优选不到1-2天内)。为了清除起见，并行施用不要求在完全相同时刻施用所有组合物，而是所有组合物的施用应当发生在患者的一次安排好的剂量给药内，以用每一种组合物并行引发免疫系统(例如可以首先施用一种组合物，接着立即或接近施用第二组合物，等等)。在一些情况中，诸如当将组合物施用于相同部位时，组合物可以混合提供，尽管甚至在施用于相同部位时，可能优选在相同剂量给药期期间序贯施用每一种组合物。在一个方面，在相同1-2天内，和在一个方面，在同一天，和在一个方面，在相同12小时时期内，和在一个方面，在相同8小时时期内，和在一个方面，在相同4小时时期内，和在一个方面，在相同1、2或3小时时期内，和在一个方面，在相同1、2、3、4、6、7、8、9、或10分钟内施用组合物。
在一些情况中，第一或第二免疫疗法组合物任一的施用比另一种更加频繁。例如，在一个方面，当第一免疫疗法组合物是基于病毒的免疫疗法组合物且第二免疫疗法组合物是基于酵母的免疫疗法组合物时，第二免疫疗法组合物的施用可以比第一免疫疗法组合物更加频繁。例如，在一个方面，在第一和第二免疫疗法组合物的并行施用之间，第二免疫疗法组合物可以多施用一次、两次、三次或更多次。例如，因为免疫接种基于病毒的免疫疗法组合物导致延长的抗原呈递，所以以较短的频率施用这种组合物可能不是必需的或有益的，而基于酵母的免疫疗法组合物呈递抗原的离散块，所以它们可以 更加频繁地施用，没有抑制免疫应答的担心。例如，在一个方面，每、2、3或4或更多周施用基于病毒的免疫疗法组合物，而以1周间隔施用基于酵母的免疫疗法组合物，其可以随着总治疗期延长而延长至更长的间隔(2、3或4周或更久)。
在本发明的一个实施方案中，并行施用两种或更多种免疫疗法组合物，但是施用于患者中的不同身体部位。例如，一种组合物可施用于个体身体一侧的部位，而另一种组合物可施用于个体身体另一侧的部位。再例如，一种组合物可施用于特定引流淋巴结附近的部位，而另一种组合物可施用于不同引流淋巴结附近的部位。在另一个实施方案中，两种或更多种不同免疫疗法组合物并行施用于患者中相同或实质性邻近的部位。实质性邻近的部位指与施用第一组合物的注射部位不是完全相同，但是与第一注射部位极其接近(挨着或接近)的部位。在一个实施方案中，混合施用两种或更多种不同免疫疗法组合物。在本发明的一个方面，皮下、肌肉内、或肿瘤内施用本发明基于病毒的免疫疗法组合物，且皮下施用基于酵母的组合物。
一些实施方案可包括施用办法的组合。例如，使用基于酵母的免疫疗法组合物(第一组合物)和基于病毒的免疫疗法组合物(第二组合物)的并行施用的例示性情况，基于酵母的组合物的剂量的一部分(例如基于酵母的组合物的总剂量的一部分)可以与基于病毒的免疫疗法组合物的部分或整个剂量混合施用或施用于与基于病毒的免疫疗法组合物的部分或整个剂量相同或邻近的部位，然后将基于酵母的免疫疗法组合物的剂量的剩余部分施用于个体中其它部位。类似地，基于病毒的组合物的剂量的一部分可以与基于酵母的组合物的部分或整个剂量混合施用或施用于与基于酵母的组合物的部分或整个剂量相同或邻近的部分，然后基于病毒的免疫疗法组合物的剩余部分施用于个体中其它部位。在一个实施方案中，在要分部分施用于个体上不同部位的基于病毒的和/或基于酵母的免疫疗法组合物的单一剂量内，一些部分可含有或表达靶抗原，而其余部分可以不这样(即其余部分可以是孔载体或表面共刺激性分子、细胞因子、或其它非抗原剂)。
疫苗或组合物的施用可以是系统的、粘膜的和/或邻近靶部位的位置(例如肿瘤附近)。优选施用路径对本领域技术人员会是显然的，这取决于要预防或治疗的状况的类型、使用的抗原、和/或靶细胞群或组织。各种可接受施用方法包括但不限于静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、结节内施用、 冠状动脉内施用、动脉内施用(例如入颈动脉)、皮下施用、经皮投递、气管内施用、皮下施用、关节内施用、心室内施用、吸入(例如气雾剂)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺部施用、导管注入、和直接注射入组织。在一个方面，施用路径包括：静脉内，腹膜内、皮下、皮内、结节内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内、和脊柱内。胃肠外投递可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管(venal catheter)路径。耳的投递可以包括滴耳液，鼻内投递可以包括滴鼻液或鼻内注射，而眼内投递可以包括滴眼液。气溶胶(吸入)投递还可以使用本领域标准方法来进行(参见例如Stribling et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992，通过述及将其完整收入本文)。调控粘膜免疫的其它施用路径在病毒感染的治疗中是有用。此类路径包括支气管、皮内、肌肉内、鼻内、其它吸入、直肠、皮下、表面、经皮、阴道和尿道路径。在一个方面，本发明的免疫治疗性组合物皮下施用。优选施用方法包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结节内、肌肉内、经皮或肿瘤内。剂量施用至少一次。可以根据指示施用后续剂量，而且通常利用后续剂量。
更特别地，在一个实施方案中，本发明的两种或更多种不同免疫疗法组合物的初始并行施用可以继以一种和(在一个实施方案中)所有(两种或更多种)免疫疗法组合物的后续加强剂量。加强剂量(加强)可以相隔任何合适时期施用，而且通常相隔1、2、3、4、5、6、7、或8周施用。两种或更多种免疫疗法组合物的加强剂量可以根据需要并行或分开施用，但是最通常的是并行施用，正如引发剂量。正如引发剂量，施用方法可使用上文关于引发剂量描述的部位和施用策略的任何组合，但不限于与引发剂量相同的施用方案。例如，如果引发剂量施用于两个不同部位(每个部位一种免疫疗法组合物)的话，加强剂量可以施用于相同两个部位、一个部位或邻近部位、或两个不同部位，或者使用上文所述分部分策略。
另外，不需要以与引发剂量完全相同的方式来配制加强剂量。例如，如果每一种免疫疗法组合物在引发剂量中提供抗原和/或其免疫原性域的话，在加强剂量中，两种免疫疗法组合物均可再次提供抗原和/或其免疫原性域，或者只有一种免疫疗法组合物可提供抗原和/或其免疫原性域，而另一种免疫疗法组合物可以是空载体或提供非抗原剂(例如免疫刺激性分子或其它药剂)。还涵盖加强阶段期间对本文所述组合物的其它可能修饰，包括修饰或改变所 使用的病毒载体(例如在引发组合物中使用痘苗病毒而在加强组合物中使用禽痘病毒，或反之亦然)，修饰或改变对酵母媒介(例如酵母株的改变、酵母生成方法的改变、酵母如何提供抗原的改变，诸如表达与混合)，剂量，由一种或多种组合物提供的抗原或域，及免疫刺激性分子或其它药剂的包括或消除或替代。
俗语“单位剂量(unit dose)”在关于本发明组合物的接种物时指适于作为哺乳动物的单一剂量，物理上离散的单元，每个单位含有与所需稀释剂联合的，根据计算，产生期望免疫原性效果的预定数量的免疫疗法组合物。本发明接种物的新颖单位剂量的规格由特定免疫疗法组合物的独特特征和要实现的特定免疫学效果规定且取决于特定免疫疗法组合物的独特特征和要实现的特定免疫学效果。在给个体(优选人)提供本发明的免疫疗法组合物时，施用的重组载体的剂量会随诸如个体的年龄、重量、高度、性别、一般医学状况、先前的医学史、疾病进展、肿瘤负荷、病原体负荷等等因素而变化。
通常将接种物在可耐受(可接受)稀释剂诸如盐水、磷酸盐缓冲盐水或其它生理可耐受稀释剂等等中制备成溶液以形成含水药物组合物。
关于本发明基于重组病毒的免疫疗法组合物，一般而言，希望给接受者提供约105至约1010噬斑形成单位范围中的重组病毒剂量，尽管可以施用更低或更高的剂量，包括但不限于102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或更多噬斑形成单位。用于将重组病毒载体施用入个体的方法的例子包括但不限于离体将肿瘤细胞暴露于重组病毒，或通过静脉内、皮下(S.C.)、皮内(I.D.)或肌肉内(I.M.)施用病毒将重组载体注射入受影响宿主。或者，可以通过直接注射入癌性病损或肿瘤或在药学可接受载体中表面应用来局部施用重组病毒载体或重组病毒载体组合。要施用的携带与编码多种共刺激性分子的核酸序列组合的一种或多种抗原的核酸序列的重组载体的数量基于病毒颗粒的滴度。要施用的抗原的一个优选范围是105至1010个病毒颗粒每只哺乳动物，优选人，尽管可以施用更低或更高的剂量，包括但不限于102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或更多噬斑形成单位。
关于本发明基于酵母的免疫疗法组合物，一般而言，一种合适的单个剂量是当在合适时期里施用一次或多次时，能够以有效引发抗原特异性免疫应答的量给给定细胞类型、组织、或患者身体区域有效提供酵母媒介和抗原(如果包括的话)的剂量。例如，在一个实施方案中，本发明的酵母媒介的单个 剂量为约1x105至约5x107个酵母细胞当量每千克施用组合物生物体体重。更优选地，本发明的酵母媒介的单个剂量为约0.1 Y.U.(1x106个细胞)至约100Y.U.(1x109个细胞)每剂(即每个生物体)，包括任何中间剂量，增量为0.1x106个细胞(即1.1x106，1.2x106，1.3x106...)。优选剂量包括1Y.U和40Y.U.之间和更优选地10Y.U.和40Y.U之间的剂量。在一个实施方案中，在个体上不同部位但在相同剂量给药期期间施用剂量。例如，40Y.U.剂量可以通过在一个剂量给药期期间注射10Y.U.剂量至个体上四个不同部位来施用。
如果要免疫接种的哺乳动物早就罹患疾病(例如癌症或转移癌或慢性病原体感染)的话，在并行施用本文所述不同免疫疗法组合物植物，可以与用于治疗疾病的其它治疗性处理(例如化学疗法、放射疗法、小分子疗法、细胞因子疗法、抗病毒疗法、生物应答修饰剂疗法、手术、等)联合施用疫苗。
本发明的免疫疗法组合物的使用方法引发在个体中免疫应答，使得个体受到保护而免于疾病或状况，或免于源自疾病或状况的症状。如本文中使用的，短语“受到保护而免于疾病”指预防疾病、预防疾病的至少一种症状、延迟疾病的发作、减轻疾病的一种或多种症状、减少疾病的发生、和/或降低疾病的严重性。关于癌症，本发明的免疫疗法组合物的并行施用优选导致下述一项或多项：预防肿瘤生长，延迟疾病发作，降低肿瘤负荷，降低肿瘤生长，延长存活，改善器官功能，和/或改善个体一般健康。关于传染性疾病和其它疾病，免疫疗法组合物的并行施用优选导致下述一项或多项：预防疾病或状况，预防感染，延迟疾病发作，延长存活，降低病原体负荷(例如降低病毒滴度)，减轻个体中源自感染的至少一种症状，减轻源自感染或疾病的器官或系统损伤，和改善器官或系统功能。
在本发明的治疗方法中，本发明免疫疗法组合物的施用可以是“预防性”的或“治疗性”的。当预防性提供时，在疾病或状况的任何症状之前提供本发明的免疫疗法组合物。免疫疗法组合物的预防性施用用来预防或改善或延迟任何后续疾病的发作时间。当治疗性提供时，在疾病的症状发作时或之后提供免疫疗法组合物。术语“疾病”指相对于动物的正常健康状况的任何偏离，包括存在疾病症状时的状态，以及已经发生偏离(例如肿瘤生长、感染、等)但是症状尚未表现出来的状况。
在本发明的任何实施方案中，在对个体施用本发明的免疫疗法组合物之外，可以单独或组合施用别的外源免疫调控剂或免疫刺激性分子、化疗药物、 抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、癌症疗法、细胞因子、和其它治疗剂、治疗性组合物、或治疗方案，这取决于要治疗的状况。可以与本发明的免疫疗法组合物联合使用的合适生物应答修饰剂包括但不限于细胞因子、趋化因子、激素、脂衍生物、肽、蛋白质、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合模块、适体(aptamer)、和生长调控剂。外源添加的药剂和生物应答修饰剂的例子包括但不限于Flt-3L、环磷酰胺、顺铂、更昔洛韦(gancyclovir)、两性霉素B、5-氟尿嘧啶、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、IL-6、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、I型干扰素(包括IFN-α)或I型干扰素的激动剂或拮抗剂或其受体；II型干扰素(包括IFN-γ)或II型干扰素的激动剂或拮抗剂或其受体；III型干扰素(包括IFN-λ)或III型干扰素的激动剂或拮抗剂或其受体；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；抗-CD40；CD40L；抗-CTLA-4抗体(例如用于释放无变应性T细胞)；T细胞共刺激物(例如抗-CD137，抗-CD28，抗-CD40)；阿伦珠单抗(alemtuzumab)(例如 )，denileukin diftitox(例如)；抗-CD4；抗-CD25；抗-PD-1，抗-PD-L1，抗-PD-L2；阻断FOXP3的药剂(例如用于消除活性/杀死CD4+/CD25+T调节性细胞)；Flt3配体，咪喹莫特(AldaraTM)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，沙莫司亭 激素，包括但不限于促乳素和生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂、和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调控剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如塞来考昔，NSAIDS)、皮质类固醇、抑制素/他汀、和沙利度胺及其类似物，包括IMiDTM(其是沙利度胺的结构和功能类似物(例如 (lenalidomide)、 (pomalidomide))；促炎剂，诸如真菌或细菌成分或任何促炎性细胞因子或趋化因子；免疫治疗性疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗、或基于抗体的疫苗；和任何其它免疫调控剂、免疫强化剂、抗炎剂、和/或促炎剂。
这些外源药剂和疗法可以与本发明的免疫疗法组合物并行地或在不同的时间点施用。例如，当与化疗联合给予个体时，可能希望在化疗剂量之间的“假期”期间施用免疫疗法组合物，以使免疫疗法组合物的功效最大化。
本发明的组合物和治疗性疫苗可进一步包括可用于保护受试者免于特定疾病或状况(包括病原体感染)的任何其它化合物，治疗或改善此类感染的任何症状的任何化合物，和用于癌症的任何化合物或治疗。
在本发明的方法中，组合物和治疗性组合物可以施用给动物，包括任何脊椎动物，特别是脊椎动物纲、哺乳类的任何成员，包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和宠物。家畜包括用于消费的或生产有用产物(例如用于羊毛生产的绵羊)的哺乳动物。要保护的哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪。
在本发明中有用的通用技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、和免疫学的常规技术，它们是本领域技术人员所公知的。此类技术在文献中有详细阐述，诸如Methods of Enzymology，Vol.194，Guthrie et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts，Skinner，et al.，eds.，Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics：alaboratory course manual，Rose et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces：Cell Cycle and Cell Biology，Pringle et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces：GeneExpression，Jones et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；TheYeast Saccharomyces：Genome Dynamics，Protein Synthesis，and Energetics，Broachet al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning：ALaboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)及Molecular Cloning：ALaboratory Manual，third edition(Sambrook and Russel，2001)(在本文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括直到2001年的增刊)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Publications，New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies：ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(在本文中统称为“Harlow and Lane”)，Beaucage et al.eds.，Current Protocols inNucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；Casarett andDoull’s Toxicology The Basic Science of Poisons，C. Klaassen，ed.，6th edition(2001)，及Vaccines，S.Plotkin and W.Orenstein，eds.，3rd edition(1999)。
通用定义
“免疫治疗性组合物”为在受试者中引发足以实现至少一种治疗性好处的免疫应答的组合物。
术语“生物学活性”一般指示化合物具有至少一种对细胞或生物体的代谢或其它过程有影响的可检测活性，如在体内(即在天然生理环境中)或在体外(即在实验室条件下)测量或观察的。因而，例如，蛋白质的生物学活性部分或片段或域指大小足以具有全长蛋白质的生物学活性的部分、片段或域。此类活性为该蛋白质特别的活性，而非作为一类的所有蛋白质的活性。
“个体”或“受试者”或“患者”(这些术语可互换使用)指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于家畜、运动用动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。术语“个体”可以与术语“动物”、“受试者”或“患者”互换使用。
依照本发明，该术语“调控”可以与“调节”互换使用，而且一般指上调或下调特定活性。如本文中使用的，术语“上调”可以一般性用于描述下述任一项：关于特定活性的引发，启动，提高，提升，加强，改进，增强，扩大，促进，或提供。类似地，术语“下调”可以一般性用于描述下述任一项：关于特定活性的降低，减轻，抑制，改善，消除，减少，阻断，或阻止。
在本发明中提到分离的蛋白质或多肽包括全长蛋白质、融合蛋白、或此类蛋白质的任何片段、结构域、构象表位、或同源物。更具体的说，分离的蛋白质，依照本发明，指已经离开其天然环境(即已经进行过人为操作)的蛋白质(包括多肽或肽)，可以包括例如纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组生成的蛋白质、和合成生成的蛋白质。因此，“分离的”并不反映蛋白质已经纯化的程度。优选的是，本发明的分离的蛋白质是重组生产的。依照本发明，术语“修饰”或“突变”可以互换使用，特别是关于本文所述蛋白质或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修饰/突变。
在用于本文时，术语“同源物”用于指因对天然存在蛋白质或肽的微小修饰而与天然存在蛋白质或肽(即“原型”或“野生型”蛋白质)不同但保留天然存在形式的基本蛋白质和侧链结构的蛋白质或肽。此类变化包括但不限于：一个或一些氨基酸侧链的变化；一个或一些氨基酸的变化，包括删除(例如截 短型式的蛋白质或肽)、插入和/或替代；一个或一些原子的立体化学变化；和/或微小衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化(prenylation)、棕榈化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。同源物可以具有与天然存在蛋白质或肽相比增强的、减弱的、或基本上相似的特性。同源物可以包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物可以使用本领域已知的蛋白质生产技术来生产，包括但不限于直接修饰分离的天然存在蛋白质、直接蛋白质合成、或修饰编码蛋白质的核酸序列(例如使用经典或重组DNA技术来实现随机或靶向诱变)。
给定蛋白的同源物可以包含与参照蛋白质的氨基酸序列至少大约45％、或至少大约50％、或至少大约55％、或至少大约60％、或至少大约65％、或至少大约70％、或至少大约75％、或至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％相同、或至少大约95％相同、或至少大约96％相同、或至少大约97％相同、或至少大约98％相同、或至少大约99％相同(或介于45％和99％之间的、整数增量的任何百分比同一性)的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，同源物包含与参照蛋白质的天然存在氨基酸序列少于100％相同、少于大约99％相同、少于大约98％相同、少于大约97％相同、少于大约96％相同、少于大约95％相同、诸如此类、增量为1％、至少于大约70％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。
在用于本文时，除非另有说明，提到百分比(％)同一性指使用如下方法进行的同源性评估：(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜索，使用blastp进行氨基酸搜索而使用blastn进行核酸搜索，其中使用标准缺省参数，其中以缺省方法(by default)对检索序列过滤低复杂性区域(见Altschul，S.F.，Madden，T.L.， ，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generationof protein database search programs.″Nucleic Acids Res.25：3389-3402，通过述及完整收入本文)；(2)BLAST 2比对(使用下文所述参数)；(3)和/或PSI-BLAST(位置特异性的叠加BLAST(Position-Specific Iterated BLAST))，其中使用标准缺省参数。注意到，由于BLAST 2.0 Basic BLAST与BLAST 2之间标准参数的一些差异，在使用BLAST 2程序时可能将两种特定序列认定为具有显著同源性，而使用序列之一作为检索序列以BLAST 2.0Basic BLAST进行的搜索可能没有在上等匹配 中鉴定到第二序列。另外，PSI-BLAST提供了自动化的、易于使用的“序型”(profile)搜索型式，这是一种寻找序列同源物的灵敏方法。该程序首先进行带缺口的BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序利用来自任何返回的显著比对的信息来构建位置特异性得分矩阵，它取代了检索序列用于下一轮数据库搜索。因此，应当理解，百分比同一性可以使用这些程序中的任一种来测定。
两种特定序列可以使用BLAST 2序列彼此比对，见Tatusova and Madden，(1999)，″Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250，通过述及完整收入本文。BLAST 2序列比对以blastp或blastn进行，使用BLAST 2.0算法在两种序列之间进行带缺口的BLAST搜索(BLAST 2.0)，容许在所得比对中引入缺口(删除和插入)。为了表述清楚，使用标准缺省参数如下进行BLAST 2序列比对。
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：
匹配奖分＝1
错配罚分＝-2
开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分
缺口x_落选(dropoff)(50)期望(expect)(10)词长(11)滤器(开)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：
打开缺口(11)和延伸缺口(1)罚分
缺口x_落选(dropoff)(50)期望(expect)(10)词长(3)滤器(开)
如本文中使用的，“激动剂”为结合受体或配体或与另一分子或化学或生物学系统内的分子相互作用并产生或触发应答的任何化合物或药剂，包括但不限于小分子、蛋白质、肽、抗体、核酸结合剂、等，，其可包括模拟天然存在物质的作用的药剂(例如蛋白质或肽的激动剂)。“拮抗剂”为阻断或抑制或降低激动剂或天然存在物质的作用的任何化合物或药剂，包括但不限于小分子、蛋白质、肽、抗体、核酸结合剂、等。
分离的核酸分子指已经离开其天然环境的(即已经进行人为操作的)核酸分子，其天然环境指在自然界中找到该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”不必然反映该核酸分子已经纯化的程度，但是指明该分子不包括在自然界中找到该核酸分子的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可以包括基因。包括基因的分离的核酸分子不是包含所述基因的染色体片段， 而是包括与该基因有关的编码区和调控区，但是没有在相同染色体上天然发现的别的基因。分离的核酸分子还可以包括侧翼(即在序列的5′和/或3′末端)有别的核酸的指定核酸序列，所述别的核酸在自然界中通常不在所述指定核酸序列的侧翼(即异源序列)。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA任一的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是这两个短语可以互换使用，尤其对于能够编码蛋白质或蛋白质之结构域的核酸分子或核酸序列。术语“多核苷酸”也可以与术语“核酸分子”或“核酸序列”互换使用。
重组的核酸分子指这样的分子，它可以包括至少一种编码任何一种或多种本文所述蛋白质的核酸序列，其可操作连接至至少一种能够有效调节核酸分子在待转染细胞中表达的任何转录控制序列。尽管短语“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是这两个短语可以互换使用，尤其对于能够编码蛋白质的核酸分子或核酸序列。另外，短语“重组分子”主要指可操作连接至转录控制序列的核酸分子，但是可以与施用于动物的短语“核酸分子”互换使用。
重组核酸分子包括重组载体，其是任何核酸序列，通常是异源序列，其可操作连接至编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子，其依照本发明能够使得融合蛋白的重组生产成为可能，且能够投递核酸分子入宿主细胞。这样的载体可包含这样的核酸序列，即在自然界中没有找到该核酸序列邻接待插入载体的分离的核酸分子。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选的是，载体是病毒或质粒。重组载体可用于核酸分子的克隆、测序、和/或其它操作，而且可用于此类分子的投递(例如在DNA组合物或基于病毒载体的组合物中)。重组载体优选用于核酸分子的表达，而且还可称为表达载体。优选的重组载体能够在受到转染的宿主细胞中表达。
在本发明的重组分子中，可以将核酸分子可操作连接至包含调控序列的表达载体，所述调控序列诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点、和与宿主细胞相容的且控制本发明核酸分子表达的其它调控序列。具体而言，本发明的重组分子包括可操作连接至一种或多种表达控制序列的核酸分子。短语“可操作连接”指将核酸分子连接至表达控制序列，其连接方式使得该分子在转染(即转化、转导或转染)入宿主细胞后表达。
依照本发明，术语“转染”用于指可以将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞的任何方法。在此类术语用于指将核酸分子导入微生物细胞诸如藻类、细菌和酵母时，术语“转化”可以与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获得外源核酸而引起的遗传变化(inherited change)，而且尤其与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于转化、细胞的化学处理、颗粒轰击、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。
提供下述实验结果是为了例示而非意图限制本发明的范围。
实施例
下文实施例中使用了下述材料和方法。
小鼠和肿瘤细胞系
对于体外刺激淋巴细胞，雌性C57BL/6(H-2b)小鼠得自国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究和开发中心(Frederick，MD)。人CEA基因表达呈纯合的C57BL/6小鼠育种对(CEA-Tg)由John Shively博士(City of Hope，Duarte，CA)惠赠。通过对小鼠尾DNA的PCR分析确认了CEA表达的纯合性(Greiner et al.，Cancer Res 2002 Dec 1；62(23)：6944-51)。6至8周龄雌性小鼠用于所有实验，而且依照AAALAC方针在无病原体的条件下在微型分隔笼中饲养。实验性研究在NIH内部动物护理和使用委员会批准下进行。靶肿瘤细胞系EL-4(H-2b，胸腺瘤)得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。LL/26鼠肺腺癌肿瘤细胞由Chandan Guha博士(Albert Einstein College of Medicine，New York，NY)馈赠。如先前所述(Robbins et al.，Cancer Res 1991 Jul 15；51(14)：3657-62)，通过用CEA cDNA进行逆转录病毒转染而生成表达人CEA的LL/2鼠肺癌细胞(LL2-CEA)。在完全培养基(DMEM，补充10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、和100μg/ml链霉素)中维持细胞。
疫苗构建体
含有鼠B7-1、ICAM-1、和LFA-3基因以及人CEA基因的重组痘苗(rV)和重组禽痘(rF)病毒(rV/F-CEA/TRICOM)先前已有记载(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15；59(22)：5800-7；及Grosenbach et al.，Cancer Res 2001 Jun1；61(11)：4497-505)。表达鼠GM-CSF的rF病毒(rFGM-CSF)先前已有记载(Kass et al.，Cancer Res 2001 Jan 1；61(1)：206-14)。表达全长CEA蛋白的重 组啤酒糖酵母构建体(酵母-CEA)先前已有记载(Bernstein et al.，Vaccine 2008Jan 24；26(4)：509-21)。如先前所述(Haller et al.，Vaccine 2007 Feb 9；25(8)：1452-63)，生成并热杀死酵母-CEA以进行这些研究。
接种进度表
对于血清细胞因子分析，如先前所述(Wansley et al.，Clin Cancer Res2008Jul 1；14(13)：4316-25)，给CEA-Tg小鼠(n＝2)接种1x108pfu rVCEA/TRICOM或4YU/动物(1YU＝107个酵母颗粒)的酵母-CEA。对于所有其它研究，在rV/F-CEA/TRICOM疫苗组中，在第0天给CEA-Tg小鼠引发与1x107pfu rF-GM-CSF混合的1x108pfu rV-CEA/TRICOM，并天7天加强与1x107pfu rF-GM-CSF混合的1x108pfu rF-CEA/TRICOM。对于依照本发明的别处和实施例的剩余部分，此疫苗方案一般会称作“rV/F-CEA/TRICOM”。在酵母-CEA疫苗组中，每7天给CEA-Tg小鼠接种酵母-CEA(4YU/小鼠)。给接受rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA疫苗组合的小鼠引发1x108pfu rV-CEA/TRICOM(皮下施用在右背侧上)和4YU/小鼠的酵母-CEA(皮下投递在腿内侧和肩胛骨上)。在多个部位上分拆酵母-CEA剂量先前已有记载(Wansley，2008，见上文)，而且本文中不仅用于酵母-CEA疫苗，而且用于rV/F-CEA/TRICOM的分拆，以靶向小鼠中的多个引流淋巴结。对于研究的剩余部分，以1周间隔给组合组中的小鼠加强1x108pfu rF-CEA/TRICOM和酵母-CEA(4YU/小鼠)。
细胞因子表达谱
对于血清细胞因子分析，在接种后第0天、第2天、和第4天对接种小鼠(见上文接种进度表)放血，并分离血清。由Linco Diagnostic Services(St.Charles，MO)使用Th1/Th2和促炎性细胞因子组分析细胞因子表达。为了测量由来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠(n＝5)的CD8+T细胞分泌的细胞因子，将CD8+T细胞大量培养并在CEA-572-579肽(GIQNSVSA，称作CEA-572且在本文中呈现于SEQ ID NO：11)或CEA-526-533肽(EAQNTTYL，称作CEA-526且在本文中呈现于SEQ ID NO：12)(10μg/ml)存在下再刺激，如先前所述(Wansley et al.，2008，见上文)。使用小鼠炎性细胞因子细胞计量珠阵列试剂盒和小鼠Th1/Th2细胞因子细胞计量珠阵列试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)依照制造商的说明书测量细胞因子水平。
T细胞受体(TCR)谱
使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)依照制造商的说明书分离RNA。然后将RNA用于使用Invitrogen RT-PCR第一链合成系统(Invitrogen，8 Carlsbad，CA)依照制造商的说明书进行的RT-PCR反应。使用先前为19种Vα和24种Vβ基因记载的引物和条件扩增Vα和Vβ基因(Pannetier et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1993May 1；90(9)：4319-23；Arden et al.，Nature 1985 Aug 29-Sep 4；316(6031)：783-7)。使用Agilent 2100生物分析仪和Agilent DNA 1000试剂盒(Agilent Technologies，SantaClara，CA)依照制造商的说明书通过芯片电泳分析PCR产物。使用Agilent 2100 Expert软件(version B.02.06SI418[Patch 01])通过大小(bp)和数量(nmol/L)来鉴定PCR产物。对于每一份样品，对存在的每一种基因的数量求和，并对于每一种基因，计算总TCR Vα或Vβ全集的百分比。
使用由对小鼠TCR Vβ2、3、4、5.1和5.2、6、7、8.1和8.2、8.3、9、10、11、12、13、14、和17特异性的单克隆抗体组成的小鼠VβTCR筛选组(BD Pharmingen，San Jose，CA)，使用FACScan细胞仪(Becton Dickinson)通过流式细胞术在蛋白质水平鉴定TCR Vβ表达。
cDNA寡聚物阵列
CEA-Tg小鼠或是无处理或是以1周间隔接种3次rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA。在第33天，收获脾细胞，并分离RNA。使用T和B细胞活化、趋化因子和趋化因子受体、和常见细胞因子cDNA寡聚物阵列(SABiosciences，Frederick，MD)来调查基因表达变化。依照制造商的推荐，若基因的标准化强度比＞2或＜0.5(2倍截留)，则分别认定基因上调或下调。
CEA特异性CTL细胞系和体外测定法
在含CEA-526或CEA-572肽(1μg/ml)和IL-2(10U/ml)及新鲜照射的APC的培养中维持自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠生成的CEA-526特异性和CEA-572特异性T细胞系。为了测量T细胞系裂解经111In标记的靶的能力，在96孔U底板中于37℃和5％CO2一式三份将多种比例的T细胞与经过标记的靶一起温育。在某些研究中，使用抗MHC I类阻断性抗体(H2Db，BD Pharmingen)来区分TCR介导的与NK样的细胞毒性。使用伽马计数器(CorbaAutogamma，Packard Instruments，Downers Grove，IL)测量上清液中的放射性。肿瘤裂解的百分比如下计算：％肿瘤裂解＝[(实验cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)]x100。为了评估CEA特异性CTL系的亲合力，如先前所 述测试肿瘤杀死活性(Hodge et al，2005，JImmunol 174(10)：5994-6004)。对数据取平均值并作为Δ％特异性裂解绘图。为了标准化每一项实验内的各组，还将数据表述为最大裂解对肽浓度的百分比。最后，将标准化数据的自然对数针对肽浓度绘图。每一种T细胞群的亲合力定义为导致50％最大靶裂解的肽浓度的对数负数(Hodge et al.，2005，见上文及Derby et al，2001，J Immuno l 166(3)：1690-1697)，并表述为nM。HIV-gag-390-398肽(SQVTNPANI，称作HIV-gag肽且在本文中呈现于SEQID NO：13)在此实验中用作阴性对照。对CEA-526和CEA-572特异性的MHC I类肽四聚物得自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。指示时，如Wunderlich et al.(1994，“Induction andmeasurement of cytotoxic T lymphocyte activity.”In：Coligan J，Kruisbeek A，Margulies D，Shevach E，Strober W(eds)Current Protocols in Immunology，Wiley，Hoboken，NJ)所述，将CTL活性换算成裂解单位(LU)。
肿瘤疗法研究
对于涉及LL2-CEA肿瘤的疗法研究，给6至8周雌性CEA-Tg小鼠在尾中静脉内注射100μl体积中的3x105个LL2-CEA细胞。肿瘤植入后4天，如上所述给小鼠引发，然后加强。为了对肺部转移计数，将来自处死小鼠的肺膨胀，用黑墨染色，并在Fekete氏溶液中固定(Wexler，J Natl Cancer Inst 1966 Apr；36(4)：641-5)。
统计分析
使用GraphPad Prism version 4.0a for Macintosh(GraphPad Software，SanDiego，CA)对体内数据实施统计分析。对第45天每只小鼠的平均肿瘤鼠实施双尾非参数Mann-Whitney检验。对第45天携带＞10个肺部肿瘤小结的小鼠(认为余生≤1周)实施时序(Mantel-Cox)检验。以95％置信区间计算所有数值，而且≤0.05的p值认定为显著。
实施例1
下述实施例显示免疫疗法载体在诱导细胞因子和趋化因子宿主先天性免疫应答(其随后可影响CEA特异性T细胞应答)中的作用。
在此实验中，调查了免疫疗法载体在诱导细胞因子和趋化因子宿主先天性免疫应答(其随后可影响CEA特异性T细胞应答)中的作用。简言之，给CEA-Tg小鼠(n＝2)接种rV-CEA/TRICOM或酵母-CEA。在第0天、第2天、和第4天收集血清，合并并使用Th1/Th2和促炎性细胞因子组分析一组细胞因 子。如图1所示，rV-CEA/TRICOM(实心方框)诱导Th1型细胞因子谱，其中MIP1α、RANTES、GM-CSF、和IL-12p70水平高而IL-5水平低(分别为图1A、B、C、和E)。相反，酵母-CEA接种诱导混合型Th1/Th2细胞因子谱，其中IL-6水平升高(图1D)，MIP1α、RANTES、IL-13、和IL-5水平低(分别为图1A、B、F、和I)。数据呈现为每一天的pg/ml细胞因子。这些数据显示接种rV-CEA/TRICOM与酵母-CEA诱导不同细胞因子表达，指示每一种疫苗平台诱导不同T细胞群。
实施例2
下述实施例演示接种rV/F-CEA/TRICOM与酵母-CEA诱导独特TCR全集。
此实验试图确定接种任一平台是否诱导具有独特TCR全集的CD8+T细胞群。如上文材料和方法部分所述，给CEA-Tg小鼠(n＝5每组)接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一。无处理小鼠充当阴性对照(图2A和2D)。在接种后14天自接种小鼠收获脾并合并。使用19种Vα特异性和24种Vβ特异性引物实施RT-PCR反应。然后分析PCR产物并为每一种基因计算总TCR全集的百分比(图2；星号指示在来自接种一种疫苗的小鼠的T细胞中与另一种疫苗相比独特表达的基因)。来自无处理小鼠和接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠的脾细胞的TCR Vα谱指示每一个组具有独特TCR Vα表达谱(图2A至C)。19种Vα基因中12种的表达在由两种疫苗诱导的T细胞之间是相似的，而7种Vα基因对于来自一种疫苗的T细胞群与另一种疫苗相比是独特的(图2B和C)。来自这些相同动物的Vβ全集的比较指示除少数例外，Vβ谱在两组小鼠间也有区别(图2D至E)。24种Vβ基因中14种的表达在由两种疫苗诱导的T细胞之间是相似的，而疫苗也诱导独特Vβ基因。如图2E和F所示，10种Vβ基因由来自rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一接种CEA-Tg小鼠的T细胞独特表达(Vβ1、Vβ4、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ8.1、Vβ8.3、Vβ9、Vβ10、和Vβ20)。这些数据指示来自无处理小鼠和接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠的T细胞的Vα和VβTCR全集具有共享的和独特的TCR基因表达样式。然而，不知道这些差异是否是由于受到不同载体感染的细胞对CEA抗原的不同加工和呈递，或者是由于载体自身。下文实施例描述了自接种两种载体平台的CEA-Tg小鼠创建的对两种不同CEA表位特异性的T细胞系的TCR全集。
实施例3
下述实施例显示，接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA，诱导了共享的和独特的、响应载体和抗原的基因表达。
为了调查载体和抗原二者对脾细胞的基因表达的影响，使用cDNA寡聚物阵列来进一步表征通过接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA诱导的T细胞群。调查了接种rV/FCEA/TRICOM或酵母-CEA的CEA-Tg小鼠的脾细胞对涉及T和B细胞活化、趋化因子、趋化因子受体、和细胞因子的252种基因的表达。表1显示对于每一个阵列，rV/FCEA/TRICOM和酵母-CEA都诱导相同基因的表达变化，包括将26种基因上调至少2倍，其中大多数涉及细胞因子信号传导。另外，两种疫苗都上调涉及免疫细胞趋化性的白三烯受体Ltb4r2、涉及T细胞增殖的基因诸如分泌型磷蛋白-1(Spp1或骨桥蛋白)、和肿瘤抑制基因Inha。同时，每一种疫苗平台均诱导数种基因的独特表达变化(表1，粗体)。酵母-CEA下调涉及免疫细胞趋化性的基因诸如Ccl12、Cxcl9、Ccr9，而rV/F-CEA/TRICOM不改变任何这些基因的表达。来自此实验的结果指示两种疫苗平台诱导共享的和独特的基因表达变化。
表1
粗体的基因由来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一的小鼠的脾 细胞特异性(而非均)上调/下调。括弧中记录＞3倍的倍数变化。
实施例4
下述实施例演示rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA诱导功能上独特的T细胞群。
为了确定由疫苗诱导的T细胞群的抗原特异性应答，调查了用两种离散CEA表位(CEA-572和CEA-526)任一体外刺激后由来自接种动物的T细胞生成的细胞因子。图3A图示CEA蛋白，显示域III的A3环上的离散、不交叠CEA-526和CEA-572表位。
如图3所示，在第0天给CEA-Tg小鼠(n＝5)引发rV-CEA/TRICOM(实心柱)，并在第7天和第14天加强rFCEA/TRICOM；在第0天给CEA-Tg小鼠(n＝5)引发，并在第7天和第14天加强酵母-CEA(空心柱)。在第33天，处死小鼠，合并脾，置于(图3B)含CEA-526或(图3C)含CEA-572肽的大量培养物(bulk cultures)中培养7天。在将淋巴细胞用CEA特异性肽或VSVN肽对照再刺激24小时后通过细胞因子珠测定法(pg/ml/Lx106个细胞)测量IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-5和IL-4。所有数据相对于VSVN肽对照标准化。
观察到两种不同CEA表位自来自接种动物的T细胞诱导不同水平的细胞因子生成。响应CEA-526，在rV/F-CEA/TRICOM接种后分泌与酵母-CEA相比更高水平的TNF-α(图3B，实心柱)，而当用CEA-572肽刺激T细胞时，酵母-CEA接种生成显著更高水平的TNF-α(图3C，空心柱)。而且，当用CEA-526和CEA-572肽刺激时，来自酵母-CEA接种的T细胞诱导与来自rV/F-CEA/TRICOM接种的T细胞相比更高水平的IL-2(图3B和3C，空心柱)。类似地，与酵母-CEA接种相比，在接种rV/F-CEA/TRICOM后，T细胞响应CEA-526和CEA-572肽诱导更高水平的IFN-γ(图3B和3C，实心柱)。
数据还显示来自接种动物的T细胞响应单一CEA表位分泌不同水平的多种细胞因子。来自接种酵母-CEA的小鼠的T细胞响应CEA-572表位分泌IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-5、和IL-2(图3C，空心柱)。另一方面，来自接种rV/F-CEA/TRICOM的小鼠的T细胞响应CEA-572肽分泌与酵母-CEA相比显著更高水平的IFN-γ和响应CEA-572表位的更低水平的IL-10和TNF-α(图3C，实心柱)。这些结果指示由接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA诱导的T细胞群是抗原特异性的且功能上独特的。
实施例5
下述实施例演示自接种rV/F-CEA/TRICOM与酵母-CEA的小鼠建立的T细胞系具有14种独特TCR全集和功能性亲合力。
为了进一步探索来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一的小鼠的T细胞的功能性的潜在差异，如材料和方法所述自接种CEA-Tg的小鼠创建对CEA-526或CEA-572肽任一特异性的T细胞系。简言之，如上所述给CEA-Tg小鼠(n＝5只每组)接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA。最后一次接种后两周，收获并合并脾，脾细胞用CEA-526或CEA-572肽进行7天的大量培养。每7天用新鲜肽、IL-2和经照射APC再刺激淋巴细胞，并保持培养以进行体外实验。在18个刺激循环后进行TCR谱分析。
来自4种细胞系的VαTCR谱指示T细胞群具有共享的和独特的VαTCR全集。如图4所示，显示了rV/F-CEA/TRICOM T细胞系(黑色柱)在(图4A)CEA-526肽和(图4B)CEA-572肽存在下维持的VαTCR全集。图4还显示了酵母-CEA T细胞系(白色柱)在(图4C)CEA-526肽和(图4D)CEA-572肽存在下维持的VαTCR全集。结果表述成总Vα链TCR全集的百分比。星号指示在来自接种一种疫苗的小鼠的T细胞中与另一种相比独特表达的31种基因。
在用CEA-526表位刺激的来自接种小鼠的T细胞中，T细胞具有19种Vα基因中16种的共享表达和3种Vα基因的独特表达(图4A和C)。在用CEA-572表位刺激的来自接种小鼠的T细胞中，T细胞具有19种Vα基因中15种的共享表达和4种Vα基因的独特表达(图4B和D)。在分析VβTCR谱时看到了相似结果(数据未显示)。另外，使用商品化单克隆抗体通过流式细胞术确认了T细胞系对选定VβTCR基因的表达(数据未显示)。这些数据提供来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一的小鼠的T细胞群是载体和抗原二者特异性的进一步证据。
为了表征来自任一载体的T细胞之间的功能性差异，比较了从rV/FCEA/TRICOM生成的与从酵母-CEA接种生成的T细胞的CEA特异性溶胞活性。确认了T细胞系培养物的纯度，即用鉴定CD8、CD4、和NK细胞的单克隆抗体进行细胞表面染色，继以流式细胞术(数据未显示)。另外，使用对CEA-526或CEA-572特异性的MHC I类肽四聚物进行的四聚物染色确认了T细胞系的肽特异性(数据未显示)。
简言之，以所示比例将自rV/F-CEA/TRICOM接种生成的且对(图5A)CEA-526肽和(图5C)CEA-572肽特异性的T细胞系与经肽脉冲的经111In标 记的EL-4细胞靶一起温育4小时。也以所示比例将自酵母-CEA接种生成的且对(图5B)CEA-526肽和(图5D)CEA-572肽特异性的T细胞系与经111In标记的EL-4细胞靶一起温育4小时。如图5所示，经CEA-572和CEA-526肽脉冲的经 111In标记的EL-4细胞以实线连接的实心方框表示，而经VSVNP(阴性对照)脉冲的经111In标记的EL-4细胞以虚线连接的空心圆圈表示。为了测定T细胞亲合力，(图5B，插图)在范围为1μM至0μM的多种浓度的CEA-526(或HIV-gag对照)肽存在下将来自rV/F-CEA/TRICOM(实心方框)和酵母-CEA(空心圆圈)的CEA-526特异性T细胞系与经111In标记的EL-4细胞一起温育4小时。自接种rV/F-CEA/TRICOM(图5E)或酵母-CEA(图5F)的小鼠生成的对CEA-572表位特异性的T细胞系也以多种比例用于使用经111In标记的LL2-CEA的溶胞T细胞测定法，并相对于LL2(阴性对照)肿瘤靶标准化。柱指示来自一式三份孔的标准误差。
图5A和5B显示自rV/F-CEA/TRICOM生成的CEA-526肽特异性T细胞系具有与自酵母-CEA接种生成的T细胞系相比更高的裂解活性。对CEA-572表位特异性的T细胞系都展示出相似水平的溶胞活性(图5C和5D)。图5B插图显示自rV/F-CEA/TRICOM接种生成的CEA-526特异性T细胞系具有比自酵母-CEA接种生成的CEA-526特异性T细胞系高23.3倍的亲合力。
CEA-572特异性T细胞系还用于靶向经111In标记的LL2-CEA细胞的CTL测定法。在此测定法之前将来自接种rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一的小鼠的CEA-572特异性T细胞培养20周。两种T细胞系都裂解LL2-CEA靶，而且裂解随T细胞对效应细胞(LL2-CEA靶)的比例降低而降低(图5E和5F)。这些结果指示两种T细胞系都能够裂解表达CEA的细胞，尽管当将LL2-CEA细胞裂解相对于LL2细胞裂解标准化时，来自接种酵母-CEA的小鼠的T细胞系(图5F)具有与来自接种rV/FCEA/TRICOM的小鼠的T细胞系(图5E)相比更高水平的活性。
为了确认在图5E和5F中观察到的细胞裂解是TCR介导的，而且不是由于NK细胞活性，用对MHC I类分子特异性的阻断性单克隆抗体用LL2-CEA肿瘤靶实施CTL实验，并相对于作为对照的LL2靶细胞标准化，显示了MHC I类阻断性抗体的存在消除细胞裂解。NK细胞介导的裂解的缺失在使用YAK1靶的CTL中得到进一步确认，其中发现MHC类阻断性抗体的存在消除各种T细胞系对YAK1细胞的裂解。总之，这些结果指示自靶向相同CEA-表位的不 同载体创建的T细胞系的裂解活性是TCR介导的，而且当靶向经肽脉冲的靶细胞时细胞裂解水平是相似的，尽管它们裂解表达CEA的肿瘤靶的能力不同。另外，rV/F-CEA/TRICOM诱导的T细胞系的亲合力可高于自酵母-CEA接种创建的T细胞系的亲合力。这些结果进一步将来自接种rV-CEA/TRICOM或酵母-CEA小鼠的T细胞群表征为平台特异性的。
实施例6
下述实施例演示在鼠正位肺部转移模型中组合rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA是有效的抗肿瘤疗法。
进行了研究来确定并行施用两种疫苗是否会生成优于单独接种任一疫苗平台的抗肿瘤活性。简言之，给CEA-Tg小鼠静脉内注射LL2-CEA肿瘤细胞。在第4天，给小鼠引发rV/F-CEA/TRICOM(n＝10)、酵母-CEA(n＝14)、或rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA(n＝10)；对照组(n＝17)不接受处理。实验持续期间每7天给小鼠加强。给rV/F-CEA/TRICOM组加强rV/F-CEA/TRICOM。给酵母-CEA组只加强酵母-CEA。给组合组加强rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA。对于这些研究，rV/F-CEA/TRICOM皮下注射在右背侧上，而1YU酵母-CEA皮下投递至每一个腿内侧和肩胛骨以靶向多个引流淋巴结。在第45天，处死小鼠并收获肺，染色，和固定。图6所示数据呈现来自两项分开实验的每只小鼠的肺部转移数(以空心与实心符号表示)。柱指示每只小鼠的平均转移数，比较无处理小鼠与rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA组合组的p＝0.015。
无处理小鼠具有每只小鼠平均10.84个肿瘤(+2.41)。接种rV/FCEA/TRICOM的小鼠具有每只小鼠平均7.50个转移(+2.02)，而接种酵母-CEA的小鼠具有每只小鼠平均9.71个转移(+1.22)。然而，接种rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA组合的小鼠具有每只小鼠2.80个转移(+0.77)；此组合组是唯一具有与无处理对照相比显著更低的转移数的组(p＝0.015)。而且，无处理、rV/F-CEA/TRICOM、和酵母-CEA组的每只小鼠最大转移数分别为36、24、和18，而组合组的最大转移数为7。此外，时序检验(在第45天携带＞9个肺部肿瘤小结的小鼠；假定余生＜1周)显示了无处理小鼠和接受rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA组合的小鼠之间的统计学显著性(p＝0.0027)。而且，单独用rV/F-CEA/TRICOM处理的小鼠与并行接种rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA的小鼠之间有统计学显著性(p＝0.0293)。另 外，单独用酵母-CEA处理的小鼠与并行接种rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA的小鼠之间有统计学显著性(p＝0.0017)。总之，这些结果指示并行施用rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA疫苗能提高抗肿瘤功效。
如上文讨论的，已发表的比较疫苗平台的报告在历史上得出结论，一种比另一种在刺激免疫系统方面更加有效，并因此推荐进一步开发更有效的平台进行临床研究(Riezebos-Brilman et al.，Gene Ther 2007 Dec；14(24)：1695-704；及Casimiro etal.，J Virol 2003 Jun；77(11)：6305-13)。本文中提供的结果证明了由每一种平台引发的T细胞群对不同CEA表位展示出独特的和共享的表型和功能应答。本文中呈现的结果首次显示(a)靶向相同抗原的2种疫苗平台诱导独特T细胞群，(b)对这些T细胞群的诱导是载体和抗原二者特异性的，且(c)疫苗可以在抗肿瘤模型中并行使用以改进抗肿瘤功效。
尽管已经详细描述了本发明的各种实施方案，对这些实施方案的更改和改动对于本领域技术人员是显而易见的。然而，应当清楚的了解，此类更改和改动在本发明的范围之内，正如所述权利要求中所列的。

Claims (19)

1.免疫疗法组合物的组合在制备药物中的用途，该药物并行施用于个体，以在个体中预防、改善或治疗疾病或状况的至少一种症状，延长个体的存活，和/或在个体中诱导针对一种或多种抗原的治疗性免疫应答，该免疫疗法组合物包含：
a)包含重组痘苗病毒的第一免疫疗法组合物，该重组痘苗病毒包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列；和
b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域，
其中该第一和第二免疫疗法组合物均包含相同抗原或其免疫原性域。
2.权利要求1的用途，进一步包括以下组合物用于在施用第一和第二免疫组合物的至少一周后并行施用给该个体：
a)第三免疫疗法组合物，包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列的重组禽痘病毒；和
b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。
3.权利要求1或2的用途，其中所述第一免疫疗法组合物还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
4.权利要求3的用途，其中GM-CSF由编码GM-CSF的重组禽痘病毒提供。
5.权利要求1的用途，其中该癌症抗原选自下组：癌胚抗原(CEA)，突变的Ras癌蛋白，Brachyury，MUC-1，EGFR，BCR-Abl，MART-1，MAGE-1，MAGE-3，GAGE，GP-100，MUC-2，正常的和点突变的p53癌蛋白，PSMA，酪氨酸酶，TRP-1(gp75)，NY-ESO-1，TRP-2，TAG72，KSA，CA-125，PSA，HER-2/neu/c-erb/B2，hTERT，p73，B-RAF，腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)，Myc，冯·希佩尔-林道蛋白(VHL)，Rb-1，Rb-2，雄激素受体(AR)，Smad4，MDR1，Flt-3，BRCA-1，BRCA-2，pax3-fkhr，ews-fli-1，HERV-H，HERV-K，TWIST，间皮素，NGEP，这些抗原的修饰，这些抗原的剪接变体，和这些抗原的表位激动剂。
6.权利要求1的用途，其中该癌症抗原是癌胚抗原(CEA)。
7.权利要求6的用途，其中该CEA包含CAP1-6D表位。
8.权利要求1的用途，其中所述药物并行施用于个体，以延长具有癌症的个体的存活，和/或在所述个体中诱导针对一种或多种癌症抗原的治疗性免疫应答，其中所述组合物包含：
a)第一免疫疗法组合物，其包含：
i)重组痘苗病毒，该病毒包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列；和
ii)GM-CSF；和
b)第二免疫疗法组合物，其包含酵母媒介，所述酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域，
其中该第一和第二免疫疗法组合物均包含相同抗原或其免疫原性域。
9.权利要求8的用途，进一步包括额外的药物用于在施用第一和第二免疫疗法组合物的至少一周后并行施用给该个体：
a)第三免疫疗法组合物，包含
i)重组禽痘病毒，所述病毒包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列；和
ii)GM-CSF；和
b)第二免疫疗法组合物，其包含酵母媒介，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域。
10.权利要求8或9的用途，其中GM-CSF由编码GM-CSF的重组病毒载体提供。
11.权利要求1，2，8或9任一项的用途，其中所述第一免疫疗法组合物中的痘苗病毒来自经修饰的痘苗安卡拉(MVA)病毒或痘苗-Wyeth株。
12.权利要求1，2，8或9任一项的用途，其中所述第二免疫疗法组合物中的酵母媒介是完整的热灭活的酵母。
13.权利要求1，2，8或9任一项的用途，其中该第二免疫疗法组合物中的酵母媒介来自酵母属(Saccharomyces)。
14.权利要求1，2，8或9任一项的用途，其中该第一和第二免疫疗法组合物施用于个体中不同部位。
15.权利要求1，2，8或9任一项的用途，其中该第一和第二免疫疗法组合物施用于个体中相同部位或邻近部位。
16.权利要求1，2，8或9任一项的用途，进一步包括用一或多种免疫疗法组合物对该个体加强免疫。
17.一种试剂盒，包含下述免疫疗法组合物：
a)包含重组痘苗病毒的第一免疫疗法组合物，该重组痘苗病毒包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-3的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列，任选还包含GM-CSF；和
b)包含酵母媒介的第二免疫疗法组合物，该酵母媒介包含至少一种癌症抗原或其免疫原性域，
其中该第一和第二免疫疗法组合物均包含相同抗原或其免疫原性域。
18.权利要求17的试剂盒，进一步包含第三免疫疗法组合物，所述组合物包含重组禽痘病毒，该病毒包含编码B7-1、ICAM-1和LFA-1的核酸序列和编码至少一种癌症抗原或其免疫原性域的核酸序列。
19.权利要求17的试剂盒，其中该抗原是包含CAP-1-6D表位的经修饰CEA。
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